CN105126121B - 一种靶向金银合金纳米笼的药物递送系统的制备方法及应用 - Google Patents
一种靶向金银合金纳米笼的药物递送系统的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及靶向金银合金纳米笼的药物递送系统的制备方法及应用，可有效解决现有肿瘤治疗药物副作用大、治疗效果不佳的问题，该系统是由靶向金银合金纳米笼基因载体负载基因药物形成的药物转运系统，其中，靶向金银合金纳米笼基因载体和基因药物的质量比为（1‑12）×106:1，所述的金银合金纳米笼基因载体是将靶向肿瘤分子叶酸和阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）以化学键和静电作用的方式连接在金银合金纳米笼的表面构成；本发明物理化学稳定性良好，制备条件简单可行，原料来源丰富，成本低，副作用小，能有效负载基因药物靶向肿瘤部位协同热疗抑制肿瘤细胞增殖，是肿瘤基因治疗与光热治疗中载体上的创新。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是一种靶向金银合金纳米笼的药物递送系统（制剂）的制备方法及应用。
背景技术
基因治疗(gene therapy)是将目的基因导入患者的特定组织和细胞进行适当的表达，以纠正或补偿因基因缺陷或异常而引起的疾病，从而达到治疗疾病的目的。基因治疗与传统治疗方法相比，具有无可争议的优越性。它从根源上修正了引起疾病的异常基因，可以选择性地治疗多种严重威胁人类健康的疾病并且取得了一定的治疗效果。目前，基因治疗已经成为医学领域里一个新的研究热点。然而，裸露的基因治疗药物存在易被核酶降解、细胞内吞效果差和细胞靶向能力差等缺点，因此，需要寻求合适的载体，将基因治疗药物有效地输递到靶细胞，实现高效的基因治疗。开发安全、高效的基因递送载体成为基因治疗的关键所在。
目前的基因载体可主要分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体因具有转导效率及表达效率高的特点,但易导致严重的副作用,例如毒性,免疫效应、致癌性以及炎症反应等。非病毒载体是新兴的基因转导系统,具有低毒、低免疫反应、外源基因整合几率低、无基因插入片断大小限制,以及使用简单、制备方便、便于保存和检验等优势，因此已经成为当今基因治疗领域里一个新的研究热点。常见的非病毒性载体主要有：阳离子脂质体、阳离子聚合物、无机材料纳米粒等。
金纳米粒子具有良好的生物活性、光热效应以及作为药物载体越来越受到生物医学研究者的青睐。金银合金纳米笼状结构(Nanocages)代表一类新型的在红外区域可调局域表面等离子体共振峰(LSPR)的纳米金结构，它除了独特的空心内部以及多孔壁特征外，还具有良好的机械柔韧性和稳定性， LSPR峰可调控性，粒径小，比表面积大，利于载药，容易功能修饰以提高生物相容性和靶向性等优势使其在诊断治疗学应用方面独树一帜。金纳米笼对700～1100nm范围的近红外光具有高吸收特性，同时生物系统对此范围的近红外光具有高度透过性，因此可利用金银合金纳米笼的光热转换特性对肿瘤进行激光热疗。金银合金纳米笼是药物转运载体，同时也是发挥热疗效应的主体，可作为基因治疗药物增敏剂和靶向热敏剂。
由于常见的治疗会引起严重的全身性毒副作用，这些毒副作用病人往往难以耐受，因此其在临床应用受到了很大的限制。这主要是因为药物递送系统缺乏对肿瘤细胞的辨识能力。传统注射给药使药物均匀分布于全身，肿瘤部位药物浓度较低，药物在杀伤肿瘤细胞的同时也伤害了人体内的正常细胞。因此，在肿瘤治疗中如何实现减毒增效的目标已成为了世界瞩目的焦点。通过药剂学手段开发抗肿瘤靶向药物递送系统是实现减轻肿瘤化疗药物毒副作用、提高肿瘤药物靶向性、增加其抗肿瘤疗效的重要手段，也是目前药剂学的研究热点。目前研究最多的靶头有叶酸（FA）、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）、精氨酸-甘氨酸-天冬酰胺（NGR）等。叶酸受体在许多癌细胞，比如肝癌，卵巢癌，肺癌，脑癌，肾癌，乳腺癌的表达显著高于正常组织细胞，在某些情况下，甚至上调了两个数量级。叶酸与叶酸受体具有较高的亲和力，即便在叶酸与叶酸共聚物浓度较低的情况下，其也可与叶酸受体高效地结合。同时，由于价格便宜，无毒，无免疫原性，易与载体结合，稳定性高，叶酸作为配体被广泛应用。
目前，通过靶向金银合金纳米笼基因载体负载基因药物形成药物递送系统，特别是在肿瘤治疗药物中的应用尚未见有报道。因此，本发明的研制成功具有统计学上的意义和实际的临床意义。
发明内容
针对上述情况，克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种靶向金银合金纳米笼的药物递送系统的制备方法及应用，可有效解决现有肿瘤治疗药物副作用大、治疗效果不佳的问题。
本发明解决的技术方案是，该系统是由靶向金银合金纳米笼基因载体负载基因药物形成的药物转运系统，其中，靶向金银合金纳米笼基因载体和基因药物的质量比为（1-12）×106:1，所述的金银合金纳米笼基因载体是将靶向肿瘤分子叶酸和阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）以化学键和静电作用的方式连接在金银合金纳米笼的表面构成；
所述的聚乙烯亚胺（PEI）为Mw 25000的bPEI、Mw 25000的LPEI或Mw1800的bPEI中的一种；所述的基因药物为质粒DNA、siRNA、microRNA或lncRNA中的一种；所述的靶向金银合金纳米笼的粒径为50-150nm，其制备方法由以下步骤实现：
1）将8-10mg叶酸、7-8mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、4-5mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）置于20ml pH值为4-7的PBS缓冲液中，室温磁力搅拌2-12h，得活化的叶酸溶液；
2）称取带有活性基团的PEG 40-60mg加入到活化的叶酸溶液中，用0.1M NaOH溶液调pH值为7-9，室温磁力搅拌12-24h，用分子量为3500Da的透析袋透析48-72h，除去未反应的叶酸，得带有活性基团PEG的SH-PEG-NH2反应溶液；
3) 取金银合金纳米笼200-300ml加入到步骤2）制备的反应溶液中，搅拌混合均匀，用0.1M NaOH溶液调溶液pH值为7-9，室温磁力搅拌4-48h，12000r/min离心15-30min，得沉淀物；将沉淀物再加入到步骤2）制备的反应溶液中，搅拌混合均匀，用0.1M NaOH溶液调溶液pH值为7-9，室温磁力搅拌4-48h，12000r/min离心15-30min，弃去上清，得沉积物，如此重复3-5次，将沉积物用超纯水分散，得PEG化的靶向金银合金纳米笼溶液；
4）称取含有巯基的小分子化合物1-5mg溶于乙醇2-10ml中，加入到步骤3）制备的PEG化的靶向金银合金纳米笼溶液中，室温磁力搅拌4-24h混合均匀，8000-12000r/min离心15-30min，弃去上清液，得沉积物，将沉积物用超纯水重新分散；然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）2-5mg、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）1-4mg，室温搅拌4-24h，再加入含有20-60mg的聚乙烯亚胺水溶液2-8ml，用1.2M稀盐酸调溶液pH值为6-7，室温搅拌0.5-24h，12000r/min离心15-30min，弃去上清，得沉淀，沉淀再重新分散于超纯水中，在12000r/min离心15-30min，如此重复离心3-5次，即得靶向金银合金纳米笼基因载体；
所述的巯基小分子化合物是11-巯基烷酸、硫辛酸、巯基乙酸、巯基丙酸中的一种；
5)将上述所制得的靶向金银合金纳米笼基因载体与基因药物以质量比为（1-12）×106︰1，将靶向金银合金纳米笼基因载体的水溶液在涡旋的状态下，逐滴加入到基因药物水溶液中，涡旋30-120s，室温孵育30-60min，即成靶向金银合金纳米笼的药物递送系统。
所述的靶向金银合金纳米笼的药物递送系统在制备抗肿瘤基因联合热疗药物中的应用，可以用于静脉注射、肌肉注射、瘤内注射和皮下注射、透皮给药、体内植入。
本发明的金银合金纳米笼基因载体能够负载基因药物，并能够靶向肿瘤部位，还具有光热转换性能，肿瘤局部激光照射，使局部温度升高从而实现肿瘤的光热治疗；本发明物理化学稳定性良好，制备条件简单可行，原料来源丰富，成本低，副作用小，能有效负载基因药物靶向肿瘤部位协同热疗抑制肿瘤细胞增殖，是肿瘤基因治疗与光热治疗中载体上的创新。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
本发明在具体实施中可由以下实施例给出。
实施例1
本发明在具体实施中，可由以下步骤实现：
1）将10mg叶酸、8mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、5mg N-羟基琥珀酰亚胺置于20ml pH值为5的PBS缓冲液中，室温磁力搅拌12h，得活化的叶酸溶液；
2）称取带有活性基团的PEG 60mg加入到活化的叶酸溶液中，用0.1M NaOH溶液调pH值为8，室温磁力搅拌18h，用分子量为3500Da的透析袋透析72h，除去未反应的叶酸，得带有活性基团PEG的SH-PEG-NH2反应溶液；
3) 取金银合金纳米笼300ml加入到步骤2）制备的反应溶液中，搅拌混合均匀，用0.1M NaOH溶液调溶液pH值为9，室温磁力搅拌48h，12000r/min离心15-30min，得沉淀物；将沉淀物再加入到步骤2）制备的反应溶液中，搅拌混合均匀，用0.1M NaOH溶液调溶液pH值为8，室温磁力搅拌48h，12000r/min离心15-30min，弃去上清，得沉积物，如此重复3-5次，将沉积物用超纯水分散，得PEG化的靶向金银合金纳米笼溶液；
4）称取硫辛酸1.5mg溶于乙醇5ml中，加入到步骤3）制备的PEG化的靶向金银合金纳米笼溶液中，室温磁力搅拌24h混合均匀，8000-12000r/min离心30min，弃去上清液，得沉积物，将沉积物用超纯水重新分散；然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐2.7mg、N-羟基琥珀酰亚胺1.6mg，室温搅拌24h，再加入含有50mg的聚乙烯亚胺水溶液5ml，用1.2M稀盐酸调溶液pH值为6.5，室温搅拌24h，12000r/min离心15-30min，弃去上清，得沉淀，沉淀再重新分散于超纯水中，在12000r/min离心15-30min，如此重复离心3次，即得靶向金银合金纳米笼基因载体；
5)将上述所制得的靶向金银合金纳米笼基因载体与基因药物以质量比为9×106︰1，将靶向金银合金纳米笼基因载体的水溶液在涡旋的状态下，逐滴加入到基因药物水溶液中，涡旋60s，室温孵育30min，即成靶向金银合金纳米笼的药物递送系统。
实施例2
本发明在具体实施中，可由以下步骤实现：
1）将9mg叶酸、7.5mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4.5mg N-羟基琥珀酰亚胺置于20ml pH值为5的PBS缓冲液中，室温磁力搅拌12h，得活化的叶酸溶液；
2）称取带有活性基团的PEG 50mg加入到活化的叶酸溶液中，用0.1M NaOH溶液调pH值为7，室温磁力搅拌18h，用分子量为3500Da的透析袋透析72h，除去未反应的叶酸，得带有活性基团PEG的SH-PEG-NH2反应溶液；
3) 取金银合金纳米笼250ml加入到步骤2）制备的反应溶液中，搅拌混合均匀，用0.1M NaOH溶液调溶液pH值为9，室温磁力搅拌48h，12000r/min离心30min，得沉淀物；将沉淀物再加入到步骤2）制备的反应溶液中，搅拌混合均匀，用0.1M NaOH溶液调溶液pH值为8，室温磁力搅拌48h，12000r/min离心30min，弃去上清，得沉积物，如此重复3次，将沉积物用超纯水分散，得PEG化的靶向金银合金纳米笼溶液；
4）称取11-巯基烷酸1.6mg溶于乙醇5ml中，加入到步骤3）制备的PEG化的靶向金银合金纳米笼溶液中，室温磁力搅拌24h混合均匀，12000r/min离心30min，弃去上清液，得沉积物，将沉积物用超纯水重新分散；然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐2.7mg、N-羟基琥珀酰亚胺1.6mg，室温搅拌24h，再加入含有40mg的聚乙烯亚胺水溶液5ml，用1.2M稀盐酸调溶液pH值为6.5，室温搅拌24h，12000r/min离心30min，弃去上清，得沉淀，沉淀再重新分散于超纯水中，在12000r/min离心30min，如此重复离心3次，即得靶向金银合金纳米笼基因载体；
5)将上述所制得的靶向金银合金纳米笼基因载体与基因药物以质量比为6×106︰1，将靶向金银合金纳米笼基因载体的水溶液在涡旋的状态下，逐滴加入到基因药物水溶液中，涡旋40s，室温孵育50min，即成靶向金银合金纳米笼的药物递送系统。
实施例3
本发明在具体实施中，可由以下步骤实现：
1）将8mg叶酸、7mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4mg N-羟基琥珀酰亚胺置于20ml pH值为5的PBS缓冲液中，室温磁力搅拌12h，得活化的叶酸溶液；
2）称取带有活性基团的PEG 40mg加入到活化的叶酸溶液中，用0.1M NaOH溶液调pH值为9，室温磁力搅拌18h，用分子量为3500Da的透析袋透析72h，除去未反应的叶酸，得带有活性基团PEG的SH-PEG-NH2反应溶液；
3) 取金银合金纳米笼200ml加入到步骤2）制备的反应溶液中，搅拌混合均匀，用0.1M NaOH溶液调pH值为9，室温磁力搅拌48h，12000r/min离心20min，得沉淀物；将沉淀物再加入到步骤2）制备的反应溶液中，搅拌混合均匀，用0.1M NaOH溶液调溶液pH值为8，室温磁力搅拌48h，12000r/min离心20min，弃去上清，得沉积物，如此重复4次，将沉积物用超纯水分散，得PEG化的靶向金银合金纳米笼溶液；
4）称取巯基丙酸0.8mg溶于乙醇3ml中，加入到步骤3）制备的PEG化的靶向金银合金纳米笼溶液中，室温磁力搅拌24h混合均匀，12000r/min离心30min，弃去上清液，得沉积物，将沉积物用超纯水重新分散；然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐2.7mg、N-羟基琥珀酰亚胺1.6mg，室温搅拌24h，再加入含有30mg的聚乙烯亚胺水溶液4ml，用1.2M稀盐酸调溶液pH值为6.5，室温搅拌24h，12000r/min离心20min，弃去上清，得沉淀，沉淀再重新分散于超纯水中，在12000r/min离心20min，如此重复离心4次，即得靶向金银合金纳米笼基因载体；
5)将上述所制得的靶向金银合金纳米笼基因载体与基因药物以质量比为4×106︰1，将靶向金银合金纳米笼基因载体的水溶液在涡旋的状态下，逐滴加入到基因药物水溶液中，涡旋100s，室温孵育40min，即成靶向金银合金纳米笼的药物递送系统。
实施例4
本发明在具体实施中，可由以下步骤实现：
1）将8mg叶酸、7mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4mg N-羟基琥珀酰亚胺置于20ml pH值为5的PBS缓冲液中，室温磁力搅拌12h，得活化的叶酸溶液；
2）称取带有活性基团的PEG 50mg加入到活化的叶酸溶液中，用0.1M NaOH溶液将调pH值为8，室温磁力搅拌24h，用分子量为3500Da的透析袋透析72h，除去未反应的叶酸，得带有活性基团PEG的SH-PEG-NH2反应溶液；
3) 取金银合金纳米笼200ml加入到步骤2）制备的反应溶液中，搅拌混合均匀，用0.1M NaOH溶液调溶液pH值为9，室温磁力搅拌48h，12000r/min离心15-30min，得沉淀物；将沉淀物再加入到步骤2）制备的反应溶液中，搅拌混合均匀，用0.1M NaOH溶液调溶液pH值为9，室温磁力搅拌48h，12000r/min离心15-30min，弃去上清，得沉积物，如此重复3-5次，将沉积物用超纯水分散，得PEG化的靶向金银合金纳米笼溶液；
4）称取巯基乙酸0.7mg溶于乙醇3ml中，加入到步骤3）制备的PEG化的靶向金银合金纳米笼溶液中，室温磁力搅拌24h混合均匀，12000r/min离心30min，弃去上清液，得沉积物，将沉积物用超纯水重新分散；然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐2.7mg、N-羟基琥珀酰亚胺1.6mg，室温搅拌24h，再加入含有20mg的聚乙烯亚胺水溶液4ml，用1.2M稀盐酸调溶液pH值为6.5，室温搅拌24h，12000r/min离心30min，弃去上清，得沉淀，沉淀再重新分散于超纯水中，在12000r/min离心30min，如此重复离心3次，即得靶向金银合金纳米笼基因载体；
5)将上述所制得的靶向金银合金纳米笼基因载体与基因药物以质量比为5×106︰1，将靶向金银合金纳米笼基因载体的水溶液在涡旋的状态下，逐滴加入到基因药物水溶液中，涡旋60s，室温孵育30min，即成靶向金银合金纳米笼的药物递送系统。
实施例1-4方法制备的靶向金银合金纳米笼的药物递送系统在制备抗肿瘤基因联合热疗药物中的应用。
本发明物理化学稳定性良好，制备条件简单可行，原料来源丰富，成本低，副作用小，能有效负载基因药物，并能够靶向聚集于肿瘤部位，还具有光热转换性能，通过局部激光照射，使肿瘤局部温度升高，能有效抑制肿瘤细胞的增殖，是肿瘤基因与光热联合治疗中基因载体上的创新，并经试验取得了非常满意的有益技术效果，有关资料如下：
本发明的靶向金银合金纳米笼的药物递送系统的制备方法及其基因药物转运系统在肿瘤治疗药物中的应用分为体外和体内两部分：
（1）体内：将本发明的靶向金银合金纳米笼负载基因药物系统水溶液加入到癌细胞A中进行培养，给药后6h后用光源B光照，光照4-8min,继续培养24h，测定癌细胞的存活率。
（2）体外：将本发明的靶向金银合金纳米笼负载基因药物系统水溶液静脉注射到荷瘤小鼠体内，给药后6h后用光源B光照，光照时间为4-8min，测量荷瘤小鼠C的肿瘤体积大小。
癌细胞A为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴茎癌，睾丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。
光源B为：780-1100nm波长的宽波长光源或者激光中的一种。优选808nm激光。
荷瘤小鼠C为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴茎癌，睾丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。
本发明的一种靶向金银合金纳米笼的药物递送系统能够通过叶酸的靶向作用更多的分布到肿瘤中，并且通过PEG长循环能够延长纳米笼在体内的循环时间。局部激光照射肿瘤部位，通过纳米笼的光热转换，使得肿瘤部位温度升高，达到肿瘤热疗与基因治疗的联合应用。
一、本发明的靶向金银合金纳米笼基因递送系统的粒子大小和表面带电量的确定。
本发明中的靶向金银合金纳米笼基因递送系统的粒子大小和表面带电量的确定，使用Nano-ZS90型激光粒度分析仪进行测定，折射率设置为1.590，吸收系数设置为0.010，温度设置为25℃，测量模式设置为自动，以Z平均统计值作为测定结果。每一水平缩合体均配制3份，每份测量一次，取三次测量值的平均值作为测量结果。介电常数设置为79，黏度系数设置为0.8872，温度设置为25℃，测量模式设置为自动。每一水平缩合体均配制3份，每份测量一次，取三次测量值的平均值作为测量结果。测得的结果是粒径为100nm-200nm，电位是(+1mV)-(+10mV)。
二、本发明中的靶向金银合金纳米笼基因递送系统的抗酶切能力和稳定性考察
将本发明中的靶向金银合金纳米笼基因递送系统的水溶液，（1）加入适量的1U/μl的肝素钠溶液，室温孵育30min后，做琼脂糖凝胶电泳；（2）加入适量的基因降解酶，室温孵育1h后，用0.1%的SDS使酶失活后再加入适量的1U/μl的肝素钠，室温孵育30min；（3）单纯的基因药物和与酶室温孵育1h组作为对照来考察制剂包封基因药物的效果。
将制备好的本发明中的靶向金银合金纳米笼基因递送系统加入到10%的血清溶液中，室温孵育1h、6h和12h，通过考察该体系在不同时间点的粒径和电位变化来分析其在血清中的稳定性。
结果显示本发明的靶向金银合金纳米笼基因递送系统能够有效的保护基因药物不被降解，并且具有较好的血清稳定性。
三、本发明中的靶向金银合金纳米笼基因递送系统体外细胞摄取实验
本发明的靶向金银合金纳米笼基因递送系统的体外细胞摄取实验：将肝癌细胞SMMC-7721（由上海细胞库提供）作为待考察的癌细胞。铺板前24h用含青霉素（100U/mL）、链霉素（100μg/mL）和10％胎牛血清的叶酸缺陷型 RPMI-1640培养基培养细胞，次日通过爬片方式接种于12孔板中，每孔1mL， 1×105个细胞/孔，置于培养箱中常规培养。培养24h后（细胞融合度达到50-70％），弃去孔中培养基，用PBS洗3遍，将配置好的药物加入对应孔中。实验设立空白对照组、靶向金银合金纳米笼基因递送系统组和非靶向金银合金纳米笼基因递送系统组放入培养箱中继续培养。分别在加药1h、2h、4h及6h后取出 12孔板，用预冷的 PBS洗 3 次，加入细胞固定液（4%多聚甲醛）0.5 mL，室温，避光固定 10 min。弃去细胞固定液，再加入DAPI细胞核染色液染色0.5 ml，37℃ 中避光染色7 -15min。染色结束后，加入预冷PBS洗 3 遍。用抗荧光猝灭液封片。放于倒置荧光显微镜下观察细胞摄取情况。
实验证明，叶酸靶向金银合金纳米笼基因递送系统组的细胞摄取能力要明显高于非靶向金银合金纳米笼基因递送系统组。
四、本发明的靶向金银合金纳米笼基因递送系统体外细胞抑制率实验
通过光照射药物转运系统在体外细胞抑制率实验：将 SMMC-7721肝癌细胞（由上海细胞库提供）用作待考察的癌细胞。铺板前24h用含青霉素（100U/mL）、链霉素（100μg/mL）和10％胎牛血清的叶酸缺陷型 RPMI-1640培养基培养细胞，次日将SMMC-7721细胞接种于96 孔细胞培养板中，细胞密度为6000个/孔（100 µL），置于培养箱中常规培养。培养24h后，弃去孔中培养基，用PBS洗3遍，与miRNA以20:1，稀释后等体积混合室温孵育15min，用上述培养基稀释，将基因药物的工作浓度为80nM（100µL/孔）。将培养板置培养箱中分别孵育至6h时，光照组放在808nm激光仪下照射8min，其中照射功率设置为1.5W/cm2,继续孵育24h、48h。孵育结束后，每孔加入 20μL 的 MTT 溶液（5.0 mg/mL），继续培养4 h。待生成紫色甲瓒结晶后，弃去上清， 每孔加入150μL 的 DMSO。水平振摇 10 min，使生成的结晶完全溶解。酶标仪于 490 nm 波长下测量每孔吸光度值，按以下公式计算细胞抑制率。
抑制率% =（给药组OD值–调零组OD值）/（空白对照组OD值–调零组OD值×100% ）
实验结果表明基因与热疗联用时（联合治疗的细胞抑制率为82.74±5.61%）比单独治疗（单独基因治疗和单独光热治疗的细胞抑制率分别为46.51±1.92%、35.37±2.95%）表现出较强的细胞抑制作用， 而且叶酸修饰的叶酸靶向金银合金纳米笼基因递送系统组的细胞抑制率约为非靶向金银合金纳米笼基因递送系统组细胞抑制率的1.2倍。空白细胞激光照射后几乎没有细胞抑制作用，未负载基因的载体组显示出较低的细胞毒性。
五、本发明的靶向金银合金纳米笼基因递送系统体内抗肿瘤活性测定。
用0.25%胰酶消化并收集取对数生长期的SMMC-7721细胞， 1000rpm离心5min弃上清，用PBS重悬，反复2次。用PBS重悬后调整细胞浓度为4×107个/ml，低温放置准备接种，用75%的酒精棉球在裸鼠背部右上侧消毒，重悬细胞，用1ml的无菌注射器分别每只裸鼠背部皮下接种细胞悬液150μL。注射完毕后将注射器针头翻转后慢慢拔出，并用干棉球按压针孔处，以防细胞悬液外漏。共接种46只。隔日称量小鼠体重并测量肿瘤的最大直径（A，单位mm）和最小直径（B，单位mm），计算肿瘤体积（Tumor volume）：V =（A×B2）/2。
接种5-6d可见接种部位皮下长出可触及的硬结，根据肿瘤体积公式计算，当肿瘤体积达到50±10 mm3时，视移植瘤造模成功。根据实验要求剔除不符合要求的荷瘤裸鼠，待瘤体积达到100-150mm3时将符合条件的荷瘤裸鼠进行随机分组并开始治疗。实验具体分组如下：（1）对照组（生理盐水组）；（2）生理盐水加激光组；（3)靶向金银合金纳米笼基因载体组；（4）靶向金银合金纳米笼基因载体加激光组；（5）非靶向金银合金纳米笼基因递送系统组；（6）靶向金银合金纳米笼基因递送系统组；（7）非靶向金银合金纳米笼基因递送系统加激光组；（8）靶向金银合金纳米笼基因递送系统加激光组。八组均采用尾静脉注射的方式给药。其中，光照组使用的光源为808近红外光源，照射功率为1.0-2.0W，给药6h后激光照射肿瘤部位，一次照射时间为3-10min。每2d给药一次，每次注射生理盐水或者药物溶液2.5mg/kg的制剂溶液200μl，共给药6次。整个实验过程中每日观察小鼠生活状态，每2d称其体重并使用游标卡尺测量小鼠肉瘤的长径(A)与短径(B)，按公式肿瘤体积V =（A×B2 ）/2计算肿瘤体积。
实验表明靶向金银合金纳米笼的药物递送系统联合热疗可以明显抑制小鼠肿瘤增长，与现有技术相比，具有以下突出的有益技术效果：
（1）本发明靶向金银合金纳米笼基因递送系统其水溶液分散性强，物理化学稳定性好，对生物体的毒性很低，制备条件简单可行，原料来源丰富，成本低，成本可降低30-50%；
（2）本发明靶向金银合金纳米笼的药物递送系统可以作为肿瘤基因治疗的一种良好载体，能够有效的包载基因药物。实验结果表明无论是体外还是体内，在联合热疗的情况下该基因递送系统可以明显抑制肿瘤细胞以及肿瘤组织的发生和发展，抑制率提高50%。
（3）本发明靶向金银合金纳米笼的药物递送系统以叶酸作为靶向性分子，能够有效的携载基因药物靶向肿瘤部位，增加在肿瘤部位的浓度，减少了对正常细胞的毒性，可以作为一种良好的抗肿瘤基因药物的载体，具有毒性极小，水溶性较强，生物相容性好，比表面积大，化学惰性高且结合激光照射可发挥更好的抗肿瘤效果，抗肿瘤效果提高50%，有巨大的经济和社会效益。
Claims (9)
1.一种靶向金银合金纳米笼的药物递送系统，其特征在于，该系统是由靶向金银合金纳米笼基因载体负载基因药物形成的药物转运系统，其中，靶向金银合金纳米笼基因载体和基因药物的质量比为（1~12）×106：1，所述的金银合金纳米笼基因载体是将靶向肿瘤分子叶酸和阳离子聚合物聚乙烯亚胺以化学键和静电作用的方式连接在金银合金纳米笼的表面构成；
所述靶向金银合金纳米笼的药物递送系统的制备方法，包括以下步骤：
1）将8~10mg叶酸、7~8mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4~5mg N-羟基琥珀酰亚胺置于20ml pH值为4~7的PBS缓冲液中，室温磁力搅拌2~12h，得活化的叶酸溶液；
2）称取带有活性基团的PEG 40~60mg加入到活化的叶酸溶液中，用0.1MNaOH溶液调pH值为7~9，室温磁力搅拌12~24h，用分子量为3500Da的透析袋透析48~72h，除去未反应的叶酸，得带有活性基团PEG的SH-PEG-NH2反应溶液；
3)取金银合金纳米笼200~300ml加入到步骤2）制备的反应溶液中，搅拌混合均匀，用0.1MNaOH溶液调溶液pH值为7~9，室温磁力搅拌4~48h，12000r/min离心15~30min，得沉淀物；将沉淀物再加入到步骤2）制备的反应溶液中，搅拌混合均匀，用0.1MNaOH溶液调溶液pH值为7~9，室温磁力搅拌4~48h，12000r/min离心15~30min，弃去上清，得沉积物，如此重复3~5次，将沉积物用超纯水分散，得PEG化的靶向金银合金纳米笼溶液；
4）称取含有巯基的小分子化合物1~5mg溶于乙醇2~10ml中，加入到步骤3）制备的PEG化的靶向金银合金纳米笼溶液中，室温磁力搅拌4~24h混合均匀，8000~12000r/min离心15~30min，弃去上清液，得沉积物，将沉积物用超纯水重新分散；然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐2~5mg、N-羟基琥珀酰亚胺1~4mg，室温搅拌4~24h，再加入含有20~60mg的聚乙烯亚胺水溶液2~8ml，用1.2M稀盐酸调溶液pH值为6~7，室温搅拌0.5~24h，12000r/min离心15~30min，弃去上清，得沉淀，沉淀再重新分散于超纯水中，在12000r/min离心15~30min，如此重复离心3~5次，即得靶向金银合金纳米笼基因载体；
所述的巯基小分子化合物是11- 巯基烷酸、硫辛酸、巯基乙酸、巯基丙酸中的一种；
5)将上述所制得的靶向金银合金纳米笼基因载体与基因药物以质量比为（1~12）×106︰1，将靶向金银合金纳米笼基因载体的水溶液在涡旋的状态下，逐滴加入到基因药物水溶液中，涡旋30~120s，室温孵育30~60min，即成靶向金银合金纳米笼的药物递送系统。
2.根据权利要求1所述的靶向金银合金纳米笼的药物递送系统，其特征在于，所述的聚乙烯亚胺为Mw25000的bPEI、Mw25000的LPEI或Mw1800的bPEI中的一种；所述的基因药物为质粒DNA、siRNA、microRNA或lncRNA中的一种；所述的靶向金银合金纳米笼的粒径为50~150nm。
3.权利要求1或2所述的靶向金银合金纳米笼的药物递送系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将8~10mg叶酸、7~8mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4~5mg N-羟基琥珀酰亚胺置于20ml pH值为4~7的PBS缓冲液中，室温磁力搅拌2~12h，得活化的叶酸溶液；
2）称取带有活性基团的PEG 40~60mg加入到活化的叶酸溶液中，用0.1MNaOH溶液调pH值为7~9，室温磁力搅拌12~24h，用分子量为3500Da的透析袋透析48~72h，除去未反应的叶酸，得带有活性基团PEG的SH-PEG-NH2反应溶液；
3)取金银合金纳米笼200~300ml加入到步骤2）制备的反应溶液中，搅拌混合均匀，用0.1MNaOH溶液调溶液pH值为7~9，室温磁力搅拌4~48h，12000r/min离心15~30min，得沉淀物；将沉淀物再加入到步骤2）制备的反应溶液中，搅拌混合均匀，用0.1MNaOH溶液调溶液pH值为7~9，室温磁力搅拌4~48h，12000r/min离心15~30min，弃去上清，得沉积物，如此重复3~5次，将沉积物用超纯水分散，得PEG化的靶向金银合金纳米笼溶液；
4）称取含有巯基的小分子化合物1~5mg溶于乙醇2~10ml中，加入到步骤3）制备的PEG化的靶向金银合金纳米笼溶液中，室温磁力搅拌4~24h混合均匀，8000~12000r/min离心15~30min，弃去上清液，得沉积物，将沉积物用超纯水重新分散；然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐2~5mg、N-羟基琥珀酰亚胺1~4mg，室温搅拌4~24h，再加入含有20~60mg的聚乙烯亚胺水溶液2~8ml，用1.2M稀盐酸调溶液pH值为6~7，室温搅拌0.5~24h，12000r/min离心15~30min，弃去上清，得沉淀，沉淀再重新分散于超纯水中，在12000r/min离心15~30min，如此重复离心3~5次，即得靶向金银合金纳米笼基因载体；
所述的巯基小分子化合物是11- 巯基烷酸、硫辛酸、巯基乙酸、巯基丙酸中的一种；
5)将上述所制得的靶向金银合金纳米笼基因载体与基因药物以质量比为（1~12）×106︰1，将靶向金银合金纳米笼基因载体的水溶液在涡旋的状态下，逐滴加入到基因药物水溶液中，涡旋30~120s，室温孵育30~60min，即成靶向金银合金纳米笼的药物递送系统。
4.根据权利要求3所述的靶向金银合金纳米笼的药物递送系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将10mg叶酸、8mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、5mg N-羟基琥珀酰亚胺置于20ml pH值为5的PBS缓冲液中，室温磁力搅拌12h，得活化的叶酸溶液；
2）称取带有活性基团的PEG 60mg加入到活化的叶酸溶液中，用0.1MNaOH溶液调pH值为8，室温磁力搅拌18h，用分子量为3500Da的透析袋透析72h，除去未反应的叶酸，得带有活性基团PEG的SH-PEG-NH2反应溶液；
3)取金银合金纳米笼300ml加入到步骤2）制备的反应溶液中，搅拌混合均匀，用0.1MNaOH溶液调溶液pH值为9，室温磁力搅拌48h，12000r/min离心15~30min，得沉淀物；将沉淀物再加入到步骤2）制备的反应溶液中，搅拌混合均匀，用0.1MNaOH溶液调溶液pH值为8，室温磁力搅拌48h，12000r/min离心15~30min，弃去上清，得沉积物，如此重复3~5次，将沉积物用超纯水分散，得PEG化的靶向金银合金纳米笼溶液；
4）称取硫辛酸1.5mg溶于乙醇5ml中，加入到步骤3）制备的PEG化的靶向金银合金纳米笼溶液中，室温磁力搅拌24h混合均匀，8000~12000r/min离心30min，弃去上清液，得沉积物，将沉积物用超纯水重新分散；然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐2.7mg、N-羟基琥珀酰亚胺1.6mg，室温搅拌24h，再加入含有50mg的聚乙烯亚胺水溶液5ml，用1.2M稀盐酸调溶液pH值为6.5，室温搅拌24h，12000r/min离心15~30min，弃去上清，得沉淀，沉淀再重新分散于超纯水中，在12000r/min离心15~30min，如此重复离心3次，即得靶向金银合金纳米笼基因载体；
5)将上述所制得的靶向金银合金纳米笼基因载体与基因药物以质量比为9×106︰1，将靶向金银合金纳米笼基因载体的水溶液在涡旋的状态下，逐滴加入到基因药物水溶液中，涡旋60s，室温孵育30min，即成靶向金银合金纳米笼的药物递送系统。
5.根据权利要求3所述的靶向金银合金纳米笼的药物递送系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将9mg叶酸、7.5mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4.5mg N-羟基琥珀酰亚胺置于20ml pH值为5的PBS缓冲液中，室温磁力搅拌12h，得活化的叶酸溶液；
2）称取带有活性基团的PEG 50mg加入到活化的叶酸溶液中，用0.1MNaOH溶液调pH值为7，室温磁力搅拌18h，用分子量为3500Da的透析袋透析72h，除去未反应的叶酸，得带有活性基团PEG的SH-PEG-NH2反应溶液；
3)取金银合金纳米笼250ml加入到步骤2）制备的反应溶液中，搅拌混合均匀，用0.1MNaOH溶液调溶液pH值为9，室温磁力搅拌48h，12000r/min离心30min，得沉淀物；将沉淀物再加入到步骤2）制备的反应溶液中，搅拌混合均匀，用0.1MNaOH溶液调溶液pH值为8，室温磁力搅拌48h，12000r/min离心30min，弃去上清，得沉积物，如此重复3次，将沉积物用超纯水分散，得PEG化的靶向金银合金纳米笼溶液；
4）称取11-巯基烷酸1.6mg溶于乙醇5ml中，加入到步骤3）制备的PEG化的靶向金银合金纳米笼溶液中，室温磁力搅拌24h混合均匀，12000r/min离心30min，弃去上清液，得沉积物，将沉积物用超纯水重新分散；然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐2.7mg、N-羟基琥珀酰亚胺1.6mg，室温搅拌24h，再加入含有40mg的聚乙烯亚胺水溶液5ml，用1.2M稀盐酸调溶液pH值为6.5，室温搅拌24h，12000r/min离心30min，弃去上清，得沉淀，沉淀再重新分散于超纯水中，在12000r/min离心30min，如此重复离心3次，即得靶向金银合金纳米笼基因载体；
5)将上述所制得的靶向金银合金纳米笼基因载体与基因药物以质量比为6×106︰1，将靶向金银合金纳米笼基因载体的水溶液在涡旋的状态下，逐滴加入到基因药物水溶液中，涡旋40s，室温孵育50min，即成靶向金银合金纳米笼的药物递送系统。
6.根据权利要求3所述的靶向金银合金纳米笼的药物递送系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将8mg叶酸、7mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4mg N-羟基琥珀酰亚胺置于20ml pH值为5的PBS缓冲液中，室温磁力搅拌12h，得活化的叶酸溶液；
2）称取带有活性基团的PEG 40mg加入到活化的叶酸溶液中，用0.1MNaOH溶液调pH值为9，室温磁力搅拌18h，用分子量为3500Da的透析袋透析72h，除去未反应的叶酸，得带有活性基团PEG的SH-PEG-NH2反应溶液；
3)取金银合金纳米笼200ml加入到步骤2）制备的反应溶液中，搅拌混合均匀，用0.1MNaOH溶液调pH值为9，室温磁力搅拌48h，12000r/min离心20min，得沉淀物；将沉淀物再加入到步骤2）制备的反应溶液中，搅拌混合均匀，用0.1MNaOH溶液调溶液pH值为8，室温磁力搅拌48h，12000r/min离心20min，弃去上清，得沉积物，如此重复4次，将沉积物用超纯水分散，得PEG化的靶向金银合金纳米笼溶液；
4）称取巯基丙酸0.8mg溶于乙醇3ml中，加入到步骤3）制备的PEG化的靶向金银合金纳米笼溶液中，室温磁力搅拌24h混合均匀，12000r/min离心30min，弃去上清液，得沉积物，将沉积物用超纯水重新分散；然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐2.7mg、N-羟基琥珀酰亚胺1.6mg，室温搅拌24h，再加入含有30mg的聚乙烯亚胺水溶液4ml，用1.2M稀盐酸调溶液pH值为6.5，室温搅拌24h，12000r/min离心20min，弃去上清，得沉淀，沉淀再重新分散于超纯水中，在12000r/min离心20min，如此重复离心4次，即得靶向金银合金纳米笼基因载体；
5)将上述所制得的靶向金银合金纳米笼基因载体与基因药物以质量比为4×106︰1，将靶向金银合金纳米笼基因载体的水溶液在涡旋的状态下，逐滴加入到基因药物水溶液中，涡旋100s，室温孵育40min，即成靶向金银合金纳米笼的药物递送系统。
7.根据权利要求3所述的靶向金银合金纳米笼的药物递送系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将8mg叶酸、7mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4mg N-羟基琥珀酰亚胺置于20ml pH值为5的PBS缓冲液中，室温磁力搅拌12h，得活化的叶酸溶液；
2）称取带有活性基团的PEG 50mg加入到活化的叶酸溶液中，用0.1MNaOH溶液将调pH值为8，室温磁力搅拌24h，用分子量为3500Da的透析袋透析72h，除去未反应的叶酸，得带有活性基团PEG的SH-PEG-NH2反应溶液；
3)取金银合金纳米笼200ml加入到步骤2）制备的反应溶液中，搅拌混合均匀，用0.1MNaOH溶液调溶液pH值为9，室温磁力搅拌48h，12000r/min离心15~30min，得沉淀物；将沉淀物再加入到步骤2）制备的反应溶液中，搅拌混合均匀，用0.1MNaOH溶液调溶液pH值为9，室温磁力搅拌48h，12000r/min离心15~30min，弃去上清，得沉积物，如此重复3~5次，将沉积物用超纯水分散，得PEG化的靶向金银合金纳米笼溶液；
4）称取巯基乙酸0.7mg溶于乙醇3ml中，加入到步骤3）制备的PEG化的靶向金银合金纳米笼溶液中，室温磁力搅拌24h混合均匀，12000r/min离心30min，弃去上清液，得沉积物，将沉积物用超纯水重新分散；然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐2.7mg、N-羟基琥珀酰亚胺1.6mg，室温搅拌24h，再加入含有20mg的聚乙烯亚胺水溶液4ml，用1.2M稀盐酸调溶液pH值为6.5，室温搅拌24h，12000r/min离心30min，弃去上清，得沉淀，沉淀再重新分散于超纯水中，在12000r/min离心30min，如此重复离心3次，即得靶向金银合金纳米笼基因载体；
5)将上述所制得的靶向金银合金纳米笼基因载体与基因药物以质量比为5×106︰1，将靶向金银合金纳米笼基因载体的水溶液在涡旋的状态下，逐滴加入到基因药物水溶液中，涡旋60s，室温孵育30min，即成靶向金银合金纳米笼的药物递送系统。
8.权利要求3所述的靶向金银合金纳米笼的药物递送系统的制备方法，其特征在于，靶向金银合金纳米笼的药物递送系统的粒径为100nm~200nm，电位为(+1mV)~(+10mV)。
9.权利要求1所述的靶向金银合金纳米笼的药物递送系统在制备抗肿瘤基因联合热疗药物中的应用。
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2015
- 2015-09-06 CN CN201510558557.1A patent/CN105126121B/zh not_active Expired - Fee Related
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Also Published As
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