CN104758930B - 一种基于磁性氧化石墨烯原位凝胶的制备方法及其应用 - Google Patents
一种基于磁性氧化石墨烯原位凝胶的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基于磁性氧化石墨烯原位凝胶的制备方法及其应用，有效解决磁性氧化石墨烯原位凝胶作为磁性热疗介质和药物转运载体在肿瘤治疗中的应用，方法是，基于磁性氧化石墨烯的原位凝胶作为药物载体系统是由负载药物的磁性氧化石墨烯和壳聚糖/β‑甘油磷酸钠凝胶混合制成，负载药物的磁性氧化石墨烯和壳聚糖/β‑甘油磷酸钠凝胶的体积比为1‑3:1，在原始的氧化石墨烯负载上铁氧化物的基础上，利用缩合反应，将氧化石墨烯表面连接上反应活性较强的大分子聚合物聚乙烯亚胺，生成水溶性磁性载体，最终将此载体与壳聚糖原位凝胶混合，制备成磁性氧化石墨烯原位凝胶，本发明原料来源丰富，成本低，质量好，靶向性强，使用效果好，是肿瘤治疗药物上的一大创新。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域,特别是一种基于磁性氧化石墨烯原位凝胶的制备方法及其应用。
背景技术
氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)为单层的氧化石墨，因其具有大量的sp2碳原子，比表面积大，所以通过π-π共轭、静电作用等非共价键作用能有效地将化学药物、DNA、RNA等固定在氧化石墨烯上。GO拥有良好的生物相容性及跨膜能力因而被作为药物载体广泛用于医药领域。但其在生理盐水和磷酸盐缓冲液中迅速聚沉，使其不能直接应用于医药生物领域，已知对其进行功能化修饰可降低毒性，因此氧化石墨烯的表面修饰是十分必要的。聚乙烯亚胺(Polyethylene imine,PEI)是一种生物相容性较好的水溶性高分子材料，带有较强的正电荷，对细胞膜具有较强的吸附能力。PEI化学反应活性非常高，已被广泛应用于基因药物和化学药物转运系统。
原位凝胶是智能水凝胶的一种，它能够感知周围环境温度的变化并作出响应，主要表现为体积的变化。在用于药物缓控释中时可以通过改变温敏水凝胶的温度使其产生相应的体积变化进而控制药物释放。而磁性纳米材料的发展则为在体外控制温敏水凝胶的温度提供了可行的方法。磁纳米靶向性肿瘤热疗技术是一种新兴的肿瘤热疗方法。与传统肿瘤治疗方式相比，磁纳米靶向性肿瘤热疗具有靶向性好、温控性强的优点，而且磁介质导入后可重复多次进行治疗，治疗过程为无创或微创。通常所用的磁性材料有铁、铁氧化物和钴、镍及其混合氧化物等。磁性纳米粒子粒径小，具有磁导向性，生物相容性和生物降解性良好，可在外加磁场的作用下定向移动到目标位置，同时也便于分离。利用这些特性，磁性纳米粒子可应用于药物载体、疾病诊断、磁靶向热疗、细胞分离纯化、磁性转染等方面。磁性纳米载体己广泛用于肿瘤的诊断与治疗、药物载体及生物样品的分离与纯化等方面，被认为是最有潜力的材料之一。
目前，将磁性氧化石墨烯表面接枝一种高分子水溶性聚合物-聚乙烯亚胺，并制备成一种原位凝胶，以及其作为磁性热疗介质和药物转运载体在制备治疗肿瘤药物中的应用还未见有报道。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种基于磁性氧化石墨烯原位凝胶的制备方法及其应用，可有效解决磁性氧化石墨烯原位凝胶作为磁性热疗介质和药物转运载体在肿瘤治疗中的应用。
本发明解决的技术方案是：基于磁性氧化石墨烯的原位凝胶作为药物载体系统是由负载药物的磁性氧化石墨烯和壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶混合制成，负载药物的磁性氧化石墨烯和壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶的体积比为1-3:1，一种磁性氧化石墨烯-聚乙烯亚胺聚合物，它是在原始的氧化石墨烯负载上铁氧化物的基础上，利用缩合反应，将氧化石墨烯表面连接上反应活性较强的大分子聚合物聚乙烯亚胺，生成水溶性磁性载体，最终将此载体与壳聚糖原位凝胶混合，制备成一种磁性氧化石墨烯原位凝胶，具体由以下步骤实现：
1)制备磁性氧化石墨烯：称取氧化石墨烯(GO)20-40mg溶于乙二醇与二乙二醇混合溶液20-40ml中，搅拌均匀，乙二醇与二乙二醇的体积比为1:19，再超声30min，然后在磁力搅拌下，依次加入醋酸钠200-450mg、六水合氯化铁(FeCl3·6H2O)100-300mg，形成均匀黄色的悬浮液，将悬浮液置于反应釜中，200℃反应10h，再3000r/min将悬浮液离心5min，得沉淀物，沉淀物依次用无水乙醇100-300ml、超纯水100-450ml离心洗涤10-20次后，将沉淀物真空干燥12-48h，即得磁性氧化石墨烯(GO-IONP)；
2)制备聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯(GO-IONP-PEI)：称取磁性氧化石墨烯(GO-IONP)20-40mg溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)20-40ml中，搅拌，超声30min，使之分散均匀；依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)100-200mg、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)50-117mg、分子量10K的聚乙烯亚胺(PEI)100-400mg，搅拌72h，用0.22μm微孔滤膜抽滤，得滤饼，滤饼用超纯水200-500ml反复洗涤10次，40-60℃真空干燥12-48h，即得聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯(GO-IONP-PEI)；
3)制备负载盐酸阿霉素的聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯：
称取聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯(GO-IONP-PEI)5-20mg溶于超纯水5-20ml中，再加入抗肿瘤药物盐酸阿霉素10-40mg，超声2-4h，即得负载盐酸阿霉素的聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯(GO-IONP-PEI/DOX)；
4)制备CS/β-GP凝胶溶液：称取脱乙酰度90％、分子量50K的壳聚糖(CS)50-170mg溶于0.1mol/L HCl 2-20ml中，磁力搅拌至澄清，配制成A液；将β-甘油磷酸钠(β-GP)200-700mg溶于超纯水0.5-2ml中，配制成B液，将B液滴加至冰浴搅拌中的A液中，冰浴搅拌10min，即得CS/β-GP凝胶溶液；
5)制备凝胶溶液：室温下，将负载盐酸阿霉素的聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯按体积比1-3:1滴加入CS/β-GP凝胶溶液，并搅拌均匀，即得负载盐酸阿霉素的磁性氧化石墨烯壳聚糖凝胶溶液。
本发明的磁性氧化石墨烯原位凝胶作为磁热介质进行磁热治疗体内浅表肿瘤，当交变磁场加热程度无法达到热疗要求时，可通过调节磁场频率、电流、运行时间的方法改善磁热升温范围进行肿瘤的治疗。采用瘤内注射的方法给药,可以将更多的药物分布在肿瘤组织中，与正常组织相比，它可以将药物转运载体长时间地保留在肿瘤组织中，当使用交变磁场时能够控制肿瘤组织中温敏原位凝胶的温度并使其装载的药物在肿瘤部位浓度提高。本发明的原料来源丰富，成本低，质量好，靶向性强，使用效果好，是肿瘤治疗药物上的一大创新。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。
实施例1
本发明方法在具体实施中，由以下步骤实现：
1)制备磁性氧化石墨烯：称取氧化石墨烯20mg溶于乙二醇与二乙二醇混合溶液20ml中，搅拌均匀，乙二醇与二乙二醇的体积比为1:19，再超声30min，然后在磁力搅拌下，依次加入醋酸钠300mg、六水合氯化铁108mg，形成均匀黄色的悬浮液，将悬浮液置于反应釜中，200℃反应10h，再3000r/min将悬浮液离心5min，得沉淀物，沉淀物依次用无水乙醇200ml、超纯水300ml离心洗涤20次后，将沉淀物真空干燥12h，即得磁性氧化石墨烯；
2)制备聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯：称取磁性氧化石墨烯30mg溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液30ml中，搅拌，超声30min，使之分散均匀；依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐120mg、N-羟基丁二酰亚胺70mg、分子量10K的聚乙烯亚胺200mg，搅拌72h，用0.22μm微孔滤膜抽滤，得滤饼，滤饼用超纯水300ml反复洗涤10次，60℃真空干燥24h，即得聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯；
3)制备负载盐酸阿霉素的聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯：称取聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯5mg溶于超纯水5ml中，再加入抗肿瘤药物盐酸阿霉素10mg，超声3h，即得负载盐酸阿霉素的聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯；
4)制备CS/β-GP凝胶溶液：称取脱乙酰度90％、分子量50K的壳聚糖85mg溶于0.1mol/L HCl 4.5ml中，磁力搅拌至澄清，配制成A液；将β-甘油磷酸钠250mg溶于超纯水1ml中，配制成B液，将B液滴加至冰浴搅拌中的A液中，冰浴搅拌10min，即得CS/β-GP凝胶溶液；
5)制备凝胶溶液：室温下，将负载盐酸阿霉素的聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯按体积比1:1滴加入CS/β-GP凝胶溶液，并搅拌均匀，即得负载盐酸阿霉素的磁性氧化石墨烯壳聚糖凝胶溶液。
实施例2
本发明方法在具体实施中，由以下步骤实现：
1)制备磁性氧化石墨烯：称取氧化石墨烯30mg溶于乙二醇与二乙二醇混合溶液30ml中，搅拌均匀，乙二醇与二乙二醇的体积比为1:19，再超声30min，然后在磁力搅拌下，依次加入醋酸钠450mg、六水合氯化铁300mg，形成均匀黄色的悬浮液，将悬浮液置于反应釜中，200℃反应10h，再3000r/min将悬浮液离心5min，得沉淀物，沉淀物依次用无水乙醇300ml、超纯水450ml离心洗涤20次后，将沉淀物真空干燥12h，即得磁性氧化石墨烯；
2)制备聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯：称取磁性氧化石墨烯40mg溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液40ml中，搅拌，超声30min，使之分散均匀；依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐200mg、N-羟基丁二酰亚胺117mg、分子量10K的聚乙烯亚胺333mg，搅拌72h，用0.22μm微孔滤膜抽滤，得滤饼，滤饼用超纯水500ml反复洗涤10次，60℃真空干燥24h，即得聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯；
3)制备负载盐酸阿霉素的聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯：称取聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯5mg溶于超纯水5ml中，再加入抗肿瘤药物盐酸阿霉素10mg，超声2-4h，即得负载盐酸阿霉素的聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯；
4)制备CS/β-GP凝胶溶液：称取脱乙酰度90％、分子量50K的壳聚糖85mg溶于0.1mol/L HCl 4.5ml中，磁力搅拌至澄清，配制成A液；将β-甘油磷酸钠300mg溶于超纯水2ml中，配制成B液，将B液滴加至冰浴搅拌中的A液中，冰浴搅拌10min，即得CS/β-GP凝胶溶液；
5)制备凝胶溶液：室温下，将负载盐酸阿霉素的聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯按体积比1:1滴加入CS/β-GP凝胶溶液，并搅拌均匀，即得负载盐酸阿霉素的磁性氧化石墨烯壳聚糖凝胶溶液。
实施例3
本发明方法在具体实施中，由以下步骤实现：
1)制备磁性氧化石墨烯：称取氧化石墨烯40mg溶于乙二醇与二乙二醇混合溶液40ml中，搅拌均匀，乙二醇与二乙二醇的体积比为1:19，再超声30min，然后在磁力搅拌下，依次加入醋酸钠400mg、六水合氯化铁300mg，形成均匀黄色的悬浮液，将悬浮液置于反应釜中，200℃反应10h，再3000r/min将悬浮液离心5min，得沉淀物，沉淀物依次用无水乙醇200ml、超纯水300ml离心洗涤20次后，将沉淀物真空干燥24h，即得磁性氧化石墨烯；
2)制备聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯(GO-IONP-PEI)：称取磁性氧化石墨烯30mg溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液30ml中，搅拌，超声30min，使之分散均匀；依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐120mg、N-羟基丁二酰亚胺70mg、分子量10K的聚乙烯亚胺200mg，搅拌72h，用0.22μm微孔滤膜抽滤，得滤饼，滤饼用超纯水300ml反复洗涤10次，60℃真空干燥24h，即得聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯；
3)制备负载盐酸阿霉素的聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯：称取聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯10mg溶于超纯水10ml中，再加入抗肿瘤药物盐酸阿霉素20mg，超声3h，即得负载盐酸阿霉素的聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯；
4)制备CS/β-GP凝胶溶液：称取脱乙酰度90％、分子量50K的壳聚糖170mg溶于0.1mol/L HCl 19ml中，磁力搅拌至澄清，配制成A液；将β-甘油磷酸钠(β-GP)700mg溶于超纯水2ml中，配制成B液，将B液滴加至冰浴搅拌中的A液中，冰浴搅拌10min，即得CS/β-GP凝胶溶液；
5)制备凝胶溶液：室温下，将负载盐酸阿霉素的聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯按体积比2:1滴加入CS/β-GP凝胶溶液，并搅拌均匀，即得负载盐酸阿霉素的磁性氧化石墨烯壳聚糖凝胶溶液。
所述步骤2)制备的聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯复合物的粒径为200-300nm。
上述方法所制备的基于磁性氧化石墨烯原位凝胶在制备抗肿瘤磁热介质中的应用。
上述方法所制备的基于磁性氧化石墨烯原位凝胶在制备抗肿瘤药物载体中的应用。
上述制备的基于磁性氧化石墨烯原位凝胶可有效用于肿瘤的治疗，实现作为磁性热疗介质和药物转运载体在制备治疗肿瘤药物中的应用，其应用分为体外和体内两部分：
1)体外：将制得的负载盐酸阿霉素的磁性氧化石墨烯壳聚糖凝胶溶液，加入到癌细胞中进行培养，给药后4h后用交变磁场加热，频率为482KHz，电流20A，时间为10～20min，继续培养24h，测定癌细胞的存活率。
2)体内：将制得的负载阿霉素的磁性氧化石墨烯原位凝胶，瘤内注射到荷瘤小鼠瘤内，给药后4h后用交变磁场加热，频率为482KHz，电流20A，时间为10～20min，测量荷瘤小鼠的肿瘤体积大小。
上述步骤中的抗肿瘤药物为：难溶性抗肿瘤药物、水溶性药物和核酸药物，比如：多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、顺铂、卡铂、柔红霉素、寡义反核苷酸、小干扰RNA和酶类药物中的一种或几种。
上述步骤中的癌细胞为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴茎癌，睾丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。
上述步骤中的荷瘤小鼠为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴茎癌，睾丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。
本发明的磁性氧化石墨烯原位凝胶作为磁热介质来进行磁热治疗体内浅表肿瘤时，当交变磁场加热程度无法达到热疗要求时，可以通过调节磁场频率、电流、运行时间的方法来改善磁热升温范围进行肿瘤的治疗。
本发明的磁性氧化石墨烯原位凝胶作为药物转运载体采用瘤内注射的方法给药,可以将更多的药物分布在肿瘤组织中，与正常组织相比，它可以将药物转运载体长时间地保留在肿瘤组织中，当使用交变磁场时能够控制肿瘤组织中温敏原位凝胶的温度并使其装载的药物在肿瘤部位浓度提高。本发明制备的基于磁性氧化石墨烯原位凝胶经试验，取得了非常满意的有益技术效果，有关试验资料如下：
一、使用交变磁场照射本发明磁性氧化石墨烯对肿瘤细胞生长的抑制活性的测定
将MCF-7乳腺癌细胞(由上海细胞库提供)用作待考察的癌细胞。将MCF-7细胞培养在含胎牛血清(FBS)10％，青链霉素混合液1％的RPMI 1640培养基中，培养箱条件为37℃、5％CO2，每2～3天传代一次。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板每孔加入200μl，铺板使待测细胞调密度至6×103个/孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。置于5％CO2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度(0.078125、0.3125、1.25、5μg/ml)的实施例1中的隐形热敏脂质体，设置复孔为4～6个。交变磁场组使用的磁场电流为20A，频率为482KHz，时间10～20min，保持实验过程中温度在37℃，结束后将细胞板置于CO2培养箱中孵育24h，对于无交变磁场组而言，则直接将细胞板置于CO2培养箱中孵育24h，终止培养，加入预冷的50％三氯乙酸(TCA)50μl，4℃放置1h。倒掉固定液，每孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。每孔加入50μl的磺酰罗丹明B(SRB)溶液，静置放置30min，未与蛋白结合的SRB用1％醋酸洗5遍，空气干燥。结合的SRB用150μl 10mmol/L非缓冲三羟甲基氨基甲烷(Tris)碱溶解。在515nm处测定每孔的光密度(OD)值。存活率的计算公式：存活率＝实验组OD值/对照组OD值，其中实验组和对照组均为扣除空白对照组后的值。
实验证明，置于交变磁场20min，本发明药物转运系统可直接影响MCF-7细胞的增殖。
二、交变磁场照射时，磁性氧化石墨烯原位凝胶的体内抗肿瘤活性测定
取小鼠S180腹水瘤细胞，用注射用生理盐水以3:1比例稀释后，每只小鼠于腹腔注射0.3ml，小鼠喂养7天后，抽取小鼠S180腹水瘤细胞，计数后以注射用生理盐水稀释成浓度为2×106个/ml的细胞悬液，皮下接种与小鼠右前肢上部。小鼠接种肿瘤7天后，取其中24只肿瘤体积≥100mm3昆明小鼠，随机分为4组，每组6只。具体分组如下：(1)对照组(NS组)：生理盐水；(2)生理盐水合并交变磁场组；(3)负载盐酸阿霉素的磁性氧化石墨烯原位凝胶组；(4)负载盐酸阿霉素的磁性氧化石墨烯原位凝胶合并交变磁场组。4组均采用瘤内注射的方式，其中交变磁场组使用的磁场电流为20A，频率为482KHz，给药4h和一天将荷瘤小鼠置于交变磁场各一次，每次时间为20min。每3天给药一次，每次注射生理盐水或者1mg/ml的负载阿霉素的磁性氧化石墨烯原位凝胶200μl，共给药5次。整个实验过程中每日观察小鼠生活状态，每3d称其体重并使用游标卡尺测量小鼠肉瘤的长径(A)与短径(B)，按公式肿瘤体积计算肿瘤体积。
当给药负载盐酸阿霉素的磁性氧化石墨烯原位凝胶合并交变磁场照射时，小鼠的肿瘤体积的增加得到了明显的抑制。
三、磁性氧化石墨烯原位凝胶作为药物转运载体在肿瘤治疗中的应用
磁性氧化石墨烯原位凝胶作为药物转运载体在肿瘤治疗中的应用。取磁性氧化石墨烯-聚乙烯亚胺5mg和盐酸阿霉素10mg，加入超纯水5ml，混合均匀后，超声分散3h，取1ml的样品进行离心(12000r/min，10min)除去大颗粒。得到了以磁性氧化石墨烯-聚乙烯亚胺为载体的抗肿瘤药物盐酸阿霉素给药系统。取上清900μl加1ml超纯水稀释，紫外分光光度计测定磁性氧化石墨烯-聚乙烯亚胺为载体包封的盐酸阿霉素的含量，载药量为1.2mg/ml。
已经证实，磁性氧化石墨烯-聚乙烯亚胺可以吸附抗肿瘤药物盐酸阿霉素，可以作为抗肿瘤药物的载体使用。
四、磁性氧化石墨烯原位凝胶理化性质考察
负载盐酸阿霉素的磁性氧化石墨烯给药系统的粒子大小和表面带电量的确定，使用Nano-ZS90型激光粒度分析仪进行测定，折射率设置为1.590，吸收系数设置为0.010，温度设置为25℃，测量模式设置为自动，以Z平均统计值作为测定结果。每一水平缩合体均配制3份，每份测量一次，取三次测量值的平均值作为测量结果。介电常数设置为79，黏度系数设置为0.8872，温度设置为25℃，测量模式设置为自动。每一水平缩合体均配制3份，每份测量一次，取三次测量值的平均值作为测量结果。测得的结果是粒径为200-300nm，电位是30mV。
原位凝胶胶凝温度的测定，将CS 50-100mg溶于0.1mol/L HCl 4.5ml中，磁力搅拌至澄清，制成不同浓度的CS溶液A1-A6。将β-GP 200-300mg溶于超纯水0.5ml中，制成不同浓度的β-GP溶液B1-B6。分别将B液滴加入冰浴中的A液中，边滴加边搅拌，冰浴搅拌约10min，即得壳聚糖原位凝胶。将一系列不同配比的凝胶，各取2ml置于试管中，放置于不同温度的水浴中恒温5min后，将试管倒置，当凝胶溶液倒置2min未发生流动，即形成凝胶，此时温度为此比例的凝胶溶液的胶凝温度。
原位凝胶体外释放度试验。试验分两组：(1)负载盐酸阿霉素的磁性氧化石墨烯原位凝胶组(2)原料药盐酸阿霉素水溶液。每组各取2ml加入透析袋(3500Da)中，释放介质为中性(pH7.4)和酸性(pH 5.0)的PBS 80ml，温度为体温(37℃)和模拟热疗时温度(42℃)。将透析袋放入释放介质中，置于恒温振荡器(转速100r/min)中，在不同时间点取出释放介质2ml，并补充等体积的新鲜释放介质。取出的样品通过紫外分光光度计进行测定，已知盐酸阿霉素在480nm处有特征吸收峰，根据样品的药物含量可以计算不同时间点的累积释放量，分别绘制不同组药物累计释放百分比曲线。实验结果显示，负载盐酸阿霉素的磁性氧化石墨烯原位凝胶具有良好的缓释作用，并且在高于体温和酸性环境释放效果更佳。
五、负载盐酸阿霉素的磁性氧化石墨烯给药系统的体外抗肿瘤活性
将MCF-7乳腺癌细胞(由上海细胞库提供)用作待考察的癌细胞。将MCF-7细胞培养在含胎牛血清(FBS)10％，青链霉素混合液1％的RPMI 1640培养基中，培养箱条件为37℃、5％CO2，每2～3天传代一次。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板每孔加入200μl，铺板使待测细胞调密度至6×103个/孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。置于5％CO2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度(0.078125、0.3125、1.25、5μg/ml)的实施例1中的负载盐酸阿霉素的磁性氧化石墨烯，设置复孔为4～6个。交变磁场组使用的磁场电流为20A，频率为482KHz，时间10～20min，保持实验过程中温度在37℃，结束后将细胞板置于CO2培养箱中孵育24h，对于无交变磁场组而言，则直接将细胞板置于CO2培养箱中孵育24h，终止培养，加入预冷的50％TCA 50μl，4℃放置1h。倒掉固定液，每孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。每孔加入50μl的SRB溶液，静置放置10min，未与蛋白结合的SRB用1％醋酸洗5遍，空气干燥。结合的SRB用150μl 10mmol/L非缓冲Tris碱溶解。在515nm处测定每孔的OD值。存活率的计算公式：存活率＝实验组OD值/对照组OD值，其中实验组和对照组均为扣除空白对照组后的值。
已经证实，磁性氧化石墨烯作为药物载体时能装载药物进入肿瘤细胞内部，1h、2h和4h的摄取率分别为58.5％,76.1％和92.2％，能够更好的发挥出抗肿瘤药物的疗效，而且结合交变磁场后，肿瘤细胞的增殖抑制率可增加10％左右。
六、负载盐酸阿霉素的磁性氧化石墨烯原位凝胶给药系统的体内抗肿瘤活性
负载盐酸阿霉素的磁性氧化石墨烯原位凝胶给药系统的体内抗肿瘤活性，取小鼠S180腹水瘤细胞，用注射用生理盐水以3:1比例稀释后，每只小鼠于腹腔注射0.3ml，小鼠喂养7天后，抽取小鼠S180腹水瘤细胞，计数后以注射用生理盐水稀释成浓度为2×106个/ml的细胞悬液，皮下接种与小鼠右前肢上部。小鼠接种肿瘤7天后，取其中24只肿瘤体积≥100mm3昆明小鼠，随机分为4组，每组6只。具体分组如下：(1)对照组(NS组)：生理盐水；(2)盐酸阿霉素注射液组；(3)负载盐酸阿霉素的磁性氧化石墨烯原位凝胶组；(4)负载盐酸阿霉素的磁性氧化石墨烯原位凝胶合并交变磁场组。4组均采用瘤内注射的方式，其中交变磁场组使用的磁场电流为20A，频率为482KHz，给药4h和一天将荷瘤小鼠置于交变磁场各一次，每次时间为20min。每3天给药一次，每次注射生理盐水或者1mg/ml的负载阿霉素的磁性氧化石墨烯原位凝胶200μl，共给药5次。整个实验过程中每日观察小鼠生活状态，每3d称其体重并使用游标卡尺测量小鼠肉瘤的长径(A)与短径(B)，按公式肿瘤体积计算肿瘤体积。
当实验结束，负载盐酸阿霉素的磁性氧化石墨烯原位凝胶组小鼠的相对肿瘤体积为1.35，合并交变磁场组小鼠肿瘤体积的增加得到了更加明显的抑制，相对肿瘤体积为0.47。
在做上述实验的同时，还采用其他磁场频率以及抗肿瘤药物做了类似的实验，均取得了相同和相类似的结果，本发明分组科学，方法稳定可靠，其他实验结果不再一一列举。
本发明提供了一种磁性氧化石墨烯原位凝胶，其制备方法以及其作为磁热介质和在药物转运载体中的应用。本发明磁性氧化石墨烯原位凝胶不会对氧化石墨烯本身的特性进行破坏，测试结果表明，本发明磁性氧化石墨烯-聚乙烯亚胺复合物，水分散性强，对生物体的毒性很低，物理以及化学稳定性良好，质量好，制备的条件容易满足，原料来源丰富，成本低。
本发明提供的磁性氧化石墨烯原位凝胶可以作为抗肿瘤磁热治疗的一种良好的磁热介质，测试表明无论是体外还是体内合并交变磁场的情况下都可以很好的抑制肿瘤细胞及组织的发生和发展，同时本发明提供的磁性氧化石墨烯原位凝胶对正常细胞及组织毒副作用很小。
本发明提供的磁性氧化石墨烯原位凝胶可以作为一种良好的抗肿瘤药物的载体，本身有着极小的毒性，水溶性强，生物相容性好，比表面积大，化学惰性高等优点。测试结果表明，本发明提供的磁性氧化石墨烯原位凝胶作为抗肿瘤药物的载体时，粒径均匀，瘤内注射后能够在瘤内形变成为凝胶，缓慢释放药物，可在较长时间内发挥抗肿瘤作用，结合磁热疗法还可以发挥出更为显著的抗肿瘤活性。
预期本发明可以用于治疗肿瘤的一种良好的磁热介质，还可以作为化学药物、蛋白质、核酸的转运载体，是药物制备上的一大创新，与现有技术相比具有以下突出的有益技术效果：
1)本发明磁性氧化石墨烯原位凝胶不会对氧化石墨烯本身的特性进行破坏，水分散性强，对生物体的毒性很低，物理以及化学稳定性良好，质量好，制备的条件容易满足，原料来源丰富，成本低；
2)本发明磁性氧化石墨烯原位凝胶可以作为抗肿瘤磁热治疗的一种良好的磁热介质，交变磁场时能够发挥抗肿瘤的活性，副作用很小，在实验中未发现有不良反应，用药安全，可以根据控制磁场频率等手段来选择性的杀伤肿瘤组织和细胞，显著提高疗效。
3)本发明磁性氧化石墨烯原位凝胶可以作为一种良好的抗肿瘤药物载体，有着极小的毒性，较强的水溶性，生物相容性好，比表面积大，化学惰性高，缓释效果明显，结合交变磁场还可以发挥出更为显著的抗肿瘤活性。
Claims (7)
1.一种基于磁性氧化石墨烯原位凝胶的制备方法，其特征在于，该磁性氧化石墨烯原位凝胶作为药物载体系统是由负载药物的磁性氧化石墨烯和壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶混合制成，负载药物的磁性氧化石墨烯和壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶的体积比为1-3:1，具体由以下步骤实现：
1）制备磁性氧化石墨烯：称取氧化石墨烯20-40 mg溶于乙二醇与二乙二醇混合溶液20-40 ml中，搅拌均匀，乙二醇与二乙二醇的体积比为1:19，再超声30 min，然后在磁力搅拌下，依次加入醋酸钠200-450 mg、六水合氯化铁100-300 mg，形成均匀黄色的悬浮液，将悬浮液置于反应釜中，200℃反应10 h，再3000 r/min将悬浮液离心5 min，得沉淀物，沉淀物依次用无水乙醇100-300 ml、超纯水100-450 ml离心洗涤10-20次后，将沉淀物真空干燥12-48 h，即得磁性氧化石墨烯；
2）制备聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯：称取磁性氧化石墨烯20-40 mg溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液20-40 ml中，搅拌，超声30 min，使之分散均匀；依次加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺盐酸盐100-200 mg、N-羟基丁二酰亚胺50-117 mg、分子量10 K的聚乙烯亚胺100-400 mg，搅拌72 h，用0.22 μm微孔滤膜抽滤，得滤饼，滤饼用超纯水200-500 ml反复洗涤10次，40-60℃真空干燥12-48 h，即得聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯；
3）制备负载盐酸阿霉素的聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯：
称取聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯5-20 mg溶于超纯水5-20 ml中，再加入抗肿瘤药物盐酸阿霉素10-40 mg，超声2-4 h，即得负载盐酸阿霉素的聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯；
4）制备CS/β-GP凝胶溶液：称取脱乙酰度90%、分子量50 K的壳聚糖50-170 mg溶于0.1mol/L HCl 2-20 ml中，磁力搅拌至澄清，配制成A液；将β-甘油磷酸钠200-700 mg溶于超纯水0.5-2 ml中，配制成B液，将B液滴加至冰浴搅拌中的A液中，冰浴搅拌10 min，即得CS/β-GP凝胶溶液；
5）制备凝胶溶液：室温下，将负载盐酸阿霉素的聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯按体积比1-3:1滴加入CS/β-GP凝胶溶液，并搅拌均匀，即得负载盐酸阿霉素的磁性氧化石墨烯壳聚糖凝胶溶液。
2.根据权利要求1所述的基于磁性氧化石墨烯原位凝胶的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：
1）制备磁性氧化石墨烯：称取氧化石墨烯20 mg溶于乙二醇与二乙二醇混合溶液20 ml中，搅拌均匀，乙二醇与二乙二醇的体积比为1:19，再超声30 min，然后在磁力搅拌下，依次加入醋酸钠300 mg、六水合氯化铁108 mg，形成均匀黄色的悬浮液，将悬浮液置于反应釜中，200 ℃反应10 h，再3000 r/min将悬浮液离心5 min，得沉淀物，沉淀物依次用无水乙醇200 ml、超纯水300 ml离心洗涤20次后，将沉淀物真空干燥12 h，即得磁性氧化石墨烯；
2）制备聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯：称取磁性氧化石墨烯30 mg溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液30 ml中，搅拌，超声30 min，使之分散均匀；依次加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺盐酸盐120 mg、N-羟基丁二酰亚胺70 mg、分子量10 K的聚乙烯亚胺200 mg，搅拌72 h，用0.22 μm微孔滤膜抽滤，得滤饼，滤饼用超纯水300 ml反复洗涤10次， 60 ℃真空干燥24 h，即得聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯；
3）制备负载盐酸阿霉素的聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯：称取聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯5 mg溶于超纯水5 ml中，再加入抗肿瘤药物盐酸阿霉素10 mg，超声3 h，即得负载盐酸阿霉素的聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯；
4）制备CS/β-GP凝胶溶液：称取脱乙酰度90%、分子量50 K的壳聚糖85 mg溶于0.1 mol/L HCl 4.5 ml中，磁力搅拌至澄清，配制成A液；将β-甘油磷酸钠250 mg溶于超纯水1 ml中，配制成B液，将B液滴加至冰浴搅拌中的A液中，冰浴搅拌10 min，即得CS/β-GP凝胶溶液；
5）制备凝胶溶液：室温下，将负载盐酸阿霉素的聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯按体积比1:1滴加入CS/β-GP凝胶溶液，并搅拌均匀，即得负载盐酸阿霉素的磁性氧化石墨烯壳聚糖凝胶溶液。
3.根据权利要求1所述的基于磁性氧化石墨烯原位凝胶的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：
1）制备磁性氧化石墨烯：称取氧化石墨烯30 mg溶于乙二醇与二乙二醇混合溶液30 ml中，搅拌均匀，乙二醇与二乙二醇的体积比为1:19，再超声30 min，然后在磁力搅拌下，依次加入醋酸钠450 mg、六水合氯化铁300 mg，形成均匀黄色的悬浮液，将悬浮液置于反应釜中，200 ℃反应10 h，再3000 r/min将悬浮液离心5 min，得沉淀物，沉淀物依次用无水乙醇300 ml、超纯水450 ml离心洗涤20次后，将沉淀物真空干燥12 h，即得磁性氧化石墨烯；
2）制备聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯：称取磁性氧化石墨烯40 mg溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液40 ml中，搅拌，超声30 min，使之分散均匀；依次加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺盐酸盐200 mg、N-羟基丁二酰亚胺117 mg、分子量10 K的聚乙烯亚胺333mg，搅拌72 h，用0.22 μm微孔滤膜抽滤，得滤饼，滤饼用超纯水500 ml反复洗涤10次，60℃真空干燥24 h，即得聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯；
3）制备负载盐酸阿霉素的聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯：称取聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯5 mg溶于超纯水5 ml中，再加入抗肿瘤药物盐酸阿霉素10 mg，超声2-4 h，即得负载盐酸阿霉素的聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯；
4）制备CS/β-GP凝胶溶液：称取脱乙酰度90%、分子量50 K的壳聚糖85 mg溶于0.1 mol/L HCl 4.5 ml中，磁力搅拌至澄清，配制成A液；将β-甘油磷酸钠300 mg溶于超纯水2 ml中，配制成B液，将B液滴加至冰浴搅拌中的A液中，冰浴搅拌10 min，即得CS/β-GP凝胶溶液；
5）制备凝胶溶液：室温下，将负载盐酸阿霉素的聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯按体积比1:1滴加入CS/β-GP凝胶溶液，并搅拌均匀，即得负载盐酸阿霉素的磁性氧化石墨烯壳聚糖凝胶溶液。
4.根据权利要求1所述的基于磁性氧化石墨烯原位凝胶的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：
1）制备磁性氧化石墨烯：称取氧化石墨烯40 mg溶于乙二醇与二乙二醇混合溶液40 ml中，搅拌均匀，乙二醇与二乙二醇的体积比为1:19，再超声30 min，然后在磁力搅拌下，依次加入醋酸钠400 mg、六水合氯化铁300 mg，形成均匀黄色的悬浮液，将悬浮液置于反应釜中，200 ℃反应10 h，再3000 r/min将悬浮液离心5 min，得沉淀物，沉淀物依次用无水乙醇200 ml、超纯水300 ml离心洗涤20次后，将沉淀物真空干燥24 h，即得磁性氧化石墨烯；
2）制备聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯：称取磁性氧化石墨烯30 mg溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液30 ml中，搅拌，超声30 min，使之分散均匀；依次加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺盐酸盐120 mg、N-羟基丁二酰亚胺70 mg、分子量10 K的聚乙烯亚胺200 mg，搅拌72 h，用0.22 μm微孔滤膜抽滤，得滤饼，滤饼用超纯水300 ml反复洗涤10次，60℃真空干燥24 h，即得聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯；
3）制备负载盐酸阿霉素的聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯：称取聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯10 mg溶于超纯水10 ml中，再加入抗肿瘤药物盐酸阿霉素20 mg，超声3 h，即得负载盐酸阿霉素的聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯；
4）制备CS/β-GP凝胶溶液：称取脱乙酰度90%、分子量50 K的壳聚糖170 mg溶于0.1mol/L HCl 19 ml中，磁力搅拌至澄清，配制成A液；将β-甘油磷酸钠700 mg溶于超纯水2 ml中，配制成B液，将B液滴加至冰浴搅拌中的A液中，冰浴搅拌10 min，即得CS/β-GP凝胶溶液；
5）制备凝胶溶液：室温下，将负载盐酸阿霉素的聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯按体积比2:1滴加入CS/β-GP凝胶溶液，并搅拌均匀，即得负载盐酸阿霉素的磁性氧化石墨烯壳聚糖凝胶溶液。
5.根据权利要求1所述的基于磁性氧化石墨烯原位凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤2）制备的聚乙烯亚胺修饰的磁性氧化石墨烯复合物的粒径为200-300 nm。
6.权利要求1或2-4任一项所述方法制备的基于磁性氧化石墨烯原位凝胶在制备抗肿瘤磁热介质中的应用。
7.权利要求1或2-4任一项所述方法制备的基于磁性氧化石墨烯原位凝胶在制备抗肿瘤药物载体中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20170901 Termination date: 20180317 |