CN108837159B - 一种纳米抗菌剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种纳米抗菌剂及其制备方法，它涉及一种抗菌剂及其制备方法。本发明的目的是要解决现有纳米材料修饰抗生素用于抗菌领域生物相容性差，不具有靶向性和抗生素的利用率低的问题。一种纳米抗菌剂为透明质酸钠对MOF和抗生素的协同体系进行表面修饰；所述的MOF和抗生素的协同体系为抗生素封装于沸石咪唑酯骨架结构材料ZIF‑8中。方法：一、制备MOF和抗生素的协同体系；二、用透明质酸钠溶液对所制备的MOF和抗生素的协同体系进行表面修饰，再进行真空干燥得到纳米抗菌剂。本发明可获得一种纳米抗菌剂。

Description

一种纳米抗菌剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种抗菌剂及其制备方法。
背景技术
抗生素曾被誉为“神奇的药物”，长期以来满足了许多医疗上的紧急需求。但不幸的是，过度和不适当的使用导致细菌对常规抗生素的耐药性急剧增强，这种现象一直是国内外的关注焦点和研究热点，世界卫生组织(WHO)也将其列为本世纪最大的公共安全问题之一。
胞内菌是指能够侵入宿主细胞，并在细胞内寄居繁殖的病原菌。胞内致病菌不仅能逃避宿主免疫系统的攻击，也能在一定程度上免受抗生素等抗感染药物的毒杀作用，造成细菌耐药性的加剧，而形成胞内的病灶会导致感染的反复发作与迁延不愈，在机体免疫力减弱时，便出现临床发病，影响病人的生存质量甚至危及生命。因此高效靶向消除胞内寄生菌具有非常重要的意义，也是恢复抗生素药效的重要途径之一。
随着纳米技术的飞速发展，高效消除胞外和胞内致病菌的新途径慢慢出现在大众面前。一些新型纳米材料例如已经广泛研究的纳米金、纳米银和氧化石墨烯等，不仅在抗菌应用方面有着出色的表现，而且很好的避开了耐药性的问题，因此，纳米技术在抗菌材料设计中具有巨大的潜力，可以用于提高细菌对抗生素的敏感性。此外，纳米材料与抗生素的复合在对抗耐药性、恢复现有抗生素的有效性方面也有着重要的意义和广阔的前景。然而，纳米材料应用于抗菌领域存在很多局限性，比如生物相容性差，在消除致病菌方面不具有靶向性等，因此，现有纳米材料生物相容性差，靶向性差和与抗生素复合的方法等问题成为纳米抗菌剂的应用中亟待解决的难题。
发明内容
本发明的目的是要解决现有纳米材料修饰抗生素用于抗菌领域生物相容性差，不具有靶向性和抗生素的利用率低的问题，而提供一种纳米抗菌剂及其制备方法。
一种纳米抗菌剂为透明质酸钠对MOF和抗生素的协同体系进行表面修饰；所述的MOF和抗生素的协同体系为抗生素封装于沸石咪唑酯骨架结构材料ZIF-8中。
进一步的所述的沸石咪唑酯骨架结构材料ZIF-8由Zn(NO)3·6H2O提供金属离子，2-甲基咪唑作为配体，去离子水为分散介质，在室温下经交联相互作用形成。
进一步的所述的抗生素为四环素类抗生素、氨基糖苷类抗生素、内酰胺类抗生素或多肽类抗生素。
进一步的所述的四环素类抗生素为四环素、金霉素、土霉素、强力霉素或二甲胺基四环素；所述的氨基糖苷类抗生素为链霉素、庆大霉素、卡那霉素或妥布霉素；所述的内酰胺类抗生素为青霉素；所述的多肽类抗生素为万古霉素。
一种纳米抗菌剂的制备方法，是按以下步骤完成的：
一、制备MOF和抗生素的协同体系：
将Zn(NO)3·6H2O水溶液和抗生素溶液在搅拌速度为250r/min～450r/min下搅拌反应1min～3min，再滴加2-甲基咪唑水溶液，再在搅拌速度为250r/min～450r/min下搅拌反应10min～20min，再离心分离，收集沉淀物；使用去离子水对收集的沉淀物清洗3次～5次，得到MOF和抗生素的混合物；将MOF和抗生素的混合物分散到去离子水中，得到MOF和抗生素的协同体系；
步骤一中所述的Zn(NO)3·6H2O水溶液与抗生素溶液的体积比为1:(2～6)；
步骤一中所述的Zn(NO)3·6H2O水溶液与2-甲基咪唑水溶液的体积比为1:(8～12)；
二、向MOF和抗生素的协同体系中加入透明质酸钠溶液，混合均匀，再在室温下静置30min～240min，再离心分离，收集沉淀物质，再在室温下真空干燥，得到纳米抗菌剂；
步骤二中所述的MOF和抗生素的协同体系与透明质酸钠溶液的体积比为3:1。
进一步的步骤一中所述的Zn(NO)3·6H2O水溶液的浓度为0.1g/mL～0.3g/mL。
进一步的步骤一中所述的抗生素溶液的浓度为0.5mg/mL～5mg/mL。
进一步的步骤一中所述的2-甲基咪唑水溶液的浓度为0.1g/mL～0.3g/mL。
进一步的步骤一中所述的MOF和抗生素的协同体系中MOF和抗生素的混合物的浓度为40mg/mL～50mg/mL。
进一步的步骤二中所述的透明质酸钠溶液的浓度为0.8mg/mL～1.5mg/mL。
本发明的原理：
本发明为了进一步扩展纳米抗菌剂的应用，制备了MOF与抗生素协同作用的纳米抗菌剂，将光谱抗生素四环素封装于沸石咪唑酯骨架结构材料ZIF-8(MOF)中，并采用透明质酸钠对MOF和抗生素的协同体系进行表面修饰。本发明制备的纳米抗菌剂可以pH响应性释放所封装的抗生素，且MOF与抗生素在抗菌试验中具有协同作用，透明质酸的修饰可以使其靶向消除胞内寄生菌；本发明制备的纳米抗菌剂的过程简单节能，兼具可控释放性，协同性，靶向性，广谱抗菌性，对胞内、胞外菌都具有高效消除效果，能够有效降低抗生素的使用量，提高利用率，在对抗细菌耐药性上有着广阔的应用前景。
与现有技术相比，其优点与积极效果在于：
一、抗菌高效协同性：本发明制备的纳米抗菌剂，其中包含MOF和抗生素两种主要成分，在抗菌过程中起到协同作用，能够明显降低所包含的抗生素的使用剂量，在对抗耐药性致病菌时恢复其有效性；
二、针对致病菌感染部位的靶向性：本发明制备的纳米抗菌剂，采用具有pH响应性的MOF材料ZIF-8作为骨架，能够控制在致病菌感染部位的酸性条件下释放所封装的抗生素，从而提高抗生素的利用率；
三、针对胞内寄生菌的靶向性，本发明制备的纳米抗菌剂，采用透明质酸进行表面修饰，可以通过透明质酸与细胞表面的CD44受体的结合增强细胞对抗菌剂的摄入，从而提高抗菌剂的有效利用率；
四、本发明合成方法节能简便，本发明制备的纳米抗菌剂，采用常温水相制备，原料简单低价，且不需要高耗能的条件和设备。因此在临床治疗和食品安全控制等领域有很好的应用前景，能降低抗生素的用量，进而有效避免抗生素耐药性的加剧；
五、本发明制备的纳米抗菌剂的直径为500nm～800nm，BET比表面积可达到2034.34m2/g。
本发明可获得一种纳米抗菌剂。
附图说明
图1为实施例一制备的纳米抗菌剂的SEM图；
图2为X射线衍射图谱表征，图中1为纯ZIF-8，2为实施例一制备的纳米抗菌剂；
图3为紫外吸收光谱表征，图中1为实施例一制备的纳米抗菌剂，2为纯ZIF-8，3为纯四环素；
图4为傅里叶变换中红外光谱表征图，图中1为纯ZIF-8，2为实施例一制备的纳米抗菌剂，3为纯四环素；
图5为热失重分析表征图，图中1为纯ZIF-8，2为实施例一制备的纳米抗菌剂，3为纯四环素；
图6为实施例一制备的纳米抗菌剂的BET比表面积测试图；
图7为实施例一制备的纳米抗菌剂在缓冲液中随时间的释放曲线，图中1为实施例一制备的纳米抗菌剂在pH值为5.5的PBS缓冲液中随时间的释放曲线，2为实施例一制备的纳米抗菌剂在pH值为7.4的PBS缓冲液中随时间的释放曲线。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式是一种纳米抗菌剂为透明质酸钠对MOF和抗生素的协同体系进行表面修饰；所述的MOF和抗生素的协同体系为抗生素封装于沸石咪唑酯骨架结构材料ZIF-8中。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同点是：所述的沸石咪唑酯骨架结构材料ZIF-8由Zn(NO)3·6H2O提供金属离子，2-甲基咪唑作为配体，去离子水为分散介质，在室温下经交联相互作用形成。其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二之一不同点是：所述的抗生素为四环素类抗生素、氨基糖苷类抗生素、内酰胺类抗生素或多肽类抗生素。其它步骤与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同点是：其它步骤与具体实施方式一至三相同。
具体实施方式五：本实施方式是一种纳米抗菌剂的制备方法是按以下步骤完成的：
一、制备MOF和抗生素的协同体系：
将Zn(NO)3·6H2O水溶液和抗生素溶液在搅拌速度为250r/min～450r/min下搅拌反应1min～3min，再滴加2-甲基咪唑水溶液，再在搅拌速度为250r/min～450r/min下搅拌反应10min～20min，再离心分离，收集沉淀物；使用去离子水对收集的沉淀物清洗3次～5次，得到MOF和抗生素的混合物；将MOF和抗生素的混合物分散到去离子水中，得到MOF和抗生素的协同体系；
步骤一中所述的Zn(NO)3·6H2O水溶液与抗生素溶液的体积比为1:(2～6)；
步骤一中所述的Zn(NO)3·6H2O水溶液与2-甲基咪唑水溶液的体积比为1:(8～12)；
二、向MOF和抗生素的协同体系中加入透明质酸钠溶液，混合均匀，再在室温下静置30min～240min，再离心分离，收集沉淀物质，再在室温下真空干燥，得到纳米抗菌剂；
步骤二中所述的MOF和抗生素的协同体系与透明质酸钠溶液的体积比为3:1。
与现有技术相比，其优点与积极效果在于：
一、抗菌高效协同性：本实施方式制备的纳米抗菌剂，其中包含MOF和抗生素两种主要成分，在抗菌过程中起到协同作用，能够明显降低所包含的抗生素的使用剂量，在对抗耐药性致病菌时恢复其有效性；
二、针对致病菌感染部位的靶向性：本实施方式制备的纳米抗菌剂，采用具有pH响应性的MOF材料ZIF-8作为骨架，能够控制在致病菌感染部位的酸性条件下释放所封装的抗生素，从而提高抗生素的利用率；
三、针对胞内寄生菌的靶向性，本实施方式制备的纳米抗菌剂，采用透明质酸进行表面修饰，可以通过透明质酸与细胞表面的CD44受体的结合增强细胞对抗菌剂的摄入，从而提高抗菌剂的有效利用率；
四、本实施方式合成方法节能简便，本实施方式制备的纳米抗菌剂，采用常温水相制备，原料简单低价，且不需要高耗能的条件和设备。因此在临床治疗和食品安全控制等领域有很好的应用前景，能降低抗生素的用量，进而有效避免抗生素耐药性的加剧；
五、本实施方式制备的纳米抗菌剂的直径为500nm～800nm，BET比表面积可达到2034.34m2/g。
本实施方式可获得一种纳米抗菌剂。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五的不同点是：步骤一中所述的Zn(NO)3·6H2O水溶液的浓度为0.1g/mL～0.3g/mL。其它步骤与具体实施方式五相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式五至六之一不同点是：步骤一中所述的抗生素溶液的浓度为0.5mg/mL～5mg/mL。其它步骤与具体实施方式五至六相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式五至七之一不同点是：步骤一中所述的2-甲基咪唑水溶液的浓度为0.1g/mL～0.3g/mL。其它步骤与具体实施方式五至七相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式五至八之一不同点是：步骤一中所述的MOF和抗生素的协同体系中MOF和抗生素的混合物的浓度为40mg/mL～50mg/mL。其它步骤与具体实施方式五至八相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式五至九之一不同点是：步骤二中所述的透明质酸钠溶液的浓度为0.8mg/mL～1.5mg/mL。其它步骤与具体实施方式五至九相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式五至十之一不同点是：步骤一中所述的Zn(NO)3·6H2O水溶液的浓度为0.1g/mL～0.2g/mL。其它步骤与具体实施方式五至十相同。
具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式五至十一之一不同点是：步骤一中所述的抗生素溶液的浓度为0.5mg/mL～1.5mg/mL。其它步骤与具体实施方式五至十一相同。
具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式五至十二之一不同点是：其它步骤与具体实施方式五至十二相同。
具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式五至十三之一不同点是：步骤一中所述的2-甲基咪唑水溶液的浓度为0.1g/mL～0.25g/mL。其它步骤与具体实施方式五至十三相同。
具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式五至十四之一不同点是：步骤一中所述的MOF和抗生素的协同体系中MOF和抗生素的混合物的浓度为41.2mg/mL～45mg/mL。其它步骤与具体实施方式五至十四相同。
具体实施方式十六：本实施方式与具体实施方式五至十四之一不同点是：步骤二中所述的透明质酸钠溶液的浓度为1mg/mL～1.5mg/mL。其它步骤与具体实施方式五至十五相同。
采用以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
实施例一：纳米抗菌剂的制备方法是按以下步骤完成的：
一、制备MOF和抗生素的协同体系：
将1mL Zn(NO)3·6H2O水溶液和4mL抗生素溶液在搅拌速度为360r/min下搅拌反应1min，再8mL滴加2-甲基咪唑水溶液，再在搅拌速度为360r/min下搅拌反应15min，再离心分离，收集沉淀物；使用去离子水对收集的沉淀物清洗5次，得到MOF和抗生素的混合物；将MOF和抗生素的混合物分散到去离子水中，得到MOF和抗生素的协同体系；
步骤一中所述的Zn(NO)3·6H2O水溶液的浓度为0.2g/mL；
步骤一中所述的抗生素溶液的浓度为1.5mg/mL；
步骤一中所述的2-甲基咪唑水溶液的浓度为0.25g/mL；
步骤一中所述的MOF和抗生素的协同体系中MOF和抗生素的混合物的浓度为41.2mg/mL；
步骤一中所述的抗生素溶液中抗生素为四环素；
二、向MOF和抗生素的协同体系中加入透明质酸钠溶液，混合均匀，再在室温下静置30min，再离心分离，收集沉淀物质，再在室温下真空干燥，得到纳米抗菌剂；
步骤二中所述的透明质酸钠溶液的浓度为1mg/mL；
步骤二中所述的MOF和抗生素的协同体系与透明质酸钠溶液的体积比为3:1。
图1为实施例一制备的纳米抗菌剂的SEM图；
从图1可知，实施例一制备的纳米抗菌剂的直径为500nm～800nm，保留了ZIF-8的基本形貌，呈现出表面粗糙的三维结构。
图2为X射线衍射图谱表征，图中1为纯ZIF-8，2为实施例一制备的纳米抗菌剂；
从图2可知，实施例一制备的纳米抗菌剂的衍射峰位置与纯ZIF-8高度一致，强度有所降低，这是由于ZIF-8的孔中存在抗生素分子并且在表面存在透明质酸分子的修饰。
为了验证抗生素的成功封装，对实施例一制备的纳米抗菌剂的紫外吸收光谱进行检测，如图3所示；
图3为紫外吸收光谱表征，图中1为实施例一制备的纳米抗菌剂，2为纯ZIF-8，3为纯四环素；
从图3可知，与纯ZIF-8相比，实施例一制备的纳米抗菌剂的特征峰出现在264nm和344nm处，与四环素的特征峰(274和358nm)基本吻合，可以证明抗生素与ZIF-8的成功复合。
为了进一步证实抗生素的负载，采用FT-IR对实施例一制备的纳米抗菌剂进行表征，如图4所示；
图4为傅里叶变换中红外光谱表征图，图中1为纯ZIF-8，2为实施例一制备的纳米抗菌剂，3为纯四环素；
从图4可知，实施例一制备的纳米抗菌剂的主要吸收峰是抗生素和ZIF-8的组合，这表明抗生素的成功负载，所发生的部分移位推测是由于这两种组分之间的氢键作用。
图5为热失重分析表征图，图中1为纯ZIF-8，2为实施例一制备的纳米抗菌剂，3为纯四环素；
从图5可知，ZIF-8在570℃以下具有较高的热稳定性，而抗生素在220℃到250℃升温过程中重量从97.6％迅速下降到73.7％，因此，实施例一制备的纳米抗菌剂在200℃左右的重量损失应该是由于其封装的抗生素引起的；继续升温至570℃时，实施例一制备的纳米抗菌剂的重量损失趋势显著高于ZIF-8，可以认为是其表面透明质酸分子的损失。
图6为实施例一制备的纳米抗菌剂的BET比表面积测试图；
从图6可知，实施例一制备的纳米抗菌剂的吸附曲线是Ⅰ型吸附等温线，属于微孔结构，其BET比表面积为2034.34m2/g。
实施例二：实施例一制备的纳米抗菌剂高效消除胞外致病菌活性的检测：
微生物菌种选用革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的标准株(ATCC29213)和革兰氏阴性沙门氏菌的标准株(LT2)。
菌株活化：取一环低温冷冻保藏的菌种，划线接种于Luria-Bertani(LB)琼脂培养基平板上，37℃条件下孵育12h形成单菌落。
菌悬液制备：挑取平板上的单菌落于30mL TSB培养基中，37℃恒温摇床中震荡培养12h，转速为180～220rpm，5000rpm离心10分钟后用PBS或TSB培养基调浊度至OD600＝0.5(约108cfu/mL)。
最低抑菌浓度(MIC)测定：实施例一制备的纳米抗菌剂的抗菌活性根据临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的微生物药敏测试的性能标准，采用微量稀释法进行，步骤如下：在96微孔板的各个孔中各加入100μL Mueller-Hinton肉汤(MHB)，然后在第1纵列孔中加入100μL实施例一制备的纳米抗菌剂或对照组(PBS，纯抗生素或纯MOF)的水溶液，浓度其中实施例一制备的纳米抗菌剂水溶液浓度为258μg/mL，纯抗生素水溶液浓度为128μg/mL，纯MOF水溶液浓度为2000μg/mL。然后将第1纵列孔中的溶液(共200μL)混合均匀，吸取100μL至第2纵列，混合均匀后再吸取100μL至第3纵列，以此类推至第11纵列，此时第1至11纵列孔中混合液体体积都为100μL。第12纵列不加任何抗菌剂，作为空白对照。用MHB将实施例三中制备的菌悬液稀释至约105cfu/mL，然后在96孔板每个孔中加入100μL，并在37℃下温育18～20h。孔中溶液没有出现浑浊且OD595nm低于空白对照组的20％的最低药物浓度被认为是有效的MIC值。
结果表明：对于金黄色葡萄球菌(ATCC29213)，纯抗生素的MIC值为8μg·mL-1，纯MOF的MIC值为125μg·mL-1，而实施例一制备的纳米抗菌剂的MIC值为16.1μg·mL-1，其中所含抗生素浓度为0.5μg·mL-1，比纯抗生素组降低了93.75％，所含MOF的浓度为15.6μg·mL-1，比纯MOF组降低了87.52％；对于沙门氏菌(LT2)，纯抗生素的MIC值为4μg·mL-1，纯MOF的MIC值为250μg·mL-1，而实施例一制备的纳米抗菌剂的MIC值为32.2μg·mL-1，其中所含抗生素浓度为1.0μg·mL-1，比纯抗生素组降低了75％，所含MOF的浓度为31.2μg·mL-1，比纯MOF组降低了87.52％。具体MIC值见表1。
实施例三：实施例一制备的纳米抗菌剂中抗生素和MOF在抗菌时交互作用的验证：
为了评估实施例一制备的纳米抗菌剂中抗生素和MOF材料的交互作用，采用微量棋盘稀释法对该纳米抗菌剂进行检测。采用96孔无菌微孔板，参照实施例二中MIC值测定方法，确定纳米抗菌剂中抗生素和MOF对金黄色葡萄球菌(ATCC29213)和沙门氏菌(LT2)的MIC值并使用以下公式计算其部分抑菌浓度(FIC)指数：
Figure BDA0001733359980000081
实施例一制备的纳米抗菌剂中抗生素和MOF组分对金黄色葡萄球菌(ATCC29213)和沙门氏菌(LT2)的FIC指数见表1。
表1纯抗生素、纯MOF和实施例一制备的纳米抗菌剂对金黄色葡萄球菌(ATCC29213)
和沙门氏菌(LT2)的MIC值以及FIC指数
Figure BDA0001733359980000091
FIC指数解释如下：FIC≤0.5，协同作用；0.5<FIC≤1，加和作用；1<FIC≤2，无关作用；FIC>2，拮抗作用。
由表1可知，相比于纯抗生素和纯MOF组，实施例一制备的纳米抗菌剂对金黄色葡萄球菌(ATCC29213)和沙门氏菌(LT2)的MIC值都有显著的降低，即实施例一制备的纳米抗菌剂抗菌活性优于抗生素和MOF材料单独使用。通过计算相应的FIC指数，验证了实施例一制备的纳米抗菌剂中MOF和抗生素两种组分在抗菌效应中起到协同作用(FIC指数<0.5)。
实施例四：实施例一制备的纳米抗菌剂高效消除胞内致病菌活性的检测：
选择小鼠单核巨噬细胞RAW264.7作为宿主细胞，在补充有10％胎牛血清(FBS)的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)中培养；选用常见的兼性胞内寄生菌金黄色葡萄球菌的标准株(ATCC29213)作为侵染细菌。
胞内寄生菌消除率测定：实施例一制备的纳米抗菌剂的抗菌活性采用平板稀释法进行计数并计算胞内菌消除率。将RAW264.7巨噬细胞以每孔105的细胞密度培养于24孔板中2小时至贴壁，弃培养基，按照感染复数(MOI)＝10～20用金黄色葡萄球菌(ATCC29213)对细胞进行1小时的侵染后，用预热的PBS洗三次，将培养物维持在补充有50μg·mL-1庆大霉素的完全培养基中1小时，以抑制胞外致病菌的生长，然后吸弃培养基，PBS洗三次，用含有等量的待测纳米抗菌剂(安全剂量50μg/mL)或对照组材料的无双抗培养基培养2小时，吸弃培养基，PBS洗三次，将培养基更换为新鲜培养基并在37℃下培养过夜。用含有0.1％曲拉通X-100的PBS裂解细胞并经过一系列梯度稀释，取100μL涂布于琼脂平板，37℃培养16小时后测定细胞内存活细菌的数量并计数菌落形成单位(CFU)并按以下公式计算消除率。
Figure BDA0001733359980000101
其中，对照组包括空白对照组(PBS)、对照组1(纯MOF组)、对照组2(纯抗生素组)、对照组3(抗生素-MOF复合物组)和对照组4(MOF-透明质酸复合物组)。对照组1-5制备方法参照实施例1并做相应修改。该纳米抗菌剂和各对照组的胞内菌消除率见表2。
由表2可知，与对照组1(纯MOF组)、对照组2(纯抗生素组)、对照组3(抗生素-MOF复合物组)和对照组4(MOF-透明质酸复合物组)相比，实施例一制备的纳米抗菌剂对胞内菌具有更显著的消除作用，在安全剂量范围内最高消除率可达到98.86％，是纯MOF组消除率的6.73倍，是纯抗生素组的2.19倍。这说明实施例一制备的纳米抗菌剂，通过透明质酸的功能化作用以及抗生素和MOF的协同抗菌作用，促进了细胞对抗菌剂的摄取且抗菌剂中的抗生素和MOF组分协同作用，对胞内菌产生更明显的杀菌活性，在一定程度上克服了消除胞内菌过程中药物渗透性和保留性差的难题。
表2 各组胞内菌消除率
组别 胞内菌消除率(％)
空白对照组 0.00±5.71
对照组1 14.70±10.55
对照组2 45.08±6.58
对照组3 62.41±8.35
对照组4 78.68±1.34
实施例一制备的纳米抗菌剂 98.86±0.61
实施例五：实施例一制备的纳米抗菌剂的抗菌靶向性验证：
为了验证实施例一制备的纳米抗菌剂对细菌感染区的靶向性，进行了纳米抗菌剂中抗生素的释放实验。将实施例一制备的纳米抗菌剂分别溶于代表细菌感染(pH＝5.5)和正常生理条件(pH＝7.4)的PBS缓冲液中，制备1mg/mL的纳米抗菌剂溶液，然后将其置于透析袋(3500KDa)中，完全浸入相应pH的PBS缓冲液中，纳米抗菌剂溶液与PBS缓冲液的初始体积比为1:4，在保持恒温(37±0.5℃)的培养箱中振荡培养8小时，固定时间间隔取出1.0mL缓冲液，并加入等量的相同pH的新鲜缓冲液以保持恒定的体积。根据四环素的紫外吸收特征峰值(274nm或358nm)与浓度的线性关系，采用紫外可见分光光度法分析药物的释放量。根据以下公式计算药物释放率：
Figure BDA0001733359980000111
实施例一制备的纳米抗菌剂中抗生素在pH＝5.5的PBS缓冲液和pH＝7.4的PBS缓冲液中的释放曲线如图7。
图7为实施例一制备的纳米抗菌剂在缓冲液中随时间的释放曲线，图中1为实施例一制备的纳米抗菌剂在pH值为5.5的PBS缓冲液中随时间的释放曲线，2为实施例一制备的纳米抗菌剂在pH值为7.4的PBS缓冲液中随时间的释放曲线。
从图7可知，在pH值为5.5的缓冲体系中，实施例一制备的纳米抗菌剂在在3小时内迅速释放，且最终释放效率高达80％以上，表明在模拟细菌感染的酸性体系中，实施例一制备的纳米抗菌剂能够将封装的抗生素高效释放，这被认为与所选择的MOF骨架由于金属离子与配体之间的配位键断裂而溶解有关。在pH值为7.4的缓冲体系中，实施例一制备的纳米抗菌剂最终释放效率约为20％，可以由此推测其在正常生理条件下(pH≈7.4)的稳定性。综上所述，实施例一制备的纳米抗菌剂是pH敏感性的药物递送系统，可以控制抗生素在细菌感染的酸性部位高效释放，而在正常的生理条件中稳定存在，因而可以提高抗生素的利用率，增强其靶向抗菌的效果。

Claims (9)

1.一种纳米抗菌剂的制备方法，其特征在于一种纳米抗菌剂为透明质酸钠对MOF和抗生素的协同体系进行表面修饰；所述的MOF和抗生素的协同体系为抗生素封装于沸石咪唑酯骨架结构材料ZIF-8中，制备方法是按以下步骤完成的：
一、制备MOF和抗生素的协同体系：
将Zn(NO)3·6H2O水溶液和抗生素溶液在搅拌速度为250r/min～450r/min下搅拌反应1min～3min，再滴加2-甲基咪唑水溶液，再在搅拌速度为250r/min～450r/min下搅拌反应10min～20min，再离心分离，收集沉淀物；使用去离子水对收集的沉淀物清洗3次～5次，得到MOF和抗生素的混合物；将MOF和抗生素的混合物分散到去离子水中，得到MOF和抗生素的协同体系；
步骤一中所述的Zn(NO)3·6H2O水溶液与抗生素溶液的体积比为1:(2～6)；
步骤一中所述的Zn(NO)3·6H2O水溶液与2-甲基咪唑水溶液的体积比为1:(8～12)；
二、向MOF和抗生素的协同体系中加入透明质酸钠溶液，混合均匀，再在室温下静置30min～240min，再离心分离，收集沉淀物质，再在室温下真空干燥，得到纳米抗菌剂；
步骤二中所述的MOF和抗生素的协同体系与透明质酸钠溶液的体积比为3:1。
2.根据权利要求1所述的一种纳米抗菌剂的制备方法，其特征在于所述的沸石咪唑酯骨架结构材料ZIF-8由Zn(NO)3·6H2O提供金属离子，2-甲基咪唑作为配体，去离子水为分散介质，在室温下经交联相互作用形成。
3.根据权利要求1所述的一种纳米抗菌剂的制备方法，其特征在于所述的抗生素为四环素类抗生素、氨基糖苷类抗生素、内酰胺类抗生素或多肽类抗生素。
4.根据权利要求3所述的一种纳米抗菌剂的制备方法，其特征在于所述的四环素类抗生素为四环素、金霉素、土霉素、强力霉素或二甲胺基四环素；所述的氨基糖苷类抗生素为链霉素、庆大霉素、卡那霉素或妥布霉素；所述的内酰胺类抗生素为青霉素；所述的多肽类抗生素为万古霉素。
5.根据权利要求1所述的一种纳米抗菌剂的制备方法，其特征在于步骤一中所述的Zn(NO)3·6H2O水溶液的浓度为0.1g/mL～0.3g/mL。
6.根据权利要求1所述的一种纳米抗菌剂的制备方法，其特征在于步骤一中所述的抗生素溶液的浓度为0.5mg/mL～5mg/mL。
7.根据权利要求1所述的一种纳米抗菌剂的制备方法，其特征在于步骤一中所述的2-甲基咪唑水溶液的浓度为0.1g/mL～0.3g/mL。
8.根据权利要求1所述的一种纳米抗菌剂的制备方法，其特征在于步骤一中所述的MOF和抗生素的协同体系中MOF和抗生素的混合物的浓度为40mg/mL～50mg/mL。
9.根据权利要求1所述的一种纳米抗菌剂的制备方法，其特征在于步骤二中所述的透明质酸钠溶液的浓度为0.8mg/mL～1.5mg/mL。
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