CN111529682A - 一种趋化抗菌纳米材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种趋化抗菌纳米材料,包括氧化石墨烯和包覆于氧化石墨烯表面的聚多巴胺,所述聚多巴胺表面吸附有抗菌肽,在所述抗菌肽上通过化学反应加载有趋化剂。其解决了细菌入侵机体以及细菌、药物在组织残留的问题。本发明还公开了上述趋化抗菌纳米材料的制备方法及应用。
Description
技术领域
本发明涉及医用卫生材料,具体涉及一种趋化抗菌纳米材料及其制备方法和应用。
背景技术
感染对人类健康构成巨大的威胁,在过去的几十年里,抗生素为感染性疾病带来的希望,拯救了许多生命。但是抗生素引发的过敏反应、毒性反应以及细菌耐药性等问题不容小觑。非抗生素抗菌剂是目前抗菌研究的重要方向。
目前所研究的非抗生素抗菌剂主要包括原始金属纳米粒子、氧自由基、光热材料、抗菌肽等等。这些材料和方法尽管在杀灭细菌方面具有一定的优势,但也有一些局限性,如选择性差、损伤正常组织和细胞、低活性和不稳定性等。此外,细菌和药物的残留对组织有非常严重的影响。因此,将细菌从伤口组织中引出、捕获并杀死,将是减少药物、细菌在组织内残留、降低组织损伤的有效方式。
当前非抗生素抗菌方法的研究热点主要有抗菌肽、光热疗法和有毒的小分子。抗菌肽是一种由多细胞生物分泌的对抗病原微生物的防御物质,它与细菌结合可以通过增加膜通透性,从而破坏其屏障功能。细菌膜的结构比较保守、难以突变,因此抗菌肽不易引起细菌耐药性,有望作为抗生素的理想替代品。然而,抗菌肽不够稳定,需要载体支持。
石墨烯、金纳米棒等光热材料既具有抗菌性能,又是良好的载体。例如,氧化石墨烯GO可以吸收808nm的近红外光并将其转换为热能。此外,GO带有丰富的基团如羧基和羟基,它们可以通过化学反应来连接不同类型的小分子,因此它可以作为一种很好的载体。为此,我们推测抗菌肽和GO的组合将形成一种非常优异的抗菌系统。
但是细菌和药物残留对组织有非常严重的影响。细菌的趋化性是指环境刺激,特别是化学物质,它能驱动细菌向生理上有利的位置移动。细菌趋化的主要机制是细菌鞭毛通过周期性的交替平滑游动和短暂的方向性变化,从而执行有偏向的随机运动。细菌趋化性显示了将细菌从感染部位转移出去的潜力,然而目前几乎没有利用细菌趋化性设计抗菌材料的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种趋化抗菌纳米材料及其制备方法和应用,其解决了细菌入侵机体以及细菌、药物在组织残留的问题。
本发明所述的趋化抗菌纳米材料,包括氧化石墨烯和包覆于氧化石墨烯表面的聚多巴胺,所述聚多巴胺表面吸附有抗菌肽,在所述抗菌肽上通过化学反应加载有趋化剂。
进一步,所述氧化石墨烯为单片层结构。
进一步,所述抗菌肽为短杆菌肽、乳酸杆菌素、天蚕素、防御素、蛙皮抗菌肽或乳链菌肽;所述趋化剂为赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸或硫化物。
进一步,所述抗菌肽为HHC-36,序列为KRWWKWWRR,所述趋化剂为L-赖氨酸。
一种趋化抗菌纳米材料的制备方法,其包括如下步骤:
S1,将盐酸多巴胺加入到Tris-HCl缓冲液中,然后加入氧化石墨烯,超声处理后,搅拌反应,以在氧化石墨烯表面包覆聚多巴胺,离心,得到PDA@GO;
S2,将抗菌肽和S1得到的PDA@GO加入到Tris-HCl缓冲液中,搅拌反应,以在聚多巴胺表面吸附抗菌肽,离心,得到抗菌肽-PDA@GO;
S3,将趋化剂溶解于Tris-HCl缓冲液中得到趋化剂溶液,先加入NHS在温度为25~30℃的条件下搅拌反应2~3h,然后加入EDC和抗菌肽-PDA@GO,搅拌反应,以在抗菌肽上通过脱水缩合反应加载趋化剂,离心,得到趋化抗菌纳米材料即趋化剂/抗菌肽-PDA@GO。
进一步,所述S1中盐酸多巴胺和氧化石墨烯的质量比为2:1;所述S2中PDA@GO和抗菌肽的质量比为5~6:1;所述S3中抗菌肽-PDA@GO和趋化剂的质量比为1:1~2。
进一步,所述S1中盐酸多巴胺按0.2mg/mL的浓度加入到Tris-HCl缓冲液中。
进一步,所述S3中趋化剂在反应溶液中的浓度为10mM,所述NHS和EDC在反应溶液中的浓度均为0.2mg/mL。
进一步,所述S1、S2和S3中的Tris-HCl缓冲液浓度为10mM,pH值为8.5。
上述趋化抗菌纳米材料或上述制备方法制备得到的趋化抗菌纳米材料在抗菌生物制剂中的应用。
本发明与现有技术相比具有如下有益效果。
1、本发明在氧化石墨烯表面包覆聚多巴胺,一方面由于聚多巴胺粘性较大,利于吸附抗菌肽,另一方面聚多巴胺能够隔开氧化石墨烯和抗菌肽,避免两者直接接触反应生成沉淀。趋化剂通过化学反应加载于抗菌肽上,实现了细菌趋化剂与抗菌剂联合。
2、本发明所述的趋化抗菌纳米材料由于加载有趋化剂,具有相当强的细菌趋化性能,并且能在短时间内聚集细菌。此外,由于该纳米材料本身具有抗菌肽,具有杀菌性,在细菌聚集的时候纳米材料对细菌的抑制作用也逐渐显现出来,直到细菌的趋化与杀菌达到一个平衡,此后,死亡的细菌占多数,因此,被趋化的活细菌数量呈现一种先增后减的趋势。
3、本发明所述的趋化抗菌纳米材料对铜绿假单胞菌的抑菌率能够达到100%,在治疗感染性伤口时,可以完全避免细菌对创面的影响,促进创面愈合。同时,该趋化抗菌纳米材料对创面细菌的趋化呈现一种3D效应,能吸引创面表层以及组织内部的细菌,避免细菌的侵袭感染。此外,由于材料无需进入组织内部,减少了细菌、药物在组织内的残留,对机体起到良好的保护作用。
附图说明
图1是本发明所述趋化抗菌纳米材料的制备流程示意图;
图2是本发明所述趋化抗菌纳米材料的趋化抗菌示意图;
图3是本发明实施例一制得的趋化抗菌纳米材料的透射电镜图;
图4是本发明实施例一制得的趋化抗菌纳米材料的原子力显微镜图;
图5是不同组别材料的运动琼脂平板趋化效果图;
图6是不同组别材料的运动琼脂平板趋化效果的定量分析图;
图7是不同组别材料的毛细管趋化效果图;
图8是不同组别材料的体外抗菌效果图;
图9是不同组别材料的体外抗菌效果数据统计图;
图10是本发明实施例一制得的趋化抗菌纳米材料的细胞活性示意图;
图11是采用不同组别材料治疗动物皮肤创面的伤口表面细菌量示意图;
图12是采用不同组别材料治疗动物皮肤创面的伤口表面细菌数据统计图之一;
图13是采用不同组别材料治疗动物皮肤创面的伤口表面细菌数据统计图之一;
图14是采用不同组别材料治疗动物皮肤创面的伤口组织细菌量示意图;
图15是采用不同组别材料治疗动物皮肤创面的伤口组织细菌数据统计图之一;
图16是采用不同组别材料治疗动物皮肤创面的伤口组织细菌数据统计图之二;
图17是不同组别的动物皮肤创面治疗效果测试的创面照片;
图18是不同组别的动物皮肤创面治疗效果测试的愈合率统计图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作详细说明。
实施例一,一种趋化抗菌纳米材料,包括氧化石墨烯和包覆于氧化石墨烯表面的聚多巴胺,所述聚多巴胺表面吸附有抗菌肽,在所述抗菌肽上通过化学反应加载有趋化剂,所述氧化石墨烯GO为片状结构,片径约500nm,抗菌肽为短杆菌肽HHC-36,序列为KRWWKWWRR,所述趋化剂为L-赖氨酸,即L-Lysine,为便于说明将其缩写为L-Lys。参见图2,所述的趋化抗菌纳米材料具有相当强的细菌趋化性能,并且能在短时间内聚集细菌,趋化抗菌纳米材料对创面细菌的趋化呈现一种3D效应,能吸引创面表层以及组织内部的细菌,避免细菌的侵袭感染。此外,由于材料无需进入组织内部,减少了细菌、药物在组织内的残留,对机体起到良好的保护作用。
采用盐酸多巴胺与氧化石墨烯反应在氧化石墨烯表面包覆聚多巴胺,所述盐酸多巴胺和氧化石墨烯的质量比为2:1。抗菌肽和包覆有聚多巴胺的氧化石墨烯的质量比为1:5。趋化剂和吸附有抗菌肽的氧化石墨烯的质量比为1:1。
实施例二,参见图1,实施例一所述的趋化抗菌纳米材料的制备方法包括如下步骤:
S1,将16mg盐酸多巴胺加入到80mL的Tris-HCl缓冲液中,摇晃混匀,所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10mM,pH值为8.5。然后加入8mg氧化石墨烯,超声处理30min后,常温下在磁力搅拌器上搅拌反应24h,以在氧化石墨烯表面包覆聚多巴胺。再以12000rpm高速离心30min,收集离心产物,使用超纯水对离心产物进行洗涤并离心,重复三次,得到纯净的PDA@GO。
S2,将HHC-36和S1得到的PDA@GO分别溶于溶剂中得到浓度为1mg/mL的HHC-36溶液和浓度为1mg/mL的P DA@GO溶液,取1mL的PDA@GO溶液和200μL的HHC-36溶液加入到9mL的Tris-HCl缓冲液中得到混合液,所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10mM,pH值为8.5。常温下将混合液在磁力搅拌器上搅拌反应12h,以在聚多巴胺表面吸附抗菌肽。再以12000rpm高速离心30min,收集离心产物,使用超纯水对离心产物进行洗涤并离心,重复三次,得到纯净的HHC-36-PDA@GO;
S3,将L-赖氨酸和S2得到的HHC-36-PDA@GO分别溶于溶剂中得到浓度为100mM的L-赖氨酸溶液和浓度为1mg/mL的HHC-36-PDA@GO溶液。取1mL的L-赖氨酸溶液、1mL的NHS和6mL的Tris-HCl缓冲液混合在一起,所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10mM,pH值为8.5,在温度为30℃的条件下搅拌反应2h。然后加入1mL的HHC-36-PDA@GO和1mL的EDC,在室温条件下搅拌反应12h,以在抗菌肽上通过脱水缩合反应加载趋化剂。再以12000rpm高速离心30min,收集离心产物,使用超纯水对离心产物进行洗涤并离心,重复三次,得到纯净的L-Lys/HHC-36-PDA@GO,即得到趋化抗菌纳米材料。
所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺,其浓度为2mg/mL。所述EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,其浓度为2mg/mL。
针对得到的产物进行性能测试,具体如下:
1)透射电镜观察:将制备的趋化抗菌纳米材料稀释后滴加于云母片上,经真空干燥后采用透射电子显微镜观察趋化抗菌纳米材料的二维结构。结果参见图3,所述趋化抗菌纳米呈片层状,片径约500nm。
2)原子力显微镜观察:将制备的趋化抗菌纳米材料稀释后滴加于云母片上,经真空干燥后采用原子力显微镜观察趋化抗菌纳米材料的三维结构。结果参见图4,所述趋化抗菌纳米材料为薄片层结构,片径约500nm,厚度约4-5nm。
3)细菌趋化效应测试。
首先制备运动琼脂平板,将0.8g琼脂粉、1g蛋白胨、0.3g酵母粉和0.5g氯化钠添加到锥形瓶中,加入100mL超纯水,然后煮沸5分钟,待成分完全溶解后,在温度为40℃时将溶液的pH值调整到7.4。再将锥形瓶经121℃高压蒸汽灭菌20分钟,然后将溶液在冷却至约40℃时倒入空平皿中。每100mm2的平皿中加入15mL琼脂溶液,将平皿在4℃冰箱中冷却固化。在上述制备的运动琼脂平板内制备9个孔,中央孔直径16mm;周边八孔对称排列,孔径均为8mm。
运动琼脂平板趋化效果评估:将50μL化学引诱剂分别加入琼脂平板的侧孔中,按顺时针方向(1~8孔)依次是PBS、HHC-36、L-Lysine、GO、PDA、PDA@GO、HHC-36-PDA@GO和L-Lys/HHC-36-PDA@GO溶液,所述L-Lys/HHC-36-PDA@GO由上述制备方法制得。将运动琼脂平板在室温放置1h形成浓度梯度。然后,在中心孔中加入100μL铜绿假单胞菌PAO1细菌悬液(~109CFU/mL),将运动琼脂平板在温度为30℃的烘箱中培养过夜。24小时后观察平板上的菌落情况。结果参见图5,第8个孔即L-Lys/HHC-36-PDA@GO所在孔周边的细菌数量最多,表面了制得的趋化抗菌纳米材料具有良好的细菌趋化效应。
随后,为了定量评估细菌在运动琼脂平板上的趋化效果,将琼脂按图5实线框所示剪下,剪下琼脂的尺寸为14mm×14mm,溶于1ml的PBS缓冲液中,混合均匀后测量溶液在600nm处的吸光度值。结果参见图6,L-Lys/HHC-36-PDA@GO所在孔的细菌吸光度最高,是对照组的11.0倍、L-lysine的10.4倍、HHC-36-PDA@GO的2.7倍。进一步说明了所得趋化抗菌纳米材料的趋化性能最强,甚至远高于原始的趋化剂L-赖氨酸。
4)毛细管趋化效果评估,将细菌悬液中PAO1的数量调整为6×107CFU/mL,并在Eppendorf管中加入1mL细菌悬液。将容量为20μL、长度为20cm、内径为0.8mm的微毛细管分为4组,分别是PBS缓冲液、L-Lys、HHC-36-PDA@GO和采用上述制备方法制得的L-Lys/HHC-36-PDA@GO,每组12个微毛细管。将微毛细管的一端插入化学引诱剂溶液中,将液体吸引至10μL高,然后将另一端密封以保持液位。将微毛细管的液体端再次插入细菌悬液中。分别在15、30、45及60分钟后取出各组的3只微毛细管,用PBS冲洗3次,将试管外壁上残留的细菌清除干净。将毛细管内溶液适当稀释10-1、10-2、10-3后均匀地涂在营养琼脂板上。营养琼脂板在温度为37℃的条件下培养过夜后,计数平板上的菌落数。结果参见图7,L-Lys/HHC-36-PDA@GO组的细菌趋化量最大,且细菌量呈现一种先升后降的趋势,这是由于后期趋化的细菌被趋化抗菌纳米材料杀灭的原因。
5)体外抗菌性能评估,将制得的趋化抗菌纳米材料溶于溶剂中,得到浓度为1mg/mL的溶液,分别将Control、GO、PDA@GO、HHC-36-PDA@GO和趋化抗菌纳米材料溶液添加到800μL的铜绿假单胞菌PAO1菌液(~109CFU/mL)中,各个组别溶液的添加量均为200μL,然后将混合溶液在温度为37℃的条件下孵育30分钟,Control组裁采用PBS缓冲液。NIR组使用808nm近红外激光在0.75W/cm2功率下照射7分钟,非NIR组即不采用激光照射。然后将溶液稀释并均匀地散布在营养琼脂板上,在温度为37℃的条件下孵育20小时后,使用自动菌落计数仪计数营养琼脂平板上的菌落数。结果参见图8和图9,在非NIR组中,L-Lys/HHC-36-PDA@GO即趋化抗菌纳米材料溶液的抑菌率最低,在NIR组中,L-Lys/HHC-36-PDA@GO即趋化抗菌纳米材料溶液的抑菌率达到了100%。
6)细胞毒性实验,采用3T3成纤维细胞对制得的趋化抗菌纳米材料进行细胞毒性试验。
3T3成纤维细胞在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中,在温度为37℃、含5%CO2培养箱中培养。将2×103个3T3成纤维细胞接种于96孔板每孔中,培养基为200μL,孵育24小时。然后吸弃培养基,用PBS洗涤孔板3次。将制得的趋化抗菌纳米材料溶于溶剂中分别得到浓度为0.2、0.4和0.8mg/mL的L-Lys/HHC-36-PDA@GO溶液,采用含有浓度为0.2、0.4和0.8mg/mL的L-Lys/HHC-36-PDA@GO溶液的新鲜培养基培养细胞。每种浓度六个孔,纯DMEM培养基组作为对照组。培养24、48或72h后,吸弃培养基,用PBS洗涤3次。加入含10%的CCK-8溶液的100μL的DMEM,在温度为37℃的条件下孵育30min,用酶标仪测量各培养液在450nm处的吸光度,根据对照组吸光度值计算细胞活力。结果参见图10,不同浓度的L-Lys/HHC-36-PDA@GO处理后的细菌活力均在90%以上,表明了制得的趋化抗菌纳米材料无细胞毒性。
7)创面愈合实验,将小鼠随机分为A、B、C、D、E、F、G七组,每组六只,A为对照组,B为空白组,C为HHC-36-PDA@GO组,D为HHC-36-PDA@GO+NIR组,E为L-Lys/HHC-36-PDA@GO组,F为L-Lys/HHC-36-PDA@GO+NIR组,G为PBS+NIR组。空白组为阴性对照,即小鼠未感染PAO1。将5μL不同组别的材料配制为溶液滴入伤口,然后轻轻触摸伤口周围皮肤,使溶液均匀地充满伤口。D、F和G组均使用808nm近红外激光在0.75W/cm2功率下照射各创面7分钟,然后用伤口贴膜覆盖伤口。
分别于术后1、3、5、7天取下贴膜,对创面进行拍照,然后再次用不同组别的药物治疗。同时,术后3、7天,用湿棉签收集创面细菌,采用标准平板计数法计数细菌量。用生理盐水仔细冲洗创面3遍后,收集各组所有小鼠6×6mm的创面组织,溶于生理盐水,使用匀浆机对组织进行匀浆,采用标准平板计数法计数细菌数量。接下来,用ImageJ软件测量不同时间的创面面积。
按照以下公式计算伤口愈合面积:伤口愈合面积(%)=(X-Y)/X×100%。其中X表示初始伤口面积,Y表示某一时刻未愈合的伤口面积。
结果参见图11至图18,L-Lys/HHC-36-PDA@GO+NIR组的抗菌效果显著,无论是创面还是组织内都能达到完全抗菌的效果;该组的创面愈合率与空白组相似,说明趋化抗菌材料可以完全消除细菌对创面的影响,达到了正常创面愈合效果。
需要说明的是,性能测试对比分析采用的材料GO即氧化石墨烯、L-Lysine即L-赖氨酸与上述制备方法采用的原材料相同,PDA@GO即聚多巴胺包覆氧化石墨烯表面由上述制备方法的S1制得,HHC-36-PDA@GO即HHC-36吸附于聚多巴胺表面由上述制备方法的S2制得。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种趋化抗菌纳米材料,其特征在于:包括氧化石墨烯和包覆于氧化石墨烯表面的聚多巴胺,所述聚多巴胺表面吸附有抗菌肽,在所述抗菌肽上通过化学反应加载有趋化剂。
2.根据权利要求1所述的趋化抗菌纳米材料,其特征在于:所述氧化石墨烯为单片层结构。
3.根据权利要求1或2所述的趋化抗菌纳米材料,其特征在于:所述抗菌肽为短杆菌肽、乳酸杆菌素、天蚕素、防御素、蛙皮抗菌肽或乳链菌肽;
所述趋化剂为赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、α酮戊二酸或硫化物。
4.根据权利要求1或2所述的趋化抗菌纳米材料,其特征在于:所述抗菌肽为HHC-36,序列为KRWWKWWRR,所述趋化剂为L-赖氨酸。
5.一种趋化抗菌纳米材料的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1,将盐酸多巴胺加入到Tris-HCl缓冲液中,然后加入氧化石墨烯,超声处理后,搅拌反应,以在氧化石墨烯表面包覆聚多巴胺,离心,得到PDA@GO;
S2,将抗菌肽和S1得到的PDA@GO加入到Tris-HCl缓冲液中,搅拌反应,以在聚多巴胺表面吸附抗菌肽,离心,得到抗菌肽-PDA@GO;
S3,将趋化剂溶解于Tris-HCl缓冲液中得到趋化剂溶液,先加入NHS在温度为25~30℃的条件下搅拌反应2~3h,然后加入EDC和抗菌肽-PDA@GO,搅拌反应,以在抗菌肽上通过脱水缩合反应加载趋化剂,离心,得到趋化抗菌纳米材料即趋化剂/抗菌肽-PDA@GO。
6.根据权利要求5所述的趋化抗菌纳米材料的制备方法,其特征在于:所述S1中盐酸多巴胺和氧化石墨烯的质量比为2:1;所述S2中PDA@GO和抗菌肽的质量比为5~6:1;所述S3中抗菌肽-PDA@GO和趋化剂的质量比为1:1~2。
7.根据权利要求5或6所述的趋化抗菌纳米材料的制备方法,其特征在于:所述S1中盐酸多巴胺按0.2mg/mL的浓度加入到Tris-HCl缓冲液中。
8.根据权利要求5或6所述的趋化抗菌纳米材料的制备方法,其特征在于:所述S3中趋化剂在反应溶液中的浓度为10mM,所述NHS和EDC在反应溶液中的浓度均为0.2mg/mL。
9.根据权利要求5或6所述的趋化抗菌纳米材料的制备方法,其特征在于:所述S1、S2和S3中的Tris-HCl缓冲液浓度为10mM,pH值为8.5。
10.权利要求1~4任一项所述趋化抗菌纳米材料或权利要求5~9任一项所述制备方法制备得到的趋化抗菌纳米材料在抗菌生物制剂中的应用。
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