CN108355140A - 一种叶酸靶向载药纳米金颗粒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种叶酸靶向载药纳米金颗粒及其应用。该叶酸靶向载药纳米金颗粒以纳米金颗粒作为载体，作为载体的纳米金颗粒为以牛血清白蛋白为模板合成的纳米金颗粒，所述的纳米金颗粒修饰有叶酸分子且负载有阿霉素，纳米金颗粒以顺乌头酸酐作为连接键结合阿霉素。该复合物对表面叶酸受体过量表达的肿瘤细胞有较好的杀伤作用，对癌症的靶向治疗具有很好的应用价值。

Description

一种叶酸靶向载药纳米金颗粒及其应用
技术领域
本发明涉及复合纳米材料制备和生物医学应用领域，具体涉及一种叶酸靶向载药纳米金颗粒及其应用。
背景技术
现代癌症已经成为人类健康的头号杀手之一。2007年4月3日世界卫生组织国际癌症研究机构主任博伊尔博士在记者会上披露，过去四十年以来癌症作为一个全球性的问题，其重点正在从高收入国家向中低收入国家转移；癌症病人的数量增长很快，增长主要来自中低收入国家。因此，不断提高癌症治疗水平，开发新型癌症治疗手段，研制更有效、毒副作用更小的抗癌药物成为广大相关科研、医务工作者刻不容缓的责任。癌症治疗的方法迄今已经发展了有十几种之多，例如：化学治疗、放射疗法、外科手术、骨髓移植、生物疗法、基因治疗、光动力学治疗、过热疗法及激素治疗等等。其中，发展比较早且使用广泛的治疗方法是化疗、放疗和手术治疗，但是存在毒副作用大或适用范围窄等一些缺点。现有癌症治疗方法的主要缺点在于：药物或治疗手段对癌细胞的靶向性不高，不能有效区分癌细胞和正常细胞，特别是化疗及一些蛋白质药物具有很高的细胞毒性，在治疗的同时也对正常机体造成很大损伤。提高治疗的靶向性无疑是改进癌症治疗效果的一个有效途径。
阿霉素是一种抗肿瘤谱广泛的化疗药物，可以抑制DNA的合成从而达到抗肿瘤效果。但是阿霉素具有损伤骨髓造血功能、心脏毒性大等药物副作用，如何将阿霉素靶向运输到肿瘤部位并减少其在正常组织中的分布将成为研究的关键。随着纳米技术的发展，纳米医学受到了越来越广泛的关注并对疾病治疗提供了许多新的思路。其中，纳米金由于生物相容性好、性质稳定、合成简便、容易修饰、无毒等优点一直是研究的热点之一，并广泛应用于生物成像、生物传感、载药等领域。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：克服现有技术不足，提供一种叶酸靶向载药纳米金颗粒及其制备方法和应用。以纳米金作为载体，结合叶酸提供靶向功能，结合阿霉素作为化疗药物，建立叶酸靶向的纳米金载体并负载阿霉素，该复合物对表面叶酸受体过量表达的肿瘤细胞有较好的杀伤作用，对癌症的靶向治疗具有很好的应用价值。
为了解决上述问题，本发明提供了一种叶酸靶向载药纳米金颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备BSA修饰的纳米金颗粒：以牛血清白蛋白(BSA)为模板合成纳米金颗粒；
(2)纳米金颗粒负载阿霉素：步骤(1)制得的纳米金颗粒以顺乌头酸酐作为连接键结合阿霉素，得载药纳米金颗粒；
(3)叶酸修饰载药纳米金颗粒：以叶酸作为靶向分子，修饰步骤(2)所得的载药纳米金颗粒。
进一步的，所述的一种叶酸靶向载药纳米金颗粒的制备方法包括以下步骤：
(1)制备BSA修饰的纳米金颗粒：将牛血清白蛋白溶液与氯金酸溶液混合，室温下搅拌均匀，再加入抗坏血酸继续搅拌至溶液由浅蓝色先变为无色再变为蓝紫色，即得纳米金溶胶；
(2)纳米金颗粒负载阿霉素：将盐酸阿霉素溶解于蒸馏水中冰浴得阿霉素溶液，将顺乌头酸酐溶解于1,4-二氧六环中，缓慢加入阿霉素溶液中搅拌均匀，向混合溶液中加入NaOH迅速将溶液的pH调至9.0±0.3，在冰水浴中反应10-60min，然后加入HCl将pH调至7.0±0.3，搅拌均匀，随后继续滴加HCl直至形成较大沉淀，冰浴10-60min后，离心去除上清液，得到沉淀物，所得沉淀物与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)一起溶解于蒸馏水中，室温黑暗中搅拌数小时，所得混合溶液与步骤(1)所得的纳米金溶胶混合后继续黑暗中搅拌数小时，待反应完成之后，通过葡萄糖凝胶G-25分离去除多余的牛血清和阿霉素，即得载药纳米金溶胶；
(3)叶酸修饰载药纳米金颗粒：将叶酸溶解于二甲基亚砜(DMSO)中得叶酸溶液，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合在室温黑暗中搅拌数小时后与叶酸溶液混合得混合溶液，将步骤(2)所得的载药纳米金溶胶加入该混合溶液，室温黑暗中搅拌反应完成后，通过葡萄糖凝胶G-25分离去除多余的叶酸，即得到叶酸修饰载药纳米金颗粒的分散液。
进一步的，所述的步骤(1)制备BSA修饰的纳米金颗粒：将10mL浓度为5mg/mL的牛血清白蛋白溶液与1mL浓度为10mM的氯金酸溶液混合，室温下置于磁力搅拌器上搅拌30min，转速为1000rpm，然后加入20mg抗坏血酸继续搅拌2h，溶液由最初的浅蓝色先变为无色再变为蓝紫色，即得纳米金溶胶。
进一步的，所述的步骤(2)纳米金颗粒负载阿霉素：将7mg盐酸阿霉素溶解于4mL蒸馏水中冰浴得阿霉素溶液，将5mg顺乌头酸酐溶解于200μL1,4-二氧六环中，然后缓慢加入阿霉素溶液中搅拌均匀，用0.5M NaOH迅速将溶液的pH调至9.0，溶液在冰水浴中反应20min，然后用1M HCl将溶液pH调至7.0，搅拌30min，随后继续滴加HCl直至形成较大沉淀，反应物继续冰浴15min后，离心去除上清，得到沉淀物，所得沉淀物与7mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、3mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)一起溶解于3mL蒸馏水中，室温黑暗中搅拌4h得混合溶液，将混合溶液与2mL步骤(1)所得的纳米金溶胶混合后继续黑暗中搅拌16h，反应完成之后，通过葡萄糖凝胶G-25分离去除多余的牛血清蛋白和阿霉素，即得到载药纳米金溶胶。
进一步的，所述的步骤(3)叶酸修饰载药纳米金颗粒：将5mg叶酸溶解于1mL DMSO中得叶酸溶液，3mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和2mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在室温黑暗中搅拌4h后与叶酸溶液混合得混合溶液，将3mL步骤(2)所得的载药纳米金溶胶加入该混合溶液，室温黑暗中搅拌10h，反应完成之后，通过葡萄糖凝胶G-25分离去除多余的叶酸，即得到叶酸修饰载药纳米金颗粒的分散液。
本发明还公开了由上述方法制得的叶酸靶向载药纳米金颗粒，所述的叶酸靶向载药纳米金颗粒以纳米金颗粒作为载体，作为载体的纳米金颗粒为以牛血清白蛋白为模板合成的纳米金颗粒，所述的纳米金颗粒修饰有叶酸分子且负载有阿霉素，纳米金颗粒以顺乌头酸酐作为连接键结合阿霉素。
本发明还公开了所述的叶酸靶向载药纳米金颗粒在杀伤叶酸高表达肿瘤细胞治疗肿瘤方面的应用。
进一步的，所述肿瘤细胞包括宫颈癌细胞。
本发明的有益效果是：提供一种叶酸靶向载药纳米金颗粒及其制备方法和应用。以纳米金作为载体，结合叶酸提供靶向功能，结合阿霉素作为化疗药物，建立叶酸靶向的纳米金载体并负载阿霉素，该复合物对表面叶酸受体过量表达的肿瘤细胞有较好的杀伤作用，对癌症的靶向治疗具有很好的应用价值。具体而言：
(1)本发明的叶酸靶向载药纳米金颗粒在合成过程中，以以牛血清白蛋白为模板,用抗坏血酸还原氯金酸合成的纳米金颗粒作为载体，经测试由该方法合成的纳米金颗粒的平均粒径为50nm该粒径范围有利于在体内的长期循环和肿瘤靶向治疗，且该纳米金颗粒合成简便，生物相容性好，易于修饰，且稳定性好，无细胞毒性，是很好的药物载体材料。
(2)叶酸是机体生长发育必需的营养物质，作为一种物质合成必须的维生素，叶酸在增生旺盛的细胞中需求量更大。叶酸可通过叶酸受体进入细胞，叶酸受体在正常细胞表面低表达，而在大多数肿瘤细胞表面过度表达，以使生长旺盛的肿瘤细胞获得更多的叶酸。本发明的叶酸靶向载药纳米金颗粒在纳米金颗粒表面修饰结合叶酸分子，利用叶酸受体的表达特性，将叶酸-叶酸受体作为药物靶向的重要分子，结合抗肿瘤药物阿霉素构建成叶酸靶向的载药平台，以实现抗肿瘤药物的靶向输送，实现癌症的靶向治疗。
(3)本发明的叶酸靶向载药纳米金颗粒以顺乌头酸酐作为连接键结合纳米金颗粒和阿霉素，由本发明合成的复合物对抗肿瘤药物的靶向输送和pH响应的药物缓释具有很好的效果。经测试，该叶酸靶向载药纳米金颗粒在酸性环境中(pH为3.5，5.0)可以在12小时内持续释放阿霉素，释放率到达90％，在pH为6.5时阿霉素释放率可达约60％，而在pH为7.4和9.0时，释放率仅在20％左右。在对叶酸受体高表达的癌症细胞的干预中，该复合物的杀伤作用强于游离阿霉素的杀伤作用，差异有统计学意义(T＝26，P<0.05)。即该复合物对表面叶酸受体过量表达的肿瘤细胞有较好的杀伤作用，对癌症的靶向治疗具有很好的应用价值。
附图说明
图1：实施例1合成的纳米金颗粒的TEM照片；
图2：实施例1所得产物的紫外吸收光谱；
图3：实施例1合成的纳米金颗粒对HeLa细胞的细胞毒性测试结果；
图4：实施例1合成的纳米金颗粒对MCF-7细胞的细胞毒性测试结果；
图5：实施例1合成的纳米金颗粒对HSF细胞的细胞毒性测试结果；
图6：阿霉素浓度与吸光度值的标准曲线；
图7：本发明实施例的叶酸修饰载药纳米金颗粒的DOX释放曲线；
图8：叶酸修饰载药纳米金颗粒与阿霉素对HeLa细胞的杀伤作用比较；
图9：叶酸修饰载药纳米金颗粒与阿霉素对MCF-7细胞的杀伤作用比较；
图10：叶酸修饰载药纳米金颗粒与阿霉素对HSF细胞的杀伤作用比较。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过实施方式对本方案进行阐述。
实施例1
一种叶酸靶向载药纳米金颗粒的制备方法，包括以下步骤：一种叶酸靶向载药纳米金颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备BSA修饰的纳米金颗粒：将10mL浓度为5mg/mL的牛血清白蛋白溶液(BSA)与1mL浓度为10mM的氯金酸溶液混合，室温下置于磁力搅拌器上搅拌30min，转速为1000rpm，然后加入20mg抗坏血酸继续搅拌2h，溶液由最初的浅蓝色先变为无色再变为蓝紫色，即得纳米金(Au-BSA纳米颗粒)溶胶；通过透射电子显微镜观察所合成的纳米金颗粒如图1所示，镜下观察为单分散的花状结构，粒径在50nm左右，有研究表明，粒径在10-200nm之间的纳米颗粒有利于在体内的长期循环和肿瘤靶向治疗，本发明所制备纳米金粒径为50nm与其研究结果相符合；该金纳米颗粒在室温下可稳定存在三个月以上；
(2)纳米金颗粒负载阿霉素：将7mg盐酸阿霉素溶解于4mL蒸馏水中冰浴得阿霉素(DOX)溶液，将5mg顺乌头酸酐溶解于200μL 1,4-二氧六环中，然后缓慢加入阿霉素溶液中搅拌均匀，用0.5M NaOH迅速将溶液的pH调至9.0，溶液在冰水浴中反应20min，然后用1MHCl将溶液pH调至7.0，搅拌30min，随后继续滴加HCl直至形成较大沉淀，反应物继续冰浴15min后，离心去除上清，得到沉淀物，所得沉淀物与7mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、3mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)一起溶解于3mL蒸馏水中，室温黑暗中搅拌4h得混合溶液，将混合溶液与2mL步骤(1)所得的纳米金溶胶混合后继续黑暗中搅拌16h，反应完成之后，通过葡萄糖凝胶G-25分离去除多余的BSA和DOX，即得到载药纳米金(Au-BSA-DOX复合物)溶胶；
(3)叶酸修饰载药纳米金颗粒：将5mg叶酸(FA)溶解于1mL DMSO中得叶酸溶液，3mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和2mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在室温黑暗中搅拌4h后与叶酸溶液混合得混合溶液，将3mL步骤(2)所得的载药纳米金溶胶加入该混合溶液，室温黑暗中搅拌10h，反应完成之后，通过葡萄糖凝胶G-25分离去除多余的叶酸，即得到叶酸修饰载药纳米金颗粒(Au-BSA-DOX-FA复合物)的分散液。
实施例2
利用紫外可见分光光度计测量实施例步骤(1)和(3)合成的产物的吸收光谱，确定复合物是否成功合成，所得结果如图2所示，叶酸(FA)和阿霉素(DOX)分别在360nm和495nm波长处有强的吸收峰。步骤(1)所得的Au-BSA纳米颗粒在280nm处有一个强的吸收峰，这是牛血清白蛋白的特征峰，说明纳米金颗粒中有牛血清白蛋白的存在，纳米金的特征吸收峰如小图所示，在580nm波长处。牛血清白蛋白、叶酸、阿霉素的特征吸收峰(280nm，360nm，495nm)在Au-BSA-DOX-FA复合物的吸收曲线中均可见，说明成功在Au-BSA纳米颗粒上结合上了FA和DOX。
实施例3
为了确定实施例1所合成的Au-BSA纳米颗粒的细胞毒性，用MTT法检测经Au-BSA培养的人宫颈癌细胞(HeLa细胞)、人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)和人皮肤成纤维细胞(HSF细胞)的活力。细胞毒性测定中，取对数生长期的HeLa细胞、MCF-7细胞和HSF细胞接种于96孔板，每孔加入100μL，接种密度为1×104/孔。不同浓度的Au-BSA溶液(0，1.6，3.2，6.25，12.5，25，50，100μg/mL)分别加到不同组别的孔中。二氧化碳培养箱中培养48h后，用pH为7.0的PBS清洗三次，向各孔中加入MTT继续培养4h，去除上清然后加入DMSO溶液，震荡10min后用酶标仪在570nm波长下检测OD值。测试结果如图3至图5所示，结果表明随着浓度的提高，HeLa细胞(图3)、MCF-7细胞(图4)和HSF细胞(图5)的细胞活力未受到明显抑制，说明Au-BSA纳米颗粒对两种癌细胞和正常细胞均未产生明显的细胞毒性，即Au-BSA纳米颗粒具有良好的生物相容性。
实施例4
以2倍浓度梯度配置不同浓度的阿霉素标准溶液，标准溶液浓度分别为1.875μg/mL、3.75μg/mL、7.5μg/mL、15μg/mL、30μg/mL、60μg/mL。用紫外可见分光光度计在495nm波长下测定各标准溶液的吸光度值，计算回归方程，绘制标准曲线。
建立吸光度值(A)对阿霉素标准溶液(C)的一元线性回归方程。495nm波长时不同浓度阿霉素的吸光度值如表1所示，回归方程为：A＝0.044C+0.04，决定系数R2＝0.999，说明在吸光度值A的总变异中，浓度C可以解释吸光度值A变异的99.9％，即用浓度来预测吸光度的效果好，在0～60μg/ml范围内，阿霉素浓度与吸光度值有良好的线性关系。标准曲线如图6所示。
表1不同浓度阿霉素标准溶液的在495nm波长的吸光度值
通过调节不同的pH值(pH分别为3.5，5.0，6.5，7.4，9.0)，绘制实施例1所得的Au-BSA-DOX-FA纳米复合物中DOX在不同pH条件下的释放曲线。将1mL纳米复合物置于透析管中，然后将透析管置于盛有10mL氢氧化钠和柠檬酸钠缓冲溶液的塑料管中，塑料管中缓冲溶液的pH分别调至3.5，5.0，6.5，7.4，9.0。该测试在摇床中进行，参数设置为37℃，50rpm。每隔一定时间间隔(3h,6h,12h,24h,48h)，更换新的缓冲溶液，并用紫外可见分光光度计测定吸光度值，根据标准曲线计算缓冲溶液中DOX的含量，绘制DOX释放曲线(如图7所示)。
为达到pH敏感可控的药物释放效果，本研究使用顺乌头酸酐作为连接阿霉素与金纳米颗粒的药物。DOX从Au-BSA-FA-DOX复合物上释放的效果通过测量阿霉素在不同pH值下在缓冲溶液中的含量来反应。如图7所示，当pH为7.4和9.0时，阿霉素从Au-BSA-FA-DOX复合物释放出来的数量约为20％。相比之下，当pH为6.5时，阿霉素的释放量在60％左右，释放量是前者的3倍。当pH为3.5和5.0时，阿霉素的释放量达到了约90％，释放量提高到4.5倍。阿霉素从复合物中的快速释放是由于顺乌头酸酐的作用，顺乌头酸酐作为阿霉素的与金纳米颗粒的连接物，在pH小于6.0时极易断裂，从而使阿霉素从复合物中释放出来。pH敏感的阿霉素释放与酸性条件下的游离羧基有关。所以，pH敏感的阿霉素释放效果表明，Au-BSA-FA-DOX复合物在循环系统中会稳定存在而在肿瘤部位的酸性环境中就会释放阿霉素作为化疗药物。
人体正常组织和血液的pH值为7.4，而肿瘤组织部位的pH比正常组织低[17]，这就为利用pH控制药物释放提供了条件。顺乌头酸酐是一种酸性敏感键，在中性和碱性环境下稳定，在酸性环境下易断裂。有研究将阿霉素利用顺乌头酸酐连接到一种树枝状大分子上形成聚合物，这种聚合物可以在酸性条件下缓慢的释放阿霉素，而在中性条件下则能稳定存在[18]。缓释药物则能保证药物浓度稳定在较高浓度，提高药物的生物利用率。本研究中，Au-BSA-DOX-FA在pH为3.5和5.0时可以释放出90％的阿霉素，且释放过程在12个小时之内持续完成，在pH为6.5时约释放出60％的阿霉素，而在中性(pH7.4)和碱性(pH9.0)环境中很少释放出阿霉素，总释放量仅为阿霉素总量的20％左右。
实施例5
为了确定靶向杀伤作用，用MTT实验测定分别经Au-BSA-DOX-FA复合物和游离的DOX干预的HeLa细胞活力、MCF-7细胞活力和HSF细胞活力。对于杀伤效果，不同浓度的Au-BSA-DOX-FA复合物和相对应其中阿霉素浓度的游离DOX(45，90，185，375，750，1500ng/mL)分别加入不同组别的孔中。37℃培养5％二氧化碳培养箱中培养48h后，用pH为7.0的PBS清洗三次，向各孔中加入MTT继续培养4h，去除上清然后加入DMSO溶液，震荡10min后用酶标仪在570nm波长下检测OD值。应用SPSS17.0软件进行统计学分析，阿霉素标准曲线做一元线性回归方程，Au-BSA-DOX-FA复合物与游离阿霉素对细胞杀伤效果比较用两组独立样本比较的秩和检验即曼-惠特尼秩和检验(Mann-Whitney Test),检验水准α＝0.05。、
比较实施例1合成的Au-BSA-DOX-FA复合物与游离阿霉素对癌细胞(HeLa细胞、MCF-7细胞)和正常细胞(HSF细胞)的杀伤效果，实验过程中Au-BSA-DOX-FA复合物中负载DOX的量与游离阿霉素的量是相同的。如图8和图9所示，在对两种癌细胞HeLa(图8)和MCF-7(图9)的干预中，随着阿霉素浓度的升高，细胞活性呈降低趋势，这是阿霉素作为肿瘤治疗药物对细胞的杀伤结果。从细胞活性的变化曲线可以看出，在对HeLa细胞的干预中，用Au-BSA-DOX-FA复合物干预的HeLa细胞活力低于用游离阿霉素干预的HeLa细胞活力，说明Au-BSA-DOX-FA复合物对Hela细胞的杀伤作用强于游离阿霉素对Hela细胞的杀伤作用。采用两组独立样本比较的秩和检验即曼-惠特尼秩和检验，差异有统计学意义(t＝26，P<0.05)；在对MCF-7的干预中(如图9所示)，用Au-BSA-DOX-FA复合物干预的MCF-7细胞活力与用游离阿霉素干预的MCF-7细胞活力无明显差异，即Au-BSA-DOX-FA复合物与游离阿霉素二者对MCF-7细胞的杀伤作用无明显差异；在对HSF的干预中，用Au-BSA-DOX-FA复合物干预的HSF细胞活力高于用游离阿霉素干预的HSF细胞活力，差异有统计学意义(t＝26.5，P<0.05)，说明游离阿霉素对人皮肤成纤维细胞的杀伤作用强于Au-BSA-DOX-FA复合物。
人宫颈癌细胞(HeLa细胞)表面叶酸受体过量表达，极易与叶酸靶向的抗肿瘤药物结合，有利于药物发挥生物学效应。在Au-BSA-DOX-FA复合物与阿霉素对癌细胞的杀伤效果比较中，如图8所示，由于HeLa细胞表面大量叶酸受体的存在，Au-BSA-DOX-FA复合物能够靶向的与HeLa细胞结合并在周围释放阿霉素，而游离阿霉素无法靶向的大量聚集于HeLa细胞周围，所以Au-BSA-DOX-FA复合物对HeLa细胞的杀伤效果优于游离阿霉素。人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)表面叶酸受体低表达，Au-BSA-DOX-FA复合物对其无靶向功能，所以与游离阿霉素的杀伤效果无明显差异。图9中Au-BSA-DOX-FA复合物的效果略低于游离阿霉素的杀伤效果，可能是因为复合物中释放的阿霉素的量低于直接加入阿霉素的量，在无靶向聚集的条件下，治疗效果与阿霉素浓度相对应。人皮肤成纤维细胞(HSF细胞)为正常组织细胞，表面叶酸受体低表达且周围环境为弱碱性，Au-BSA-DOX-FA复合物对其无靶向功能，且不会因为顺乌头酸酐键断裂而释放出阿霉素，因此图10中Au-BSA-DOX-FA复合物对HSF细胞杀伤作用显著弱于游离阿霉素的杀伤作用。
以上所列举的实施方式仅供理解本发明之用，并非是对本发明所描述的技术方案的限定，有关领域的普通技术人员，在权利要求所述技术方案的基础上，还可以作出多种变化或变形，所有等同的变化或变形都应涵盖在本发明的权利要求保护范围之内。本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。

Claims (8)

1.一种叶酸靶向载药纳米金颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备BSA修饰的纳米金颗粒：以牛血清白蛋白为模板合成纳米金颗粒；
(2)纳米金颗粒负载阿霉素：步骤(1)制得的纳米金颗粒以顺乌头酸酐作为连接键结合阿霉素，得载药纳米金颗粒；
(3)叶酸修饰载药纳米金颗粒：以叶酸作为靶向分子，修饰步骤(2)所得的载药纳米金颗粒。
2.如权利要求1所述的一种叶酸靶向载药纳米金颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备BSA修饰的纳米金颗粒：将牛血清白蛋白溶液与氯金酸溶液混合，室温下搅拌均匀，再加入抗坏血酸继续搅拌至溶液由浅蓝色先变为无色再变为蓝紫色，即得纳米金溶胶；
(2)纳米金颗粒负载阿霉素：将盐酸阿霉素溶解于蒸馏水中冰浴得阿霉素溶液，将顺乌头酸酐溶解于1,4-二氧六环中，缓慢加入阿霉素溶液中搅拌均匀，向混合溶液中加入NaOH迅速将溶液的pH调至9.0±0.3，在冰水浴中反应10-60min，然后加入HCl将pH调至7.0±0.3，搅拌均匀，随后继续滴加HCl直至形成较大沉淀，冰浴10-60min后，离心去除上清液，得到沉淀物，所得沉淀物与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺一起溶解于蒸馏水中，室温黑暗中搅拌数小时，所得混合溶液与步骤(1)所得的纳米金溶胶混合后继续黑暗中搅拌数小时，待反应完成之后，通过葡萄糖凝胶G-25分离去除多余的牛血清蛋白和阿霉素，即得载药纳米金溶胶；
(3)叶酸修饰载药纳米金颗粒：将叶酸溶解于二甲基亚砜中得叶酸溶液，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺混合在室温黑暗中搅拌数小时后与叶酸溶液混合得混合溶液，将步骤(2)所得的载药纳米金溶胶加入该混合溶液，室温黑暗中搅拌反应完成后，通过葡萄糖凝胶G-25分离去除多余的叶酸，即得到叶酸修饰载药纳米金颗粒的分散液。
3.如权利要求2所述的一种叶酸靶向载药纳米金颗粒的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)制备BSA修饰的纳米金颗粒：将10mL浓度为5mg/mL的牛血清白蛋白溶液与1mL浓度为10mM的氯金酸溶液混合，室温下置于磁力搅拌器上搅拌30min，转速为1000rpm，然后加入20mg抗坏血酸继续搅拌2h，溶液由最初的浅蓝色先变为无色再变为蓝紫色，即得纳米金溶胶。
4.如权利要求2所述的一种叶酸靶向载药纳米金颗粒的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)纳米金颗粒负载阿霉素：将7mg盐酸阿霉素溶解于4mL蒸馏水中冰浴得阿霉素溶液，将5mg顺乌头酸酐溶解于200μL 1,4-二氧六环中，然后缓慢加入阿霉素溶液中搅拌均匀，用0.5M NaOH迅速将溶液的pH调至9.0，溶液在冰水浴中反应20min，然后用1M HCl将溶液pH调至7.0，搅拌30min，随后继续滴加HCl直至形成较大沉淀，反应物继续冰浴15min后，离心去除上清，得到沉淀物，所得沉淀物与7mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、3mgN-羟基琥珀酰亚胺一起溶解于3mL蒸馏水中，室温黑暗中搅拌4h得混合溶液，将混合溶液与2mL步骤(1)所得的纳米金溶胶混合后继续黑暗中搅拌16h，反应完成之后，通过葡萄糖凝胶G-25分离去除多余的牛血清蛋白和阿霉素，即得到载药纳米金溶胶。
5.如权利要求2所述的一种叶酸靶向载药纳米金颗粒的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)叶酸修饰载药纳米金颗粒：将5mg叶酸溶解于1mL DMSO中得叶酸溶液，3mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和2mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在室温黑暗中搅拌4h后与叶酸溶液混合得混合溶液，将3mL步骤(2)所得的载药纳米金溶胶加入该混合溶液，室温黑暗中搅拌10h，反应完成之后，通过葡萄糖凝胶G-25分离去除多余的叶酸，即得到叶酸修饰载药纳米金颗粒的分散液。
6.由权利要求1至5中任一种方法制得的叶酸靶向载药纳米金颗粒，其特征在于，所述的叶酸靶向载药纳米金颗粒以纳米金颗粒作为载体，作为载体的纳米金颗粒为以牛血清白蛋白为模板合成的纳米金颗粒，所述的纳米金颗粒修饰有叶酸分子且负载有阿霉素，纳米金颗粒以顺乌头酸酐作为连接键结合阿霉素。
7.如权利要求6所述的叶酸靶向载药纳米金颗粒在杀伤叶酸高表达肿瘤细胞治疗肿瘤方面的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞包括宫颈癌细胞。
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