CN107343957A - 一种黑磷/二氧化锰复合纳米材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种黑磷/二氧化锰复合纳米材料及其制备方法应用。主要涉及到以下过程：以牛血清白蛋白为模板通过生物矿化作用，合成MnO2纳米片；对BP纳米片进行修饰调控，使原来表面带负电荷的BP纳米片表现正电荷；然后通过静电吸附作用让修饰调控带正电的黑磷纳米片BP与带负电的MnO2紧密结合，形成BP@MnO2复合纳米材料。此外，本发明还包括所述方法制得的BP@MnO2复合纳米材料的应用：复合材料在660nm激光照射下高效产生单线态氧，可以显著提高光敏剂黑磷的光稳定性和表观光动力治疗效率，极大提高黑磷的光动力治疗抗肿瘤应用。

Description

一种黑磷/二氧化锰复合纳米材料及其制备方法和应用
技术领域：
本发明属于生物医学材料制备领域，具体涉及一种黑磷/二氧化锰复合纳米材料及其制备方法和其在提高黑磷光动力治疗搞肿瘤方面的应用。
背景技术：
癌症已经成为影响人类健康的主要疾病之一。以光学为基础的光动力治疗(PDT)，是利用光敏药物和激光活化产生活性氧(ROS)来治疗肿瘤的一种新方法。其作用基础是光动力效应，有三个基本要素：光敏剂、光和氧。在特定波长的激光(hv)照射下光敏剂吸收光子受到激发，激发态的光敏剂在恢复到基态过程中部分会经历激发三重态(T1)的中间态，并把能量传递给周围相邻的基底物质或氧，生成活性很强的活性氧或单线态氧(1O2)。单线态氧和相邻的生物大分子发生氧化反应，产生细胞毒性作用，进而导致细胞受损乃至死亡。具有特异性好、创伤小、毒副作用小、不会产生耐药性等特点，逐渐替代如手术、放疗、化疗等传统治疗手段，成为目前生物医学领域的研究热点。
黑磷(BP)纳米片被证实是一种非金属高效光敏剂，在整个可见光区和近红外区都可产生单线态氧，其量子产率高达0.91，远超其它已报道的光动力治疗试剂，且其生物相容性好、毒性低、易代谢可被降解为无毒的磷氧化物，相比其它如HpD、Ce6等常规光敏剂，更符合理想光敏剂要求，具有极高的肿瘤PDT治疗优势与潜力。然而BP仍面临光稳定不良，易光氧化等问题。需要研究人员进一步研究一种新的材料可以提升黑磷表观光动力治疗效率等问题。
发明内容：
本发明的目的是提供一种生物相容性好、特异性强、光稳定性优良、能够极大提高黑磷(BP)光动力治疗效率的BP@MnO2复合纳米材料的构建方法及所得材料与应用方法。
本发明的制备的技术方案是：
以牛血清白蛋白为模板通过生物矿化作用，合成MnO2纳米片；对黑磷(BP)纳米片进行修饰调控，使原来表面带负电荷的黑磷纳米片表现正电荷；然后通过静电吸附作用让修饰调控后的带正电的黑磷纳米片与带负电的MnO2纳米片紧密结合，形成黑磷/二氧化锰复合纳米材料。
本发明优选方案是以N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)为介质的液相超声剥离法，制备BP纳米片；以牛血清白蛋白(BSA)为模板通过生物矿化作用，合成MnO2纳米片；用溶菌酶(LZM)对BP纳米片进行修饰调控，使原来表面带负电荷的BP纳米片表现正电荷；然后通过静电吸附作用让带正电的BP-LZM与带负电的MnO2紧密结合，形成黑磷/二氧化锰复合纳米材料，即BP@MnO2复合纳米材料。来提高黑磷的表观光动力治疗效率、光稳定性和特异性。
在本发明中，黑磷纳米片是由液相超声剥离法制得。
所述的黑磷BP纳米片通过现成黑磷粉末冰浴超声剥离获得，分散剂选用饱和氢氧化钠的N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)溶液。
作为优选，液相超声剥离的时长为4～20h，更优选为5～12h。
作为优选，液相超声剥离获得的黑磷悬液经过2000～5000rpm离心5～10min，获得BP纳米片悬液。
在本发明中，所述的BP纳米片经过试剂修饰对其表面电性进行调控。修饰后BP纳米片表面Zeta电位为正。
作为优选，对BP纳米片进行修饰调控的试剂可为溶菌酶(LZM)、转铁蛋白、聚醚酰亚胺(PEI)中一种，更优选为溶菌酶。发明人通过实验发现修饰LZM虽然改变了BP纳米片的Zeta电位但并不会对其产生1O2有影响，GSH抑制影响也相同。
作为优选，黑磷和溶菌酶质量比为100～1000，更优选为500～1000。
在本发明中，所述的MnO2纳米片通过牛血清白蛋白(BSA)为模板生物矿化作用合成。
作为优选，反应温度为20～50℃，更优选为35～40℃.
作为优选，反应时间为2～15h，更优选为4～12h.
作为优选，BSA浓度为1～100mg/mL，更优选为10～50mg/mL.
在本发明中，所获BP和MnO2产物都分别用水和乙醇洗涤至少3次，1000～12000rpm离心再利用。
在本发明中，通过静电吸附作用让带正电的BP-LZM与带负电的MnO2紧密结合，形成BP@MnO2复合纳米材料。
作为优选，所述修饰调控后黑磷纳米片(如BP-LZM纳米片)与MnO2纳米片复合投加比例为，BP-LZM：5～500μg/mL，MnO2：0.1～5mM。
发明人首次成功的制得了，BP@MnO2复合纳米材料，且本发明的复合材料的优势主要为：(1)该方法合成的BP@MnO2复合纳米材料生物相容性好、毒性低、可被细胞大量摄入；本发明的实验中的BP@MnO2复合纳米材料浓度为0、25、50、100、200μg/mL时，对4T1、HeLa和L929三种细胞存活率皆高达80％以上，且在与新鲜的小鼠红细胞共同孵育中，没有发生溶血情况，因此，以上的高的细胞存活率说明和溶血情况均表明，本发明所合成的BP@MnO2复合纳米材料细胞毒性低、生物相容性好。(2)本发明材料可显著提高黑磷的表观光动力治疗效率，特别是BP@MnO2复合纳米材料在相同条件660nm激光灯照射下产生ROS更多，光动力治疗效果更强。(3)本发明材料具有更好的光稳定性，BP@MnO2复合纳米材料在整个可见光及近红外区均有较强的吸收，避免了BP自身光氧化现象，实验证明BP@MnO2复合纳米材料光稳定性增强。(4)本发明材料具有GSH条件下特异性响应优势；可降低GSH含量，提高BP的PDT效率，发明人的实验表明肿瘤细胞内过量表达的GSH会对BP-LZM纳米片等光敏剂的光动力治疗有消极影响，降低光动力治疗效果，而对所合成BP@MnO2没有明显影响，所合成BP@MnO2复合纳米材料可以从消除GSH影响方面提高光敏剂的光动力治疗效率。(5)发明人还进行了体内抗肿瘤治疗，发现BP@MnO2+660nm小鼠肿瘤体积基本没有增长，小鼠的肿瘤基本完全受到了抑制。而试验结果表明BP-LZM、660nm、MnO2、BP@MnO2或MnO2+660nm都没有肿瘤治疗效果，不能抑制肿瘤生长，虽然，光敏剂BP-LZM纳米片和BP@MnO2复合纳米材料都有光动力治疗效果，但BP@MnO2复合纳米材料抑制效果明显更好，小鼠的肿瘤基本完全受到了抑制。证明在体内，BP@MnO2复合纳米材料可以明显提高动力学治疗效果。因此，本发明的产品具有更高的肿瘤光动力治疗药物应用效果。
附图说明：
【图1】BP、BP-LZM、MnO2、BP@MnO2的Zeta电位图；
【图2】BP-LZM、MnO2、BP@MnO2的紫外-可见吸收光谱图；
【图3】(a)BP的TEM图；(b)MnO2的TEM图；(c)(d)BP@MnO2的TEM图和P、Mn、O的元素扫描电镜图；
【图4】以DPBF为1O2的检测探针，浓度梯度GSH条件下在30min光照时间内的紫外-可见光谱图(410nm)吸光度变化；
【图5】以DPBF为1O2的检测探针，不同条件下在30min光照时间内的紫外-可见光谱图(410nm)吸光度变化；
【图6】GSH/GSSG试剂盒检测结果，(a)体外，(b)胞内；
【图7】不同浓度BP@MnO2对4T1、HeLa、L929细胞毒性；
【图8】不同浓度BP@MnO2引发红细胞溶血率；
【图9】正常GSH条件下，(a)不同处理下胞内ROS荧光成像，(b)胞内ROS探针荧光强度对比；
【图10】促进/抑制GSH条件下，(a)不同处理条件下细胞内ROS荧光成像；(b)胞内ROS探针荧光强度对比；
【图11】(a)不同处理条件下细胞内Dead-Live负染成像；(b)胞内Calcein-AM/PI探针荧光强度对比；
【图12】(a)第14天小鼠肿瘤体积对比，(1)空白，(2)BP-LZM，(3)660nm，(4)MnO2，(5)BP@MnO2，(6)MnO2+660nm，(7)BP-LZM+660nm，(8)BP@MnO2+660nm；(b)不同治疗方式下小鼠肿瘤体积增长曲线；(c)治疗过程中小鼠体重变化。
具体实施方式：
下面结合具体的实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，基于本发明的原理对本发明所做出的各种改动或修改同样落入本发明权利要求书所限定的范围。
1、BP纳米片的制备：
取出5mg左右BP粉末于5个10mL离心管中，各加入9mL饱和NaOH的NMP分散液，密封，冰浴超声处理8h。将所得棕色悬浮液以3000rpm离心10min，收集上清悬液于50mL离心管中，用锡箔纸避光保存于-20℃冰箱。取2mL BP，12000rpm离心10min去除上清液，用适量超纯水重复洗涤3次，加入2mL超纯水定容，超声分散均匀。在紫外-可见分光光度计下，以水为基线，测量其在800nm处的吸光度，对比标准曲线，确定BP悬液浓度，标记待用。
2、溶菌酶修饰：
浓度梯度溶菌酶(LZM)配制，称取50mg LZM，加入2.5mL超纯水溶解，配制成20mg/mL的LZM溶液，超声分散均匀，各取500μL稀释成16、12、8、4mg/mL溶液。取70μg BP，12000rpm离心10min去除上清液，用适量超纯水重复洗涤3次，加入3.5mL超纯水溶解、稀释至20μg/mL，超声分散均匀。取6个2mL样品瓶中，分别加入500μL 20μg/mL BP，和浓度梯度为0(H2O)、4、8、12、16、20mg/mL的LZM各500μL，BP终浓度为10μg/mL，LZM浓度梯度为0、2、4、6、8、10mg/mL，避光搅拌30min。分别取出混合液，12000rpm离心10min去除上清液，用适量超纯水重复洗涤3次，加入等量超纯水，超声30s，分散均匀，测其Zeta电位的变化，确定最佳LZM量。
3、MnO2纳米片的制备：
母液配制，(1)：称取750mg BSA，用5mL超纯水溶解，超声30s，得到150mg/mL的BSA溶液；(2)：称取0.895g的50％硝酸锰(Ⅱ)(Mn(NO3)2)溶液于50mL容量瓶中，加入超纯水定容，得到50mM的Mn2+溶液；(3)：称取0.8g NaOH固体，用10mL超纯水溶解，超声1min得到2M的NaOH溶液。反应体系配制，在搅拌下，向5mL样品瓶中依次加入：200μL 150mg/mL的BSA溶液、1300μL超纯水、300μL 2M的NaOH溶液、200μL 50mM的Mn2+溶液；37℃条件水浴反应4h，取出10000rpm离心10min，除去上清液，用适量超纯水重复洗涤4次，至上清液为中性，用定量超纯水溶解。用标准曲线法在原子吸收分光光度计下确定MnO2纳米片浓度，标记待用。
4、BP@MnO2复合及表征：
按实验测定的较佳比例BP：LZM＝10μg：10mg混合搅拌30min，获得BP-LZM纳米片，12000rpm离心10min，弃去上清液，用适量超纯水重复洗涤3次，将过量的游离LZM洗净。将获得的BP-LZM纳米片与MnO2纳米片按比例(体外实验：BP-LZM：MnO2＝10μg/mL：1mM,体内实验：BP-LZM：MnO2＝50μg/mL：1mM)混合搅拌30min。分别取样进行Zeta电位、紫外-可见吸收光谱、透射电镜(TEM)表征。
5、GSH对BP产生1O2抑制作用检测：
取200μg BP，12000rpm离心10min去除上清液，用适量超纯水重复洗涤3次，用50％乙醇溶液溶解、稀释至10μg/mL，用锡箔纸避光保存待用。浓度梯度GSH配制，称取0.06146gGSH粉末，定量加入1mL超纯水溶解，超声1min，分散均匀，配制成200mM GSH，分别取100μL200mM GSH稀释成100mM、50mM、25mM、10mM，超声1min，分散均匀。称取1mg 1,3-二苯基苯并呋喃(DPBF)粉末，定量加入1mL乙醇溶液溶解，超声1min，分散均匀，配制成1mg/mL DPBF溶液。在紫外-可见分光光度计下，用常量紫外比色皿，取2mL50％乙醇扫基线，扫描范围为300nm～600nm，分别测量(1)：2mL BP+40μL DPBF+20μL H2O；(2)：2mL BP+40μL DPBF+20μL10mM GSH；(3)：2mL BP+40μL DPBF+20μL 25mM GSH；(4)：2mL BP+40μL DPBF+20μL 50mMGSH；(5)：2mL BP+40μL DPBF+20μL 100mM GSH；(6)：2mL BP+40μL DPBF+20μL 200mM GSH；(7)：2mL 50％乙醇+40μL DPBF+20μL H2O。形成GSH浓度梯度为：0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0mM与单纯DPBF的对照实验。测量前依次按BP、GSH(H2O)、DPBF加入，稍加吹匀后，测量用660nm激光灯(1W)分别光照0、5、10、15、20、25、30min时的紫外-可见吸收光谱，分析最大吸收峰的变化情况，判断不同浓度GSH对BP产生1O2抑制作用。
6、BP@MnO2对GSH抑制作用消除检测：
合成5mL 10μg/mL BP-LZM、5mL 10μg/mL BP@MnO2，12000rpm离心10min，弃去上清液，用定量50％乙醇溶液溶解，用锡箔纸避光保存。在紫外分光光度计下，用常量紫外比色皿，取2mL 50％乙醇扫基线，扫描范围为300nm～600nm，分别测量(1)：2mL 50％乙醇+40μLDPBF+20μL H2O；(2)：2mL BP-LZM+40μL DPBF+20μL H2O；(3)：2mL BP-LZM+40μL DPBF+20μL200mM GSH；(4)：2mL BP@MnO2+40μL DPBF+20μL H2O；(5)：2mL BP@MnO2+40μL DPBF+20μL200mM GSH。测量前依次按BP-LZM(BP@MnO2)、GSH(H2O)、DPBF加入，稍加吹匀后，测量用660nm激光灯(1W)分别光照0、5、10、15、20、25、30min时的紫外-可见吸收光谱，分析最大吸收峰的变化情况，判断BP@MnO2对GSH抑制消除作用。
7、体外GSH/GSSG检测：
合成1mL 10μg/mL BP@MnO2、1mL 10μg/mL BP-LZM，12000rpm离心10min，弃去上清液，用定量蛋白去除试剂M溶液(GSH和GSSG检测试剂盒提供)溶解，用锡箔纸避光保存待用。根据GSH和GSSG检测试剂盒说明书，配制检测工作液和标准样品，待用。将所配制的BP-LZM、BP@MnO2平均分成两份各500μL，另取两份500μL蛋白去除试剂M溶液作空白对照，各加入5μL200mM GSH，充分摇匀后，25℃反应10min。其中一份按说明书加入GSH清除辅助液和GSH清除试剂工作液，充分摇匀后，25℃反应60min，按：10μL样品/标准品+150μL检测工作液+50μLNADPH加入96孔板，充分混匀，25℃反应25min，在酶标仪下测量405nm处的吸光度，通过标准曲线法计算出各样品的(GSSG+GSH)和GSSG的含量，从而推算出GSH的含量，可判断GSH/GSSG的值。重复实验3次取平均值。
8、MTT法毒性检测：
提前24h接种三块4T1、HeLa、L929细胞的96孔细胞培养板，置于37℃含5％CO2的饱和湿度CO2培养箱中预培养。合成浓度梯度为：25、50、100、200μg/mL的BP@MnO2，各500μL，12000rpm离心10min，弃去上清液，酒精灭菌后，转移到超净工作台中，定量加入500μL DMEM培养基，封口膜密封，超声30s，分散均匀，紫外灭菌30min。将接种细胞的96孔板取出，在倒置显微镜下观察细胞长势，选取细胞密度相近的15个孔标记清楚，酒精灭菌后，转移到超净工作台中，沿壁将旧培养基吸除，依次加入100μL/孔浓度梯度为：0(DMEM培养基)、25、50、100、200μg/mL的BP@MnO2，做好标记，酒精灭菌后放入CO2培养箱中继续培养24h。取出，酒精灭菌后，转移到超净工作台中，每孔加入10μL 5mg/mL MTT溶液，放入CO2培养箱中培养4h，用平板离心机2500rpm离心3min，酒精灭菌后，转移到超净工作台中，吸去孔内培养液，按150μL/孔加入DMSO，置于摇床上低速振荡5min，使结晶物充分溶解，用酶标仪测定490nm和680nm处的紫外吸收值，根据公式(1)计算细胞活性，判断药物毒性。
OD490nm：溶液在490nm处的吸光度值，
OD680nm：溶液在680nm处的吸光度值。
9、溶血实验：
红细胞准备，取500μL新鲜的小鼠血液，3000rpm离心5min除去上层血清，用PBS重复洗涤下层红细胞4次，将血清除净，取20μL红细胞用PBS稀释成2％的红细胞溶液。合成浓度梯度为：25、50、100、200μg/mL的BP@MnO2，各500μL，12000rpm离心10min，弃去上清液，用定量PBS溶解超声30s，分散均匀。分别取150μL浓度梯度为：0(PBS)、25、50、100、200μg/mL的BP@MnO2和150μL H2O于500μL离心管，另加入150μL 2％的红细胞溶液混合，置于37℃恒温水浴锅中共同孵育4h。取出样品，5000rpm离心5min，分别测定上清液在540nm处的吸光度值，根据公式(2)计算溶血率，判断其溶血情况
Hemolysis(％)＝(I/I0)×100％ (2)
I：红细胞与样品溶液孵育后上清液的，
I0：红细胞在去离子水中完全溶血后的上清液的吸光度值。
10、细胞内吞检测：
提前24h接种四块4T1细胞的96孔细胞培养板，置于37℃含5％CO2的饱和湿度CO2培养箱中预培养。溶液配制，称取0.015g无水Na2CO3和0.029g无水NaHCO3，用10mL超纯水溶解，再用0.1M NaOH或0.1M盐酸在PH计监测下进行微调，配制PH＝9的Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液。称取1mg FITC粉末，用100μL DMSO溶解，配制成10mg/mL FITC溶液，锡箔纸避光保存备用。合成1200μL 50μg/m BP@MnO2的样品，12000rpm离心10min，弃去上清液，加入1200μL PH＝9的Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液，超声30s，转移至2mL样品瓶，搅拌下缓慢滴加10μL 10mg/mLFITC溶液，避光搅拌4h，转移到1.5mL离心管，12000rpm离心10min，弃去上清液，用适量超纯水洗涤3次，将过量的游离FITC洗净，12000rpm离心10min，弃去上清液，酒精灭菌后，转移到超净工作台中，定量加入1200μL DMEM培养基，封口膜密封，超声30s，分散均匀，紫外灭菌30min。将接种了4T1细胞的四块96孔板从CO2培养箱中取出，在倒置显微镜下观察细胞长势，分别选取细胞密度相近的3个孔并标记清楚，酒精灭菌后，转移到超净工作台中，沿壁将旧培养基吸走，加入BP@MnO2(100μL/孔)做好标记，将其中两块酒精灭菌后放入37℃、CO2培养箱中继续培养2h和4h，另外两块放入4℃冰箱中同样培养2h和4h。检测，2h时，各取出一块96孔板，酒精灭菌后，转移到超净工作台中，将旧培养基吸尽，用PBS洗涤细胞2次，加入(100μL/孔)稀释的Hoechst 33342探针(1mL DMEM培养基中加入5μL探针)，酒精灭菌后放入CO2培养箱中继续避光培养30min，用PBS洗涤细胞2次，加入50μL PBS防止细胞失活，在荧光倒置显微镜下成像，根据其荧光信号，分析FITC荧光强度，间接评估BP@MnO2进入细胞含量。在4h时重复相同操作。
11、正常GSH下ROS胞内成像：
提前24h接种一块4T1细胞的96孔细胞培养板，置于37℃含5％CO2的饱和湿度CO2培养箱中预培养。合成500μL 50μg/mL BP@MnO2、500μL 50μg/mL BP-LZM、500μL 1mM MnO2，12000rpm离心10min，弃去上清液，酒精灭菌后，转移到超净工作台中，定量加入500μL DMEM培养基，封口膜密封，超声30s，分散均匀，紫外灭菌30min。将接种细胞的96孔板取出，在倒置显微镜下观察细胞长势，选取细胞密度相近的16个孔并标记清楚，酒精灭菌后，转移到超净工作台中，沿壁将旧培养基吸走，依次加入MnO2、BP-LZM、BP@MnO2、DMEM培养基各4个孔，100μL/孔，做好标记，酒精灭菌后放入CO2培养箱中继续培养4h。取出，酒精灭菌后，转移到超净工作台中，按10μL/孔加入稀释的DCFH-DA探针(按照1:40用DMEM培养基稀释成250μM)，酒精灭菌后放入CO2培养箱中继续避光培养30min，在4种对照组中各选2个平行孔用660nm激光灯(1W)光照10min，形成DMEM、BP-LZM、MnO2、BP@MnO2、DMEM+660nm、BP-LZM+660nm、MnO2+660nm、BP@MnO2+660nm 8组各2平行；用PBS洗涤细胞2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA探针，加入50μL PBS防止细胞失活，在荧光倒置显微镜下成像，根据其荧光信号强度，分析光动力治疗中产生ROS的水平。
12、促进/抑制GSH下ROS胞内成像：
提前24h接种一块4T1细胞的96孔细胞培养板，置于37℃含5％CO2的饱和湿度CO2培养箱中预培养。培养至12h时，选取两排细胞加入10mM LPA(DL-α-Lipoic-Acid)溶液(10μL/孔)；加药前20min，另选两排细胞加入40μM NMM(N-Methylmaleimide)溶液(10μL/孔)。合成600μL 50μg/mL BP@MnO2、600μL 50μg/mL BP-LZM，12000rpm离心10min，弃去上清液，酒精灭菌后，转移到超净工作台中，定量加入600μL DMEM培养基，封口膜密封，超声30s，分散均匀，紫外灭菌30min。将接种细胞的96孔板取出，在倒置显微镜下观察细胞长势，各选取细胞密度相近的4个孔，并标记清楚，酒精灭菌后，转移到超净工作台中，沿壁将旧培养基吸走，往促进/抑制了GSH后的细胞中加入BP-LZM、BP@MnO2各2个孔(100μL/孔)，做好标记，酒精灭菌后放入CO2培养箱中继续培养4h。取出，酒精灭菌后，转移到超净工作台中，按10μL/孔加入稀释的DCFH-DA探针(按照1:40用DMEM培养基稀释成250μM)，酒精灭菌后放入CO2培养箱中继续避光培养30min，用660nm激光灯(1W)光照10min，形成LPA+BP-LZM+660nm、LAP+BP@MnO2+660nm、NMM+BP-LZM+660nm、NMM+BP@MnO2+660nm 4组对照实验各2平行；用PBS洗涤细胞2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA探针，加入50μL PBS防止细胞失活，在荧光倒置显微镜下成像，根据其荧光信号强度，分析光动力治疗中产生ROS的水平。
13、Dead-Live负染检测：
提前24h接种一块4T1细胞的96孔细胞培养板，置于37℃含5％CO2的饱和湿度CO2培养箱中预培养。合成500μL 50μg/mL BP@MnO2、500μL 50μg/mL BP-LZM、500μL 1mM MnO2，12000rpm离心10min，弃去上清液，酒精灭菌后，转移到超净工作台中，定量加入500μL DMEM培养基，封口膜密封，超声30s，分散均匀，紫外灭菌30min。将接种细胞的96孔板取出，在倒置显微镜下观察细胞长势，选取细胞密度相近的16个孔并标记清楚，酒精灭菌后，转移到超净工作台中，沿壁将旧培养基吸走，依次加入BP-LZM、MnO2、BP@MnO2、DMEM培养基各4个孔，100μL/孔，做好标记，酒精灭菌后放入CO2培养箱中继续培养4h。取出，酒精灭菌后，转移到超净工作台中，用660nm激光灯(1W)光照10min，形成DMEM、MnO2、BP-LZM、BP@MnO2、DMEM+660nm、MnO2+660nm、BP-LZM+660nm、BP@MnO2+660nm 8组各2平行，用PBS洗涤细胞2次，加入100μL Calcein-AM/PI探针工作液(1mL DMEM培养基加入2μL Calcein-AM和4μL PI)，酒精灭菌后放入CO2培养箱中继续避光培养30min，取出，用PBS洗涤细胞2次，以充分去除未进入细胞内的Calcein-AM/PI，加入50μL PBS防止细胞失活，在荧光倒置显微镜下成像，根据其荧光信号强度，分析活/死细胞分布水平，判断光动力治疗效果。
14、胞内GSH/GSSG检测：
提前24h接种一块4T1细胞的6孔细胞培养板，置于37℃含5％CO2的饱和湿度CO2培养箱中预培养。分别合成1mL 50μg/mL(MnO2浓度为0.1mM)的BP@MnO2、1mL 50μg/mL(MnO2浓度为0.5mM)的BP@MnO2、1mL 50μg/mL(MnO2浓度为1mM)的BP@MnO2、1mL 50μg/mL BP-LZM，12000rpm离心10min，弃去上清液，酒精灭菌后，转移到超净工作台中，定量加入1mL DMEM培养基，封口膜密封，超声30s，分散均匀，紫外灭菌30min。将接种了4T1细胞的6孔板从CO2培养箱中取出，酒精灭菌后，转移到超净工作台中，沿壁将旧培养基吸走，依次加入BP-LZM、BP@MnO2(0.1mM、0.5mM、1mM)、DMEM培养基，1mL/孔，做好标记，酒精灭菌后放入CO2培养箱中继续培养12h。将6孔板取出，酒精灭菌后，转移到超净工作台中，沿壁将旧培养基吸走，用PBS洗涤细胞3次，加入含25％EDTA的胰蛋白酶溶液(500μL/孔)，酒精灭菌后放入CO2培养箱中培养5min，吹打2次把细胞尽可能吹落，将细胞悬液转移到1mL无菌离心管中，1500rpm离心5min，吸尽上清，收集细胞，加入细胞沉淀体积3倍量的蛋白去除试剂M溶液，充分吹散均匀，然后利用液氮和37℃水浴对样品进行两次快速的冻融，4℃放置5分钟，12000rpm离心10min，取上清液用于(GSH+GSSG)和GSSG的测定。根据GSH和GSSG检测试剂盒说明书，配制检测工作液和标准样品，待用。将所处理的细胞上清液，各平均分成两份，其中一份按说明书加入GSH清除辅助液和GSH清除试剂工作液，充分摇匀后，25℃反应60min，按：10μL样品/标准品+150μL检测工作液+50μL NADPH加入96孔板，充分混匀，25℃反应25min，在酶标仪下测量405nm处的吸光度，通过标准曲线法计算出各样品的(GSSG+GSH)和GSSG的含量，从而推算出GSH的含量，可判断GSH/GSSG的值。重复实验3次取平均值。
15、体内抗肿瘤治疗：
采购40只雄性4周龄小鼠(BALB/c小鼠)，根据小鼠的生物学特性及习性，以每笼8只分5笼饲养。肿瘤模型建立，提前准备25瓶(75cm2培养瓶)4T1细胞，收集对数期4T1细胞，，将贴壁细胞脱落，转移到15mL无菌离心管中，1500rpm离心3min，酒精灭菌后转移到超净工作台，弃去上清液，PBS洗涤一次，除去残余的胰蛋白酶溶液，收集高浓度对数期4T1细胞，用4mL生理盐水分散细胞，在6周的雄性BALB/c小鼠的背部皮下按100μL/只注射含以生理盐水分散的细胞悬液，继续培养一星期。待小鼠背部长出肿瘤后，通过游标卡尺测量，计算肿瘤体积大小，按v＝ab2/2(其中v为肿瘤的体积；a为肿瘤的长度；b为肿瘤的宽度)。待肿瘤体积皆长至120mm3时，进行药物瘤内注射和光动力治疗。合成500μg/mL BP@MnO2、500μg/mL BP-LZM、10mM MnO2各500μL的样品，12000rpm离心10min，弃去上清液，用定量生理盐水溶解，紫外灭菌30min。将小鼠随机分成4组，分别按20μL/只进行瘤内注射，2h后各选取一半用660nm激光灯(1W)照射肿瘤部位15min，形成：(1)空白、(2)BP-LZM、(3)660nm、(4)MnO2、(5)BP@MnO2、(6)MnO2+660nm、(7)BP-LZM+660nm、(8)BP@MnO2+660nm，8组对照实验。每天测量小鼠肿瘤的大小和体重，并做好记录，连续检测14天。通过公式(3)计算肿瘤的抑制率。
VC：空白对照组小鼠肿瘤体积，VT：实验组小鼠肿瘤体积。
本发明的试验结果：
1、材料表征：
为考察静电吸附作用结合的BP@MnO2复合纳米材料复合效果，我们对所合成的BP@MnO2复合纳米材料进行了Zeta电位表征、紫外-可见光谱表征、TEM表征。结果如图1、图2、图3所示。
图1结果表示，复合前MnO2纳米片的Zeta电位为-40.5mV、BP-LZM纳米片的Zeta电位为+11.1mV，复合后的BP@MnO2复合纳米材料的Zeta电位为-27.9mV，Zeta电位向两者中间趋近，初步说明BP-LZM纳米片与MnO2纳米片通过静电吸附作用结合形成了BP@MnO2复合纳米材料。
图2结果表示，BP@MnO2复合纳米材料在450nm～900nm处的吸收主要与BP-LZM纳米片的吸收相似，而在300nm～450nm处的吸收主要来自MnO2纳米片，但却比单纯的MnO2纳米片的峰要低且宽。可再次证实BP-LZM纳米片与MnO2纳米片通过静电吸附作用结合形成了BP@MnO2复合纳米材料。
图3结果表示，(a)为BP纳米片的微观形貌，可以看出BP纳米片表面比较光滑平整，大小为200nm左右，分散性较好；(b)为MnO2纳米片的微观形貌，可以看出MnO2纳米片表面具有较多的褶皱，大小为50nm左右；(c)为所得到的BP@MnO2复合材料的微观形貌，大小为250nm左右，属于纳米级别材料，且可以看到BP纳米片与MnO2纳米片紧密结合在了一起。为了进一步验证(c)中为BP@MnO2的复合物，对其进行了Mapping扫描，可以看出该复合纳米材料主要由P、Mn和O组成，如(d)，结果证明该纳米材料确实为BP@MnO2复合纳米材料。
2、GSH对BP产生1O2抑制作用检测结果：
DPBF是一种常用1O2的捕获剂，利用其在410nm处的紫外吸收变化，可用来评价光敏剂光氧化产生单线态氧的相对大小。为检测GSH对BP纳米片产生1O2的影响，证明GSH对BP产生1O2的抑制作用，我们通过体外模拟GSH环境，向同浓度BP纳米片(10μg/mL)中加入0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0mM浓度梯度GSH，以DBPF为1O2捕获剂，检测各组样品在660nm激光灯光照30min内的紫外-可见光谱随时间变化情况，结果如图4所示。
图4结果表示单纯DPBF(20μg/mL)条件下的紫外-可见光谱不随光照时间变化而变化，表明所用1O2捕获剂DPBF不受660nm光照影响。在DPBF(20μg/mL)+BP(10μg/mL)条件下的紫外-可见光谱随光照时间变化而明显下降，表明BP纳米片是一种高效光敏剂，可被660nm光激发产生1O2。不同GSH(0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0mM)对同浓度BP纳米片(10μg/mL)产生有效1O2的抑制情况，可以看出随着GSH浓度逐渐增加，斜率逐渐降低，BP产生有效1O2量逐渐减小。在660nm激光灯光照30min内，相比0min时，单纯DPBF降低了8.3％，GSH浓度为：0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0mM分别降低了56.8％、49.8％、47.9％、42.3％、22.6％、11.6％，且当GSH浓度达到2.0mM时与单纯DPBF基本一致，表明GSH对BP产生1O2有明显抑制作用，浓度越大抑制越强，当GSH浓度达到2mM时可基本完全抑制10ug/mL BP纳米片产生1O2。证明肿瘤细胞内过表达的高浓度GSH(1mM～15mM)会对光动力治疗PDT有影响极大，降低PDT治疗效率。
3、BP@MnO2对GSH抑制作用消除检测结果：
图5结果表示BP纳米片与BP-LZM纳米片在相同浓度GSH与光照条件下的紫外-可见光谱图，基本一致，说明修饰LZM虽然改变了BP纳米片的Zeta电位但并不会对其产生1O2有影响，GSH抑制影响也相同。DPBF+BP@MnO2光谱随光照时间变化基本不变，发现在MnO2存在条件下，光照并不能激发BP-LZM纳米片产生1O2，分析其原因为MnO2在200nm～800nm内有较强的吸收峰，660nm光照可被MnO2强吸收，而不能激发BP-LZM纳米片产生1O2，避免了BP自身光氧化现象，可有效提高光稳定性，说明BP@MnO2复合纳米材料光稳定性增强，且具有在GSH存在条件下特异性响应的优势，肿瘤细胞内GSH的含量要比正常细胞高得多，特异性响应的优势，可以让药物特异性杀死肿瘤细胞，而不会对正常细胞造成过大的损伤。在660nm激光灯光照30min内，相比0min时，单纯DPBF降低了8.3％，BP-LZM降低了55.4％、BP-LZM+2mM降低了11.5％、BP@MnO2降低了5.2％，说明BP-LZM纳米片同样可高效产生1O2且同样受GSH影响；BP@MnO2复合纳米材料可能具有在GSH存在条件下特异性响应的优势。而BP@MnO2+2mM GSH降低了52.7％，在高浓度GSH条件下同样拥有高的有效1O2产生速率，证明BP@MnO2复合纳米材料对GSH抑制有消除作用，可在体外提高BP-LZM纳米片的PDT效率，具有极大的肿瘤治疗的潜力。
4、GSH/GSSG检测结果：
为进一步证明BP@MnO2复合纳米材料是通过MnO2与GSH发生反应而消耗GSH，将其氧化成GSSG的机理来提高PDT效率，我们利用碧云天的GSH和GSSG检测试剂盒进行了体外、胞内的GSH/GSSG检测实验，结果如图6所示。
图6(a)结果表示分别加入等量BP@MnO2复合纳米材料与BP-LZM纳米和相同底物条件下(蛋白去除试剂M溶液+2.0mM GSH)的Control组的GSH/GSSG试剂盒检测的三次测量平均值。BP@MnO2复合纳米材料的GSH/GSSG明显下降。图6(b)分别显示加入BP@MnO2复合纳米材料(调节MnO2浓度，0.1、0.5、1.0mM)、BP-LZM纳米和未用药物处理的细胞内GSH/GSSG比例三次测量的平均值。结果与体外实验一致，BP@MnO2复合纳米材料处理后的细胞样品中的GSH/GSSG明显下降，且随着MnO2浓度提高，GSH/GSSG比例逐步下降。
5、MTT法毒性检测结果：
为考察BP@MnO2复合纳米材料是否适用于生物系统进行光动力治疗，我们设置了浓度梯度为：0、25、50、100、200μg/mL的BP@MnO2复合纳米材料，与4T1、HeLa、L929细胞共同培养24h，通过MTT法检测其毒性大小，结果如图7所示。结果表示BP@MnO2复合纳米材料浓度为0、25、50、100、200μg/mL时，对4T1、HeLa和L929三种细胞存活率皆高达80％以上，高的细胞存活率说明，所合成的BP@MnO2复合纳米材料细胞毒性低、生物相容性好。
6、溶血实验结果：
为考察BP@MnO2复合纳米材料对血液中红细胞影响，我们设置了浓度梯度为：0、25、50、100、200μg/mL的BP@MnO2复合纳米材料，与新鲜的小鼠红细胞37℃下共同孵育4h，检测其溶血情况，结果如图8所示。结果表示BP@MnO2复合纳米材料浓度为0、25、50、100、200μg/mL时，红细胞皆没有发生明显溶血情况，说明所合成的BP@MnO2复合纳米材料细胞毒性低、生物相容性好，对红细胞没有影响，可适用于生物系统，有望用于细胞实验及动物实验，甚至未来用于PDT的临床应用。
7、正常GSH下ROS胞内成像结果：
为考察BP@MnO2复合纳米材料在细胞内的光动力治疗效果，产生ROS效率。我们通过DCFH-DA探针，检测正常GSH下BP@MnO2在细胞内产生ROS水平，结果如图9所示。结果表示在荧光倒置显微镜下的相同观测条件(放大倍数、曝光时间、感光度等)观测到的ROS探针荧光成像图及荧光强度对比图。(1)：DMEM、(2)：MnO2、(3)：BP-LZM、(4)：BP@MnO2、(5：)DMEM+660nm、(6)：MnO2+660nm nm、(7)：BP-LZM+660、(8)：BP@MnO2+660nm。(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)为Control组，可以看出：(1)、(2)、(3)、(4)4组基本无绿色荧光强度接近0，(5)、(6)两组有极微弱的绿色荧光，说明在无光照条件下BP-LZM、MnO、BP@MnO2本身皆不会对DCFH-DA探针有影响，无光敏剂、单纯660nm激光灯光照10min会对DCFH-DA探针有轻微的“光漂白”现象，但极其微弱，可忽略，不会影响实验；(7)、(8)相较于Control组，有较强的绿色荧光，且(8)比(7)荧光强度大较多，说明光敏剂BP-LZM纳米片和BP@MnO2复合纳米材料皆可在细胞内产生ROS，而且BP@MnO2复合纳米材料在相同条件660nm激光灯(1W)光照10min条件下产生ROS更多，光动力治疗效果更强。
8、促进/抑制GSH下ROS胞内成像结果：
为考察BP@MnO2复合纳米材料在调控细胞GSH含量后光动力治疗产生ROS水平。我们通过提前用GSH增强剂LPA或者GSH抑制剂NMM处理，调控细胞GSH含量。加入BP或BP@MnO2培养4h后，利用DCFH-DA探针，检测ROS水平，结果如图10所示。结果表示在荧光倒置显微镜下的相同观测条件(放大倍数、曝光时间、感光度等)观测到的ROS探针荧光成像图及荧光强度对比图，(1)：LPA+BP-LZM+660nm、(2)：LAP+BP@MnO2+660nm、(3)：BP-LZM+660nm、(4)：BP@MnO2+660nm、(5)：NMM+BP-LZM+660nm、(6)：NMM+BP@MnO2+660nm。通过(1)(2)、(3)(4)、(5)(6)相同GSH条件下的横向比较，发现BP@MnO2的绿色荧光强度总比BP-LZM要强，且随着GSH含量减少，这种差异在减小；同时通过(1)(3)(5)、(2)(4)(6)在LPA、Normal、NMM三种GSH条件下的纵向比较，发现随着细胞内GSH的增加，BP-LZM产生的ROS逐渐减少，而BP@MnO2基本则不受细胞内GSH改变的影响。进一步说明，肿瘤细胞内过量表达的GSH会对BP-LZM纳米片等光敏剂的光动力治疗有消极影响，降低光动力治疗效果，而对所合成BP@MnO2没有明显影响，所合成BP@MnO2复合纳米材料可以从消除GSH影响方面提高光敏剂的光动力治疗效率。
9、Dead-Live负染检测结果：
为研究BP@MnO2复合纳米材料在细胞内的光动力治疗效果，产生杀伤肿瘤细胞效率。本实验通过利用Calcein-AM/PI活/死细胞负染试剂盒，评估BP@MnO2复合纳米材料光动力治疗后细胞凋亡情况，结果如图11所示。结果表示在荧光倒置显微镜下的相同观测条件(放大倍数、曝光时间、感光度等)观测到的ROS探针荧光成像图及荧光强度对比图。(1)：DMEM、(2)：MnO2、(3)：BP-LZM、(4)：BP@MnO2、(5)：DMEM+660nm、(6)：MnO2+660nm、(7)：BP-LZM+660nm、(8)：BP@MnO2+660nm。(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)为Control组，可以看出Control组基本为活细胞(绿色)，几乎没有红色凋亡细胞，说明MnO2、BP-LZM、BP@MnO2及光照本身不会对细胞正常生长有较大影响；而(7)、(8)相较于Control组，有较多红色凋亡细胞，且(8)比(7)红色凋亡细胞更多，说明光敏剂BP-LZM纳米片和BP@MnO2复合纳米材料皆可在细胞内产生ROS，杀伤肿瘤细胞，而且BP@MnO2复合纳米材料在相同条件660nm激光灯(1W)光照10min条件下产生ROS更多，杀伤效果更好，光动力治疗效果更强。
10、体内抗肿瘤治疗结果：
为了考察BP@MnO2复合纳米材料在体内的其抗肿瘤效果，以BALB/c小鼠为动物实验对象，在小鼠的皮下建立肿瘤模型，肿瘤体积达到120mm3时，进行药物瘤内注射和光动力治疗，检测小鼠肿瘤的大小和体重，结果如图12所示。(a)分别显示第14天(1)：空白、(2)：BP-LZM、(3)：660nm、(4)：MnO2、(5)：BP@MnO2、(6)：MnO2+660nm、(7)：BP-LZM+660nm、(8)：BP@MnO2+660nm的小鼠肿瘤体积照片。可以看出：Control组，(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)小鼠肿瘤体积较大，相互间没有较大差异；而(7)、(8)小鼠肿瘤体积明显较小，特别是(8)小鼠肿瘤体积只有Control组的约10％；(b)表示不同治疗方式下小鼠肿瘤体积增长曲线，同样Control组，(1)：空白、(2)：BP-LZM、(3)：660nm、(4)：MnO2、(5)：BP@MnO2、(6)：MnO2+660nm、小鼠肿瘤体积在这14天中明显增长较快，在第14天时小鼠肿瘤体积达到原来的10～12倍，增长较快。而(7)：BP-LZM+660nm、(8)：BP@MnO2+660nm小鼠肿瘤体积增长明显减慢，(7)：BP-LZM+660nm在第14天时小鼠肿瘤体积是原来的4倍，(8)：BP@MnO2+660nm小鼠肿瘤体积基本没有增长，小鼠的肿瘤基本完全受到了抑制。结果表明BP-LZM、660nm、MnO2、BP@MnO2或MnO2+660nm都没有肿瘤治疗效果，不能抑制肿瘤生长，光敏剂BP-LZM纳米片和BP@MnO2复合纳米材料都有光动力治疗效果，且BP@MnO2复合纳米材料抑制效果明显更好，小鼠的肿瘤基本完全受到了抑制。证明在体内，BP@MnO2复合纳米材料可以明显提高动力学治疗效果。(c)表示治疗过程中小鼠体重变化，发现8组实验小鼠体重没有明显下降，证明不同治疗方式对小鼠生长没有明显影响。

Claims (10)

1.一种黑磷/二氧化锰复合纳米材料制备方法，其特征在于，以牛血清白蛋白为模板通过生物矿化作用，合成MnO2纳米片；对黑磷纳米片进行修饰调控，使原来表面带负电荷的黑磷纳米片表现正电荷；然后通过静电吸附作用让修饰调控后的带正电的黑磷纳米片与带负电的MnO2纳米片紧密结合，形成黑磷/二氧化锰复合纳米材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，对黑磷纳米纳米片进行修饰调控的试剂是溶菌酶、转铁蛋白或聚醚酰亚胺。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，采用溶菌酶修饰，黑磷和溶菌酶质量比为100～1000。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，黑磷纳米片是由液相超声剥离法制得。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的液相超声剥离法的分散剂为饱和氢氧化钠的N-甲基-2-吡咯烷酮溶液；其中液相超声剥离的时长为4～20h；液相超声剥离获得黑磷悬液经过2000～5000rpm离心5～10min，获得黑磷纳米纳米片悬液。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的MnO2纳米片通过牛血清白蛋白为模板生物矿化作用合成，反应温度为20～50℃，反应时间为2～15h，牛血清白蛋白浓度为1～100mg/mL。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所获修饰调控后的黑磷纳米片和MnO2纳米片都分别用水和乙醇洗涤至少3次，1000～12000rpm离心再利用。
8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述修饰调控后的黑磷纳米片与MnO2纳米片投加比例分别为，5～500μg/mL，0.1～5mM。
9.一种黑磷/二氧化锰复合纳米材料，其特征在于，是由权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的。
10.权利要求9所述的黑磷/二氧化锰复合纳米材料的应用于制备光动力治疗抗肿瘤药物。
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