CN111220579B

CN111220579B - 一种基于功能化黑磷生物传感器检测循环肿瘤核酸的方法

Info

Publication number: CN111220579B
Application number: CN201811427758.8A
Authority: CN
Inventors: 喻学锋; 周文华; 黄赤
Original assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Current assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date: 2018-11-27
Filing date: 2018-11-27
Publication date: 2023-02-24
Anticipated expiration: 2038-11-27
Also published as: CN111220579A

Abstract

本发明公开了一种基于功能化黑磷生物传感器检测循环肿瘤核酸的方法，属于生物医学领域中核酸检测方法。本发明的技术方案主要包括：制备出对硝基苯功能化黑磷；然后将对硝基苯功能化黑磷用于单链核苷酸序列的检测。本发明对硝基苯功能化黑磷可以提高黑磷区分单链DNA和双链DNA的能力，在人血清中可以实现ctDNA的快速灵敏检测，检测限可达0.5nM及以下。与此同时，在人血清中，本发明对硝基苯功能化黑磷对ctDNA具有很强的专一性，即使是单碱基的突变或缺失，也能被识别。

Description

一种基于功能化黑磷生物传感器检测循环肿瘤核酸的方法

技术领域

本发明是一种功能化黑磷生物传感器检测循环肿瘤核酸的方法，具体涉及对硝基苯功能化黑磷生物传感器的构建，属于生物医学领域中的循环肿瘤核酸检测方法。

背景技术

癌症是一种基因突变引起的疾病。肿瘤专家认为，对癌症的早期发现、早期诊断和早期治疗，可以有效的提高患者生存期和生活质量。循环肿瘤核酸(ctDNA)是当肿瘤细胞死亡时，DNA分子从其支离破碎的基因组中释放到体液中，是一种重要的肿瘤生物标志物。目前，ctDNA检测方法主要采用二代测序，聚合酶链式反应和数字聚合酶链式反应等方法进行检测，但这些检测方法存在着一定的局限性，如操作复杂，检测时间长，成本高且对实验操作人员实验技能有要求。

申请号CN106918583A，披露了一种利用黑磷纳米薄片构建核酸适体生物传感器制备方法和应用，其构建二维黑磷核酸适体探针，实现对肿瘤细胞的检测。该方法中二维黑磷纳米片作为荧光探针淬灭剂，并不能高特异、高灵敏地检测核酸分子。

申请号CN105300950A，披露了一种部分还原氧化石墨烯的DNA荧光传感器制备方法和应用，其构建部分还原石墨烯DNA荧光传感器，可以高灵敏检测DNA。同样，该石墨烯对单链DNA探针起到淬灭作用，但是石墨烯DNA荧光传感器并不能高特异高灵敏地检测血清中的DNA。

目前，ctDNA检测方法主要采用二代测序，聚合酶链式反应和数字聚合酶链式反应的方法进行检测，但这些检测方法存在着一定的局限性，如操作复杂，检测时间长，成本高且对实验操作人员有较高的实验技能要求。

黑磷具有褶皱型结构，比表面积大，吸附能比较大，可以吸附更多的物质。但仍然存在一定的灵敏度不高和专一性差等问题。鉴于现有的单链DNA检测方法的缺陷，开发出灵敏度高，专一性强，快速检测ctDNA的功能化黑磷生物传感器具有重要意义。

发明内容

本发明的目的之一在于提供了一种对硝基苯功能化黑磷生物传感器。

本发明另一目的在于提供了对硝基苯功能化黑磷生物传感器在检测单链核苷酸序列中的应用。

本发明再一目的在于提供了一种基于对硝基苯功能化黑磷生物传感器检测单链核苷酸序列的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一方面，本发明提供一种对硝基苯功能化黑磷生物传感器，其制备方法为：黑磷分散于乙腈溶液中，然后加入对硝基苯四氟硼酸重氮盐，混匀后在黑暗条件下搅拌，离心，所得沉淀清洗干净得对硝基苯功能化黑磷生物传感器。

优选的，所述黑磷与对硝基苯四氟硼酸重氮盐的质量比为1：4～6。

优选的，所述黑磷选自黑磷纳米片、黑磷量子点、黑磷微纳米颗粒中的至少一种。

优选的，所述搅拌时间为18～22小时，所述离心转速为11000～13000转/分，离心时间为8～12分钟。

优选的，所述清洗为先用乙醇洗，再用水洗。

一方面，本发明提供上述任一项所述的对硝基苯功能化黑磷生物传感器在检测单链核苷酸序列中的应用，所述应用不包括疾病的诊断或治疗。

一方面，本发明提供上述任一项所述的对硝基苯功能化黑磷生物传感器在制备检测单链核苷酸序列产品中的应用。

优选的，所述单链核苷酸序列包括单链DNA、单链RNA。

优选的，所述单链DNA包括ctDNA。

一方面，本发明提供一种基于对硝基苯功能化黑磷生物传感器检测单链核苷酸序列的方法，包括以下步骤：

1)将能够检测目标单链核苷酸序列的荧光标记的单链DNA探针和待测样品溶液混合，杂交反应后再加入上述任一项所述的对硝基苯功能化黑磷生物传感器，孵育反应，检测荧光强度；

2)若加入对硝基苯功能化黑磷前后荧光强度没有发生显著变化，则待测样品中存在与探针相结合的目标单链核苷酸序列；若加入对硝基苯功能化黑磷后，荧光强度显著变弱，则待测样品溶液中不存在与该探针相结合的目标单链核苷酸序列，从而实现对样品中目标单链核苷酸序列的定性检测；或者根据标准曲线对待测样品溶液中目标单链核苷酸序列进行定量检测；

或者，包括以下步骤：

1)将能够检测目标单链核苷酸序列的荧光标记的单链DNA探针和上述任一项所述的对硝基苯功能化黑磷生物传感器孵育反应后，再加入待测样品溶液混合，杂交反应后，检测荧光强度；

2)若加入待测样品溶液前后荧光强度没有发生显著变化，则待测样品中不存在与探针相结合的目标单链核苷酸序列；若加入待测样品溶液后，荧光强度显著变强，则待测样品溶液中存在与该探针相结合的目标单链核苷酸序列，从而实现对样品中目标单链核苷酸序列的定性检测；或者根据标准曲线对待测样品溶液中目标单链核苷酸序列进行定量检测；

或者，包括以下步骤：

将能够检测目标单链核苷酸序列的荧光标记的单链DNA探针、上述任一项所述的对硝基苯功能化黑磷生物传感器和待测样品混合反应12～30min，检测荧光强度；根据标准曲线对待测样品溶液中目标单链核苷酸序列进行定量检测。

优选的，所述杂交反应的时间为12～20min；所述孵育反应的时间为12～20min。

优选的，荧光标记的单链DNA探针与对硝基苯功能化黑磷的用量比为1～10nmol：0.8～5mg。

优选的，所述单链核苷酸序列包括单链DNA、单链RNA。

优选的，所述单链DNA包括ctDNA。

优选的，所述ctDNA包括PIK3CA E542K 1624G>A，所述荧光标记的单链DNA探针的序列包括5’-TCAGTGATTTTAGAGAGAGGA-3’(SEQ ID NO:1)。

优选的，所述待测样品溶液包括血清。

本发明的有益效果是：

本发明能够快速灵敏的检测单链核苷酸序列，本发明对硝基苯功能化黑磷可以提高黑磷区分单链DNA和双链DNA的能力，在人血清中可以实现ctDNA的快速灵敏检测，检测限可达0 .5nM及以下。与此同时，在人血清中，本发明对硝基苯功能化黑磷对ctDNA具有很强的专一性，即使是单碱基的突变或缺失，也能被识别。

本发明针对现有的循环肿瘤核酸检测方法操作复杂，检测时间长，成本高等问题，提出一种功能化黑磷生物传感器检测循环肿瘤核酸的方法。本发明对黑磷进行对硝基苯功能化后，展现出更高的灵敏度和专一性。提供了一种快速、简便、灵敏的检测单链核苷酸序列的新方法。该检测新方法所用的对硝基苯功能化黑磷生物传感器制备方法简便，具有更强的吸附单链DNA能力，及检测快速等特点。

附图说明

图1为黑磷、功能化黑磷与荧光标记单链DNA探针作用的荧光光谱图。图中，横坐标为荧光波长，纵坐标为荧光强度。

图2为对硝基苯功能化黑磷(NP-BPs)检测不同浓度血清ctDNA(分别为0、0 .5、0.7、1、2 .5、5nM)的荧光曲线图。图中，横坐标为荧光波长，纵坐标为荧光强度。

图3为对硝基苯功能化黑磷(NP-BPs)检测血清ctDNA的标准曲线。图中，横坐标为ctDNA浓度，纵坐标为荧光强度。

图4为黑磷(BPs)检测不同浓度血清ctDNA的荧光曲线图。图中，横坐标为荧光波长，纵坐标为荧光强度。

图5为黑磷(BPs)检测血清ctDNA的标准曲线。图中，横坐标为ctDNA浓度，纵坐标为荧光强度。

图6为本发明对硝基苯功能化黑磷(NP-BPs)检测血清中单链DNA的专一性。

图7为黑磷(BPs)检测血清中单链DNA的专一性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

本发明主要内容是一种功能化黑磷生物传感器检测循环肿瘤核酸的方法。下面以PIK3CA E542K ctDNA为例作进一步说明，但本发明并不限于以下实例。

实施例1：对硝基苯功能化黑磷生物传感器的制备

将1mg黑磷(可以是黑磷纳米片、黑磷量子点或黑磷微纳米颗粒)分散于1mL乙腈溶液中，得到黑磷悬浮液，然后加入5mg对硝基苯四氟硼酸重氮盐，混匀后在黑暗条件下搅拌20小时，12000转/分离心10分钟，将沉淀分别经过乙醇洗两次，水洗两次后，得对硝基苯功能化黑磷生物传感器。

实施例2：对硝基苯功能化黑磷对DNA探针的荧光淬灭效果

根据需要配制相应的单链DNA探针溶液，如30μL 500nmol/L 6-羧基荧光素(FAM)标记单链DNA探针，用荧光分析该溶液的荧光信号，如图1中的空白对照曲线；再将相同体积和浓度的探针溶液中分别加入等量的黑磷、对硝基苯功能化黑磷(实施例1)，并在荧光仪上检测荧光，观察荧光信号的情况。

检测结果如图1所示，从图1中可以看出，对硝基苯功能化黑磷组相比空白对照组，荧光信号变得很变弱，能够淬灭95 .5％的荧光信号，而黑磷组只是少量淬灭相应的荧光信号，从图中可以看出，对硝基苯功能化黑磷淬灭单链DNA探针荧光的能力显著高于黑磷。说明对硝基苯功能化黑磷对单链DNA探针荧光具有高效的淬灭作用。

实施例3一种基于功能化黑磷生物传感器检测循环肿瘤核酸的方法

方法：将30μL 500nmol/L 6-羧基荧光素(FAM)标记的单链DNA探针(该探针能够与靶ctDNA反向配对结合)溶液与待测样品溶液混合，杂交15分钟后，加入30μL 100μg/mL对硝基苯功能化黑磷，室温下反应15分钟，测定荧光曲线，并对比加入对硝基苯功能化黑磷前后荧光的变化情况，激发波长是488nm。

结果分析：若加入对硝基苯功能化黑磷前后荧光强度没有发生显著变化，则待测样品中存在与荧光探针相结合的靶ctDNA；若加入对硝基苯功能化黑磷后，荧光强度显著变弱(具有显著差异)，则待测样品溶液中不存在与该荧光探针相结合的靶ctDNA，实现对样品中靶ctDNA的定性检测；进一步根据标准曲线能够对样品中靶ctDNA进行定量检测。

实施例4一种基于功能化黑磷生物传感器检测循环肿瘤核酸的方法

方法：将30μL 500nmol/L 6-羧基荧光素(FAM)标记的单链DNA探针溶液(该探针能够与靶ctDNA反向配对结合)加入30μL 100μg/mL对硝基苯功能化黑磷，混合后室温下反应15分钟；然后再加入待测样品溶液(如血清)，杂交15分钟后，测定荧光曲线，并对比加入待测样品溶液前后荧光的变化情况，激发波长是488nm。

结果分析：若加入待测样品溶液前后荧光强度没有发生显著变化，则待测样品中不存在与荧光探针相结合的靶ctDNA；若加入待测样品溶液后，荧光强度显著变强(具有显著差异) ，则待测样品溶液中存在与该荧光探针相结合的靶ctDNA，从而实现对样品中靶ctDNA的定性检测；进一步根据相应标准曲线能够对样品中靶ctDNA进行定量检测。

实施例5功能化黑磷生物传感器检测单链DNA的标准曲线

将30μL 500nmol/L 6-羧基荧光素(FAM)标记单链DNA探针与30μL不同浓度目标ctDNA血清溶液，使目标ctDNA在溶液中的终浓度分别为0、0 .5、0 .7、1、2 .5、5nM，各组分别杂交15分钟后，加入30μL 100μg/mL对硝基苯功能化黑磷(NP-BPs)。室温下反应15分钟，测定荧光曲线，制作标准曲线，激发波长是488nm。所述单链DNA探针与ctDNA之间能够杂交配对结合。

对比例1黑磷检测单链DNA的标准曲线

将30μL 500nmol/L 6-羧基荧光素(FAM)标记单链DNA探针，加入30μL不同浓度目标ctDNA血清溶液，使目标ctDNA在溶液中的终浓度分别为0、5、10、15、20nM，各组分别杂交15分钟后，加入30μL 100μg/mL黑磷(BP)，室温下反应15分钟，测定荧光曲线，制作标准曲线，激发波长是488nm。对比例1和实施例5所用的单链DNA探针、ctDNA均相同，单链DNA探针与ctDNA之间能够杂交配对结合。

图2为对硝基苯功能化黑磷(NP-BPs)检测不同浓度血清ctDNA(分别为0、0 .5、0.7、1、2 .5、5nM)的荧光曲线图；图3为对硝基苯功能化黑磷(NP-BPs)检测血清ctDNA的标准曲线；图4为黑磷(BP)检测不同浓度血清ctDNA(分别为0、5、10、15、20nM)的荧光曲线图；图5为黑磷(BP)检测血清ctDNA的标准曲线。从中可以看出，对硝基苯功能化黑磷在血清中对单链DNA的检测灵敏度更好，对0～5nM的单链DNA也能进行准确的检测(如图3)，另外图2也显示了0 .5nM的ctDNA能被检测出来，5nM的ctDNA与0nM的空白对照组相比，荧光强度相差1倍以上。而黑磷(BP)检测单链DNA的灵敏度远不及对硝基苯功能化黑磷(NP-BPs)，如图4和图5所示，5nM的ctDNA与0nM的空白对照组相比，荧光强度相差不大，对5nM以下的ctDNA并不能进行很好地识别。

上述结果说明对硝基苯功能化黑磷可以提高黑磷区分单链DNA和双链DNA的能力，在人血清中可以实现ctDNA的更灵敏、更快速度地检测，检测灵敏度可达0 .5nM及以下。

实施例6功能化黑磷生物传感器检测单链DNA的专一性检测

将30μL 500nmol/L FAM-DNA探针(见表1中的PIK3CA E542K probe(P))加入30μL100nmol/L目标链DNA血清溶液(见表1中的PIK3CA E542K 1624G>A)、单碱基错配DNA(见表1中的PIK3CA E542K 1624G>C、PIK3CA E542K 1624G>T，Wild type)、单碱基缺失DNA(见表1中的PIK3CA E542K Deletion)、非互补链DNA混合，杂交15分钟后，再分别加入30μL 100μg/mL对硝基苯功能化黑磷或黑磷，室温下反应15分钟，测定荧光曲线，激发波长是488nm。

表1荧光标记DNA探针和不同单链DNA序列

检测结果如图6和图7所示，图6为对硝基苯功能化黑磷检测血清靶ctDNA(PIK3CAE542K 1624G>A(T))的检测结果，从中可以看出，只有加入的单链DNA为靶ctDNA(PIK3CAE542K 1624G>A (T))时，才能检测到明显的荧光强度，而加入的单碱基错配DNA(PIK3CAE542K 1624G>C、PIK3CA E542K 1624G>T，Wild type)、单碱基缺失DNA等均空白对照组(血清组)一样，不能检测到明显的荧光强度；说明对硝基苯功能化黑磷检测血清中单链DNA具有很强的专一性。而黑磷检测血清靶ctDNA(PIK3CA E542K 1624G>A(T))时，除了靶ctDNA(PIK3CA E542K 1624G>A(T))能被检测到明显的荧光强度，其他实验组与空白对照组(血清组)也能检测到明显的荧光强度，该荧光强度与靶ctDNA(PIK3CA E542K 1624G>A(T))的荧光强度没有显著差异，尤其是其中的单碱基缺失DNA组(Deletion)。上述结果说明对硝基苯功能化黑磷提高了黑磷在检测血清中单链DNA的专一性，具有更好的抗干扰能力。

实施例7一种基于功能化黑磷生物传感器检测循环肿瘤核酸的方法

方法：将30μL 500nmol/L 6-羧基荧光素(FAM)标记的单链DNA探针溶液(该探针能够与靶ctDNA反向配对结合)、30μL 100μg/mL对硝基苯功能化黑磷、待测样品溶液(如血清)，混合反应25分钟后，测定荧光曲线，激发波长是488nm。

结果分析：根据测定的荧光曲线和相应的标准曲线能够对样品中靶ctDNA进行定量检测。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、功能化、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院深圳先进技术研究院

<120> 一种基于功能化黑磷生物传感器检测循环肿瘤核酸的方法

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcagtgattt tagagagagg a 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcctctctct aaaatcactg ag 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcctctctct caaatcactg ag 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcctctctct taaatcactg ag 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcctctctct gaaatcactg ag 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcctctctct aaatcactga g 21

Claims

1.一种用于检测ctDNA的对硝基苯功能化黑磷生物传感器，其特征在于，其制备方法为：黑磷分散于乙腈溶液中，然后加入对硝基苯四氟硼酸重氮盐，混匀后在黑暗条件下搅拌，离心，所得沉淀清洗干净得对硝基苯功能化黑磷生物传感器；

所述黑磷选自黑磷纳米片、黑磷量子点、黑磷微纳米颗粒中的至少一种；

所述搅拌时间为18～22小时，所述离心转速为11000～13000转/分，离心时

间为8～12分钟。

2.权利要求1所述的对硝基苯功能化黑磷生物传感器在检测单链核苷酸序列中的应用，所述应用不包括疾病的诊断或治疗；所述单链核苷酸序列为ctDNA。

3.权利要求1所述的对硝基苯功能化黑磷生物传感器在制备检测单链核苷酸序

列产品中的应用，所述单链核苷酸序列为ctDNA。

4.一种基于对硝基苯功能化黑磷生物传感器检测单链核苷酸序列的方法，其特

征在于，包括以下步骤：

1)将能够检测目标单链核苷酸序列的荧光标记的单链DNA探针和待测样品溶液混合，杂交反应后再加入权利要求1所述的对硝基苯功能化黑磷生物传感器，孵育反应，检测荧光强度；

2)若加入对硝基苯功能化黑磷前后荧光强度没有发生显著变化，则待测样

品中存在与探针相结合的目标单链核苷酸序列；若加入对硝基苯功能化黑磷

后，荧光强度显著变弱，则待测样品溶液中不存在与该探针相结合的目标单链核苷酸序列，从而实现对样品中目标单链核苷酸序列的定性检测；或者根据标准曲线对待测样品溶液中目标单链核苷酸序列进行定量检测；

或者，包括以下步骤：

1)将能够检测目标单链核苷酸序列的荧光标记的单链DNA探针和权利要求1

所述的对硝基苯功能化黑磷生物传感器孵育反应后，再加入待测样品溶液混合，杂交反应后，检测荧光强度；

2)若加入待测样品溶液前后荧光强度没有发生显著变化，则待测样品中

不存在与探针相结合的目标单链核苷酸序列；若加入待测样品溶液后，荧光强度显著变强，则待测样品溶液中存在与该探针相结合的目标单链核苷酸序列，从而实现对样品中目标单链核苷酸序列的定性检测；或者根据标准曲线对待测样品溶液中目标单链核苷酸序列进行定量检测；

或者，包括以下步骤：

将能够检测目标单链核苷酸序列的荧光标记的单链DNA探针、权利要求1所述的对硝基苯功能化黑磷生物传感器和待测样品混合反应12～30min，检测荧光强度；根据标准曲线对待测样品溶液中目标单链核苷酸序列进行定量检测；

所述单链核苷酸序列为ctDNA。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述杂交反应的时间为12～20min；所述孵育反应的时间为12～20min。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，荧光标记的单链DNA探针与对硝基苯功能化黑磷的用量比为1～10nmol：0 .8～5mg。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述待测样品溶液包括血清。