CN109260473A - 一种具有肿瘤靶向功能的卟啉纳米复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有肿瘤靶向功能的卟啉纳米复合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种具有肿瘤靶向功能的卟啉纳米复合物及其制备方法和应用，属于材料化学与生物纳米医药技术领域。本发明提供具有肿瘤靶向功能的卟啉纳米复合物的制备方法，将乙酰丙酮钆卟啉和四苯基锌卟啉利用共组装策略来驱动两种疏水卟啉成分进行共组装，得到的卟啉纳米复合物表现出高的光动力治疗效率和MRI的成像效率。同时卟啉纳米复合物还修饰有HeLa细胞膜碎片，提高肿瘤靶向功能并增强HeLa细胞的摄取。本发明提供的卟啉纳米复合物可用作优异的光敏剂和/或造影剂。

Description

一种具有肿瘤靶向功能的卟啉纳米复合物及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于材料化学与生物纳米医药技术领域，具体涉及一种具有肿瘤靶向功能的卟啉纳米复合物及其制备方法和应用。
背景技术
光动力疗法(PDT)是一种新型的非侵入型肿瘤治疗手段。光敏剂、光和组织氧是组成PDT的三大组成部分。光敏剂在光照下产生活性氧物质 (ROS)，从而实现杀死肿瘤细胞的目标。单线态氧(1O2)是PDT治疗过程中的关键细胞毒性物种。常见的PDT光敏剂包括卟啉衍生物，bodipy染料和半导体量子点等。其中卟啉作为一种有机共轭大分子，通过改变中心金属的种类，可以衍生出丰富的成像(MRI，荧光，PET和SPET等)和治疗(PDT 和PTT)功能，适用于多种生物应用。例如，中心金属原子是Gd或Mn的卟啉，显示出优异的MRI成像能力。而中心为锌的卟啉将提供有利的光动力效应。其中MRI成像和PDT两种技术因其高效和非侵入的优点被研究者广泛研究。然而，这些卟啉分子作为小分子，水溶性差且肿瘤选择性低，当其用于PDT应用时，其激发光多在紫外光下，长波长吸收能力较低，限制了其光动力治疗效率。
纳米材料的自组装方法是一种强有力的自下而上的材料合成方法，可实现单分散和高度均匀的纳米材料的制备，从而应用于生物领域、选择性催化、气体储存、光捕获和能量转移。自组装制备可以得到高亲水性，增强吸收的纳米材料。但是自组装方法表现出低的光动力治疗效率和MRI的成像效率。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有肿瘤靶向功能的卟啉纳米复合物及其制备方法和应用，所述卟啉纳米复合物不仅能提高光动力治疗效率和MRI的成像效率还具有较强的肿瘤靶向功能。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种具有肿瘤靶向功能的卟啉纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)乙酰丙酮钆卟啉、四苯基锌卟啉和氯仿混合，得到卟啉混合氯仿溶液；
(2)将所述卟啉混合氯仿溶液在乳化剂的作用下造乳，去除氯仿，得到双卟啉组分纳米微球水溶液(GZNs)；
(3)提取HeLa细胞的细胞膜碎片，分选，得到200～300nm的Hela细胞的细胞膜碎片溶液；
(4)将所述步骤(3)中Hela细胞的细胞膜碎片溶液和双卟啉组分纳米微球水溶液混合，收集经400nm的多孔膜过滤的膜下物质，获得包裹有细胞膜碎片的卟啉纳米复合物(mGZNs)；
所述步骤(1)～(2)和步骤(3)之间没有时间顺序的限制。
优选的，所述步骤(1)中乙酰丙酮钆卟啉的质量、四苯基锌卟啉的质量和氯仿的体积比为1～9mg：1～9mg：1mL；所述乙酰丙酮钆卟啉的质量和四苯基锌卟啉的总质量为10mg。
优选的，所述步骤(2)中乳化剂包括十二烷基磺酸钠水溶液；所述十二烷基磺酸钠水溶液的浓度为0.005～0.015mol/L。
优选的，所述步骤(2)中卟啉混合氯仿溶液和乳化剂的体积比为1～2： 7～10mL。
优选的，所述步骤(2)中造乳的方法包括超声处理；所述超声处理的功率为60～100W；所述超声处理的时间为1～5min。
优选的，所述步骤(2)中去除氯仿的方法为加热；所述加热的温度为 60～65℃。
优选的，所述步骤(4)中Hela细胞的细胞膜碎片溶液和双卟啉组分纳米微球水溶液的体积比为1:1；
所述Hela细胞的细胞膜碎片溶液的浓度为2mg/mL；
所述双卟啉组分纳米微球水溶液的浓度1～5mg/mL。
本发明提供了所述制备方法制备的具有肿瘤靶向功能的卟啉纳米复合物，所述卟啉纳米复合物的结构包括纳米复合微球和包裹在纳米复合微球表面的HeLa细胞的细胞膜碎片；所述纳米复合微球包括Gd和Zn元素。
本发明提供了一种包含所述卟啉纳米复合物的光敏剂和/或造影剂。
本发明还提供了所述卟啉纳米复合物在核磁共振成像的造影剂和/或光动力治疗中光敏剂中的应用。
本发明提供了一种具有肿瘤靶向功能的卟啉纳米复合物制备方法，将乙酰丙酮钆卟啉和四苯基锌卟啉为原料，利用共组装策略来驱动两种疏水卟啉成分进行共组装，即光活性的四苯基锌卟啉(ZnTPP)和具有MRI成像功能的乙酰丙酮钆卟啉(GdTPP)。同时在双卟啉组分纳米微球中修饰HeLa细胞膜碎片(mGZNs)后，细胞膜碎片的表面蛋白(或粘附分子)具有与癌细胞的细胞膜的同种或不同种的细胞粘附分子结合的能力，因此，细胞膜碎片辅助卟啉纳米复合物实现对癌细胞的精确导航和定位，从而实现肿瘤靶向功能。同时本发明提供的制备方法操作简便，重复性好，成本低，便于工业化生产。
本发明提供的卟啉纳米复合物，同时含有Gd和Zn元素，使卟啉复合纳米微球对长波长(635nm)的吸光能力大大增强，有利于增强后期的PDT 效率，再结合仿生修饰提高了纳米复合物的肿瘤靶向效率，所述卟啉纳米复合物表现出较高的光动力治疗效率和MRI的成像效率(Gd-DTPA的2.5倍)，实现了卟啉纳米复合物的MRI和PDT双功能。经实验证明：通过研究卟啉纳米复合物在细胞水平的的单线态氧产生能力和光动力治疗效果，发现在 635nm(0.15W/cm2)光照9min下，产生了接近90％的癌细胞杀死效率；同时研究体外/体内MRI成像效果，发现卟啉纳米复合物还表现出优异的体内 MRI成像效果，可以广泛用于动态观察治疗效果。
附图说明
图1为mGZNs的TEM图，其中图1-a为200nm条件下观察的GZNs的TEM 图，图1-b为400nm条件下观察的Hela细胞膜的TEM图，图1-c为200nm 条件下观察的mGZNs的TEM图；
图2为纳米复合物所对应的元素mapping图；
图3为纳米复合物与单体的吸收对比图及其单线态氧产生的ESR测试结果图，其中图3-a为纳米复合物与单体的吸收对比图，图3-b为单线态氧产生的ESR测试结果图；
图4为mGZNs进行细胞水平的测试结果图；其中图4-a为mGZNs的光动力治疗效率的MTT细胞实验；图4-b为不同浓度下DCFH-DA与单线态氧结合后荧光强度变化，对应着单线态氧的产量；图4-c为肿瘤细胞膜很好地包覆在纳米复合物的表面；纳米复合物成功包覆细胞膜的激光共聚焦照片，其中蓝光：核染料Hoechst 33342，绿光：Dio染细胞膜，红光：卟啉荧光；图4-d为不同处理中的HeLa细胞产生的单线态氧的测试结果；
图5为体外/体内MRI成像效果；其中图5-a为纳米复合物对应的体外 MRI成像，图5-b为纳米复合物对应的体内MRI成像；图5-c为弛豫率计算结果图；
图6为光动力治疗荷瘤小鼠的结果图；其中图6-a为皮下肿瘤在不同时间点肿瘤的变化结果；图6-b为皮下肿瘤在不同时间点肿瘤的体积的变化结果和小鼠体重的变化。
具体实施方式
本发明提供了一种具有肿瘤靶向功能的卟啉纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)乙酰丙酮钆卟啉、四苯基锌卟啉和氯仿混合，得到卟啉混合氯仿溶液；
(2)将所述卟啉混合氯仿溶液在乳化剂的作用下造乳，去除氯仿，得到双卟啉组分纳米微球水溶液(GZNs)；
(3)提取HeLa细胞的细胞膜碎片，分选，得到200～300nm的Hela细胞的细胞膜碎片溶液；
(4)将所述步骤(3)中Hela细胞的细胞膜碎片溶液和双卟啉组分纳米微球水溶液混合，收集经400nm的多孔膜过滤的膜下物质，获得包裹有细胞膜碎片的卟啉纳米复合物(mGZNs)；
所述步骤(1)～(2)和步骤(3)之间没有时间顺序的限制。
本发明将乙酰丙酮钆卟啉、四苯基锌卟啉和氯仿混合，得到卟啉混合氯仿溶液。
在本发明中，所述乙酰丙酮钆卟啉的质量、四苯基锌卟啉的质量和氯仿的体积比优选为1～9mg：1～9mg：1mL；所述乙酰丙酮钆卟啉的质量和四苯基锌卟啉的总质量优选为10mg。所述混合的方式优选为搅拌。所述搅拌的时间优选为25～35min，更优选为30min。所述搅拌的转速没有特殊限制，采用本领域所熟知的搅拌的转速即可。所述乙酰丙酮钆卟啉的来源购买自 Frontier Scientific。四苯基锌卟啉的来源购自strem chemicals,inc。
得到卟啉混合氯仿溶液后，本发明将所述卟啉混合氯仿溶液在乳化剂的作用下造乳，去除氯仿，得到双卟啉组分纳米微球水溶液(GZNs)。
在本发明中，所述乳化剂优选包括十二烷基磺酸钠水溶液；所述十二烷基磺酸钠水溶液的浓度优选为0.005～0.015mol/L，更优选为0.01mol/L。所述卟啉混合氯仿溶液和乳化剂的体积比优选为1～2：7～10，更优选为1:10。
在本发明中，所述造乳的方法优选包括超声处理；所述超声处理的功率优选为60～100W，更优选为80W。所述超声处理的时间优选为1～5min，更优选为1min。
在本发明中，所述去除氯仿的方法优选为加热；所述加热的温度优选为 60～65℃。所述加热的时间优选为30～60min。
本发明提取HeLa细胞的细胞膜碎片，分选，得到200～300nm的Hela 细胞的细胞膜碎片溶液。
在本发明中，所述提取HeLa细胞的细胞膜碎片溶液的方法优选为采用试剂盒法进行。本发明对所述试剂盒的选择没有特殊限制，采用本领域所熟知的细胞膜碎片提取试剂盒即可。在本发明实施例中，所述试剂盒购自碧云天。
所述HeLa细胞的细胞膜碎片溶液的提取方法具体包括以下步骤：
①首先培养2000万～5000万个HeLa细胞，PBS缓冲液洗一次，加入含有2mM EDTA但不含胰酶的细胞消化液处理细胞使细胞不再贴壁，吹打细胞，得到单细胞；
②将所述单细胞离心收集细胞，吸除上清，留下细胞沉淀备用，用预冷的PBS重悬细胞沉淀，取少量细胞用于计数，剩余细胞4℃，600g离心5min 沉淀细胞；弃上清，随后4℃，600g离心1min，收集沉淀细胞；
③把1ml临用前添加了10μL PMSF(苯甲基磺酰氟，分子式为C7H7FO2S，分子量为174.19)的膜蛋白抽提试剂A加入至上述沉淀细胞中，轻轻并充分悬浮细胞，冰浴放置10～15min，在4℃，700～1000g离心10min，收集上清液至新离心管中，再次4℃，14000g离心30min，沉淀为细胞膜碎片；
④将所述细胞膜碎片分散在超纯水中4℃保存备用。
在本发明中，所述Hela细胞的细胞膜碎片溶液的分选方法优选采用膜挤出器进行，所述膜挤出器所用的聚碳酸酯膜的孔径为200nm和300nm。采用膜挤出器进行分选能够使提取的大尺寸的细胞膜变成小尺寸的细胞膜，便于后续纳米微球的包被。
得到200～300nm的Hela细胞的细胞膜碎片溶液和双卟啉组分纳米微球水溶液后，本发明将所述的Hela细胞的细胞膜碎片溶液和双卟啉组分纳米微球水溶液混合，过400nm的多孔膜，获得包裹有细胞膜碎片的卟啉纳米复合物(mGZNs)。
在本发明中，所述Hela细胞的细胞膜碎片溶液和双卟啉组分纳米微球水溶液的体积比优选为1～2：1～2，最优选为1:1。所述Hela细胞的细胞膜碎片溶液的浓度优选为1.5～5mg/mL，更优选为2mg/mL。所述双卟啉组分纳米微球水溶液的浓度优选为1～5mg/mL，更优选为2mg/mL。
在本发明中，所述混合优选采用搅拌的方式进行。所述搅拌的时间优选为25～35min，更优选为30min。所述过400nm的多孔膜的方法优选采用膜挤出器。
本发明提供了所述制备方法制备的具有肿瘤靶向功能的卟啉纳米复合物，所述卟啉纳米复合物的结构包括纳米复合微球和包裹在纳米复合微球表面的HeLa细胞的细胞膜碎片；所述纳米复合微球包括Gd和Zn元素。
在本发明中，所述卟啉纳米复合物通过透射电镜观察形貌发现具有明显的包覆状态，说明细胞膜已经成功地包裹在纳米微球表面。通过元素mapping 表征，表明卟啉纳米复合物中同时含有Gd和Zn元素，证明成功合成双卟啉复合的纳米微球。卟啉纳米复合物中的吸收波长有明显的长波长增强现象，证明卟啉复合纳米微球的吸光能力在共组装后大大增强，有利于增强后期的PDT效率。
本发明提供了一种包含所述卟啉纳米复合物的光敏剂和/或造影剂。
本发明还提供了所述卟啉纳米复合物在核磁共振成像的造影剂和/或光动力治疗中光敏剂中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的一种具有肿瘤靶向功能的卟啉纳米复合物及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1)将乙酰丙酮钆卟啉(5mg)和四苯基锌卟啉(5mg)混溶于1mL的氯仿溶剂中，搅拌30min后得到两种卟啉的混合氯仿溶液。
2)将混合卟啉的氯仿溶液加入到十二烷基磺酸钠(SDS，0.01M)的水溶液中，在超声造乳的作用下(80W)超声1min，然后置于63℃水浴锅中加热30min挥发氯仿，挥发后的溶液冷却恢复到室温，得到纳米复合微球。
3)首先培养约5000万HeLa细胞，PBS洗一遍后加入含有EDTA但不含胰酶的细胞消化液处理细胞使细胞不再贴壁，并用移液器吹打细胞。离心收集细胞，吸除上清，留下细胞沉淀备用，用适量预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，取少量细胞用于计数，剩余细胞4℃，600g离心5min沉淀细胞。弃上清，随后4℃，600g离心1min，以沉淀离心管管壁上的残留液体并进一步沉淀细胞，把1mL临用前添加了10μLPMSF的膜蛋白抽提试剂A加入至细胞中，充分悬浮细胞，冰浴放置10-15min，4℃，700g离心10min，小心收集上清液至一新的离心管中。4℃，14000g离心30min，沉淀细胞膜碎片，分散在超纯水中4℃备用。
4)取前面提取的Hela细胞膜，用膜挤出器将细胞膜从400nm聚碳酸酯膜中挤出，将挤出的细胞膜和2mg/ml的纳米粒子的水溶液混合，然后将混合物从400nm的聚碳酸酯多孔膜挤出，获得包裹细胞膜的卟啉纳米复合物(mGZNs)。
实施例2
将实施例1制备的包裹细胞膜的卟啉纳米复合物(mGZNs)进行透射电镜观察形貌，结果图1所示。
由图1中所示，可以看到明显的包覆状态，证明细胞膜已经成功地包裹在纳米微球表面。
实施例3
将实施例1制备过程中产生的纳米复合微球(GZNs)对Gd，Zn，C,N 元素进行元素mapping表征。
表征结果见图2。由图2可知，纳米复合微球中同时含有Gd和Zn元素，证明成功合成双卟啉复合的纳米微球。
实施例4
为了研究材料的单线态氧性能和光吸收波长性能，对实施例1中的纳米复合微球进行了ESR的测试和光吸收波长测试，其中以乙酰丙酮钆卟啉和四苯基锌卟啉单体作为对照，结果见图3。
光吸收波长测试的结果如图3-a所示。由图3-a可知，复合纳米微球中的吸收波长有明显的长波长增强现象，证明卟啉复合纳米微球的吸光能力在共组装后大大增强，有利于增强后期的PDT效率。
单线态氧性能结果如下图3-b所示。由图3-b可知，得到了明显的单线态氧特征峰。
实施例5
为了研究材料在细胞水平的的单线态氧产生能力和光动力治疗效果，对实施例中mGZNs进行细胞水平的测试，具体方法如下：在96孔板中培养 Hela细胞，每孔大约5000个/孔，贴壁24h。然后将不同浓度的mGZNs( 0mM，0.05mM，0.1mM和0.2mM)分加入96孔板中孵化4h，用PBS将多余mGZNs洗掉，用0.15W/cm2分别进行不同时间的光照(0min，3min， 6min，9min)，继续培养12h。按照1:9的比例用培养基稀释CCK-8(Cell Counting Kit-8)，然后于96孔板中的每个孔中加入100μL的CCK-8，孵化半小时，于酶标仪中测量450nm处的吸光值，计算卟啉纳米复合物的PDT 效率。结果图4所示。
从图4-a中可以看出，mGZNs在635nm(0.15W/cm2)光照9min下，产生了接近90％的癌细胞杀死效率。
采用DCFH-DA单线态氧荧光探针对其不同浓度产生的单线态氧进行测试和可视化细胞荧光成像，发现单线态氧的产生呈现出剂量依赖的趋势(图4-b)。通过Dio染膜后的激光共聚焦观察，发现绿色发光代表的肿瘤膜与红色光代表的卟啉纳米复合物很好地重叠在一起，证明肿瘤细胞膜很好地包覆在纳米复合物的表面(图4-c)。
实施例6
为了研究材料的体外MRI成像效果，采用型号为的MesoMR23-060H-I 成像仪进行成像，设置共振频率为23.317MHz，磁体强度为0.5T，线圈直径为60mm，磁体温度为32℃。将实施例1～3制备的mGZNs纳米复合物分别进行稀释(0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5，单位为mM)依次排列在拖盘上，进行成像，对比了不同浓度下的T1加权成像效果(图5-a)，并计算了其对应的弛豫率图5-c。材料同时还表现出优异的体内MRI成像效果。
实施例7
为了验证在动物水平的光动力治疗效果，将实施例1中的mGZNs纳米复合物对小鼠进行实验，将200μL的Hela细胞/PBS溶液经皮下注射到8 周的BALB/c小鼠的右后腿，建立HeLa肿瘤模型。当肿瘤体积达到约60 mm3时，将小鼠随机分成6组，分别为PBS，PBS+L，GZNs，GZNs+L和 mGZNs，mGZNs+L，其中不经过光照(L)的组别为对照组，加光照的组别为实验组。将PBS，GZNs(200μL，0.5mM)和mGZNs(200μL，0.5mM) 采用尾静脉的方式注射到光照组和对照组的小鼠体内。4小时后，照射小鼠 (波长：635nm，功率强度：0.65W/cm2)肿瘤部位并持续5min(对照组不加光)。每两天记录一次小鼠的体重和肿瘤的体积变化。光照后21天，处死小鼠并收集心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织用于H&E(苏木精-伊红染色法) 分析，癌症体积计算如下：V＝W2×L/2，其中W和L分别代表宽度和长度。结果图6所示。
由图6可知，发现小鼠的肿瘤具有明显的光动力消融现象，且各个组中的小鼠体重没有明显变化，说明纳米复合物具有很好的生物相容性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种具有肿瘤靶向功能的卟啉纳米复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)乙酰丙酮钆卟啉、四苯基锌卟啉和氯仿混合，得到卟啉混合氯仿溶液；
(2)将所述卟啉混合氯仿溶液在乳化剂的作用下造乳，去除氯仿，得到双卟啉组分纳米微球水溶液；
(3)提取HeLa细胞的细胞膜碎片，分选，得到200～300nm的Hela细胞的细胞膜碎片溶液；
(4)将所述步骤(3)中的Hela细胞的细胞膜碎片溶液和双卟啉组分纳米微球水溶液混合，收集经400nm的多孔膜过滤的膜下物质，获得包裹有细胞膜碎片的卟啉纳米复合物；
所述步骤(1)～(2)和步骤(3)之间没有时间顺序的限制。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中乙酰丙酮钆卟啉的质量、四苯基锌卟啉的质量和氯仿的体积比为1～9mg：1～9mg：1mL；所述乙酰丙酮钆卟啉的质量和四苯基锌卟啉的总质量为10mg。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中乳化剂包括十二烷基磺酸钠水溶液；所述十二烷基磺酸钠水溶液的浓度为0.005～0.015mol/L。
4.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中卟啉混合氯仿溶液和乳化剂的体积比为1～2mL：7～10mL。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中造乳的方法包括超声处理；所述超声处理的功率为60～100W；所述超声处理的时间为1～5min。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中去除氯仿的方法为加热；所述加热的温度为60～65℃。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中Hela细胞的细胞膜碎片溶液和双卟啉组分纳米微球水溶液的体积比为1:1；
所述Hela细胞的细胞膜碎片溶液的浓度为2mg/mL；
所述双卟啉组分纳米微球水溶液的浓度1～5mg/mL。
8.权利要求1～7任意一项所述制备方法制备的具有肿瘤靶向功能的卟啉纳米复合物，其特征在于，所述卟啉纳米复合物的结构包括纳米复合微球和包裹在纳米复合微球表面的HeLa细胞的细胞膜碎片；所述纳米复合微球包括Gd和Zn元素。
9.一种包含权利要求8所述卟啉纳米复合物的光敏剂和/或造影剂。
10.权利要求8所述卟啉纳米复合物在核磁共振成像的造影剂和/或光动力治疗中光敏剂中的应用。
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