CN103566381A

CN103566381A - 一种多功能磁性纳米颗粒及其制备方法

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Publication number: CN103566381A
Application number: CN201310526635.0A
Authority: CN
Inventors: 蓝闽波; 赵雪伶; 赵红莉; 袁慧慧; 陈宗艳; 张登浩; 陶亮
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2013-10-30
Filing date: 2013-10-30
Publication date: 2014-02-12

Abstract

本发明涉及一种新型多功能磁性纳米颗粒及其制备方法。所述多功能磁性纳米颗粒具有核-壳结构，其核为可用医用的纳米磁性颗粒，其壳为负载光动力药物的具有介孔结构的纳米二氧化硅，且在所述的壳上还修饰有对人体或动物安全的亲水基团和靶向试剂；所述多功能磁性纳米颗粒的比表面积（BET）为600m²/g～800m²/g。本发明提供的是一种具有良好的功能可控性的集肿瘤靶向、影像和光动力治疗于一体的多功能磁性纳米颗粒。

Description

一种多功能磁性纳米颗粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种集肿瘤靶向、影像和光动力治疗于一体的新型多功能磁性纳米颗粒及其制备方法。

背景技术

人类健康是一个永恒的课题，随着人类经济社会的发展，健康问题越来越受到人们的重视。当前，癌症是对人类健康危害最严重的疾病之一，发病率持续上升，造成严重的社会和经济负担。由于缺乏高灵敏度诊断及低毒副作用治疗方法，癌症的早期诊断和治疗仍然是当今医学的难题之一。

纳米技术在癌症的预防、诊断、影像和治疗领域具有潜在的巨大贡献。纳米生物医学的快速发展也为开发安全、高效、特异、智能化的纳米探针提供了新思路。纳米颗粒比癌细胞小100倍，甚至1000倍，很容易通过细胞屏障。另外，由于肿瘤组织的高通透高滞留效应（Enhanced permeability and retention effect）它们优先聚集在肿瘤部位。如何应用纳米颗粒的特性如小尺寸效应、纳米表面效应、量子效应、纳米结构独特声、光、电、热、磁等性质来提高肿瘤的靶向成像和选择性治疗，是目前生命科学对纳米科技提出的最具挑战性的问题，也是纳米科技发展面临的一项重大需求。

磁性纳米颗粒因其尺寸可控、易于操纵和能增强磁共振成像对比等特性受到广泛关注，可以应用于细胞分离，医学诊断、癌症热疗、靶向载药及磁共振成像等技术中。此外，磁性纳米颗粒还可以与荧光探针、生物靶向分子或抗肿瘤药物等相结合实现磁性纳米颗粒的多功能化，在多模式成像、肿瘤的靶向诊断与治疗中有较好的应用前景。因此，开发新型的集检测、载药、治疗等于一体的多功能磁纳米生物探针是目前纳米生物医学领域的研究热点之一。

光动力学治疗（Photodynamic therapy，PDT）是一种新兴的治疗癌症的方法。对比于传统疗法，PDT具有以下优点：对肿瘤细胞具有相对选择性和组织特异性；毒性低，安全，副作用小；冷光化学反应，不影响其他治疗，与手术、放疗和化疗等疗法相辅相成；可重复用药，无药物耐受性；治疗时间短，48～72小时即可发生作用。PDT包含三个可变参数:光敏剂、光源以及组织中的分子态氧，三者缺一不可。光敏剂能够吸收特定波长的光的能量并传递给周围的氧分子，产生化学性质很活泼的单线态氧，单线态氧可以与生物大分子发生作用，破坏细胞和细胞器的结构与功能，从而杀伤癌细胞，达到治疗肿瘤的目的。

光敏剂不仅能够产生单线态氧用于癌症治疗，而且还能产生荧光，尤其是近红外荧光，可以用于活体成像。光敏剂的荧光可以用于监测其分布和摄取量，区分正常组织和病变组织，从而对癌症进行诊断分析，并实时评估PDT的治疗效果。

光动力学疗法广泛应用于多种疾病（如：癌症、心血管疾病、皮肤病和眼病等）的治疗和研究，作为一种微创疗法，备受青睐，但在其广泛的临床应用中，存在诸多问题，如：皮肤光毒作用；现有的大多数光敏剂为疏水性分子，在水溶液中容易团聚导致量子产率降低；光敏剂的靶向选择性不高，在正常组织中的存留极有可能导致对正常组织的伤害，严重者会危及到病人的生命。因而构建高效的光敏剂药物载体成为研究的热点。

近年来，研究人员在磁靶向光动力学治疗领域进行了大量的工作。例如，R.Kopelman等设计了一种以聚丙烯酰胺（PAA）为核，内夹杂光敏剂和核磁共振成像造影剂，表面包覆PEG和靶向分子功能基团的多功能纳米颗粒，实验证明该颗粒能有效的治疗小鼠的脑肿瘤（J.Magn.Magn.Mater，2005,293,404-410）；D.J.Lee等设计合成了由PLGA-mPEG，PLGA-Ce6和四氧化三铁纳米颗粒组成的多功能纳米粒子，用于肿瘤的荧光成像和光动力治疗（Int.J.Pharm，2012,434,257-263）；Y.Sun等制备了一种具有良好生物相容性的装载有光敏剂的磁性壳聚糖纳米颗粒，体内外实验表明该纳米药物载体具有良好的靶向性和优越的生物活性（Nanotechnology,2009,20,135102-135109）。但由现有技术制备出来的多功能纳米颗粒没有良好的功能可控性（所述功能可控性是指：可根据实际需要更换不同功能基团，如荧光试剂、靶向基团、药物分子等，实现肿瘤诊断和治疗的同步实施）。因此，设计及制备具有良好的功能可控性的多功能纳米颗粒，是本发明需要解决的技术问题。

发明内容

本发明的一个目的在于，提供一种良好的功能可控性的集肿瘤靶向、影像和光动力治疗于一体的多功能磁性纳米颗粒。

所述多功能磁性纳米颗粒具有核-壳结构，其核为可用医用的纳米磁性颗粒，其壳为负载光动力药物的具有介孔结构的纳米二氧化硅（SiO₂），且在所述的壳上还修饰有对人体或动物安全的亲水基团和靶向试剂；

所述多功能磁性纳米颗粒的比表面积（BET）为600m²/g～800m²/g。

本发明所述的多功能磁性纳米颗粒的结构示意图如图1.所示。

本发明另一个目的在于，提供一种制备上述多功能磁性纳米颗粒的方法，所述方法包括如下步骤：

（1）制备纳米磁性颗粒的步骤；

（2）采用反相微乳液法，将二氧化硅（SiO₂）包覆由步骤（1）制得的纳米磁性颗粒，得到核-壳结构的纳米颗粒的步骤；

（3）修饰由步骤（2）所得的核-壳结构的纳米颗粒，得到壳上具有对人体或动物安全的亲水基团和靶向试剂的核-壳结构的纳米颗粒的步骤；和

（4）采用浸渍法，将光动力药物负载于由步骤（3）得到的核-壳结构的纳米颗粒，得到目标物（本发明所述多功能磁性纳米颗粒）的步骤。

附图说明

图1.为本发明提供的多功能磁性纳米颗粒的结构示意图；

图2.由实施例1制备的多功能磁性纳米颗粒的X射线衍射图谱。

图3.由实施例1制备的多功能磁性纳米颗粒的透射电镜照片，

其中，a—四氧化三铁磁性纳米颗粒，b—多功能磁性纳米颗粒。

图4.由实施例1制备的多功能磁性纳米颗粒的粒径分布图，

其中，a—四氧化三铁磁性纳米颗粒，b—多功能磁性纳米探针。

图5.由实施例1制备的多功能磁性纳米颗粒的比表面积分析图。

图6.由实施例1制备的多功能磁性纳米颗粒的紫外可见吸收光谱图，

其中，a—亚甲基蓝（MB）化合物，b—复合磁性纳米颗粒，c—负载MB的复合磁性纳米颗粒。

图7由实施例1制备的多功能磁性纳米颗粒的荧光发射光谱图。

图8由实施例1制备的多功能磁性纳米颗粒的体外释放曲线（在pH=7.4浓度为0.02M缓冲溶液中）。

图9亚甲基蓝和由实施例1制备的多功能磁性纳米颗粒分别对细胞NIH3T3（a）和细胞MCF-7（b）的毒性柱形图。

图10由实施例1制备的多功能磁性纳米颗粒对细胞NIH3T3、HeLa和SKOV3共同孵育3小时的激光共聚焦显微镜照片。

图11在由实施例1制备的多功能磁性纳米颗粒存在，650nm、5mW/cm²的激发光源照射下DPBF的紫外-可见吸收光谱（a），以照射时间作为函数，DPBF的衰变吸收曲线（b），

其中，A—乙腈中DPBF与亚甲基蓝溶液，B—乙腈中DPBF与Fe₃O₄mSiO₂(MB)-FA多功能磁性纳米颗粒。

图12癌细胞HeLa（a）、SKOV3（b）在不同浓度的由实施例1制备的多功能磁性纳米颗粒存在及650nm光照射条件下的生存曲线。

具体实施方式

本发明对所用纳米磁性颗粒并无特殊要求，现有的、可用医用的纳米磁性颗粒均适合本发明（粒径最好小于200nm）。在本发明一个优选的技术方案中，构成本发明所述的多功能磁性纳米颗粒的核为四氧化三铁（Fe₃O₄）颗粒。

同样，本发明对所负载的光动力药物并无特别要求，现有的、且可通过浸渍法负载的光动力药物均适合本发明。因此，在本发明另一个优选的技术方案中，负载于所述多功能磁性纳米颗粒的光动力药物可选自：亚甲基蓝、四羧基铝酞菁、血卟啉单甲醚或5-氨基乙酰丙酸中的一种或二种以上混合物（含二种）。

在本发明又一个优选技术方案中，采用液相回流法合成Fe₃O₄磁性纳米颗粒，回流温度为60℃～80℃。

在本发明又一个优选技术方案中，在制备壳层（具有介孔结构的SiO₂）时，所用原料为正硅酸酯（如：正硅酸甲酯或正硅酸乙酯等）；所用模板剂（或称为表面活性剂）为至少含有一个长碳链（碳原子数大于八）的脂肪族季铵盐，本发明推荐使用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）。

在本发明又一个优选技术方案中，使用聚乙二醇硅氧烷对壳层（介孔二氧化硅层）进行修饰（即引入亲水基团），使所述的磁性纳米颗粒具有良好的生物相容性，能稳定的分散于水、磷酸缓冲溶液（PBS）等溶液中。

在本发明又一个优选技术方案中，在所述多功能磁性纳米颗粒的壳层上所引入的靶向试剂为叶酸靶向性试剂。在引入叶酸靶向性试剂时，所用的硅烷偶联剂是含氨基的硅氧烷，如（但不限于）：3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-氨丙基三甲氧基硅烷、N-2-氨乙基-3-氨丙基三乙氧基硅烷或/和3-氨丙基甲基二乙氧基硅烷等。

此外，本发明所提供的多功能磁性纳米颗粒可以单独使用，也可以与在药理上可以接受的稀释剂、缓冲液和/或其它助剂组合使用。用于MRI、荧光成像、靶向热疗和靶向光动力学治疗等领域，使得肿瘤诊断和治疗实现同步实施。

与传统的包埋方式相比，本发明解决了包封率低，包埋后壳层会影响光动力药物对光的吸收的缺陷，可有效的提高治疗效果。

此外，本发明提供的多功能磁性纳米颗粒，通过叶酸的靶向作用，在无磁场作用下也能将药物输送至肿瘤部位，再利用光动力药物在激光照射下发射荧光并产生单线态氧与病灶作用的特性，可实现肿瘤的同步诊断和治疗。

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

实施例1

多功能磁性纳米探针的制备

（1）Fe₃O₄磁性纳米颗粒的制备

将0.360g(1.33×10^-3mol)FeCl₃·6H₂O，0.133g(6.69×10^-4mol)FeCl₂·4H₂O和1.621g(5.32×10^-3mol)油酸钠依次加入到已有4mL乙醇，3mL双蒸水，7mL甲苯混合液的25mL圆底烧瓶中。该混合物在氮气气氛下磁力搅拌，74℃回流4h。回流结束后，烧瓶从油浴中移出冷却至室温，然后加入乙醇沉淀产物。离心分离后得到磁颗粒，再将得到的磁颗粒重新分散到正己烷中，重复上述步骤2-3次，终产物重新分散于三氯甲烷中，配制成Fe₃O₄/CHCl₃溶液（10mg/mL）。

（2）Fe₃O₄mSiO₂纳米粒子的制备

将1mL Fe₃O₄/CHCl₃溶液加入到10mL含有100mg CTAB水溶液中，40℃下强烈搅拌30min，形成褐色的水包油微乳液，将该混合液加热到60℃后陈化约30min，蒸发掉CHCl₃，形成透明的褐色的Fe₃O₄/CTAB溶液。所得溶液用0.45μm滤膜过滤后，加入到含有90mL水的250mL三口烧瓶中，40℃下加热搅拌30min。随后，2mL氨水、3mL乙酸乙酯和0.2mL正硅酸乙酯（TEOS）依次加入反应液中，继续搅拌4h。产物Fe₃O₄mSiO₂纳米粒子用乙醇洗涤3次，除去未反应物，再重新分散在20mL乙醇中。除去CTAB模板的方法：Fe₃O₄mSiO₂(MB)-PEG加入到50mL含有0.3g NH₄NO₃的乙醇溶液中，60℃搅拌2h，该过程重复两次。终产物置于透析袋中透析48h，冷冻干燥。

（3）Fe₃O₄mSiO₂纳米粒子壳层的修饰

（3a）PEG修饰的Fe₃O₄mSiO₂纳米粒子的制备

将50μL PEG-silican加入到上述20mL Fe₃O₄mSiO₂的乙醇分散液中，室温反应2h。产物离心洗涤后，超声分散于30mL无水乙醇中。

（3b）Fe₃O₄mSiO₂-NH₂纳米粒子的制备

向30mL已制得的Fe₃O₄mSiO₂-PEG纳米粒子的乙醇分散液中加入50μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），室温磁力搅拌反应2h，离心分离，乙醇洗涤三次除去未反应物，得到Fe₃O₄mSiO₂-NH₂纳米粒子，室温真空干燥。

（3c）叶酸修饰的Fe₃O₄mSiO₂-NH₂纳米粒子的制备

1.7mg叶酸（FA）溶解于9mL二甲基亚砜（DMSO）中，加入1.5mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）和2.2mg N-羟基丁二酰亚胺（NHS），室温反应30min。随后，将15mg Fe₃O₄mSiO₂-NH₂样品溶解于1mL的DMSO中，与上述叶酸活性酯混合。混合物于室温避光缓慢搅拌1.5h。产物高速离心分离后，用去离子水洗涤3-4次，室温真空干燥。

（4）负载亚甲基蓝的Fe₃O₄mSiO₂-FA纳米粒子的制备

称取10mg Fe₃O₄mSiO₂-FA纳米颗粒，超声分散于5mL MB水溶液中（6μg/mL），室温避光反应24h后离心分离，产物用去离子水洗涤，直至上清液无紫外吸收。保留所有上清液，用于测定材料的包封率和负载量。

经计算得，其包封率为85.07％，负载量为87.92％，说明材料较好的满足载药的需要，为制备抗肿瘤多功能磁性纳米探针奠定了基础。

经透射电子显微镜观察，制备得到的油酸钠包覆的Fe₃O₄单分散性良好，粒径在5nm左右，经过一系列包覆和修饰后，粒径增大到75nm左右，且可以看到明显的介孔结构（参见附图3）。X射线衍射图谱、粒径分布图、比表面积分析图谱、紫外可见吸收光谱图和荧光发射光谱图，分别见附图2至附图7；不同表面修饰的Fe₃O₄样品的磁学参数如图表1。

表1

实施例2

负载亚甲基蓝的多功能磁性纳米探针的体外释放

将5mL多功能磁性纳米探针的水溶液，装入截留分子量为8000-14000的透析袋中，然后将透析袋放入装含有100mL pH=7.40.02M的PBS溶液的烧杯中，烧杯用保鲜膜封口。将烧杯置于摇床里，设定摇床速度为100rpm。在37℃下进行药物释放实验。每隔0.5小时或1小时取出2mL释放介质，并迅速补加2mL新鲜介质。72小时后用紫外-可见分光光度仪在664nm处测定释放介质的MB浓度。根据标准曲线换算释放出的药物量，并算出药物释放率。由得到的曲线（附图8）可知，前12h的药物释放速度较快，大部分的药物释放行为发生在这个阶段。超过24小时后，释药过程比较持续而稳定，释药量逐渐达到平衡，直至72h后，药物释放总量基本保持在30％左右。这一结果保证了较多药物能达到靶向部位，避免了靶向过程中药物的损失。

实施例3

多功能磁性纳米（颗粒）探针的细胞毒性评价

取NIH3T3细胞（小鼠胚胎成纤维细胞）和MCF-7细胞（人乳腺癌细胞）用MTT（噻唑蓝）法评价游离的亚甲基蓝化合物和多功能磁性纳米探针的细胞毒性。实验结果如附图9所示，可以看出随着MB浓度的增大，细胞存活率降低，且最低达到15％左右，说明游离的MB对细胞毒性较大，不适宜直接用作药物；而MB负载的磁性纳米颗粒的毒性相对小许多，与细胞作用24h后细胞存活率在85％以上，作用时间延长至48h时细胞存活率仍高于82％，对细胞暗毒性较小。此结果说明，MB负载到Fe₃O₄mSiO₂-FA磁性纳米颗粒上以后能较大的降低MB的暗毒性，如果作为一种载药材料，能在达到靶向部位的过程中减少对正常细胞和组织的伤害（具体参见图9）。

实施例4

多功能磁性纳米探针的体外细胞摄取实验

制备得到的多功能磁性纳米探针具有肿瘤靶向、荧光成像的功能，我们使用激光共聚焦显微镜评价该样品对叶酸受体过度表达的SKOV3、HeLa和叶酸受体缺乏的NIH3T3细胞的体外细胞摄取能力。

取SKOV3、HeLa和NIH3T3细胞种入带有盖玻片的6孔板。培养24小时贴壁后弃去原培养基，加入培养液分散的多功能磁性纳米探针，浓度200μg/mL，培养3h后，弃去含有纳米颗粒的培养液，PBS溶液洗涤，4％多聚甲醛，1％曲拉通（Triton）X-100，1μg/mL4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色细胞核。将盖玻片取出密封后应用激光共聚焦显微镜进行观察，激发波长为405、640nm，发射通道选择为DAPI和630-740nm发射波长。

激光共聚焦显微镜观察显示多功能磁性纳米探针能够选择性的被SKOV3、HeLa和NIH3T3细胞摄取。如附图10所示，激光照射下DAPI染色的细胞核呈蓝色，MB呈红色，HeLa细胞和SKOV3细胞在激光共聚焦显微镜下显示了强烈的红色荧光，这是多功能磁性纳米探针通过细胞的内吞作用进入细胞的典型特征。但当多功能磁性纳米探针在同样的条件下与NIH3T3细胞共同孵育后，由于NIH3T3细胞表面缺乏叶酸受体，从附图10B的MB通道中没有发现MB发出的红色荧光。

实施例5

多功能磁性纳米探针单线态氧产率的测定

用1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）作探针，检测单线态氧的产率。DPBF可与¹O₂反应造成DPBF在410nm左右的吸光度的减少。实验过程如下，将15μL5.5mM的DPBF加入到2mL乙腈中，再加入适当浓度的样品，DPBF与MB溶液分散在乙腈中作标准对照。5mW/cm²的光照下，用650nm的激发光源照射，用紫外-可见分光光度计记录410nm吸收值的变化，每10s记录一次。

与DPBF共同孵育后的Fe₃O₄mSiO₂(MB)-FA在光照不同时间后的吸收光谱如图11(a)所示。随着光照时间的延长，DPBF在410nm处的吸光度逐渐下降，说明有¹O₂不断产生。图11(b)为DPBF和亚甲基蓝在乙腈中分散及DPBF与Fe₃O₄mSiO₂-FA-MB在乙腈中分散的吸收值对时间的关系图。根据报道的单线态氧产率的计算方法（Langmuir,2007,23(15),8194-8199）估算得到Fe₃O₄mSiO₂(MB)-FA在乙腈中释放的单线态氧为0.05。

实施例6

多功能磁性纳米探针对肿瘤细胞的光杀伤效果

将SKOV3和HeLa细胞与多功能磁性纳米探针共同种植在96孔培养板上，孵育24小时后，采用650nm激光垂直照射培养板的小孔，照射后再培养24小时，采用MTT法检测细胞存活率。

在激光能量密度为16.8J/cm²，Fe₃O₄mSiO₂(MB)-FA多功能磁性纳米颗粒与细胞的作用时间为24h时，MTT检测结果显示HeLa细胞和SKOV3细胞经PDT处理后的细胞存活率与对照组比较有显著差异，其存活率随着磁性纳米颗粒浓度的增加而降低（具体参见图12），说明在与表面有叶酸受体的细胞作用时，磁性纳米颗粒的浓度越大进入细胞的磁性纳米颗粒就越多，在相同强度光照射相同时间后，产生的¹O₂就越多，对癌细胞的光杀伤作用就越明显。

Claims

1.一种具有良好的功能可控性的集肿瘤靶向、影像和光动力治疗于一体的多功能磁性纳米颗粒，其特征在于，所述多功能磁性纳米颗粒具有核-壳结构，其核为可用医用的纳米磁性颗粒，其壳为负载光动力药物的具有介孔结构的纳米二氧化硅，且在所述的壳上还修饰有对人体或动物安全的亲水基团和靶向试剂；所述多功能磁性纳米颗粒的比表面积（BET）为600m²/g～800m²/g。

2.如权利要求1所述的多功能磁性纳米颗粒，其特征在于，其中所述可用医用的纳米磁性颗粒为粒径小于200nm的四氧化三铁颗粒。

3.如权利要求1所述的多功能磁性纳米颗粒，其特征在于，其中所述光动力药物选自：亚甲基蓝、四羧基铝酞菁、血卟啉单甲醚或5-氨基乙酰丙酸中的一种或二种以上混合物。

4.如权利要求1所述的多功能磁性纳米颗粒，其特征在于，其中所述靶向试剂为叶酸。

5.一种制备如权利要求1～4中任意一项所述的多功能磁性纳米颗粒的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）制备纳米磁性颗粒的步骤；

（2）采用反相微乳液法，将二氧化硅包覆由步骤（1）制得的纳米磁性颗粒，得到核-壳结构的纳米颗粒的步骤；

（4）采用浸渍法，将光动力药物负载于由步骤（3）得到的核-壳结构的纳米颗粒，得到目标物的步骤。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，采用液相回流法合成Fe₃O₄磁性纳米颗粒，回流温度为60℃～80℃。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所用原料为正硅酸酯；所用模板剂为至少含有一个碳原子数大于八的脂肪族季铵盐。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，其中所述正硅酸酯为正硅酸乙酯，所述脂肪族季铵盐为十六烷基三甲基溴化铵。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，使用聚乙二醇硅氧烷对由步骤（2）所得的核-壳结构的纳米颗粒进行修饰。

10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所引入的靶向试剂为叶酸靶向性试剂，在引入叶酸靶向性试剂时，所用的硅烷偶联剂是含氨基的硅氧烷。