CN104437440A - 一种多氨基硅包磁性纳米粒子的制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多氨基硅包磁性纳米粒子的制备方法与应用，以磁性纳米粒子为核心，用反相微乳液法对磁性核心进行包硅与氨基化修饰，在氨水催化作用下，水解TEOS和APTES，包被硅层的同时表面形成粗糙的网状结构，此结构表面携带大量的氨基基团，即为多氨基硅包磁性纳米粒子，可以用于非特异性以及特异性的DNA分离。本发明制备的多氨基硅包磁性纳米粒子原料成本低，制备方法操作简易、时间短，产物无毒，环境友好；与传统的先合成硅包磁性纳米粒子再氨基化制备的氨基硅包磁性纳米粒子相比，表面氨基数量极大提高，对DNA的分离率也大为提高。

Description

一种多氨基硅包磁性纳米粒子的制备与应用
技术领域
本发明属于功能材料与检测分析领域，具体地涉及一种多氨基硅包磁性纳米粒子的制备方法与生物应用。
背景技术
磁性纳米粒子因为独特的超顺磁性而广泛的应用于生物分离领域，例如，磁性纳米粒子标记抗体制备免疫磁珠分离目标细胞，标记小分子或者大分子物质(如甘露糖、万古霉素、适配体等)分离致病菌，标记与目标序列互补的寡核苷酸分离目标核酸序列，以及硅包磁性纳米粒子分离纯化基因组DNA等。
DNA是生物体稳定的遗传物质，分子生物学技术可以准确可靠地通过特异性的靶标序列检测生物有机体(如致病菌、病毒、转基因食品等)的存在，但是有些检测目标物的残留限度非常之低，所以检测条件非常苛刻。例如基于分子杂交的目标核酸序列分离，如果目标残留片段非常有限，那么只有捕获序列大量存在的情况下，才可能捕获到痕量的目标序列。因此，磁性纳米粒子表面功能化基团的多少也直接关系到最终的检测灵敏度。在本发明中，我们制备了一种多氨基的硅包磁性纳米粒子，和普通的氨基化硅包磁性纳米粒子对比，表面带有粗糙的网状结构，携带有大量的氨基基团，不管是用这种多氨基硅包磁性纳米粒子直接非特异的吸附基因组DNA还是将目标序列进行寡核苷酸修饰通过杂交反应特异性的分离目标DNA序列，分离率都得到很大的提高，此外，氨基化修饰的纳米粒子也可以轻易地进行羧基化等改性，可以广泛应用于各种生物分离当中。在生物分离方面具有巨大的优势和潜力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对一些生物检测样品检测要求苛刻，增加磁性分离的分离能力，开发一种表面多氨基的硅包磁性纳米粒子，还提供了上述磁性纳米粒子非特异性和特异性的分离目标DNA的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了制备多氨基硅包磁性纳米粒子的方法，包括以下步骤：
1)合成磁性纳米粒子；
2)制备反相微乳液体系；
3)硅包与氨基化修饰：将磁性纳米粒子加入反相微乳液体系，在氨水催化作用下，水解正硅酸四乙酯(TEOS)和3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，包被硅层的同时表面形成粗糙的网状结构，此结构表面携带大量的氨基基团，即为多氨基硅包磁性纳米粒子。
上述方法制备的多氨基硅包磁性纳米粒子可以用于非特异性以及特异性的DNA分离。
步骤1)中合成的磁性纳米粒子可以是容易制备的铁氧体磁性纳米粒子，如Fe3O4、γ-Fe2O3，也可以是Fe-Co、Fe-Ni、Co-Ni等合金磁性纳米粒子，甚至是复杂的磁性复合物纳米粒子。但是，无论哪种磁性纳米粒子作为核心，均要求粒径均一，单分散性好，这样最终得到的产品才具有较高性能：较好的封闭磁性核心，具有较大的表面积并携带有大量的氨基基团。
当所述磁性纳米粒子为Fe3O4时，可采用简易的共沉淀法合成磁性纳米粒子，具体步骤如下：
将摩尔比2:1的Fe3+和Fe2+相互混合，在氮气氛围下剧烈搅拌，然后加热到60-90℃后快速注入氨水调节pH为9-12，继续反应20-30min，室温冷却，磁性收集Fe3O4磁性纳米粒子并用乙醇和水洗涤。
优选地，为了使Fe3O4能够具有更好的单分散性，需要对其进行柠檬酸钠处理，具体步骤为，洗涤之后加入柠檬酸钠溶液，超声20-40min后磁性收集纳米粒子，然后重新加入新鲜的柠檬酸钠溶液中搅拌3-12h，再次磁性收集Fe3O4之后再用乙醇和水洗涤，最后进行干燥；其中所述柠檬酸钠溶液的优选浓度为0.5mol/L。
步骤2)制备反相微乳液体系的具体方法为：将环己烷、正己醇、曲拉通X-100、水以14-16:3-4:3-4:1的体积比混合，搅拌辅以超声分散，将步骤1)中制备的磁性纳米粒子加入到混合液中，继续超声分散一段时间，然后搅拌3-12h，形成反相微乳液体系；
当所述磁性纳米粒子为Fe3O4时，优选以0.15-1.2g/L的浓度加入混合液中。
步骤3)硅包与氨基化修饰的具体操作方法为：向步骤2)形成的反相微乳液体系中加入氨水，搅拌20-40min后加入TEOS，搅拌反应3-24h后，加入APTES，继续反应3-24h，加入丙酮破乳，然后用乙醇和水洗涤多次，干燥待用。
优选地，上述硅包与氨基化修饰操作方法中加入氨水的体积与反相微乳液体系的体积比为1:100-600；加入TEOS的体积与反相微乳液体系的体积比为1:60-200；加入APTES的体积与反相微乳液体系的体积比为1:100-1800。
本发明还提供一种非特异性吸附目标生物体基因组DNA的方法，其步骤为：制备含有待检测DNA的缓冲体系，将多氨基硅包磁性纳米粒子加入到缓冲体系中，90-100℃下振荡混合10-120min，然后加入脱脂奶粉，在60℃下封闭10-30min，磁性分离，获得非特异性吸附有目标生物体基因组DNA的磁性分离物，磁性分离物用1×PCR缓冲液洗涤后可直接加入PCR体系中进行分析。
优选地，所述含有待检测DNA的缓冲体系使用的缓冲液为pH＝9.0的TE缓冲液。
优选地，加入脱脂奶粉的最终浓度为1％(w/v)。
当加入的多氨基硅包磁性纳米粒子为Fe3O4磁性纳米粒子时优选的加入量为40-60μg/ml。
本发明还提供一种特异性杂交分离目标DNA序列的方法，制备的多氨基磁性纳米粒子可以修饰寡核苷酸作为磁性探针通过杂交反应特异性的分离目标DNA序列，其步骤为：
1)将多氨基硅包磁性纳米粒子通过偶联剂戊二醛与氨基化修饰并具有多聚T连接臂的寡核苷酸序列结合，结合物用脱脂奶粉溶液进行封闭，经洗涤后，磁性收集磁性分离探针；
2)进行分离时，将磁性分离探针与目标分离序列在40-60℃混合30-120min(如目标分离序列为双链DNA需要预先热变性)，然后磁性分离。
以上步骤分离的产物用1×PCR缓冲液洗涤后可直接加入PCR体系进行扩增。
优选地，步骤1)中将多氨基硅包磁性纳米粒子通过偶联剂戊二醛与氨基化修饰并具有多聚T连接臂的寡核苷酸序列结合的具体操作为：将多氨基硅包磁性纳米粒子用TE缓冲液洗涤多次，然后将多氨基硅包磁性纳米粒子分散于含有戊二醛的TE缓冲液中，室温振荡2-4小时之后，用TE缓冲液洗去游离的戊二醛，然后分散到TE缓冲液中，加入氨基化修饰并具有多聚T连接臂的寡核苷酸，混合反应4-6小时。其中使用的TE缓冲液的pH优选为8.0，含有戊二醛的TE缓冲液中戊二醛的浓度优选为5％(w/v)。
优选地，步骤1)中用脱脂奶粉进行封闭的脱脂奶粉的终浓度为1-10％(w/v)，温度为60℃，时间为10-30min。
优选地，步骤1)中收集得的磁性分离探针可分散于含有1-10％(w/v)BSA和0.05-0.15％(w/v)叠氮钠的水溶液中保存。
优选地，步骤2)中磁性分离探针与目标分离序列混合的溶液体系为3-10×SSC溶液。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明制备的多氨基硅包磁性纳米粒子原料均为常用的化工产品，价格低廉。
2、本发明的制备方法操作简易，制备条件简单，产物无毒，环境友好。
3、本发明相比传统的先合成硅包磁性纳米粒子再氨基化的方法相比，时间减少，条件更为简单，同样很好的封闭磁性核心，更为优越的是表面氨基数量极大提高。
4、本发明制备的多氨基硅包磁性纳米粒子用于DNA分离，分离率与普通氨基磁性纳米粒子为基础的分离相比大为提高。
附图说明
图1为本发明制备的多氨基硅包磁性纳米粒子和传统的先合成硅包磁性纳米粒子然后再氨基化的方法合成的氨基硅包磁性纳米粒子氨基数目比较(对硝基苯甲醛分光光度法测氨基)。
图2为本发明制备的多氨基硅包磁性纳米粒子的TEM图片。
图3为普通氨基硅包磁性纳米粒子的TEM图片。
图4为多氨基硅包磁性纳米粒子与普通氨基化硅包纳米粒子对人工添加的沙门氏菌基因组DNA分离后的RT-qPCR对比结果(其中原溶液为用2μl原溶液直接作为模板进行RT-qPCR)。
图5为多氨基硅包磁性纳米粒子与普通氨基化硅包磁性纳米粒子分别标记寡核苷酸序列制备得到分离探针MP1与MP2特异性分离目标寡核苷酸序列后磁性分离物的RT-qPCR对比结果。
具体实施方式
以下结合附图通过实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：多氨基硅包磁性纳米粒子与普通氨基化硅包磁性纳米粒子表面氨基数量比较
本发明的多氨基硅包磁性纳米粒子是将磁性纳米粒子加入反相微乳液体系中同时完成硅包被和氨基化修饰的，具体步骤如下：1)单分散的Fe3O4磁性纳米粒子合成：FeCl3·6H2O(0.0216mol)与FeSO4·7H2O(0.0108mol)混合于100ml去离子水中，氮气保护，强力搅拌，加热到85℃后一次性快速注入7.5ml氨水，继续反应25min，室温冷却，磁性收集Fe3O4磁性纳米粒子，反复用乙醇和水洗涤，然后将磁性收集物分散于200ml 0.5mol/L柠檬酸钠溶液中，超声30min，然后磁性收集纳米粒子，重新加入新鲜的200ml 0.5mol/L柠檬酸钠溶液，室温搅拌5h。最后用乙醇和水反复洗涤后真空干燥；2)反相微乳液体系制备：将112.5ml环己烷、26.5ml曲拉通X-100、27ml环己烷、7.5ml去离子水混合，搅拌辅以超声分散，将60mg步骤1)合成的Fe3O4磁性纳米粒子加入到反相微乳液体系中，继续超声分散30min，然后搅拌3h以上形成反相微乳液体系；3)硅包与氨基化修饰：然后加入0.9ml氨水，搅拌30min后加入1.5ml的TEOS，搅拌反应12h后加入0.5ml的APTES，继续搅拌12h，加入丙酮破乳，最后用乙醇和水反复洗涤，干燥待用。
普通的氨基化磁性纳米粒子是在硅包磁性纳米粒子的表面进行氨基化修饰的，具体步骤如下：1)单分散的Fe3O4磁性纳米粒子合成：方案同上。2)反相微乳液体系制备：将112.5ml环己烷、26.5ml曲拉通X-100、27ml环己烷、7.5ml去离子水混合，搅拌辅以超声分散，将60mg步骤1)合成的Fe3O4磁性纳米粒子加入到反相微乳液体系中，继续超声分散30min，搅拌3h以上形成反相微乳液体系；3)硅包磁性纳米粒子合成：然后加入0.9ml氨水，搅拌30min后加入1.5ml的TEOS，搅拌反应24h，丙酮破乳，然后用乙醇和水反复洗涤多次，干燥；4)氨基化修饰：将步骤3)中得到的干燥无水的硅包磁性纳米粒子加入到50ml甲苯中，超声分散，然后加入2ml APTES，80℃通氮气回流12h，然后用乙醇和水反复洗涤，干燥待用。
用对硝基苯甲醛分光光度法检测纳米粒子表面携带的氨基，步骤如下：5mg表面携带氨基的硅包磁性纳米粒子反复用偶联溶液(移取1.6ml的冰乙酸，无水甲醇定容至200ml)进行洗涤，然后加入1ml 1％的对硝基苯甲醛偶联试剂(溶剂为偶联溶液)，混合3h后用偶联溶液反复洗涤，然后加入1ml水解液(含有0.4ml冰醋酸的300ml 50％甲醇溶液)混合反应1h，14000rpm离心10min，然后吸取900μl上清液测定267nm处的吸收值，并用不同浓度的对硝基甲醛溶液做标准曲线，计算样品的具体氨基含量。结果如图1所示，本发明制备的多氨基硅包磁性纳米粒子携带氨基数量远大于普通氨基化硅包磁性纳米粒子。图2中的TEM图片显示本发明制备的多氨基硅包磁性纳米粒子表面形成粗糙的网状结构，这是大量的TEOS与APTES分子互相交联而形成的，所以携带大量的氨基基团，而图3中普通的氨基化硅包磁性纳米粒子表面因为只有单分子层的APTES，所以和硅包磁性纳米粒子一样表面仍然光滑。此外，本发明所制备的多氨基磁性纳米粒子不但表面携带有大量的氨基基团，而且制备时间缩短，制备过程更加简单。
实施例2：多氨基硅包磁性纳米粒子与普通氨基化硅包磁性纳米粒子非特异性分离目标基因组DNA比较
为了证明多氨基硅包磁性纳米粒子具有更好的分离性能，用多氨基硅包磁性纳米粒子与普通氨基化硅包磁性纳米粒子进行分离比较，分离对象为含有沙门氏菌基因组DNA的脱脂奶粉溶液。具体步骤如下：在2ml 5％的脱脂奶粉(溶液为pH＝9.0的TE缓冲液)中人工添加0.5ng沙门氏菌基因组DNA，100μg携带氨基的硅包磁性纳米粒子添加其中，95℃下混合10min，磁性分离，TE缓冲液洗涤一次，吸附了DNA的磁性混合物直接添加到RT-qPCR体系当中。
RT-qPCR引物正向序列QS95-F：TCAATAATCGCAGTATCCAGTAATG；反向序列QS95-R：GAAGAGATTTTAGCGCAGTGTAG。25μl的PCR体系包括分别5pmol的上下游引物，以及12.5μl的Green PCR master mix(TaKaRa)。PCR循环如下：95℃预变性2min，然后包括95℃变性15s,60℃退火15s,72℃延伸20s三个步骤的循环40次。
图4为RT-qPCR结果，基于标准曲线计算多氨基的磁性纳米粒子分离率为60.0％而普通PCR的分离率为11.5％。显然，在非特异性吸附中，氨基数量越多的纳米粒子分离率越高，多氨基硅包磁性纳米粒子具有明显优势。
实施例3：多氨基硅包磁性纳米粒子与普通氨基化硅包磁性纳米粒子标记寡核苷酸分离特异性DNA序列比较
标记了寡核苷酸序列的磁性分离探针制备：2mg表面携带氨基的硅包磁性纳米粒子用TE缓冲液(pH＝8.0)反复洗涤，最后的磁性收集物分散于1ml的含有5％戊二醛的TE缓冲液中，室温振荡3h之后用TE缓冲液反复洗涤除去游离的戊二醛，然后分散到500μl的TE缓冲液中，添加200μl的10μmol/L寡核苷酸(5′-NH2-TTTTTTTTTTTTTTTATTCCGCCGTGTATCGTAATTGAGT-3′)溶液。混合物持续反应5h，然后洗涤，用5％脱脂奶粉溶液封闭30min后再次洗涤，最终的产物分散于2％BSA和0.1％的叠氮钠溶液中保存。
多氨基硅包磁性纳米粒子制备得到的磁性核酸分离探针(MP1)和普通氨基化硅包磁性纳米粒子制备得到的磁性分离探针(MP2)进行分离比较：取50μg磁性核酸分离探针加入到含有1pmol的人工合成的DNA单链(5′GAAGAGATTTTAGCGCAGTGTAGCGAACCCGCCAAATTGCGAAAATTACTCTGGCATTACTGGATACTGCGATTATTGATGTGGTTGTCCACTCAATTACGATACACGGCGGAAT3′)的6xSSC溶液当中，50℃下振荡混合30min，然后磁性分离并用TE缓冲液洗涤一次后磁性复合物直接添加到RT-qPCR体系当中进行扩增。
RT-qPCR引物正向序列QS95-F：TCAATAATCGCAGTATCCAGTAATG；反向序列QS95-R：GAAGAGATTTTAGCGCAGTGTAG。25μl的PCR体系包括分别5pmol的上下游引物，以及12.5μl的Green PCR master mix(TaKaRa)。PCR循环如下：95℃预变性2min，然后包括95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s这三个步骤的循环40次。
图5为RT-qPCR结果，多氨基的硅包磁性纳米粒子制备的磁性分离探针(MP1)分离得到的目标序列数目比普通氨基化硅包磁性纳米粒子制备的磁性分离探针(MP2)分离率高很多。也就是说，不论直接应用携带氨基的硅包磁性纳米粒子直接分离，还是将纳米粒子进行修饰后再进行分离，多氨基都具有明显的优势。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种多氨基硅包磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)合成磁性纳米粒子；
2)制备反相微乳液体系；
3)硅包与氨基化修饰：将磁性纳米粒子加入反相微乳液体系，在氨水催化作用下，水解TEOS和APTES，包被硅层的同时表面形成粗糙的网状结构，此结构表面携带大量的氨基基团，即为多氨基硅包磁性纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的多氨基硅包磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述磁性纳米粒子为铁氧体磁性纳米粒子、合金磁性纳米粒子或磁性复合物纳米粒子。
3.根据权利要求1所述的多氨基硅包磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述磁性纳米粒子是铁氧体磁性纳米粒子，且步骤1)的具体操作为：将摩尔比2:1的Fe3+和Fe2+相互混合，在氮气氛围下剧烈搅拌，然后加热到60-90℃后快速注入氨水调节pH为9-12，继续反应20-30min，室温冷却，磁性收集Fe3O4磁性纳米粒子并用乙醇和水洗涤，再用柠檬酸钠溶液超声处理20-40min，然后重新加入新鲜的柠檬酸钠溶液中搅拌3-12h，再次磁性收集Fe3O4之后再用乙醇和水洗涤，最后进行干燥。
4.根据权利要求1所述的多氨基硅包磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤2)制备反相微乳液体系的具体方法为：将环己烷、正己醇、曲拉通X-100、水以14-16:3-4:3-4:1的体积比混合，搅拌辅以超声分散，将步骤1)中制备的磁性纳米粒子加入到混合液中，继续超声分散一段时间，然后搅拌3-12h，形成反相微乳液体系。
5.根据权利要求1所述的多氨基硅包磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤3)硅包与氨基化修饰的具体操作方法为：向步骤2)形成的反相微乳液体系中加入氨水，搅拌20-40min后加入TEOS，搅拌反应3-24h后，加入APTES，继续反应3-24h，加入丙酮破乳，然后用乙醇和水洗涤多次，干燥待用。
6.根据权利要求6所述的多氨基硅包磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于，向步骤2)形成的反相微乳液体系中加入氨水的体积与反相微乳液体系的体积比为1:100-600；加入TEOS的体积与反相微乳液体系的体积比为1:60-200；加入APTES的体积与反相微乳液体系的体积比为1:100-1800。
7.根据权利要求1-6任一项所述的多氨基硅包磁性纳米粒子的制备方法制备的多氨基硅包磁性纳米粒子。
8.如权利要求7所述的多氨基硅包磁性纳米粒子在非特异性或特异性的DNA分离中的应用。
9.一种利用权利要求7所述的多氨基硅包磁性纳米粒子非特异性吸附目标生物体基因组DNA的方法，其特征在于，包括步骤：制备含有待检测DNA的缓冲体系，将多氨基硅包磁性纳米粒子加入到缓冲体系中，90-100℃下振荡混合，然后加入脱脂奶粉溶液，在60℃下封闭，磁性分离，获得非特异性吸附有目标生物体基因组DNA的磁性分离物。
10.一种利用权利要求7所述的多氨基硅包磁性纳米粒子特异性杂交分离目标DNA序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将多氨基硅包磁性纳米粒子通过偶联剂戊二醛与氨基化修饰并具有多聚T连接臂的寡核苷酸序列结合，结合物用脱脂奶粉溶液进行封闭，经洗涤后，磁性收集磁性分离探针；
2)进行分离时，将磁性分离探针与目标分离序列在40-60℃混合30-120min，然后磁性分离。
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