CN107699562B - 乙肝共价闭合环状dna磁性捕获技术 - Google Patents

乙肝共价闭合环状dna磁性捕获技术 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乙肝共价闭合环状DNA磁性捕获技术。本发明制备HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球的方法，步骤如下：(1)采用化学共沉淀法制备Fe3O4纳米粒子；(2)采用反相乳液法制备硅壳磁性纳米颗粒；(3)对硅壳磁性纳米颗粒进行亲和素修饰；(4)偶联针对cccDNA特异序列的ssDNA探针。本发明还公开了前述方法制备得到的探针磁性纳米微球，以及应用该微球富集HBV cccDNA的方法。本发明方法制备的HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球，可以有效特异捕获HBV cccDNA，能够实现HBV cccDNA的高效快速富集分离的，分离方法简单，应用前景良好。

Description

乙肝共价闭合环状DNA磁性捕获技术
技术领域
本发明涉及一种富集分离乙肝共价闭合环状DNA的方法。
背景技术
慢性乙型肝炎是由于感染乙型肝炎病毒(HBV)引起的疾病，目前尚无特效药能够治愈。而HBV cccDNA是乙肝病毒持续感染、难以治愈的关键因素，通过检测HBV cccDNA可以了解HBV感染状态及传染性，评价药物治疗HBV的疗效，帮助了解机体清除HBV的程度，为临床医生判断何时停止抗病毒治疗及停止治疗后HBV是否会重新复制活跃导致乙肝复发提供一个客观指标，也是评价肝外组织是否被HBV感染以及在肝移植中评价移植肝脏是否被再感染的指标。
国内外学者已建立了许多检测HBV cccDNA的方法，如，Southern印迹杂交法、PCR法等等。但是由于分离富集得到较高纯度的ccc DNA非常难，导致检测的特异性和敏感度均不理想。影响ccc DNA富集的难度主要体现在以下两个方面：(1)体内与cccDNA序列同源性较高其他形的HBV DNA的干扰，比如成熟病毒颗粒中的松rcDNA；部分病毒颗粒中存在dslDNA及由前基因组RNA反转录形成的ss D NA。(2)细胞内ccc DNA的含量较少，获取高纯度的ccc DNA难度较大。
因此，有效分离富集得到高纯度的ccc DNA极为重要。
磁性分离技术是以纳米或微米级的磁性微粒为载体，利用结合于磁性微粒表面功能化基团特异亲和特性，在外加磁场的定向控制下，通过亲和吸附、清洗、解吸操作，从复杂的生物体系中一步分离到目标物分子。
它具有磁性分离简单方便、亲和吸附高特异性及高敏感性等众多优点。国内外众多学者都利用超顺磁性纳米粒子的小尺寸效应和生物素与亲和素的亲和作用，构建了具超顺磁性的DNA纳米富集技术来特异性地结合目标单链寡聚核苷酸，从而可实现对互补单链核苷酸片段的高效快速富集分离的方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种采用磁性纳米技术分离富集HBV cccDNA的方法以及HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球。
本发明制备HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球的方法，其特征在于：
(1)采用化学共沉淀法制备Fe3O4纳米粒子；
(2)采用反相乳液法制备硅壳磁性纳米颗粒；
(3)对硅壳磁性纳米颗粒进行亲和素修饰；
(4)偶联针对cccDNA特异序列的ssDNA探针。
所述步骤(1)的方法如下：将1.0mol/L FeCl3溶液与2.0mol/L FeCl2溶液混合，FeCl3溶液与FeCl2溶液的体积比为4:1，加入FeCl2溶液25倍体积的浓度为0.7mol/L的氨水溶液，离心，得黑褐色沉淀，用FeCl2溶液15倍体积的浓度为2.0mol/L的高氯酸溶液分散，水洗至中性，干燥，得Fe3O4纳米粒子。
所述步骤(2)的方法如下：将Triton X-100、正己醇和环己烷按体积比1：1：4混合均匀，加入Fe3O4纳米粒子，搅拌均匀，然后加入正硅酸乙酯和氨水，持续搅拌24h，反应结束后，用丙酮破坏乳化，收集颗粒，得硅壳磁性纳米颗粒。
所述步骤(3)的方法如下：将2.5mg/ml的链霉亲和素溶液加入到硅壳磁性纳米颗粒中，在4℃下恒温振荡培育24h，用PBS缓冲液洗涤颗粒3次，再加入2％的戊二醛溶液在室温下浸泡，得磁性纳米悬浊液。
所述步骤(4)的方法如下：
1)纳米预处理：取磁性纳米颗粒混悬液，离心，弃上清，加入结合缓冲液，制成浓度为1μg/μl的磁性微粒悬液，其中，结合缓冲液是Tris-HCl和NaCl的混合溶液，Tris-HCl的浓度为20mmol/L，NaCl的浓度为150mmol/L；
2)纳米预处理：探针预处理：将合成探针配制成浓度为10μM的探针溶液；
3)偶联：在步骤1)制得到的磁性微粒悬液中加入15μl步骤2)制得的探针溶液，在37℃、150rpm/min条件下反应2h；
4)封闭、清洗，即可。
所述步骤4)中的探针溶液包含4条探针，4条探针的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1～4所示，4条探针的5’端均标记有生物素。
本发明还制备得到了前述方法制备得到的HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球。
本发明富集分离HBV cccDNA的方法，步骤如下：取待检样品，加入权利要求7所述HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球，混匀，在外磁场环境中作用20min，去除上清液，通过分子变性解离，即可得到富集分离的cccDNA。
本发明方法制备的HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球，可以有效特异捕获HBV cccDNA，能够实现HBV cccDNA的高效快速富集分离的，分离方法简单，应用前景良好。下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
附图说明
图1磁性纳米微球分离法HBVcccDNA步骤原理图，A为Fe3O4纳米粒子，b为SiO2纳米粒子，c为Fe3O4纳米粒子@SiO2复合纳米粒子，d为亲和素，e为亲和素化的Fe3O4纳米粒子@SiO2复合纳米粒子，f为生物素化的cccDNA互补捕获DNA探针，g为Fe3O4@SiO2/亲和素-生物素/捕获DNA探针，h为细胞株中分离出的HBVcccDNA分子，i为培养稳定复制的HBV基因组的细胞株，j为Fe3O4@SiO2/亲和素-生物素/捕获DNA探针/HBVcccDNA，k为磁性分离装置。
图2本发明HBV cccDNA特异性DNA分针探针磁性纳米微球分离的效果验证，其中，a为空白：不含cccDNA、b为捕捉分离前的样品液的cccDNA、c为捕捉分离后的样品液的cccDNA。
具体实施方式
实验例1本发明富集分离乙肝共价闭合环状DNA的方法
一、制备方法
制备工艺如图1所示：
1.HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球的制备
1.1化学共沉淀法制备Fe3O4纳米粒子：
将20ml FeCl3(1.0mol/L)与5ml FeCl2(2.0mol/L，在2.0mol/L的盐酸溶液中配制)溶液混合均匀加入到250ml 0.7mol/L的氨水溶液中，离心分离后所得的黑褐色沉淀用150ml 2.0mol/L的高氯酸溶液分散，用超纯水洗至中性，干燥，得到Fe3O4纳米粒子。
1.2反相乳液法制备硅壳磁性纳米颗粒：
将Triton X-100、正己醇和环己烷按体积比1：1：4混合均匀，得混合溶液，，取混合溶液50μL，加入浓度为5mmol/L的Fe3O4纳米粒子溶液20μL，搅拌均匀，然后加入正硅酸乙酯和氨水(1:1)(氨水的浓度为28％—30％)的混合液2mL，持续搅拌24h，反应结束后，用丙酮破坏乳化，在磁性环境下收集颗粒，得硅壳磁性纳米颗粒。
1.3复合纳米颗粒亲和素修饰
将2.5mg/ml的链霉亲和素溶液(用10mmol/L，pH＝7.0的PBS缓冲液配制)加入到5mg硅壳磁性纳米颗粒中，在4℃下恒温振荡培育(浸泡)24h，用PBS缓冲液洗涤颗粒3次。用2％的戊二醛溶液在室温下浸泡(将吸附在纳米颗粒表面的链霉亲和素加以固定)，得磁性纳米悬液。
1.4偶联针对cccDNA特异序列的ssDNA探针
设计4条探针，它们分别是：HBV-probe 1：5’ACT CTC AGC AAT GTC
AAC GAC CGA CC3’(26nt)、HBV-probe 2：5’CTT CGC TTC ACC TCT GCA CGT3’(21nt)、HBV-probe 3：5’TGT ACT AGG AGG CTG TAG GCA TAA ATT GGT CTG TT3’(35nt)、HBV-probe 4：5’AGG TTA ATG ATC TTT GTA CTA GGA GGC TGT AGG CAT AAA TTG GTC TGTT3’(49nt)；所有序列5’用生物素标记，交由生工生物工程(上海)股份公司合成和标记。
(1)纳米预处理：取磁性纳米颗粒混悬液(5mg/m L)，充分混匀后，用移液器取50μl(250μg)于2mL离心管中，磁性分离2min，弃上清(将离心管放置于磁性分离器上，待溶液完全清亮，让离心管仍处于磁性分离架上，用移液器从另一侧吸去上清，弃去)。然后加入200μl清洗缓冲液，用移液器轻轻吹打混匀微粒，磁性分离，弃上清。重复操作2次后再加入250μl结合缓冲液，用移液器轻轻吹打混匀微粒备用。(其中，清洗缓冲液：10mmol/L Tris-HCl，100mmol/L Na Cl，1mmol EDTA，总体积为100m L，调p H＝7.4，高压灭菌后分装保存备用；结合缓冲液：20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，总体积为100m L，调p H＝8.0，高压灭菌后分装保存备用)
(2)探针预处理：将合成探针用无菌dd H2O配制成100μM的储存液，分装后-20℃保存；临用时将100μM浓度稀释为10μM应用液。
(3)偶联：在预处理后的磁性微粒悬液中加入15μl生物素化标记寡核苷酸探针，然后在37℃恒温摇床中以150rpm/min反应2h。
(5)封闭：反应完毕后，用清洗缓冲液洗涤3次，磁性分离，每管加入250μl封闭液(1×PBS，5％脱脂奶)，在37℃恒温摇床中以250rpm/min振荡反应过夜，磁性分离，弃上清。(其中，清洗缓冲液：10mmol/L Tris-HCl，100mmol/L Na Cl，1mmol EDTA，总体积为100m L，调pH＝7.4，高压灭菌后分装保存备用)
(6)清洗：在步骤(5)中加入1×PBST缓冲液250μl，用移液器轻轻吹打混匀微粒，磁性分离，弃上清。重复本步骤3次后，得HBV cccDNA特异性DNA探针磁性纳米微球，加入PBS缓冲液50μl(磁性微粒的浓度约为5μg/μl)，2-8℃保存备用。
2、采用HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球分离富集血液中的HBVcccDNA
取待检血液，将1ml 5mg/ml功能化磁性cccDNA纳米颗粒溶液，加入到1ml血液中，震荡混匀后2h，将盛有混合溶液的试管放入外置磁性分离装置，在外磁场环境中作用20min,去除上清液，然后通过分子变性解离后得到富集分离的cccDNA。
3、采用HBV cccDNA特异性DNA分针探针磁性纳米微球分离富集HBV cccDNA
2.1将稳定复制HBV基因的HepAD38细胞培养：HepAD38细胞用含10％胎牛血清、1％青链霉素、1％谷胺酰胺、100mg/L卡那霉素和0.3mg/L四环素的DMEM培养基在37℃、5％CO2和饱和湿度条件下培养48h。用PBS溶液洗涤细胞3次，更换培养基为不含四环素的DMEM培养基，使HepAD38细胞产生HBV病毒粒子。
2.2在更换无四环素培养基后0h、24h、48h、72h、96h收集细胞，调整细胞浓度为1.0-5.0×106/ml，将1ml 5mg/ml功能化磁性cccDNA纳米颗粒溶液，加入到1ml细胞液中，震荡混匀后2h，将盛有混合溶液的试管放入外置磁性分离装置，在外磁场环境中作用20min,去除上清液，然后通过分子变性解离后得到富集分离的cccDNA。
二、本发明HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球分离富集HBV cccDNA的效果评价
1实验方法
(1)互补寡核苷酸序列设计与合成：设计与生物素标记探针序列互补的寡核苷酸序列，然后交由生工生物工程(上海)股份公司合成和标记，序列如下表：
Figure BDA0001072264980000051
(2)杂交：用PBS(pH＝7.4)洗涤已偶联好的磁性纳米微粒3次，取50μl磁性微粒(50μg)；同时将FITC标记互补寡核苷酸探针配制为10μM应用液，按下列条件进行杂交反应。反应共分为实验组和空白对照组(探针对照组)，用移液器轻轻吹打混匀并于62℃杂交反应30min。反应完毕后，磁性分离，弃上清。再用清洗缓冲液充分洗涤磁微粒3次，分别用荧光显微镜观察杂交前后上清液荧光信号变化及用荧光分光光度计检测加入探针各组在杂交前后荧光信号强度变化
FITC标记互补寡核苷酸 5～20μl
纳米微粒悬浊液 10μl
5M Na Cl溶液 10μl
杂交缓冲液 补足到 100μl。
2实验结果
如图2所示，采用本发明HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球分离后，荧光强度明显降低，说明本发明HBV cccDNA特异性DNA分子探针可以有效结合HBV cccDNA，能够实现HBV cccDNA的高效快速富集分离的。
三、本发明HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球分离富集HBV cccDNA的的最大捕获量
经过检测，本发明HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球最大捕获量大是5pmol/mg。
实验结果说明，本发明HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球可以有效特异捕获HBV cccDNA，能够实现HBV cccDNA的高效快速富集分离的，分离方法简单，应用前景良好。
Figure IDA0001086771220000011
Figure IDA0001086771220000021
Figure IDA0001086771220000031

Claims (8)

1. 一种制备HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球的方法，其特征在于：步骤如下：
(1)采用化学共沉淀法制备Fe3O4纳米粒子；
(2)采用反相乳液法制备硅壳磁性纳米颗粒；
(3)对硅壳磁性纳米颗粒进行亲和素修饰；
(4)偶联针对cccDNA特异序列的ssDNA探针；
所述步骤(2)的方法如下：将Triton X-100、正己醇和环己烷按体积比1:1:4混合均匀，加入Fe3O4纳米粒子溶液，搅拌均匀，然后加入正硅酸乙酯和氨水，持续搅拌24h，反应结束后，用丙酮破坏乳化，收集颗粒，得硅壳磁性纳米颗粒。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)的方法如下：将1.0mol/L FeCl3溶液与2.0mol/L FeCl2溶液混合，FeCl3溶液与FeCl2溶液的体积比为4:1，加入FeCl2溶液25倍体积的浓度为0.7mol/L的氨水溶液，离心，得黑褐色沉淀，用FeCl2溶液15倍体积的 浓度为2.0mol/L的高氯酸溶液分散，水洗至中性，干燥，得Fe 3O4纳米粒子。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：加入Fe3O4纳米粒子溶液的浓度为5mmol/L，加入的量为Triton X-100、正己醇和环己烷混合溶液体积的2/5；正硅酸乙酯和氨水的加入量分别为Triton X-100、正己醇和环己烷混合溶液体积的20倍。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)的方法如下：将2.5mg/ml 的链霉亲和素溶液加入到硅壳磁性纳米颗粒中，在4℃下恒温振荡培育24h，用PBS缓冲液洗涤颗粒3次，再加入2％的戊二醛溶液在室温下浸泡，得磁性纳米悬浊液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)的方法如下：
1)纳米预处理：取磁性纳米颗粒混悬液，离心，弃上清，加入结合缓冲液，制成浓度为1μg/μl的磁性微粒悬液，其中，结合缓冲液是Tris-HCl和NaCl的混合溶液，Tris-HCl的浓度为20mmol/L，NaCl的浓度为150mmol/L；
2)探针预处理：将探针配制成浓度为10μM的探针溶液；
3)偶联：在步骤1)制得到的磁性微粒悬液中加入15μl步骤2)制得的探针溶液，在37℃、150rpm/min条件下反应2h；
4)封闭、清洗，即可。
6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中的探针溶液包含4条探针，4条探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～4所示，4条探针的5’端均标记有生物素。
7. 权利要求1～6任意一项所述方法制备得到的HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳 米微球。
8. 一种富集分离HBV cccDNA的方法，其特征在于：步骤如下：取待检样品，加入权利要求7所述HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球，混匀，在外磁场环境中作用20min，去除上清液，通过分子变性解离，即可得到富集分离的cccDNA。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112456564B (zh) * 2020-11-10 2022-03-08 南京邮电大学 一种四氧化三铁纳米磁性颗粒阵列组装结构及组装方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1995052A (zh) * 2006-01-06 2007-07-11 上海柏汇申生物科技有限公司 一种用于核酸分离的磁性纳米粒子复合物及其制法和应用
WO2012112690A2 (en) * 2011-02-16 2012-08-23 Fabius Biotechnology Targeting of therapeutic drugs and diagnostic agents employing collagen binding domains
CN103160577A (zh) * 2013-02-05 2013-06-19 上海交通大学 一种快速检测食品中致病菌的方法
CN103443626A (zh) * 2011-02-15 2013-12-11 协和梅迪克斯株式会社 链霉亲和素结合磁性粒子及其制造方法
CN104360077A (zh) * 2014-11-25 2015-02-18 重庆市科学技术研究院 一种用于检测多西环素残留的适配体核酸探针试剂盒、制备方法及其应用
CN104437440A (zh) * 2014-11-14 2015-03-25 上海交通大学 一种多氨基硅包磁性纳米粒子的制备与应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1995052A (zh) * 2006-01-06 2007-07-11 上海柏汇申生物科技有限公司 一种用于核酸分离的磁性纳米粒子复合物及其制法和应用
CN103443626A (zh) * 2011-02-15 2013-12-11 协和梅迪克斯株式会社 链霉亲和素结合磁性粒子及其制造方法
WO2012112690A2 (en) * 2011-02-16 2012-08-23 Fabius Biotechnology Targeting of therapeutic drugs and diagnostic agents employing collagen binding domains
CN103160577A (zh) * 2013-02-05 2013-06-19 上海交通大学 一种快速检测食品中致病菌的方法
CN104437440A (zh) * 2014-11-14 2015-03-25 上海交通大学 一种多氨基硅包磁性纳米粒子的制备与应用
CN104360077A (zh) * 2014-11-25 2015-02-18 重庆市科学技术研究院 一种用于检测多西环素残留的适配体核酸探针试剂盒、制备方法及其应用

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chemiluminescence Analysis for HBV-DNA Hybridization Detection with Magnetic Nanoparticles Based DNA Extraction from Positive Whole Blood Samples;Nongyue He等;《Journal of Biomedical Nanotechnology》;20131231;第9卷(第2期);第267-273页 *
Chemiluminescence Molecular Detection of Sequence-Specific HBV-DNA Using Magnetic Nanoparticles;Fang Wang等;《Journal of Biomedical Nanotechnology》;20121231;第8卷(第5期);第786-790页 *
Development of Magnetic Capture Hybridization and Quantitative Polymerase Chain Reaction for Hepatitis B Virus Covalently Closed Circular DNA;Yongcan Guo等;《Hepat Mon》;20150131;第15卷(第1期);第e23729页 *
Fe3O4水基磁流体的制备;王煦漫等;《化学工程师》;20070930(第9期);第4-7页 *
HBV CccDNA磁性捕获杂交定量PCR方法的建立及应用评价;郭永灿;《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》;20150215;第E060-26页 *
HBV共价闭合环状DNA功能化纳米颗粒制备及鉴定;郭永灿等;《福建医科大学学报》;20161231;第50卷(第6期);第370-374页 *
Long Spacer Arm-Functionalized Magnetic Nanoparticle Platform for Enhanced Chemiluminescent Detection of Hepatitis B Virus;Haowen Yang等;《Journal of Biomedical Nanotechnology》;20141231;第10卷(第12期);第3610-3619页 *
Synthesis of Size-Controlled Fe3O4@SiO2 Magnetic Nanoparticles for Nucleic Acid Analysis;Huanxiang Sun等;《Journal of Nanoscience and Nanotechnology》;20120101;第12卷(第1期);第267-273页 *
基于上转换荧光标记和磁分离技术的沙门氏菌DNA检测新方法;马小媛等;《食品与生物技术学报》;20131231;第32卷(第12期);第1303-1310页 *

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