JP2008513007A - 生物学材料および細胞材料からの核酸の単離方法 - Google Patents
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Abstract
生物学材料または細胞材料のサンプルから核酸を単離する方法は、固相結合材料を使用し、いかなる溶解溶液又は被覆の使用を避けることを開示している。固相結合材料の使用は、細胞の核酸内容物が遊離され、直接的におよび1つの工程で捕捉されることを予想外にも可能とする。新規な方法は、現存の方法を越えて、重要な簡易さを表現する。核酸は、5分以内の下流プロセスのために、適切な形態で捕捉および解離されうる。本発明の方法と組成物で使用する好適な固相材料は、4級オニウム核酸結合部分を含む。
Description
本発明は、核酸、特に、生物学起源の材料でとりわけ血液および細胞の培養組織からの全体ゲノム核酸、を捕捉および単離するための簡易な方法に関する。さらに、本発明は、これらの方法で有用な固相結合材料を含んでいるキットに関する。
分子診断(diagnostic)および分子生物学における最新の技術(逆転写、クローニング、制限分析、増幅、および配列解析を含む)においては、核酸の抽出が要求される。核酸を得ることは、標的核酸が見出されるのが基質(matrix)サンプルの複合物中であるために、複雑である。かかるサンプルには、例えば、組織(tissues)からの細胞、体液からの細胞、血液、培養組織中の細菌細胞、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、または標的核酸の増幅から得られる溶液が含まれる。基質サンプルはしばしば顕著な量の汚染物質を含み、関心のある核酸を分子生物学的または診断技術において使用する前に、これらをその核酸から除去しなければならない。
上述のような細胞や組織より生成される混合物から標的核酸を得るための慣用の技術には、フェノール、クロロホルム、および臭化エチジウム等の有害な化学薬品の使用が必要となる。フェノール/クロロホルム抽出は、標的核酸と様々な汚染物質との混合物から汚染物質を抽出するためのかかる手法において用いられる。あるいはまた、塩化セシウム−臭化エチジウム勾配が、公知技術の方法として使用される。例えば、「分子クローニング(Molecular Cloning)」,サンブルック(Sambrook)ら著(1989),コールドスプリングハーバープレス(Cold Spring Harbor Press),1.42〜1.50頁を参照。後者の方法は、一般に、エタノールまたは2−プロパノールを水相に添加して核酸を沈殿させることにより、抽出された水相中に残留する核酸材料を沈殿することによる。沈殿物は、通常は遠心分離により溶液から除去され、結果として得られる沈殿物のペレットは、さらなる使用のために水または緩衝液中に再懸濁される前に、乾燥される。
様々なタイプの固相を使用する単純かつ迅速な方法が、細胞溶解物または核酸と汚染物質との他の混合物から核酸を分離するために、開発されている。かかる固相には、クロマトグラフィ樹脂、ポリマーおよびシリカ、または、繊維、フィルターおよび被覆された容器などの様々な外形および形態でのガラスベース材料が含まれる。小さな微粒子の形態である場合には、磁性コアが時に分離の実行において助けを与える。
全血からのDNA抽出DNAは、血液中の白血球から抽出される。血液は、通常、赤血球を選択的に溶解するために処理され、沈殿または遠心分離工程の後に、無傷白血球が、核酸内容物を露出させるために分離して溶解される。タンパク質は蒸解され、得られたDNAは固相で分離され、次いで配列多形(polymorphism)の決定、配列解析、RFLP分析、突然変異検出または他のタイプの診断分析のために使用される。欧州特許EP0796327B1号公報に開示された方法は、粒子の固体支持体の存在下で、細菌の培養組織あるいは全血等の細胞−含有サンプルと溶解洗浄剤を混合することを含む。対照的に本方法では、いかなる洗浄剤または溶解溶液の使用をも排除される。他の方法は、抗体(antibody)で被覆された粒子で全血から白血球を選択的に捕捉し、次いで捕捉した白血球を溶解する工程を含み、固体支持体上の解離した核酸を捕捉することを含む(米国特許出願2003/0180754A1号明細書)。
細菌からの核酸抽出、米国特許5,990,301号明細書には、溶解とそれに続くアニオン交換体上で遊離した核酸の単離、制御されたイオン強度の溶液での溶離、およびその後のエンドトキシン(endotoxins)を除去するための洗浄剤またはクロマトグラフィの支持体での処理による細菌またはウイルスからの核酸の単離方法が開示されている。固体結合支持体材料を含んでいるキットが開発されており、これは細菌の培養組織から、またヒト全血からゲノムを単離する方法に使用するために市場で入手可能である。製品によって供給される手順には、常に、核酸の除去と精製を始める前に細胞が溶解されなければならないことが明記されている。付加的な沈殿工程もまた、固体支持体の使用の前に時々使用される(例えば、K.スミス(K.Smith)ら、J.Clin.Microbiol.,41(6),2440−3(2003);P.レビソン(P.Levison)ら、J.Chromatography A,827、337−44(1998))。
固相材料
核酸の単離に使用される1つのタイプの固相には、高速液体クロマトグラフィ(HPLC)での使用のために設計された多孔質シリカゲル粒子が含まれる。多孔質シリカゲル粒子の表面は、一定の塩およびpH条件下でプラスミドDNAと交換されるアニオン交換体で官能化されている。例えば、米国特許4,699,717号および5,057,426号明細書を参照。これらの固相材料に結合したプラスミドDNAは、高濃度の塩を含んでいる水溶液中で溶離される。そこで溶離された核酸溶液は、下流のプロセスで使用される前に、塩を除去するためにさらに処理されなければならない。
核酸の単離に使用される1つのタイプの固相には、高速液体クロマトグラフィ(HPLC)での使用のために設計された多孔質シリカゲル粒子が含まれる。多孔質シリカゲル粒子の表面は、一定の塩およびpH条件下でプラスミドDNAと交換されるアニオン交換体で官能化されている。例えば、米国特許4,699,717号および5,057,426号明細書を参照。これらの固相材料に結合したプラスミドDNAは、高濃度の塩を含んでいる水溶液中で溶離される。そこで溶離された核酸溶液は、下流のプロセスで使用される前に、塩を除去するためにさらに処理されなければならない。
他のシリカベース固相材料には、制御ポアガラス(CPG)、シリカ粒子で取り囲まれたフィルター、シリカゲル粒子、珪藻土、ガラス繊維または上記の混合物が含まれる。各シリカベース固相材料は、核酸を含んでいるサンプル中で、ヨウ化ナトリウム(NaI)、グアニジニウム(guanidinium)チオシアネートまたは塩化グアニジニウムなどのカオトロピック(chaotropic)剤の存在下で、可逆的に核酸と結合する。例えば、米国特許5,234,809号および6,582,922号明細書を参照。かかる固相は、核酸材料と結合してこれを保持し、残留しているサンプル成分から、基質とそれに結合した核酸材料とを分離するために、固相の遠心分離または減圧ろ過が行われる。核酸材料はその後、水または低塩溶離緩衝液で溶離することにより固相から遊離される。市場で入手可能な核酸単離用のシリカベース固相材料には、例えば、Wizard(登録商標)DNA精製システム製品(プロメガ(株),マディソン,WI)、the QiaPrep(登録商標)DNA単離システム((株)キアゲン,サンタクラリタ,CA)、ハイピュア(ロシュ社(Roche))、およびGFXマイクロプラスミドキット(Micro Plasmid Kit)(アマルシャム社(Amersham))が含まれる。
粒子の形態での重合樹脂も、核酸の単離および精製のために広範に使用されている。カルボキシレート変性重合粒子(バーンズ,エージェンコート(Bangs,Agencourt))は、公知である。4級アンモニウム先端基を有するポリマーは、欧州特許出願公開番号EP1243649A1号明細書中に開示されている。このポリマーは共有結合された線状非架橋ポリマーを有する不活性担体粒子である。このタイプの重合固相は一般に、触手(テンタクル)樹脂と呼ばれる。この線状ポリマーは、4級テトラアルキルアンモニウム基を包含する。アルキル基は、メチル基またはエチル基として明示されている(4欄、52〜55行)。より長いアルキル基は、望ましくないと考えられる。
アニオン交換則に基づいて核酸と結合するための他の固相材料が、現在使用されている。これらには、DEAE先端基を有するシリカベース材料((株)キアゲン)および欧州特許EP0496822B1号明細書に記載されたクロマトグラフィ支持体に基づくシリカ−ヌクレオボンドAX(ベクトン ディッキンソン(Becton Dickinson),ロシュ−ゲノピュア(Roche−Genopure))が含まれる。重合トリアルキルアンモニウム基をもつポリマー樹脂が、欧州特許EP1243649号明細書中に開示されている(ゲネスキャン(GeneScan))。DNA単離用のカルボキシ変性ポリマーは、非常に多くの供給先から入手可能である。核酸は、高塩条件下で引き寄せられて、低イオン強度条件下で解離される。
細胞を溶解するための洗浄剤、弱塩基およびキレート試薬を含んでいる組成物で被覆されたろ紙またはメンブラン(membrane)等の固体基質あるいは基材を含んでいる材料は、米国特許5,496,562号、5,756,126号、6,645,717号および6,746,841号明細書に開示されている。コーティングは、溶液として塗布され、次いで基質上で乾燥される。このコーティングは、分離した追加の層であり、材料の一体化した部分ではない。更に、核酸は、次の加熱工程によって基質に固定される。
カチオン性のトリメチルアミンを外側に有する重合マイクロキャリアビーズは、米国特許6,214,618号明細書に開示されている。このビーズは、比較的大きな径(75〜225μm)を有し、細胞の結合と培養組織中での成長のための支持体として有用である。これらのビーズについて、核酸を捕捉すること、または核酸と結合することは報告されていない。
磁性反応粒子もまた、核酸を単離する際に固相として使用するために開発されている。核酸単離用に設計された幾つかの異なるタイプの磁性反応粒子は公知技術であり、かつ、いくつかの出所から市場で入手可能である。可逆的に核酸材料と結合する磁性粒子には、まさにマグネシル(Magnesil)(登録商標)粒子(プロメガ(株))が含まれる。磁性粒子は、mRNAのポリA末端とのハイブリッド形成のために結びついたオリゴdT末端を有する共有結合されたアビジンまたはストレプトアビジンを介して、可逆的にmRNAと結合することも知られている。
種々のタイプの磁性反応シリカベース粒子を、核酸結合単離法において固相として使用することは公知である。かかるタイプの1つは、磁性反応ガラスビーズであり、好ましくは、CPG社(リンカーンパーク,NJ)から磁性ポアガラス(MPG)粒子として入手可能な制御ポア径を有するもの、または、米国特許4,395,271号,4,233,169号,4,297,337号、もしくは6,255,477号明細書に記載された磁性ポアガラス粒子である。核酸の結合および単離のために有用な他のタイプの磁性粒子は、重合二酸化シリコン化合物の基質中に磁性材料を混合することにより製造される。例えば、ドイツ特許DE4307262A1号、米国特許5,945,525号、6,027,945号および6,296,937号明細書参照。4級アンモニウム基を有するセルロース基質に固定された酸化鉄ナノ粒子を含んでいる磁性粒子は、MagaCell−Q(登録商標)としてコルテックスバイオケム(Cortex Biochem)(San Leandro、CA)により市場で製造されている。
誘導可能な磁性特性を有する粒子またはビーズは、磁石の存在下で一時的に磁性特性を発現しうる金属酸化物を形成するための遷移金属、例えば、鉄、ニッケル、銅、コバルトおよびマンガンの小粒子を含む。これらの粒子は、常磁性体または超常磁性体と呼ばれる。常磁性体または超常磁性体ビーズを形成するために、金属酸化物は、水中で比較的安定なポリマーで被覆される。米国特許4,554,088号明細書には、重合シランの層により被包された金属酸化物コアを含んでいる常磁性体粒子が開示されている。米国特許5,356,713号明細書には、疎水性ビニル芳香族モノマーの殻で被包された磁化しうる粒子のコアを含む、磁化しうるミクロスフェアが開示されている。米国特許5,395,688号明細書には、混合された常磁性体金属酸化物−ポリマー層で被覆されたポリマーコアが開示されている。他の方法は、ポリマーコアを、例えば米国特許4,774,265号明細書中におけるように、金属酸化物を吸着するために利用する。常磁性体金属酸化物層で被覆された重合コアを含んでいる磁性粒子は、米国特許5,091,206号明細書中に開示されている。この粒子は、その後さらに、金属酸化物層を遮蔽するとともに反応性コーティングを与えるために、付加的な重合層で被覆される。米国特許5,866,099号明細書には、タンパク質の存在下で2つの金属塩の混合物を共沈させて、金属塩を配位結合させるとともに、混合された金属酸化物を捕捉する磁性粒子の調製が開示されている。非常に多くの典型的な金属塩対が記載されている。米国特許5,411,730号明細書には、沈殿された混合金属酸化物をデキストラン、オリゴ糖類中で捕捉する、類似の方法が記載されている。
DNAおよびRNAを不可逆的に捕捉するためのアルミナ(酸化アルミニウム)粒子が、米国特許6,291,166号明細書に開示されている。結合核酸は、PCRなどの固相増幅法での使用に、利用できる。
これらの固相材料に結合したDNAは、高濃度の塩を含んでいる水溶液中で溶離される。これらから溶離された核酸溶液は、下流のプロセスで使用される前に、塩を除去するためにさらに処理されなければならない。対称的に、シリカベース材料に結合した核酸は、水または低塩溶離緩衝液での溶離により、固相から遊離される。米国特許5,792,651号明細書には、細胞内のトランスフェクション(transfection)での核酸の能力を増大させ、核酸のクロマトグラフィ単離のための組成物が開示されている。この組成物は、2−プロパノールと任意の塩と緩衝材料を含んでいる水溶液を含む。
さらに、磁性マイクロコアを含むアガロースまたはセルロース粒子を含んでいる他の磁性固相材料は、高濃度の塩とポリアルキレングリコールを含んでいる組成物での処理により、核酸に結合して核酸を保持することが報告されている(例えば、米国特許5,898,071号明細書およびPCT公報WO02066993号)。核酸は、水または低イオン強度緩衝液での処理により、続いて解離される。
本出願人により出願中の、米国出願番号10/714,763号、10/715,284号および10/891,880号、10/942,491号および60/638,631号明細書は、ここで参照として受け入れられ、開裂可能な材料と核酸の結合および解離の方法を含めて、新規な固相核酸結合材料を開示する。
トリブチルホスホニウム先端基を有する重合ビーズは、3相システムでの相転写触媒としての使用について開示されている。このビーズは、架橋ポリスチレンから調製される(J.Chem.Soc.Perkin Trans. II,1827−1830,(1983))。アルキレン鎖およびアルキレンエーテル鎖を介して架橋ポリスチレン樹脂に結合されたペンダント型のトリアルキルホスホニウム基を有するポリマービーズも開示されている(トモイ(Tomoi)ら,Makromolekulare Chemie,187(2),357−65(1986);トモイ(Tomoi)ら,Reactive Polymers,Ion Exchangers,Sorbents,3(4),341−9(1985))。架橋ポリスチレン樹脂をベースとする混合された4級アンモニウム/ホスホニウム不溶性ポリマーは、触媒および殺生物剤として開示されている(ダビデシュー(Davidescu)ら,Chem.Bull.Techn.Univ.Timisoara,40(54),63−72(1995);パルベルシュー(Parvulescu)ら,Reactive&Functional Polymers,33(2,3),329−36(1997))。
本発明の第1の目的は、生物学材料および細胞材料から核酸を捕捉するための簡易で迅速な方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、生物学材料および細胞材料から核酸を単離するための簡易で迅速な方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、有機体の血液画分または全血から核酸を捕捉および単離するための方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、細胞培養組織(cultures)から核酸を捕捉および単離するための方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、5分以内に生物学材料および細胞材料から核酸を捕捉および単離するための方法を提供することである。
図1は、本発明による血液サンプルからの核酸の単離を概略的に示す。
図2Aは、実施例2の粒子を使用して、ヒト血液サンプルから単離したDNAを表すゲル像である。図2Bは、図2Aで単離したゲノムDNAの範囲の増幅を表すゲル像である。
図3は、実施例2または実施例7の粒子と様々な添加剤を使用して本方法により単離したゲノムDNAの範囲の増幅を表すゲル像である。
図4は、本発明の様々な粒子を使用して、ヒト血液サンプルから単離したDNAを表すゲル像である。
図5Aは、実施例2または4の粒子を使用し、様々なNaOH濃度で溶離してヒト血液サンプルから単離したDNAを表すゲル像である。図5Bは、図5Aに示した単離したゲノムDNAの範囲の増幅を表すゲル像である。
図6は、本発明の様々な粒子を使用して、ヒト血液サンプルから単離したDNAを表すゲル像である。
発明の詳細な説明
定義
アルキル基−1〜20個の炭素原子を含む分岐、直鎖または環状炭化水素基であり、水素原子以外の1またはそれ以上の置換基で置換されていてもよい。ここで使用されるような低級アルキル基は、炭素原子を8個まで含むアルキル基に当てはまる。
定義
アルキル基−1〜20個の炭素原子を含む分岐、直鎖または環状炭化水素基であり、水素原子以外の1またはそれ以上の置換基で置換されていてもよい。ここで使用されるような低級アルキル基は、炭素原子を8個まで含むアルキル基に当てはまる。
アラルキル基−アリール基で置換されたアルキル基である。
アリール基−1〜5個の炭素環式芳香環を含む芳香環含有基であり、水素原子以外の1またはそれ以上の置換基で置換されていてもよい。
生物学材料−全血、凝固を阻止した全血、組織(tissue)、細胞、細胞内容物(content)、細胞外の核酸、ウイルスを含む。
細胞材料−無傷細胞または材料であり、動物、植物または細菌起源の無傷細胞を含有する組織を含む。
細胞の核酸内容物−細胞材料中に見られる核酸に関連し、ゲノムDNA、RNAおよび、ウイルスやプラスミドを含む感染要因由来のもの等の他の核酸である。
磁性粒子−外部磁場に対し反応する粒子、微粒子またはビーズである。この粒子はそれ自体が磁性体、常磁性体または超常磁性体であってよい。強磁性材料を用いる場合のように、外部磁石かまたは適用された磁場に引き付けられてもよい。粒子は、磁性的に反応し、1またはそれ以上の非磁性的に反応する層により被包された固体コア部分を有してもよい。あるいはまた、磁性的に反応する部分は周囲の層であってもよく、または、非磁性的に反応するコア内に配置された粒子であってもよい。
オリゴマー、オリゴヌクレオチド−ここに使用されるものとして、ホスホジエステルヌクレオチド間結合および5’−末端モノホスフェート基を含む化合物が当てはまる。ヌクレオチドは、通常生ずるリボヌクレオチドA,C,GおよびUまたはデオキシリボヌクレオチドdA,dC,dGおよびdTであってよい。
核酸−ポリヌクレオチドはDNA,RNAまたはPNA等の合成DNA類似体であってよい。これら3つのいかなるタイプの鎖の一本鎖化合物および二本鎖ハイブリッドもまた、この用語の範囲内である。
解離、溶離−溶液または組成物と接触させることにより、固相材料の表面またはポアに結合した材料の実質的な部分を除去すること。
サンプル−核酸を含むかまたは含んでいる可能性のある流体である。本発明の方法において使用可能である代表的なサンプルは、集められた血液検体に通常見られるように凝固を阻止したものでもよい血液、血漿、漿液、尿、精液、唾液等の体液、細胞培養組織、組織抽出物等を含む。他のタイプのサンプルには、溶剤、海水、工業用水サンプル、食品サンプル、ならびに、土壌または水、植物材料、原核生物、真核生物、細菌、プラスミド、およびウイルス由来の細胞等の環境サンプルが含まれる。
固相材料−核酸分子を引き寄せ得る表面を有する材料である。この材料は、微粒子、繊維、ビーズ、メンブラン、およびテストチューブやマイクロウェル等の他の支持体の形態を有してよい。
置換−1つの基内における少なくとも1個の水素原子の、非水素基による置換に当てはまる。置換基に関しては、明確に他のことを示している場合を除き、置換基が複数となる点が存在し得ることを意味することに留意すべきである。
慣例的に、核酸は、種々のサンプルタイプから様々な技術によって抽出、単離され、その他の方法で精製される。これらの技術の多くは、核酸に対するいくらかの親和力による材料の表面への選択的吸着による。他の強固でない結合成分を除去するための洗浄工程後、固相は、結合核酸を除去するか、または溶離するために溶液で処理される。
細胞材料の一部からゲノム核酸を抽出して単離することは、しばしば必要である。そうして得られた核酸は、増幅、診断テスト、突然変異の分析、遺伝子の表現プロファイリング(profiling)およびクローニングを含む次のプロセスで使用される。本発明の方法により単離されうる核酸からのサンプルには、細菌の培養組織、体液、全血と血液成分、組織抽出物、植物材料および細胞材料を含む環境サンプルが含まれる。
公知の方法による細胞の核酸内容物の除去は、内部にアクセスするために細胞膜または細胞壁の破裂あるいは浸透を必要とする。この目的のために、従来の方法では細胞溶解工程を使用していた。これらの方法の1つは、溶解するために試薬を使用する。溶解溶液には、使用される溶解の方法に依存して2つのタイプがある。1つのタイプは、アルカリ溶解用の高pH水溶液である。もう1つのタイプは、細胞膜を粉砕するために1つまたはそれ以上の界面活性剤あるいは洗浄剤を使用する。溶解溶液は、また細胞の核酸内容物の遊離を助けるために、プロテイナーゼ酵素等の消化酵素を含んでもよい。他の方法は、捕捉工程の前に、完全な細胞を粉砕するために、硬い粒子とともに超音波あるいは制御された振動をもって細胞を機械的に破壊する、予備的工程を採用する。
本出願人は、新規な方法および新規な固相結合材料を開発し、これらは、ウイルス、プラスミド、細胞外のDNAまたはRNA、全血、凝固を阻止した血液、あるいは細菌等の、生物学および細胞材料のサンプルからの核酸の迅速な捕捉および単離に使用され、いかなる予備的な溶解工程をも必要としない。固相結合材料は、細胞の核酸内容物を一工程で捕捉することを、予想外にも可能とした。新規な方法は、溶解溶液の使用を排除したことから、迅速性、簡易性、利便性及び自動化の容易性において著しい改善を示している。
本発明の1つの側面は、次の工程を含む生物学材料または細胞材料のサンプルからの核酸の捕捉方法を提供する。
a)固相結合材料を与える工程と、
b)前記核酸を前記固相結合材料に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記固相結合材料を一緒にする工程。
a)固相結合材料を与える工程と、
b)前記核酸を前記固相結合材料に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記固相結合材料を一緒にする工程。
本発明の他の側面は、次の工程を含む生物学材料または細胞材料のサンプルからの核酸の単離方法を提供する。
a)固相結合材料を与える工程と、
b)前記核酸を前記固相結合材料に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる細胞材料のサンプルと前記固相結合材料を一緒にする工程と、
c)前記固相結合材料から前記サンプルを分離する工程と、
d)随意に前記固相結合材料を洗浄する工程と、
e)前記固相結合材料から結合核酸を解離する工程。
a)固相結合材料を与える工程と、
b)前記核酸を前記固相結合材料に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる細胞材料のサンプルと前記固相結合材料を一緒にする工程と、
c)前記固相結合材料から前記サンプルを分離する工程と、
d)随意に前記固相結合材料を洗浄する工程と、
e)前記固相結合材料から結合核酸を解離する工程。
生物学サンプルから核酸を捕捉または単離する従来の方法と異なって、細胞を溶解する予備的工程はない。さらに、溶解試薬、洗浄剤、界面活性剤またはカオトロープ(chaotrope)は、固相結合材料とサンプルを接触する前、それと同時、またはその後にも使用されず、あるいは必要とされない。必要とされるのは、短い時間で固相と細胞材料のサンプルを接触させることだけである。以下の実施例に示すように、接触時間は3分あるいはそれより短く、若干の場合には、30秒程の短い時間でかなりの量の核酸を捕捉することができる。捕捉された量は、ゲル電気泳動、蛍光染色、PCR増幅等の通常の技術により、固相から解離された後、容易に検出することができる。
便宜のため、固相結合材料は、水、または溶解もしくは細胞の分解を起こすことが知られていない溶液もしくは緩衝液中のサンプルに加えることができる。一方で、固相結合材料は、乾燥した固体として直接サンプルに加えることもできる。
本発明の好適な側面は、次の工程を含む生物の全血からの核酸の捕捉方法を提供する。
a)固相結合材料を与える工程と、
b)前記核酸を前記固相結合材料に結合させるに十分な時間、全血サンプルと前記固相結合材料を一緒にする工程。
a)固相結合材料を与える工程と、
b)前記核酸を前記固相結合材料に結合させるに十分な時間、全血サンプルと前記固相結合材料を一緒にする工程。
本発明の他の好適な側面は、次の工程を含む有機体の全血中の白血球内に含まれる核酸の捕捉方法を提供する。
a)固相結合材料を与える工程と、
b)前記白血球からの前記核酸を前記固相結合材料に結合させるに十分な時間、全血サンプルと前記固相結合材料を一緒にする工程。
a)固相結合材料を与える工程と、
b)前記白血球からの前記核酸を前記固相結合材料に結合させるに十分な時間、全血サンプルと前記固相結合材料を一緒にする工程。
上記方法は、次の追加工程を行なうことにより、捕捉した核酸を単離するために使用することができる。
c)前記固相結合材料から前記サンプルを分離する工程と、
d)随意に前記固相結合材料を洗浄する工程と、
e)前記固相結合材料から結合核酸を解離する工程。
c)前記固相結合材料から前記サンプルを分離する工程と、
d)随意に前記固相結合材料を洗浄する工程と、
e)前記固相結合材料から結合核酸を解離する工程。
本発明の方法で使用する核酸を結合するための固相材料は、そのサイズ、形、多孔性、および物理学的特性を規定する基質を含み、粒子、微粒子、繊維、ビーズ、メンブラン、およびテストチューブやマイクロウェル等の他の支持体の形態とすることができる。任意の特別な操作理論により洗浄せず結合されたままとする一方、本方法において有効な固相支持体の表面が、サンプルから直接核酸を固定する役割を果たすことができる場合がある。ここで使用されるように核酸捕捉の用語は、通常、その使用の条件下で固相と核酸を結合させるための操作でのいかなる方式をも含んでおり、固相が無傷細胞と結合する場合も同様に予期している。
固相材料は、全血、細菌培養組織等の細胞材料のサンプルから直接核酸と結合する所望特性を有する任意の適切な物質とすることができる。好適な固相材料には、シリカ、ガラス、焼結ガラス、制御ポアガラス、アルミナ、ジルコニア、チタニア、不溶性合成ポリマー、不溶性多糖類、並びに、金属、金属酸化物および金属硫化物から選択される金属材料、同様にシリカ、ガラス、不溶性合成ポリマーまたは不溶性多糖類で被覆された磁性反応材料が含まれる。典型的な材料には、細胞を粉砕して核酸を誘引する役割を有する共有結合した表面官能基で官能化され、あるいは被覆されたシリカベース材料が含まれる。また、好適に表面を官能化された炭水化物ベース材料、およびこの表面官能性をもつ重合材料も含まれる。非常に多くの特有の材料およびそれらの調製が、本出願人により出願中の、米国出願番号10/714,763号、10/715,284号、10/891,880号、10/942,491号、もしくは60/638,631号明細書に記載されている。
1つの実施形態として、さらにこの材料は、様々な長さの核酸分子の捕捉および結合を可能とする表面、またはその近傍において、共有結合した核酸結合部分を含む。ここで、表面は、固相材料の外表面だけでなく、固相材料内の利用できるいかなる多孔質領域の表面をも意味する。非常に多くの特別な材料とそれらの調製が、本出願人により出願中の、米国出願番号10/714,763号、10/715,284号、10/891,880号、10/942,491号および60/638,631号明細書に記載されている。
本発明の他の側面は、次の工程を含む生物学材料または細胞材料のサンプルからの核酸の捕捉方法を提供する。
a)核酸結合部分と結合させる基質を含む固相を与える工程と、
b)前記核酸を前記固相に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記固相を一緒にする工程。
a)核酸結合部分と結合させる基質を含む固相を与える工程と、
b)前記核酸を前記固相に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記固相を一緒にする工程。
本発明の他の側面は、次の工程を含む生物学材料または細胞材料のサンプルからの核酸の単離方法を提供する。
a)核酸結合部分と結合させる基質を含む固相を与える工程と、
b)前記核酸を前記固相に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記固相を一緒にする工程と、
c)前記固相から前記サンプルを分離する工程と、
d)随意に前記固相を洗浄する工程と、
e)前記固相から結合核酸を解離する工程。
a)核酸結合部分と結合させる基質を含む固相を与える工程と、
b)前記核酸を前記固相に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記固相を一緒にする工程と、
c)前記固相から前記サンプルを分離する工程と、
d)随意に前記固相を洗浄する工程と、
e)前記固相から結合核酸を解離する工程。
他の実施形態として、さらにこの材料は、様々な長さの核酸分子の捕捉および結合を可能とする表面、またはその近傍において、非共有結合した核酸結合部分を含む。非共有結合した核酸結合部分は、その表面上の、反対に荷電された残基への静電的誘引により固体基質と結合されるか、または、その表面との疎水性引力により結合される。
共有または非共有結合した核酸結合基を有するこれらの材料の基質材料は、いかなる適切な物質であってもよい。好適な基質材料は、シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマー、不溶性多糖類、および、金属、金属酸化物および金属硫化物から選択される金属材料、並びに、シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマーまたは不溶性多糖類で被覆された磁性反応材料から選択される。典型的な材料には、細胞を粉砕して核酸を誘引するために利用する共有結合した表面官能基で官能化され、あるいは被覆されたシリカベース材料が含まれる。また、好適に表面を官能化された炭水化物ベース材料、およびこの表面官能性をもつ重合材料も含まれる。非常に多くの特有の材料およびそれらの調製は、本出願人により出願中の、米国出願番号10/714,763号、10/715,284号、10/891,880、10/942,491号および60/638,631号明細書に記載されている。核酸結合基として利用される表面官能基には、細胞の構造的な完全性を粉砕し、かつ、固体支持体に核酸を誘引させることのできるいかなる基も含まれる。かかる基には、限定はされないが、ヒドロキシル基、シラノール基、カルボキシル基、アミノ基、アンモニウム基、4級アンモニウムおよびホスホニウム塩並びに以下に記載される3級スルホニウム塩タイプの材料が含まれる。結合のために最初の低pHでプロトン化され、かつ、結合核酸の解離の間に次の高pHで脱プロトン化されるアミノ基を組み込んでいる固相材料、例えば、欧州特許EP01036082B1号明細書に開示されている材料は、本発明において有用な固相材料の範囲内である。
多くの用途のために、固相材料は粒子の形態であることが好ましい。好ましくは粒子は、約50μmより小さい粒子であり、より好ましくは約10μmより小さい粒子である。小さい粒子は、溶液中により迅速に分散され、高い表面/体積比を有する。大きな粒子およびビーズもまた、重力沈殿または遠心分離が使用される方法で有用である。さらに、固相は、好ましくは磁性反応部分を含んでいてもよく、この部分は通常、磁性微粒子の形態であり、粒子は磁場により誘引され、操作することができる。かかる磁性微粒子は、磁性金属酸化物または金属硫化物のコアを含み、これは一般に、核酸結合基が共有結合される層であって、吸着結合または共有結合された当該層により囲まれ、これにより表面が被覆されている。磁性金属酸化物コアは、好ましくは鉄酸化物または鉄硫化物であり、ここで鉄は、Fe2+、Fe3+またはその両方である。磁性粒子はまた、米国特許4,654,267号明細書に開示されているように、多孔ポリマーの存在下で金属粒子を沈殿させて、磁性反応性金属粒子を捕捉することにより形成することができる。これにより調製されうる磁性金属酸化物には、Fe3O4,Fe2O3,MnFe2O4,NiFe2O4,およびCoFe2O4が含まれる。他の磁性粒子はまた、米国特許5,411,730号明細書に開示されているように、多糖類デキストランの存在下で金属酸化物粒子を沈殿させて、磁性反応性金属粒子を捕捉することにより形成することができる。さらに、他の種類の磁性粒子は、前述の米国特許5,091,206号明細書中に開示されている。この粒子は、金属酸化物層を遮蔽するとともに反応性コーティングを与えるために、常磁性金属酸化物層および付加的な重合層で被覆された重合コアを含む。クロロメチル化メリーフィールド樹脂を含んでいるマグネタイトの調製は、出版物(テトラへドロン(Tetrahedron Lett.,40(1999),8137−8140))中に記載されている。
市場で入手可能な磁性シリカまたは磁性重合粒子は、本発明において有用な磁性固相結合材料の調製における出発材料として使用することができる。表面カルボキシル基を有する好適なタイプの重合粒子は、商品名セラマグ(SeraMag,登録商標)(セラダイン社,Seradyn)およびビオマグ(BioMag,登録商標)(ポリサイエンスアンドバーンズラボラトリーズ)により公知である。好適なタイプのシリカ磁性粒子は、商品名マグネシル(MagneSil,登録商標)(プロメガ(株))により公知である。表面にカルボキシル基またはアミノ基を有するシリカ磁性粒子は、ケミセル(Chemicell)GmbH社(ベルリン)から入手可能である。
本出願人は、核酸結合(NAB)部分と結合される有機結合基と、被覆なしか、または被覆された金属コアを結合させることで、本発明による磁性反応粒子の結合材料を調製した。被覆された金属コアを使用する場合、便利な被覆コアには、シリカ−被覆磁性コアまたはガラス−被覆磁性コアがある。好適な磁性反応金属コアは、マグネタイト、Fe3O4により得られる。マグネタイトは市場において入手可能であり、または、通常知られている方法で、塩基性の溶液中で鉄(II)および鉄(III)塩の反応によって調製することができる。
1つの末端にトリアルコキシシラン基を含んでいる結合基は、シリカまたはガラス−被覆磁性粒子等の被覆金属材料または金属材料の表面に結合されうる。好適なトリアルコキシシラン化合物は、構造式R1−Si(OR)3を有し、ここでRは低級アルキル基であり、また、R1は、直鎖、分岐鎖および環から選択される有機基であって、1〜100個の原子を含む。この原子は、好ましくは、C,H,B,N,O,S,Si,P、ハロゲンおよびアルカリ金属から選択される。典型的なR1基は、3−アミノプロピル、2−シアノエチルおよび2−カルボキシエチル、並びに、以下により詳細に記載したような開裂可能な部分を有する基である。好適な実施形態として、トリアルコキシシラン化合物は、開裂可能な中央部分と反応基末端部分を含み、ここで反応基は1つの工程で、3級アミン、3級ホスフィンまたは有機硫化物との反応により、4級または3級オニウム塩に転化されうる。
かかる結合基は、フッ化物イオンを用いるプロセスで、金属粒子およびガラスまたはシリカ−被覆金属粒子の表面に付着しうることが見出された。この反応は、低級アルコールおよびトルエン等の芳香族溶剤を含む有機溶媒中で行うことができる。好適なフッ化物源は、かかる有機溶剤中でかなりの溶解性を有し、セシウムフルオライドおよびテトラアルキルアンモニウムフルオライド塩等がある。
本発明の方法で有用な固相結合材料中に含まれるNAB基は、2つの目的に利用できることが明らかである。NAB基は、種々の長さおよび塩基組成または配列をもつオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよび核酸を引き寄せて、これらと結合する。これらはまた、細胞の外被から核酸を遊離させるための役割を果す多少の能力を発揮することができる。核酸結合基には、例えば、カルボキシル基、アミン基および3級または4級オニウム基、またはこれらの基の1つ以上の混合が含まれる。アミン基は、NH2、アルキルアミンおよびジアルキルアミン基であってよい。好適なNAB基は、4級トリアルキルアンモニウム基(−QR3 +)、トリアルキルホスホニウム若しくはトリアリールホスホニウムまたは混合アルキルアリールホスホニウム基を含むホスホニウム基(−QR3 +)、および3級スルホニウム基(−QR2 +)を含む3級または4級オニウム基である。固相は、ここに記載されているような核酸結合基を一種を超えて含んでもよい。R基が少なくとも4個の炭素原子をもつアルキル基である3級または4級オニウム基−QR2 +または−QR3 +を含んでいる固相材料は、核酸との結合において特に有効であるが、1個程度の少ない炭素原子を有するアルキル基もまた、アリール基と同様に有用である。かかる固相材料は、結合核酸を強固に保持し、かつ、従来技術において公知の溶離のために使用される大抵の条件下で、核酸の除去または溶離を阻害する。低および高イオン強度の両方の大抵の公知の溶離条件は、結合核酸の除去において効果を有しない。DEAEおよびPEI基を含む慣用のアニオン交換樹脂とは異なり、3級または4級オニウム固相材料は、反応媒体のpHに関わらず、プラスに荷電されたままである。
ある好適な実施形態では、選択的に切断されうる結合(linkage)を介してNAB基が基質に結合する固相結合材料が用いられる。この結合の切断は、固相からいかなる結合核酸をも効果的に分離する。この結合は、明確に開裂可能な結合部分(linker)で結合を切断するが、関心のある核酸を破壊することのない、いかなる化学的、酵素的、光化学的または他の方法によっても開裂させることができる。かかる開裂可能な固相材料は、シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマーおよび不溶性多糖類、並びに、金属、金属酸化物および金属硫化物から選択される金属材料から選択される基質を含む固体支持体部分を含む。核酸を引きよせて結合するための核酸結合(NAB)部分は、開裂可能な結合部分により、固体支持体表面に結合されている。
好適な実施形態において、NABは、上述したように一般式QR2 +X−で示される3級オニウム基または4級オニウム基QR3 +X−である。
開裂可能な結合部分は、好ましくは、直鎖、分岐鎖および環から選択される有機基であり、1〜100個の原子を含む。この原子は、好ましくは、C,H,B,N,O,S,Si,P、ハロゲンおよびアルカリ金属から選択される。典型的な結合基は、加水分解的に開裂可能な基であり、これは加水分解により開裂する。カルボキシエステルおよび無水物、チオエステル、カーボネートエステル、チオカーボネートエステル、ウレタン、イミド、スルホンアミド、およびスルホンイミドは、スルホネートエステルのように、典型的である。好適な実施形態において、開裂可能な結合はアルカリ水溶液で処理される。他の典型的な結合基の種類は、エタンチオール、メルカプトエタノール、およびDTTなどのチオールにより開裂されるジスルフィド(S−S)結合などの還元開裂を受ける基である。他の典型的な基は、過酸化(O−O)結合を含んでいる有機基である。過酸化結合は、チオール、アミンおよびホスフィンにより開裂可能である。
他の典型的な基は、次式のニトロで置換された芳香族のエーテル及びエステル等の光化学的に開裂可能な結合基である。
ここで、Rdは、H、アルキル基またはフェニル基である。オルト−ニトロベンジルエステルは、以下のよく知られた反応として紫外光により開裂する。
他の典型的な開裂可能な基は、酵素的に開裂可能な結合基である。典型的な基には、エステラーゼおよび加水分解酵素により開裂可能なエステル、プロテアーゼおよびペプチダーゼにより開裂可能なアミドおよびペプチド、グリコシダーゼにより開裂可能なグリコシド基が含まれる。
他の典型的な開裂可能な基は、開裂可能な1,2−ジオキセタン部分である。かかる材料は、熱により分解されうるか、または化学反応もしくは酵素剤により断片化を開始されうるジオキセタン部分を含む。オキシアニオンを生成するための保護基の除去は、ジオキセタン環の分解を促進する。断片化(フラグメンテーション)は、過酸化O−O結合の開裂により、C−C結合と同様に、よく知られたプロセスに従って生ずる。開裂可能なジオキセタンは、非常に多くの特許および出版物に記載されている。典型的な例には、米国特許4,952,707号、5,707,559号、5,578,253号、6,036,892号、6,228,653号および6,461,876号明細書が含まれる。
あるいはまた、結合したオニウム基は、アリール基Arに対してか、または、開裂可能な基Yに対して、結合可能である。さらにあるいはまた、固相および3級または4級オニウム基に対する結合は、示された方向とは逆である。
他の開裂可能な結合基は、不安定な1,2−ジオキセタン部分に転化されうるエレクトロンリッチC−C二重結合である。二重結合における少なくとも1個の置換基は、O,SまたはN原子を用いて二重結合と結合する。エレクトロンリッチ二重結合の一重項酸素との反応により、不安定な1,2−ジオキセタン環基が生成され、このジオキセタン環基は、周囲温度にて自然に断片化して、2つのカルボニル断片を生成する。エレクトロンリッチ二重結合から構成される不安定なジオキセタンは、A.P.シャップ(A.P.Schaap)およびS.D.ガグノン(S.D.Gagnon),J.Am.Chm.Sco.,104,3504−6(1982);W.アダム(W.Adam),Chem.Ber.,116,839−46,(1983);米国特許5,780,646号明細書によって例示される非常に多くの特許および出版物に記載されている。
開裂可能な結合基を有する固相材料の他の基は、PCT公報WO03/053934号に開示されているように、開裂可能な部分としてケテンジチオアセタールを有する。ケテンジチオアセタールは、ペルオキシダーゼ酵素および過酸化水素を用いた酵素の酸化により、酸化開裂を受ける。
開裂可能な部分は示された構造を有し、アクリダン環において置換基をもつ類似体を含み、ここでRa、RbおよびRCはそれぞれ、C,N,O,S,P,Siおよびハロゲン原子から選択される1〜約50個の非水素原子を含んでいる有機基であり、ここでRaおよびRbは互いに結合して環を形成してもよい。非常に多くの他の開裂可能な基は、熟練した技術者には明らかだろう。
本発明の他の側面は、次の工程を含む生物学材料または細胞材料のサンプルからの核酸の捕捉方法を提供する。
a)選択的に開裂可能な結合(linkage)を介して、核酸結合部分に結合される基質を含む固相を与える工程と、
b)前記核酸を前記固相に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記固相を一緒にする工程。
a)選択的に開裂可能な結合(linkage)を介して、核酸結合部分に結合される基質を含む固相を与える工程と、
b)前記核酸を前記固相に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記固相を一緒にする工程。
さらに、次の工程を含む生物学材料または細胞材料のサンプルからの核酸の単離方法を提供する。
a)選択的に開裂可能な結合を介して、核酸結合部分に結合される基質を含む固相を与える工程と、
b)前記核酸を前記固相に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記固相を一緒にする工程と、
c)前記固相から前記サンプルを分離する工程と、
d)随意に前記固相を洗浄する工程と、
e)結合部分を選択的に開裂することにより前記固相から結合核酸を解離する工程。
a)選択的に開裂可能な結合を介して、核酸結合部分に結合される基質を含む固相を与える工程と、
b)前記核酸を前記固相に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記固相を一緒にする工程と、
c)前記固相から前記サンプルを分離する工程と、
d)随意に前記固相を洗浄する工程と、
e)結合部分を選択的に開裂することにより前記固相から結合核酸を解離する工程。
好適な実施形態において、固相は、シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマーおよび不溶性多糖類から選択される基質、並びに、式QR2 +X−(ここでRはC1〜C20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Xはアニオンである)で示される3級スルホニウム基、式NR3 +X−(ここでRはC1〜C20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Xはアニオンである)で示される4級アンモニウム基および式PR3 +X−(ここでRはC1〜C20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Xはアニオンである)で示される4級ホスホニウム基から選択される基質の表面に結合されたオニウム基を含む。
核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと固相を一緒にする工程は、サンプル材料と固相結合材料を混合することを伴い、随意に混合物を機械的に攪拌して、細胞材料を粉砕し固相に核酸を結合させるに有効な時間、サンプルの容積内で固相を均一に分散させる。サンプルの核酸内容物のすべてを固相に結合させる必要はないが、可能な限り多く結合させることが有利である。サンプル/固相混合物の攪拌は、振盪、機械的な振動子あるいはロッカー(rocker)、ボルテキシング(vortexing)、超音波攪拌などを含む任意便宜形態とすることができる。この工程で核酸を結合させるために必要とされる時間は、通常数秒から2,3分のオーダーであるが、日常の実験によって、実験的に立証されうる。
固相からサンプルを分離する工程は、例えば、ろ過、重力沈殿、傾瀉、磁力分離、遠心分離、減圧吸引、および多孔膜またはフィルターマットに液体を強制的に通すための空気または他のガスによる過圧により実施することができる。核酸以外のサンプルの成分は、この工程において除去される。他の成分の除去が完全でない限り、1またはそれ以上の洗浄を行って、それらの完全な除去を助けることができる。塩、生物または細胞の残渣、タンパク質およびヘモグロビンなどのサンプル成分を除去するための洗浄試薬には、水および緩衝剤水溶液があり、界面活性剤を含んでもよい。
固相から結合核酸を解離する工程は、固相から結合核酸を解離させるために溶液と固相材料を接触させることを必要とする。この溶液は、解離した核酸を溶解して、かつ、十分に保護する必要がある。溶液は、pH約7〜9である緩衝剤水溶液を含む試薬組成物であり、随意に0.1〜3Mの緩衝塩、金属ハライドあるいは酢酸塩を含んでいてもよく、随意に0.1〜50%の有機補助溶剤または界面活性剤を含んでいてもよい。
あるいはまた、開裂後の固相から核酸を解離するための試薬は、強アルカリ水溶液でもよい。少なくとも10−4Mの濃度のアルカリ金属水酸化物または水酸化アンモニウムの溶液は、開裂および開裂した固相からの核酸の溶離に効果的である。強アルカリ溶液は、共役結合の切断により開裂または分断されうる基を介して、核酸結合部分が基質に結合する固相結合材料と共に有用である。かかる材料は、以下および前述の出願中の、米国出願番号10/714,763号、10/715,284号および10/891,880号明細書に記載されている。解離工程は室温で実施することができるが、都合のよいいかなる温度も使用することができる。溶離温度は、核酸を単離する本方法の成功に対し重要ではない。周囲温度が好ましいが、若干の場合には、高温により溶離速度を増大させることができる。
固相核酸の捕捉方法は、非常に多くの用途に用いることができる。以下特有の個々の実施例に示すように、一本鎖と二本鎖の核酸の両方が捕捉され、解離されうる。DNA、RNAおよびPNAは捕捉および解離されうる。
本方法の好適な用途は、全血からのDNAの単離である。背景技術の欄で上述したように、全血中の白血球からのDNA抽出も、典型的に扱いにくい多工程プロセスであり、このプロセスは溶液溶解条件下で固体支持体の使用またはオートメーション化を困難にしている。本発明の方法は、従来の方法の限界を克服する。この方法は、操作上簡易であり、固相材料上で核酸内容物を捕捉するための短い時間、固相結合材料と血液サンプルとを混合することのみを必要としている。全体のプロセスは、5分以内に手動で実施することができる。この方法は、固体材料が粒子または微粒子の形態である場合に、特に効果的で迅速である。簡易であり必要とされる時間が短いにもかかわらず、かなりの量の核酸が捕捉される。
これらの方法の重要な利点は、多くの下流の分子生物学プロセスと両立できることである。本方法により単離された核酸は、多くの場合、さらなるプロセスで直接的に使用することができる。PCR、米国特許5,998,175号明細書に記載された多重オリゴマーの連結反応(LMO)およびLCRなどの増幅反応には、かかる核酸の溶離剤を使用することができる。慣用技術による核酸の単離、特に細菌細胞の培養組織から、または血液サンプルからの核酸の単離は、低分子量アルコールを高容積パーセントで加えることによる沈殿を必要とする。次いで、沈殿した材料は、使用する前に、分離され、収集され、かつ、好適な溶媒中に再溶解させなければならない。これらの工程は、本方法を使用する本発明の固相結合材料からの核酸の溶離によって不要にすることができる。解離された核酸を含んでいる溶液を直接的に核酸増幅反応において使用して、核酸またはそれのセグメントの量をポリメラーゼまたはリガーゼ仲介反応を用いて増幅させることは、好ましい実施である。
固相結合材料の広い多様性は、前述の欄に記載されており、非常に多くの特有の典型的な材料が、次の特有の実施例における本方法に示されている。当業者ならば、ここに記載された方法の日常的な応用により、適切な材料を決定することができるであろう。
さらに、本発明は、上述の方法に有用な固相結合材料を有するキットに関する。キットは、固相結合材料と、固相から核酸を解離するための試薬とを含む。キットはまた、他の構成要素、例えば、洗浄緩衝液、希釈液または使用説明書を含む。
固相材料は、溶解溶液の使用または溶解試薬の被覆なしで、生物学材料または細胞材料から直接核酸を捕捉する能力を有する。核酸捕捉のためのその使用は、いかなる予備的な溶解工程をも必要とせず、一工程で生物学材料または細胞材料の核酸内容物を捕捉することを可能にする。一実施形態においては、固相材料は、粒子材料または磁性反応粒子材料である。
実施例:
下記実施例に示された構造式の図は、固相材料の開裂可能な結合部分のみを図示することを意図したものである。図は、固相材料の完全な規定を示すものではない。
下記実施例に示された構造式の図は、固相材料の開裂可能な結合部分のみを図示することを意図したものである。図は、固相材料の完全な規定を示すものではない。
実施例1
4’−ヒドロキシフェニル4−クロロメチル−チオベンゾエートの合成
3Lのフラスコに100.9gの4−クロロメチル−安息香酸と1.2Lの塩化チオニルを入れた。反応では4時間還流し、その後、塩化チオニルを減圧下で除去した。塩化チオニル残留物を、CH2Cl2の添加、および減圧下での蒸発により除去した。
4’−ヒドロキシフェニル4−クロロメチル−チオベンゾエートの合成
3Lのフラスコに100.9gの4−クロロメチル−安息香酸と1.2Lの塩化チオニルを入れた。反応では4時間還流し、その後、塩化チオニルを減圧下で除去した。塩化チオニル残留物を、CH2Cl2の添加、および減圧下での蒸発により除去した。
113.1gの4−クロロメチル安息香酸クロライドの入った3Lフラスコに、98.17gの4−ヒドロキシ−チオフェノールと1.5LのCH2Cl2を加えた。アルゴンでパージし、67.75mLのピリジンを加えた。一晩攪拌後、反応混合物を1LのCH2Cl2で希釈し、全量5Lの水で抽出した。水相はCH2Cl2で逆抽出した。混合したCH2Cl2溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、固形物になるまで濃縮した。固形物を500mLのCH2Cl2で洗浄し、ろ過し、風乾した。1H NMR(アセトン−d6):δ4.809(s,2H),6.946−6.968(d,2H),7.323−7.346(d,2H),7.643−7.664(d,2H),8.004−8.025(d,2H)。
実施例2
トリブチルホスホニウム基と開裂可能なアリールチオエステル結合を含有し、ポリメタクリレート結合部分により官能化された磁性シリカ粒子の合成
トリブチルホスホニウム基と開裂可能なアリールチオエステル結合を含有し、ポリメタクリレート結合部分により官能化された磁性シリカ粒子の合成
磁性カルボン酸により官能化されたシリカ粒子(ケミセル社,SiMAG−TCL,1.0meq/g,1.5g)を20mLの塩化チオニル中にいれ、4時間還流した。過剰の塩化チオニルを減圧下で除去した。樹脂を25mLのCHCl3に再懸濁し、懸濁液を超音波により分散させた。溶媒を蒸発させ、超音波洗浄処理を繰り返した。粒子をさらなる使用のため、減圧下で乾燥させた。
酸塩化物により官能化された粒子を388mgのジイソプロピルエチルアミンと共に38mLのCH2Cl2中で懸濁した。4’−ヒドロキシフェニル4−クロロメチルチオベンゾエート(524mg)を加え、密閉反応フラスコ中で一晩振盪機にて振盪した。粒子を50mLのプラスチック製試験管に移し、磁性分離にて、CH2Cl2、CH3OH、1:1 CH2Cl2/CH3OH、次いでCH2Cl2で繰り返し洗浄した。未反応の可溶性出発材料の除去のため、洗浄液をTLCにてモニターした。さらなる使用の前に、固形物を風乾した。
アルゴン雰囲気中で、樹脂(1.233g)を20mLのCH2Cl2に懸濁した。トリブチルホスフィン(395mg)を加え、スラリーを7日間振盪した。粒子を50mLのプラスチック製試験管に移し、40mLのCH2Cl2で4回、次いで40mLのMeOHで4回、40mLのCH2Cl2で4回、洗浄した。次いで、樹脂を風乾し、1.17gのライトブラウンの固形物を得た。
実施例3
トリブチルホスホニウム基を含有する開裂可能な結合部分により官能化されたシリケート結合部分の合成
トリブチルホスホニウム基を含有する開裂可能な結合部分により官能化されたシリケート結合部分の合成
13mLのエタノールと75mLのヘプタン中の3−アミノプロピルトリエトキシシラン(13.2mL)の溶液をアルゴン雰囲気中に置き、5.5gの無水コハク酸と共に攪拌した。反応は4.5時間還流し、その後、一晩室温で冷却した。溶媒を除去し、透明のオイルとしてアミド生成物を得た。
5.5gの4’−ヒドロキシ−フェニル4−クロロメチルベンゾエート(実施例1)を加える前に、100mLのCH2Cl2中のEDC塩酸塩(4.0g)と上記生成物2.86gの溶液をアルゴン雰囲気下に置き、1時間攪拌した。反応は一晩攪拌することにより行った。反応混合物を150gのシリカを用いクロマトグラフにかけて、1〜2%のEtOH/CH2Cl2で溶離し、白色の固形物としてカップリングした生成物1.84gを得た。
実施例4
トリブチルホスホニウム基を含有する開裂可能な結合部分により官能化されたシリカ粒子の合成
トリブチルホスホニウム基を含有する開裂可能な結合部分により官能化されたシリカ粒子の合成
アルゴン雰囲気下で、50mLの乾燥トルエン中の実施例3の生成物(1.84g)を、オーブンで乾燥させた3.83gのシリカの入ったフラスコにカニューレを介して加えた。反応は、一晩還流した。室温に冷却した後、シリカをろ過し、500mLのCH2Cl2で洗浄し、4時間減圧乾燥させた。
50mLのCH2Cl2中のクロロベンジル末端基を有する誘導体化されたシリカ(2.0g)を8.0gのトリブチルホスフィンと混合した。反応混合物をアルゴン雰囲気下で2日間攪拌した。シリカをろ過し、CH2Cl2とヘキサンで洗浄し数時間減圧乾燥した。
実施例5
トリブチルホスホニウム基を含有する開裂可能な結合部分により被覆された磁性粒子の合成
トリブチルホスホニウム基を含有する開裂可能な結合部分により被覆された磁性粒子の合成
実施例3のシリケート結合部分(0.25g)を0.5gのFe3O4粒子と、還流トルエン中、アルゴン雰囲気下で一晩攪拌して反応させた。冷却後、固形物とトルエン溶液を50mLの遠心管に移した。固形物を外部磁石で誘引し、トルエンをデカントし、固形物をトルエンで3回、CH2Cl2で3回洗浄した。
前工程の粒子(0.40g)を25mLのCH2Cl2中に懸濁した。トリブチルホスフィン(1.6g)をこの懸濁液に加え、1.5日間オービタルシェーカー(orbital shaker)にかける前に、容器を密栓した。固形物につき上述の磁性洗浄を行い、黒色の粉体を得た。
実施例6
トリブチルホスホニウム基を含有する開裂可能な結合部分により被覆された磁性シリカ粒子の合成
開裂可能な核酸結合基をシリカ粒子の表面上に受動的に吸着させることで、核酸結合材料を調製した。
トリブチルホスホニウム基を含有する開裂可能な結合部分により被覆された磁性シリカ粒子の合成
開裂可能な核酸結合基をシリカ粒子の表面上に受動的に吸着させることで、核酸結合材料を調製した。
ステアリン酸(1.33g)を10mLのSOCl2中で2時間還流した。過剰のSOCl2を減圧下で除去し、褐色の液体としてステアロイルクロライドを生成した。
ステアロイルクロライドを10mLのCH2Cl2に溶解し、30mLのCH2Cl2中の、実施例1に記載のように調製された4’−ヒドロキシフェニル4−クロロメチルチオベンゾエート1.0gおよび1.56mLのジイソプロピルエチルアミンの溶液に加え、混合物を一晩攪拌した。溶媒を除去し、残留物を、1:1のヘキサン/CH2Cl2を溶離剤として用いて、カラムクロマトグラフィーに供した。ステアロイルエステル(1.43g)を、白色の固形物として単離した。
30mLのCH2Cl2中の上記生成物(1.43g)およびトリブチルホスフィン(1.27mL)の溶液をアルゴン雰囲気下で2日間攪拌した。CH2Cl2除去後、残留物を6×50mLのエーテルで洗浄し、CH2Cl2に再溶解し、エーテルで沈殿して、1.69gのホスホニウム塩生成物を生成した。この材料は水に不溶であることがわかった。
このホスホニウム塩(0.6g)を6mLのCH2Cl2に溶解し、6.0gのシリカゲルに攪拌しながら加えた。溶媒を蒸発させ、核酸結合材料を得た。
実施例7
ポリビニルベンジルトリブチルホスホニウム基を含有する重合層を有する磁性粒子の合成
ポリビニルベンジルトリブチルホスホニウム基を含有する重合層を有する磁性粒子の合成
磁性メリフィールドペプチド樹脂(ケミセル社 SiMag クロロメチル,100mg)をガラスバイアル中で2mLのCH2Cl2に加えた。トリブチルホスフィン(80μL)を加え、そのスラリーを室温で3日間振盪した。バイアルの下に磁石を設置し、ピペットで、上澄みを除去した。固形物を2mLのCH2Cl2で4回洗浄した(洗浄液もまた磁石/ピペットの手順で除去した)。樹脂を風乾した(93mg)。
実施例8
トリブチルホスホニウム基と開裂可能なアリールチオエステル結合を含有するポリメタクリレートポリマー粒子の合成
トリブチルホスホニウム基と開裂可能なアリールチオエステル結合を含有するポリメタクリレートポリマー粒子の合成
ポリ(メタクリロイルクロライド)粒子(1.0meq/g,1.5g)を2.45gのジイソプロピルエチルアミンを含む75mLのCH2Cl2に加えた。トリエチルアミン(1.2g)を加えた。4’−ヒドロキシフェニル4−クロロメチルチオベンゾエート(4.5g)を加え、密閉した反応混合物を室温で一晩攪拌した。そのスラリーをろ過し、樹脂を10mLのCH2Cl2、200mLのアセトン、200mLのMeOH、2×100mLの1:1のTHF/CH2Cl2、250mLのTHF、250mLのCH2Cl2、250mLのヘキサンで洗浄した。樹脂はさらなる使用のため風乾した。
樹脂(1.525g)をアルゴン雰囲気下で25mLのCH2Cl2中で懸濁した。トリブチルホスフィン(1.7g)を加え、そのスラリーを4日間攪拌した。樹脂をろ過して、225mLのCH2Cl2で4回、続いて175mLのヘキサンで洗浄した。樹脂をその後風乾し、1.68gの固形物を得た。
実施例9
トリブチルホスホニウム基を含有するポリスチレンポリマーの合成
トリブチルホスホニウム基を含有するポリスチレンポリマーの合成
架橋結合したクロロメチル化ポリスチレンであるメリフィールドペプチド樹脂(シグマ社,1.1meq/g,20.0g)をアルゴン雰囲気下で200mLのCH2Cl2/DMF(50/50)中で攪拌した。過剰のトリブチルホスフィン(48.1g,10当量)を加え、そのスラリーを7日間室温で攪拌した。そのスラリーをろ過し、得られた固形物を200mLのCH2Cl2で2回洗浄した。樹脂を減圧下で乾燥した(21.5g)。元素分析:実測値P 2.52%,Cl 3.08%,期待値 P 2.79%,Cl 3.19%:P/Cl比は0.94
実施例10
トリブチルアンモニウム基を含有するポリスチレンポリマーの合成
トリブチルアンモニウム基を含有するポリスチレンポリマーの合成
メリフィールドペプチド樹脂(オールドリッチ社、1.43meq/g,25.1g)をアルゴン雰囲気下で150mLのCH2Cl2中で攪拌した。過剰のトリブチルアミン(25.6g,4当量)を加え、そのスラリーを室温で、8日間攪拌した。スラリーをろ過し、得られた固形物を250mLのCH2Cl2で2回洗浄した。樹脂を減圧下で乾燥した(28.9g)。元素分析:実測値 N 1.18% Cl 3.40%;期待値 N 1.58% Cl 4.01%:N/Cl比 0.88
実施例11
トリブチルホスホニウム基により官能化されたシリカ粒子の合成
トリブチルホスホニウム基により官能化されたシリカ粒子の合成
1時間、110℃でアルゴン雰囲気下にて乾燥させたシリカゲル(4.82g)を2.79gのEt3Nと共に50mLのCH2Cl2に加えた。混合物を20分間攪拌し、その後、2.56gの3−ブロモプロピルトリクロロシランを加え、発熱を生じさせた。混合物を24時間攪拌し、ろ過し、固形物を3×40mLのCH2Cl2、4×40mLのMeOHおよび2×40mLのCH2Cl2で順次洗浄した。固形物を一晩風乾し、6.13gを得た。
50mLのCH2Cl2中の上記により調製した官能化されたシリカ(5.8g)を5.33mLのトリブチルホスフィンと10日間攪拌した。混合物をろ過し、固形物を7×50mLのアセトンで洗浄した。風乾して、5.88gの生成物を得た。
実施例12
実施例6のNAB材料中の結合部分の制御された開裂
実施例6の被覆されたシリカ材料(70mg)を1.0mLのD2Oに懸濁させ、3分間ボルテクシング(vortexing)により混合した。1H NMRによる水溶液の分析では、溶液中への材料の解離は見られなかった。
実施例6のNAB材料中の結合部分の制御された開裂
実施例6の被覆されたシリカ材料(70mg)を1.0mLのD2Oに懸濁させ、3分間ボルテクシング(vortexing)により混合した。1H NMRによる水溶液の分析では、溶液中への材料の解離は見られなかった。
40μLの40%NaODにてシリカ懸濁液を処理し、3分間ボルテックスし、上澄みをNMRにて分析すると、結合部分の開裂とシリカから溶液中への解離がみられた。
実施例13
シロキサン被覆されたマグネタイトの合成
100mLの無水エタノール中の1.00gのマグネタイト(アルファ アエサー(Alfa Aesar))を、3.2mLのTEOS、3.32gのCsFおよび1.0mLの水とアルゴン雰囲気下で2時間還流で反応させた。冷却した反応混合物をデカントし、固形物をエタノールで4回、CH2Cl2で5回磁性的に洗浄した。アルゴン雰囲気下で固形物を乾燥させ、3.14gの固形物を得た。この材料1.0gを5×50mLの脱イオン水および5×50mLのメタノールで順次洗浄した。乾燥させて0.67gの固形物を得た。
シロキサン被覆されたマグネタイトの合成
100mLの無水エタノール中の1.00gのマグネタイト(アルファ アエサー(Alfa Aesar))を、3.2mLのTEOS、3.32gのCsFおよび1.0mLの水とアルゴン雰囲気下で2時間還流で反応させた。冷却した反応混合物をデカントし、固形物をエタノールで4回、CH2Cl2で5回磁性的に洗浄した。アルゴン雰囲気下で固形物を乾燥させ、3.14gの固形物を得た。この材料1.0gを5×50mLの脱イオン水および5×50mLのメタノールで順次洗浄した。乾燥させて0.67gの固形物を得た。
実施例14
ポリビニルベンジルトリブチルホスホニウム基を含有する磁性粒子の合成
1.0gの酸化鉄を100mLのエタノール中に超音波浴を用いて分散した。反応容器に1.50mLのTEOS、1.65gのp−(クロロメチル)フェニルトリメトキシシラン(Gelest)、3.32gのフッ化セシウムおよび1.0mLの脱イオン水を加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下で2時間、還流中攪拌した。混合物を室温に冷却し、溶媒をデカントし、固形物を磁性的にエタノールで5回、CH2Cl2で5回洗浄した。固形物をアルゴン気流で乾燥させ、2.96gの生成物を得た。
ポリビニルベンジルトリブチルホスホニウム基を含有する磁性粒子の合成
1.0gの酸化鉄を100mLのエタノール中に超音波浴を用いて分散した。反応容器に1.50mLのTEOS、1.65gのp−(クロロメチル)フェニルトリメトキシシラン(Gelest)、3.32gのフッ化セシウムおよび1.0mLの脱イオン水を加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下で2時間、還流中攪拌した。混合物を室温に冷却し、溶媒をデカントし、固形物を磁性的にエタノールで5回、CH2Cl2で5回洗浄した。固形物をアルゴン気流で乾燥させ、2.96gの生成物を得た。
前工程の粒子(0.50g)を20mLのCH2Cl2に懸濁した。トリブチルホスフィン(0.5mL)を懸濁液に加え、オービタルシェーカーで一晩振盪する前に容器を密閉した。固形物をCH2Cl2で5回、磁性的に洗浄した。アルゴン気流にて固形物を乾燥し、0.48gの生成物を得た。
実施例15
官能化されたシロキサン−被覆マグネタイトの合成
200mLの無水エタノール中のマグネタイト(アルファ アエサー)1.00gを3.0mLの3−(トリエトキシシリル)−ピロピオニトリル、3.32gのCsFおよび1.0mLの水とアルゴン雰囲気下で2時間還流にて反応させた。冷却した混合反応物をデカントし、固形物をエタノールで4回、CH2Cl2で5回、磁性的に洗浄した。アルゴン雰囲気下で固形物を乾燥し、2.46gの固形物を得た。
官能化されたシロキサン−被覆マグネタイトの合成
200mLの無水エタノール中のマグネタイト(アルファ アエサー)1.00gを3.0mLの3−(トリエトキシシリル)−ピロピオニトリル、3.32gのCsFおよび1.0mLの水とアルゴン雰囲気下で2時間還流にて反応させた。冷却した混合反応物をデカントし、固形物をエタノールで4回、CH2Cl2で5回、磁性的に洗浄した。アルゴン雰囲気下で固形物を乾燥し、2.46gの固形物を得た。
実施例16
官能化されたシロキサン−被覆、制御ポアガラスの合成
アルゴン雰囲気下、50mLの乾燥トルエン中の実施例2のシリケート結合部分(1.84g)をカニューレを介して、3.83gのオーブンで乾燥させた制御ポアガラス(プライム シンセシス ネイティブ(Prime Synthesis native))CPG(0.5g)が入ったフラスコに加えた。反応は一晩還流させた。室温に冷却した後、ガラスをろ過し、500mLのCH2Cl2で洗浄し、4時間減圧乾燥した。
官能化されたシロキサン−被覆、制御ポアガラスの合成
アルゴン雰囲気下、50mLの乾燥トルエン中の実施例2のシリケート結合部分(1.84g)をカニューレを介して、3.83gのオーブンで乾燥させた制御ポアガラス(プライム シンセシス ネイティブ(Prime Synthesis native))CPG(0.5g)が入ったフラスコに加えた。反応は一晩還流させた。室温に冷却した後、ガラスをろ過し、500mLのCH2Cl2で洗浄し、4時間減圧乾燥した。
50mLのCH2Cl2中のクロロベンジル末端基を有する誘導体化したガラス(2.0g)を8.0gのトリブチルホスフィンと混合した。反応混合物を2日間アルゴン雰囲気下で攪拌した。ガラスをろ過し、CH2Cl2、およびヘキサンで洗浄し、数時間減圧乾燥した。
実施例17A
官能化された磁性ポリスチレンの合成
官能化された磁性ポリスチレンの合成
アミン官能化された磁性ポリスチレンビーズ(スフェロテック(Spherotech))の懸濁水溶液(4×1mLで1mLあたり25mgを含む)をとり、2本の1.5mLの試験管に加えた。上澄みを除きビーズを3×1mLの0.1M MES緩衝液、pH4.0、で洗浄した。それぞれの試験管に600μLのMES緩衝液、28mgのEDC(0.147mmol)および300μLのDMF中の50mgの4−クロロメチル安息香酸(0.174mmol)の溶液を加えた。1日攪拌後、試験管を1時間、超音波処理して、磁気ラック(magnetic rack)に保管した。反応混合物を2本の50mLの試験管に移し、H2Oで40mLに希釈した。ビーズを水(4×40mL)、1:1CH3OH:H2O(40mL)およびCH3OH(3×40mL)で磁性的に洗浄し、試験管内で乾燥した。
上記固形物(90mg)を1.5mL試験管に入れ、800μLのCH3OHを加えた。200μLのCH3OH中の30mgのPBu3の溶液をこの懸濁液に加えた。反応混合物を30分間超音波処理し、室温で攪拌した。9日間攪拌後、磁石上に保持して上澄みを除去した。ビーズを水(4×1mL)、CH3OH(4×1mL)、および水(1×1mL)で、磁性的に洗浄した。ついで、1mLの水をビーズに加え、10mg/mLの保存懸濁液を作製した。
実施例17B
官能化された磁性ポリスチレンの別の合成
30mLのアセトン中の3.00mLのトリブチルホスフィン(12.0mmol)と1.00gの4−クロロメチル安息香酸(5.86mmol)の溶液をアルゴン雰囲気下で一晩攪拌し、1H NMRにより4−カルボキシ−ベンジルトリブチルホスホニウムクロライドと同定される白色の沈殿物を生成した。固形物をろ過収集し、アセトンで洗浄し、その後へキサンで洗浄した。収量2.19g,89%であった。
官能化された磁性ポリスチレンの別の合成
30mLのアセトン中の3.00mLのトリブチルホスフィン(12.0mmol)と1.00gの4−クロロメチル安息香酸(5.86mmol)の溶液をアルゴン雰囲気下で一晩攪拌し、1H NMRにより4−カルボキシ−ベンジルトリブチルホスホニウムクロライドと同定される白色の沈殿物を生成した。固形物をろ過収集し、アセトンで洗浄し、その後へキサンで洗浄した。収量2.19g,89%であった。
アミン官能化された磁性ポリスチレンビーズ(スフェロテック)の懸濁水溶液(2×1mLで1mLあたり25mgを含む)をとり、2本の1.5mLの試験管に加えた。上澄みを除き、ビーズを3×1mLの0.1M MES緩衝液、pH4.0で洗浄した。それぞれの試験管に、600μLのMES緩衝液と、200μLのDMF/200μLのMES緩衝液中の30mgの4−カルボキシ−ベンジルトリブチルホスホニウムクロライド(80μmol)の溶液およびEDC(15mg、78μmol)を加えた。試験管を30分間超音波処理し、1日振盪した。磁石上に保持して上澄みを除去した。ビーズを水(4×1mL)、CH3OH(4×1mL)、および水(1mL)で磁性的に洗浄し、ついで、水を加え、100mg/mLの保存懸濁液を作製した。
実施例18
官能化された磁性ポリスチレンの合成
官能化された磁性ポリスチレンの合成
30mLのアセトン中の1.0gの4’−アミノフェニル4−クロロメチル−ベンゼンチオカルボキシレート(4−クロロメチル安息香酸と4−アミノチオフェノールのEDCカップリングにより調製)の溶液と2.0gのトリブチルホスフィンをアルゴン雰囲気下で一晩攪拌した。生成した沈殿物をろ過し、アセトンおよびヘキサンで洗浄した。ホスホニウム塩の収量は1.41g,82%であった。
100mg/mLの懸濁液からの1mLの磁性カルボキシル化ポリスチレン樹脂をデカントし、固形物を3×1.0mLの0.1M MES緩衝液、pH4.0、で洗浄した。前工程の生成物(50mg)を400μLのDMFと400μLのMES緩衝液に溶解した。この溶液を200μLのMES緩衝液中のビーズの懸濁液に加えた。次いで、28mgのEDCを加え、懸濁液を30分間超音波処理し、振盪した。1日攪拌の後、反応混合物を除去した。ビーズを4×1mLのH2O、4×1mLのCH3OH、1×1mLのH2Oで磁性的に洗浄した。ビーズをH2Oに懸濁させた(100mg/mL)。
実施例19
官能化された磁性ポリスチレンの合成
官能化された磁性ポリスチレンの合成
100mg/mLの磁性カルボキル化ポリスチレン樹脂の懸濁液の1mLから上澄みを除き、固形物を3×1mLの0.1M MES緩衝液、pH4.0、で洗浄した。ビーズを800μLのMESに懸濁させ、200μLのMES緩衝液中の63mgの1,4−ジアミノブタンの溶液を加えた。EDC(28mg,0.147mmol)を加え、ビーズを30分間超音波処理し、次いで、室温で攪拌した。反応混合物を磁性的にビーズから分離した。ビーズをその後、4×1mLの水および4×1mLのMES緩衝液で、磁性的に洗浄した。
50mgの4−カルボキシベンジルトリブチルホスホニウムクロライド(0.134mmol)を400μLのDMF/MES緩衝液1:1混合物に溶解し、600μLのMES緩衝液中の上記ビーズの懸濁液に加えた。試験管を30分間超音波処理し、振盪した。1日攪拌の後、溶液をデカントし、ビーズを水(4×1mL)で、CH3OH(4×1mL)で、水(1mL)で磁性的に洗浄し、水を加えて100mg/mLの保存懸濁液を調製した。
実施例20
静電気的に結合したホスホニウム基を有する磁性ポリマーの合成
静電気的に結合したホスホニウム基を有する磁性ポリマーの合成
100mg/mLの磁性カルボキル化ポリスチレン樹脂の懸濁液の1mLから上澄みを除いた。ビーズを1mLの0.1M NaOHで5分間攪拌した。溶液をデカントした後、ビーズを1mLの水で洗浄した。400μLの水中の20mgのプラスエンハンサー(Plus Enhancer)(登録商標)(米国特許5,451,437号明細書の記載に基づき調製)の溶液をビーズに加え、混合物を5分間振盪した。上澄みを除いた後、ビーズを3×1mLの水で洗浄し、水を加えて100mg/mLの保存懸濁液を調製した。
実施例21
官能化された磁性ポリマーの合成
官能化された磁性ポリマーの合成
25mgの固形物を含むビーズ(ダイナル(Dynal)マグネチック COOH ビーズ,Cat.No G03810)のアリコートを、磁石を用いてデカントした。次いで、一晩乾燥させる前に、ビーズを3×1mLの水、および3×1mLのCH3CNで洗浄した。ビーズを800μLのCH2Cl2に懸濁し、15mgのEDC(78μmol)に加えた。200μLのDMF中の実施例1の化合物(30mg)の溶液を混合物に加えた。30分間試験管を超音波処理し、一晩振盪した。上澄みを除き、ビーズを4×1mLのCH2Cl2、1mLの1:1のMeOH:CH2Cl2、3×1mLのMeOH、および4×1mLのCH2Cl2で、磁性的に洗浄した。ビーズを一晩風乾した。
ビーズを1mLのCH2Cl2に懸濁させ、30μLのトリブチルホスフィンを加えた。反応混合物を30分間超音波処理し、合計で5日間振盪した。磁石上に保持して溶媒をデカントした。ビーズを4×1mLのCH2Cl2、3×1mLのCH3OH、および2×1mLの水で、磁性的に洗浄した。1mLの水を加えて、ビーズの保存溶液(25mg/mL)を調製した。
実施例22
官能化された磁性ポリマーの合成
官能化された磁性ポリマーの合成
ダイナルトシル活性化ビーズ(Dynal tosyl activated beads)のアリコート(1mLの97.5mg/mL保存溶液、CAT.No.F68710)を1.5mLの試験管にいれ、磁気ラックを用いて、溶媒を除去した。ビーズを2×1mLの水、および5×1mLのCH3OHで洗浄した。トリブチルホスフィン(100μL)を1mLのCH3OH懸濁液中のビーズに加えた。試験管を室温で振盪した。9日後、上澄みを、磁石を用いて除いた。ビーズを4×1mLの水、4×1mLのCH3OH、および1mLの水で洗浄した。次いで、1mLの水をビーズに加えて、100mg/mLの保存溶液を調製した。
実施例23
粒子に非共有結合したトリブチルホスホニウム基を含有する開裂可能な結合部分を有する磁性ポリマー粒子の合成
粒子に非共有結合したトリブチルホスホニウム基を含有する開裂可能な結合部分を有する磁性ポリマー粒子の合成
磁性カルボキル化ポリスチレン粒子の保存溶液(100mg/mL)から、ラック上の1.5mLの試験管に500μLとり、上澄みを除去した。ビーズを3×500μLの水および4×500μLのMeOHで洗浄した。上述した化合物10mgを100μLのCH3OHに溶解し、ビーズに加え、溶媒を大気中に蒸発させた。
実施例24
ポリメタクリレート結合部分により官能化され、トリス(カルボキシエチル)ホスホニウム基と開裂可能なアリールチオエステル結合を含有する磁性シリカ粒子の合成
ポリメタクリレート結合部分により官能化され、トリス(カルボキシエチル)ホスホニウム基と開裂可能なアリールチオエステル結合を含有する磁性シリカ粒子の合成
磁性カルボン酸により官能化されたシリカ粒子(ケミセル社,SiMAG−TCL,1.0meq/g,1.5g)を、最終工程を除いて実施例2に記載されているように官能化した。この材料(116.5mg)を10mLのCH2Cl2に3分間超音波処理により懸濁した。トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(66.8mg)と32μLのトリエチルアミンを加え、スラリーを7日間振盪した。粒子をフラスコに移し、20mLのCH2Cl2で3回洗浄し、次いで、20mLのMeOHで4回洗浄し、20mLのCH2Cl2で2回洗浄した。固形物をその後風乾し、109mgの材料を得た。
実施例25
官能化された磁性ポリメタクリレート粒子の合成
官能化された磁性ポリメタクリレート粒子の合成
40mLのSera−Mag 磁性カルボキシレート−変性微粒子懸濁液(セラディン(Seradyn))からの磁性粒子を磁性的に収集し、上澄みをデカントした。粒子を4×50mLのタイプIの水、次いで4×50mLのアセトニトリルで、磁性的に洗浄した。最終洗浄後、粒子を乾燥させ、1.93gの褐色の固形物を得た。
100mLの丸底フラスコに1.02gの粒子、0.2899g(1.5mmol)のEDC、0.5058g(1.8mmol)の実施例1の結合部分、および50mLのCH2Cl2を加えた。混合物を10分間超音波処理し、均質性を確保するために定期的に5分間超音波処理を行って、オービタルシェーカーで11日間攪拌した(170rpm)。生成物を磁性的に収集し、固形物を4×50mLのCH2Cl2、50mLの1:1 CH2Cl2/MeOH、4×50mLのMeOH、50mLの1:1 CH2Cl2/MeOH、および4×50mLのCH2Cl2で磁性的に洗浄した。固形物を乾燥し、0.951gの褐色の固形物を得た。
50mLの丸底フラスコに0.8993gの上記材料と20mLのCH2Cl2を加えた。混合物を5分間超音波処理し、0.24g(1.2mmol)のトリブチルホスフィンを加えた。この添加の後、混合物を更に15分間超音波処理して、定期的に超音波処理を行いながら7日間オービタルシェーカーにて攪拌した。その後、生成物を磁性的に収集し、4×50mLのCH2Cl2、50mLの1:1 CH2Cl2/MeOH、4×50mLのMeOH、50mLの1:1 CH2Cl2/MeOH、および4×50mLのCH2Cl2で洗浄した。この固形物を乾燥し、褐色の固形物0.8801gを得た。
実施例26
予め生成したポリマーへの酸化鉄の包含による磁性官能化させたポリマーの合成
1.00gの実施例9のポリマー生成物と0.2gの酸化鉄の混合物を20mLのCH2Cl2を加える前に均質になるよう混合した。混合物を15分超音波処理し、100mLのヘキサンで希釈し、ろ過した。収集した固形物を200mLのアセトンおよび400mLの水で色落ちがなくなるまで洗浄し、次いで、200mLのアセトンで洗浄した。固形物を4×40mLのアセトンで、磁性的に洗浄した。固形物をろ過により収集し、アセトンで洗浄し、乾燥した。顕微鏡で観察した際に、非常に少量の遊離マグネタイトのみが観察される固形物0.7gを得た。
予め生成したポリマーへの酸化鉄の包含による磁性官能化させたポリマーの合成
1.00gの実施例9のポリマー生成物と0.2gの酸化鉄の混合物を20mLのCH2Cl2を加える前に均質になるよう混合した。混合物を15分超音波処理し、100mLのヘキサンで希釈し、ろ過した。収集した固形物を200mLのアセトンおよび400mLの水で色落ちがなくなるまで洗浄し、次いで、200mLのアセトンで洗浄した。固形物を4×40mLのアセトンで、磁性的に洗浄した。固形物をろ過により収集し、アセトンで洗浄し、乾燥した。顕微鏡で観察した際に、非常に少量の遊離マグネタイトのみが観察される固形物0.7gを得た。
実施例27
官能化された制御ポアガラスの調製
0.5gのnative制御ポアガラス(プライム シンセシス アストン(Prime Synthesis,Aston),PA 18−50メッシュ,500Åポアサイズ)を実施例3のトリエトキシシラン結合部分(0.25g、0.43mmol)と50mLの無水トルエンと一緒にした。混合物を18時間アルゴン雰囲気下で還流した。室温に冷却後、ガラス粒子を吸引ろ過にて単離し、0.2Lのトルエンおよび0.2LのCH2Cl2で洗浄した。一晩風乾後、0.52gのガラス粒子を得た。
官能化された制御ポアガラスの調製
0.5gのnative制御ポアガラス(プライム シンセシス アストン(Prime Synthesis,Aston),PA 18−50メッシュ,500Åポアサイズ)を実施例3のトリエトキシシラン結合部分(0.25g、0.43mmol)と50mLの無水トルエンと一緒にした。混合物を18時間アルゴン雰囲気下で還流した。室温に冷却後、ガラス粒子を吸引ろ過にて単離し、0.2Lのトルエンおよび0.2LのCH2Cl2で洗浄した。一晩風乾後、0.52gのガラス粒子を得た。
上記ガラス粒子0.450gと、10mLのCH2Cl2と、PBu3(0.91g,4.5mmol)を一緒にした。混合物を室温にてロータリーオービタルシェーカーに設置し、3日間振盪した。ガラス粒子を吸引ろ過により単離し、0.2LのCH2Cl2、0.2LのMeOH、および0.3LのCH2Cl2で順次洗浄した。一晩風乾後、0.454gのガラス粒子を得た。
同様な手順で、120〜200メッシュ、ポアサイズ500または1000Åを有するCPGについて行った。
実施例28
官能化された焼結ガラスの調製
4つの小さな焼結ガラスフィルター(ca.35mg ea,R&H Filter Co.)を20%NaOH水溶液,1N HCl,水,およびMeOHで順次前処理した。乾燥後、フリット(frit)を実施例3のトリエトキシシラン(0.32g,0.55mmol)、10mLのトルエン、および10μLのH2Oと一緒にした。混合物をアルゴン雰囲気下で16時間還流した。室温に冷却後、フリットを除き、CH2Cl2、MeOH、およびCH2Cl2で順次洗浄した。
官能化された焼結ガラスの調製
4つの小さな焼結ガラスフィルター(ca.35mg ea,R&H Filter Co.)を20%NaOH水溶液,1N HCl,水,およびMeOHで順次前処理した。乾燥後、フリット(frit)を実施例3のトリエトキシシラン(0.32g,0.55mmol)、10mLのトルエン、および10μLのH2Oと一緒にした。混合物をアルゴン雰囲気下で16時間還流した。室温に冷却後、フリットを除き、CH2Cl2、MeOH、およびCH2Cl2で順次洗浄した。
上記ガラスフィルターを10mlのCH2Cl2およびPBu3(0.20g,0.99mmol)と一緒にした。混合物を室温にてロータリーオービタルシェーカーに設置し、7日間振盪した。フィルターを除き、CH2Cl2、MeOH、およびCH2Cl2で順次洗浄した。
実施例29
アクリジニウムアミドにより官能化されたシリカゲルの調製
アクリジニウムアミドにより官能化されたシリカゲルの調製
3−アミノプロピルシリカゲルは、市場で得られ(シリサイクル,キュービック(Silicycle,Quebec),カナダ)、または、トルエン中で過剰の3−アミノプロピルトリエトキシシランと“シリカゲル(silica gel)60”を一晩還流することによっても得られる。3−アミノプロピル誘導体化シリカゲル(1.00g,loading ca.1mmol/g)をアルゴン雰囲気下でCH2Cl2(15mL)に懸濁した。N,N−ジイソプロピルエチルアミン(1.5mL,8.61mmol)をシリンジを介して加え、次いで、アクリジン9−アシッドクロライド(360mg,1.49mmol)を加えた。混合物をロータリーオービタルシェーカーに設置し、室温で2時間振盪した。暗褐色の反応生成物を焼結ガラス漏斗(funnel)にて吸引ろ過し、CH2Cl2(0.2L)、20%(v/v)のMeOH:CH2Cl2(0.2L)、およびCH2Cl2(0.25L)で順次洗浄した。風乾後、粉末状の固形物1.16gを得た。
上記により調製した材料(1.00g)をCH2Cl2(15mL)中に懸濁し、かき混ぜて固形物を分散した。メチルトリフレート(Methyltriflate)(0.17mL,1.5mmol)を加え、ゴム隔膜(septum)で栓をして反応させた。混合物をロータリーオービタルシェーカーに設置し、室温で16時間振盪した。得られた混合物を焼結ガラス漏斗で吸引ろ過し、CH2Cl2(0.2L)、MeOH(0.2L)、およびCH2Cl2(0.25L)で順次洗浄した。風乾後、1.02gの粉末状の固形物を得た。
実施例30
官能化されたシリカゲルの調製
官能化されたシリカゲルの調製
30mLのCH2Cl2中の2.00gの2−(3−トリエトキシシリルプロピル)無水コハク酸と1.82gの4’−アミノフェニル4−クロロメチル−ベンゼンチオカルボキシレートの溶液を室温で一晩攪拌した。溶媒を蒸発させ、3.8gのワックス状の固形物を得た。この固形物を170mLのトルエン中で、1.0gのシリカと混合し、70℃に加熱し、16時間攪拌した。冷却後、黄色の固形物をろ過し、アセトン(5×50mL)、CH2Cl2(5×50mL)、MeOH(5×50mL)、およびCH2Cl2(2×50mL)で順次洗浄した。風乾後、3.02gの黄色の固形物を得た。
100mLのCH2Cl2中の2.00gの上記材料の懸濁液を5分間超音波処理し、アルゴン雰囲気下に置き、1.40mLのトリブチルホスフィンで処理した。この混合物を7日間攪拌し、ろ過し、CH2Cl2(4×50mL)、MeOH(4×50mL)、およびCH2Cl2(4×50mL)で順次洗浄した。風乾後、2.04gの黄色の固形物を得た。
実施例31
ヒト全血からのDNAの捕捉
10mgの粒子を試験管中で、70μLのヒトの全血と混合した。試験管を15秒間ボルテックス(vortex)し、室温で5分置き、再び15秒間ボルテックスした。混合物を300μLの10mMトリス緩衝液、pH8.0、で希釈し、液体を粒子から、磁性反応粒子を用いた場合は磁石を用いて除去した。磁性分離は、Dynal MPC−5 磁気ラックを用いて行った。
ヒト全血からのDNAの捕捉
10mgの粒子を試験管中で、70μLのヒトの全血と混合した。試験管を15秒間ボルテックス(vortex)し、室温で5分置き、再び15秒間ボルテックスした。混合物を300μLの10mMトリス緩衝液、pH8.0、で希釈し、液体を粒子から、磁性反応粒子を用いた場合は磁石を用いて除去した。磁性分離は、Dynal MPC−5 磁気ラックを用いて行った。
実施例32
ヒト全血からのDNAの単離
前述の実施例の手順により固相結合材料上に捕捉された核酸を、500μLの10mMトリス緩衝液、pH8.0、で3回洗浄し、その都度上澄みを廃棄した。100μLの0.1M NaOHを用いて、37℃、5分間で溶離することにより核酸を粒子から除いた。その他のNaOH濃度もまた有効であった。
ヒト全血からのDNAの単離
前述の実施例の手順により固相結合材料上に捕捉された核酸を、500μLの10mMトリス緩衝液、pH8.0、で3回洗浄し、その都度上澄みを廃棄した。100μLの0.1M NaOHを用いて、37℃、5分間で溶離することにより核酸を粒子から除いた。その他のNaOH濃度もまた有効であった。
実施例33
迅速な単離プロトコール
1mgの粒子を100μLのヒト全血と試験管中で混合した。試験管を30秒間ボルテックスした。混合物を300μLの10mMトリス緩衝液、pH8.0、で希釈し、粒子から液体を、磁性反応粒子を用いた場合は磁石を用いて除去した。前述の実施例の手順により固相結合材料上に捕捉された核酸を、500μLの10mMトリス緩衝液、pH8.0、で3回洗浄し、その都度上澄みを廃棄した。核酸を50μLの0.05M NaOHを用いて、室温、30秒間で溶離させることにより粒子から除いた。
迅速な単離プロトコール
1mgの粒子を100μLのヒト全血と試験管中で混合した。試験管を30秒間ボルテックスした。混合物を300μLの10mMトリス緩衝液、pH8.0、で希釈し、粒子から液体を、磁性反応粒子を用いた場合は磁石を用いて除去した。前述の実施例の手順により固相結合材料上に捕捉された核酸を、500μLの10mMトリス緩衝液、pH8.0、で3回洗浄し、その都度上澄みを廃棄した。核酸を50μLの0.05M NaOHを用いて、室温、30秒間で溶離させることにより粒子から除いた。
実施例34
蛍光アッセイプロトコール
上澄み液と溶離剤を、DNA含量について、DNAを染色するためにピコグリーン(PicoGreen)(登録商標)を使用する蛍光アッセイで分析した。簡潔にいえば、DNAを含むか、もしくは含むと思われる溶液を10μLとり、190μLの蛍光DNA染色溶液でインキュベートした。蛍光染色液(fluorescent stain)は0.1Mトリス,pH7.5,1mMのEDTAで1:400に希釈したピコグリーン(モレキュラー プローブ(Molecular Probes))であった。少なくとも5分間サンプルをインキュベートした後、蛍光をマイクロプレートフルオロメーター(microplate fluorometer)(フルオロスカン ラブシステムズ(Fluoroskan、Labsystems))にて測定した。使用したフィルターセットは480nmおよび535nmであった。既知量の同じDNAを含むポジティブコントロールと、ネガティブコントロールを同時に実験した。核酸を100μLの0.1M NaOH中に溶離させた実験では、10μLアリコートを用いた。核酸を50μLの0.05M NaOH中に溶離させた実験では、5μLアリコートを用いた。
蛍光アッセイプロトコール
上澄み液と溶離剤を、DNA含量について、DNAを染色するためにピコグリーン(PicoGreen)(登録商標)を使用する蛍光アッセイで分析した。簡潔にいえば、DNAを含むか、もしくは含むと思われる溶液を10μLとり、190μLの蛍光DNA染色溶液でインキュベートした。蛍光染色液(fluorescent stain)は0.1Mトリス,pH7.5,1mMのEDTAで1:400に希釈したピコグリーン(モレキュラー プローブ(Molecular Probes))であった。少なくとも5分間サンプルをインキュベートした後、蛍光をマイクロプレートフルオロメーター(microplate fluorometer)(フルオロスカン ラブシステムズ(Fluoroskan、Labsystems))にて測定した。使用したフィルターセットは480nmおよび535nmであった。既知量の同じDNAを含むポジティブコントロールと、ネガティブコントロールを同時に実験した。核酸を100μLの0.1M NaOH中に溶離させた実験では、10μLアリコートを用いた。核酸を50μLの0.05M NaOH中に溶離させた実験では、5μLアリコートを用いた。
実施例35
ゲル電気泳動プロトコール
0.75%、または1.5%のアガロースゲルを核酸溶離剤の分析のために調製した。適切な量のアガロースを、2分間煮沸させることにより、10mLのTAE緩衝液に溶解させた。50〜60℃に冷却後直ちに、1mg/mLの臭化エチジウム溶液(20μL)を加え、ゲルを注いだ。それぞれのサンプル(ca.12μL)を、0.25%のブロモフェノールブルー、0.25%のキシレンシアノールおよび30%のグリセロールを含有する2μLの6×充填(loading)緩衝液と混合した。ゲル電気泳動は70Vで実験した。
ゲル電気泳動プロトコール
0.75%、または1.5%のアガロースゲルを核酸溶離剤の分析のために調製した。適切な量のアガロースを、2分間煮沸させることにより、10mLのTAE緩衝液に溶解させた。50〜60℃に冷却後直ちに、1mg/mLの臭化エチジウム溶液(20μL)を加え、ゲルを注いだ。それぞれのサンプル(ca.12μL)を、0.25%のブロモフェノールブルー、0.25%のキシレンシアノールおよび30%のグリセロールを含有する2μLの6×充填(loading)緩衝液と混合した。ゲル電気泳動は70Vで実験した。
実施例36
ゲノムDNAのPCR増幅
本発明の方法を0.05Mまたは0.1M NaOH中における、実施例2,4〜11および13〜30(1または2μL)のそれぞれの固相材料で全血に適用して溶出したDNAを、24塩基対のプライマーとともにPCR増幅に供し、200bpアンプリコン(amplicon)を生成した。PCR反応混合物は、以下の表に記載されている成分を含んでいた。
ゲノムDNAのPCR増幅
本発明の方法を0.05Mまたは0.1M NaOH中における、実施例2,4〜11および13〜30(1または2μL)のそれぞれの固相材料で全血に適用して溶出したDNAを、24塩基対のプライマーとともにPCR増幅に供し、200bpアンプリコン(amplicon)を生成した。PCR反応混合物は、以下の表に記載されている成分を含んでいた。
ネガティブコントロールでは反応混合物中のテンプレートを1μLの水と置き換えた。さらなる反応には、1:10に水で希釈した1μLのテンプレートを用いた。反応混合物を94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒の30サイクルに供した。反応生成物を1.5%アガロースゲルで分析した結果、期待したアンプリコンを示した。
別の実験では、実施例2の粒子を用いて単離されたDNAを、以下のリストのように、いくつかの異なった染色体の部位の増幅反応に用いた。結果は、単離手順により得られたDNAが無傷のゲノムの典型であることを示した。
実施例37
異なった量の粒子による全血からの核酸の捕捉と単離
70μLのヒト全血からのDNAを様々な量の実施例2の粒子と結合し、実施例33の迅速なプロトコールにより単離した。溶離剤中の様々なNaOH濃度の効果もまた試験した。溶離したDNAの量を蛍光分析(fluorescence)により定量し、DNAの標準参照サンプルと比較した。
異なった量の粒子による全血からの核酸の捕捉と単離
70μLのヒト全血からのDNAを様々な量の実施例2の粒子と結合し、実施例33の迅速なプロトコールにより単離した。溶離剤中の様々なNaOH濃度の効果もまた試験した。溶離したDNAの量を蛍光分析(fluorescence)により定量し、DNAの標準参照サンプルと比較した。
実施例38
異なった量の粒子による全血からの核酸の捕捉と単離
70μLのヒト全血からのDNAを様々な量の種々の粒子に結合し、実施例31および32のプロトコールにより単離した。溶離剤を、図4に示すようにゲル電気泳動により分析した。比較として、500bpから40,000bpのサイズ範囲のサイズ標識のラダー(ladder)を示す。
異なった量の粒子による全血からの核酸の捕捉と単離
70μLのヒト全血からのDNAを様々な量の種々の粒子に結合し、実施例31および32のプロトコールにより単離した。溶離剤を、図4に示すようにゲル電気泳動により分析した。比較として、500bpから40,000bpのサイズ範囲のサイズ標識のラダー(ladder)を示す。
追加サンプルを図6に示す。
実施例39
異なった量の粒子による異なった量の全血からの核酸の捕捉と単離
1mLのヒトの全血からのDNAを実施例2の粒子5mgと結合し、実施例31および33のプロトコールにより単離した。蛍光分析による複製サンプルの溶離剤(100μL)の分析は、17〜24μgのDNA収量を示した。10mgの同タイプの粒子を用いた70μLの血液からのDNAの単離からの溶離剤の同様な分析では、100μLの0.1M NaOHを用い、30秒または1分で溶離され、それぞれ、収量は6.5μgと7.3μgであった。プロトコール31,32による実施例5の粒子の使用により、70μLの血液から2.8μgのDNAを得た。
異なった量の粒子による異なった量の全血からの核酸の捕捉と単離
1mLのヒトの全血からのDNAを実施例2の粒子5mgと結合し、実施例31および33のプロトコールにより単離した。蛍光分析による複製サンプルの溶離剤(100μL)の分析は、17〜24μgのDNA収量を示した。10mgの同タイプの粒子を用いた70μLの血液からのDNAの単離からの溶離剤の同様な分析では、100μLの0.1M NaOHを用い、30秒または1分で溶離され、それぞれ、収量は6.5μgと7.3μgであった。プロトコール31,32による実施例5の粒子の使用により、70μLの血液から2.8μgのDNAを得た。
実施例40
異なった固相材料による全血からの核酸の捕捉と単離
100μLのヒト全血からのDNAを、本発明の方法に従い実施例33の迅速なプロトコールにより1mgの様々な固相材料に結合させ、50μLの50mM NaOH溶液を用いて溶離した。溶離したDNAの量を蛍光分析により定量し、DNAの標準参照サンプルと比較した。
異なった固相材料による全血からの核酸の捕捉と単離
100μLのヒト全血からのDNAを、本発明の方法に従い実施例33の迅速なプロトコールにより1mgの様々な固相材料に結合させ、50μLの50mM NaOH溶液を用いて溶離した。溶離したDNAの量を蛍光分析により定量し、DNAの標準参照サンプルと比較した。
実施例27の非磁性制御ポアガラス粒子(10mg)と実施例28の焼結ガラスフリット(10mg)を、磁性分離よりもむしろ遠心分離により固形物から液体を除去したことを除いて、上記のように試験に用いた。
Claims (46)
- 生物学材料または細胞材料のサンプルから核酸を捕捉する方法において、
a)固相結合材料を与える工程と、
b)前記核酸を前記固相結合材料に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記固相結合材料を一緒にする工程と、
を含む、サンプルからの核酸の捕捉方法。 - 生物学材料または細胞材料のサンプルから核酸を単離する方法において、
a)固相結合材料を与える工程と、
b)前記核酸を前記固相結合材料に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記固相結合材料を一緒にする工程と、
c)前記固相結合材料から前記サンプルを分離する工程と、
d)随意に前記固相結合材料を洗浄する工程と、
e)前記固相結合材料から結合核酸を解離する工程と、
を含む、サンプルからの核酸の単離方法。 - 前記生物学材料または細胞材料が、細胞外の核酸、動物、植物または細菌起源の無傷細胞、および動物、植物または細菌起源の無傷細胞を含んでいる組織からなる群から選択される請求項1記載の捕捉方法。
- 5分以内で行なわれる請求項2記載の単離方法。
- 生物の全血から核酸を捕捉する方法において、
a)固相結合材料を与える工程と、
b)前記核酸を前記固相結合材料に結合させるに十分な時間、全血サンプルと前記固相結合材料を一緒にする工程と、
を含む、全血からの核酸の捕捉方法。 - c)前記固相結合材料から前記サンプルを分離する工程と、
d)随意に前記固相結合材料を洗浄する工程と、
e)前記固相結合材料から結合核酸を解離する工程と、
を含む請求項5記載の捕捉方法。 - 前記核酸が、前記全血中の白血球内に含まれる請求項5記載の捕捉方法。
- 5分以内で行なわれる請求項6記載の捕捉方法。
- 前記核酸が、DNAおよびRNAからなる群から選択される請求項1記載の捕捉方法。
- 前記核酸が、有機体のゲノムDNAである請求項1記載の捕捉方法。
- 前記固相結合材料が、シリカ、ガラス、焼結ガラス、制御ポアガラス、アルミナ、ジルコニア、チタニア、不溶性合成ポリマー、不溶性多糖類、並びに、金属、金属酸化物および金属硫化物から選択される金属材料、から選択される請求項1記載の捕捉方法。
- 前記固相結合材料が磁性反応部分を含む請求項1記載の捕捉方法。
- 前記固相結合材料が共有結合した核酸結合部分を含む請求項1記載の捕捉方法。
- 前記固相結合材料が非共有結合した核酸結合部分を含む請求項1記載の捕捉方法。
- 前記固相結合材料が、ヒドロキシル基、シラノール基、カルボキシル基、アミノ基、アンモニウム基、3級スルホニウム基、4級アンモニウム基および4級ホスホニウム基からなる群から選択される基を含む請求項1記載の捕捉方法。
- 前記共有結合した核酸結合部分が、4級ホスホニウム基を含む請求項13記載の捕捉方法。
- 前記共有結合した核酸結合部分が、カルボキシル基を含む請求項13記載の捕捉方法。
- 前記核酸結合部分が、選択的に開裂されうる結合を介して、前記固相結合材料に結合される請求項13記載の捕捉方法。
- 前記結合核酸が、強アルカリ溶液中で前記固相結合材料から解離される請求項1記載の捕捉方法。
- 前記結合核酸が、下流の分子生物学プロセスで直接使用されうる溶液中で、前記固相結合材料から解離される請求項1記載の捕捉方法。
- 前記結合核酸が、下流の分子生物学プロセスで直接使用されうる溶液中で、前記固相結合材料から解離される請求項19記載の捕捉方法。
- 前記下流の分子生物学プロセスが、核酸増幅反応である請求項20記載の捕捉方法。
- 前記下流の分子生物学プロセスが、核酸増幅反応である請求項21記載の捕捉方法。
- 生物学材料または細胞材料のサンプルから核酸を捕捉する方法において、
a)核酸結合部分と結合される基質を含む固相を与える工程と、
b)前記核酸を前記固相に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記固相を一緒にする工程と、
を含む、サンプルからの核酸の捕捉方法。 - 生物学材料または細胞材料のサンプルから核酸を単離する方法において、
a)核酸結合部分と結合される基質を含む固相を与える工程と、
b)前記核酸を前記固相に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記固相を一緒にする工程と、
c)前記固相から前記サンプルを分離する工程と、
d)随意に固相結合材料を洗浄する工程と、
e)前記固相から結合核酸を解離する工程と、
を含む、サンプルからの核酸の単離方法。 - 生物学材料または細胞材料のサンプルから核酸を捕捉する方法において、
a)選択的に開裂可能な結合を介して、核酸結合部分と結合される基質を含む固相を与える工程と、
b)前記核酸を前記固相に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記固相を一緒にする工程と、
を含む、サンプルからの核酸の捕捉方法。 - 生物学材料または細胞材料のサンプルから核酸を単離する方法において、
a)選択的に開裂可能な結合を介して、核酸結合部分と結合される基質を含む固相を与える工程と、
b)前記核酸を前記固相に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記固相を一緒にする工程と、
c)前記固相から前記サンプルを分離する工程と、
d)随意に固相結合材料を洗浄する工程と、
e)結合部分を選択的に開裂させることにより前記固相から結合核酸を解離する工程と、
を含む、サンプルからの核酸の単離方法。 - 前記固相が、シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマーおよび不溶性多糖類から選択される基質、並びに、式QR2 +X−(ここでRはC1〜C20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Xはアニオンである)で示される3級スルホニウム基、式NR3 +X−(ここでRはC1〜C20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Xはアニオンである)で示される4級アンモニウム基(4級オニウム基)および式PR3 +X−(ここでRはC1〜C20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Xはアニオンである)で示される4級ホスホニウム基から選択される、前記基質の表面に結合されたオニウム基を含む請求項24記載の捕捉方法。
- 前記固相が、シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマーおよび不溶性多糖類から選択される基質、並びに、式QR2 +X−(ここでRはC1〜C20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Xはアニオンである)で示される3級スルホニウム基、式NR3 +X−(ここでRはC1〜C20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Xはアニオンである)で示される4級アンモニウム基(4級オニウム基)および式PR3 +X−(ここでRはC1〜C20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Xはアニオンである)で示される4級ホスホニウム基から選択される、前記基質の表面に結合されたオニウム基を含む請求項26記載の捕捉方法。
- 生物学材料または細胞材料のサンプルから核酸を捕捉する方法において、
a)粒子結合材料を与える工程と、
b)前記核酸を前記粒子結合材料に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記粒子結合材料を一緒にする工程と、
を含む、サンプルからの核酸の捕捉方法。 - 前記核酸が3分以内に捕捉される請求項30記載の捕捉方法。
- 前記核酸が30秒以内に捕捉される請求項30記載の捕捉方法。
- 生物学材料または細胞材料のサンプルから核酸を単離する方法において、
a)粒子結合材料を与える工程と、
b)前記核酸を前記粒子結合材料に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記粒子結合材料を一緒にする工程と、
c)前記粒子結合材料から前記サンプルを分離する工程と、
d)随意に前記粒子結合材料を洗浄する工程と、
e)前記粒子結合材料から結合核酸を解離する工程と、
を含む、サンプルからの核酸の単離方法。 - 5分以内で行なわれる請求項33記載の単離方法。
- 生物学材料または細胞材料のサンプルから核酸を捕捉する方法において、
a)粒子結合材料を与える工程と、
b)前記核酸を前記粒子結合材料に結合するために、3分を超えない時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記粒子結合材料を一緒にする工程と、
を含む、サンプルからの核酸の捕捉方法。 - 生物学材料または細胞材料のサンプルから核酸を単離する方法において、
a)粒子結合材料を与える工程と、
b)前記核酸を前記粒子結合材料に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記粒子結合材料を一緒にする工程と、
c)前記粒子結合材料から前記サンプルを分離する工程と、
d)随意に前記粒子結合材料を洗浄する工程と、
e)前記粒子結合材料から結合核酸を解離する工程と、
を含み、5分以内で行なわれるサンプルからの核酸の単離方法。 - a)溶解溶液の使用または溶解試薬のコーティングなしで、生物学材料または細胞材料から直接核酸を捕捉する能力を有し、生物学材料または細胞材料から直接核酸を捕捉するための固相結合材料と、
b)前記固相結合材料から核酸を解離するための試薬と、
を含むキット。 - 前記固相結合材料が粒子材料である請求項37記載のキット。
- 前記粒子材料が磁性的に反応する請求項38記載のキット。
- 前記固相結合材料が、シリカ、ガラス、焼結ガラス、制御ポアガラス、アルミナ、ジルコニア、チタニア、不溶性合成ポリマー、不溶性多糖類、並びに、金属、金属酸化物および金属硫化物から選択される金属材料、から選択される請求項37記載のキット。
- 前記固相結合材料が共有結合した核酸結合部分を含む請求項37記載のキット。
- 前記核酸結合部分が、選択的に開裂されうる結合を介して、前記固相結合材料に結合する請求項41記載のキット。
- 前記固相結合材料から核酸を解離するための試薬が、強アルカリ溶液である請求項41記載のキット。
- 前記固相結合材料が、ヒドロキシル基、シラノール基、カルボキシル基、アミノ基、アンモニウム基、3級スルホニウム基、4級アンモニウム基および4級ホスホニウム基からなる群から選択される基を含む請求項37記載のキット。
- 前記共有結合した核酸結合部分が、4級ホスホニウム基を含む請求項41記載のキット。
- 前記共有結合した核酸結合部分が4級ホスホニウム基を含み、前記固相から核酸を解離するための試薬が、強アルカリ溶液である請求項42記載のキット。
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