KR20070062555A - 생물학 및 세포 물질에서 핵산을 분리하는 방법 - Google Patents

생물학 및 세포 물질에서 핵산을 분리하는 방법 Download PDF

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Abstract

고상 바인딩 물질을 사용하고, 세포 용해 용액이나 코팅은 전혀 사용하지 않는, 생물학 또는 세포 물질의 샘플로부터 핵산을 분리하는 방법이 개시된다. 상기 고상 바인딩 물질의 사용은 뜻밖에도, 세포의 핵산 내용물이 직접적으로 그리고 한 단계만에 유리되고 캡처되도록 한다. 상기 새로운 방법은 종래의 방법에 비해 매우 단순화된 방법을 제공한다. 핵산은 5분 내에 다운스트림 공정에 적합한 형태로 캡처되고 방출될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물 및 상기 방법과 함께 사용되는 바람직한 고상 물질들은 4급 오늄 핵산 바인딩 부위를 포함한다.
핵산 분리, 세포 용해 용액, 고상 바인딩 물질, 핵산 바인딩 부위, 전혈, 게놈.

Description

생물학 및 세포 물질에서 핵산을 분리하는 방법{METHODS FOR ISOLATING NUCLEIC ACIDS FROM BIOLOGICAL AND CELLULAR MATERIALS}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 출원인들의 함께 계류 중인 2003년 11월 17일에 출원한 미국 출원번호 10/714,763과 2003년 11월 17일에 출원한 미국 출원번호 10/715,284의 일부계속출원인 출원인들의 함께 계류 중인 2004년 9월 16일에 출원한 출원번호 10/942,491 및 출원인들의 함께 계류 중인 2004년 12월 22일에 출원한 가출원번호 60/638,621의 일부계속출원이다.
본 발명은 핵산을 캡처(capturing)하고 분리(isolating)하는 간편한 방법에 관한 것이며, 상세하게는 생물학적 기원 물질, 특히 혈액과 박테리아 배양물로부터의 전체 게놈 핵산에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 이러한 방법에 유용한 고상 바인딩(binding) 물질을 함유하는 키트에 관한 것이기도 하다.
분자 진단 및 분자 생물학(역전사, 복제, 제한 분석, 증폭 및 서열 분석 포함)의 최근 기술들은 핵산의 추출을 필요로 한다. 표적 핵산이 발견되는 샘플 매트릭스가 복잡하므로 핵산의 확보가 복잡해진다. 그러한 샘플은 예컨대, 조직 세포, 체액 세포, 혈액, 배양물의 박테리아 세포, 아가로스 겔, 폴리아크릴아미드 겔, 또 는 표적 핵산 증폭 용액을 포함한다. 샘플 매트릭스는 종종, 핵산을 분자 생물학이나 진단 기술에 사용하기 전에 관심 핵산으로부터 제거해야 하는 오염 물질들을 상당량 함유한다.
상기와 같은 세포와 조직으로부터 생성된 혼합물에서 표적 핵산을 확보하기 위한 종래 기술들은 페놀, 클로로포름 및 에티듐 브로마이드와 같은 유독 화학 물질을 사용한다. 그러한 방법들은 표적 핵산과 다양한 오염 물질의 혼합물에서 오염 물질을 추출하기 위해 페놀/클로로포름 추출물을 사용한다. 선택적으로, 본 발명 관련 기술 분야에서 공지된 방법에 따라 세슘 클로라이드-에티듐 브로마이드 구배가 사용된다. 예컨대, Sambrook 등이 편집한 Molecular Cloning, (1989), Cold Spring Harbor Press, pp. 1.42-1.50를 참고하라. 후자의 방법은 일반적으로 그 이후에, 추출된 수성상에 에탄올이나 2-프로판올을 첨가함으로써 그 수성상에 잔류하는 핵산 물질을 침전시키는 단계가 이어진다. 일반적으로 원심 분리에 의해 용액에서 침전물을 제거하고, 그로 인해 얻어진 침전물 펠릿은 후속 공정에 사용하기 위해 물이나 버퍼 용액에 재현탁하기 전에 건조한다.
세포 용해물(cell lysate)이나 핵산과 오염 물질의 기타 혼합물에서 핵산을 분열시키기 위해 다양한 형태의 고상을 이용하는 더 간단하고 더 빠른 방법들이 개발되어왔다. 그러한 고상들은 섬유, 필터 및 코팅된 컨테이너와 같은 다양한 형상과 형태의 크로마토그래피 수지, 중합체 및 실리카 또는 유리계 물질을 포함한다. 작은 입자 형태일 경우, 종종 자기 코어를 제공하여 분열(separation) 작업을 보조한다.
전혈(whole blood) DNA로부터의 DNA 추출은 혈액 내의 백혈구로부터 추출한다. 혈액은 일반적으로 적혈구를 선택적으로 용해하도록 처리되고 침전 내지 원심 분리 단계 후에 미손상 백혈구를 각각 용해하여 핵산 내용물을 노출시킨다. 단백질을 소화하고 얻어진 DNA는 고상과 함께 분리하여 서열 다형성(sequence polymorphism) 결정, 서열 분석, RFLP 분석, 돌연변이 검출 또는 기타 형태의 진단 시험에 사용한다. EP 0796327B1에 개시된 방법은 특정 고상의 존재 하에서 박테리아 배양물이나 전혈과 같은 세포-함유 샘플과 세포 용제(lysis detergent)를 혼합하는 단계를 포함한다. 반면, 본 방법은 용제나 세포 용해 용액(lysis solution)을 사용하지 않는다. 또 다른 방법은 항체-코팅 입자를 이용하여 전혈에서 백혈구를 선택적으로 캡처하고 그 이후 캡처된 백혈구를 용해하며 고체 서포트(support)상에 방출된 핵산을 캡처한다(미국 특허출원공개번호 2003/0180754A1).
박테리아로부터의 핵산 추출 미국특허번호 5,990,301은 세포 용해 후에 음이온 교환기 상에 유리(free)된 핵산을 분리하고, 제어된 이온 강도의 용액으로 용리하며, 그 후 용제나 크로마토그래피 서포트로 처리하여 균체내 독소(endotoxin)를 제거함으로써 박테리아나 바이러스에서 핵산을 분리하는 방법을 개시하고 있다. 고체 바인딩 서포트 물질을 함유하는 키트가 개발되었으며 박테리아 배양물에서 그리고 인간 전혈에서 게놈을 분리하는 방법에 상업적으로 입수하여 이용할 수 있다. 제작자로부터 제공된 절차는 핵산의 제거 및 정제를 시작하기 전에 세포를 용해할 것을 언제나 명기하고 있다. 때로는 고체 서포트를 사용하기 전에 추가 침전 단계를 이용하기도 한다(예컨대, K. Smith 등, J. Clin. Microbiol., 41(6), 2440-3 (2003); P. Levison 등, J. Chromatography A, 827, 337-44 (1998)).
고상 물질 핵산 분리에 사용되는 고상의 일 유형은 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography: HPLC)에 사용되도록 설계된 다공성 실리카 겔 입자를 포함한다. 다공성 실리카 겔 입자의 표면은 음이온-교환기로 기능화되어 특정한 염과 pH 조건에서 플라스미드 DNA와 교환된다. 예컨대, 미국 특허번호 4,699,717 및 5,057,426를 참고하라. 이러한 고상 물질에 속박된 플라스미드 DNA는 고농도 염을 함유하는 수용액 내에서 용리된다. 그로부터 용리된 핵산 용액은 다운스트림 공정에 사용하기 전에 추가 처리하여 염을 제거해야 한다.
기타 실리카계 고상 물질들은 조절 공극 유리(controlled pore glass: CPG), 실리카 입자들이 박힌 필터, 실리카 겔 입자, 규조토(diatomaceous earth), 유리 섬유, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 각 실리카계 고상 물질은 요오드화 나트륨(NaI), 구아니디늄 티오시아네이트 또는 구아니디늄 클로라이드와 같은 카오트로픽제(chaotropic agent)가 존재할 때 핵산 함유 샘플에 핵산을 가역적으로 바인딩시킨다. 예컨대, 미국 특허번호 5,234,809, 6,582,922를 보라. 잔여 샘플 성분에서 매트릭스 및 그에 바인딩된 핵산 물질을 분열시키기 위해 고상을 원심 분리 또는 진공 여과할 때 그러한 고상들은 핵산 물질을 바인딩하여 유지시킨다. 그 후 물이나 저염 용리 버퍼로 용리함으로써 고상으로부터 핵산 물질을 유리시킨다. 상업적으로 입수 가능한 핵산 분리용 실리카계 고상 물질은 예컨대, WizardTM DNA 정제 시스템 제품(Promega, Madison, WI), QiaPrepTM DNA 분리 시스템(Qiagen, Santa Clarita, CA), High Pure (Roche), 및 GFX Micro Plasmid Kit(Amersham)를 포함한다.
입자 형태의 중합체 수지들도 핵산의 분리 및 정제에 널리 사용된다. 카르복시산염-수정 중합체 입자들(Bangs, Agencourt)이 공지되어 있다. 4급 암모늄 헤드기(quaternary ammonium head group)를 가지는 중합체들이 유럽 특허출원공개번호 EP 1243649A1에 개시되어 있다. 상기 중합체는 공유 부착된 선형 비가교결합 중합체를 가지는 불활성 캐리어 입자이다. 이 유형의 중합체 고상은 통상 텐터클 수지(tentacle resin)라고 불린다. 상기 선형 중합체는 4급 테트라알킬암모늄기를 포함한다. 알킬기는 구체적으로 메틸 또는 에틸기를 들 수 있다(4 컬럼, 52-55 라인). 더 긴 알킬기는 바람직하지 않은 것으로 판단된다.
음이온 교환 이론에 기초한 기타 핵산 바인딩용 고상 물질들이 현재 사용되고 있다. 이들은 EP 0496822B1에 개시된 크로마토그래피 서포트에 기초한 실리카-NucleoBond AX (Becton Dickinson, Roche-Genopure) 및 DEAE 헤드기를 가지는 실리카계 물질(Qiagen)을 포함한다. 폴리머-트리알킬암모늄기(polymeric-trialkylammonium group)를 가지는 중합체 수지가 EP 1243649에 개시되었다(GeneScan). DNA 분리를 위한 카르복실-수정 중합체는 많은 공급자들로부터 입수 가능하다. 핵산은 고염 조건에서는 끌어 당겨지고, 저이온 강도 조건에서는 방출된다.
세포 용해를 유발하는 용제, 약염기 및 킬레이트제를 함유하는 조성으로 코팅된 여과막이나 여과지와 같은 고체 매트릭스나 기판을 포함하는 물질들이 미국 특허번호 5,496,562, 5,756,126, 6,645,717 및 6,746,841에 개시되어 있다. 상기 코팅은 용액 상태로 적용한 후 매트릭스 상에서 건조한다. 상기 코팅은 따라서 별개의 부가층이며 물질의 일체화된 부분은 아니다. 또한, 핵산은 후속 가열 단계에 의해 상기 매트릭스에 고정된다.
양이온 트리메틸아민 외면(exterior)을 가지는 중합체 미세캐리어 비드(bead)가 미국 특허번호 6,214,618에 개시되어 있다. 상기 비드는 비교적 큰 직경(75-225 ㎛)을 가지며 배양물에서의 세포 부착 및 성장을 위한 서포트로서 유용하다. 이러한 비드가 핵산을 캡처하거나 바인딩한다는 보고는 없었다.
자기반응성(magnetically responsive) 입자들도 핵산 분리에서 고상으로 사용되도록 개발되었다. 핵산 분리용으로 설계된 몇몇 다양한 유형의 자기반응성 입자들이 본 발명 관련 기술 분야에서 공지되어있고, 몇몇 공급자들로부터 상업적으로 입수 가능하다. 핵산 물질을 직접 가역적으로 바인딩하는 자기 입자는 MagneSilTM 입자(Promega)를 포함한다. 자기 입자도 mRNA의 poly A tail과의 혼성화(hybridization)를 위한 부착 oligo dT tail을 가지는 공유 부착 아비딘(avidin)이나 스트렙트아비딘(streptavidin)을 통해 mRNA를 가역적으로 바인딩하는 것으로 알려져 있다.
다양한 유형의 자기반응성 실리카계 입자들이 핵산 바인딩 분리 방법에서 고상으로 사용되는 것으로 알려져 있다. 그러한 한 유형은 미국 특허번호 4,395,271; 4,233,169; 4,297,337; 또는 6,255,477에 개시된 다공성 자기 유리 입자들; 또는 CPG, Inc.(Lincoln Park, NJ)로부터 Magnetic Porous Glass(MPG) 입자로 입수 가능한, 바람직하게는 조절된 공극 크기를 가지는 자기반응성 유리 비드이다. 핵산의 바인딩 및 분리에 유용한 다른 유형의 자성체는 예컨대, 독일 특허번호 DE 4307262A1; 미국 특허번호 5,945,525; 6,027,945, 및 6,296,937과 같이 중합체 이산화 규소 화합물의 매트릭스에 자기 물질을 혼합함으로써 만들어진다. 4급 암모늄기를 가지는 셀룰로오스 매트릭스에 삽입된 산화철 나노 입자를 포함하는 자기 입자들이 Cortex Biochem(San Leandro, CA)에 의해 상업적으로 MagaCell-QTM로서 생산되고 있다.
유도성 자기 입자를 가지는 비드나 입자는 철, 니켈, 구리, 코발트 및 망간과 같은 작은 전이금속 입자를 포함하여 자석이 존재할 때 일시적 자성을 가질 수 있는 금속 산화물을 형성한다. 이러한 입자는 상자성 또는 초상자성으로 불린다. 상자성 또는 초상자성 비드를 형성하기 위해, 물에서 상대적으로 안정한 중합체로 금속 산화물을 코팅하였다. 미국 특허번호 4,554,088은 중합체 실란의 코팅으로 둘러싸인 금속 산화물 코어를 포함하는 상자성 입자를 개시하고 있다. 미국 특허번호 5,356,713은 소수성 비닐방향족 모노머의 셸로 둘러싸인 자화성 입자의 코어로 구성된 자화성 마이크로스피어(magnetizable microsphere)를 개시하고 있다. 미국 특허번호 5,395,688은 혼합된 상자성 금속 산화물-중합체 층으로 코팅된 중합체 코어를 개시하고 있다. 또 다른 방법은 예컨대 미국 특허번호 4,774,265처럼 금속 산화물을 흡착하기 위해 중합체 코어를 이용한다. 상자성 금속 산화물층으로 코팅된 중 합체 코어를 포함하는 자기 입자가 미국 특허번호 5,091,206에 개시되어 있다. 상기 입자는 그 후, 금속 산화물층을 보호하고 반응성 코팅을 제공하기 위해 추가 중합체층으로 더 코팅된다. 미국 특허번호 5,866,099는 금속 염을 조정하고 혼합된 금속 산화물을 포착하기 위해 단백질이 존재할 때 두 가지 금속 염의 혼합물을 공침(co-precipitation)시킴으로써 자기 입자를 준비하는 것을 개시하고 있다. 금속 염 쌍의 다양한 예가 개시되었다. 미국 특허번호 5,411,730은 침전된 혼합 금속 산화물이 덱스트런, 올리고당에 포착되는 유사한 공정을 개시하고 있다.
DNA와 RNA의 비가역적 캡처를 위한 알루미나(알루미늄 산화물)가 미국 특허번호 6,291,166에 개시되어 있다. 바인딩 핵산이 PCR과 같은 고상 증폭 방법에 사용될 수 있다.
이러한 고상 물질들에 바인딩된 DNA는 고농도 염을 함유한 수용액에서 용리된다. 용리된 핵산 용액을 다운스트림 공정에서 사용하려면 염을 제거해야 한다. 반면, 실리카계 물질에 바인딩된 핵산은 물이나 저염 용리 버퍼로 용리시킴으로써 고상으로부터 유리된다. 미국 특허번호 5,792,651은 핵산의 세포 내 트랜스펙션(transfection)에서 핵산의 능력을 향상시키는 핵산의 크로마토그래피 분리 조성물을 개시하고 있다. 상기 조성물은 버퍼 물질과, 선택적인 염 및 2-프로판올을 함유하는 수용액을 포함한다.
그런데 고농도 염과 폴리알킬렌 글리콜을 포함하는 조성물로 처리할 때 자기 미세 코어를 함유하는 셀룰로스 입자 또는 아가로스를 포함하는 다른 자기 고상 물질들이 핵산을 바인딩하고 유지하는 것으로 보고되었다(예컨대, 미국 특허번호 5,898,071 및 국제특허출원 공개번호 WO02066993). 그 후 물이나 저이온 강도 버퍼로 처리함으로써 핵산이 방출된다.
본 명세서에 참고로서 포함된, 출원인들의 함께 계류 중인 미국 출원번호 10/714,763, 10/715,284, 10/891,880, 10/942,491 및 60/638,631은 절단성(cleavable) 물질을 포함하는 새로운 고상 핵산 바인딩 물질들과, 핵산의 바인딩 및 방출 방법을 개시하고 있다.
트리부틸포스포늄 헤드기를 가지는 중합체 비드가 3상계에서 상전이(phase transfer) 촉매로 사용되는 것으로 설명되었다. 상기 비드는 가교결합 폴리스티렌으로부터 준비되었다(J. Chem. Soc. Perkin Trans. Ⅱ, 1827-1830, (1983)). 알킬렌 체인 및 알킬렌 에테르 체인을 통해 가교결합 폴리스티렌에 링크(link)된 펜던트(pendant) 트리알킬포스포늄기를 가지는 중합체 비드도 설명되었다(Tomoi 등, Makromolekulare Chemie, 187(2), 357-65 (1986); Tomoi 등, Reactive Polymers, Ion Exchangers, Sorbents, 3(4), 341-9 (1985)). 가교결합된 폴리스티렌 수지에 근거한 혼합 4급 암모늄/포스포늄 불용성 중합체가 촉매 및 살생물제로 개시되었다(Davidescu 등, Chem. Bull. Techn. Univ. Timisoara, 40(54), 63-72 (1995); Parvulescu 등, Reactive & Functional Polymers, 33(2,3), 329-36 (1997)).
본 발명의 한 목적은 생물학 및 세포 물질에서 핵산을 캡처하는 간편하고 신속한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 생물학 및 세포 물질에서 핵산을 분리하는 간편하고 신속한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 유기체의 전혈이나 혈액 일부에서 핵산을 캡처하고 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포 배양물에서 핵산을 캡처하고 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 5분 내에 생물학 및 세포 물질에서 핵산을 캡처하고 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
정의
알킬 - 하나 이상의 비수소 치환기로 치환될 수 있는 1-20 탄소를 포함하는, 분기된 선형 체인 또는 고리형 탄화수소기. 본 명세서에서 언급되는 저급 알킬(lower alkyl)은 8개 이하의 탄소를 포함하는 알킬기를 말한다.
아랄킬 - 아릴기로 치환된 알킬기.
아릴 - 하나 이상의 비수소 치환기로 치환될 수 있는 1개 내지 5개의 카르보사이클릭(carbocyclic) 방향족 고리를 포함하는 방향족 고리-포함 기(group).
생물학 물질 - 전혈, 항응고 처리된 전혈, 조직, 세포, 세포 내용물, 세포외 핵산, 바이러스 포함.
세포 물질 - 동물, 식물 또는 박테리아 기원의 미손상(intact) 세포를 함유하고, 조직을 포함하는 비손상 세포 또는 물질.
세포 핵산 내용물 - 세포 물질 내에서 발견되는 핵산을 말하며, 게놈 DNA 및 RNA, 그리고 바이러스 및 플라스미드를 포함하는 전염성 작용제에서 나온 것과 같은 기타 핵산일 수 있다.
자성체 - 외부 자기장에 반응하는 입자, 미세 입자 또는 비드. 상기 입자는 그 자체로 자성, 상자성 또는 초상자성일 수 있다. 강자성 물질을 사용하면 가해진 자기장이나 외부 자성체에 끌어 당겨질 수 있다. 입자들은 자기반응성이며 하나 이상의 비자기반응성 층으로 둘러싸인 고체 코어 부분을 가질 수 있다. 교대로, 자기반응성 부분은 비자기반응성 코어 둘레의 층일 수 있거나 비자기반응성 코어 내의 입자들일 수 있다.
올리고머, 올리고뉴클레오티드 - 본 명세서에서는 인산이중에스테르(phosphodiester) 뉴클레오티드간 링크(linkage) 및 5'-말단 단인산염기(monophosphate group)를 포함하는 화합물을 의미한다. 뉴클레오티드는 통상적으로 발생하는 리보뉴클레오티드, A, C, G 및 U, 또는 디옥시리보뉴클레오티드, dA, dC, dG 및 dT일 수 있다.
핵산 - 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA 또는 PNA와 같은 합성 DNA 유사체(analog)일 수 있다. 이러한 세 가지 유형의 체인들 중 어느 하나의 단일 가닥 화합물들 및 이중 가닥 혼성물도 핵산의 범위에 속한다.
방출, 용리 - 용액이나 조성물과의 접촉에 의해 고상 물질의 구멍이나 표면에 바인딩된 물질의 실질적 부분을 제거하는 것.
샘플 - 핵산을 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 유체. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 대표적인 샘플은, 수집된 혈액 표본들에서 통상 발견되는 것과 같은 항응고 처리된 혈액일 수 있는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 정액, 타액, 세포 배양물, 조직 추출물 등과 같은 체액을 포함한다. 다른 유형의 샘플들은 용제,해수, 산업수 샘플, 음식 샘플 및 토양이나 물과 같은 환경 샘플, 식물 물질(plant material), 원핵 생물에서 생겨난 세포, 진핵 생물, 박테리아, 플라스미드 및 바이러스와 같은 환경 샘플을 포함한다.
고상 물질 - 핵산 분자를 끌어당길 수 있는 표면을 가지는 물질. 물질은 미세입자, 섬유, 비드, 멤브레인(membrane), 그리고 시험관 및 마이크로웰(microwell)과 같은 기타 서포트일 수 있다.
치환 - 기(group)의 적어도 하나의 수소 원자를 비수소기로 대체하는 것을 말한다. 치환된 기에 관해서는, 명백히 달리 표시하지 않은 한, 다양한 점의 치환이 존재할 수 있음을 뜻한다는 것을 주의해야 한다.
종래에는, 다양한 유형의 샘플로부터 다양한 기술들을 사용하여 핵산을 추출, 분리 및 그렇지 않다면 정제하였다. 이러한 기술들 중 많은 기술은 핵산에 대해 얼마간의 친화성을 가지는 물질 표면에 대한 선택적 흡착에 의존한다. 덜 강하게 바인딩된 다른 성분들을 제거하기 위한 세척 단계 후에, 고상을 용액으로 처리하여 바인딩된 핵산을 제거하거나 용리한다.
세포 물질 일부로부터 게놈 핵산을 추출하고 분리하는 것이 종종 필요하다. 그렇게 얻어진 핵산은 증폭, 진단 테스트, 돌연변이 분석, 유전자 발현 프로파일링 및 생물 복제를 포함하는 후속 공정에서 사용된다. 본 발명의 방법에 의해 핵산을 분리할 수 있는 샘플은 박테리아 배양물, 체액, 전혈 및 혈액 성분, 조직 추출물, 식물 물질, 및 세포 물질을 포함하는 환경 샘플을 포함한다.
공지의 방법으로 세포 핵산 내용물을 제거하려면 내부로 접근하기 위해 세포 막이나 벽을 관통할 필요가 있다. 이러한 목적으로, 종래의 방법은 세포 용해 단계를 채용했다. 이러한 방법들 중 하나는 세포 용해에 영향을 미치는 시약을 사용한다. 세포 용해 용액은 사용된 세포 용해 방법에 따라 두 가지 유형이 있다. 한 가지 유형은 알칼리성 세포 용해를 위한 고 pH의 수용액이다. 또 다른 유형은 세포막을 부수기 위해 하나 이상의 계면 활성제나 용제(detergent)를 사용한다. 세포 용해 용액은 세포의 핵산 내용물의 유리를 돕기 위해 프로테이나아제(proteinase) 효소와 같은 소화 효소를 함유할 수도 있다. 다른 방법들은 캡처 단계 이전에 세포의 보전 상태를 부수기 위해 단단한 입자들을 이용한 제어 진동이나 초음파로 세포를 기계적으로 파괴하는 예비 단계를 사용한다.
본 출원인들은 바이러스, 플라스미드, 세포간 DNA 또는 RNA, 전혈, 항응고 처리된 혈액, 또는 박테리아와 같은 생물학 및 세포 물질의 샘플로부터 핵산을 신속하게 캡처하고 분리하는 데에 사용될 수 있는 새로운 고상 바인딩 물질들과 새로운 방법을 개발했는데, 이는 어떠한 예비 세포 용해 단계도 필요로 하지 않는다. 상기 고상 바인딩 물질들은 뜻밖에도 세포의 핵산 내용물이 한 단계에 캡처되도록 한다. 상기 새로운 방법은 세포 용해 용액의 사용이 필요 없기 때문에 속도, 단순함, 편리성, 및 자동화의 용이성의 현저한 향상을 가져온다.
본 발명의 일 태양에 따르면,
a) 고상 바인딩 물질을 제공하는 단계; 및
b) 핵산을 함유하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플과 상기 고상 바인딩 물질을, 상기 핵산을 상기 고상 바인딩 물질에 바인딩하기에 충분한 시간 동안 결합하는 단계를 포함하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플로부터 핵산을 캡처하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면,
a) 고상 바인딩 물질을 제공하는 단계;
b) 핵산을 함유하는 세포 물질의 샘플과 상기 고상 바인딩 물질을, 상기 핵산을 상기 고상 바인딩 물질에 바인딩하기에 충분한 시간 동안 결합하는 단계;
c) 상기 샘플을 상기 고상 바인딩 물질로부터 분열시키는 단계;
d) 상기 고상 바인딩 물질을 선택적으로 세척하는 단계; 및
e) 상기 바인딩된 핵산을 상기 고상 바인딩 물질로부터 방출하는 단계를 포함하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플로부터 핵산을 분리하는 방법이 제공된다.
생물학 샘플로부터 핵산을 캡처 또는 분리하는 종래의 방법과 달리, 세포 용해의 예비 단계를 사용하지 않는다. 게다가, 세포 용해 시약, 용제, 계면 활성제 또는 카오트로프(chaotrope)도 상기 샘플을 상기 고상 바인딩 물질에 접촉시킬 때나 그 전후에 있어 전혀 사용 또는 요구되지 않는다. 세포 물질의 샘플을 짧은 시간 동안 상기 고상과 접촉시킬 것이 요구될 뿐이다. 하기 예들에서 설명되는 것처럼, 상당량의 핵산을 캡처하기 위한 접촉 시간은 3분 이하일 수 있고, 몇몇 케이스에서는 30초에 불과할 수도 있다. 캡처된 양은, 겔 전기 영동(gel electrophoresis), 형광 착색(fluorescent staining) 및 PCR 증폭과 같은 종래 기술을 이용한 상기 고상으로부터의 방출 후에 용이하게 검출할 수 있다.
편의상 상기 고상 바인딩 물질은 물, 또는 세포 용해나 세포 파괴를 초래하지 않는 것으로 알려진 용액 또는 버퍼 내의 샘플에 첨가될 수 있다. 그러나, 상기 고상 바인딩 물질은 건조 고상으로 직접 상기 샘플에 첨가될 수도 있다.
본 발명의 바람직한 일 태양에 따르면,
a) 고상 바인딩 물질을 제공하는 단계; 및
b) 전혈 샘플과 상기 고상 바인딩 물질을, 핵산을 상기 고상 바인딩 물질에 바인딩하기에 충분한 시간 동안 바인딩하는 단계를 포함하는 유기체의 전혈로부터 핵산을 캡처하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 태양에 따르면,
a) 고상 바인딩 물질을 제공하는 단계; 및
b) 전혈 샘플과 상기 고상 바인딩 물질을, 백혈구로부터의 핵산을 상기 고상 바인딩 물질에 바인딩하기에 충분한 시간 동안 결합하는 단계를 포함하는 유기체의 전혈 내의 백혈구 내에 함유된 핵산을 캡처하는 방법이 제공된다.
상기 방법은
c) 상기 고상 바인딩 물질로부터 상기 샘플을 분열시키는 단계;
d) 상기 고상 바인딩 물질을 선택적으로 세척하는 단계; 및
e) 상기 바인딩된 핵산을 상기 고상 바인딩 물질로부터 방출하는 단계의 추가 단계들을 수행함으로써 상기 캡처된 핵산을 분리하는 데에도 사용할 수 있다.
본 발명의 방법과 함께 사용되는 핵산을 바인딩하는 고상 물질들은 그 크기, 형상, 기공도 및 기계적 성질들을 한정하는 매트릭스를 포함하고, 입자, 미세 입자, 섬유, 비드, 멤브레인, 그리고 시험관 및 마이크로웰과 같은 기타 서포트의 형태일 수 있다. 임의의 특정 작용 원리에 의해 제한되기를 원하는 것은 아니지만, 본 방법에서 효과적인 상기 고상 서포트의 표면이 상기 샘플로부터 직접 핵산을 고정하는 역할을 하는 경우일 수 있다. 본 명세서에 사용된 핵산 캡처라는 개념은 일반적으로, 사용 조건 하에서 고상에 핵산을 결합시키기 위해 작용하는 모든 방식을 포함하며, 고상이 미손상 세포를 바인딩하는 경우도 고려한다.
고상 물질은 전혈, 박테리아 배양물과 같은 세포 물질의 샘플로부터 직접 핵산을 바인딩하는 바람직한 성질을 가지는 임의의 적당한 물질일 수 있다. 바람직한 고상 물질은 실리카, 유리, 합성 중합체, 또는 불용성 다당류로 코팅된 자기 반응성 물질은 물론이고, 실리카, 유리, 소결 유리, 조절 공극 유리, 소결 유리, 알루미나, 지르코니아, 티타니아, 불용성 합성 중합체, 불용성 다당류, 및 금속, 금속 산화물 및 금속 황화물에서 선택된 금속성 물질을 포함한다. 예시 물질은 세포를 파괴하고 핵산을 끌어당기는 기능을 하는 공유 부착된 표면 작용기(surface functional group)로 기능화되거나 코팅된 실리카계 물질을 포함한다. 또한, 적당하게 표면-기능화된(surface-functionalized) 탄수화물계 물질 및 이러한 표면 기능성을 가지는 중합체 물질을 포함한다. 매우 많은 특정 물질들과 그 조제가 본 출원인들의 함께 계류중인 미국 출원번호 10/714,763, 10/715,284, 10/891,880, 10/942,491 및 60/638,631에 설명되어 있다.
일 실시예에서, 상기 물질은 다양한 길이의 핵산 분자들의 캡처 및 바인딩을 가능하게 하는 표면이나 표면 근처의 공유 링크된 핵산 바인딩 부위를 더 포함한다. 표면은 고상 물질의 외면뿐만 아니라 고상 물질 내의 임의의 접근 가능한 다공성 영역의 표면도 함께 의미한다. 매우 많은 특정 물질들과 그 조제가 본 출원인들의 함께 계류중인 미국 출원번호 10/714,763, 10/715,284, 10/891,880, 10/942,491 및 60/638,631에 설명되어 있다.
본 발명의 또 다른 태양에서는,
a) 핵산 바인딩 부위가 부착되는 매트릭스를 포함하는 고상을 제공하는 단계;
b) 핵산을 함유하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플과 상기 고상을, 상기 핵산을 상기 고상에 바인딩하기에 충분한 시간 동안 결합하는 단계를 포함하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플로부터 핵산을 캡처하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에서는,
a) 핵산 바인딩 부위가 부착되는 매트릭스를 포함하는 고상을 제공하는 단계;
b) 핵산을 함유하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플과 상기 고상을, 상기 핵산을 상기 고상에 바인딩하기에 충분한 시간 동안 결합하는 단계;
c) 상기 샘플을 상기 고상으로부터 분열시키는 단계;
d) 상기 고상을 선택적으로 세척하는 단계; 및
e) 상기 바인딩된 핵산을 상기 고상으로부터 방출하는 단계를 포함하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플로부터 핵산을 분리하는 방법이 제공된다.
또 다른 실시예에서는, 상기 물질은 다양한 길이의 핵산 분자들을 캡처하고 바인딩할 수 있게 하는 표면이나 표면 근처의 비공유 결합된 핵산 바인딩 부위를 더 포함한다. 상기 비공유 결합된 핵산 바인딩 부위는 표면 위의 반대 전하로 대전된 잔류물에 대한 정전기 인력에 의해 고체 매트릭스와 결합되거나 표면과의 소수성 인력에 의해 결합된다.
공유 또는 비공유 부착된 핵산 바인딩기(nucleic acid binding group)를 가지는 이러한 물질들의 매트릭스 물질은 임의의 적당한 물질일 수 있다. 바람직한 매트릭스 물질은 실리카, 유리, 합성 중합체, 또는 불용성 다당류로 코팅된 자기 반응성 물질은 물론이고, 실리카, 유리, 불용성 합성 중합체, 불용성 다당류, 및 금속, 금속 산화물 및 금속 황화물에서 선택된 금속성 물질에서 선택된다. 예시 물질은 세포를 파괴하고 핵산을 끌어당기는 역할을 하는 공유 부착 표면 작용기로 기능화되거나 코팅된 실리카계 물질을 포함한다. 적당하게 표면-기능화된 탄수화물계 물질, 및 이러한 표면 기능성을 가지는 중합체 물질도 또한 포함된다. 매우 많은 특정 물질들 및 그 조제가 본 출원인들의 함께 계류중인 미국 출원번호 10/714,763, 10/715,284, 10/891,880, 10/942,491 및 60/638,631에 설명되어 있다. 핵산 바인딩기의 기능을 하는 표면 작용기는 세포의 구조적 완전성을 파괴하고 핵산이 고상 서포트로 끌어 당겨지도록 할 수 있는 임의의 기를 포함한다. 그러한 기(group)는, 비제한적으로, 아래에서 설명된 히드록실, 실란올, 카르복실, 아미노, 암모늄, 4급 암모늄 및 포스포늄 염과 3급 술포늄 염 유형의 물질들을 포함한다. 바인딩을 위한 제1의 저 pH에서 양자가 부가되고, 바인딩된 핵산이 방출되는 동안 제2의 고 pH에서 양자가 제거되는 아미노기를 포함하는 고상 물질, 예컨대 유럽 특허명세서 EP01036082B1에 개시된 물질이 본 발명에서 유용한 고상 물질의 범위 내에 속하는 것으로 고려된다.
많은 용도에 있어, 상기 고상 물질은 입자 형태인 것이 바람직하다. 바람직하게는 상기 입자의 크기는 50 ㎛ 미만이고 더욱 바람직하게는 10 ㎛ 미만이다. 작은 입자는 용액에 더욱 쉽게 분산되고 더욱 큰 표면/부피 비율을 가진다. 큰 입자와 비드도 중력 침전이나 원심분리가 사용되는 방법에서 유용하다. 상기 고상은 바람직하게는, 일반적으로 자기장에 끌어 당겨지고 조종될 수 있는 자기 미세- 입자의 형태인 자기 반응성 부위를 더 포함할 수 있다. 그러한 자기 미세입자는 자기 금속 산화물 또는 금속 황화물 코어를 포함하는데, 이러한 코어는 일반적으로 핵산 바인딩기가 공유적으로 바인딩되는 공유 또는 흡착 바인딩 층으로 둘러싸여서 표면을 코팅한다. 자기 금속 산화물 코어는 바람직하게는 철 산화물 또는 철 황화물이고, 여기서 철은 Fe2 +나 Fe3 +, 또는 둘 모두이다. 자기 입자는 미국 특허번호 4,654,267에 개시된 것처럼, 다공성 중합체가 존재할 때 금속 입자를 침전시켜 자기 반응성 금속 입자를 포착함으로써 형성할 수 있다. 바람직한 자기 금속 산화물은 따라서 Fe3O4, Fe2O3, MnFe2O4, NiFe2O4, 및 CoFe2O4를 포함한다. 다른 자기 입자들도 미국 특허번호 5,411,730에 개시된 것처럼 올리고당 덱스트런이 존재할 때 금속 산화물 입자들을 침전시켜 자기 반응성 금속 입자들을 포착함으로써 형성할 수도 있다. 또 다른 종류의 자기 입자가 기언급된 미국 특허번호 5,091,206에 개시되어 있다. 상기 입자는 금속 산화물층을 보호하고 반응성 코팅을 제공하기 위해 상자성 금속 산화물층 및 추가 중합체층으로 코팅된 중합체 코어를 포함한다. 클로로메틸화 메리필드 수지(chloromethylated Merrifield resin)를 함유하는 마그네타이트의 준비가 문헌(Tetrahedron Lett., 40 (1999), 8137-8140)에 설명되어 있다.
상업적으로 입수 가능한 자기 실리카 또는 자기 중합체 입자들이 본 발명에서 유용한 자기 고상 바인딩 물질을 준비하는 데에 개시 물질로 사용될 수 있다. 표면 카르복실기를 가지는 중합체 입자로 적당한 유형은 상표명 SeraMagTM (Seradyn) 및 BioMagTM (Polysciences and Bangs Laboratories)로 알려져 있다. 실리카 자기 입자로 적당한 유형은 상표면 MagneSilTM (Promega)로 알려져 있다. 표면에 카르복시기 또는 아미노기를 가지는 실리카 자기 입자는 Chemicell GmBH (Berlin)로부터 입수 가능하다.
출원인들은 본 발명에 따라 노출된 또는 코팅된 금속 코어들을 핵산 바인딩 (NAB) 부위가 링크되는 유기 링커기와 링크하여 자기 반응성 미립자 바인딩 물질을 준비했다. 코팅 금속 코어를 준비할 때, 편리한 코팅 코어는 실리카-코팅 자기 코어 또는 유리-코팅 자기 코어이다. 바람직한 자기 반응성 금속 코어는 마그네타이트, Fe3O4에 의해 제공된다. 마그네타이트는 상업적으로 입수하거나, 일반적으로 알려진 방법에 따라 염기성 용액 내에서 철 (Ⅱ)와 철 (Ⅲ) 염을 반응시켜 준비할 수 있다.
한 말단에서 트리알콕시실란기(trialkoxysilane group)를 포함하는 링커기는 금속 물질이나, 실리카 또는 유리-코팅 자기 입자와 같은 코팅 금속 물질의 표면에 부착될 수 있다. 바람직한 트리알콕시실란 화합물은 R1-Si(OR)3의 식으로 표현되고, 여기서 R은 저급 알킬이고 R1은 선형 체인, 분기 체인 및 고리에서 선택되는 유기기이고 1 내지 100 원자를 포함한다. 상기 원자는 바람직하게는 C, H, B, N, O, S, Si, P, 할로겐 및 알칼리 금속에서 선택된다. 예시적인 R1 기는 하기에서 더욱 상세히 설명되는 것처럼 절단성 모이어티를 포함하는 기는 물론이고, 3-아미노프로필, 2-시아노에틸 및 2-카르복시에틸이다. 바람직한 실시예에서, 트리알콕시실란 화합물은 절단성 중앙 부위 및 반응기 말단 부위를 포함하는데, 여기서 반응기는 3급 아민, 3급 포스핀 또는 유기 황화물과의 반응에 의해 한 단계에 4급 또는 3급 오늄 염으로 변환될 수 있다.
그러한 링커기는 불화물 이온을 이용하여 공정 중에 금속 입자와 유리 및 실리카-코팅 금속 입자의 표면에 자리 잡을 수 있는 것으로 알려졌다. 톨루엔을 포함하는 저급 알콜 및 방향족 용매를 포함하는 유기 용매에서 상기 반응이 수행될 수 있다. 적당한 불화물 소스는 그러한 유기 용매에서 상당한 용해도를 가지며 세슘 불화물 및 테트라알킬암모늄 불화물 염을 포함한다.
본 발명 방법에 유용한 고상 바인딩 물질을 포함하는 NAB기는 이중 목적을 충족시키는 것으로 나타난다. NAB기는 다양한 길이 및 염기(base) 조성이나 서열의 핵산, 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드를 끌어당겨 바인딩한다. NAB기는 또한 어느 정도는 세포 외막(cellular envelope)으로부터 핵산을 유리시키는 기능을 할 수도 있다. 핵산 바인딩기는 예컨대, 카르복실, 아민 및 3급 또는 4급 오늄기 또는 이러한 기들 중 하나 이상의 혼합물을 포함한다. 아민기는 NH2, 알킬아민 및 디알킬아민기일 수 있다. 바람직한 NAB기는 4급 트리알킬암모늄기(-QR3 +), 트리알킬포스포늄 또는 트리아릴포스포늄 또는 혼합 알킬 아릴 포스포늄기를 포함하는 포스포늄기(-QR3 +), 및 3급 술포늄기(-QR2 +)를 포함하는 3급 또는 4급 오늄기이다. 고상은 본 명세서에서 설명된 바와 같이 하나 이상의 종류의 핵산 바인딩기를 함유할 수 있다. 핵산을 바인딩하는 데에 있어, 3급 또는 4급 오늄기-QR2 + 또는 QR3 +, 여기서 R기는 적어도 네 개의 탄소를 가지는 알킬-를 포함하는 고상 물질이 특히 효과적이지만, 탄소를 하나밖에 가지지 않는 알킬기도 아릴기처럼 유용하다. 그러한 고상 물질은 바인딩된 핵산을 강한 점착력으로 보유하며, 종래 기술에 따른 용리에 사용되는 대부분의 조건에서 핵산의 제거나 용리에 견뎌낸다. 공지된 대부분의, 저이온 강도 및 고이온 강도 모두의 용리 조건들이 바인딩된 핵산을 제거하지 못한다. DEAE 및 PEI기를 함유하는 종래의 음이온-교환 수지와 달리, 3급 또는 4급 오늄 고상 물질은 반응 매질의 pH에 무관하게 양이온 대전 상태를 유지한다.
몇몇 바람직한 실시예들은 선택적으로 파괴될 수 있는 링크를 통해 상기 NAB기가 상기 매트릭스에 부착되는 고상 바인딩 물질을 사용한다. 상기 링크의 파괴는 임의의 바인딩된 핵산을 상기 고상으로부터 효과적으로 "차단한다". 상기 링크는 절단성 링커(cleavable linker)의 결합(들)을 특정적으로 파괴할 뿐 관심 핵산을 함께 파괴하지는 않는 임의의 화학적, 효소적, 광화학적 또는 기타 수단에 의해 절단될 수 있다. 그러한 절단성 고상 물질은 실리카, 유리, 불용성 합성 중합체, 불용성 다당류, 및 금속, 금속 산화물 및 금속 황화물에서 선택되는 금속 물질에서 선택되는 매트릭스를 포함한다. 핵산을 끌어당기고 바인딩하는 핵산 바인딩(NAB) 부위는 절단성 링커 부위에 의해 상기 고체 서포트의 표면에 부착된다.
Figure 112007028808434-PCT00001
바람직한 일 실시예에서 상기 NAB는 전술한 바와 같이 식 QR2 +X-의 3급 오늄기 또는 식 QR3 +X-의 4급 오늄기이다.
Figure 112007028808434-PCT00002
절단성 링커 부위는 바람직하게는 선형 체인, 분기 체인 및 고리에서 선택되는 유기기이고 1 내지 100 원자를 포함한다. 상기 원자는 바람직하게는 C, H, B, N, O, S, Si, P, 할로겐 및 알칼리 금속에서 선택된다. 예시 링커기는 가수분해에 의해 절단되는 가수분해 절단성 기(hydrolytically cleavable group)이다. 술폰산염 에스테르처럼 카르복실 에스테르와 무수 화합물(anhydride), 티오에스테르, 탄산염 에스테르, 티오탄산염 에스테르, 우레탄, 이미드, 술폰아미드, 및 술폰이미드가 대표적이다. 바람직한 일 실시예에서 상기 절단성 링크는 알칼리성 수용액으로 처리된다. 다른 예시 종류의 링커기는 에탄티올, 메르캅토에탄올, 및 DTT와 같은 티올에 의해 절단되는 이황화 결합(S-S bond)과 같은 환원성 절단을 겪게 되는 기이다. 또 다른 대표적 기는 과산화 결합(O-O bond)을 포함하는 유기 기이다. 과산화 결합은 티올, 아민 및 포스핀에 의해 절단될 수 있다.
또 다른 대표적 기는 하기 식에 의해 표현되고
Figure 112007028808434-PCT00003
여기서 Rd는 H, 알킬 또는 페닐인 니트로-치환 방향족 에테르 및 에스테르와 같은 광화학 절단성 링커기이다. 오르토-니트로벤질 에스테르는 자외선광에 의해 하기 공지 반응에 따라 절단된다.
Figure 112007028808434-PCT00004
또 다른 대표적인 절단성 기는 효소 절단성 링커기이다. 예시 기는 에스테라아제와 가수분해효소에 의해 절단되는 에스테르, 프로테아제와 펩티다아제에 의해 절단되는 아미드와 펩티드, 글리코시다제에 의해 절단되는 글리코시드기를 포함한다.
또 다른 대표적인 절단성 기는 절단성 1,2-디옥세탄 모이어티(moiety)이다. 그러한 물질은 열적으로 분해되거나 화학 또는 효소제에 의해 붕괴(fragmentation)가 유발될 수 있는 디옥세탄 모이어티를 포함한다. 보호기를 제거하여 산소음이온을 생성하면 디옥세탄 고리의 분해가 촉진된다. 공지의 과정에 따라 C-C 결합뿐만 아니라 과산화 O-O 결합도 절단함으로써 붕괴가 일어난다. 절단성 디옥세탄은 많은 특허와 문헌에 설명되어 있다. 대표적인 예는 미국 특허번호 4,952,707, 5,707,559, 5,578,253, 6,036,892, 6,228,653, 및 6,461,876을 포함한다.
Figure 112007028808434-PCT00005
선택적으로, 링크된 오늄기는 아릴기 Ar이나 절단성 기 Y에 부착될 수 있다. 또 다른 선택으로, 고상 및 3급이나 4급 오늄기로의 링크는 도시된 방위와 반대로 된다.
또 다른 절단성 링커기는 불안정 1,2-디옥세탄 모이어티로 변환될 수 있는 전자-풍부 C-C 이중 결합이다. 상기 이중 결합 상의 치환기 중 적어도 하나는 O, S 또는 N 원자에 의해 상기 이중 결합에 부착된다. 전자-풍부 이중 결합과 1중항 산소가 반응하면 주위 온도에서 자발적으로 붕괴되어 두 개의 카르보닐 조각을 생성하는 불안정 1,2-디옥세탄 고리기를 만든다. 전자-풍부 이중 결합으로부터 형성된 불안정 디옥세탄은 예컨대 A.P. Schaap 및 S.D. Gagnon, J. Am. Chem. Soc., 104, 3504-6 (1982); W. Adam, Chem. Ber., 116, 839-46 (1983); 미국 특허번호 5,780,646과 같은 많은 특허와 문헌에 설명되어 있다.
Figure 112007028808434-PCT00006
절단성 링커 기를 가지는 고상 물질의 또 다른 기는 국제특허공개번호 WO 03/053934에 개시된 것처럼 절단성 모이어티로 케텐 디티오아세탈을 가진다. 케텐 디티오아세탈은 과산화효소 및 과산화수소와의 효소 산화에 의해 산화성 절단을 겪게 된다.
Figure 112007028808434-PCT00007
상기 절단성 모이어티는 도시된 구조를 가지고, 아크리단(acridan) 고리가 치환되는 유사체를 포함하고, 상기 Ra, Rb, Rc는 각각 C, N, O, S, P, Si 및 할로겐 원자에서 선택된 1 내지 약 50 개의 비수소 원자를 포함하는 유기 기이고, 그리고 Ra 및 Rb는 함께 결합하여 고리를 형성할 수 있다. 다른 많은 절단성 기들은 당업자에게 명백하다.
본 발명의 또 다른 태양에서는,
a) 핵산 바인딩 부위가 선택적 절단성 링크를 통해 부착되는 매트릭스를 포함하는 고상을 제공하는 단계;
b) 핵산을 함유하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플과 상기 고상을, 상기 핵산을 상기 고상에 바인딩하기에 충분한 시간 동안 결합하는 단계를 포함하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플로부터 핵산을 캡처하는 방법이 제공된다.
또한,
a) 핵산 바인딩 부위가 선택적 절단성 링크(selectively cleavable linkage)를 통해 부착되는 매트릭스를 포함하는 고상을 제공하는 단계;
b) 핵산을 함유하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플과 상기 고상을, 상기 핵산을 상기 고상에 바인딩하기에 충분한 시간 동안 결합하는 단계;
c) 상기 샘플을 상기 고상으로부터 분열시키는 단계;
d) 상기 고상을 선택적으로 세척하는 단계; 및
e) 상기 링커(linker)를 선택적으로 절단함으로써 상기 바인딩된 핵산을 상기 고상으로부터 방출하는 단계를 포함하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플로부터 핵산을 분리하는 방법도 더 제공된다.
바람직한 일 실시예에서, 상기 고상은 실리카, 유리, 불용성 합성 중합체, 및 불용성 다당류에서 선택된 매트릭스, 및 R이 C1-C20 알킬, 아랄킬 및 아릴기에서 선택되는 식 QR2 +X-로 표현되는 3급 술포늄기, R이 C1-C20 알킬, 아랄킬 및 아릴기에서 선택되는 식 NR3 +X-로 표현되는 4급 암모늄기, 및 R이 C1-C20 알킬, 아랄킬 및 아릴기에서 선택되는 식 PR3 +X-로 표현되는 4급 포스포늄기에서 선택되고, 여기서 X는 음이온인 상기 매트릭스의 표면에 부착되는 오늄기(onium group)를 포함한다.
핵산을 함유하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플과 상기 고상을 결합하는 상기 단계는 상기 샘플 물질과 상기 고상 바인딩 물질을 혼합하는 단계와, 선택적으로, 상기 고상을 상기 샘플의 용적 내에 균일하게 분산시키기 위해 상기 혼합물을, 상기 세포 물질을 부수고 핵산을 상기 고상에 바인딩시키기에 충분한 시간 동안, 기계적으로 교반(agitating)하는 단계를 포함한다. 상기 샘플의 핵산 내용물을 모두 상기 고상에 바인딩시킬 필요는 없지만, 가능한 한 많이 바인딩시키는 것이 유리하다. 상기 샘플/고상 혼합물의 교반(agitation)은 진동 교반(shaking), 기계적 진동기나 락커(rocker)의 이용, 와동 교반(vortexing), 초음파 교반 등을 포함하는 임의의 편리한 형상을 취할 수 있다. 이 단계에서 핵산 바인딩에 필요한 시간은 일반적으로 수 초 내지 수 분 대이지만, 일상적인 실험에 의해 실험적으로 검증될 수 있다.
상기 고상으로부터 상기 샘플을 분열시키는 단계는, 예컨대, 여과법, 중력 침강법, 경사법(decantation), 자기 분리법, 원심 분리법, 진공 흡인법, 공기나 기타 가스의 과압으로 액체를 다공성 막이나 필터 매트를 통해 밀어 넣는 등의 방법에 의해 수행될 수 있다. 핵산 외의 샘플 성분들이 이 단계에서 제거된다. 기타 성분들의 제거가 완료되기 전까지는 완전히 제거되도록 돕기 위해 일 회 이상의 세척이 수행될 수 있다. 염, 생물학 또는 세포 조각, 단백질 및 헤모글로빈과 같은 샘플 성분들을 제거하기 위한 세척제는 물 및 수성 버퍼 용액을 포함하며 계면 활성제를 함유할 수 있다.
상기 고상으로부터 상기 바인딩된 핵산을 방출하는 단계는 상기 고상 물질을 용액과 접촉시켜 상기 바인딩된 핵산을 상기 고상으로부터 방출하는 것을 포함한다. 상기 용액은 상기 방출된 핵산을 용해하여 충분히 보존해야 한다. 상기 용액은 약 7-9의 pH를 가지고, 선택적으로 0.1-3 M의 버퍼 염, 금속 할로겐화물 또는 아세테이트 염을 함유하며, 선택적으로 0.1-50%의 유기 공용매 또는 계면 활성제를 함유하는 수성 버퍼 용액을 포함하는 시약 조성물일 수 있다.
절단 후에 고상으로부터 핵산을 방출하는 상기 시약은 택일적으로 강 알칼리성 수용액일 수 있다. 적어도 10-4 M의 농도의 알칼리 금속 수산화물이나 암모늄 수산화물의 용액은 상기 절단된 고상으로부터 핵산을 절단하고 용리하는 데에 효과적이다. 강 알칼리성 용액은 공유 결합 파괴에 의해 붕괴되거나 절단될 수 있는 기를 통해 핵산 바인딩 부위가 매트릭스에 부착되는 고상 바인딩 물질과 함께 유용하다. 그러한 물질들은 하기에서 설명되며, 전술한 함께 계류중인 미국 특허출원번호 10/714,763, 10/715,284 및 10/891,880에도 설명되어 있다. 상기 방출 단계는 실온에서 수행될 수 있지만, 임의의 편리한 온도가 사용될 수 있다. 용리 온도는 본 핵산 분리 방법의 성공에 민감하지 않은 것으로 나타났다. 주위 온도가 바람직하지만, 온도가 올라가면 몇몇 경우에 용리 속도가 증가할 수 있다.
고상 핵산 캡처 방법은 수많은 용도에 사용될 수 있다. 하기 특정 예에서 설명되는 것처럼, 단일 가닥 및 이중 가닥 핵산의 양자 모두가 캡처 및 방출될 수 있다. DNA, RNA, 및 PNA도 캡처 및 방출될 수 있다.
본 방법의 바람직한 용도는 전혈로부터 DNA를 분리하는 것이다. 이론적 배경 부분에서 설명된 것처럼, 전혈의 백혈구로부터의 DNA 추출은 번거로운, 자동화가 어려운 다단계 공정이거나 용액 세포용해 조건 하의 고체 서포트를 이용한다. 본 발명의 방법은 종래 방법의 한계를 극복했다. 본 방법은 작동상 간단하며, 핵산 내용물을 고상 물질로 캡처시키기 위해 짧은 시간 동안 혈액 샘플과 고상 바인딩 물질 사이의 혼합을 필요할 뿐이다. 전체 공정은 수동으로 5분 내에 수행된다. 본 방법은 특히 고체 물질이 입자나 미세입자의 형태일 때 효과적이고 신속하다. 간단하고 수행 시간이 짧음에도 불구하고 상당한 야의 핵산이 캡처된다.
본 방법의 중요한 효과는 많은 다운스트림 분자 생물학 공정과 호환된다는 것이다. 본 방법에 의해 분리된 핵산은 많은 경우에 후속 공정에서 직접 사용될 수 있다. PCR과 같은 증폭 반응, 미국 특허번호 5,998,175에서 설명된 다중 올리고머 결찰(ligation of multiple oligomers: LMO), 및 LCR이 그러한 핵산 용리액(eluent)를 사용할 수 있다. 종래 기술에 의한, 특히 박테리아 세포 배양체나 혈액 샘플로부터의 핵산 분리는 큰 부피 분율의 저분자량 알콜을 첨가함에 따른 침전을 필요로 한다. 침전된 물질은 그 후, 사용 전에 적당한 배지에서 분열, 수집 및 재용해되어야 한다. 본 방법을 사용하여 본 발명의 고상 바인딩 물질로부터 핵산을 용리함으로써 이 단계들을 생략할 수 있다. 방출된 핵산을 함유하는 용액을 핵산 증폭 반응에 직접 사용하고, 그로써 폴리머라아제 또는 리가아제-조정 반응을 이용하여 핵산이나 핵산 조각의 양을 증폭하는 것이 바람직한 방법이다.
매우 다양한 고상 바인딩 물질이 상기 부분에서 설명되었고, 수많은 특정 예시 물질들이 하기 특정 예에서 청구된 방법에서 설명된다. 당업자라면 본 명세서에서 설명된 방법을 반복적으로 적용함으로써 적절항 물질을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명은 또한 상기 방법에 유용한 고상 바인딩 물질을 포함하는 키트에 관한 것이기도 하다. 키트는 고상 바인딩 물질과 고상으로부터 핵산을 방출하는 시약을 포함한다. 키트는 또한 세척 완충액, 희석제, 또는 사용 설명서 등과 같은 기타 구성요소들을 포함할 수 있다.
고상 물질은 세포 용해 용액이나 세포 용해제 코팅을 사용하지 않고 핵산을 생물학 또는 세포 물질로부터 직접 캡처하는 능력을 가진다. 핵산을 캡처하기 위한 사용은 예비 세포 용해 단계를 필요로 하지 않고 생물학 또는 세포 물질의 핵산 내용물이 한 단계에 캡처되도록 한다. 일 실시예에서, 고상 물질은 미립자 물질 또는 자기 반응성 미립자 물질이다.
도 1은 본 발명에 따른, 혈액 샘플에서 핵산을 분리하는 방법을 개략적으로 나타낸 도면.
도 2A는 예 2의 입자들을 사용하여 인간 혈액 샘플에서 분리된 DNA를 보여주는 겔의 이미지.
도 2B는 도 2A와 같이 분리된 게놈 DNA 영역을 증폭한 것을 보여주는 겔의 이미지.
도 3은 예 2 또는 예 7의 입자들과 다양한 첨가제들을 사용하여 본 발명에 따라 분리된 게놈 DNA 영역을 증폭한 것을 보여주는 겔의 이미지.
도 4는 본 발명의 다양한 입자들을 사용하여 인간 혈액 샘플에서 분리된 DNA를 보여주는 겔의 이미지.
도 5A는 예 2 또는 예 4의 입자들을 사용하고 다양한 농도의 NaOH로 용리시켜 인간 혈액 샘플에서 분리된 DNA를 보여주는 겔의 이미지.
도 5B는 도 5A와 같이 분리된 게놈 DNA 영역을 증폭한 것을 보여주는 겔의 이미지.
도 6은 본 발명의 다양한 입자들을 사용하여 인간 혈액 샘플에서 분리된 DNA 를 보여주는 겔의 이미지.
하기 예에서 구조도가 제시된 경우, 그 구조도는 고상 물질의 절단성 링커 부위만을 설명하기 위한 것이다. 그 구조도가 고상 물질을 완전히 설명하는 것은 아니다.
예 1. 4'- 히드록시페닐 4- 클로메틸티오벤조에이트의 합성.
3 ℓ 플라스크에 4-클로로메틸벤조산 100.9 g과 티오닐 염화물 1.2 ℓ를 채웠다. 반응을 4시간 동안 환류시켰고, 그 후 티오닐 염화물을 감압 하에서 제거했다. CH2Cl2를 첨가하고 감압 하에서 기화시켜 잔류 티오닐 염화물을 제거했다.
113.1 g의 4-클로로메틸벤조산 염화물을 포함하는 3 ℓ 플라스크에 4-히드록시티오페놀 98.17 g 및 CH2Cl2 1.5 ℓ를 채웠다. 아르곤을 퍼지(purge)하고 피리딘 67.75 ㎖를 첨가했다. 밤새 저은 후, 반응 혼합물을 CH2Cl2 1 ℓ로 희석하고 총 5 ℓ의 물로 추출했다. 물 층은 CH2Cl2로 되추출했다. 결합된 CH2Cl2 용액을 황산나트륨 상에서 건조하고 고체로 농축했다. 고체를 CH2Cl2 500 ㎖로 세척하고, 여과 및 공기 건조시켰다. 1H NMR (아세톤-d6): δ 4.809 (s, 2H), 6.946-6.968 (d, 2H), 7.323-7.346 (d, 2H), 7.643-7.664 (d, 2H), 8.004-8.025 (d, 2H).
예 2. 폴리메타크릴산염 링커로 기능화되고, 트리부틸포스포늄기와 절단성 아릴티오에스테르 링크를 포함하는 자기 실리카 입자의 합성.
Figure 112007028808434-PCT00008
자기 카르복시산-기능화 실리카 입자(Chemicell, SiMAG-TCL, 1.0 meq/g, 1.5g)를 20 ㎖의 염화티오닐에 넣고 4 시간 동안 환류시켰다. 과잉 염화티오닐을 감압 하에서 제거했다. 수지를 CHCl3 25 ㎖에 재현탁하고 현탁액을 초음파로 분산시켰다. 용매를 기화하고 초음파 세척 처리를 반복했다. 후에 사용하기 위해 입자를 진공 하에서 건조시켰다.
산 염화물 기능화 입자(acid chloride functionalized particles)를 388 mg의 디이소프로필에틸아민과 함께 CH2Cl2 38 ㎖에 현탁했다. 4'-히드록시페닐 4-클로로메틸-티오벤조에이트(524mg)를 첨가하고 봉인된 반응 플라스크를 밤새 진동 교반기(shaker)에 올려두었다. 입자를 50 ㎖ 플라스틱 시험관으로 옮기고, 자기 분열로, 일부의 CH2Cl2, CH3OH, 1:1 CH2Cl2/CH3OH, 그리고 이어서 CH2Cl2로 반복 세척했다. 미반응 가용성 개시 물질의 제거를 위해 TLC로 세척 용액을 모니터했다. 계속하여 사용하기 전에 고체를 공기 건조시켰다.
수지(1.233 g)를 아르곤 하, CH2Cl2 20 ㎖에서 현탁했다. 트리부틸포스핀(395 mg)을 첨가하고 슬러리를 7 일간 진동 교반했다. 입자를 50 ㎖의 플라스틱 시험관으로 옮기고 CH2Cl2 40 ㎖로 4회 세척했으며, 이어서 MeOH 40 ㎖로 4회, CH2Cl2 40 ㎖로 4회 세척했다. 그 후 수지를 공기 건조하여 1.17 g의 연갈색 고체를 얻었다.
예 3. 트리부틸포스포늄기를 포함하는 절단성 링커로 기능화된 규산염 링커의 합성.
Figure 112007028808434-PCT00009
헵탄 75 ㎖와 에탄올 13 ㎖ 내의 3-아미노프로필트리에톡시실란(13.2 ㎖)의 용액을 아르곤 하에 두고 숙신산 무수화물 5.5 g으로 저었다. 반응을 4.5시간 동안 환류시키고 그 후 밤새 실온으로 냉각시켰다. 용매를 제거하여 아미드 생성물을 맑은 기름으로 얻었다.
CH2Cl2 100 ㎖ 내의 상기 생성물 2.86 g과 EDC 염산염(4.0 g)의 용액을 Ar 아래에 두고 1시간 동안 저은 후 4'-히드록시페닐 4-클로로메틸티오벤조에이트(예 1) 5.5g을 첨가했다. 반응을 밤새 저었다. 반응 혼합물을 실리카 150 g 상으로 크로마토그래프하고, 1-2% EtOH/CH2Cl2로 용리하여 결합 생성물 1.84 g을 백색 고체로 얻었다.
예 4. 트리부틸포스포늄기를 포함하는 절단성 링커로 기능화된 실리카 입자의 합성.
Figure 112007028808434-PCT00010
캐뉼러를 통해 건조 톨루엔 50 ㎖ 내의 예 3의 생성물을 Ar 블랭킷 하에서 오븐-건조된 실리카 3.83 g을 포함하는 플라스크에 첨가했다. 반응을 밤새 환류시켰다. 실온으로 냉각한 후, 실리카를 여과 제거하고, CH2Cl2 500 ㎖로 세척한 후 4시간 동안 진공 건조시켰다.
CH2Cl2 50 ㎖ 내의 클로로벤질 말단기를 가지는 유도체화(derivatized) 실리카(2.0 g)을 트리부틸포스핀 8.0 g과 혼합했다. 반응 혼합물을 Ar 하에서 2일 동안 저었다. 실리카를 여과 제거하고, CH2Cl2와 헥산으로 세척한 후 수 시간 동안 진공 건조시켰다.
예 5. 트리부틸포스포늄기를 포함하는 절단성 링커로 코팅된 자기 입자의 합성.
Figure 112007028808434-PCT00011
예 3의 규산염 링커(0.25 g)와 Fe3O4 입자 0.5 g을 Ar 하, 환류 톨루엔 내에 서 밤새 뒤섞어 반응시켰다. 냉각 후에, 고체와 톨루엔 용액을 50 ㎖ 원심분리관으로 옮겼다. 외부 자석으로 고체를 끌어당기고, 톨루엔을 옮겨 따른 후, 고체를 3x 톨루엔과 3x CH2Cl2로 세척했다.
이전 단계의 입자(0.40 g)를 CH2Cl2 25 ㎖에 현탁했다. 트리부틸포스핀(1.6 g)을 현탁액에 첨가하고 용기를 밀봉한 후 궤도형 교반기(orbital shaker)에 1.5일간 올려두었다. 고체에 대해 전술한 자기 세척을 실시하여 흑색 분말을 얻었다.
예 6. 트리부틸포스포늄기를 포함하는 절단성 링커로 코팅된 자기 실리카 입자의 합성.
절단성 핵산 바인딩기를 실리카 표면에 부동적으로(passively) 흡착하여 핵산 바인딩 물질을 준비했다.
스테아린산(1.33 g)을 SOCl2 10 ㎖에서 2시간 동안 환류시켰다. 과잉 SOCl2를 감압 하에서 제거하여 스테아로일 염화물을 갈색 액체로 생성했다.
스테아로일 염화물을 CH2Cl2 10 ㎖에 용해시킨 후, CH2Cl2 30 ㎖ 내의 예 1에서 설명된 바와 같이 준비된 4'-히드록시페닐 4-클로로메틸티오벤조에이트 1,0 g과 디이소프로필에틸아민 1.56 ㎖의 용액에 첨가하고, 혼합물을 밤새 저었다. 용매를 제거하고, 잔류물에 대해 1:1 헥산/CH2Cl2를 용리액으로 사용하여 칼럼 크로마토그래피(column chromatography)를 실시했다. 상기 스테아로일 에스테르(1.43 g)를 백색 고체로 분리했다.
CH2Cl2 30 ㎖ 내의 상기 생성물(1.43 g)과 트리부틸포스핀(1.27 ㎖)의 용액을 Ar 분위기 아래에서 2일간 저었다. CH2Cl2를 제거한 후 잔류물을 6 x 50 ㎖의 에테르로 세척했다. 그 후 CH2Cl2에 재용해하고 에테르로 침전시켜 포스포늄 염 생성물 1.69 g을 얻었다. 이 물질은 물에 녹지 않는 것으로 나타났다.
Figure 112007028808434-PCT00012
상기 포스포늄 염(0.6 g)을 CH2Cl2 6 ㎖에 용해시키고, 실리카 겔 6.0 g에 교반과 함께 첨가하였다. 용매를 기화시켜 핵산 바인딩 물질을 얻었다.
예 7. 폴리비닐벤질 트리부틸포스포늄기를 포함하는 중합체 층을 가지는 자기 입자의 합성.
Figure 112007028808434-PCT00013
유리 비알 내의 CH2Cl2 2 ㎖에 자기 메리필드 펩티드 수지(Chemicell, SiMag Chloromethyl, 100 mg)를 첨가했다. 트리부틸포스핀(80 ㎕)을 첨가하고 슬러리를 실온에서 3일 동안 진동 교반했다. 상기 비알 아래에 자석을 두고 부유물을 피펫으로 제거했다. 고체를 CH2Cl2 2 ㎖로 4회 세척했다(세척제도 자석/피펫 절차로 제거했다). 수지를 공기 건조시켰다(93 mg).
예 8. 트리부틸포스포늄기와 절단성 아릴티오에스테르 링크를 포함하는 폴리메타크릴산염 중합체 입자의 합성.
Figure 112007028808434-PCT00014
폴리(메타크릴로일 염화물) 입자(1.0 meq/g, 1.5 g)를 디이소프로필에틸아민 2.45 g을 포함하는 CH2Cl2 75 ㎖ 내에 두었다. 트리에틸아민(1.2 g)을 첨가했다. 4'-히드록시페닐 4-클로로메틸티오벤조에이트(4.5 g)를 첨가하고 밀봉된 반응 혼합물을 실온에서 밤새 저었다. 슬러리를 여과하고 수지를 CH2Cl2 10 ㎖, 아세톤 200 ㎖, MeOH 200 ㎖, 1:1 THF/CH2Cl2 2 x 100 ㎖, THF 250 ㎖, CH2Cl2 250 ㎖, 헥산 250 ㎖로 세척했다. 후에 사용하기 위해 수지를 공기 건조시켰다.
수지(1.525 g)를 아르곤 하에서 CH2Cl2 25 ㎖에 현탁했다. 트리부틸포스핀(1.7 g)을 첨가하고 슬러리를 4일 동안 저었다. 수지를 여과하고 CH2Cl2 225 ㎖, 이어서 헥산 175 ㎖로 4회 세척했다. 그 후 수지를 공기 건조시켜 1.68 g의 고체를 얻었다.
예 9. 트리부틸포스포늄기를 포함하는 폴리스티렌 중합체의 합성.
Figure 112007028808434-PCT00015
가교결합 클로로메틸화 폴리스티렌인 메리필드 펩티드 수지(Sigma, 1.1 meq/g, 20.0 g)를 아르곤 패드 하에서 CH2Cl2 /DMF (50/50) 200 ㎖에서 저었다. 과잉 트리부틸포스핀(48.1 g, 10 당량)을 첨가하고 슬러리를 실온에서 7일 동안 저었다. 슬러리를 여과하고 그 결과물인 고체를 CH2Cl2 200 ㎖로 2회 세척했다. 수지를 진공 하에서 건조시켰다(21.5 g). 기본 분석: 검출 P 2.52%, Cl 3.08%; 예상 P 2.79%, Cl 3.19%: P/Cl 분율은 0.94.
예 10. 트리부틸암모늄기를 포함하는 폴리스티렌 중합체의 합성.
Figure 112007028808434-PCT00016
메리필드 펩티드 수지(Aldrich, 1.43 meq/g, 25.1 g)를 아르곤 패드 하의 CH2Cl2 150 ㎖에서 저었다. 과잉 트리부틸 아민(25.6 g, 4 당량)을 첨가하고 슬러리를 실온에서 8일 동안 저었다. 슬러리를 여과하고 결과물인 고체를 CH2Cl2 250 ㎖로 2회 세척했다. 수지를 진공 하에서 건조시켰다(28.9 g). 기본 분석: 검출 N 1.18%, Cl 3.40%; 예상 N 1.58%, Cl 4.01%: N/Cl 분율은 0.88.
예 11. 트리부틸포스포늄기로 기능화된 실리카 입자의 합성.
Figure 112007028808434-PCT00017
Ar 하, 110 ℃에서 1시간 동안 건조시킨 실리카 겔(4.82 g)을 Et3N 2.79 g과 함께 CH2Cl2 50 ㎖에 첨가했다. 20분 동안 혼합물을 저은 후 3-브로모프로필트리클로로실란 2.56 g을 첨가하여 발열하도록 했다. 혼합물을 24시간 동안 저은 후 여과하고 고체를 CH2Cl2 3 x 40 ㎖, MeOH 4 x 40 ㎖ 및 CH2Cl2 2 x 40 ㎖로 연속 세척하였다. 고체를 밤새 공기 건조시키고 6.13 g을 얻었다.
CH2Cl2 50 ㎖에 상기 준비된 기능화 실리카(5.8 g)을 트리부틸포스핀 5.33 ㎖로 10일 동안 저었다. 혼합물을 여과하고 고체를 7 x 50 ㎖의 아세톤으로 세척했다. 고체를 공기 건조하여 생성물 5.88 g을 얻었다.
예 12. 예 6의 NAB 물질 내의 링커의 제어된 절단.
예 6의 코팅된 실리카 물질(70 mg)을 D2O 1.0 ㎖에 현탁하고 3분 동안 와동 교반(vortexing)하여 혼합했다. 상기 수용액을 1H NMR 분석한 결과, 용액 속으로 물질이 방출되지 않는 것으로 나타났다.
상기 실리카 현탁액을 40% NaOD 40 ㎕로 처리하고 3분 동안 와동 교반한 후, 부유물을 NMR 분석한 결과, 링커가 절단되고 실리카에서 용액 속으로 방출이 이루어지는 것으로 나타났다.
예 13. 실록산 -코팅 마그네타이트의 합성.
무수 에탄올 100 ㎖ 내의 마그네타이트 1.00 g(Alfa Aesar)을 TEOS 3.2 ㎖, CsF 3.32 g 및 물 1.0 ㎖와 Ar 하, 두 시간 동안 환류에서 반응시켰다. 냉각된 반응 혼합물을 옮겨 따르고 고체를 4x 에탄올과 5x CH2Cl2로 자기(magnetically) 세척했다. 상기 고체를 Ar 하에서 건조시켜 3.14 g의 고체를 얻었다. 이 물질의 1.0 g 부분을 탈이온수 5 x 50 ㎖ 및 메탄올 5 x 50 ㎖로 연속 세척했다. 건조를 통해 고체 0.67 g을 얻었다.
예 14. 폴리비닐벤질 트리부틸포스포늄기를 포함하는 자기 입자의 합성.
초음파 욕을 이용하여 산화철 1.0 g을 에탄올 100 ㎖에 분산시켰다. 반응 용기에 TEOS 1.50 ㎖, p-(클로로메틸)페닐트리메톡시실란 (Gelest) 1.65 g, 불화 세슘 3.32 g 및 탈이온수 1.0 ㎖를 채웠다. 반응 혼합물을 Ar 분위기 아래 환류에서 두 시간 동안 뒤섞었다. 혼합물을 실온으로 냉각하고 용매를 옮겨 따른 후 고상을 에탄올로 5회, CH2Cl2로 5회 자기 세척했다. 상기 고체를 Ar 기류로 건조하여 생성물 2.96 g을 얻었다.
상기 단계의 입자(0.50 g)를 CH2Cl2 20 ㎖에 현탁했다. 트리부틸포스핀(0.5 ㎖)을 현탁액에 첨가하고 용기를 밀봉한 후 궤도형 교반기에 밤새 올려두었다. 고체를 CH2Cl2로 5회 자기 세척하였다. 상기 고체를 Ar 기류로 건조하여 생성물 0.48 g을 얻었다.
예 15. 기능화 실록산 -코팅 마그네타이트의 합성.
Ar 하 환류에서 두 시간 동안, 무수 에탄올 200 ㎖ 내의 마그네타이트 1.00 g(Alfa Aesar)을 3-(트리에톡시실릴)-프로피오니트릴 3.0 ㎖, CsF 3.32 g 및 물 1.0 ㎖와 반응시켰다. 냉각된 반응 혼합물을 옮겨 따르고 고체를 4x 에탄올 및 5x CH2Cl2로 자기 세척했다. Ar 하에서 상기 고체를 건조하여 고체 2.46 g을 얻었다.
예 16. 기능화 실록산 -코팅 조절 공극 유리의 합성.
Ar 플랭킷 하에서 캐뉼러를 통해, 3.83 g의 오븐-건조 조절 공극 유리 Prime Synthesis 천연 CPG(0.5g)를 포함하는 플라스크에 건조 톨루엔 50 ㎖ 내의 예 2의 규산염 링커(1.84 g)를 첨가했다. 반응을 밤새 환류시켰다. 실온으로 냉각한 후에 유리를 여과 제거하고 CH2Cl2 500 ㎖로 세척한 후 4시간 동안 진공 건조시켰다.
CH2Cl2 50 ㎖ 내의 클로로벤질 말단기를 가지는 유도체화(derivatized) 유리(2.0 g)를 트리부틸포스핀 8.0 g과 혼합했다. 반응 혼합물을 Ar 하에서 2일간 저 었다. 유리를 여과 제거하고, CH2Cl2 및 헥산으로 세척한 후 수 시간 동안 진공 건조시켰다.
예 17A. 기능화 자기 폴리스티렌의 합성.
Figure 112007028808434-PCT00018
H2O 내 아민-기능화 자기 폴리스티렌 비드(Spherotech)의 현탁액(4 x 1 ㎖, 각각 25 mg 포함)을 취하여 두 개의 1.5 ㎖ 시험관에 첨가했다. 부유물을 제거하고 비드를 3 x 1 ㎖의 0.1 M MES 완충액, pH 4.0으로 세척했다. 28 mg EDC(0.147 mmol)와 MES 완충액 600 ㎕, 그리고 300 ㎕ DMF(0.174 mmol) 내 4-클로로메틸벤조산 50 mg의 용액을 각 시험관에 첨가했다. 1일간 섞은 후에, 시험관을 1시간 동안 초음파 처리하고 자기 래크(magnetic rack) 위에 두었다. 반응 혼합물을 두 개의 50 ㎖ 시험관으로 옮기고 H2O 40 ㎖로 희석했다. 비드를 물(4 x 40 ㎖), 1:1 CH3OH:H2O(40 ㎖), 및 CH3OH (3 x 40 ㎖)로 자기 세척하고 시험관에서 건조되도록 하였다.
상기 고체(90 mg)를 1.5 ㎖ 시험관에 넣고 CH3OH 800 ㎕를 첨가했다. 이 현탁액에, CH3OH 200 ㎕ 내 PBu3 30 mg의 용액을 첨가했다. 반응 혼합물을 30분간 초 음파 처리하고 실온에서 저어 주었다. 9일간 저어 준 후에, 자석 위에 유지시켜 부유물을 제거했다. 비드를 물(4 x 1 ㎖), CH3OH (4 x 1 ㎖) 및 물(1 x 1 ㎖)로 자기 세척했다. 그 후 비드에 물 1 ㎖를 첨가하여 저장 현탁액(stock suspension) 10 mg/㎖를 만들었다.
예 17B. 기능화 자기 폴리스티렌의 교대 합성.
아세톤 30 ㎖ 내의 4-클로로메틸벤조산(5.86 mmol) 1.00 g과 트리부틸포스핀(12.0 mmol) 3.00 ㎖의 용액을 밤새 Ar 하에서 저어주어 1H NMR에 의해 4-카르복시벤질트리부틸포스포늄 염화물로 확인된 백색 침전물이 형성되도록 하였다. 상기 고체를 여과하여 수집하고 아세톤과 뒤이어 헥산으로 세척했다. 이를 통해 2.19 g, 89%가 얻어졌다.
H2O 내 아민-기능화 자기 폴리스티렌 비드(Spherotech)의 현탁액(2 x 1 ㎖, 각각 25 mg 포함)을 취하여 두 개의 1.5 ㎖ 시험관에 첨가했다. 부유물을 제거하고 비드 3 x 1 ㎖의 0.1 M MES 완충액, pH 4.0으로 세척했다. EDC(15 mg, 78 μmol)와 MES 완충액 200 ㎕/DMF 200 ㎕ 내 4-카르복시벤질트리부틸포스포늄 염화물(80 μmol) 30 mg의 용액과 MES 완충액 600 ㎕를 각 시험관에 첨가했다. 시험관을 30분간 초음파 처리하고 1일 동안 진동 교반기에 올려두었다. 자석 위에 두어 부유물을 제거했다. 비드를 물(4 x 1 ㎖), CH3OH(4 x 1 ㎖), 및 물 (1 ㎖)로 자기 세척하고, 그 후 물을 첨가하여 저장 현탁액 100 mg/㎖를 만들었다.
예 18. 기능화 자기 폴리스티렌의 합성.
Figure 112007028808434-PCT00019
트리부틸포스핀 2.0 g과 아세톤 30 ㎖ 내 4'-아미노페닐 4-클로로메틸벤젠에티오카르복시산염(4-클로로메틸벤조산과 4-아미노티오페놀의 EDC 결합에 의해 준비) 1.0 g의 용액을 Ar 하에 밤새 저었다. 형성된 침전물을 여과하고 아세톤 및 헥산으로 세척했다. 얻어진 포스포늄 염은 1.41 g, 82%였다.
Figure 112007028808434-PCT00020
자기 카르복시화 폴리스티렌 수지, 100 mg/㎖ 현탁액으로부터 1 ㎖를 옮겨 따르고 고체를 3 x 1 ㎖의 0.1 M MES 완충액, pH 4.0으로 세척했다. 상기 단계의 생성물(50 mg)을 DMS 400 ㎕와 MES 완충액 400 ㎕에 용해시켰다. 이 용액을 MES 완충액 200 ㎕ 내 비드의 현탁액에 추가했다. 그 후, EDC 28 mg을 첨가하고 현탁액을 30분간 초음파 처리한 후 진동 교반기에 올려두었다. 하루 동안 저어준 후, 반응 혼합물을 제거했다. 비드를 4 x 1 ㎖ H2O, 4 x 1 ㎖ CH3OH, 1 x 1 ㎖ H2O로 자기 세 척했다. 비드를 H2O(100 mg/㎖)에 현탁했다.
예 19. 기능화 자기 폴리스티렌의 합성.
Figure 112007028808434-PCT00021
100 mg/㎖의 자기 카르복시화 폴리스티렌 수지의 현탁액 1 ㎖에서 부유물을 제거하고 고체를 3 x 1 ㎖의 0.1 M MES 완충액, pH 4.0으로 세척했다. 비드를 MES 800 ㎕ MES에 현탁하고 MES 완충액 200 ㎕ 내 1,4-디아미노부탄 63 mg의 용액을 첨가했다. EDC(28 mg, 0.147 mmol)를 첨가하고 비드를 30분간 초음파 처리한 후, 실온에서 저어 주었다. 반응 혼합물을 비드로부터 자기적으로 분열시켰다. 그 후 물 4 x 1 ㎖와 MES 완충액 4 x 1 ㎖로 비드를 자기 세척했다.
4-카르복시벤질트리부틸포스포늄 염화물(0.134 mmol) 50 mg을 DMF/MES 완충액 400 ㎕의 1:1 혼합물에 용해시키고 MES 완충액 600 ㎕ 내 상기 비드의 현탁액에 첨가했다. 시험관을 30분간 초음파 처리하고 진동 교반기에 올려두었다. 1일간 저어준 후에, 용액을 옮겨 따르고 비드를 물(4 x 1 ㎖), CH3OH(4 x 1 ㎖), 및 물(1 ㎖)로 자기 세척하고 물을 첨가하여 100 mg/㎖ 저장 현탁액을 만들었다.
예 20. 정전기 결합된 포스포늄기를 가지는 자기 중합체의 합성.
Figure 112007028808434-PCT00022
100 mg/㎖의 자기 카르복실화 폴리스티렌 수지의 현탁액 1 ㎖에서 부유물을 제거했다. 비드를 0.1 M NaOH 1 ㎖로 5분간 교반했다. 용액을 옮겨 따른 후, 비드를 물 1 ㎖로 세척했다. 물 400 ㎕ 내 Plus EnhancerTM(미국 특허번호 5,451,437에 설명된 바와 같이 준비됨) 20 mg의 용액을 비드에 첨가하고 혼합물을 5분간 진동 교반했다. 부유물을 제거한 후, 비드를 물 3 x 1 ㎖로 세척했다. 그 후, 물을 첨가하여 저장 현탁액 100 mg/㎖를 만들었다.
예 21. 기능화 자기 중합체의 합성.
Figure 112007028808434-PCT00023
고체 25 mg을 포함하는 비드(Dynal magnetic COOH beads, Cat. No. G03810)의 분취량(aliquot)을 자석을 이용해서 옮겨 따랐다. 그 후 물 3 x 1 ㎖와 CH3CN 3 x 1 ㎖로 비드를 세척한 후 밤새 건조시켰다. EDC(78 μmol) 15 mg이 첨가되는 CH2Cl2 800 ㎕에 비드를 현탁했다. 상기 혼합물에 DMF 200 ㎕ 내 예 1의 화합물(30 mg)의 용액을 첨가했다. 시험관을 30분간 초음파 처리하고 밤새 진동 교반했다. 부유물을 제거하고 비드를 CH2Cl2 4 x 1 ㎖, 1:1 MeOH:CH2Cl2 1 ㎖, MeOH 3 x 1 ㎖ 및 CH2Cl2 4 x 1 ㎖로 자기 세척했다. 비드를 밤새 공기 건조했다.
트리부틸포스핀 30 ㎕가 첨가되는 CH2Cl2 1 ㎖에 비드를 현탁했다. 반응 혼합물을 30분간 초음파 처리하고 총 5일간 진동 교반했다. 자석 위에 유지시켜 용매를 옮겨 따랐다. 비드를 CH2Cl2 4 x 1 ㎖, CH3OH 3 x 1 ㎖, 및 물 2 x 1 ㎖로 자기 세척했다. 물 1 ㎖를 첨가하여 비드 저장 용액(25 mg/㎖)을 만들었다.
예 22. 기능화 자성체의 합성
Figure 112007028808434-PCT00024
Dynal 토실(tosyl) 활성화 비드의 분취량(97.5 mg/㎖ 저장의 1 ㎖, Cat. No. F68710)을 1.5 ㎖ 시험관에 넣고 자기 래크를 이용하여 용매를 제거했다. 비드를 물 2 x 1 ㎖와 CH3OH 5 x 1 ㎖로 세척했다. CH3OH 1 ㎖의 현탁액 내의 비드에 트리부틸포스핀(100 ㎕)을 첨가했다. 시험관을 실온에서 진동 교반기에 올렸다. 9일 후에, 자석을 이용하여 부유물을 제거했다. 비드를 물 4 x 1 ㎖, CH3OH 4 x 1 ㎖, 및 물 1 ㎖로 세척했다. 그 후, 비드에 물 1 ㎖를 첨가하여 100 mg/㎖ 저장 용액을 준 비했다.
예 23. 비공유 바인딩된 트리부틸포스포늄기를 포함하는 절단성 링커를 구비하는 자기 중합체 입자의 합성.
Figure 112007028808434-PCT00025
100 mg/㎖의 저장 용액으로부터 자기 카르복시화 폴리스티렌 입자, 500 ㎕를 래크 상의 1.5 ㎖ 시험관에 넣고, 부유물을 제거했다. 비드를 물 3 x 500 ㎕와 MeOH 4 x 500 ㎕로 세척했다. 상기 화합물 10 mg을 CH3OH 100 ㎕에 용해시켜 비드에 첨가하고 용매는 공기 중에서 기화시켰다.
예 24. 폴리메타크릴레이트 링커로 기능화되고 트리스(카르복시에틸)포스포 늄기와 절단성 아릴티오에스테르 링크를 포함하는 자기 실리카 입자의 합성.
Figure 112007028808434-PCT00026
자기 카르복시산-기능화 실리카 입자(Chemicell, SiMAG-TCL, 1.0 meq/g, 1.5 g)를 마지막 단계를 제외하고 예 2에서 설명한 바와 같이 기능화시켰다. 이 물질(116.5 mg)을 3분간 초음파 처리하여 CH2Cl2 10 ㎖에 현탁했다. 트리스(2-카르복 시에틸)-포스핀(66.8 mg)과 32 ㎕의 트리에틸아민을 첨가하고 슬러리를 7일간 진동 교반시켰다. 입자들을 플라스크로 옮기고 CH2Cl2 20 ㎖로 3회 세척하고 이어서 MeOH 20 ㎖로 4회, 그리고 CH2Cl2 20 ㎖로 2회 세척했다. 그 후 고체를 공기 건조시켜 물질 109 mg을 얻었다.
예 25. 기능화 자기 폴리메타크릴레이트 입자의 합성.
Figure 112007028808434-PCT00027
Sera-Mag 자기 카르복시산염-수정 미세 입자 현탁액(Seradyn) 40 ㎖로부터 자기 입자들을 자기적으로 모으고 부유물을 옮겨 따랐다. 입자들을 유형 Ⅰ 물 4 x 50 ㎖와 이어서 아세토니트릴 4 x 50 ㎖로 자기 세척했다. 최종 세척 후에 입자를 건조시켜 1.93 g의 갈색 고체를 얻었다.
바닥이 둥그스름한 100 ㎖ 플라스크에 상기 입자 1.02 g, EDC 0.2899 g(1.5 mmol), 예 1의 링커 0.5058 g(1.8 mmol), 및 CH2Cl2 50 ㎖를 채웠다. 혼합물을 10분간 초음파 처리하고 균질성을 위해 궤도형 교반기에 올리고 5분 주기의 초음파 처리로 11일간 뒤섞어 주었다(170 rpm). 생성물을 자기적으로 수집하고 고체를 CH2Cl2 4 x 50 ㎖, 1:1 CH2Cl2/MeOH 50 ㎖, MeOH 4 x 50 ㎖, 1:1 CH2Cl2/MeOH 50 ㎖, 및 CH2Cl2 4 x 50 ㎖로 자기 세척했다. 고체를 건조시켜 0.951 g의 갈색 고체를 얻었다.
바닥이 둥그스름한 50 ㎖ 플라스크에 상기 물질 0.8993 g과 CH2Cl2 20 ㎖를 채웠다. 혼합물을 5분간 초음파 처리하고 트리부틸포스핀 0.24 g(1.2 mmol)을 첨가했다. 이 첨가 후에, 혼합물을 15분간 더 초음파 처리하고 궤도형 교반기에서 주기적 초음파 처리로 7일간 뒤섞어 주었다. 그 후 생성물을 자기적으로 수집하고 CH2Cl2 4 x 50 ㎖, 1:1 CH2Cl2/MeOH 50 ㎖, MeOH 4 x 50 ㎖, 1:1 CH2Cl2/MeOH 50 ㎖, 및 CH2Cl2 4 x 50 ㎖로 세척했다. 고체를 건조시켜 0.8801 g의 갈색 고체를 얻었다.
예 26. 이미 형성된 중합체에 산화철을 포함시킴에 따른 자기 기능화 중합체의 합성.
예 9의 중합체 생성물 1.00 g과 산화철 0.2 g의 혼합물을 동질로 혼합하고 그 후 CH2Cl2 20 ㎖를 첨가했다. 상기 혼합물을 15분간 초음파 처리하고 헥산 100 ㎖로 희석한 후 여과했다. 수집된 고체를 아세톤 200 ㎖와 물 400 ㎖로 아무런 색도 벗겨지지 않을 때까지 세척하고 그 후 아세톤 200 ㎖로 세척했다. 상기 고체를 아세톤 4 x 40 ㎖로 자기 세척했다. 여과를 통해 고체를 수집했고, 아세톤으로 세척한 후 건조시켰다. 현미경으로 관찰했을 때 매우 작은 양의 자유 마그네타이트를 보여주는 0.7 g의 고체가 있었다.
예 27. 기능화 조절 공극 유리의 준비
천연 조절 공극 유리(Prime Synthesis, Aston, PA 18-50 메쉬, 공극 크기 500 Å) 0.5 g을 예 3의 트리에톡시실란 링커(0.25 g, 0.43 mmol) 및 무수 톨루엔 50 ㎖와 결합했다. 혼합물을 Ar 블랭크 하에 18시간 동안 환류시켰다. 실온으로 냉각한 후, 흡입 여과를 통해 유리 입자를 분리하고, 톨루엔 0.2 ℓ와 CH2Cl2 0.2 ℓ로 세척했다. 밤새 공기 건조한 후, 유리 입자 0.52 g을 얻었다.
상기 유리 입자의 0.450 g 부분을 10 ㎖의 CH2Cl2 및 PBu3(0.91g, 4.5 mmol)와 결합시켰다. 혼합물을 실온에서 로터리 궤도형 교반기에 올리고 3일간 진동 교반했다. 흡입 여과에 의해 유리 입자들을 분리하고 CH2Cl2 0.2 ℓ, MeOH 0.2 ℓ, 및 CH2Cl2 0.3 ℓ로 연속 세척했다. 밤새 공기 건조시킨 후, 0.454 g의 유리 입자를 얻었다.
120-200 메쉬의 크기와 500 또는 1000 Å의 공극 크기를 가지는 CPG를 위해 유사한 절차를 후속하여 진행하였다.
예 28. 기능화 소결 유리의 준비
네 개의 작은 소결 유리 필터(ca. 35 mg ea, R & H Filter Co.)를 20% 수성 NaOH, 1 N HCl, 물, 및 MeOH로 연속하여 예비처리했다. 건조 후에, 프릿을 예 3의 트리에톡시실란(0.32 g, 0.55 mmol), 10 ㎖ 톨루엔, 및 10 ㎕ H2O와 결합시켰다. 혼합물을 Ar 블랭킷 하에서 16시간 동안 환류시켰다. 실온으로 냉각한 후에, 프릿을 제거하고 CH2Cl2, MeOH 및 CH2Cl2로 연속 세척하였다.
상기 유리 필터를 10 ㎖의 CH2Cl2 및 PBu3(0.20g, 0.99 mmol)와 결합시켰다. 상기 혼합물을 실온에서 로터리 궤도형 교반기에 올리고 7일간 진동 교반시켰다. 필터를 제거하고 CH2Cl2, MeOH, 및 CH2Cl2로 연속 세척하였다.
예 29. 아크리디늄 아미드 기능화 실리카 겔의 준비
Figure 112007028808434-PCT00028
3-아미노프로필 실리카 겔을 상업적으로 입수하거나(Silicycle, Quebec, Canada) 톨루엔에서 과잉 3-아미노프로필 트리에톡시실란과 함께 "실리카겔 60"을 밤새 환류시켜 준비했다. 3-아미노프로필 유도체화 실리카 겔(1.00 g, loading ca. 1 mmol/g)을 Ar 블랭킷 하에서 CH2Cl2(15 ㎖)에 현탁시켰다. 주입기를 통해 N,N-디이소프로필에틸아민(1.5 ㎖, 8.61 mmol)과, 이어서 아크리딘 9-산 염화물(360 mg, 1.49 mmol)을 첨가했다. 혼합물을 로터리 궤도형 교반기에 올리고 실온에서 2시간 동안 진동 교반시켰다. 암갈색 반응 생성물을 소결 유리 펀넬(funnel) 상에서 흡입 여과하고 CH2Cl2 (0.2 ℓ), 20%(v/v) MeOH:CH2Cl2 (0.2 ℓ), 및 CH2Cl2 (0.25 ℓ)로 연속 세척하였다. 공기 건조 후에 분말 고체 1.16 g을 얻었다.
상기 준비된 물질(1.00 g)을 CH2Cl2 (15 ㎖)에 현탁시키고 와류시켜 고체를 분산시켰다. 메틸 트리플레이트(0.17 ㎖, 1.5 mmol)를 첨가하고 반응을 고무 격벽으로 밀봉하였다. 혼합물을 로터리 궤도형 교반기에 올리고 실온에서 16시간 동안 진동 교반시켰다. 결과 혼합물을 소결 유리 펀넬 상에서 흡입 여과하고 CH2Cl2 (0.2 ℓ), MeOH (0.2 ℓ), 및 CH2Cl2 (0.25 ℓ)로 연속 세척하였다. 공기 건조 후에 분말 고체 1.02 g을 얻었다.
예 30. 기능화 실리카 겔의 준비
Figure 112007028808434-PCT00029
CH2Cl2 30 ㎖ 내 2-(3-트리에톡시실릴프로필)숙신산 무수화물, 2.00 g과 4'-아미노페닐 4-클로로메틸벤젠에티오카르복시산염, 1.82 g의 용액을 실온에서 밤새 섞어주었다. 용매를 기화시켜 광택성 고체 3.8 g을 얻었다. 이 고체를 톨루엔 170 ㎖ 내에서 실리카 1.0 g과 혼합하고 16시간 동안 저으면서 70 ℃로 가열하였다. 냉각 후에, 황색 고체를 여과하고 아세톤(5 x 50 ㎖), CH2Cl2(5 x 50 ㎖), MeOH(5 x 50 ㎖), 및 CH2Cl2(2 x 50 ㎖)로 연속 세척하였다. 공기-건조 후에, 노란색이 도는 고체 3.02 g을 얻었다.
CH2Cl2 100 ㎖ 내 상기 물질, 2.00 g의 현탁액을 5분간 초음파 처리하고, 아 르곤 블랭킷 하에 놓은 후 트리부틸포스핀 1.40 ㎖로 처리했다. 이 혼합물을 7일간 섞어주고, 여과한 후 CH2Cl2(4 x 50 ㎖), MeOH(4 x 50 ㎖), 및 CH2Cl2(4 x 50 ㎖)로 연속 세척했다. 공기-건조 후에, 노란색이 도는 고체 2.04 g을 얻었다.
예 31. 인간 전혈에서 DNA 의 캡처
시험관에서 상기 입자들의 10 mg 부분을 인간 전혈 70 ㎕와 혼합하였다. 시험관을 15초간 와동 교반(vortex)하고 실온에서 5분간 유지한 후 다시 15초간 와동 교반하였다. 혼합물을 300 ㎕의 10 mM 트리스 완충액, pH 8.0로 희석하고 입자에서 액체를 제거했으며, 특히 자기 반응성 입자가 사용된 경우에는 자석을 이용하여 제거했다. Dynal MPC-5 자기 래크로 자기 분열을 수행하였다.
예 32. 인간 전혈에서 DNA 의 분리.
상기 예의 절차에 따라 고상 바인딩 물질에 캡처된 핵산을 500 ㎕의 10 mM 트리스 완충액, pH 8.0으로 3회 세척하고, 각 세척마다 부유물을 제거했다. 37 ℃에서, 0.1 M NaOH 100 ㎕로 5분 동안 용리함으로써 입자에서 핵산을 제거했다. 다른 농도의 NaOH도 효과적이었다.
예 33. 신속 분리 프로토콜
시험관에서 상기 입자들의 1 mg 부분을 인간 전혈 100 ㎕와 혼합하였다. 시험관을 30초간 와동 교반하였다. 혼합물을 300 ㎕의 10 mM 트리스 완충액, pH 8.0으로 희석하고 입자에서 액체를 제거했으며, 특히 자기 반응성 입자가 사용된 경우에는 자석을 이용하여 제거했다. 상기 예의 절차에 따라 고상 바인딩 물질에 캡처 된 핵산을 500 ㎕의 10 mM 트리스 완충액, pH 8.0으로 3회 세척하고, 각 세척시 부유물을 제거했다. 실온에서 30초간 50 ㎕의 0.05 M NaOH로 용리함으로써 입자에서 핵산을 제거했다.
예 34. 형광 분석 프로토콜
DNA 착색(staining)을 위해 PicoGreenTM을 사용하여 형광 분석법으로 부유물과 용리액의 DNA 내용물을 분석했다. 간략히 말해서, DNA를 포함하거나 포함하는 것으로 의심되는 용액의 10 ㎕ 분취량을 형광 DNA "착색(staining)" 용액 190 ㎕로 배양한다. 형광 착색은 0.1 M 트리스, pH 7.5, 1 mM EDTA에 1:400 희석된 PicoGreen (Molecular Probes)이었다. 샘플을 적어도 5분간 배양한 후 마이크로플레이트 형광계(Fluoroskan, Labsystems)에서 형광성을 측정했다. 필터 세트는 480 nm 및 535 nm였다. 알려진 양의 동일한 DNA를 포함하는 양성 대조군과 음성 대조군을 동시에 진행하였다. 핵산이 100 ㎕의 0.1 M NaOH에서 용리되는 실험을 위해 10 ㎕의 분취량이 사용되었다. 핵산이 50 ㎕의 0.05 M NaOH에서 용리되는 실험을 위해서는 5 ㎕의 분취량이 사용되었다.
예 35. 겔 전기 영동 프로토콜.
핵산 용리액을 분석하기 위해 0.75% 또는 1.5% 아가로스 겔을 준비하였다. 2분간 끓여서 10 ㎖의 TAE 완충액에 적당한 양의 아가로스를 용해시켰다. 50-60 ℃로 냉각한 직후에 1 mg/㎖ 브롬화 에티듐의 용액(20 ㎕)을 첨가하고 겔을 부었다. 각 샘플(ca. 12 ㎕)을 0.25% 브로모페놀 블루, 0.25% 크실렌 시아놀 및 30% 글리세 롤을 포함하는 6x 로딩(loading) 완충액 2 ㎕와 혼합하였다. 겔은 70 V에서 진행되었다.
예 36. 게놈 DNA 의 PCR 증폭.
0.05 M 또는 0.1 M NaOH에서 예 2, 예 4-11, 및 예 13-30의 고상 바인딩 물질(1 또는 2 ㎕)을 각각 가지는 전혈에 본 방법을 적용하여 용리된 DNA에 200 bp 앰플리콘을 생산하는 24 염기 프라이머의 쌍으로 PCR 증폭을 실시하였다. 상기 성분들을 포함하는 PCR 반응 혼합물을 하기 표에 나열하였다.
성분 부피(㎕)
10X PCR 완충類? 2
프라이머 1 (100 ng/㎕) 2
프라이머 2 (100 ng/㎕) 2
2.5 mM dNTPs 2
50 mM MgCl2 1.25
Taq DNA 폴리머라제 (5U/㎕) 0.25
템플리트 1
탈이온수 9.5
합계 20
음성 대조군은 반응 혼합물에서 템플리트를 1 ㎕의 물로 대체했다. 추가 반응은 물에 1:10 희석된 1 ㎕의 템플리트를 사용했다. 반응 혼합물에 대해 94 ℃, 30초; 60 ℃, 30초; 72℃, 30초의 30 사이클을 실시했다. 1.5% 아가로스 겔에서 분석된 반응 생성물을 예기된 앰플리콘을 보여주었다.
별도의 실험에서, 예 2의 입자를 이용하여 분리된 DNA를 하기 나열된 것과 같은 몇 가지 다른 염색체의 영역의 증폭 반응에 사용하였다. 결과는 상기 분리 절차에 의해 생성된 DNA가 전체 게놈을 나타낸다는 것을 보여준다.
유전자 유전자 영역 염색체
혈액응고장애(Factor V Leiden) NA 1
코르티코트로핀-β-리포단백질 엑손 2
전구체
CFTR (낭포성 섬유증) NA 7 (엑손 10)
갑상샘 글로불린 5' 플랭킹(flanking) 8
인터페론 알파 3' 미해독 9
Factor Ⅱ (프로트롬빈) NA 11
아데노신 데아미나아제 인트론 20
β-2 인테그린 단백질 3' 미해독 21
예 37. 다양한 양의 입자들로 전혈에서 핵산을 캡처 및 분리
70 ㎕의 인간 전혈로부터의 DNA를 예 2의 다양한 양의 입자들에 바인딩하고 예 33의 신속 프로토콜에 따라 분리했다. 용리액에서 NaOH 농도 변화의 영향도 조사했다. 용리된 DNA의 양을 형광성으로 정량화하고 표준 레퍼런스 DNA 샘플과 비교했다.
[ NaOH ] 1 mg 0.5 mg 0.1 mg
50 mM 1.3 ㎍ 1.0 ㎍ 0.47 ㎍
60 mM 1.0 ㎍ 1.1 ㎍ 0.62 ㎍
70 mM 1.3 ㎍ 1.0 ㎍ 0.67 ㎍
80 mM 1.1 ㎍ 0.9 ㎍ 0.71 ㎍
90 mM 0.7 ㎍ 1.2 ㎍ 0.49 ㎍
100 mM 1.2 ㎍ 1.3 ㎍ 0.51 ㎍
예 38. 다양한 양의 입자들로 전혈에서 핵산을 캡처 및 분리
예 31 및 32의 프로토콜에 따라 70 ㎕의 인간 전혈로부터의 DNA를 다양한 양의 다양한 입자들에 바인딩하고 분리했다. 도 4에 나타낸 것처럼 겔 전기 영동에 의해 용리액을 분석하였다. 비교를 위해, 크기 범위가 500 bp 내지 40,000 bp인 크기 마커 사다리(ladder of size)를 나타내었다.
또 다른 샘플들이 도 6에 나타나 있다.
예 39. 다양한 양의 입자들로 다양한 부피의 전혈에서 핵산을 캡처 및 분리
예 31 및 33의 프로토콜에 따라 1 ㎖의 인간 전혈로부터의 DNA를 예 2의 입자 5 mg에 바인딩하고 분리했다. 형광성에 의한 복제(replicate) 샘플의 용리액(100 ㎕) 분석은 17-24 ㎍의 DNA 수율을 나타내었다. 유사하게, 동일한 유형의 입자 10 mg으로 70 ㎕의 혈액으로부터의 DNA 분리로부터의 용리액에 대한 분석은 30초나 1분간 0.1 M NaOH 100 ㎕로 용리했고 6.5 ㎍ 및 7.3 ㎍의 수율이 각각 나타났다. 프로토콜 31, 32에 따라 예 5의 입자를 사용하면 혈액 70 ㎕로부터 2.8 ㎍ DNA의 수율이 나타났다.
예 40. 다양한 고상 물질로 전혈로부터 핵산을 캡처 및 분리.
본 발명의 방법에 따른 1 mg의 다양한 고상 물질에 바인딩된 100 ㎕의 인간 전혈로부터의 DNA를 예 33의 신속 프로토콜에 따라, 그리고 50 ㎕의 50 mM NaOH 용액으로 용리시켰다. 용리된 DNA의 양을 형광성으로 정량화하고 표준 레퍼런스 DNA 샘플과 비교했다.
예 DNA (㎍)
26 1.35
24 0.4
예 27의 비-자기 조절 공극 유리 입자(10 mg)와 예 28의 소결 유리 프릿(10mg)도, 액체가 자기 분열이 아닌 원심분리 후에 상기 고체로부터 제거된다는 점을 제외하고 나머지는 상기 설명한 바와 똑같이 테스트하였다.
예 DNA (㎍)
30 7.5
28 0.65
27-A 11.2
27-B 2.63
27-C 10.3
27-A: 18-50 메쉬, 공극 크기 500 Å
27-B: 100-200 메쉬, 공극 크기 1000 Å
27-C: 100-200 메쉬, 공극 크기 500 Å

Claims (46)

  1. a) 고상 바인딩 물질을 제공하는 단계; 및
    b) 핵산을 함유하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플과 상기 고상 바인딩 물질을, 상기 핵산을 상기 고상 바인딩 물질에 바인딩하기에 충분한 시간 동안 결합하는 단계를 포함하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 캡처하는(capturing) 방법.
  2. a) 고상 바인딩 물질을 제공하는 단계;
    b) 핵산을 함유하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플과 상기 고상 바인딩 물질을, 상기 핵산을 상기 고상 바인딩 물질에 바인딩하기에 충분한 시간 동안 결합하는 단계;
    c) 상기 샘플을 상기 고상 바인딩 물질로부터 분열시키는(separating) 단계;
    d) 상기 고상 바인딩 물질을 선택적으로 세척하는 단계; 및
    e) 상기 바인딩된 핵산을 상기 고상 바인딩 물질로부터 방출하는(releasing) 단계를 포함하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 분리하는(isolating) 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 생물학 또는 세포 물질은 세포간 핵산, 동물, 식물 또는 박테리아 기 원(origin)의 비손상 세포 및 동물, 식물 또는 박테리아 기원의 비손상 세포를 함유하는 조직으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 캡처하는 방법.
  4. 제2항에 있어서,
    5분 내에 수행되는 것을 특징으로 하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 분리하는 방법.
  5. a) 고상 바인딩 물질을 제공하는 단계; 및
    b) 전혈 샘플과 상기 고상 바인딩 물질을, 핵산을 상기 고상 바인딩 물질에 바인딩하기에 충분한 시간 동안 결합하는 단계를 포함하는 유기체의 전혈에서 핵산을 캡처하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    c) 상기 고상 바인딩 물질로부터 상기 샘플을 분열시키는 단계;
    d) 상기 고상 바인딩 물질을 선택적으로 세척하는 단계; 및
    e) 상기 바인딩된 핵산을 상기 고상 바인딩 물질로부터 방출하는 단계를 더 포함하는 유기체의 전혈에서 핵산을 캡처하는 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 핵산은 상기 전혈 내의 백혈구에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 유기체의 전혈에서 핵산을 캡처하는 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    5분 내에 수행되는 것을 특징으로 하는 유기체의 전혈에서 핵산을 캡처하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 핵산은 DNA 및 RNA로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 캡처하는 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 핵산은 유기체의 게놈 DNA인 것을 특징으로 하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 캡처하는 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 고상 물질은 실리카, 유리, 소결 유리, 제어 공극 유리, 소결 유리, 알루미나, 지르코니아, 티타니아, 불용성 합성 중합체, 불용성 다당류, 및 금속, 금속 산화물, 및 금속 황화물에서 선택되는 금속성 물질에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 캡처하는 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 고상은 자기 반응성 부위를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 캡처하는 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 고상은 공유 링크된(covalently linked) 핵산 바인딩 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 캡처하는 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 고상은 비공유 링크된(non-covalently linked) 핵산 바인딩 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 캡처하는 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 고상은 히드록실, 실란올, 카르복실, 아미노, 암모늄, 3급 술포늄기, 4급 암모늄기 및 4급 포스포늄기로 구성되는 군에서 선택된 기를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 캡처하는 방법.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 공유 링크된 핵산 바인딩 부위는 4급 포스포늄기를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 캡처하는 방법.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 공유 링크된 핵산 바인딩 부위는 카르복실기를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 캡처하는 방법.
  18. 제13항에 있어서,
    상기 핵산 바인딩 부위는 선택적으로 절단될 수 있는 링크(linkage)를 통해 상기 물질에 부착되는 것을 특징으로 하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 캡처하는 방법.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 바인딩된 핵산은 강알칼리성 용액 내에서 상기 고상으로부터 방출되는 것을 특징으로 하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 캡처하는 방법.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 바인딩된 핵산은 다운스트림(downstream) 분자 생물학 공정에서 직접 사용될 수 있는 용액 내에서 상기 고상으로부터 방출되는 것을 특징으로 하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 캡처하는 방법.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 바인딩된 핵산은 다운스트림 분자 생물학 공정에서 직접 사용될 수 있는 용액 내에서 상기 고상으로부터 방출되는 것을 특징으로 하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 캡처하는 방법.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 다운스트림 분자 생물학 공정은 핵산 증폭 반응인 것을 특징으로 하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 캡처하는 방법.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 다운스트림 분자 생물학 공정은 핵산 증폭 반응인 것을 특징으로 하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 캡처하는 방법.
  24. a) 핵산 바인딩 부위가 부착되는 매트릭스를 포함하는 고상을 제공하는 단계;
    b) 핵산을 함유하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플과 상기 고상을, 상기 핵산을 상기 고상에 바인딩하기에 충분한 시간 동안 결합하는 단계를 포함하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 캡처하는 방법.
  25. a) 핵산 바인딩 부위가 부착되는 매트릭스를 포함하는 고상을 제공하는 단계;
    b) 핵산을 함유하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플과 상기 고상을, 상기 핵산을 상기 고상에 바인딩하기에 충분한 시간 동안 결합하는 단계;
    c) 상기 샘플을 상기 고상으로부터 분열시키는 단계;
    d) 상기 고상 바인딩 물질을 선택적으로 세척하는 단계; 및
    e) 상기 바인딩된 핵산을 상기 고상으로부터 방출하는 단계를 포함하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 분리하는 방법.
  26. a) 핵산 바인딩 부위가 선택적 절단성 링크를 통해 부착되는 매트릭스를 포함하는 고상을 제공하는 단계;
    b) 핵산을 함유하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플과 상기 고상을, 상기 핵산을 상기 고상에 바인딩하기에 충분한 시간 동안 결합하는 단계를 포함하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 캡처하는 방법.
  27. a) 핵산 바인딩 부위가 선택적 절단성 링크(selectively cleavable linkage)를 통해 부착되는 매트릭스를 포함하는 고상을 제공하는 단계;
    b) 핵산을 함유하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플과 상기 고상을, 상기 핵산을 상기 고상에 바인딩하기에 충분한 시간 동안 결합하는 단계;
    c) 상기 샘플을 상기 고상으로부터 분열시키는 단계;
    d) 상기 고상 바인딩 물질을 선택적으로 세척하는 단계; 및
    e) 상기 링커(linker)를 선택적으로 절단함으로써 상기 바인딩된 핵산을 상기 고상으로부터 방출하는 단계를 포함하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 분리하는 방법.
  28. 제24항에 있어서,
    상기 고상은 실리카, 유리, 불용성 합성 중합체, 및 불용성 다당류에서 선택되는 매트릭스, 그리고 식 QR2 +X-로 표현되고 여기서 R은 C1-C20 알킬, 아랄킬 및 아릴기에서 선택되는 3급 술포늄기, 식 NR3 +X-로 표현되고 여기서 R은 C1-C20 알킬, 아랄킬 및 아릴기에서 선택되는 4급 암모늄기, 및 식 PR3 +X-로 표현되고 여기서 R은 C1-C20 알킬, 아랄킬 및 아릴기에서 선택되는 4급 포스포늄기에서 선택되고, 여기서 X는 음이온인 상기 매트릭스의 표면에 부착되는 오늄기(onium group)를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 캡처하는 방법.
  29. 제26항에 있어서,
    상기 고상은 실리카, 유리, 불용성 합성 중합체, 및 불용성 다당류에서 선택되는 매트릭스, 그리고 식 QR2 +X-로 표현되고 여기서 R은 C1-C20 알킬, 아랄킬 및 아 릴기에서 선택되는 3급 술포늄기, 식 NR3 +X-로 표현되고 여기서 R은 C1-C20 알킬, 아랄킬 및 아릴기에서 선택되는 4급 암모늄기, 및 식 PR3 +X-로 표현되고 여기서 R은 C1-C20 알킬, 아랄킬 및 아릴기에서 선택되는 4급 포스포늄기에서 선택되고, 여기서 X는 음이온인 상기 매트릭스의 표면에 부착되는 오늄기(onium group)를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 캡처하는 방법.
  30. a) 미립자(particulate) 바인딩 물질을 제공하는 단계; 및
    b) 핵산을 함유하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플과 상기 미립자 바인딩 물질을, 상기 핵산을 상기 미립자 바인딩 물질에 바인딩하기에 충분한 시간 동안 결합하는 단계를 포함하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 캡처하는 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 핵산이 3분 내에 캡처되는 것을 특징으로 하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 캡처하는 방법.
  32. 제30항에 있어서,
    상기 핵산이 30초 내에 캡처되는 것을 특징으로 하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 캡처하는 방법.
  33. a) 미립자 바인딩 물질을 제공하는 단계;
    b) 핵산을 함유하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플과 상기 미립자 바인딩 물질을, 상기 핵산을 상기 미립자 바인딩 물질에 바인딩하기에 충분한 시간 동안 결합하는 단계;
    c) 상기 미립자 바인딩 물질로부터 상기 샘플을 분열시키는 단계;
    d) 상기 미립자 바인딩 물질을 선택적으로 세척하는 단계; 및
    e) 상기 바인딩된 핵산을 상기 미립자 바인딩 물질로부터 방출하는 단계를 포함하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 분리하는 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    5분 내에 수행되는 것을 특징으로 하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 분리하는 방법.
  35. a) 미립자 바인딩 물질을 제공하는 단계; 및
    b) 핵산을 함유하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플과 상기 미립자 바인딩 물질을, 상기 핵산을 상기 미립자 바인딩 물질에 바인딩하기 위해 3분 이하의 시간 동안 결합하는 단계를 포함하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 캡처하는 방법.
  36. a) 미립자 바인딩 물질을 제공하는 단계;
    b) 핵산을 함유하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플과 상기 미립자 바인딩 물질을, 상기 핵산을 상기 미립자 바인딩 물질에 바인딩하기에 충분한 시간 동안 결합하는 단계;
    c) 상기 미립자 바인딩 물질로부터 상기 샘플을 분열시키는 단계;
    d) 상기 미립자 바인딩 물질을 선택적으로 세척하는 단계; 및
    e) 상기 바인딩된 핵산을 상기 미립자 바인딩 물질로부터 방출하는 단계를 포함하고,
    5분 이내에 수행되는 것을 특징으로 하는 생물학 또는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 분리하는 방법.
  37. a) 세포 용액이나 세포 용해제의 코팅을 사용하지 않고 생물학 또는 세포 물질로부터 직접 핵산을 캡처하는 능력을 가지는 생물학 또는 세포 물질로부터 직접 핵산을 캡처하는 고상 바인딩 물질; 및
    b) 상기 고상으로부터 핵산을 방출하는 시약(reagent)을 포함하는 키트(kit).
  38. 제37항에 있어서,
    상기 고상 바인딩 물질은 미립자 물질인 것을 특징으로 하는 키트.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 미립자 물질은 자기 반응성인 것을 특징으로 하는 키트.
  40. 제37항에 있어서,
    상기 고상 물질은 실리카, 유리, 소결 유리, 제어 공극 유리, 소결 유리, 알루미나, 지르코니아, 티타니아, 불용성 합성 중합체, 불용성 다당류, 및 금속, 금속 산화물 및 금속 황화물에서 선택되는 금속성 물질에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
  41. 제37항에 있어서,
    상기 고상은 공유 링크된 핵산 바인딩 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  42. 제41항에 있어서,
    상기 핵산 바인딩 부위는 선택적으로 절단될 수 있는 링크를 통해 상기 물질에 부착되는 것을 특징으로 하는 키트.
  43. 제41항에 있어서,
    상기 고상으로부터 핵산을 방출하는 상기 시약은 강알칼리성 용액인 것을 특징으로 하는 키트.
  44. 제37항에 있어서,
    상기 고상은 히드록실, 실란올, 카르복실, 아미노, 암모늄, 3급 술포늄기, 4급 암모늄기 및 4급 포스포늄기로 구성되는 군에서 선택되는 기(group)를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  45. 제41항에 있어서,
    상기 공유 링크된 핵산 바인딩 부위는 4급 포스포늄기를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  46. 제42항에 있어서,
    상기 공유 링크된 핵산 바인딩 부위는 4급 포스포늄기를 포함하고, 상기 고상으로부터 핵산을 방출하는 상기 시약은 강알칼리성 용액인 것을 특징으로 하는 키트.
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