KR20070062557A - 세포 물질에서 핵산을 분리하는 단순화된 방법 - Google Patents

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Abstract

고상 바인딩 물질을 사용하고 세포 용해 용액의 사용이 필요없는, 세포 물질의 샘플에서 핵산을 분리하는 방법. 고상 바인딩 물질을 사용하면 뜻밖에도 세포의 핵산 내용물이 직접 그리고 한 단계에 유리되고 캡처될 수 있다. 본 새로운 방법은 종래 방법에 비해 매우 간단하다. 본 발명의 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 바람직한 고상 물질은 4급 오늄 핵산 바인딩 부위를 포함한다.
핵산 분리, 세포 용해 용액, 고상 바인딩 물질, 핵산 바인딩 부위, 전혈, 게놈.

Description

세포 물질에서 핵산을 분리하는 단순화된 방법{SIMPLIFIED METHODS FOR ISOLATING NUCLEIC ACIDS FROM CELLULAR MATERIALS}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 출원인들의 함께 계류 중인 2003년 11월 17일에 출원한 미국 출원번호 10/714,763과 2003년 11월 17일에 출원한 미국 출원번호 10/715,284의 일부계속출원이다.
본 발명은 생물학 기원 물질로부터 핵산, 특히 전 게놈 핵산을 캡처(capturing)하고 분리(isolating)하는 단순화된 방법에 관한 것이다.
분자 진단 및 분자 생물학(역전사, 복제, 제한 분석, 증폭 및 서열 분석 포함)의 최근 기술들은 핵산의 추출을 필요로 한다. 표적 핵산이 발견되는 샘플 매트릭스가 복잡하므로 핵산의 확보가 복잡해진다. 그러한 샘플은 예컨대, 조직 세포, 체액 세포, 혈액, 배양물에서의 박테리아 세포, 아가로스 겔, 폴리아크릴아미드 겔, 또는 표적 핵산 증폭 용액을 포함한다. 샘플 매트릭스는 종종 핵산을 분자 생물학이나 진단 기술에 사용하기 전에 관심 핵산으로부터 제거해야 하는 오염 물질들을 상당량 함유한다.
상기와 같은 세포 및 조직으로부터 생산된 혼합물로부터 표적 핵산을 확보하 기 위한 종래 기술들은 페놀, 클로로포름 및 에티듐 브로마이드와 같은 유독 화학 물질들을 사용한다. 그러한 방법들은 표적 핵산과 다양한 오염 물질의 혼합물에서 오염 물질을 추출하기 위해 페놀/클로로포름 추출물을 사용한다. 선택적으로, 본 발명 관련 기술 분야에서 공지된 방법에 따라 세슘 클로라이드-에티듐 브로마이드 구배가 사용된다. 예컨대, Sambrook 등이 편집한 Molecular Cloning, (1989), Cold Spring Harbor Press, pp. 1.42-1.50를 참고하라. 후자의 방법은 일반적으로 그 이후에, 추출된 수성상에 에탄올이나 2-프로판올을 첨가함으로써 그 수성상에 잔류하는 핵산 물질을 침전시키는 단계가 이어진다. 일반적으로 원심 분리에 의해 용액에서 침전물을 제거하고, 그로 인해 얻어진 침전물 펠릿은 후속 공정에 사용하기 위해 물이나 버퍼 용액에 재현탁하기 전에 건조한다.
세포 용해물(cell lysate)이나 핵산과 오염 물질의 기타 혼합물에서 핵산을 분열시키기 위해 다양한 형태의 고상을 이용하는 더 간단하고 더 빠른 방법들이 개발되어왔다. 그러한 고상들은 섬유, 필터 및 코팅 컨테이너와 같은 다양한 형상과 형태의 크로마토그래피 수지, 중합체 및 실리카 또는 유리계 물질을 포함한다. 작은 입자 형태일 경우, 종종 자기 코어를 제공하여 분열(separation) 작업을 보조한다.
고체 바인딩(binding) 서포트(support) 물질을 함유하는 키트(kit)가 개발되었으며 박테리아 배양물로부터 그리고 인간 전혈로부터 게놈을 분리하는 방법에 상업적으로 입수하여 사용할 수 있다. 제작자로부터 제공된 절차는 언제나, 핵산 제거 및 정제를 시작하기 전에 세포를 용해하라고 명기하고 있다. 때로는 고체 서포 트를 사용하기 전에 추가 침전 단계가 사용되기도 한다(예컨대, K. Smith 등, J. Clin. Microbiol., 41(6), 2440-3 (2003); P. Levison 등, J. Chromatography A, 827, 337-44 (1998)).
핵산 분리에 사용되는 고상의 한 유형은 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography: HPLC)에 사용되도록 설계된 다공성 실리카 겔 입자를 포함한다. 다공성 실리카 겔 입자의 표면은 음이온-교환기로 기능화되어 특정 염 및 pH 조건에서 플라스미드 DNA와 교환된다. 예컨대, 미국 특허번호 4,699,717 및 5,057,426를 참고하라. 이러한 고상 물질들에 속박된 플라스미드 DNA는 고농도 염을 함유하는 수용액 내에서 용리된다. 그로부터 용리된 핵산 용액을 추가 처리하여 염을 제거한 후 다운스트림 공정에 사용한다.
기타 실리카계 고상 물질들은 조절 공극 유리(controlled pore glass: CPG), 실리카 입자들이 박힌 필터, 실리카 겔 입자, 규조토(diatomaceous earth), 유리 섬유, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 각 실리카계 고상 물질은 요오드화 나트륨(NaI), 구아니디늄 티오시아네이트 또는 구아니디늄 클로라이드와 같은 카오트로픽제(chaotropic agent)의 존재 하에서 핵산을 함유하는 샘플에 핵산을 가역적으로 바인딩한다. 잔여 샘플 성분으로부터 매트릭스 및 그에 바인딩된 핵산 물질을 분열시키기 위해 고상을 원심 분리 또는 진공 여과할 때 그러한 고상들은 핵산 물질을 바인딩하여 유지시킨다. 그 후 물이나 저염 용리 버퍼로 용리함으로써 핵산 물질이 고상으로부터 유리된다. 상업적으로 입수 가능한 핵산 분리용 실리카계 고상 물질 은 예컨대, WizardTM DNA 정제 시스템 제품(Promega, Madison, WI), QiaPrepTM DNA 분리 시스템(Qiagen, Santa Clarita, CA), High Pure (Roche), 및 GFX Micro Plasmid Kit(Amersham)를 포함한다.
입자 형태의 중합체 수지들도 핵산의 분리 및 정제에 널리 사용된다. 카르복시산염-수정 중합체 입자들(Bangs, Agencourt)이 공지되어 있다. 4급 암모늄 헤드기(quaternary ammonium head group)를 가지는 중합체들이 유럽 특허출원공개번호 EP 1243649A1에 개시되어 있다. 상기 중합체는 공유 부착된 선형 비가교결합 중합체를 가지는 불활성 캐리어 입자이다. 이 유형의 중합체 고상은 통상 텐터클 수지(tentacle resin)라고 불린다. 상기 선형 중합체는 4급 테트라알킬암모늄기를 포함한다. 알킬기는 구체적으로 메틸 또는 에틸기를 들 수 있다(4 컬럼, 52-55 라인). 더 긴 알킬기는 바람직하지 않은 것으로 판단된다.
음이온 교환 이론에 기초한 다른 핵산 바인딩용 고상 물질들이 현재 사용되고 있다. 이들은 EP 0496822B1에 개시된 크로마토그래피 서포트에 기초한 실리카-NucleoBond AX (Becton Dickinson, Roche-Genopure) 및 DEAE 헤드기를 가지는 실리카계 물질(Qiagen)을 포함한다. 폴리머-트리알킬암모늄기(polymeric-trialkylammonium group)를 가지는 중합체 수지가 EP 1243649에 개시되었다(GeneScan). DNA 분리를 위한 카르복실-수정 중합체가 많은 공급자들로부터 입수 가능하다. 핵산은 고염 조건에서는 끌어 당겨지고, 저이온 강도 조건에서는 방출된다. 양이온 트리메틸아민 외면(exterior)을 가지는 중합체 미세캐리어 비드(bead) 가 미국 특허번호 6,214,618에 개시되어 있다. 상기 비드는 비교적 큰 직경을 가지며 배양물에서의 세포 부착 및 성장을 위한 서포트로서 유용하다.
트리부틸포스포늄 헤드기를 가지는 중합체 비드가 3상계에서 상전이(phase transfer) 촉매로 사용되는 것으로 설명되었다. 상기 비드는 가교결합 폴리스티렌으로부터 준비되었다(J. Chem. Soc. Perkin Trans. Ⅱ, 1827-1830, (1983)). 알킬렌 체인 및 알킬렌 에테르 체인을 통해 가교결합 폴리스티렌에 링크(link)된 펜던트(pendant) 트리알킬포스포늄기를 가지는 중합체 비드도 설명되었다(Tomoi 등 , Makromolekulare Chemie, 187(2), 357-65 (1986); Tomoi 등, Reactive Polymers, Ion Exchangers, Sorbents, 3(4), 341-9 (1985)). 가교결합된 폴리스티렌 수지에 근거한 혼합 4급 암모늄/포스포늄 불용성 중합체가 촉매 및 살생물제로 개시되었다(Davidescu 등, Chem. Bull. Techn. Univ. Timisoara, 40(54), 63-72 (1995); Parvulescu 등, Reactive & Functional Polymers, 33(2,3), 329-36 (1997)).
자기반응성(magnetically responsive) 입자들도 핵산 분리에서 고상으로 사용되도록 개발되었다. 핵산 분리용으로 설계된 몇몇 다양한 유형의 자기반응성 입자들이 본 발명 관련 기술 분야에서 공지되어있고, 몇몇 공급자들로부터 상업적으로 입수 가능하다. 핵산 물질을 직접 가역적으로 바인딩하는 자기 입자는 MagneSilTM 입자(Promega)를 포함한다. 자기 입자도 mRNA의 poly A tail과의 혼성화(hybridization)를 위한 부착 oligo dT tail을 가지는 공유 부착 아비딘(avidin)이나 스트렙트아비딘(streptavidin)을 통해 mRNA를 가역적으로 바인딩하는 것으로 알려져 있다.
다양한 유형의 자기반응성 실리카계 입자들이 핵산 바인딩 분리 방법에서 고상으로 사용되는 것으로 알려져 있다. 그러한 한 유형은 미국 특허번호 4,395,271; 4,233,169; 또는 4,297,337에 개시된 다공성 자기 유리 입자들; 또는 CPG, Inc.(Lincoln Park, NJ)로부터 Magnetic Porous Glass(MPG) 입자로 입수할 수 있는, 바람직하게는 조절된 공극 크기를 가지는 자기반응성 유리 비드이다. 핵산의 바인딩 및 분리에 유용한 다른 유형의 자성 입자는 중합체 이산화 규소 화합물의 매트릭스에 자기 물질을 혼합함으로써 만들어진다(독일 특허번호 DE 4307262A1). 4급 암모늄기를 가지는 셀룰로오스 매트릭스에 삽입된 산화철 나노 입자를 포함하는 자기 입자들이 Cortex Biochem(San Leandro, CA)에 의해 MagaCell-QTM로서 상업적으로 생산되고 있다.
유도성 자기 입자를 가지는 비드나 입자는 철, 니켈, 구리, 코발트 및 망간과 같은 작은 전이금속 입자를 포함하여 자석이 존재할 때 일시적 자성을 가질 수 있는 금속 산화물을 형성한다. 이러한 입자는 상자성 또는 초상자성으로 불린다. 상자성 또는 초상자성 비드를 형성하기 위해, 금속 산화물이 물에서 상대적으로 안정한 중합체로 코팅되었다. 미국 특허번호 4,554,088은 중합체 실란의 코팅으로 둘러싸인 금속 산화물 코어를 포함하는 상자성 입자를 개시하고 있다. 미국 특허번호 5,356,713은 소수성 비닐방향족 모노머의 셸로 둘러싸인 자화성 입자의 코어로 구성된 자화성 마이크로스피어(magnetizable microsphere)를 개시하고 있다. 미국 특 허번호 5,395,688은 혼합된 상자성 금속 산화물-중합체 층으로 코팅된 중합체 코어를 개시하고 있다. 다른 방법은 예컨대 미국 특허번호 4,774,265에서와 같이 금속 산화물을 흡착하기 위해 중합체 코어를 이용한다. 상자성 금속 산화물 입자층으로 코팅된 중합체 코어 입자를 포함하는 자기 입자가 미국 특허번호 5,091,206에 개시되어 있다. 상기 입자는 그 후, 금속 산화물층을 보호하고 반응성 코팅을 제공하기 위해 추가 중합체층으로 더 코팅한다. 미국 특허번호 5,866,099는 금속 염을 조정하고 혼합된 금속 산화물 입자를 포착하기 위해 단백질이 존재할 때 두 가지 금속 염의 혼합물을 공침(co-precipitation)시킴으로써 자기 입자를 준비하는 것을 개시하고 있다. 금속 염 쌍의 다양한 예가 개시되었다. 미국 특허번호 5,411,730은 침전된 혼합 금속 산화물이 덱스트런, 올리고당에 포착되는 유사한 공정을 개시하고 있다.
DNA와 RNA의 비가역적 캡처를 위한 알루미나(알루미늄 산화물)가 미국 특허번호 6,291,166에 개시되어 있다. 바인딩된 핵산이 PCR과 같은 고상 증폭 방법에 사용될 수 있다.
이러한 고상 물질들에 바인딩된 DNA는 고농도 염을 함유한 수용액에서 용리된다. 용리된 핵산 용액은 다운스트림 공정에서 사용되기 전에 염을 제거해야 한다. 반면, 실리카계 물질에 바인딩된 핵산은 물이나 저염 용리 버퍼로 용리시킴으로써 고상으로부터 유리된다. 미국 특허번호 5,792,651은 핵산의 세포 내 트랜스펙션(transfection)에서 핵산의 능력을 향상시키는 핵산의 크로마토그래피 분리 조성을 개시하고 있다. 상기 조성은 버퍼 물질과, 선택적인 염 및 2-프로판올을 함유하 는 수용액을 포함한다.
그런데 자기 미세입자 코어를 함유하는 셀룰로스 입자 또는 아가로스를 포함하는 다른 자기 고상 물질들이 고농도의 염과 폴리알킬렌 글리콜을 함유하는 조성물로 처리할 때 핵산을 바인딩하고 유지하는 것으로 보고되었다(예컨대, 미국 특허번호 5,898,071 및 국제특허출원 공개번호 WO02066993). 그 후 물이나 저이온 강도 버퍼로 처리함으로써 핵산이 방출된다.
본 명세서에 참고로서 포함된, 출원인들의 함께 계류 중인 미국 출원번호 10/714,763, 10/715,284 및 10/891,880은 절단성(cleavable) 물질을 포함하는 새로운 고상 핵산 바인딩 물질들과, 핵산의 바인딩 및 방출 방법을 개시하고 있다.
본 발명의 한 목적은 화학적 세포 용해 단계 없이 고상 핵산 바인딩 물질을 이용하여 생물학 물질로부터 핵산을 캡처하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 화학적 세포 용해 단계 없이 고상 핵산 바인딩 물질을 이용하여 핵산을 캡처하고 이어서 상기 캡처된 핵산을 방출함으로써 생물학 물질로부터 핵산을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 한 목적은 절단성 링커기(linker group)를 포함하는 고상 핵산 바인딩 물질을 이용하여 생물학 및 세포 물질로부터 핵산을 캡처하고 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 한 목적은 포스포늄, 암모늄 및 술포늄기에서 선택된 양이온기를 포함하는 고상 핵산 바인딩 물질을 이용하여 생물학 및 세포 물질로부터 핵산을 캡처하고 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
정의
알킬 - 하나 이상의 비수소 치환기로 치환될 수 있는 1-20 탄소를 포함하는, 분기된 선형 체인 또는 고리형 탄화수소기. 본 명세서에서 언급되는 저급 알킬(lower alkyl)은 8개 이하의 탄소를 포함하는 알킬기를 말한다.
아랄킬 - 아릴기로 치환된 알킬기.
아릴 - 하나 이상의 비수소 치환기로 치환될 수 있는 1개 내지 5개의 카르보사이클릭(carbocyclic) 방향족 고리를 포함하는 방향족 고리-포함 기(group).
세포 물질 - 동물, 식물 또는 박테리아 기원의 미손상(intact) 세포를 함유하고, 조직을 포함하는, 비손상 세포 또는 물질.
세포 핵산 내용물 - 세포 물질 내에서 발견되는 핵산을 말하며, 게놈 DNA 및 RNA, 그리고 바이러스 및 플라스미드를 포함하는 전염성 작용제에서 나온 것과 같은 기타 핵산일 수 있다.
자성 입자 - 외부 자기장에 반응하는 입자, 미세 입자 또는 비드. 상기 입자는 그 자체로 자성, 상자성 또는 초상자성일 수 있다. 강자성 물질을 사용하면 가해진 자기장이나 외부 자성체에 끌어 당겨질 수 있다. 입자들은 자기반응성이며 하나 이상의 비자기반응성 층으로 둘러싸인 고체 코어 부분을 가질 수 있다. 교대로, 자기반응성 부분은 비자기반응성 코어 둘레의 층일 수 있거나 비자기반응성 코어 내의 입자들일 수 있다.
올리고머, 올리고뉴클레오티드 - 본 명세서에서는 인산이중에스테르(phosphodiester) 뉴클레오티드간 링크(linkage) 및 5'-말단 단인산염기(monophosphate group)를 포함하는 화합물을 의미한다. 뉴클레오티드는 통상적으로 발생하는 리보뉴클레오티드, A, C, G 및 U, 또는 디옥시리보뉴클레오티드, dA, dC, dG 및 dT일 수 있다.
핵산 - 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA 또는 PNA와 같은 합성 DNA 유사체(analog)일 수 있다. 이러한 세 가지 유형의 체인들 중 어느 하나의 단일 가닥 화합물들 및 이중 가닥 혼성물도 핵산의 범위에 속한다.
방출, 용리 - 용액이나 조성물과의 접촉에 의해 고상 물질의 구멍이나 표면에 바인딩된 물질의 실질적 부분을 제거하는 것.
샘플 - 핵산을 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 유체. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 대표적인 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 정액, 타액, 세포 배양물, 조직 추출물 등과 같은 체액을 포함한다. 다른 유형의 샘플들은 용제,해수, 산업수 샘플, 음식 샘플 및 토양이나 물과 같은 환경 샘플, 식물 물질(plant material), 원핵 생물에서 생겨난 세포, 진핵 생물, 박테리아, 플라스미드 및 바이러스와 같은 환경 샘플을 포함한다.
고상 물질 - 핵산 분자를 끌어당길 수 있는 표면을 가지는 물질. 물질은 미세입자, 섬유, 비드, 멤브레인(membrane), 그리고 시험관 및 마이크로웰(microwell)과 같은 기타 서포트일 수 있다.
치환 - 기(group)의 적어도 하나의 수소 원자를 비수소기로 대체하는 것을 말한다. 치환된 기에 관해서는, 명백히 달리 표시하지 않은 한, 다양한 점의 치환이 존재할 수 있음을 뜻한다는 것을 주의해야 한다.
핵산은 여러 가지 기술에 의해 다양한 샘플 유형으로부터 추출, 분리 및 그렇지 않다면 정제된다. 이러한 기술 중 많은 기술들은 핵산에 대한 다소간의 친화력으로 물질의 표면에 대한 선택적 흡착에 의존한다. 기타, 덜 강하게 바인딩된 성분들을 제거하기 위한 세척 단계 후에, 상기 고상이 용액으로 처리됨으로써 바인딩된 핵산이 제거 또는 용리된다. 세포 물질 일부로부터 게놈 핵산을 추출하고 분리하는 것이 종종 필요하다. 그렇게 얻어진 핵산은 증폭, 진단 테스트, 돌연 변이 분석, 유전자 발현 프로파일링(gene expression profiling) 및 복제를 포함하는 후속 공정에서 이용된다. 본 발명의 방법에 의해 핵산이 분리될 수 있는 샘플은 세포 물질을 포함하는 박테리아 배양물, 체액, 전혈 및 혈액 성분, 조직 추울물, 식물 물질, 및 환경 샘플을 포함한다.
세포 핵산 내용물을 제거하려면 내부로 접근하기 위해 세포 막이나 벽을 관통할 필요가 있다. 이러한 목적으로, 종래의 방법은 세포 용해에 영향을 미치는 시약을 사용하는 세포 용해 단계를 사용했다. 세포 용해 용액은 사용된 세포 용해 방법에 따라 두 가지 유형이 있다. 한 가지 유형은 알칼리성 세포 용해를 위한 고 pH의 수용액이다. 또 다른 유형은 세포막을 부수기 위해 하나 이상의 계면 활성제나 용제(detergent)를 사용한다. 세포 용해 용액은 세포의 핵산 내용물의 유리를 돕기 위해 프로테이나아제(proteinase) 효소와 같은 소화 효소를 함유할 수도 있다. 본 출원인들은 세포 용해 용액의 사용을 회피하는 고상 바인딩 물질을 사용하여 세포 물질의 샘플로부터 핵산을 분리하는 방법을 개발했다. 상기 고상 바인딩 물질은 뜻밖에도, 세포의 핵산 내용물이 직접 그리고 한 단계 내에 유리 및 캡처되도록 한다. 상기 새로운 방법은 세포 용해 용액의 사용이 필요 없기 때문에 간단함, 편리함 및 자동화의 용이성의 현저한 향상을 가져온다.
본 발명의 일 태양에 따르면,
a) 핵산 바인딩 부위가 부착되는 매트릭스를 포함하는 고상을 제공하는 단계;
b) 아무런 세포 용해(lysis) 용액의 첨가 없이 핵산을 포함하는 세포 물질의 샘플과 상기 고상을, 상기 핵산을 상기 고상에 바인딩하기에 충분한 시간 동안 결합하는 단계;
c) 상기 고상으로부터 상기 샘플을 분열시키는 단계; 및
d) 상기 고상으로부터 상기 바인딩된 핵산을 방출하는 단계를 포함하는 세포 물질의 샘플로부터 핵산을 분리하는 방법이 제공된다.
본 발명의 방법과 함께 사용되는 핵산을 바인딩하는 고상 물질은 그 크기, 형상, 기공도 및 기계적 성질들을 한정하는 매트릭스와 공유 링크된 핵산 바인딩 기를 포함하고, 입자, 미세 입자, 섬유, 비드, 멤브레인, 그리고 시험관 및 마이크로웰과 같은 기타 서포트의 형태일 수 있다. 상기 물질은 다양한 길이의 핵산 분자의 캡처와 바인딩을 가능하게 하는 표면이나 그 부근의 핵산 바인딩 부위를 더 포함한다. 표면은 고상 물질의 외표면 뿐만 아니라 고상 물질 내의 임의의 접근 가능한 다공성 영역의 표면도 함께 의미한다.
매트릭스 물질은 임의의 적당한 물질일 수 있다. 바람직한 매트릭스 물질은 실리카, 유리, 불용성 합성 중합체 및 불용성 다당류에서 선택된다. 예시 물질은 세포를 파괴하고 핵산을 끌어당기는 역할을 하는 공유 부착 표면 작용기로 기능화되거나 코팅된 실리카계 물질을 포함한다. 적당하게 표면-기능화된 탄수화물계 물질, 및 이러한 표면 기능성을 가지는 중합체 물질도 또한 포함된다. 매우 많은 특정 물질들 및 그 조제가 본 출원인들의 함께 계류중인 미국 출원번호 10/714,763, 10/715,284 및 10/891,880에 설명되어 있다. 핵산 바인딩기의 기능을 하는 표면 작용기는 세포의 구조적 완전성을 파괴하고 핵산이 고상 서포트로 끌어 당겨지도록 할 수 있는 임의의 기를 포함한다. 그러한 기는, 비제한적으로, 아래에서 설명되는 4급 암모늄 및 포스포늄 염과 3급 술포늄 염 유형의 물질들을 포함한다.
일반적으로, 상기 고상은 자기장에 의해 끌어 당겨지고 조종될 수 있는 입자인 자기 미세 입자의 형태를 가지는 자기 반응성 부위를 더 포함할 수 있다. 그러한 자기 미세입자는 일반적으로, 핵산 바인딩기가 공유 바인딩되는 공유 또는 흡착 바인딩 층으로 둘러싸인 자기 금속 산화물 또는 금속 황화물 코어를 포함하며, 따라서 표면을 코팅한다. 핵산 바인딩기가 공유 바인딩되고 이에 따라 표면을 코팅하는 공유 또는 흡착 바인딩층에 의해 둘러싸인 자기 금속 산화물 또는 금속 황화물 코어를 포함한다. 상기 자기 금속 산화물 코어는 바람직하게는 철 산화물 또는 철 황화물이며, 여기서 철은 Fe2 +나 Fe3 +, 또는 둘 모두이다. 자기 입자들은 U.S. 4,654,267에 설명된 것처럼 다공성 중합체가 존재할 때 금속 입자들을 침전시켜 자기 반응성 금속 입자를 포착함으로써 형성될 수도 있다. 그에 의해 준비될 수 있는 자기 금속 산화물은 Fe3O4, MnFe2O4, NiFe2O4, 및 CoFe2O4를 포함한다. U.S. 5,411,730에 설명된 것처럼 올리고당 덱스트런이 존재할 때 금속 산화물을 침전시켜 자기 반응성 금속 입자들을 포착함으로써 다른 자기 입자들도 형성될 수 있다. 또 다른 종류의 자기 입자가 기언급된 미국 특허번호 5,091,206에 개시되어 있다. 상기 입자는 금속 산화물층을 보호하고 반응성 코팅을 제공하기 위해 상자성 금속 산화물 입자층 및 추가 중합체층으로 코팅된 중합체 코어 입자를 포함한다. 클로로메틸화 메리필드 수지(chloromethylated Merrifield resin)를 함유하는 마그네타이트의 준비가 문헌(Tetrahedron Lett., 40 (1999), 8137-8140)에 설명되어 있다.
상업적으로 입수 가능한 자기 실리카 또는 자기 중합체 입자들이 본 발명에서 유용한 자기 고상 바인딩 물질을 준비하는 데에 개시 물질로 사용될 수 있다. 표면 카르복실기를 가지는 중합체 입자로 적당한 유형은 상표명 SeraMagTM (Seradyn) 및 BioMagTM (Polysciences and Bangs Laboratories)로 알려져 있다. 실리카 자기 입자로 적당한 유형은 상표면 MagneSilTM (Promega)로 알려져 있다. 표면에 카르복시기 또는 아미노기를 가지는 실리카 자기 입자는 Chemicell GmBH (Berlin)로부터 입수 가능하다.
고상 바인딩 물질이 불용성 합성 중합체 부위를 포함할 때, 유용한 중합체는 하나 이상의 에틸렌 불포화 모노머(ethylenically unsaturated monomer) 유닛의 호모폴리머(homopolymer) 또는 코폴리머(copolymer)이며 가교결합 내지 비가교결합될 수 있다. 바람직한 중합체는 폴리아크릴-타입 중합체와 폴리스티렌을 포함하는 폴리올레핀이다. 전자는 다양한 치환된 아크릴산, 아미드 및 에스테르의 중합체를 포함하는데, 여기서 아크릴 모노머는 2- 또는 3-탄소에 알킬 치환기를 가질 수도, 가지지 않을 수도 있다.
본 발명의 방법에 유용한 고상 바인딩 물질에 포함된 핵산 바인딩(nucleic acid binding: NAB)기는 이중 목적을 충족시키는 것으로 나타난다. NAB기는 다양한 길이 및 염기(base) 조성이나 서열의 핵산, 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드를 끌어당겨 바인딩한다. NAB기는 또한 어느 정도는 세포 외막(cellular envelope)으로부터 핵산을 유리시키는 기능을 한다. 핵산 바인딩기는 예컨대, 카르복실, 아민 및 3급 또는 4급 오늄기를 포함한다. 아민기는 NH2, 알킬아민 및 디알킬아민기일 수 있다. 3급 또는 4급 오늄기는 4급 트리알킬암모늄기(-QR3 +), 트리알킬포스포늄 또는 트리아릴포스포늄 또는 혼합 알킬 아릴 포스포늄기를 포함하는 포스포늄기(-QR3 +), 및 3급 술포늄기(-QR2 +)를 포함한다. 고상은 본 명세서에서 설명된 바와 같이 하나 이상의 종류의 핵산 바인딩기를 함유할 수 있다. 핵산을 바인딩하는 데에 있어, 3급 또는 4급 오늄기-QR2 + 또는 QR3 +, 여기서 R기는 적어도 네 개의 탄소를 가지는 알킬-를 포함하는 고상 물질이 특히 효과적이지만, 탄소를 하나밖에 가지지 않는 알킬기도 아릴기처럼 유용하다. 그러한 고상 물질은 바인딩된 핵산을 강한 점착력으로 보유하며, 종래 기술에 따른 용리에 사용되는 대부분의 조건에서 핵산의 제거나 용리에 견뎌낸다. 공지된 대부분의, 저이온 강도 및 고이온 강도 모두의 용리 조건들이 바인딩된 핵산을 제거하지 못한다. DEAE 및 PEI기를 함유하는 종래의 음이온-교환 수지와 달리, 3급 또는 4급 오늄 고상 물질은 반응 매질의 pH에 무관하게 양이온 대전 상태를 유지한다.
본 발명의 추가적 실시예들에 따르면,
a) 실리카, 유리, 불용성 합성 중합체, 및 불용성 다당류로부터 선택되는 매트릭스와, 식 QR2 +X-로 표현되고 여기서 R은 C1-C20 알킬, 아랄킬 및 아릴기에서 선택되는 3급 술포늄기, 식 NR3 +X-로 표현되고 여기서 R은 C1-C20 알킬, 아랄킬 및 아릴기에서 선택되는 4급 암모늄기, 및 식 PR3 +X-로 표현되고 여기서 R은 C1-C20 알킬, 아랄킬 및 아릴기에서 선택되는 4급 포스포늄기에서 선택되고, 상기 X는 음이온인, 상기 매트릭스의 표면에 부착되는 오늄기를 포함하는 고상을 제공하는 단계;
b) 세포 용해 용액이 첨가되지 않은 상태에서 핵산을 함유하는 세포 물질의 샘플과 상기 고상을, 상기 핵산을 상기 고상에 바인딩하기에 충분한 시간 동안 결합하는 단계;
c) 상기 고상으로부터 상기 샘플을 분열시키는 단계; 및
d) 상기 고상으로부터 상기 바인딩된 핵산을 방출하는 단계를 포함하는 샘플로부터 핵산을 분리하는 방법이 제공된다.
핵산을 함유하는 세포 물질의 샘플과 상기 고상을 결합하는 상기 단계는 상기 샘플 물질과 상기 고상 바인딩 물질을 혼합하는 단계와, 선택적으로, 상기 고상을 상기 샘플의 용적 내에 균일하게 분포시키기 위해 상기 혼합물을, 상기 세포 물질을 부수고 핵산을 상기 고상에 바인딩시키기에 충분한 시간 동안, 기계적으로 교반(agitating)하는 단계를 포함한다. 상기 샘플의 핵산 내용물을 모두 상기 고상에 바인딩시킬 필요는 없지만, 가능한 한 많이 바인딩시키는 것이 유리하다. 상기 샘플/고상 혼합물의 교반(agitation)은 진동 교반(shaking), 기계적 진동기나 락커(rocker)의 이용, 와동 교반(vortexing), 초음파 교반 등을 포함하는 임의의 편리한 형상을 취할 수 있다. 이 단계에서 핵산 바인딩에 필요한 시간은 일반적으로 수 분 대이지만, 일상적인 실험에 의해 실험적으로 검증될 수 있다.
상기 고상으로부터 상기 샘플을 분열시키는 단계는, 예컨대, 여과법, 중력 침강법, 경사법(decantation), 자기 분리법, 원심 분리법, 진공 흡인법, 공기나 기타 가스의 과압으로 액체를 다공성 막이나 필터 매트를 통해 밀어 넣는 등의 방법에 의해 수행될 수 있다. 핵산 외의 샘플 성분들이 이 단계에서 제거된다. 기타 성분들의 제거가 완료되기 전까지는 완전히 제거되도록 돕기 위해 일 회 이상의 세척이 수행될 수 있다. 염, 세포 조각, 단백질 및 헤모글로빈과 같은 샘플 성분들을 제거하기 위한 세척제는 물 및 수성 버퍼 용액을 포함하며 계면 활성제를 함유할 수 있다.
상기 고상으로부터 상기 바인딩된 핵산을 방출하는 단계는 상기 고상 물질을 용액과 접촉시켜 상기 바인딩된 핵산을 상기 고상으로부터 방출하는 것을 포함한다. 상기 용액은 상기 방출된 핵산을 용해하여 충분히 보존해야 한다. 상기 용액은 약 7-9의 pH를 가지고, 선택적으로 0.1-3 M의 버퍼 염, 금속 할로겐화물 또는 아세테이트 염을 함유하며, 선택적으로 0.1-50%의 유기 공용매 또는 계면 활성제를 함유하는 수성 버퍼 용액을 포함하는 시약 조성물일 수 있다.
절단 후에 고상으로부터 핵산을 방출하는 상기 시약은 택일적으로 강 알칼리성 수용액일 수 있다. 적어도 10-4 M의 농도의 알칼리 금속 수산화물이나 암모늄 수산화물의 용액은 상기 절단된 고상으로부터 핵산을 용리하는 데에 효과적이다. 그러한 강 알칼리성 용액은 RNA의 안정성에 해로운 것으로 인정된다. RNA를 얻으려 할 때는, 강 알칼리성 용액과의 접촉을 피하거나 최소 시간에 그쳐야 한다. 강 알칼리성 용액은 공유 결합 파괴에 의해 붕괴(fragment)되거나 절단될 수 있는 기를 통해 핵산 바인딩 부위가 매트릭스에 부착되는 고상 바인딩 물질과 함께 유용하다. 그러한 물질들은 하기에서 설명되며, 전술한 함께 계류중인 미국 특허출원번호 10/714,763, 10/715,284 및 10/891,880에도 설명되어 있다.
몇몇 바람직한 실시예들은 선택적으로 파괴될 수 있는 링크를 통해 상기 NAB기가 상기 매트릭스에 부착되는 고상 바인딩 물질을 사용한다. 상기 링크의 파괴는 임의의 바인딩된 핵산을 상기 고상으로부터 효과적으로 "차단한다". 상기 링크는 절단성 링커(cleavable linker)의 결합(들)을 특정적으로 파괴할 뿐 관심 핵산을 함께 파괴하지는 않는 임의의 화학적, 효소적, 광화학적 또는 기타 수단에 의해 절단될 수 있다. 그러한 절단성 고상 물질은, 핵산 바인딩(NAB) 부위 위에서 부착되어 핵산을 끌어당겨 바인딩하는 실리카, 유리, 불용성 합성 중합체, 및 불용성 다당류에서 선택되는 매트릭스를 포함하고, 상기 NAB 부위는 절단성 링커 부위에 의해 상기 고체 서포트 부위에 링크되는 고상 서포트 부위를 포함한다.
Figure 112007028910393-PCT00001
일 실시예에서 상기 NAB는 전술한 바와 같이 식 QR2 +X-의 3급 오늄기 또는 식 QR3 +X-의 4급 오늄기이다.
Figure 112007028910393-PCT00002
절단성 고상의 한 유형은 상업적으로 입수 가능한, 메리필드(Merrifield) 수지(가교 결합)로 언급되는 종류와 같은 폴리스트렌형 중합체로부터 유도된다. 이러한 중합체에서 일정 비율의 스티렌 유닛은 공유 부착 수단으로 반응기(reactive group), 일반적으로 클로로메틸 또는 히드록시메틸기를 포함한다. 황화물(R2S)이나 3급 아민 또는 포스핀과 반응시켜 몇몇 염소를 대체함으로써 본 발명의 고상 물질을 생산한다. 이러한 설명에 따라 준비된 중합체는 모든 반응성 클로로메틸기가 3급 또는 4급 오늄기로 변환되었을 때 하기 식 (1)로 표현될 수 있다. 본 발명의 중합체 고상이 종종 오늄기 및 클로로메틸기의 혼합물을 포함하도록 그러한 기(group)가 모두 변환될 필요는 없다.
Figure 112007028910393-PCT00003
상기 식에서, m, n, 및 o는 상기 중합체 내에서 각 모노머 유닛의 몰분율을 나타내며, m은 0.1 내지 100%, n은 0 내지 99%, o는 0 내지 10%의 값을 가질 수 있다. 더욱 바람직하게는, m은 1 내지 20%, n은 80 내지 99%, o는 0 내지 10%이다.
또 다른 실시예에서, 절단성 고상은 상업적으로 입수 가능한, 공유 부착을 위한 반응성 클로로아세틸 또는 클로로프로피오닐기를 포함하는 일정 비율의 스티렌 유닛을 가지는 가교 결합 메리필드(Merrifield) 수지로부터 유도된다. 수많은 다른 공지된 중합체 수지들이 절단성 고상 물질을 준비하는 데에 있어 고체 매트릭스로 사용될 수 있다. 중합체 수지들은 Advanced ChemTech (Louisville, KY) 및 NovaBiochem과 같은 상업적 제공자들로부터 입수할 수 있다. 상기 수지들은 일반적으로, 반응성 작용기를 가지는 가교결합 중합체 입자에 기초한다. Advanced ChemTech 2002 Catalog, pp.105-140에 설명된 것과 같은 고체 지지 펩티드 합성에 사용되는 많은 적당한 중합체 수지들이 개시 물질로 적당하다. 반응성 NH2, NH-NH2, OH, SH, CHO, COOH, CO2CH=CH2, NCO, Cl, Br, SO2CH=CH2, SO2Cl, SO2NH2, 아실이미다졸, 옥심(C=N-OH), 숙신이미드 에스테르기를 가지는 중합체들이, 본 발명의 중합체 고상의 준비에 사용되도록, 각각 상업적으로 입수 가능하다. 하기 수많은 예들과, 이미 언급된 함께 계류중인 특허 출원들에서 설명된 것처럼, 종종, 전구체 중합체 수지를 3급 또는 4급 오늄기에 공유 결합시키는 수단을 제공하는 것이 필요하거나 바람직하다. 이는 일반적으로, 알킬렌, 아릴렌, 또는 아랄킬렌기에서 선택된 1-20 분자들의 체인이나 고리기를 포함한다. 상기 체인이나 고리는 케톤, 에스테르, 티오에스테르, 아미드, 우레탄, 탄산염, 크산토겐산염, 요소, 이민, 옥심, 설폭사이드(sulfoxide) 및 티오케톤 형태의 카르보닐기와 O, S 또는 N 원자들을 포함할 수 있다.
절단성 링커 부위는 바람직하게는 선형 체인, 분기 체인 및 고리에서 선택된 유기기(organic group)이고, 1 내지 100 개의 원자, 더욱 바람직하게는 1 내지 약 50 개의 원자를 포함한다. 상기 원자는 바람직하게는 C, H, B, N, O, S, Si, P, 할로겐 및 알칼리 금속에서 선택된다. 예시 링커기는 가수분해에 의해 절단되는 가수분해 절단성 기(hydrolytically cleavable group)이다. 술폰산염 에스테르처럼 카르복실 에스테르와 무수 화합물(anhydride), 티오에스테르, 탄산염 에스테르, 티오탄산염 에스테르, 우레탄, 이미드, 술폰아미드, 및 술폰이미드가 대표적이다. 다른 예시 종류의 링커기는 에탄티올, 메르캅토에탄올, 및 DTT와 같은 티올에 의해 절단되는 이황화 결합(S-S bond)과 같은 환원성 절단을 겪게 되는 기이다. 또 다른 대표적 기는 과산화 결합(O-O bond)을 포함하는 유기 기이다. 과산화 결합은 티올, 아민 및 포스핀에 의해 절단될 수 있다. 또 다른 대표적 기는 하기 식에 의해 표현되고
Figure 112007028910393-PCT00004
여기서 Rd는 H, 알킬 또는 페닐인 니트로-치환 방향족 에테르 및 에스테르와 같은 광화학 절단성 링커기이다. 오르토-니트로벤질 에스테르는 자외선광에 의해 하기 공지 반응에 따라 절단된다.
Figure 112007028910393-PCT00005
또 다른 대표적인 절단성 기는 효소 절단성 링커기이다. 예시 기는 에스테라아제와 가수분해 효소에 의해 절단되는 에스테르, 프로테아제와 펩티다아제에 의해 절단되는 아미드와 펩티드, 글리코시다제에 의해 절단되는 글리코시드기를 포함한다.
또 다른 대표적인 절단성 기는 절단성 1,2-디옥세탄 모이어티(moiety)이다. 그러한 물질은 열적으로 분해(decomposition)되거나 화학 또는 효소제에 의해 붕괴(fragmentation)가 유발될 수 있는 디옥세탄 모이어티를 포함한다. 보호기를 제거하여 산소음이온을 생성하면 디옥세탄 고리의 분해(decomposition)가 촉진된다. 공지의 과정에 따라 C-C 결합뿐만 아니라 과산화 O-O 결합도 절단함으로써 붕괴가 일어난다. 절단성 디옥세탄은 많은 특허와 문헌에 설명되어 있다. 대표적인 예는 미국 특허번호 4,952,707, 5,707,559, 5,578,253, 6,036,892, 6,228,653, 및 6,461,876을 포함한다.
Figure 112007028910393-PCT00006
선택적으로, 링크된 오늄기는 아릴기 Ar이나 절단성 기 Y에 부착될 수 있다. 또 다른 선택으로, 고상 및 3급이나 4급 오늄기로의 링크는 도시된 방위와 반대로 된다.
또 다른 절단성 링커기는 불안정 1,2-디옥세탄 모이어티로 변환될 수 있는 전자-풍부 C-C 이중 결합이다. 상기 이중 결합 상의 치환기 중 적어도 하나는 O, S 또는 N 원자에 의해 상기 이중 결합에 부착된다. 전자-풍부 이중 결합과 1중항 산소가 반응하면 주위 온도에서 자발적으로 붕괴되어 두 개의 카르보닐 조각을 생성하는 불안정 1,2-디옥세탄 고리기를 만든다. 전자-풍부 이중 결합으로부터 형성된 불안정 디옥세탄은 예컨대 A.P. Schaap 및 S.D. Gagnon, J. Am. Chem. Soc., 104, 3504-6 (1982); W. Adam, Chem. Ber., 116, 839-46 (1983); 미국 특허번호 5,780,646과 같은 많은 특허와 문헌에 설명되어 있다.
Figure 112007028910393-PCT00007
절단성 링커 기를 가지는 고상 물질의 또 다른 기는 국제특허공개번호 WO 03/053934에 개시된 것처럼 절단성 모이어티로 케텐 디티오아세탈을 가진다. 케텐 디티오아세탈은 과산화효소 및 과산화수소와의 효소 산화에 의해 산화성 절단을 겪게 된다.
Figure 112007028910393-PCT00008
상기 절단성 모이어티는 도시된 구조를 가지고, 아크리단(acridan) 고리가 치환되는 유사체를 포함하고, 상기 Ra, Rb, Rc는 각각 C, N, O, S, P, Si 및 할로겐 원자에서 선택된 1 내지 약 50 개의 비수소 원자를 포함하는 유기 기이고, 그리고 Ra 및 Rb는 함께 결합하여 고리를 형성할 수 있다. 다른 많은 절단성 기들은 당업자에게 명백하다.
고상 핵산 캡처 방법은 수많은 용도에 사용될 수 있다. 하기 특정 예에서 설명되는 것처럼, 단일 가닥 및 이중 가닥 핵산의 양자 모두가 캡처 및 방출될 수 있다. DNA, RNA, 및 PNA도 캡처 및 방출될 수 있다.
바람직한 용도는 전혈로부터 DNA를 분리하는 것이다. DNA는 일반적으로 사용되는 방법에서 백혈구로부터 추출될 수 있다. 일반적으로 혈액을 처리하여 적혈구를 선택적으로 용해하고, 침전이나 원심분리 단계 후에, 미손상 백혈구를 선택적으로 용해하여 핵산 내용물이 드러나도록 한다. 단백질을 소화하고 얻어진 DNA를 고상으로 분리한 후 서열 다형성의 결정, 서열 분석, RFLP 분석, 돌연변이 검출 또는 기타 형태의 진단 분석에 사용한다.
또 다른 용도는 DNA와 RNA의 혼합물에서 DNA를 분리하는 것이다. 강 알칼리성 용리 조건, 특히 높아진 온도를 사용하는 강 알칼리성 용리 조건을 포함하는 본 발명의 방법은 미손상 DNA를 떠나는 동안 존재하는 RNA를 감성시키거나 파괴할 수 있다. 강 알칼리성 절단 반응을 포함하는 방법은 유사하게 작용한다.
추가적인 용도들은 다른 샘플-토양, 식물, 박테리아, 및 폐수-로부터의 핵산 물질의 추출과 기록 보관 목적의 핵산 물질 장기간 보관을 포함한다.
본 방법의 중요한 효과는 많은 다운스트림 분자 생물학 공정과 호환된다는 것이다. 본 방법에 의해 분리된 핵산은 많은 경우에 후속 공정에서 직접 사용될 수 있다. PCR과 같은 증폭 반응, 미국 특허번호 5,998,175에서 설명된 다중 올리고머 결찰(ligation of multiple oligomers: LMO), 및 LCR이 그러한 핵산 용리액(eluent)를 사용할 수 있다. 종래 기술에 의해, 특히 박테리아 세포 배양물이나 혈액 샘플로부터 분리된 핵산은 침전 단계를 사용한다. 수용액으로부터 핵산을 침전시키기 위해 저분자량 알콜이 높은 부피 분율로 첨가된다. 침전된 물질은 사용되기 전에 분열, 수집 및 적당한 보존액(medium)에서 재용해되어야 한다. 본 방법을 사용하여 본 발명의 고상 바인딩 물질로부터 핵산을 용리함으로써 이 단계들을 생략할 수 있다. 방출된 핵산을 함유하는 용액을 핵산 증폭 반응에 직접 사용하고, 그로써 폴리머라아제 또는 리가아제-조정 반응을 이용하여 핵산이나 핵산 조각의 양을 증폭하는 것이 바람직한 방법이다.
도 1은 본 발명에 따른, 혈액 샘플에서 핵산을 분리하는 방법을 개략적으로 나타낸 도면.
도 2A는 예 1의 입자들을 사용하여 인간 혈액 샘플에서 분리된 DNA를 보여주는 겔의 이미지.
도 2B는 도 2A와 같이 분리된 게놈 DNA 영역을 증폭한 것을 보여주는 겔의 이미지.
도 3은 예 1 또는 예 4의 입자들과 다양한 첨가제들을 사용하여 본 발명에 따라 분리된 게놈 DNA 영역을 증폭한 것을 보여주는 겔의 이미지.
도 4는 예 5-7의 입자를 이용하여 본 발명에 따라 분리된 게놈 DNA 영역을 증폭한 것을 보여주는 겔의 이미지.
도 5A는 예 1 또는 예 2의 입자들을 사용하고 다양한 농도의 NaOH로 용리시켜 인간 혈액 샘플에서 분리된 DNA를 보여주는 겔의 이미지.
도 5B는 도 5A와 같이 분리된 게놈 DNA 영역을 증폭한 것을 보여주는 겔의 이미지.
하기 예에서 구조도가 제시된 경우, 그 구조도는 고상 물질의 절단성 링커 부위만을 설명하기 위한 것이다. 그 구조도가 고상 물질을 완전히 설명하는 것은 아니다.
예 1. 폴리메타크릴산염 링커로 기능화되고, 트리부틸포스포늄기와 절단성 아릴티오에스테르 링크를 포함하는 자기 실리카 입자의 합성.
Figure 112007028910393-PCT00009
자기 카르복시산-기능화 실리카 입자(Chemicell, SiMAG-TCL, 1.0 meq/g, 1.5g)를 20 ㎖의 염화티오닐에 넣고 4 시간 동안 환류시켰다. 과잉 염화티오닐을 감압 하에서 제거했다. 수지를 CHCl3 25 ㎖에 재현탁하고 현탁액을 초음파로 분산시켰다. 용매를 기화하고 초음파 세척 처리를 반복했다. 후에 사용하기 위해 입자를 진공 하에서 건조시켰다.
산 염화물 기능화 입자(acid chloride functionalized particles)를 388 mg의 디이소프로필에틸아민과 함께 CH2Cl2 38 ㎖에 현탁했다. 4'-히드록시페닐 4-클로로메틸-티오벤조에이트(524mg)를 첨가하고 봉인된 반응 플라스크를 밤새 진동 교반기(shaker)에 올려두었다. 입자를 50 ㎖ 플라스틱 시험관으로 옮기고, 자기 분열로, 일부의 CH2Cl2, CH3OH, 1:1 CH2Cl2/CH3OH, 그리고 이어서 CH2Cl2로 반복 세척했다. 미반응 가용성 개시 물질의 제거를 위해 TLC로 세척 용액을 모니터했다. 계속하여 사용하기 전에 고체를 공기 건조시켰다.
수지(1.233 g)를 아르곤 하, CH2Cl2 20 ㎖에서 현탁했다. 트리부틸포스핀(395 mg)을 첨가하고 슬러리를 7 일간 진동 교반했다. 입자를 50 ㎖의 플라스틱 시험관으로 옮기고 CH2Cl2 40 ㎖로 4회 세척했으며, 이어서 MeOH 40 ㎖로 4회, CH2Cl2 40 ㎖로 4회 세척했다. 그 후 수지를 공기 건조하여 1.17 g의 연갈색 고체를 얻었다.
예 2. 트리부틸포스포늄기를 포함하는 절단성 링커로 기능화된 실리카 입자의 합성.
Figure 112007028910393-PCT00010
헵탄 75 ㎖와 에탄올 13 ㎖ 내의 3-아미노프로필트리에톡시실란(13.2 ㎖) 용액을 Ar 하에 두고 숙신산 무수화물 5.5 g으로 저었다. 상기 반응을 4.5 시간 동안 환류시킨 후 밤새 실온으로 냉각시켰다. 용매를 제거하여 아미드 생성물을 맑은 기름으로 얻었다.
CH2Cl2 100 ㎖ 내의 상기 생성물 2.86 g과 EDC 염산염(4.0 g)의 용액을 Ar 하에 두고 1 시간 동안 저은 후 4.16 g의 5.5 g의 4'-히드록시-페닐 4-클로로메틸티오벤조에이트를 첨가하였다. 상기 반응을 밤새 저었다. 반응 혼합물을 실리카 150 g 상으로 크로마토그래프하고 1-2% EtOH/CH2Cl2로 용리하여 1.84 g의 결합 생성물을 백색 고체로 얻었다.
건조 톨루엔 50 ㎖ 내의 이전 단계 생성물(1.84 g)을 Ar 블랭킷(blanket) 하에서 캐뉼러를 통해 과건조 실리카 3.84 g을 포함하는 플라스크에 첨가했다. 상기 반응을 밤새 환류시켰다. 실온으로 냉각 후에 실리카를 여과 제거하고 CH2Cl2 500 ㎖로 세척한 후 4 시간 동안 진공 건조했다.
CH2Cl2 50 ㎖ 내의 클로로벤질 말단기를 가지는 유도체화(derivatized) 실리 카를 트리부틸포스핀 8.0 g과 혼합했다. 반응 혼합물을 Ar 하에서 2 일간 저었다. 실리카를 여과 제거하고, CH2Cl2 및 헥산으로 세척한 후 수 시간 동안 진공 건조했다.
예 3. 트리부틸포스포늄기를 포함하는 절단성 링커로 코팅된 자기 실리카 입자의 합성.
절단성 핵산 바인딩기를 실리카 입자의 표면에 부동적으로(passively) 흡착하여 핵산 바인딩 물질을 준비했다.
3ℓ의 플라스크에 4-클로로메틸벤조산 100.9 g과 SOCl2 1.2ℓ를 채웠다. 반응을 4 시간 동안 환류시키고, 그 후 감압 하에서 염화티오닐을 제거했다. CH2Cl2를 첨가하고 감압 하에서 기화시킴으로써 잔류 SOCl2를 제거했다.
4-클로로메틸벤조산 염화물 113.1 g을 포함하는 3ℓ 플라스크에 4-히드록시티오페놀 98.17 g과 CH2Cl2 1.5ℓ를 채웠다. 아르곤을 안으로 퍼지(purge)하고 피리딘 67.75 ㎖을 첨가했다. 밤새 저은 후 반응 혼합물을 CH2Cl2 1ℓ로 희석하고 물 5ℓ로 추출했다. 물 층(water layer)을 CH2Cl2로 되추출했다. 결합된 CH2Cl2 용액을 황산 나트륨 상에서 건조시키고 고체로 농축했다. 고체를 CH2Cl2 500 ㎖로 세척하고, 여과 및 공기 건조시켰다. 1H NMR (아세톤-d6) : δ 4.809 (s, 2H), 6.946-6.968 (d, 2H), 7.323-7.346 (d, 2H), 7.643-7.664 (d, 2H), 8.004-8.025 (d, 2H).
스테아린산(1.33 g)을 SOCl2 10 ㎖에 2 시간 동안 환류시켰다. 감압 하에서 과잉 SOCl2를 제거하여 스테아로일 염화물을 갈색 액체로 제조했다.
스테아로일 염화물을 CH2Cl2 10 ㎖에 용해하고 CH2Cl2 30 ㎖ 내 디이소프로필에틸아민 1.56 ㎖와 4'-히드록시페닐 4-클로로메틸티오벤조에이트 1.0 g의 용액에 첨가한 후 혼합물을 밤새 저었다. 용매를 제거하고 잔류물에 대해 1:1 헥산/CH2Cl2를 용리액으로 사용하여 칼럼 크로마토그래피를 실시했다. 스테아로일 에스테르(1.43 g)를 흰색 고체로 분리했다.
CH2Cl2 30 ㎖ 내 상기 생성물(1.43 g)과 트리부틸포스핀(1.27 ㎖)의 용액을 Ar 분위기 하에서 2일간 저었다. CH2Cl2를 제거한 후 잔류물을 6 x 50 ㎖의 에테르에 세척하고, CH2Cl2에 용해하고, 그리고 에테르로 침전시켜 1.69 g의 포스포늄 염 생성물을 제조했다. 이 물질은 물에 불용성인 것으로 나타났다.
Figure 112007028910393-PCT00011
포스포늄염(0.6 g)을 CH2Cl2 6 ㎖에 용해하고, 교반하면서 실리카 겔 6.0 g에 첨가했다. 용매를 기화시켜 핵산 바인딩 물질을 생산했다.
예 4. 폴리비닐벤질 트리부틸포스포늄기를 포함하는 중합체 층을 가지는 자 기 입자의 합성
Figure 112007028910393-PCT00012
유리 비알 내의 CH2Cl2 2 ㎖에 자기 메리필드 펩티드 수지(Chemicell, SiMag Chloromethyl, 100 mg)를 첨가했다. 트리부틸포스핀(80 ㎕)을 첨가하고 슬러리를 실온에서 3일 동안 진동 교반했다. 상기 비알 아래에 자석을 두고 부유물을 피펫으로 제거했다. 고체를 CH2Cl2 2 ㎖로 4회 세척했다(세척제도 자석/피펫 절차로 제거했다). 수지를 공기 건조시켰다(93 mg).
예 5. 트리부틸포스포늄기와 절단성 아릴티오에스테르 링크를 포함하는 폴리메타크릴산염 중합체 입자의 합성.
Figure 112007028910393-PCT00013
폴리(메타크릴로일 염화물) 입자(1.0 meq/g, 1.5 g)를 디이소프로필에틸아민 2.45 g을 포함하는 CH2Cl2 75 ㎖ 내에 두었다. 트리에틸아민(1.2 g)을 첨가했다. 4'-히드록시페닐 4-클로로메틸티오벤조에이트(4.5 g)를 첨가하고 밀봉된 반응 혼합물을 실온에서 밤새 저었다. 슬러리를 여과하고 수지를 CH2Cl2 10 ㎖, 아세톤 200 ㎖, MeOH 200 ㎖, 1:1 THF/CH2Cl2 2 x 100 ㎖, THF 250 ㎖, CH2Cl2 250 ㎖, 헥산 250 ㎖로 세척했다. 후에 사용하기 위해 수지를 공기 건조시켰다.
수지(1.525 g)를 아르곤 하에서 CH2Cl2 25 ㎖에 현탁했다. 트리부틸포스핀(1.7 g)을 첨가하고 슬러리를 4일 동안 저었다. 수지를 여과하고 CH2Cl2 225 ㎖, 이어서 헥산 175 ㎖로 4회 세척했다. 그 후 수지를 공기 건조시켜 1.68 g의 고체를 얻었다.
예 6. 트리부틸포스포늄기를 포함하는 폴리스티렌 중합체의 합성.
Figure 112007028910393-PCT00014
가교결합 클로로메틸화 폴리스티렌인 메리필드 펩티드 수지(Sigma, 1.1 meq/g, 20.0 g)를 아르곤 패드 하에서 CH2Cl2 /DMF (50/50) 200 ㎖에서 저었다. 과잉 트리부틸포스핀(48.1 g, 10 당량)을 첨가하고 슬러리를 실온에서 7일 동안 저었 다. 슬러리를 여과하고 그 결과물인 고체를 CH2Cl2 200 ㎖로 2회 세척했다. 수지를 진공 하에서 건조시켰다(21.5 g). 기본 분석: 검출 P 2.52%, Cl 3.08%; 예상 P 2.79%, Cl 3.19%: P/Cl 분율은 0.94.
예 7. 트리부틸암모늄기를 포함하는 폴리스티렌 중합체의 합성.
Figure 112007028910393-PCT00015
메리필드 펩티드 수지(Aldrich, 1.43 meq/g, 25.1 g)를 아르곤 패드 하의 CH2Cl2 150 ㎖에서 저었다. 과잉 트리부틸 아민(25.6 g, 4 당량)을 첨가하고 슬러리를 실온에서 8일 동안 저었다. 슬러리를 여과하고 결과물인 고체를 CH2Cl2 250 ㎖로 2회 세척했다. 수지를 진공 하에서 건조시켰다(28.9 g). 기본 분석: 검출 N 1.18%, Cl 3.40%; 예상 N 1.58%, Cl 4.01%: N/Cl 분율은 0.88.
예 8. 트리부틸포스포늄기로 기능화된 실리카 입자의 합성.
Figure 112007028910393-PCT00016
Ar 하, 110 ℃에서 1시간 동안 건조시킨 실리카 겔(4.82 g)을 Et3N 2.79 g과 함께 CH2Cl2 50 ㎖에 첨가했다. 20분 동안 혼합물을 저은 후 3-브로모프로필트리클로로실란 2.56 g을 첨가하여 발열하도록 했다. 혼합물을 24시간 동안 저은 후 여과하고 고체를 CH2Cl2 3 x 40 ㎖, MeOH 4 x 40 ㎖ 및 CH2Cl2 2 x 40 ㎖로 연속 세척하였다. 고체를 밤새 공기 건조시키고 6.13 g을 얻었다.
CH2Cl2 50 ㎖에 상기 준비된 기능화 실리카(5.8 g)을 트리부틸포스핀 5.33 ㎖로 10일 동안 저었다. 혼합물을 여과하고 고체를 7 x 50 ㎖의 아세톤으로 세척했다. 고체를 공기 건조하여 생성물 5.88 g을 얻었다.
예 9. 예 3의 NAB 물질 내의 링커의 제어된 절단.
예 3의 코팅된 실리카 물질(70 mg)을 D2O 1.0 ㎖에 현탁하고 3분 동안 와동 교반(vortexing)하여 혼합했다. 상기 수용액을 1H NMR 분석한 결과, 용액 속으로 물질이 방출되지 않는 것으로 나타났다.
상기 실리카 현탁액을 40% NaOD 40 ㎕로 처리하고 3분 동안 와동 교반한 후, 부유물을 NMR 분석한 결과, 링커가 절단되고 실리카에서 용액 속으로 방출이 이루어지는 것으로 나타났다.
예 10. 인간 전혈로부터 DNA 의 캡처.
예 1-8의 입자 각각에서 10 mg 부분을 시험관 내에서 인간 전혈 70 ㎕와 혼합하였다. 시험관을 15초간 와동 교반 혼합하고 실온에서 5분간 유지한 후 다시 15 초간 와동 교반 혼합했다. 300 ㎕의 10 mM 트리스 완충액, pH 8.0으로 혼합물을 희석하고 입자에서 액체를, 자기 반응성 입자가 사용된 경우에는 자석을 활용하여, 제거했다.
예 11. 인간 전혈에서 DNA 의 분리.
상기 예의 절차에 따라 고상 바인딩 물질에 캡처된 핵산을 500 ㎕의 10 mM 트리스 완충액, pH 8.0으로 3회 세척하고, 각 세척마다 부유물을 제거했다. 37 ℃에서, 0.1 M NaOH 100 ㎕로 5분 동안 용리함으로써 입자에서 핵산을 제거했다. 도 5A 및 도 5B에 도시한 것처럼, 다른 농도의 NaOH도 효과적이었다.
예 12. 게놈 DNA 의 PCR 증폭.
0.1 M NaOH 내의 상기 예의 용리된 DNA(1 ㎕)를, 200 bp 앰플리콘(amplicon)을 생산하는 24 염기(base) 프라이머 쌍으로 PCR 증폭했다. 상기 성분들을 포함하는 PCR 반응 혼합물을 하기에 나열하였다.
성분 부피(㎕)
10X PCR 버퍼 2
프라이머 1 (100 ng/㎕) 2
프라이머 2 (100 ng/㎕) 2
2.5 mM dNTPs 2
50 mM MgCl2 1.25
Taq DNA 폴리머라제 (5U/㎕) 0.25
템플리트 1
탈이온수 9.5
합계 20
음성 대조군은 반응 혼합물에서 템플리트를 1 ㎕의 물로 대체했다. 추가 반응은 물에 1:10 희석된 1 ㎕의 템플리트를 사용했다. 반응 혼합물에 대해 94 ℃, 30초; 60 ℃, 30초; 72℃, 30초의 30 사이클을 실시했다. 반응 생성물을 1.5% 아가로스 겔에서 전개시켰다. 도 3은 비드에서 용리된 DNA가 손상되지 않았음을 보여준다.

Claims (13)

  1. a) 핵산 바인딩 부위가 부착되는 매트릭스를 포함하는 고상을 제공하는 단계;
    b) 아무런 세포 용해(lysis) 용액의 첨가 없이 핵산을 포함하는 세포 물질의 샘플과 상기 고상을, 상기 핵산을 상기 고상에 바인딩하기에 충분한 시간 동안 결합하는 단계;
    c) 상기 고상으로부터 상기 샘플을 분열시키는(separating) 단계; 및
    d) 상기 고상으로부터 상기 바인딩된 핵산을 방출하는 단계를 포함하는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 분리하는(isolating) 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포 물질은 동물, 식물 또는 박테리아 기원의 미손상 세포, 그리고 동물, 식물 또는 박테리아 기원의 미손상 세포를 포함하는 조직으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 분리하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 샘플은 세포 물질을 포함하는 박테리아 배양물, 체액, 전혈 및 혈액 성분, 조직 추출물, 식물 물질, 및 환경 샘플로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 분리하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 샘플은 전혈인 것을 특징으로 하는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 분리하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 핵산은 DNA 및 RNA로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 분리하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 핵산은 유기체의 게놈 DNA인 것을 특징으로 하는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 분리하는 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 핵산은 전혈에서 얻어진 인간 게놈 DNA인 것을 특징으로 하는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 분리하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 매트릭스는 실리카, 유리, 불용성 합성 중합체, 및 불용성 다당류에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 분리하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 고상의 상기 매트릭스는 실리카인 것을 특징으로 하는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 분리하는 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 고상은 자기 반응성 부위를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 분리하는 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 핵산 바인딩 부위는 3급 술포늄기, 4급 암모늄기 및 4급 포스포늄기로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 분리하는 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 핵산 바인딩 부위는 선택적으로 절단될 수 있는 링크(linkage)를 통해 상기 매트릭스에 부착되는 것을 특징으로 하는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 분리하는 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 바인딩된 핵산은 강알칼리성 용액 내에서 상기 고상으로부터 방출되는 것을 특징으로 하는 세포 물질의 샘플에서 핵산을 분리하는 방법.
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