CN101107365A - 从细胞材料分离核酸的简化方法 - Google Patents
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Abstract
公开了从细胞材料的样品分离核酸的方法,该方法使用固相结合材料并避免使用裂解液。固相结合材料的使用出人意料地允许细胞的核酸内含物被释放并直接被捕获,而且是在一个步骤中。相对于现有方法,新方法表现出明显的简化。用于本发明的方法和组合物的优选的固相材料包括季核酸结合部分。
Description
相关申请的交叉参考
[0001]本申请是申请人的共同未决申请的部分继续申请,所述共同未决申请是2003年11月17日提交的美国申请序列第10/714,763号和2003年11月17日提交的美国申请序列第10/715,284号。
发明领域
[0002]本发明涉及用于捕获和分离核酸的简化方法,特别地从生物来源的材料捕获和分离总基因组核酸。
背景技术
[0003]分子诊断学和分子生物学中的现代技术(包括反转录、克隆、限制性分析、扩增和序列分析),要求提取核酸。在其中发现有目标核酸的复杂的样品基质使得获取核酸被复杂化。此类样品包括例如来自组织的细胞、来自体液的细胞、血液、培养中的细菌细胞、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶或从目标核酸扩增得到的溶液。样品基质经常含有显著量的污染物,在感兴趣的核酸被用于分子生物学或分子诊断技术之前所述污染物必须从所述核酸中去除。
[0004]从上述细胞和组织产生的混合物中获得目标核酸的常规技术,需要使用有害化学品例如酚、氯仿以及溴化乙锭。酚/氯仿提取被用于此类步骤,以从目标核酸和多种污染物的混合物中抽提掉污染物。可选地,根据本领域中熟知的方法,使用氯化铯-溴化乙锭梯度。参见例如Molecular Cloning,由Sambrook等编著(1989),Cold Spring HarborPress,pp.1.42-1.50。通常,该在后方法之后,通过将乙醇或2-丙醇加入水相以沉淀核酸来沉淀保留在抽提的水相中的核酸物质。通常,通过离心从溶液中移出沉淀物,并且在水或缓冲溶液中重悬以作进一步使用之前,允许干燥所得到的沉淀物小球。
[0005]已经开发出更简单和更快的方法,其采用各种类型的固相,以从细胞裂解液或核酸和污染物的其它混合物中分离核酸。此类固相包括各种形状和形式例如纤维的层析树脂、聚合物和二氧化硅基或玻璃基物质,过滤器以及包被的容器。当为小颗粒的形式时,有时提供磁芯,以帮助实现分离。
[0006]已经开发出含有固体结合支持材料的试剂盒,并可以在商业上获得,用于从细菌培养物和从人全血分离基因组的方法中。制造商提供的步骤总是详细说明,在开始核酸的移除和纯化之前必须裂解细胞。在使用固体支持物之前,有时也利用额外的沉淀步骤(例如K.Smith等,J.Clin.Microbiol.,41(6),2440-3(2003);P.Levison等,J.ChromatographyA,827,337-44(1998))。
[0007]在分离核酸中使用的一种类型的固相包括设计用于高效液相色谱(HPLC)的多孔硅胶颗粒。用阴离子交换剂对多孔硅胶颗粒的表面进行官能化,以在某一盐和pH条件下与质粒DNA交换。参见,例如美国专利4,699,717和5,057,426。在含有高浓度盐的水溶液中洗脱结合到这些固相材料的质粒DNA。从那里洗脱的核酸溶液在其被用于下游过程之前必须被进一步处理,以除去盐。
[0008]其它硅基固相材料包括可控孔度玻璃(controlled pore glass,CPG)、包埋有二氧化硅颗粒的滤器、硅胶颗粒、硅藻土、玻璃纤维或上述的混合物。在存在离液剂例如碘化钠(NaI)、硫氰酸胍或氯化胍的情况下,在含有核酸的样品中,每一硅基固相材料可逆地结合核酸。此类固相结合并保持核酸物质,同时该固相经受离心或真空过滤以从残余样品成分中分离基质和结合于其上的核酸物质。然后,通过用水或低盐洗脱缓冲液洗脱,从固相释放出该核酸物质。商业上可得的用于核酸分离的硅基固相材料包括例如WizardTM DNA纯化系统产品(Promega,Madison,WI)、QiaPrepTM DNA分离系统(Qiagen,Santa Clarita,CA)、High Pure(Roche)以及GFX Micro Plasmid Kit(Amersham)。
[0009]颗粒形式的聚合树脂也被广泛用于核酸的分离和纯化。羧酸盐改性的聚合颗粒(Bangs,Agencourt)是已知的。欧洲专利申请公开第EP1243649A1中公开了含有季铵首基(head group)的聚合物。该聚合物是具有共价连接的线性非交联聚合物的惰性载体颗粒。该类型的聚合固相一般是指触角树脂(tentacle resin)。线型聚合物掺入四烷基季铵基团。该烷基基团被指定为甲基或乙基基团(第4栏,第52-55行)。较长的烷基被认为是不期望的。
[0010]基于阴离子交换原理的其它用于结合核酸的固相材料目前正在使用中。这些包括具有DEAE首基(Qiagen)和二氧化硅-NucleoBond AX(Becton Dickinson,Roche-Genopure)的硅基材料,这基于在EP0496822B1中描述的层析载体。具有聚合的三烷基铵基团的聚合物树脂被描述于EP 1243649(GeneScan)。用于DNA分离的羧基改性聚合物可以从众多的供应商获得。在高盐条件下核酸被吸引,而在低离子强度条件下核酸被释放。具有阳离子三甲胺外部的聚合微载体珠被描述在美国6,214,618中。该珠具有相对大的直径并且作为培养中细胞粘附和生长的支持物是有用的。
[0011]含有三丁基(tributylphosphonium)首基的聚合珠已经被描述用于三相体系中的相转移催化剂。由交联的聚苯乙烯制备该珠。(J.Chem.Soc.Perkin Trans.II,1827-1830,(1983))。具有通过亚烷基链和亚烷基醚链(alkylene ether chain)连接至交联的聚苯乙烯树脂的侧链三烷基基团的聚合物珠也已被描述(Tomoi,et al.,Makromolekulare Chemie,187(2),357-65(1986);Tomoi,et al.,Reactive Polymers,Ion Exchangers,Sorbents,3(4),341-9(1985))。基于交联的聚苯乙烯树脂的混合季铵/不溶性聚合物作为催化剂和生物杀伤剂被公开(Davidescu,et al.,Chem.Bull.Techn.Univ.Timisoara,40(54),63-72(1995);Parvulescu,et al,.Reactive & Functional Polymers,33(2,3),329-36(1997)。
[0012]磁响应性颗粒也已经被开发用作核酸分离中的固相。设计用于核酸分离的若干种不同类型的磁响应性颗粒在本领域中是已知的,并且可以从若干来源商业获得。可逆地直接结合核酸材料的磁性颗粒包括MagneSilTM颗粒(Promega)。也已知,磁性颗粒通过共价连接的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白可逆地结合mRNA,其中抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白具有用于与mRNA的聚腺苷酸尾杂交的连接的寡dT尾。
[0013]已知多种类型的磁响应性硅基颗粒被用作核酸结合分离法中的固相。一个这样的颗粒类型是磁响应性玻璃珠,优选具有受控孔尺寸的磁响应性玻璃珠,其作为Magnetic Porous Glass(MPG)颗粒可以从CPG,Inc.(Lincon Park,NJ)获得;或者在美国专利第4,395,271、4,233,169、或4,297,337号中描述的多孔磁玻璃颗粒。在核酸的结合和分离中有用的另一类型的磁性颗粒是通过将磁性材料掺入聚合的二氧化硅化合物基质中而产生的(德国专利DE4307262A1)。包含包埋在具有季铵基的纤维素基质中的氧化铁纳米颗粒的磁颗粒由CortexBiochem(San Leandro,CA)作为MagaCell-QTM商业化生产。
[0014]具有可诱导磁性性质的颗粒或珠包括过渡金属的小颗粒,例如铁、镍、铜、钴和锰,以形成金属氧化物,在磁体存在下可以使该金属氧化物具有暂时的磁性。这些颗粒被称为顺磁性的或超顺磁性的。为形成顺磁或超顺磁珠,已用在水中相对稳定的聚合物包被金属氧化物。美国专利4,554,088公开了顺磁颗粒,其包括被高分子硅烷包被层包围的金属氧化物芯。美国专利5,356,713公开了可磁化的微球体,其包括被疏水乙烯基芳族单体外壳包围的可磁化颗粒芯。美国专利5,395,688公开了已经用混合的顺磁金属氧化物-聚合物层包被的聚合物芯。另一种方法采用聚合物芯以吸收金属氧化物,例如诸如在美国专利第4,774,265号中。包含用顺磁金属氧化物颗粒层包被的聚合芯颗粒的磁性颗粒被公开于美国专利5,091,206中。然后,用另外的聚合层进一步包被该颗粒,以保护金属氧化物层并提供反应性包被层。美国专利5,866,099公开了在用于配位金属盐并包载(entrap)混合的金属氧化物颗粒的蛋白存在的情况下,通过两种金属盐的混合物共沉淀制备磁性颗粒。许多示例性金属盐对被描述。美国专利5,411,730描述了相似的方法,其中沉淀的混合的金属氧化物颗粒被包载在葡聚糖——一种寡糖中。
[0015]用于不可逆地捕获DNA和RNA的氧化铝(Alumina)(氧化铝(aluminum oxide))颗粒被公开于美国专利6,291,166中。用于固相扩增法例如PCR的结合的核酸是可得的。
[0016]在含有高浓度盐的水溶液中洗脱结合到这些固相材料的DNA。从那里洗脱的核酸溶液在其可以被用在下游过程之前必须被进一步处理以除去盐。相反,通过用水或低盐洗脱缓冲液洗脱,从固相释放结合至硅基材料的核酸。美国专利5,792,651描述了用于核酸的色谱分离的组合物,其增强核酸在细胞中转染的能力。该组合物包括含有2-丙醇和任选地含有盐和缓冲物质的水溶液。
[0017]据报道,还有其它包括含有磁微粒芯的琼脂糖或纤维素颗粒的磁性固相材料在用含有高浓度盐和聚亚烷基二醇的组合物处理后结合并保持核酸(例如美国专利5,898,071,和PCT公开WO02066993)。随后,通过用水或低离子强度缓冲液处理释放核酸。
[0018]申请人的共同在审美国申请序列第10/714,763、10/715,284和10/891,880公开了新颖的固相核酸结合材料,包括可切割的材料,和结合并释放核酸的方法,这两个申请并入本文作为参考。
发明概述
[0019]本发明的第一个目标是提供在无化学裂解步骤的情况下,使用固相核酸结合材料从生物材料捕获核酸的方法。
[0020]本发明的另一个目标是提供从生物材料分离核酸的方法,所述方法通过在无化学裂解步骤的情况下,使用固相核酸结合材料捕获核酸,并且随后释放捕获的核酸来进行。
[0021]本发明的一个目标是使用具有可裂解的连接体基团的固相核酸结合材料,从生物和细胞材料捕获和分离核酸的方法。
[0022]本发明的一个目标是使用具有阳离子基团的固相核酸结合材料,从生物和细胞材料捕获和分离核酸的方法,所述阳离子基团选自基、铵基和锍基基团。
附图简述
[0023]图1示意性地描述了根据本发明的核酸从血样的分离。
[0024]图2A是凝胶图像,显示了使用实施例1的颗粒从人血样分离的DNA。图2B是凝胶图像,显示了如图2A中分离的基因组DNA的区域的扩增。
[0025]图3是凝胶图像,显示了根据本发明方法分离的基因组DNA的区域的扩增,使用实施1或实施例4的颗粒和各种添加剂。
[0026]图4是凝胶图像,显示了根据本发明方法分离的基因组DNA的区域的扩增,使用实施例5-7的颗粒。
[0027]图5A是凝胶图像,显示了使用实施例1或2的颗粒从人血样分离的DNA,用各种浓度的NaOH洗脱。图5B是凝胶图像,显示了如5A显示分离的基因组DNA的区域的扩增。
发明详述
定义
[0028]烷基(alkyl)——含有1-20个碳原子的支链、直链或环状烃基团,其可以用除了H以外的1个或多个取代基取代。本文中所使用的低级烷基是指那些含有高达8个碳的烷基基团。
[0029]芳烷基(aralkyl)——用芳基取代的烷基基团。
[0030]芳基(aryl)——含有1至5个碳环芳香环的含芳香环的基团,其可以用除了H以外的1个或多个取代基取代。
[0031]细胞材料(cellular material)——完整细胞或材料,包括组织,含有动物、植物或细菌来源的完整细胞。
[0032]细胞核酸内含物(cellular nucleic acid content)——指在细胞材料内发现的核酸,可以是基因组DNA和RNA,和其他核酸,诸如来自感染源的核酸,包括病毒和质粒。
[0033]磁性颗粒(maganetic particle)——颗粒、微粒或珠,其对外部的磁场有响应。该颗粒本身可以是磁性的、顺磁性的或超顺磁性的。如当使用铁磁材料时,其可以被吸引到外部磁体或被施加磁场。颗粒可以具有固体芯部分,该固体芯部分是磁响应性的,并且被一层或多层非磁响应性层包围。可选地,磁响应性部分可以是周围的层或者可以是布置在非磁响应性芯内的颗粒。
[0034]寡聚物、寡核苷酸(oligomer,oligonucleotide)——如本文所使用的,将是指含有核苷酸间磷酸二酯键(phosphodiester internucleotidelinkage)和5′-端单磷酸基团的化合物。核苷酸可以是正常发生的核糖核苷酸A、C、G和U或脱氧核糖核苷酸dA、dC、dG和dT。
[0035]核酸(nucleic acid)——多核苷酸,可以是DNA、RNA或合成的DNA类似物,如PNA。任何这三类链的单链化合物和双链杂交体也都在该术语的范围内。
[0036]释放、洗脱(release,elute)——通过与溶液或组合物接触,除去结合至固相材料的表面或孔的大部分材料。
[0037]样品(sample)——含有或疑似含有核酸的流体。可以用在本发明的方法中的典型的样品包括体液,例如血液、血浆、血清、尿、精液、唾液、细胞培养物、组织提取液和类似物。其它类型的样品包括溶剂、海水、工业水样、食物样品和环境样品例如土壤或水、植物材料、原核生物来源的细胞、真核生物、细菌、质粒和病毒。
[0038]固相材料(solid phase material)——具有可以将核酸分子吸引至其上的表面的材料。材料可以是微粒、纤维、珠、膜以及其它支持物例如试管和微孔的形式。
[0039]取代的(substituted)——是指用非氢原子基团置换某个基团上的至少一个氢原子。应该注意到的是,关于取代的基团,其意图是可以存在多点取代,除非明确另外指出。
[0040]通过各种技术,从不同的样品类型提取、分离并另外纯化核酸。这些技术的许多依赖于选择性吸附到对核酸具有一些亲和力的材料的表面上。在除去其它较弱结合的成分的洗涤步骤之后,用溶液处理固相,以除去或洗脱结合的核酸(多种核酸)。从细胞材料的一部分提取和分离基因组核酸常常是必需的。如此获得的核酸被用于随后的过程中,包括扩增、诊断试验、突变分析、基因表达型分析和克隆。通过本发明的方法从其可以分离出核酸的样品包括细菌培养物、体液、全血和血液组分、组织提取物、植物材料以及含有细胞材料的环境样品。
[0041]细胞核酸内含物的去除需要破裂或穿透细胞膜或细胞壁,以便进入细胞内部。对于该目的,现有的方法利用细胞裂解步骤,该步骤使用导致裂解的试剂。根据使用的裂解方法,有两类裂解溶液。一类是高pH的含水溶液,用于碱裂解。另一类利用一种或多种表面活性剂或去污剂来破坏细胞膜。裂解溶液也可以含有消化酶如蛋白酶,以便帮助将细胞的核酸内含物释放出来。申请人已经开发出使用固相结合材料从细胞材料样品分离核酸的方法,该方法避免使用裂解液。固相结合材料意料不到地允许细胞的核酸内含物被释放并被直接捕获,而且在一个步骤中完成。因为免除了对裂解液的使用,该新方法在简单、便利和易于自动化方面代表着显著的提高。
[0042]在本发明的一个方面,提供了从细胞材料的样品分离核酸的方法,包括:
a)提供固相,该固相包括:连接有核酸结合部分的基质;
b)在不存在任何添加的裂解液下,将所述固相与含有核酸的细胞材料的样品混合一段时间,所述时间足以将所述核酸结合至所述固相;
c)从所述固相分离所述样品;和
d)从所述固相释放结合的核酸。
[0043]与本发明的方法一起使用的、用于结合核酸的固相材料包括基质,该基质限定了它的尺寸、形状、孔隙度和机械性能,以及共价连接的核酸结合基团,并可以是颗粒、微粒、纤维、珠、膜以及其它支持物例如试管和微孔的形式。该材料在表面上或表面附近进一步包括核酸结合部分,其允许捕获和结合不同长度的核酸分子。表面不但指固相材料的外围,而且指固相材料内任何可及的多孔区的表面。
[0044]基质材料可以是任何合适的物质。优选的基质材料选自二氧化硅、玻璃、不溶性的合成聚合物和不溶性的多糖。示例性的材料包括用共价结合的表面官能团包被或官能化的硅基材料,所述共价结合的表面官能团用于破坏细胞并吸引核酸。也包括被合适地表面官能化的碳水化合物基材料,和具有该表面官能度的聚合材料。申请人的共同未决美国申请序列第10/714,763、10/715,284和10/891,880描述了众多具体的材料和它们的制备。充当核酸结合基团的表面官能团包括能够破坏细胞的结构完整性并导致核酸吸引至固体支持物的任何基团。此基团不受限制地包括描述于下的季铵和盐和三元锍盐((ternarysulfonium salt)类材料。
[0045]固相还可以包括磁响应部分,其通常将是磁微颗粒的形式——可以被磁场吸引并操作的颗粒。此类磁微颗粒包括磁金属氧化物或金属硫化物芯,其通常被吸附性或共价性的结合层包围,该吸附性或共价性的结合层共价结合核酸结合基团,从而包覆表面。磁金属氧化物芯优选是氧化铁或硫化铁,其中铁是Fe2+或Fe3+或两者。如美国4,654,267所述,磁性颗粒也可以通过在多孔聚合物存在下沉淀金属颗粒以捕获磁响应性金属颗粒而形成。可制备的磁性金属氧化物从而包括Fe3O4、MnFe2O4、NiFe2O4和CoFe2O4。其它磁性颗粒也可以如美国5,411,730所述通过在寡糖葡聚糖存在下沉淀金属氧化物颗粒以捕获磁响应性金属颗粒而形成。前述的美国专利5,091,206公开了另一种磁性颗粒。该颗粒包括用顺磁性金属氧化物颗粒层包被的聚合芯颗粒以及另外的聚合层,以保护金属氧化物层并提供反应性包被层。含有氯甲基化的Merrifield树脂的磁铁矿(四氧化三铁,magnetite)的制备被描述于出版物(Tetrahedron Lett.,40(1999),8137-8140)中。
[0046]商业可得的磁性二氧化硅或磁性聚合颗粒可以被用作制备在本发明中有用的磁固相结合材料的原材料。具有表面羧基基团的聚合颗粒的合适类型已知为商品名SeraMagTM(Seradyn)和BioMagTM(Polysciences and Bangs Laboratories)。二氧化硅磁性颗粒的合适类型已知为商品名MagneSilTM(Promega)。在表面上具有羧基或氨基的二氧化硅磁性颗粒可以从Chemicell GmbH(Berlin)获得。
[0047]当固相结合材料包括不溶性合成聚合物部分时,有用的聚合物是一种或多种烯键式不饱和单体单元的均聚物或共聚物,并且可以是交联的或非交联的。优选的聚合物是聚烯烃,包括聚苯乙烯以及聚丙烯酸型聚合物。后者包括多种取代的丙烯酸、酰胺和酯的聚合物,其中丙烯酸单体在2-或3-碳上可以含有或可以不含有烷基取代基。
[0048]包含在可用于本发明的方法中的固相结合材料中的核酸结合(nucleic acid binding,NAB)基团表现出具有双重效用。NAB基团吸引并结合具有各种长度和碱基组成或碱基序列的核酸、多核苷酸和寡核苷酸。它们也具有一些将核酸从细胞包膜中释放出来的能力。核酸结合基团包括例如羧基、胺和三元或四元基(ternary or quaternaryonium groups)。胺基团可以是NH2、烷基胺以及二烷基胺基团。三元或四元基包括三烷基季铵基团(-QR3 +)、基(-QR3 +)包括三烷基或三芳基或混合的烷基芳基基、以及三元锍基(-QR2 +)。固相可以含有一种以上类型的核酸结合基团,如本文中所述。含有其中R基团是具有至少4个碳的烷基的三元或四元基-QR2 +或-QR3 +的固相材料在结合核酸中特别有效,但少至1个碳的烷基基团也如芳基那样有用。此类固相材料以高的韧度保持结合的核酸并在现有技术中已知用于洗脱的大多数条件下阻止核酸的去除或洗脱。大部分已知的低和高离子强度的洗脱条件对于除去结合的核酸是无效的。不同于含有DEAE和PEI基团的传统阴离子交换树脂,三元或四元固相材料保持带正电,无论反应介质的pH如何。
[0049]在本发明另外的实施方案中,提供了从样品中分离核酸的方法,包括:
a)提供固相,所述固相包括:
选自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶的多糖的基质,和结合至所述基质表面上的基,所述基选自:式QR2 +X-的三元锍基,其中R选自C1-C20烷基、芳烷基和芳基;式NR3 +X-的季铵基,其中R选自C1-C20烷基、芳烷基和芳基;以及季基PR3 +X-,其中R选自C1-C20烷基、芳烷基和芳基,并且其中X是阴离子;
b)在不存在任何添加的裂解液下,将所述固相与含有核酸的细胞材料的样品混合一段时间,所述时间足以将所述核酸结合至所述固相;
c)从所述固相分离所述样品;和
d)从所述固相释放所述结合的核酸。
[0050]将固相与含有核酸的细胞材料的样品混合的步骤,涉及将样品材料与固相结合材料混合,和任选地,机械搅拌混合物以将固相均匀分散在样品体积内,所用时间为有效地破坏细胞材料并将核酸结合至固相。样品的所有核酸内含物不必都结合至固相,然而尽可能多地结合是有利的。对样品/固相混合物的搅拌可以采用任何便利的形式,包括摇动、使用机械振荡器或摇摆器(rocker)、旋转、超声波搅拌和类似形式。在该步骤中结合核酸所需要的时间通常在数分钟的水平,但是可通过常规实验进行实验性地确认。
[0051]从固相分离样品的步骤可以通过下列方法完成:过滤、重力沉降、倾析、磁力分离、离心、真空抽吸、过压空气或其它气体以使液体通过多孔膜或例如过滤毡片(filter mat)。该样品中除了核酸之外的组分在该步骤被除去。就其它组分的除去不完全而言,可以进行一种或多种洗涤,以帮助它们完全被去除。用于去除样品组分如盐、细胞碎片、蛋白质和血红蛋白的洗涤剂包括水和含水缓冲溶液,并可以含有表面活性剂。
[0052]从固相释放结合的核酸的步骤,涉及将所述固相材料与溶液接触以从所述固相释放结合的核酸。溶液应该溶解并充分保护释放的核酸。该溶液可以是试剂组合物,其包括pH约7-9的含水缓冲液,任选地含有0.1-3M的缓冲盐、金属卤化物或醋酸盐以及任选地含有0.1-50%的有机助溶剂、或表面活性剂。
[0053]用于裂解后从固相释放核酸的试剂可以选择性的是强碱含水溶液。浓度至少为10-4M的碱金属氢氧化物或氢氧化铵的溶液有效地将核酸从裂解的固相洗脱出来。应该认识到,此强碱性溶液对于RNA的稳定性是有害的。当想要获得RNA时,与强碱性溶液的接触应该被避免或保持最小的时间。强碱性溶液可用于联合固相结合材料,在其中,核酸结合部分通过基团被连接到基质,所述基团可以通过共价键的断裂(breakage)而被断裂(fragment)或裂解(cleave)。此类材料描述于下和前述共同未决美国专利申请序列第10/714,763、10/715,284和10/891,880中。
[0054]某些优选的实施方案利用固相结合材料,在其中,NAB基团通过可以被选择性断裂的键连接到基质。断裂该连接有效地将任何结合的核酸与固相“分开”。所述连接可以通过任何化学、酶法、光化学或特异性断裂可裂解接头中的键(许多键)但也不破坏感兴趣的核酸的其他方法而裂解。此类可裂解固相材料包括固体支持部分(solid supportportion),所述固体支持部分包括选自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物以及不溶多糖的基质,在其表面上连接有核酸结合部分(nucleicacid binding portion,NAB),用于吸引和结合核酸,所述核酸结合部分由可裂解的连接体部分连接到固体支持部分。
[0055]
在一个实施方式中,NAB是式QR2 +X-的三元基,或四元基QR3 +X-,如上所述。
[0056]一种类型的可裂解固相来源于商业可得的聚苯乙烯型聚合物例如被称为Merrifield树脂(交联的)的那些类型。在这些聚合物中,一定百分比的苯乙烯单元含有反应性基团,通常为氯甲基或羟甲基,作为共价连接的工具。通过与硫化物(R2S)或三元胺或膦反应,置换一些氯,产生本发明的固相材料。当所有的反应性氯甲基基团已经被转化成三元或四元基时,根据本定义制备的聚合物可以用下面的式(1)描绘。对于所有此类基团,不必须都被转化,使得本发明的聚合固相将经常含有基和氯甲基基团的混合物。
在上式中,m、n和o表示聚合物中每一单体单元的摩尔百分数,并可以取值为:m从0.1%至100%、n从0至99%、以及o从0至10%。更优选地,m从1%至20%、n从80至99%、以及o从0至10%。
[0057]在另一个实施方式中,可裂解固相来源于商业可得的交联的Merrifield树脂,其一定百分比的苯乙烯单元含有反应性氯乙酰基或氯丙酰基,用于共价连接。许多其它本领域已知的聚合树脂可以被用作制备可裂解固相材料中的固体基质。聚合树脂可以从商业供应商例如Advanced ChemTech(Louisville,KY)和NovaBiochem获得。该树脂通常基于具有反应性官能团的交联的聚合颗粒。用在如Advanced ChemTech2002 Catalog,pp.105-140中所述的固体支持的肽合成中的许多合适的聚合树脂是适宜的原材料。具有反应性NH2、NH-NH2、OH、SH、CHO、COOH、CO2CH=CH2、NCO、Cl、Br、SO2CH=CH2、SO2Cl、SO2NH2、酰基咪唑、肟(C=N-OH)、琥珀酰亚胺酯基团的聚合物每一个都是商业可得的,用于制备本发明的聚合固相。如在下面的多个例子和前述共同未决专利申请中所示,提供将前体聚合树脂共价接合到三元或四元基的方法有时是必需或期望的。这将通常包括选自亚烷基、亚芳基或亚芳烷基(aralkylene)基团的1-20个原子的链或环基团。该链或环还可以含有O、S或N原子以及以酮、酯、硫代酸酯、酰胺、氨基甲酸乙酯、碳酸酯、黄原酸酯、脲、亚胺、肟、亚砜和硫酮形式的羰基基团。
[0058]可裂解连接体部分优选选自直链、支链和环的有机基团,并包括1至100个原子并更优选1至约50个原子。该原子优选选自C、H、B、N、O、S、Si、P、卤素和碱金属。示例性的连接体基团是通过水解裂解的水解可裂解基团。羧酸酯和羧酸酐、硫代酸酯、碳酸酯、硫代碳酸酯、氨基甲酸乙酯、二酰亚胺、磺酰胺和磺酰亚胺是代表性的,如同磺酸酯也是代表性的。连接体基团的另一个示例性类别是经受还原性裂解的那些基团,如二硫(S-S)键,所述二硫键通过硫醇例如乙硫醇、巯基乙醇和DTT被裂解。另一个代表性基团是含有过氧化物(O-O)键的有机基团。过氧化物键可以通过硫醇、胺和膦裂解。另一代表性的基团是光化学可裂解连接体基团如硝基取代的芳族醚和酯,式为
其中Rd为H、烷基或苯基。邻硝基苄基酯根据下面熟知的反应被紫外光裂解。
[0059]另一代表性的可裂解基团是可酶法裂解连接体基团。示例性的基团包括通过酯酶和水解酶裂解的酯、通过蛋白酶和肽酶裂解的酰胺和肽、通过糖苷酶裂解的糖苷基团。
[0060]另一代表性的可裂解基团是可裂解的1,2-二氧杂环丁烷(dioxetane)部分。此类材料包含可以被热分解或由化学剂或酶剂引发成片段的二氧杂环丁烷部分。除去保护基以产生氧阴离子,促进二氧杂环丁烷环的分解。根据熟知的方法,通过裂解过氧化物的O-O键以及C-C键而发生断裂(fragmentation)。可裂解的1,2-二氧杂环丁烷描述于众多专利和出版物中。代表性的例子包括美国专利4,952,707、5,707,559、5,578,253、6,036,892、6,228,653和6,461,876。
可选地,连接的基可以被结合到芳基Ar或结合到可裂解的基团Y。进一步可选地,与固相和三元或四元基的连接从所示出的方向被颠倒。
[0061]另一可裂解的连接体基团是可以转化成不稳定的1,2-二氧杂环丁烷部分的多电子的C-C双键。在该双键上的至少一个取代基利用O、S或N原子被结合到双键上。多电子双键与单态氧的反应产生不稳定的1,2-二氧杂环丁烷环基团,其在环境温度下自发断裂(fragment),以产生两个羰基片段。由多电子的双键形成的不稳定的1,2-二氧杂环丁烷描述于许多专利和出版物中,例子是A.P.Schaap和S.D.Gagnon,J.Am.Chem.Soc.,104,3504-6(1982);W. Adam,Chem.Ber.,116,839-46,(1983);美国专利5,780,646。
[0062]具有可裂解连接体基团的另一组固相材料具有乙烯酮二硫缩醛(ketene dithioacetal)作为可裂解部分,如在PCT公布WO 03/053934中所公开。乙烯酮二硫缩醛经受通过与过氧化物酶和过氧化氢的酶氧化导致的氧化性裂解。
可裂解部分具有所示的结构,包括在9,10-二氢化吖啶环上具有取代的类似物,其中Ra、Rb和Rc每一个都是有机基团,该有机基团含有1至约50个选白C、N、O、S、P、Si和卤素原子的非氢原子,并且其中Ra和Rb可以被接合在一起而形成环。无数的其他可裂解基团对技术人员而言将是明显的。
[0063]固相核酸捕获的方法可以投入无数用途中。如在下面的特定实施例中所显示,单链和双链核酸都可以被捕获并释放。DNA、RNA和PNA可以被捕获并释放。
[0064]优选的用途是从全血中分离DNA。用通常使用的技术从白细胞提取DNA。通常,处理血液,以选择性裂解红细胞,并且在沉淀或离心步骤之后,单独裂解完整的白细胞以暴露核酸内容物。消化蛋白质,并且得到的DNA用固相分离,随后用于序列多态性的测定、序列分析、RFLP分析、突变检测或其它类型的诊断试验。
[0065]另一用途是从DNA和RNA的混合物分离DNA。本发明的方法涉及强碱性洗脱条件,特别是使用高温的那些条件,可以在使DNA保留完整而同时降解或破坏存在的RNA。涉及强碱性裂解反应的方法类似地起作用。
[0066]另外的用途包括从其他样品——土壤、植物、细菌和废水中提取核酸材料,以及为了存档的目的对核酸材料进行长期保存。
[0067]本方法的重要优势是它们与许多下游的分子生物学过程相容。在很多情况下,本方法分离的核酸可以在进一步的过程中被直接使用。扩增反应例如PCR、美国专利5,998,175中描述的多寡聚体连接(Ligation of Multiple Oligomers,LMO)、以及LCR可以采用此类核酸洗脱液。通过常规技术、尤其是从细菌细胞培养物或从血样中分离的核酸,采用沉淀步骤。加入高体积百分比的低分子量醇,以从水溶液中沉淀核酸。然后,在使用前,沉淀的物质必须被分离、收集并重溶于合适的介质中。通过使用本方法,从本发明的固相结合材料洗脱核酸,这些步骤可以被免除。将含有释放的核酸的溶液直接用于核酸扩增反应中,从而用聚合酶或连接酶-介导的反应扩增核酸或其片段的数量,这是优选的实践。
实施例
[0068]当存在于下面的实施例中时,结构图旨在仅仅说明固相材料的可裂解连接体部分。所述图不代表固相材料的完整定义。
实施例1.用聚甲基丙烯酸酯连接体官能化的、并含有三丁基基和可裂解芳基硫酯键(arylthioester linkage)的磁性二氧化硅颗粒的合成。
[0069]将磁性的羧酸官能化的二氧化硅颗粒(Chemicell,SiMag-TCL,1.0meq/g,1.5g)置于20mL亚硫酰氯中并回流4小时。减压下除去过量的亚硫酰氯。将该树脂重悬于25mL CHCl3中并通过超声分散该悬浮液。蒸发溶剂并重复超声洗涤处理。真空下干燥该颗粒,待进一步使用。
[0070]酰基氯官能化的颗粒与388mg二异丙基乙胺一起被悬于38mLCH2Cl2中。加入4′-羟苯基4-氯甲基-硫代苯甲酸酯(524mg)并将密封的反应瓶置于摇床上过夜。将颗粒转移至50mL塑料管,并用若干份CH2Cl2、CH3OH、1∶1的CH2Cl2/CH3OH,然后用CH2Cl2反复洗涤,伴随以磁分离。通过TLC监测洗涤溶液中未反应的可溶性原材料的去除。在进一步使用前风干该固体。
[0071]在氩下,将该树脂(1.233g)悬于20mL CH2Cl2中。加入三丁基膦(395mg)并摇动该浆液7天。将颗粒转移至50mL塑料管,并用40mLCH2Cl2洗涤4次,随后用40mL MeOH洗涤4次以及用40mL CH2Cl2洗涤4次。然后,风干该树脂,得到1.17g浅棕色固体。
实施例2.用含有三丁基基的可裂解的连接体官能化的二氧化硅颗粒的合成。
[0072]将3-氨丙基三乙氧基硅烷(13.2mL)在75mL庚烷和13mL乙醇中的溶液置于Ar下,并用5.5g的琥珀酸酐搅拌。回流反应4.5h,然后冷却至室温过夜。除去溶剂,产生酰胺产物,为清澈的油。
[0073]将EDC氢氯化物(4.0g)和2.86g上述产物在100mL CH2Cl2中的溶液放置在Ar下,并搅拌1h,然后加入5.5g的4′-羟基-苯基4-氯甲基硫代苯甲酸酯(chloromethylthiobenzoate)中的4.16g。反应过夜搅拌。将反应混合物层析到150g的二氧化硅上,用1-2%EtOH/CH2Cl2洗脱,产生1.84g偶联的产物,为白色固体。
[0074]在Ar覆盖下,将在50mL干燥甲苯中的前面步骤的产物(1.84g)通过套管加入到含有3.83g烘箱干燥的二氧化硅的瓶中。反应回流过夜。在冷却至室温之后,过滤出二氧化硅,用500mL的CH2Cl2洗涤,真空干燥4h。
[0075]将在50mL的CH2Cl2中的具有氯苄基末端基团的衍生化的二氧化硅(2.0g)与8.0g的三丁基膦混合。反应混合物在Ar下搅拌2天。过滤出二氧化硅,用CH2Cl2和己烷洗涤,真空干燥几小时。
实施例3.用含有三丁基基的可裂解的连接体包被的磁性二氧化硅颗粒的合成。
[0076]通过被动地将可裂解的核酸结合基团吸附到二氧化硅颗粒表面,制备核酸结合材料。
[0077]将100.9g 4-氯甲基-苯甲酸和1.2L的SOCl2装载入3L瓶中。回流反应4小时,之后,在减压下除去亚硫酰氯。通过加入CH2Cl2和减压下蒸发,除去残留的SOCl2。
[0078]向含有113.1g的4-氯甲基苯甲酸氯化物的3L瓶中装载入98.17g4-羟基苯硫酚和1.5L CH2Cl2。吹扫入(purged in)氩,并加入67.75mL吡啶。在搅拌过夜后,用1L CH2Cl2稀释反应混合物并用5L水萃取。水层用CH2Cl2反萃取。合并的CH2Cl2溶液经硫酸钠干燥,并浓缩至固体。用500mL CH2Cl2洗涤该固体,过滤并风干。1H NMR(丙酮-d6):δ4.809(s,2H),6.946-6.968(d,2H),7.323-7.346(d,2H),7.643-7.664(d,2H),8.004-8.025(d,2H)。
[0079]将硬脂酸(1.33g)在10mL的SOCl2中回流2h。减压下,去除过量的SOCl2,产生硬脂酰氯,为棕色液体。
[0080]将硬脂酰氯溶解在10mL的CH2Cl2中,并加入到于30mLCH2Cl2中的1.0g4′-羟苯基4-氯-甲基硫代苯甲酸酯和1.56mL二异丙基乙胺的溶液中,并将混合物搅拌过夜。去除溶剂,将残留物进行柱层析,使用1∶1己烷/CH2Cl2作为洗脱液。分离硬脂酰酯(1.43g),为白色固体。
[0081]在Ar气氛下,将上面的产物(1.43g)和三丁基膦(1.27mL)在30mL的CH2Cl2中的溶液搅拌2天。除去CH2Cl2之后,残留物用6×50mL的醚洗涤,重新溶解在CH2Cl2中,并用醚沉淀,产生1.69g的盐产物。发现该材料在水中是不溶的。
[0082]将盐(0.6g)溶解在6mL的CH2Cl2中,并伴随着搅拌加入到6.0g的硅胶中。蒸发溶剂,产生核酸结合材料。
实施例4.具有含聚乙烯基苄基三丁基基团的聚合物层的磁性颗粒的合成。
[0083]在玻璃瓶中,将磁性Merrifield肽树脂(Chemicell,SiMagChloromethyl,100ng)加至2mL CH2Cl2中。加入三丁基膦(80μL),并在室温下摇动浆液3天。在该瓶下放置磁体,并用移液管除去上清液。用2mL CH2Cl2洗涤固体4次(洗涤液也通过磁体/移液管步骤除去)。风干该树脂(93mg)。
实施例5.含三丁基基团和可裂解芳基硫酯键的聚甲基丙烯酸酯聚合物颗粒的合成。
[0084]将聚(甲基丙烯酰氯)颗粒(1.0meq/g,1.5g)置于含2.45g二异丙基乙胺的75mL CH2Cl2中。加入三乙胺(1.2g)。加入4′-羟苯基4-氯甲基硫代苯甲酸酯(4.5g),并将密封的反应混合物在室温下搅拌过夜。过滤该浆液,并用10mL CH2Cl2、200mL丙酮、200mL MeOH、2×100mL 1∶1的THF/CH2Cl2、250mLTHF、250mL CH2Cl2、250mL己烷洗涤树脂。风干该树脂,待进一步使用。
[0085]在氩下,将该树脂(1.525g)悬于25mL CH2Cl2中。加入三丁基膦(1.7g)并搅拌该浆液4天。过滤该树脂,并用225 mL CH2Cl2,随后用175mL己烷洗涤4次。然后,风干该树脂,得到1.68g固体。
实施例6.含三丁基基的聚苯乙烯聚合物的合成。
[0086]在氩填塞(argon pad)下,在200mL CH2Cl2/DMF(50/50)中,搅拌Merrifield肽树脂(Merrifield peptide resin)(Sigma,1.1meq/g,20.0g),其为交联的氯甲基化聚苯乙烯。加入过量的三丁基膦(48.1g,10当量),并在室温下搅拌浆液7天。过滤该浆液,并用200mL CH2Cl2洗涤所得到的固体2次。在真空下干燥树脂(21.5g)。元素分析:观察到的(Found)P 2.52%,Cl 3.08%;期望的(Expected)P 2.79%,Cl 3.19%:P/Cl比率为0.94。
实施例7.含三丁基铵基团的聚苯乙烯聚合物的合成。
[0087]在氩填塞下,在150mL CH2Cl2中,搅拌Merrifield肽树脂(Aldrich,1.43meq/g,25.1g)。加入过量的三丁基胺(25.6g,4当量),并在室温下搅拌浆液8天。过滤该浆液,并用250mL CH2Cl2洗涤所得到的固体2次。在真空下干燥树脂(28.9g)。元素分析:观察到的N 1.18%,Cl3.40%;期望的N 1.58%,Cl 4.01%:N/Cl比率为0.88。
实施例8.用三丁基基团官能化的二氧化硅颗粒的合成。
[0088]将在Ar下于110℃干燥1小时的硅胶(4.82g)与2.79g的Et3N一起加入到50 mL的CH2Cl2中。将混合物搅拌20分钟,这之后,加入2.56g的3-溴丙基三氯硅烷,引起放热。将混合物搅拌24h,过滤,并用3×40mL的CH2Cl2、4×40mL的MeOH和2×40mL的CH2Cl2依次洗涤固体。过夜空气干燥固体,称重,为6.13g。
[0089]将于50mL的CH2Cl2中的上面制备的官能化的二氧化硅(5.8g)与5.33mL的三丁基膦一起搅拌10天。过滤混合物,并用7×50mL的丙酮洗涤固体。空气干燥固体,产生5.88g的产物。
实施例9.在实施例3的NAB材料中的连接体的可控裂解。
[0090]将实施例3的包被的二氧化硅材料(70mg)悬浮在1.0mL的D2O中,并通过旋转混合3分钟。通过1H NMR对水溶液的分析显示,没有材料释放到溶液中。
[0091]用40μL的40%NaOD处理二氧化硅悬浮液,旋转3分钟,并对上清液进行NMR分析,显示连接体裂解并从二氧化硅释放到溶液。
实施例10.从人全血捕获DNA。
[0092]在管中,将实施例1-8中每一个实施例的10mg份的颗粒与70μL的人全血混合。对管旋转混合15秒,在室温中放置5分钟,并再次旋转混合15秒。用300μL pH8.0的10mM tris缓冲液稀释混合物,当利用磁响应性颗粒时,在磁体的帮助下,从颗粒去除液体。
实施例11.从人全血分离DNA。
[0093]根据前面实施例的程序而捕获在固相结合材料上的核酸用500μL pH8.0的10mM tris缓冲液洗涤三次,每次丢弃上清液。通过在37℃,用100μL的0.1M NaOH洗脱5分钟,从颗粒移去核酸。NaOH的其他浓度也有效,如图5A和5B所示。
实施例12.基因组DNA的PCR扩增
[0094]在0.1M NaOH中的前面实施例的洗脱的DNA(1μL)用一对24个碱基的引物进行PCR扩增,产生200bp的扩增子。PCR反应混合物含有下表列出的组分。
组分 体积(μL)
10×PCR缓冲液 2
引物1(100ng/μL) 2
引物2(100ng/μL) 2
2.5mM dNTPs 2
50mM MgCl2 1.25
Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.25
模板 1
去离子水 9.5
总计 20
阴性对照用1μL水替换反应混合物中的模板。一个另外的反应使用1μL以1∶10稀释于水中的模板。反应混合物经受30个循环:94℃,30秒;60℃,30秒;72℃,30秒。反应产物在1.5%琼脂糖凝胶上跑胶。图3说明了从珠洗脱的DNA是完整的。
Claims (13)
1.从细胞材料的样品分离核酸的方法,包括:
a)提供固相,该固相包括:连接有核酸结合部分的基质;
b)在不存在任何添加的裂解液下,将所述固相与含有核酸的细胞材料的样品混合一段时间,所述时间足以将所述核酸结合至所述固相;
c)从所述固相分离所述样品;和
d)从所述固相释放该结合的核酸。
2.权利要求1所述的方法,其中所述细胞材料选自动物、植物或细菌来源的完整细胞和含有动物、植物或细菌来源的完整细胞的组织。
3.权利要求1所述的方法,其中所述样品选自细菌培养物、体液、全血和血液组分、组织提取物、植物材料以及含有细胞材料的环境样品。
4.权利要求1所述的方法,其中所述样品是全血。
5.权利要求1所述的方法,其中所述核酸选自DNA和RNA。
6.权利要求5所述的方法,其中所述核酸是生物体的基因组DNA。
7.权利要求5所述的方法,其中所述核酸是获自全血的人基因组DNA。
8.权利要求1所述的方法,其中所述基质选自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶的多糖。
9.权利要求1所述的方法,其中所述固相的所述基质是二氧化硅。
10.权利要求1所述的方法,其中所述固相还包括磁响应部分。
11.权利要求1所述的方法,其中所述核酸结合部分选自三元锍基、季铵基和季基。
12.权利要求1所述的方法,其中所述核酸结合部分通过可以被选择性地裂解的键连接到所述基质。
13.权利要求1所述的方法,其中所述结合的核酸在强碱性溶液中从所述固相释放。
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