CN107249752B - 用于磁性核酸提取的分层硅石薄片 - Google Patents

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Abstract

本文公开了一种使用基于二氧化硅沉积和由热收缩引起的自褶皱的薄聚合物芯来制备磁性硅石纳米膜的新方法。这些微观尺寸和纳米尺寸的结构大大增加了硅石的比表面积，因此磁性硅石纳米膜可用于核酸的固相提取。磁性硅石纳米膜适用于核酸纯化和分离，并且在核酸回收产率和完整性方面的表现优于商业颗粒。此外，由于硅石的比表面积显著增加，因此磁性硅石纳米膜可具有高的核酸容量。本文还提供了该磁性硅石纳米膜的使用方法以及包括该磁性硅石纳米膜的装置。

Description

用于磁性核酸提取的分层硅石薄片
背景技术
从样品中分离核酸可能是遗传分析的重要步骤，所述样品例如为细胞、组织、植物、细菌、病毒颗粒、血液、血清或血浆。通常，广泛使用诸如苯酚/氯仿沉淀之类的液相提取技术。尽管这些方法可以产生高质量的核酸，但是这样方法费力、耗时并且高度依赖于操作者。固相提取技术是常见的替代方法。当处理大量样品时，固相提取技术通常是所选择的方法。通常使用的固相基材包括(例如)可提供用于核酸结合的大表面积的硅石旋转柱和硅石磁性颗粒。然而，这些多孔基材和微/纳米颗粒可能由于流动和颗粒混合而导致核酸剪切，致使核酸的完整性降低。
自从最初引入旋转柱和磁性微粒开始，核酸提取(例如DNA提取)的主要方法基本保持不变。尽管诸如旋转柱和磁性微粒之类的方法快速且容易，但是通过这些方法施加的剪切力可能会使核酸断裂，并且对于新一代的长读长测序和基因组测绘技术而言，可能不具有足够的核酸质量。因此，仍需要开发新型分离材料和能够更容易地从生物样品中分离和纯化核酸的方法。
先前已经公开了这样的热塑性基材，其包含微观尺度折叠的分层结构，该分层结构层叠有纳米尺度的硅石薄层，该热塑性基材是通过使用廉价的热收缩性聚烯烃(PO)膜容易地制造的。该纳米膜可以被微调以产生能够捕获大量核酸而不施加使核酸断裂的剪切力的无孔大表面积结合基材。通过使断裂最小化，可以将核酸结合偏离倾斜构象(proneconformation)而朝向触角构象(tentacle conformation)，从而将结合能力提高到例如比以前报道的硅石微粒高约100至约1,000,000倍。此外，硅石纳米膜使用简单的结合、洗涤和洗脱方案，其将柱和磁珠提取的容易性与苯酚-氯仿的性能相结合，使得核酸产量可以比任何柱或磁珠的产量高大约10倍，且获得高纯度和高分子量的核酸。
为了便于从细胞、组织和体液中提取大量高质量的高分子量核酸，本文公开了一种磁性硅石纳米膜材料，其通过在除了至少一层硅石层之外还将磁性部分沉积到或嵌入到热塑性基材中而制备。磁性硅石纳米膜可通过类似于磁选法的方式进行萃取，由此可以使用磁体将纳米膜拉伸到试管等容器的侧面或底部，从而便于移液和洗涤，而不会干扰纳米膜或被结合的核酸。
本文公开了廉价的磁性热塑性纳米膜材料，其使用微米级和纳米级硅石薄片的分层和磁化层，从而得到了能够捕获大量未断裂的高分子量核酸的高表面积和低剪切基材。
发明内容
本文公开了一种磁性硅石纳米膜，其包括：具有第一表面和第二表面的聚合物芯；设置在所述聚合物芯上的至少一层二氧化硅层，所述二氧化硅层包括选自多个(a)微观尺寸硅石结构和(b)纳米尺寸硅石结构中的至少一种表面形态；以及至少一个磁性部分。
在某些实施方案中，所述至少一个磁性部分包含至少一种选自抗磁性材料、顺磁性材料、亚铁磁性材料和铁磁性材料中的磁性材料，并且在某些实施方案中，所述至少一个磁性部分包含至少一种选自铁、镍、钴、磁铁矿、赤铁矿、磁赤铁矿、以及磁性材料的合金(如钢、阿尔帕姆合金、坡莫合金、费尔尼柯低膨胀系数合金、森达斯特铝硅铁合金、镀铜铁镍合金和阿尔尼科合金)中的磁性材料。
在某些实施方案中，所述至少一个磁性部分选自设置在聚合物芯上的至少一层磁性材料、嵌入聚合物芯内的至少一种磁性材料、以及至少一个磁性聚合物芯。在某些示例性实施方案中，所述至少一个磁性部分是厚度为约5nm至约10μm的磁性层。
在某些实施方案中，所述至少一个磁性部分包括设置在所述至少一层二氧化硅层上的磁性材料层。在本文公开的某些实施方案中，所述至少一层二氧化硅层设置在所述聚合物芯的第一表面上，并且所述至少一个磁性部分是设置在第二表面上的磁性层。在某些实施方案中，第一层二氧化硅层设置在聚合物芯的第一表面上，所述至少一个磁性部分是设置在第二表面上的磁性层，并且第二层二氧化硅层设置在所述至少一个磁性部分上。在各种其他示例性实施方案中，第一层二氧化硅层设置在聚合物芯的第一表面上，所述至少一个磁性部分是设置在第二表面上的磁性层，第二层二氧化硅层设置在所述至少一个磁性部分上，并且第三层二氧化硅层设置在聚合物芯的第一表面和所述至少一个磁性部分之间。在其他实施方案中，第一层二氧化硅层设置在聚合物芯的第一表面上，所述至少一个磁性部分设置在聚合物芯的第二表面上，第二层二氧化硅层设置在所述至少一个磁性部分上，第三层二氧化硅层设置在聚合物芯的第二表面和所述至少一个磁性部分之间，第二磁性部分设置在位于聚合物芯的第一表面上的第一层二氧化硅层上，并且第四二氧化硅层设置在第二磁性部分上。在各种实施方案中，第二磁性部分设置在聚合物芯的第一表面和所述至少一层二氧化硅层之间。在某些实施方案中，本文公开的磁性纳米膜还包括设置在所述至少一个磁性部分上的钝化层，并且在某些实施方案中，所述至少一个二氧化硅层的厚度在约2nm至约500nm厚的范围内。
在本文公开的某些实施方案中，所述至少一层二氧化硅层是通过使用选自电子束蒸镀、溅射、化学气相沉积、等离子体增强化学气相沉积、电镀、原子层沉积、化学溶液沉积和旋涂中的沉积方法而沉积的。在本文公开的各种其他实施方案中，本文公开的磁性硅石纳米膜进一步包括选自氨基丙基、氯丙基、十八烷基、辛基、季铵基、二乙基氨基乙基、磺酸基、苯基、壳聚糖、生物素、链霉亲和素、抗体、蛋白质、脂质、聚乙二醇和酶中的至少一种的表面官能化。在某些示例性实施方案中，本文公开的磁性硅石纳米膜的聚合物芯包含至少一种选自聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、环状聚烯烃聚合物、聚丙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、氟化乙烯丙烯、聚四氟乙烯和聚偏二氟乙烯中的热塑性材料。
本文还公开了从样品中提取核酸的方法，所述方法包括：获得包含核酸的样品；使所述样品与至少一个磁性纳米膜接触，所述至少一个磁性纳米膜包括至少一层二氧化硅层和至少一个磁性部分；使样品中的核酸吸附在所述至少一个磁性纳米膜上；使用磁体操纵所述至少一个磁性纳米膜；并使所述核酸从所述至少一个磁性硅石纳米膜上解吸，以从所述样品中获得提取的核酸。
在本文公开的用于从样品中提取核酸的方法的某些实施方案中，所述核酸选自DNA、RNA、以及DNA和RNA的混合物。在某些实施方案中，核酸分散在包含裂解缓冲液的上清液中，或者在某些实施方案中，核酸分散在反应溶液中。
在本文公开的方法的某些实施方案中，操纵所述至少一个磁性纳米膜包括利用磁体将磁性纳米膜保持在期望的位置，同时移除溶液以使其不与磁性纳米膜接触，并释放磁性，并且在某些实施方案中，操纵所述至少一个磁性纳米膜包括用磁体转移磁性纳米膜，并在转移后磁性释放所述至少一个磁性纳米膜。
在本文公开的方法的某些实施方案中，洗涤所述至少一个磁性纳米膜包括：a)使所述至少一个磁性纳米膜与洗涤溶液接触；以及b)操纵所述至少一个磁性纳米膜以将所述洗液与所述磁性纳米膜分离。在各种实施方案中，本文公开的方法还可以包括将步骤a)和b)的过程重复一次或多次。
在本文公开的方法的某些实施方案中，解吸核酸包括使样品与洗脱液接触并将所述至少一个磁性纳米膜释放到洗脱液中，并且在某些实施方案中，所提取的核酸的平均长度为至少约100千碱基。本文还公开了这样的实施方案，其中从样品中提取核酸的方法由自动化仪器以自动方式进行。
从下文提供的详细描述中，本文公开的实施方案的其他适用范围将变得显而易见。应当理解，详细描述和具体实施方案仅是为了说明的目的，而不是为了限制本公开的范围。
附图说明
由详细描述和附图将更全面地理解本公开，其中：
图1示出了包括聚合物芯、二氧化硅层和铁层的磁性硅石纳米膜的制造方法的图示。
图2示出了包括聚合物芯、多层二氧化硅层、以及铁层的磁性硅石纳米膜的制造方法。
图3示出了使用磁性硅石纳米膜进行DNA提取的示例性方法的流程图。
图4是通过使用磁体而被吸引至微量离心管侧的磁性纳米膜片的照片。
图5是比较使用磁性硅石纳米膜与苯酚-氯仿、Qiagen Minispin柱、和Qiagen磁性颗粒技术进行萃取的DNA收率的柱状图。
图6是示出了UV吸光度与通过使用苯酚-氯仿、磁性硅石纳米膜、磁珠微粒和旋转柱从MCF-7细胞中提取的DNA波长间的关系的曲线图。
图7示出了使用苯酚氯仿、磁性硅石纳米膜、磁珠微粒和旋转柱从MCF-7细胞中提取的基因组DNA的大小的脉冲场凝胶图像。
图8示出了使用磁性纳米膜和非磁性纳米膜从人全血中提取的总核酸收率的柱状图。
图9示出了由Thermo Scientific KingFisherTMDuo Prime自动DNA提取系统的机器人臂上的磁棒捕获的磁性纳米膜的照片。
图10示出了在自动DNA提取系统上运行的八个样品的DNA回收的柱状图。
图11是使用磁性纳米膜和磁棒驱动的仪器的自动DNA提取的示意图。
图12是使用磁棒驱动的仪器在自动DNA提取中的溶液之间的磁性纳米膜的示例性转移的示意图。
图13是扫描电子显微镜(SEM)图像，其示出了磁性硅石纳米膜的表面形貌。插图示出了较高放大倍数下的区域。
图14A、14B和14C示出了包括聚合物芯、至少一层二氧化硅和至少一个磁性部分的磁性硅石纳米膜的各种示例性实施方案。
发明详述
各种实施方案的以下描述本质上仅仅是示例性的，并且绝不旨在限制本公开、其应用或其用途。
如本文所使用的，范围用作描述在该范围内的各个值和每个值的简写。可以选择范围内的任何值作为该范围的终点。此外，本文引用的所有参考文献通过引用的方式整体并入本文。在本公开的定义和引用的参考文献中的定义中发生冲突的情况下，以本公开为准。
如本文所使用的，涉及项目的列举如A和B的术语“…中的一个或多个”指的是单独的A、单独的B、或A和B。术语“…中的至少一个”用于表示可以选择所列举项目中的一个或多个。
除非另有说明，否则本说明书和本说明书其他部分所表述的所有百分比和量应理解为指重量百分比。给出的量基于材料的有效重量。
本文公开的是基于新颖且相对廉价的分层磁性硅石纳米膜的核酸提取方法。本文公开的磁性硅石纳米膜是包含微观尺寸和/或纳米尺寸硅石结构和至少一个磁性部分的分层形貌的聚合物基材。如本文所用，微观尺寸结构应被理解为特征尺寸小于或等于约1000μm，例如小于或等于约500μm、小于或等于约200μm或小于或等于约100μm。如本文所用，纳米尺寸结构应被理解为特征尺寸小于或等于约1000nm，例如小于或等于约500nm、小于或等于约200nm或小于或等于约100nm。与硅石磁珠和柱(其会施加使DNA/RNA片段断裂的剪切力)不同，本文公开的无孔硅石纳米膜基材可以结合并释放DNA/RNA而不使其断裂，实现更高的DNA/RNA尺寸(高达Mb范围)，这可能超过被认为是本领域金标准的苯酚-氯仿萃取。此外，本文公开的通过使用磁性硅石纳米膜的核酸提取方法在许多方面比磁珠和柱更简单。此外，本文公开的方法的提取率可以比使用磁珠和/或柱的已知方法高至少约五倍至约三十倍。
本文公开的磁性硅石纳米膜可用于从培养的细胞、组织、细菌、病毒、植物细胞、全血、血清、血块黄层、血浆、尿液、唾液、粪便、胸腔积液、脑脊髓液、导管灌洗液、福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样品或其他含核酸材料中提取核酸。本领域技术人员应理解，可能需要对提取缓冲体系进行修改对于适应不同的样品类型。
如本文所用，术语“硅石纳米膜”是指硅石在聚合物芯上的三维构象，其可以包括尺寸在数十纳米至微米范围内的结构，例如微褶皱、纳米褶皱和硅石薄片。术语薄片、褶皱、折叠、小薄片、芯片等是用于描述纳米膜表面上的硅石结构的外观的描述性术语。如本领域普通技术人员将理解的，硅石在微观尺寸和/或纳米尺寸水平所呈现的形貌可以根据各种因素而变化，这些因素包括(例如)所沉积的二氧化硅的量和由收缩期间的聚合物芯所采用的独特的构造，并且本文公开的实施方案不受沉积在聚合物芯上的至少一个二氧化硅层所呈现的形貌的限制。
本文所用的术语“硅石”是指氧化硅、二氧化硅和二氧化硅衍生物，例如SiO2晶体和其他形式的SiO2，例如由SiO2组成的硅藻、沸石、无定形二氧化硅、玻璃粉末、硅酸、水玻璃、硼硅酸盐以及硅酸铝和活化硅酸盐。
如本文所用的术语“样品”或“生物样品”是指包含细胞或细胞材料的任何样品，例如细胞、冷冻细胞团、固定细胞、排泄物/粪便、血块黄层(即白细胞血液部分)、腹水、拭子(例如脸颊或咽喉拭子、子宫颈拭子)、痰液、器官穿刺物、精液、组织样品、固定组织样品、固定或非固定组织样品的组织切片(如冷冻切片和石蜡切片，例如福尔马林固定的石蜡切片)、肿瘤材料、活检样品、血液样品(例如全血或血液部分)、细胞悬浮液，并且在最广泛的意义上，包括细胞成分的所有样品，其中包括完整细胞和细胞组分。此外，该术语还包括其他含核酸的生物材料，例如血清或血浆(如含病毒血清或血浆、HIV感染和HCV感染的血清样品)、分泌物、CSF、胆汁、淋巴液和尿液。类似地，其可以是来自生物化学或生物技术过程并且随后将被纯化的含有核酸的材料。
如本文所用，术语“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，通常是指DNA或RNA聚合物，所述DNA或RNA聚合物可以是单链或双链的，合成的或者天然来源获得的(例如，分离和/或纯化的)，其包含天然的、非天然的或改变的核苷酸，其可以包含天然的、非天然的或改变的核苷酸间键合，例如氨基磷酸酯键或硫代磷酸酯键，而不是未修饰寡核苷酸的核苷酸之间发现的磷酸二酯。在某些实施方案中，核酸不包括任何插入、缺失、反转和/或取代。然而，如本文所讨论的，在一些情况下，核酸包含一个或多个插入、缺失、反转和/或取代可能是合适的。
在某些实施方案中，本文公开的核酸是重组的。如本文所用，术语“重组”是指(i)通过将天然或合成核酸区段连接到可在活细胞中复制的核酸分子而构建在活细胞外部的分子，或(ii)由上述(i)中描述的那些的复制而得到的分子。出于本文的目的，复制可以是体外复制或体内复制。
如本文所用，术语“聚合物”是指能够热收缩的任何聚合物基材。在一些实施方案中，聚合物是热塑性聚合物。如本文所用，术语“热塑性”是指在高于特定温度时变得柔软或可模塑、并且在冷却时返回固态的聚合物。热塑性塑料可包括(例如)诸如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯、聚苯乙烯(PS)和环状聚烯烃(PO)聚合物之类的聚合物。
本文使用的二氧化硅纳米膜可以使用常用的聚合物基材制造，包括例如预拉伸热塑性塑料，例如PMMA、聚碳酸酯、PS和环状PO聚合物。可以用作硅石纳米膜的聚合物芯的其他示例性聚合物基材包括(例如)聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、氟化乙烯丙烯、聚四氟乙烯和聚偏二氟乙烯。在某些实施方案中，可以将硅石沉积在可收缩的PO膜上。在高温下培养后，聚合物膜收缩，并且由于上述机理，硅石形成纳米结构。
在某些实施方案中，磁性硅石纳米膜的聚合物芯的收缩厚度范围为约5μm至约5mm。在某些实施方案中，磁性硅石纳米膜的聚合物芯的预收缩厚度范围为约5μm至约500mm。
在本文公开的某些实施方案中，磁性硅石纳米膜可以通过用至少一层二氧化硅覆盖聚合物芯(例如聚烯烃聚合物膜)来制造。在某些实施方案中，至少一层二氧化硅的厚度范围可以为约2nm至约500nm，例如约50nm至约200nm、约75nm至约150nm或约100nm。在一个实施方案中，使用电子束蒸镀，用100nm厚的二氧化硅层覆盖20μm厚的聚烯烃膜的一侧。二氧化硅可以直接沉积在聚合物芯上，或者在某些实施方案中，当首先用至少一个磁性部分、至少一层惰性层和/或至少一层另外的二氧化硅层覆盖聚合物芯后，再在其上沉积二氧化硅。
在聚合物芯已经覆盖有至少一层硅石之后，聚合物芯的另一侧可以被至少一个磁性部分覆盖，或者在某些实施方案中，聚合物芯的另一侧可以被第二层硅石覆盖。在某些实施方案中，然后已经覆盖有硅石的聚合物芯的另一侧可被至少一个磁性部分覆盖，并且在某些实施方案中，已经覆盖有硅石的聚合物芯的另一侧首先被第二硅石层覆盖，其中该第二硅石层随后被至少一个磁性部分覆盖。
在本文公开的某些实施方案中，然后可以用磁性部分覆盖聚合物芯的另一侧(例如聚烯烃膜)。在某些实施方案中，磁性部分可以是厚度为约15nm至约200nm，例如约30nm至约100nm、约100nm或约30nm厚的磁性层。在某些实施方案中，磁性部分可以嵌入在聚合物芯内。在某些实施方案中，聚合物芯可以由具有固有磁性的材料构成。
在某些实施方案中，聚合物芯(例如厚度为约10μm至约100μm的聚烯烃膜)的一侧可被二氧化硅层覆盖。然后聚合物芯的另一侧可被磁性层(如20nm至100nm厚的磁性层)覆盖。然后可以使被覆盖的聚合物芯基材热收缩，例如在烘箱中。这产生了可以用于磁性核酸提取的纳米膜，该纳米膜的一侧具有微观尺寸和纳米尺寸的硅石结构，另一侧具有磁性层。在某些实施方案中，磁性层也可以具有由所述制造过程中产生的纳米尺寸和微观尺寸的结构。图1示出了根据本文公开的实施方案的示例性制造工艺的流程图。如图1所示，至少一层二氧化硅层101可沉积在聚合物芯100(例如聚烯烃膜)的第一表面上。接下来，在纳米膜热收缩之前，可以在聚合物芯100的第二表面上沉积至少一个磁性部分102(例如铁)。
在某些实施方案中，一侧覆盖有二氧化硅的纳米膜的另一侧可交替覆盖有铁和二氧化硅，然后可以使被覆盖的聚烯烃基材热收缩。这产生了在两侧均具有微观尺寸和纳米尺寸的硅石结构的纳米膜。背侧硅石结构包括被硅石覆盖的铁磁铁层，使得可以进行磁性操控，并且核酸可以结合到纳米膜的两侧。覆盖铁的硅石用作核酸的结合表面，并保护铁不与缓冲组分发生反应。图2示出了根据本文公开的实施方案的各种示例性制造工艺的流程图。如图2所示，至少一层二氧化硅层201可沉积在聚合物芯200(例如聚烯烃膜)的第一表面上。接下来，至少一个磁性部分202(例如铁)可沉积在聚合物芯200的第二表面上。在某些实施方案中，在纳米膜热收缩之前，第二层二氧化硅层201可沉积在所述至少一个磁性部分202上。
或者，如图2所示，至少一层二氧化硅层201可以沉积在聚合物芯200的第一表面上，并且第二层二氧化硅层201可沉积在聚合物芯200的第二表面上。接下来，可以在第二层二氧化硅层201上沉积至少一个磁性部分202(例如铁)。最后，在纳米膜热收缩之前，可以在所述至少一个磁性部分202上沉积第三层二氧化硅层201。
在本公开的某些实施方案中，可以在聚合物芯的第一表面上沉积第一层二氧化硅层，并且可在聚合物芯的第二表面上沉积至少一个磁性部分，其中可以在所述至少一个磁性部分上沉积第二层二氧化硅层。此外，在某些实施方案中，可以在第一层二氧化硅层与聚合物芯的第一表面之间沉积第二磁性部分。
如图14A所示，在某些实施方案中，至少一层二氧化硅层1401可沉积在聚合物芯1400的第一表面上，并且至少一个磁性部分1402可沉积在所述至少一层二氧化硅层1401。在某些实施方案中，第二层二氧化硅层1401可以沉积在所述至少一个磁性部分1402上。任选地，在聚合物芯1400的第二表面上没有沉积任何层，使得(例如)纳米膜包括聚合物芯1400、第一层二氧化硅层1401、磁性部分1402和第二层二氧化硅层1401。
或者，在某些实施方案中并如图14A所示，至少一层二氧化硅层1401可以沉积在聚合物芯1400的第一表面上，并且至少一层第二层二氧化硅层1401可以沉积在聚合物芯1400的第二表面。接下来，至少一个磁性部分1402可以沉积在所述至少一层二氧化硅层1401上，并且第二磁性部分1402可以沉积在第二层二氧化硅层1401上。最后，在如图14A所示的各种可任选的实施方案中，第三层二氧化硅层1401可以沉积在所述至少一个磁性部分1402上，并且任选地，第四层二氧化硅层1401可以沉积在所述第二磁性部分1402上。
如图14B所示，在某些实施方案中，至少一个磁性部分1402可以沉积在聚合物芯1400的第一表面上，并且至少一层二氧化硅层1401可沉积在所述至少一个磁性部分上。在各种任选的实施方案中，在聚合物芯1400的第二表面上没有沉积层，使得(例如)纳米膜包括聚合物芯1400、磁性部分1402和二氧化硅层1401。
在图14B所示的某些其他实施方案中，至少一个第一磁性部分1402可以沉积在聚合物芯1400的第一表面上，并且至少一层二氧化硅层1401可沉积在聚合物芯1400的第二表面上。接下来，第二磁性部分1402可以沉积在所述至少一层二氧化硅层1401上。可选地，在某些实施方案中，第二层二氧化硅层1401可以沉积在第二磁性部分1402上。在图14B中示出的某些其他实施方案中，第三层二氧化硅层1401可沉积在所述至少一个第一磁性部分1402上。
如图14C所示，在某些实施方案中，至少一个第一磁性部分1402可以沉积在聚合物芯1400的第一表面上，并且至少一个第二磁性部分1402可以沉积在聚合物芯1400的第二表面上。磁性部分可以相同或不同。在某些实施方案中，至少一层二氧化硅层1401可沉积在所述至少一个第一磁性部分1402上。在某些示例性实施方案中，任选地，第二层二氧化硅层1401可沉积在第二磁性部分1402上。
在各种其他实施方案中，可以用二氧化硅覆盖聚烯烃膜的一侧，然后使该聚烯烃膜热收缩。接下来，在热收缩之后，可以在纳米膜的另一侧上沉积磁性层。在本文公开的可替代实施方案中，在聚烯烃膜热收缩之后，可以用二氧化硅覆盖至少一个磁性部分以用作钝化层。
在本文公开的某些实施方案中，磁性部分可以是抗磁性的、顺磁性的、铁磁性的或亚铁磁性的。在各种实施方案中，磁性部分是顺磁性的，使得纳米膜不会彼此粘附。在各种实施方案中，磁性部分可以由铁、镍、钴、磁铁矿、赤铁矿、磁赤铁矿、磁性合金(如钢、坡莫合金和阿尔尼科合金)或任何此类材料制成。
在某些示例性实施方案中，磁性材料可以具有高磁化率，使得可以沉积较薄的磁性材料层，同时获得足够的磁力以在溶液中拉动纳米膜。对于给定的施加磁场，较厚的层可能导致较大的磁拉力。为了有效的磁力操纵，需要足够的磁力来克服粘力、表面张力、浮力等。在一个实施方案中，磁性层的厚度可以从约2nm到约10μm不等。
在某些实施方案中，磁性材料可以是化学惰性和生物惰性的，使得其不会被缓冲组分或生物材料所降解、水解或发生不利地反应。磁性材料也不会受到高应力，并且不会破坏核酸提取所需的二氧化硅薄片结构的形成。
沉积后，将被覆盖的聚合物芯在烘箱中热收缩。这产生了这样的纳米膜，该纳米膜的一侧具有微观尺寸和纳米尺寸的二氧化硅结构，例如薄片，另一侧具有磁性层，然后可以将其用于磁性核酸提取。
当聚合物薄膜收缩时，薄膜应力的差异产生了微观尺寸折叠的分层结构，其上层叠有纳米尺寸的二氧化硅薄片，其可以通过二氧化硅沉积厚度进行精细调节。
在本文公开的各种实施方案中，聚合物芯的一侧可被第一层二氧化硅层覆盖。然后聚烯烃膜的另一侧可以交替地覆盖有第二层二氧化硅层，随后是位于第二层二氧化硅层上的磁性材料层，以及位于磁性材料层之上的第三层二氧化硅层。然后可以将被覆盖的聚合物基材热收缩，例如在烘箱中。在某些实施方案中，被覆盖的聚合物基材可以热收缩。这产生了在两侧具有微观尺寸和纳米尺寸的二氧化硅薄片的纳米膜。背侧二氧化硅薄片包括夹在硅石之间的磁性中心，使得可以进行磁性操作，并且核酸可以结合或吸附到纳米膜的两侧。包封磁性材料两侧的二氧化硅充当核酸的结合表面，并保护磁性材料不与缓冲组分发生反应。在某些实施方案中，磁性材料可以是铁。在其他实施方案中，磁性材料可以是合金，例如钢、阿尔尼科合金、坡莫合金、阿尔帕姆合金、费尔尼柯低膨胀系数合金、森达斯特铝硅铁合金、镀铜铁镍合金等。
在另一个实施方案中，聚合物芯的一侧可被第一层二氧化硅层覆盖。然后，聚合物膜的另一侧可以交替地被磁性材料层和第二层硅石层覆盖。然后可以将被覆盖的聚合物基材热收缩。
在另一个实施方案中，聚合物芯的一侧可以覆盖有二氧化硅层，然后热收缩。接下来，在热收缩之后，可以在纳米膜的另一侧上沉积磁性层。
在本文公开的实施方案中，层的沉积可以通过本领域已知的任意方式进行。在某些实施方案中，可以通过热蒸发、电子束蒸镀、溅射、化学气相沉积、等离子体增强的化学气相沉积、电镀、原子层沉积、化学溶液沉积、旋涂或任意其他沉积方法来沉积这些层。在一个实施方案中，可以通过电子束蒸镀沉积这些层。
在其他实施方案中，可以通过沉积其他的层或覆层使磁性层钝化，从而使其变得更加化学惰性或生物学惰性。
在本文公开的某些实施方案中，可以用本领域已知的其他化合物或组分对包含硅石的硅石纳米膜进行衍生化或官能化，以提供所需的化学、物理或电学性质或执行特定功能，例如促进或防止吸附或结合、以及促进生化反应。在一些实施方案中，可用氨基丙基、氯丙基、十八烷基、辛基、季铵基、二乙基氨基乙基、磺酸基、苯基、生物素、链霉亲和素、抗体、蛋白质、脂质、壳聚糖或酶将二氧化硅衍生化。
在各种实施方案中，磁性部分可以被硅石层覆盖以使核酸结合于纳米膜的两侧。
在一些实施方案中，将纳米膜在约100°F至500°F、例如约200°F至约400°F、或约250°F至约300°F的温度范围内加热。在一些实施方案中，将纳米膜加热约10秒至约10分钟，例如约1分钟至约5分钟，或约2分钟至约3分钟。在一些实施方案中，可以向纳米膜施加应力以控制收缩率和方向。
在一个实施方案中，可以在热收缩后通过切割或冲压从而将纳米膜成形为特定尺寸。在某些实施方案中，例如，可以热收缩之后使用冲头形成纳米膜的盘，例如盘的范围为约1μm至数米，例如约1mm至约6mm。在另一个实施方案中，可以在热收缩之前通过切割或冲压将纳米膜成形为特定尺寸。
本文公开的硅石纳米膜上的分层图案基于沉积有硅石的热收缩性聚合物膜的热诱导表面褶皱。使用由预拉伸的软质聚合物基材涂覆的金属薄膜收缩或膨胀引起的表面褶皱是制造纳米材料的简单且低成本的方法。由于聚合物基体和刚性膜之间的收缩或膨胀系数不同，应力将积聚在膜内并最终导致自发的表面起皱现象。
在制备磁性硅石纳米膜的过程中形成的精确纳米结构取决于二氧化硅的涂层或层以及所沉积的磁性材料的厚度。随着硅石层变厚，可以大大提高硅石纳米膜的比表面积，同时增强核酸结合能力。因此，与商业硅石柱和磁性颗粒相比，本文公开的磁性硅石纳米膜可具有更高的核酸回收率。与其他已知方法(如苯酚-氯仿方法)相比，本文公开的磁性硅石纳米膜能够以高产率和高质量从培养的人细胞中提取核酸，例如DNA。
针对特定的目的，本文公开的磁性硅石纳米膜可以制造成任何合适的形状，例如平面状或珠状构造。在某些实施方案中，磁性硅石纳米膜可以是圆形、正方形或任何特定形状，包括不规则形状、新颖的形状和三维形状。在一个实施方案中，本文公开的磁性硅石纳米膜可以是圆形的并且可以装配到试管中。在某些实施方案中，磁性硅石纳米膜可适于装入用于流通分析的柱或移液管末端或能够容纳样品的任何其他装置。在某些实施方案中，磁性硅石纳米膜可以折叠、弯曲或附着在一起以形成三维形状。
在某些实施方案中，本文公开了制备磁性硅石纳米膜的方法，其包括：a)在具有原始尺寸的聚合物芯上沉积至少一层二氧化硅；b)在聚合物芯上沉积至少一个磁性部分；以及c)在足够的温度下将聚合物芯加热足够的时间以使聚合物芯收缩，并且其中聚合物芯的收缩在硅石纳米膜的表面上产生了硅石微结构和/或纳米结构。在某些实施方案中，本文公开了制备磁性硅石纳米膜的方法，其包括：a)在具有原始尺寸的聚合物芯的第一侧上沉积至少一层二氧化硅层；b)在所述聚合物芯的第二侧上沉积至少一个磁性层；以及c)在足够的温度下将聚合物芯加热足够的时间以使聚合物芯收缩，并且其中聚合物芯的收缩在硅石纳米膜的表面上产生了硅石微结构和/或纳米结构。
本文公开的磁性硅石纳米膜可以使用简单、廉价的和/或本发明的热塑性方法制造。在一些实施方案中，通过任何已知的沉积方法将约2nm至约500nm范围内的二氧化硅沉积在约5μm至约500μm厚的聚合物芯(例如聚烯烃膜)上。沉积方法的实例可以包括但不限于化学气相沉积、电泳沉积、浸涂、物理气相沉积、电子束气相沉积、溅射、旋涂或液相沉积。
然后在烘箱中将被二氧化硅覆盖的聚合物膜在足以使聚合物收缩的温度下使其热收缩。温度可以根据所用聚合物的类型和聚合物的起始厚度而变化。可以使用任何加热装置，例如红外加热器、热枪或电阻加热元件。在某些实施方案中，聚合物在约100°F至约500°F、例如约250°F或约300°F的温度范围内加热。
收缩过程的加热时间也可以根据聚合物类型和聚合物的起始厚度而变化。在一些实施方案中，聚合物可以加热约10秒至约10分钟，例如约2分钟至约3分钟。
聚合物的热收缩可造成膜的面积的收缩尺寸超过95％，同时增加厚度，并产生了顶部为纳米级薄片的微观尺寸折叠的分层结构。然后可以根据需要为各种应用制造各种形状或尺寸的磁性硅石纳米膜。在一些实施方案中，当受热收缩时，聚合物芯膜可以收缩至其原始尺寸的约0.1％至约95％或约75％。可以设想，本文公开的方法能够以任何规模实施，包括小规模批量处理和工业规模的卷对卷工艺。
在某些实施方案中，磁性硅石纳米膜可以冲压成不同直径的圆。在一个实施方案中，可以使用6mm直径的片，其能够装配到普通的1.5mL管中。在某些实施方案中，可以使用1mm直径或更小的片，以减少润湿体积和流体死体积，从而促进微观体积和低丰度样品的提取。在某些实施方案中，本文公开的磁性硅石纳米膜分别能够结合大于约150μg的DNA，例如大于约160μg的DNA或约175μg或更多的DNA。在某些实施方案中，本文公开的磁性硅石纳米膜分别能够结合大于约250μg的总核酸，例如大于约500μg的总核酸，或约1000μg或更多的总核酸。在本文公开的某些实施方案中，磁性硅石纳米膜可以保持稳定超过至少约六个月。在一个实施方案中，可以将6mm的圆形硅石纳米膜装入1.5mL管的帽中并用于核酸分离。这些管可以是预制的并且可作为试剂盒使用，其可以包括(例如)使用说明书、以及用于样品制备和清洁的试剂。
根据某些实施方案，本文公开了一种从样品中提取核酸的方法，包括：a)获得包含核酸的样品；b)使样品与足够量的磁性硅石纳米膜接触；c)允许样品中的核酸吸附到磁性硅石纳米膜上；d)使用磁体移动磁性硅石纳米膜；e)任选地洗涤磁性硅石纳米膜以除去任何非核酸组分；和f)使核酸从磁性硅石纳米膜上解吸下来以从样品中获得分离和纯化的核酸。在图3所示的流程图中示意性地示出了用于从样品中提取核酸的示例性方法300。
在一些实施方案中，使用本文公开的磁性硅石纳米膜提取核酸的方法可在步骤a)中包括使核酸与离液剂接触。这可能有助于核酸吸附或结合至纳米膜上的硅石微结构和纳米结构。离液剂或化合物是改变或破坏蛋白质、核酸和蛋白质-核酸复合物的二级结构、三级结构和四级结构并同时使初级结构保持完整的化合物。在溶液中，在离液条件下，生物分子(例如蛋白质、蛋白质-核酸复合物和核酸)的分子内相互作用被破坏，这是因为离液化合物会干扰生物分子中的稳定化分子内相互作用，例如氢键、范德瓦尔力和疏水作用。由于离液化合物的尺寸较大，所以其通常具有大体积离子，其可能干扰分子间相互作用并因此降低溶剂的极性，从而破坏分子间和分子内氢键。因此，许多蛋白质析出；然而，双链核酸片段的螺旋结构得以维持。通过向细胞裂解物或细胞悬浮液中添加离液化合物，可以使蛋白质析出，同时可以将核酸保留在溶液中。在离液条件下，非常有利于核酸在二氧化硅类基材上的结合。离液化合物包括(例如)高浓度尿素溶液(例如6至8摩尔/升尿素)、胍盐溶液(例如6摩尔/升氯化胍)、高浓度锂盐(例如4.5摩尔/升高氯酸锂)。离液阴离子包括阴离子F-、PO4 3-、SO4 2-、CH3COO-、CI-，以及例如BR-、I-、NO3 -、C1O4 -、SCN-和CI3CCOO-。离液阳离子包括阳离子Li+、Mg2+、Ca2+、Ba2+，以及例如异硫氰酸胍([CH6N3]+SCN-)和氯化胍。离液化合物还有助于裂解细胞膜和使蛋白质变性。
在一些实施方案中，使用如本文公开的磁性硅石纳米膜提取核酸的方法进一步包括在步骤b)中在含水醇溶液(如乙醇或异丙醇)的存在下，使样品与足量的磁性硅石纳米膜接触。众所周知，含水醇溶液可以有助于使核酸从样品中的其他细胞或组织成分中析出。
在一些实施方案中，使用本文公开的磁性硅石纳米膜提取核酸的方法可以包括例如两个、三个或更多个洗涤步骤，例如在步骤e)中。这些洗涤剂可以包括缓冲液、醇、洗涤剂或已知适用于分离和纯化核酸的其他试剂。
对于DNA的纯化，可以优选将生物学有效量的RNA酶添加到样品中，由此RNA可以被消化并且可以从样品中分离出完整的DNA。RNA酶消化可以在提取期间的不同时间进行，最早在裂解后进行，并且最迟在纯化结束时的洗脱之后进行。然而，在某些实施方案中，DNA的检测可以在共纯化的RNA的存在下进行，即通过省略RNA酶步骤或通过使用能够排除RNA来选择性分离DNA的缓冲条件。
为了分离RNA，可以优选将生物有效量的DNA酶添加到样品中。这可能导致DNA被“消化”并进入溶液，而未消化的RNA可以从溶液中分离出来。DNA酶消化可以在提取期间的不同时间进行，最早在裂解后进行，最迟在纯化结束时的洗脱后进行。
本文公开的方法可用于富集样品中特定类型的核酸(例如DNA或RNA)。例如，在步骤e)中，可以添加DNA酶以从样品中的核酸中除去DNA，并富集样品中的RNA。类似地，可以在步骤e)中向样品中加入RNA酶，以从样品中的核酸中除去RNA并富集样品中的DNA。
本文公开的方法可用于富集样品中的特定类型的核酸，例如DNA、RNA、长核酸或短核酸。例如，在结合步骤c)和洗涤步骤e)的过程中，可利用缓冲液中的醇的百分比以调节溶解度，从而对特定物质进行优选的结合和洗脱。也可使用盐来调节相对溶解度，从而优先提取特定类型的核酸。还可利用有机溶剂以将目标分子分成不同的液相，从而优先提取特定类型的核酸。
在一些实施方案中，使用本文公开的磁性硅石纳米膜提取核酸的方法可包括在步骤e)之后的干燥步骤。
在本文公开的某些实施方案中，无孔磁性硅石纳米膜可以将核酸保留在栓系(tethered)构象中，其能够通过保护核酸免受断裂并远离倾向构象的偏斜结合而提取大量的超高分子量(UHMW)核酸。与微粒和旋转柱(其中核酸会因颗粒混合或流过多孔基材而被剪切)相反，用本文公开的磁性硅石纳米膜提取的核酸可以直接结合并从二氧化硅薄片中释放而不断裂。这种温和的方法确保了高质量的Mb型核酸的快速分离(例如少于约1小时)，并且核酸损伤(如切口)和脱碱基位点的量最小，该方法可用于产生高质量的长的单分子测序文库。
例如，在某些实施方案中，当提取的核酸是长核酸时，本文公开的新型触手结合方法可以捕获超高分子量DNA，长度高达兆碱基，并且结合能力比硅石微粒的结合能力高1,000,000倍。在某些实施方案中，本文公开的方法可以相对较快，例如小于约1小时、小于约45分钟、小于约30分钟、小于约15分钟、或约15分钟。本文公开的提取方法能够实现超高分子量和低DNA损伤，如此可以产生高质量测序文库，其具有至少约20kb、例如至少约50kb、至少约75kb、至少约100kb、至少约150kb、至少约200kb、至少约500kb或至少约1Mb的单分子平均读取长度。
本领域普通技术人员将理解，通过使用本领域已知的任何洗脱液，可以将结合或吸附在本文公开的磁性硅石纳米膜上的核酸从纳米膜上解吸。典型的洗脱溶液可以是(例如)包含(0.5M)乙酸铵、10mM乙酸镁和1mM EDTA的混合物的缓冲液。另一种典型的洗脱液可以是(例如)包含10mM Tris碱和1mM EDTA的混合物的缓冲液。另一种典型的洗脱溶液可以是水。
根据另一个实施方案，本文还公开了从福尔马林固定-石蜡包埋(FFPE)样品中提取核酸的方法，其包括：a)获得包含核酸的FFPE样品；b)使样品脱蜡；c)使样品与足够量的磁性硅石纳米膜接触；d)使样品中的核酸吸附到磁性硅石纳米膜上；e)使用磁铁移动磁性纳米膜；f)洗涤磁性硅石纳米膜以除去任何非核酸成分；以及g)使核酸从磁性硅石纳米膜上解吸下来，以从样品中获得分离并纯化的核酸。
在本文公开的某些实施方案中，FFPE组织样品可以通过加入有机溶剂如二甲苯来脱蜡。然后除去二甲苯，并用梯度乙醇溶液洗涤样品微球，以除去二甲苯并再次使DNA水解。在其他实施方案中，可以通过改变二甲苯浓度、孵育时间和洗涤方案来改变脱蜡方法，以确保所有的石蜡被去除并且二甲苯进行量(carry through)是最小的。FFPE组织样品也可能含有高度交联的DNA。在一些实施方案中，交联反转可以通过加热进行，例如加热至约95℃的温度。在其他实施方案中，可以通过化学方式进行反转。在脱蜡和交联反转后，使用如上所述的方法进行核酸提取。
本领域普通技术人员还将理解，使用本文公开的磁性硅石纳米膜的组合物、装置和方法可以与本领域已知的用于分离、纯化和分析核酸的任何其他分析技术组合。
根据某些实施方案，本文公开了一种试剂盒，其包括一个或多个磁性硅石纳米膜和使用磁性硅石纳米膜从样品中分离或纯化核酸如DNA或RNA的说明书。可以在容器中提供这样的试剂盒以及进行核酸分离和纯化所需的其他试剂或材料。本文公开的试剂盒还可以包括包含磁性硅石纳米膜的装置或设备。
在一个实施方案中，磁性纳米膜用于从细胞样品中提取DNA。可以首先将细胞样品用胰蛋白酶处理，添加到容器中，并重悬于缓冲液(如磷酸盐缓冲盐水(PBS))中。
然后可以裂解细胞样品。样品的裂解可以包括通过本领域已知的任何方式破碎样品中的细胞或细胞结构。裂解可以包括(例如)机械裂解方法(如超声或珠打浆)、热裂解(例如冻融循环或加热样品)和化学裂解(例如用洗涤剂或酶)。在某些实施方案中，然后将裂解缓冲液添加到细胞中。在某些实施方案中，裂解缓冲液可以包含例如蛋白酶K、盐酸胍和Triton X-100。
裂解后，可以向裂解的细胞中加入本文所公开的磁性硅石纳米膜，以使核酸与磁性纳米膜结合。另外，在某些实施方案中，可以将异丙醇添加到溶液中。在其他实施方案中，可以向溶液中添加乙醇。结合后，可以使用磁体将磁性硅石纳米膜拉至容器的侧面，从而能够吸出裂解缓冲液和未结合的细胞杂质。
然后可以将洗涤缓冲液添加到容器中，并释放磁体以使洗涤溶液充分接触纳米膜。在某些示例性实施方案中，洗涤缓冲液可以包含(例如)异丙醇或乙醇。在其他实施方案中，洗涤溶液可以包含离液盐。也可以利用磁体将纳米膜拉至一侧以吸出洗涤溶液，并且洗涤可以重复多次，例如两次、三次或四次。这一系列洗涤步骤可以作为严格洗涤。
在最终洗涤之后，可将洗脱缓冲液添加到容器中并释放磁体。在某些实施方案中，可以将容器温育以使DNA能够从纳米膜释放或解吸。最后，可以再次使用磁铁将纳米膜拉到一侧，从而可以吸出纯化的DNA。
本文公开的磁性硅石纳米膜的低剪切、平面、非多孔形式能够提取长度超过约100kb的大基因组片段，例如大于约250kb、大于约500kb、大于约1Mb、大于约5Mb或大于约10Mb。
在本文公开的某些实施方案中，可以使用永磁体或电磁体。
在一些实施方案中，结合和洗涤缓冲液可以包含高浓度的异丙醇(70％)或乙醇(70％)，以及高浓度的离液盐，如盐酸胍(6M)、硫氰酸胍(6M)、过氯化钠(4M)或碘化钠(4M)，以促进核酸结合到二氧化硅纳米膜上并去除污染物盐、蛋白质、脂质等。
在某些实施方案中，提取缓冲液可以具有与磁性材料不相容并且导致降解或浸出到溶液中的组分。因此，在一个实施方案中，提取缓冲液可以被优化以保持与磁性材料的化学相容性。在另一个实施方案中，可以使用钝化层来保护磁性材料免受攻击。
在另一个实施方案中，磁性硅石纳米膜用于自动提取系统中的自动化核酸提取。自动提取系统可以包括(例如)移液式仪器，如Qiagen QIAsymphony、Qiagen Biorobot、Tecan Freedom EVO和Beckman Coulter Biomek工作站，以及磁棒式仪器，如ThermoScientific KingFisher和Perkin Elmer Chemagic。
在一些实施方案中，可将多片磁性硅石纳米膜用于一个提取管中。
根据又另一个实施方案，磁性硅石纳米膜可以以微流体芯片形式使用。在某些实施方案中，微流体芯片是这样的装置，其包括包含多个离散的磁性硅石纳米膜区域的固体基底。磁性硅石纳米膜可以位于基底上的空间限定的地方。如本领域技术人员将理解的，磁性硅石纳米膜可以以各种各样的方式附着到芯片上，或者限制在芯片的某些区域内。可以首先合成磁性硅石纳米膜，随后附着或限制在芯片上，或者可以直接在芯片上合成磁性硅石纳米膜或作为芯片的一部分。
实施例
实施例1-磁性纳米膜制造
使用电子束蒸镀，用100nm厚的二氧化硅层覆盖20μm厚的聚烯烃膜的一侧。然后使用电子束蒸镀，在另一侧交替地覆盖20nm厚的二氧化硅层、30nm厚的铁层和20nm厚的二氧化硅层。然后将被覆盖的聚烯烃基材在300°F的烘箱中热收缩3分钟。这产生了两侧具有微观尺寸和纳米尺寸的二氧化硅薄片的纳米膜。背侧二氧化硅薄片包括夹在硅石之间的磁铁中心，使得可以进行磁性操控，核酸可以结合或吸附到磁性纳米膜的两侧。包裹铁两侧的硅石作为核酸的结合表面，并保护铁不与缓冲组分发生反应。图2为示出了示例性制造过程的流程图。图13示出了磁性硅石纳米膜的表面形貌的SEM图像，显示了微观尺寸和纳米尺寸的硅石结构，如薄片、薄层、褶皱和折叠。右侧的插图示出了更高放大倍数下的区域。
实施例2-MCF-7细胞的磁性纳米膜提取方法
将上述实施例1中制备的磁性硅石纳米膜用于从2×106个MCF-7培养细胞中提取DNA。将培养细胞用胰蛋白酶处理并重悬于磷酸盐缓冲盐(PBS)溶液中。然后将包含蛋白酶K、盐酸胍和Triton X-100的裂解缓冲液添加到细胞中并孵育1小时。然后将磁性硅石纳米膜和异丙醇添加到裂解的细胞中以使核酸与磁性硅石纳米膜结合。然后使用磁体将磁性纳米膜拉向微量离心管侧，使得可以吸出裂解缓冲液和未结合的细胞杂质。图4示出了通过使用磁性架而被拉至微量离心管侧的磁性纳米膜的照片。然后将含有70％EtOH的洗涤缓冲液添加到管中，并释放磁体以使洗涤溶液能够充分接触纳米膜。然后利用磁体拉动纳米膜，使得可以吸出洗涤溶液。再次重复洗涤两次。
第三次洗涤后，将洗脱缓冲液加入管中，然后释放磁体。将管孵育15分钟以使DNA能够从纳米膜中释放或解吸。最后，再次施加磁铁，将纳米膜拉至一侧，纯化的DNA被吸出。根据测定法进行测量，回收了61μg的DNA。相比之下，通过使用苯酚-氯仿对2×106个MCF-7培养细胞进行DNA提取，回收了45μg的DNA，Qiagen Minispin柱回收了41μg的DNA，通过Qiagen磁性颗粒技术进行DNA提取回收了49μg的DNA。图5示出了磁性硅石纳米膜的DNA提取结果与使用苯酚-氯仿、Qiagen Minispin柱和磁性颗粒技术的DNA提取结果间的对比的柱状图。如图5所示，磁性硅石纳米膜能够提取更高产量的DNA。
使用分光光度计通过UV吸光度测定所有提取方法中提取的DNA的纯度。提取的DNA的纯度与所有四种方法相当。使用苯酚-氯仿提取的DNA具有高纯度，260/230比值和260/280比值分别为1.91和2.15。使用磁性硅石纳米膜提取的DNA也具有非常高的纯度，260/280比值和260/230比值分别为1.96和2.16。用磁珠微粒提取的DNA的纯度为：260/280比值和260/230比值分别为1.99和2.23，而用旋转柱提取的DNA的纯度为：260/280比值和260/230比值分别为1.89和2.16。图6是说明UV吸光度与波长的关系的曲线图，下表1示出了分析的所有四种DNA提取方法的UV吸光度的纯度结果。
表1
提取方法 260/280 260/230
苯酚-氯仿 1.91 2.15
纳米膜 1.96 2.16
微颗粒 1.99 2.23
旋转柱 1.89 2.16
对通过纳米膜、苯酚-氯仿、旋转柱和磁珠提取的DNA进行脉冲场凝胶电泳以比较DNA尺寸，脉冲场凝胶电泳图像如图7所示。如图7所示，纳米薄膜的低剪切、平面、非多孔形式能够提取长度超过100kb、并且一些长度超过300kb的DNA的基因组片段。
实施例3-使用人全血的磁性纳米膜提取方法
将上述实施例1中制备的磁性硅石纳米膜用于从人全血中提取DNA。将包含蛋白酶K、盐酸胍和Triton X-100的裂解缓冲液添加到细胞中并孵育1小时。然后将磁性硅石纳米膜和异丙醇添加到裂解的细胞中，以使核酸与磁性硅石纳米膜结合。然后使用磁体将磁性纳米膜拉向微量离心管侧，使得可以吸出裂解缓冲液和未结合的细胞杂质。然后将含有70％EtOH的洗涤缓冲液添加到管中，并释放磁体以使洗涤溶液能够充分接触纳米膜。然后使用磁体以将纳米膜拉至一侧，使得可以吸出洗涤溶液。再次重复进行两次洗涤。
在第三次洗涤之后，将洗脱缓冲液加入到管中，然后释放磁体。将管孵育15分钟以使DNA能够从纳米膜中释放或解吸。最后，再次施加磁铁，以将纳米膜拉至一侧，吸出纯化的DNA。磁性纳米膜提取了18.9μg的总核酸(DNA+RNA)。如图8所示，柱形图比较了由磁性纳米膜提取的总核酸量和由非磁性纳米膜提取的总核酸量，使用磁性纳米膜的核酸产量与非磁性纳米膜相当，表明存在磁性层对提取效率没有不利影响。
实施例4–利用KingFisherTMDuo Prime的自动磁性纳米膜提取方法
在Thermo Scientific KingFisherTMDuo Prime上进行自动提取。并未如图3所示使用磁铁来保持磁性纳米膜并从管中吸出和吸入溶液，而是如图11所示利用了KingFisherDuo Prime，其使用包括排列的磁棒的磁性头将磁性纳米膜从一个溶液转移到下一个溶液从而提取DNA。如图11中的方法1100所示，使磁棒进出溶液使得磁性纳米膜能够从一个缓冲液转移到下一个缓冲液。将磁棒拉出塑料杆盖，使得磁性纳米膜能够释放到溶液中，以方便洗涤和混合。以这种方式，可以通过将磁性纳米膜连续转移到结合缓冲液中以捕获裂解的DNA，然后进入洗涤缓冲液中以冲洗掉盐和杂质，最后进入洗脱缓冲液中以洗脱DNA并除去使用过的磁性纳米膜，从而进行DNA提取。可以跳过洗涤步骤来加速处理。例如参见图11。
在Thermo Scientific KingFisherTMDuo Prime上进行MCF-7细胞中的自动DNA提取。使用自动化提取系统同时运行8个样品。对培养的细胞进行胰蛋白酶化并重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中。如图12所示，将1x106个细胞置于96深孔板1200的A行中的七个分开的孔洞中。将八个单独的磁性纳米膜添加到C行的孔洞中，将洗涤缓冲液加入到D、E和F行，并将洗脱缓冲液加入到洗脱条中。例如参见图12。然后将包含蛋白酶K、盐酸胍和Triton X-100的裂解缓冲液添加到样品孔洞(A行)中，并轻轻搅拌孵育10分钟。将异丙醇手动添加到A行中的每个孔洞中。包括一系列磁性棒的KingFisherTM机器臂然后从C行捕获磁性纳米膜，并将其移动到A行以使其与样品接触，使DNA吸附磁性纳米膜。图9示出了由头部捕获的磁性纳米膜的照片，其包括机器臂上的一组磁棒。然后如图12所示，机器臂将磁性纳米膜依次移动到D、E和F行中的洗涤缓冲液中。
在第三次洗涤之后，机器臂将磁性纳米膜移动到洗脱缓冲液以洗脱吸附的DNA。然后通过机器臂去除磁性纳米膜，留下纯化的DNA。用自动DNA提取系统从八个样品中的每一个样品中回收的DNA的量显示在图10的柱形图中。使用自动提取系统的DNA产量为9.1±3.5μg。

Claims (25)

1.一种磁性硅石纳米膜，包括：
具有第一表面和第二表面的聚合物芯；
设置在所述聚合物芯上的至少一层二氧化硅层，所述二氧化硅层包括选自多个(a)微米尺寸硅石结构和(b)纳米尺寸硅石结构中的至少一种表面形态；以及
至少一个磁性部分，
其中所述至少一个磁性部分选自：设置在所述聚合物芯上的至少一层磁性材料、嵌入所述聚合物芯内的至少一种磁性材料、至少一个磁性聚合物芯以及设置在所述二氧化硅层上的至少一层磁性材料。
2.根据权利要求1所述的磁性硅石纳米膜，其中所述至少一个磁性部分包含选自抗磁性材料、顺磁性材料、亚铁磁性材料和铁磁性材料中的至少一种磁性材料。
3.根据权利要求1所述的磁性硅石纳米膜，其中所述至少一个磁性部分包含选自铁、镍、钴、磁铁矿、赤铁矿、磁赤铁矿、钢、阿尔尼科合金、坡莫合金、阿尔帕姆合金、费尔尼柯低膨胀系数合金、森达斯特铝硅铁合金和镀铜铁镍合金中的至少一种磁性材料。
4.根据权利要求1所述的磁性硅石纳米膜，其中所述至少一个磁性部分为磁性层，且所述磁性层的厚度在5nm至10um的范围内。
5.根据权利要求1所述的磁性硅石纳米膜，其中所述至少一层二氧化硅层设置在所述聚合物芯的所述第一表面上，并且所述至少一个磁性部分设置在所述第二表面上。
6.根据权利要求5所述的磁性硅石纳米膜，还包括设置在所述至少一个磁性部分上的第二层二氧化硅层。
7.根据权利要求6所述的磁性硅石纳米膜，进一步包括设置在所述聚合物芯的所述第二表面和所述至少一个磁性部分之间的第三层二氧化硅层。
8.根据权利要求7所述的磁性硅石纳米膜，还包括在位于所述聚合物芯的所述第一表面上的所述二氧化硅层上设置的第二磁性部分、以及设置在所述第二磁性部分上的第四层二氧化硅层。
9.权利要求5的所述磁性硅石纳米膜，其中在所述聚合物芯的所述第一表面上设置第二磁性部分。
10.根据权利要求9所述的磁性硅石纳米膜，其中在位于所述聚合物芯的所述第二表面上的所述至少一个磁性部分上设置第二层二氧化硅。
11.根据权利要求1所述的磁性硅石纳米膜，其中所述二氧化硅层的厚度为2nm至500nm。
12.根据权利要求1所述的磁性硅石纳米膜，其中所述至少一个磁性部分为磁性层，且所述磁性硅石纳米膜还包括设置在所述至少一个磁性层上的钝化层。
13.根据权利要求1所述的磁性硅石纳米膜，其中使用选自电子束蒸镀、溅射、化学气相沉积、电镀、原子层沉积、化学溶液沉积和旋涂中的沉积方法沉积所述至少一层二氧化硅层。
14.根据权利要求1所述的磁性硅石纳米膜，还包括选自氨基丙基、氯丙基、十八烷基、辛基、季铵基、二乙基氨基乙基、磺酸基、苯基、聚乙二醇、脂质、壳聚糖、生物素、链霉亲和素、抗体、蛋白质和酶中的至少一种的表面官能化。
15.根据权利要求1所述的磁性硅石纳米膜，其中所述聚合物芯包含选自聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、环状聚烯烃聚合物、聚丙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、氟化乙烯丙烯、聚四氟乙烯和聚偏二氟乙烯中的至少一种热塑性材料。
16.一种从样品中提取目标核酸的方法，所述方法包括：
获得包含核酸的样品；
使所述样品与至少一个根据权利要求1-15中任意一项所述的磁性硅石纳米膜接触，所述至少一个磁性硅石纳米膜包括至少一层二氧化硅层和至少一个磁性部分；
使所述样品中的所述核酸吸附在所述至少一个磁性纳米膜上；
使用磁体操纵所述至少一个磁性纳米膜；以及
使所述核酸从所述至少一个磁性纳米膜上解吸，以由所述样品中获得提取的核酸。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述核酸选自DNA、RNA、以及DNA和RNA的混合物。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述核酸分散在包含裂解缓冲液的上清液中。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述核酸分散在反应溶液中。
20.根据权利要求19所述的方法，其中操纵所述至少一个磁性纳米膜包括利用磁体将所述磁性纳米膜保持在期望的位置，同时移除所述反应溶液以使其不与所述磁性纳米膜接触，并在移除所述反应溶液之后磁性释放所述至少一个磁性纳米膜。
21.根据权利要求16所述的方法，其中操纵所述至少一个磁性纳米膜包括用所述磁体转移所述磁性纳米膜，并在转移后磁性释放所述至少一个磁性纳米膜。
22.根据权利要求16所述的方法，还包括：通过以下步骤洗涤所述至少一个磁性纳米膜以除去非核酸成分：
a)使所述至少一个磁性纳米膜与洗涤溶液接触；以及
b)操纵所述至少一个磁性纳米膜，以使所述洗涤溶液与所述至少一个磁性纳米膜分离。
23.根据权利要求22所述的方法，还包括将a)和b)的过程重复一次或多次。
24.根据权利要求16所述的方法，其中解吸所述核酸包括使所述样品与洗脱液接触，并将所述至少一个磁性纳米膜释放到所述洗脱液中。
25.根据权利要求16所述的方法，其中所述从样品中提取目标核酸的方法由自动化仪器以自动方式执行。
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