WO2019096407A1 - Vorrichtung und verfahren zur reversiblen immobilisierung von biomolekülen - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur reversiblen immobilisierung von biomolekülen Download PDF

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Kai Hassler
Konstantin Lutze
Harald Quintel
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Hombrechtikon Systems Engineering Ag
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Definitions

  • the invention relates to a device for the reversible immobilization of biomolecules.
  • the invention further relates to a method for the reversible immobilization of biomolecules according to the preamble of independent claim 16.
  • the invention further relates to a device Apparatus for the automated processing of biomolecules comprising a device for the reversible immobilization of biomolecules according to the preamble of independent claim 18.
  • DNA extraction which precipitates DNA in a nonpolar environment.
  • DNA can be removed by centrifugation, e.g. after cell disruption or by electrophoretic methods.
  • Biomolecules can also be synthesized and purified by immobilization on an insoluble support.
  • Common substrates for immobilizing biomolecules are glass as well as other, less common substrates such as gold, platinum, oxides, semiconductors and various polymer substrates.
  • Magnetic bead-based clean-up and “magnetic bead-based normalization” are widespread methods for immobilization, purification and
  • the magnetic particles are typically held in the container by ring magnets which enclose a container. As a result, a solution containing impurities can be pipetted off, while the magnetic particles with the bound biomolecules remain in the container.
  • the magnetic beads were developed at the Whitehead Institute in 1995 for the purification of PCR products.
  • the magnetic particles are paramagnetic and may be e.g. made of polystyrene coated with iron. On the iron then various molecules can be attached with carboxyl groups. These carboxyl groups can reversibly bind the DNA molecules. This immobilizes the DNA molecules.
  • Magnetic particle methods usually include the following steps. First, the PCR products are bound to the magnetic particles. Subsequently, the magnetic particles with the attached PCR products are separated from impurities (this step is realized, for example, by pipetting off the solution from the solid). Then the magnetic particles are washed with the attached PCR products. After washing, the PCR products are eluted from the magnetic particles and transferred to a new plate.
  • the magnetic particle-bound nucleic acids are collected at the bottom and at the edge of the cavities and depending on the routine optimized pipetting up and down again brought into solution. Finally, the DNA or RNA are eluted for direct storage or further applications in separate tubes with lids.
  • l-DOT Dispendix's “Immediate Drop on Demand Technology”
  • l-DOT Dispendix's “Immediate Drop on Demand Technology”
  • This system for liquid dispensing is based on a microtiter plate with so-called “wells” which have openings of a few micrometers in diameter on their underside.
  • the liquid is held in the wells by capillary forces.
  • a well-defined pressure pulse from above on a liquid-filled wells a drop of accurate volume is formed, which is discharged through the lower openings of the wells.
  • Liquid quantities are dispensed in the nanoliter range, but a dispensing system does not provide a means of purification
  • a dispensing device is also known from US 8,877,145 B2.
  • a liquid is held by a capillary which has a liquid reservoir.
  • a hydraulic pressure By applying a hydraulic pressure, the capillary forces are overcome and an accurate
  • US Pat. No. 4,111,754 discloses a device in which a plastic structure for surface enlargement is attached in a capillary. In this capillary, the fluid is held by the capillary forces and antigens or antibodies can adhere to the plastic structure. Thus, the antigens or antibodies can be immobilized on the plastic surface. By adding washing liquid, the impurities can then be removed.
  • a disadvantage of this device is that the antigens and antibodies are bound inside the capillary and not with the
  • Carrier material can be ejected.
  • the antigens and antibodies can only be eluted by being released from the container so mobilized again.
  • the surface to which the biomolecules are attached can be adjusted only by changing the capillary, that is, by changing the device, and in a reaction, the carrier for the biomolecules can not be moved to better mixing, thereby also increasing the reaction time.
  • the device described is also not compatible with all purification protocols, which makes it difficult to integrate the device into existing workflows
  • Biomolecules are attached to stationary support materials. Thus, the methods known in the art are slow, costly and less efficient.
  • the object of the invention is therefore an apparatus for immobilizing biomolecules by binding the biomolecules to a solid surface, a method for the reversible immobilization and purification of biomolecules by binding the biomolecules to a solid surface and an apparatus for the automated processing of biomolecules with a device for To provide immobilization of biomolecules which avoid the adverse effects known from the prior art.
  • the object is achieved by a device for the reversible immobilization of biomolecules with the features of independent claim 1, by a method for the reversible immobilization of biomolecules with the
  • the method may include the following steps. Magnetic particles and a liquid, in particular a liquid with reagents, are arranged in a container. Biomolecules or reagents are bound to the magnetic particles, in particular bound reversibly. The magnetic particles are fixed with a magnet in the container. The liquid, in particular the liquid with impurities, is removed from the opening of the container by opening the valve, in particular for the purification of the biomolecules. The biomolecules are, e.g. with a solvent, detached from the magnetic particles. Then the solved ones
  • Biomolecules are removed by opening the valve from the container.
  • the container may have a second opening.
  • liquid can be supplied via this second opening.
  • the valve can be controlled.
  • the second opening may be on the opposite side of the container from the opening.
  • the valve may be controlled via the second opening to regulate pressure on the liquid through the second opening.
  • containers are used whose depressions have one (or more) openings, preferably on the underside, which are such that they have a valve function or can be controlled by a valve, thus it is possible to hold liquid in the depression or to empty the depression through the openings, wherein the magnetic particles are held by the magnet in the recess of the container.
  • the biomolecules are reversibly bindable to the particles and the magnetic particles can have an enlarged surface compared to the container wall and can also be removed together with bound biomolecules from the container.
  • biomolecules can be selectively bound to the surface of the magnetic particles so that only one sort of biomolecule is bound from a liquid.
  • magnetic particles have the great advantage that the magnetic particles are simply transferred through a magnet (e.g., permanent or electromagnet) or through a magnetic field into the magnetic field
  • the magnet is arranged so movable on the container that the
  • magnetic particles during a reaction step in the container are freely movable and during a washing step, by changing the
  • the magnet may be movable such that the magnet is in a first position on the container is arranged and the magnetic particles fixed and by moving the magnet to a second position on or around the container, the magnetic particles are movable.
  • biomolecule DNA, RNA, nucleic acids, proteins, start sequences for biomolecules; Cells and
  • a washing step in the context of the invention is a process step in which the liquid is discharged from the containers by actuation of the valve and in which the impurities are separated from magnetic particles with the attached biomolecules. Washing may also involve washing with a washing solution (water or others).
  • a reaction step in the context of the invention is a process step in which the biomolecules bound to the magnetic particles
  • chain extension e.g., PCR “polymerase chain reaction”
  • Reagents may also be biomolecules and / or their monomers.
  • an impurity is generally a substance which is not completely reacted or is not bound to the magnetic particles, the solvent, by-products and contaminations, as well as a mixture of two or more of those described above.
  • impurities may also be reagents or biomolecules.
  • a liquid may be a solution within the scope of the invention.
  • reaction mixture of biomolecules and / or reagents and / or impurities.
  • purification may correspond to the removal of the liquid, in particular the removal of a liquid after a washing step or the removal of the liquid between
  • purification may also be understood to mean the normalization of biomolecules and the selection of biomolecules.
  • valve according to the invention may be mechanical and / or electrical and / or magnetic device for closing and opening the valve.
  • the valve according to the invention it is also conceivable within the scope of the invention for the valve according to the invention to be a capillary.
  • a shutter mechanism could be a substance whose addition to the fluid changes the viscosity and / or the surface tension of that fluid. In such a closure mechanism / capillary combination, a pressure change would correspond to a reduction in surface tension and / or viscosity.
  • a pressure changer may be a device for generating pressure (liquid and / or air pressure), such as a pump, a blower or a stamp.
  • a pressure changer can also be a device which manipulates a film in such a way that a pressure can be applied to the liquid.
  • a pressure changer may further be a device for pulling apart a container and a catching device so as to retain the liquid
  • the retention force of the valve can in the invention
  • Capillary force of a capillary the negative pressure generated by a film and generally a negative pressure, the surface tension and / or the
  • Fluid barrier or a magnetic or mechanical force of a
  • immobilization is to be understood as meaning the binding, in particular the reversible binding of the biomolecules to the magnetic particles.
  • a magnetic particle also called “magnetic bead”
  • a magnetic particle may be porous.
  • a biomolecule may hereinafter generally be understood as meaning thiol groups and / or amino groups and / or
  • a magnetic particle may in the context of the invention be a coated nickel particle or any other ferromagnetic or paramagnetic particle. Magnetic particles typically have a diameter of about 1 micrometer. In the context of the invention, about 1 micron is to be understood as meaning 0.5 to 1.5 microns, in particular 0.7 to 1.3 microns, in particular 0.9 to 1.1 microns.
  • a valve may generally also be a pressure valve, a flow valve or a check valve, particularly preferably one
  • a magnet may be a permanent magnet and / or an electromagnet and / or a superconductor and / or a ferromagnet and / or a paramagnet.
  • a magnet can be a
  • a measuring device In the context of the invention, a measuring device, a luminescence and
  • inventive method are:
  • Biomolecules can be selectively bound - By using particles much larger surface is created
  • the device can be easily integrated into existing (manual, semi-automated or automated) workflows (can build on standard procedures for DNA purification)
  • the closure mechanism may be a pressure changer, wherein by the pressure changer, a pressure on the liquid is variable so that a restraining force of the valve can be overcome by the pressure.
  • the valve can be opened.
  • the control of the pressure on the liquid is important to empty the depression as needed.
  • the pressure can be through a pressure chamber with the upper part of the wells,
  • the upper part is the part can be exercised over the pressure on the liquid.
  • Microtitration plate can by independent pressure chambers (eg per well or per area of the multiwellplate a pressure chamber) individual area or wells are pressurized independently.
  • a pressure chamber arrangement with independent pressure chambers can be connected to the upper part of the depression or of the container.
  • the pressure difference can also be generated by creating a negative pressure on the outside of the opening.
  • the upper part of the depression or of the container and / or the lower opening can be closed. Also reversible closure is conceivable for longer storage of samples or reagents in the container (possibly reversible closure to make a multiwell plate, in particular a microtiter plate PCR-enabled).
  • a pressure changer When using a pressure changer, the opening of the valve corresponds to an increase in the pressure on the liquid or a generated negative pressure which acts on the liquid at the opening of the container. The valve is always closed when no liquid is removed from the container through the opening (only if there is still liquid in the container).
  • a pressure changer can have the following principles: hydrostatics, capillary pressure, centrifugal force, gas pressure.
  • the closure mechanism may be a hydrostatic pressure changer, wherein by the hydrostatic
  • a hydrostatic pressure changer could be a liquid delivery device (for example, a washing liquid for a washing step).
  • a polarity and / or viscosity and / or surface tension of the liquid in the container can be variable by the closure mechanism, so that a retention force of the valve can be overcome, and thus the valve can be opened.
  • the polarity and / or viscosity and / or surface tension of the liquid can be changed, for example, by adding other liquids or substances, or by changing the pFI value.
  • the closure mechanism could be used as a substance delivery device (for example, surfactants for
  • the pressure changer can change the air pressure above the liquid and / or at the opening, in particular an opening arranged at the bottom of the container. So can the generation of a
  • air pressure above the liquid is meant the air pressure which also acts on the liquid so that the liquid can be removed from the container.
  • the valve of the device may be arranged at the opening.
  • the valve may also be the opening, eg if the valve is a capillary, the opening of the capillary is also the opening for discharging the liquid.
  • the valve and / or the opening can be arranged on the underside of the container.
  • a recess of the device may comprise a plurality of valves and / or openings.
  • the openings could also act as a kind of sieve, through which the magnetic particles do not fit, but the liquid can drain.
  • the valve of the device may be formed as a capillary or as a filter or as a foil or as a collecting container.
  • the capillary pressure is sufficient to prevent a spontaneous emptying of the cavities.
  • the liquid can now be removed by applying a pressure pulse (through the pressure reducer) to the liquid from above so that the liquid is removed through the opening (opening the valve).
  • a pressure pulse through the pressure reducer
  • the valve is formed as a filter, the liquid is retained by the fluid barrier of the filter material.
  • Liquid can also be removed here by a pressure pulse (by the pressure changer) is given from above the liquid, so that the pressure pulse (by the pressure changer) is given from above the liquid, so that the pressure pulse (by the pressure changer) is given from above the liquid, so that the pressure pulse (by the pressure changer) is given from above the liquid, so that the pressure pulse (by the pressure changer) is given from above the liquid, so that the pressure pulse (by the pressure changer) is given from above the liquid, so that the
  • Liquid is forced through the filter (opening the valve) and removed through the opening.
  • the valve is a film
  • the film may be disposed over the container such that a volume of gas between the film and the liquid is trapped.
  • manipulating the film eg by moving the film through a pressure generated by the pressure changer
  • the gas volume between the liquid and the film can be compressed in this way a pressure is exerted on the liquid which forces the liquid out of the opening (opening of the valve).
  • the opening of the device may be closable with a bead drivable on the liquid. So there is the possibility to empty the liquid through the opening and then to close the opening of the recess.
  • the container of the device is a
  • Multiwell plate in particular a microtitration plate, with depressions.
  • the pressure changer of the device may be a pressure chamber arrangement, so that each recess can be acted upon individually with pressure.
  • a measuring device can be arranged so that a measurement can be carried out on the hanging drop or on the liquid in the container.
  • the device may comprise a mixer.
  • the mixer may be a variable magnetic field and / or a magnetically movable solid.
  • a magnetically movable solid may in this case be a stirring bar and / or magnetic stirrer, which is guided by a
  • Magnetic field is set in motion.
  • magnetic particles can be caused by a variable magnetic field, a movement of the magnetic particles, which also a
  • devices may also be connected in series.
  • the apparatus and method can be used for post-ligation purification.
  • Biomolecules proposed carried out with a device for reversible immobilization, in particular for the purification of
  • Biomolecules The method may include the following steps. Magnetic particles and a liquid with reagents are placed in a container. Biomolecules or reagents for the synthesis of
  • Biomolecules are bound to the magnetic particles, in particular bound reversibly.
  • the magnetic particles are fixed with a magnet in the container.
  • the fluid with contaminants is removed from the mouth of the container by opening the valve to purify the biomolecules.
  • the biomolecules are, e.g. with a solvent, detached from the magnetic particles. Then the dissolved biomolecules can be removed by opening the valve from the container.
  • the method may, of course, include multiple steps in which liquids must be added and removed, as well as impurities are separated or in which the biomolecules are detached from the magnetic particles.
  • the purified biomolecules can be dispensed by removing them through the opening of the device after detachment from the magnetic particles.
  • the liquid can then be removed by a pressure change (depending on the type of valve).
  • a pressure change depending on the type of valve.
  • the invention also proposes an apparatus for the automated processing of biomolecules with a device for reversible immobilization, in particular for the purification of biomolecules.
  • Fig. 1 is a schematic representation of a device for reversible
  • Fig. 2 is a schematic representation of another
  • Fig. 3 is a schematic representation of another
  • FIG. 4 shows a first embodiment of a valve
  • Fig. 5 shows a second embodiment of a valve
  • Fig. 6 shows a third embodiment of a valve
  • Fig. 7 is a schematic representation of another
  • the container is designed as a multiwell plate 21.
  • the depressions 22 of the multiwell plate 21 can be filled with a liquid 6.
  • the magnetic particles 3 are disposed in the recesses 22 of the multiwell plate 21 and as a collection of magnetic particles
  • a liquid 6 with the biomolecules to be processed together with the reagents required for this would be located in the depressions 22 of the multiwell plate 21.
  • the biomolecules which are located in the liquid 6 can be reversibly attached to the magnetic particles 3 (ie be immobilized).
  • the desired biomolecules can be selectively bound to the magnetic particles.
  • the unbound impurities are then removed through the opening.
  • the biomolecules may be e.g. are extended on the surface of the magnetic particles 3 (e.g., by PCR). After a reaction has taken place during the reaction or not fully reacted impurities, which are located in the liquid 6 are removed.
  • a pressure changer which is designed here as a pressure chamber assembly 41 (here device which generates a pressure p)
  • a pressure chamber assembly 41 here device which generates a pressure p
  • the retention force of the valve 20 are overcome by a pressure on the liquid in the wells 6 (not here shown) is exercised.
  • the liquid 6 can be removed from the multiwell plate 21, while the biomolecules remain on the surface of the magnetic particles 3.
  • the magnetic particles are held by a magnet 5 in the recess 22 of the multiwell plate 21.
  • Fig. 2 shows a schematic representation of another
  • Embodiment of a device 1 for the reversible immobilization and purification of biomolecules a device 1 for the reversible immobilization and purification of biomolecules.
  • a drivable bead 7 is mounted in the container 2, 21 in the recess 22.
  • state A in which no liquid 6 in the container 2, 21, closes the Floating ball 7, the opening 23 and the valve 20.
  • the valve 20 may be, for example, a capillary, in which the liquid 6 is held by the capillary forces.
  • the container 2 21 is formed as a multiwell plate 21, in which a plurality of wells 22 are arranged side by side, thus when emptying the wells 22 by applying pressure generated by the pressure changer (here device which generates a pressure p) p (not shown here), a pressure drop can be prevented.
  • the pressure changer here device which generates a pressure p
  • State B are located.
  • the pressure drop can be prevented by closing the opening 23 of a depression 22, which is in the state A, by the drivable pellet 7.
  • a drivable bead may e.g. be used in a device according to Fig. 1.
  • Fig. 3 shows a schematic representation of another
  • Embodiment of a device for the reversible immobilization and purification of biomolecules in the container 2, 21 is a liquid 6 with magnetic particles 3.
  • Liquid 6 is passed through a valve 20 in the form of a capillary 201
  • a Stirrer 81 is located in the recess 22 of the container 2, 21 .
  • This stirring rod 81 is adapted to the liquid 6 to set in motion such that the liquid 6 at a
  • the liquid 6 can at a
  • Washing step by applying a pressure p drain faster when the liquid 6 by the stirring rod 81 in
  • stir bar 81 shown in Fig. 3 may be combined with any valve 20, and the stir bar 81 may be formed as another magnetically movable solid.
  • Fig. 4 shows a first embodiment of a valve.
  • the valve is designed as a film 203.
  • the opening 23 need not be a capillary, but may simply be configured as a channel.
  • the liquid 6 can not flow through the opening 23 from the recess 22 of the container 2, 21, since the liquid is held by a negative pressure in the container. Only when moving the film 203, when the gas volume between the film and liquid 6 is compressed, that is, a pressure P3 is exerted on the liquid, the liquid 6 can flow through the opening 23.
  • the film 203 could be moved by a pressure changer, so that the film 203 by a pressure (not shown here) on the film from the liquid-side facing, a lowering of the film 203 in the direction of the liquid 6 causes.
  • the magnetic particles 3 could be replaced by a
  • Magnets 5 are held in the recess 22, while the liquid 6 can flow together with impurities when moving the film 203
  • FIG. 4 Magnetic particles 3 and magnet 5, see Fig. 1.
  • a valve according to Fig. 4 of course, with a device 1 according to Fig. 1, and a drivable beads 7 according to FIG. 2 and a stirring rod 81 according to FIG. 3 are combined.
  • Fig. 5 shows a second embodiment of a valve.
  • the valve is designed as a collecting container 204.
  • an overpressure P1 is generated in such a way that the liquid 6 can not flow out of the recess 22 of the container 2, 21 through the opening 23. Only when pulling apart the container 2, 21 and the collecting container 204, when the pressure P1 adjusts to the ambient pressure P2, the liquid 6 can flow through the opening 23.
  • the pressure P1 adjusts to the ambient pressure P2
  • the liquid 6 can flow through the opening 23.
  • inventive method could in a washing step the
  • a pressure changer would correspond to a device for pulling apart the container 2, 21 and the collecting container 204, since the overpressure P1 is thus changed to the ambient pressure P2, whereby the liquid 6 can flow off.
  • a valve according to FIG. 5 can, of course, be combined with a device 1 according to FIG. 1, as well as a stirring rod 81 according to FIG.
  • a pressure change is also implied differently.
  • the valve according to FIG. 5 can, of course, be combined with a device 1 according to FIG. 1, as well as a stirring rod 81 according to FIG.
  • a pressure change is also implied differently.
  • FIG. 6 shows a third embodiment of a valve.
  • the valve is designed as a filter 202.
  • the filter 202 Through the filter 202, the liquid is the sixth
  • a pressure changer would correspond to a device for generating pressure, as this will overcome the retention force of the filter 202, allowing the liquid 6 to drain off.
  • a valve according to FIG. 6 can, of course, be combined with a device 1 according to FIG. 1, as well as a stirring rod 81 according to FIG.
  • Fig. 7 shows a schematic representation of another
  • Embodiment of a device for the reversible immobilization and purification of biomolecules This embodiment shows a
  • a liquid 6 can be transferred from an upper container 2, 21 to a lower container 2, 21 by passing the liquid from one opening 23 into the next container 2, 21 by actuation of the valve 20.
  • the valves 20 of the various containers may all be the same or all different or partially different. So could e.g. a first valve 205 may be a capillary 201, while a second valve 206 is a filter. However, it would also be conceivable that a first valve 205 is a first capillary 2013, while a second valve 206 is a second capillary 2012. Thus, the first and the second capillary 2012, 2013 may be different lengths and / or thick, whereby in each container 2, 21 a different residence time of the liquid 6 is achieved.
  • a series circuit according to Fig. 7 can of course with a

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung (1) zur reversiblen Immobilisierung Biomolekülen. Die Vorrichtung (1) umfasst einen mit einer Flüssigkeit (6) mit Biomolekülen befüllbaren Behälter (2, 21) mit einer Öffnung (23) und einem Ventil (20). Das Ventil (20) für das kontrollierbare Abfliessen der Flüssigkeit (6) kann durch einen Verschlussmechanismus geöffnet und geschlossen werden. Magnetische Partikel (3) an welchen die Biomoleküle immobilisierbar sind, insbesondere reversibel immobilisierbar sind, können frei bewegbar im Behälter (2, 21) angeordnet werden. Ein Magnet (5), für das Fixieren der magnetischen Partikel (3) im Behälter (2, 21), ist am Behälter (2, 21) angeordnet, wobei die Flüssigkeit (6) im offenen Zustand des Ventils (20), durch die Öffnung (23), aus dem Behälter (2, 21) entfernbar ist.

Description

Hombrechtikon Systems Engineering AG, Garstliqweq 6, CH-8634
Hombrechtikon
Vorrichtung und Verfahren zur reversiblen Immobilisierung von Biomolekülen Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur reversiblen Immobilisierung von Biomolekülen gemäss dem Oberbegriff des unabhängigen Anspruchs 1. Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zur reversiblen Immobilisierung von Biomolekülen gemäss dem Oberbegriff des unabhängigen Anspruchs 16. Die Erfindung betrifft weiter einen Apparat zur automatisierten Verarbeitung von Biomolekülen umfassend eine Vorrichtung zur reversiblen Immobilisierung von Biomolekülen gemäss dem Oberbegriff des unabhängigen Anspruchs 18.
Im Stand der Technik sind viele Methoden zur Aufreinigung von DNS und anderen Biomolekülen bekannt. Eine Art der Aufreinigung ist die DNS- Extraktion, bei welcher die DNS in unpolarer Umgebung ausgefällt wird. Auch kann DNS über Zentrifugation, z.B. nach einem Zellaufschluss gereinigt werden oder über elektrophoretische Methoden.
Biomoleküle können auch durch Immobilisierung auf einem unlöslichen Träger synthetisiert und gereinigt werden. Übliche Substrate um Biomoleküle zu immobilisieren sind Glas sowie anderen, weniger verbreitete Substrate wie Gold, Platin, Oxide, Halbleiter und diverse Polymersubstrate.
“Magnetic bead-based clean-up” und“magnetic bead-based normalization” sind weit verbreitete Verfahren zur Immobilisierung, Aufreinigung und
Konzentrationsanpassung von Nukleinsäure. Typische Anwendungsgebiete dieser Verfahren sind die Probenvorbereitung im Kontext von DNS
Sequenzierung oder DNS Detektion (z.B. mittels PCR, englisch polymerase Chain reaction, deutsch Polymerase-Kettenreaktion). Im Stand der Technik werden die magnetischen Partikel typischerweise durch Ringmagnete, welche einen Behälter umschliessen, im Behälter gehalten. Dadurch kann eine Lösung mit Verunreinigungen abpipettiert werden, während die magnetischen Partikel mit den gebundenen Biomolekülen im Behälter verbleiben.
Die magnetischen Partikel (magnetic beads) wurden 1995 am Whitehead Institute zu Aufreinigung von PCR Produkten entwickelt. Die magnetischen Partikel sind paramagnetisch und können z.B. aus Polystyrol bestehen, welches mit Eisen beschichtet ist. Auf dem Eisen können dann verschiedene Moleküle mit Carboxylgruppen angebracht sein. Diese Carboxylgruppen können die DNS-Moleküle reversibel binden. Dadurch werden die DNS- Moleküle immobilisiert. Verfahren mit magnetischen Partikeln umfassen meist folgende Schritte. Zuerst werden die PCR-Produkte an die magnetischen Partikel gebunden. Anschliessend werden die magnetischen Partikel mit den angehefteten PCR- Produkten von Verunreinigungen getrennt (dieser Schritt wird z.B. durch abpipettieren der Lösung vom Feststoff realisiert). Dann werden die magnetischen Partikel mit den angehefteten PCR-Produkten gewaschen. Nach dem Waschen werden die PCR-Produkte von den magnetischen Partikeln eluiert und auf eine neue Platte transferiert.
Bei vollautomatisierten Prozessen werden nach dem Einbringen des
Ausgangsmaterials in einem Isolationsprozess die notwendigen Reagenzien automatisch zur Probe pipettiert und mittels Pipettenspitze wieder entfernt.
Die Magnetpartikel-gebundenen Nukleinsäuren werden am Boden und am Rand der Kavitäten gesammelt und in Abhängigkeit der Routine durch optimiertes Auf- und Abpipettieren wiederum in Lösung gebracht. Final werden die DNS oder die RNS für eine direkte Lagerung oder weitere Anwendungen in separate Gefäße mit Deckel eluiert.
Diese Schritte erfordern also wiederholte Zugabe und Entnahme von
Flüssigkeiten bzw. Reagenzien. Dies wird typischerweise durch Pipettieren mit Einwegpipettenspitzen in Mikrotitterplatten (96 Proben oder mehr) bewerkstelligt. Diese Verfahren haben also den grossen Nachteil, dass sehr viele Pipettenspitzen verbraucht werden, da diese nach jedem Schritt gewechselt werden müssen.
Weiterhin sind aus dem Stand der Technik verschiedene Dosierverfahren bekannt. Zum Beispiel die l-DOT Technologie („Immediate Drop on Demand Technology“) von Dispendix, welche nur ein Dispensing-System ist. Dieses System zum Flüssigkeitsspenden basiert auf einer Mikrotitterplatte mit sogenannten ,,wells“(Vertiefungen), welche an deren Unterseite Öffnungen von einigen Mikrometern Durchmesser aufweisen. Die Flüssigkeit wird durch Kapillarkräfte in den Vertiefungen gehalten. Durch einen wohl-definierten Druckpuls von oben auf eine flüssigkeitsgefüllten Vertiefungen bildet sich ein Tropfen genauen Volumens, welcher durch die unteren Öffnungen der Vertiefungen ausgegeben wird. Somit können zwar genaue
Flüssigkeitsmengen im Nanoliterbereich ausgegeben werden, aber ein Dispensing-System bietet keine Möglichkeit zur Aufreinigung von
Biomolekülen. Eine Dispensing Vorrichtung ist auch aus der US 8,877,145 B2 bekannt. Bei der Vorrichtung wird eine Flüssigkeit durch eine Kapillare gehalten, welche über ein Flüssigkeitsreservoir verfügt. Durch Anbringen eines hydraulischen Drucks werden die Kapillarkräfte überwunden und eine genaue
Flüssigkeitsmenge kann ausgegeben werden. Aus der US 4,111 ,754 ist eine Vorrichtung bekannt, bei welcher in einer Kapillare eine Plastikstruktur zur Oberflächenvergrösserung angebracht ist. In dieser Kapillare wird die Flüssigkeit durch die Kapillarkräfte gehalten und Antigene oder Antikörper können an die Plastikstruktur anhaften. So können die Antigene oder Antikörper auf der Plastikoberfläche immobilisiert werden. Durch Zugabe von Waschflüssigkeit können dann die Verunreinigungen entfernt werden. Ein Nachteil dieser Vorrichtung ist, dass die Antigene und Antikörper im Inneren der Kapillare gebunden sind und nicht mit dem
Trägermaterial ausgeworfen werden können. Die Antigene und Antikörper können nur eluiert werden, indem sie aus dem Behälter gelöst also wieder mobilisiert werden. Weiter kann die Oberfläche an welche die Biomoleküle angeheftet werden nur durch Ändern der Kapillare, also durch Ändern der Vorrichtung angepasst werden und bei einer Reaktion kann der Träger für die Biomoleküle nicht zu besseren Durchmischung bewegt werden, wodurch auch die Reaktionszeit erhöht wird. Die beschriebene Vorrichtung ist ausserdem nicht kompatibel mit allen Aufreinigungsprotokollen, was die Integration der Vorrichtung in existierende Arbeitsabläufe erschwert
Die wesentlichen Nachteile des Standes der Technik sind einerseits, dass viele Pipettenspitzen verbraucht werden und andererseits, dass die
Biomoleküle an stationären Trägermaterialien befestigt werden. Somit sind die im Stand der Technik bekannten Verfahren langsam, kostenintensiv sowie wenig effizient.
Aufgabe der Erfindung ist es daher eine Vorrichtung zur Immobilisierung von Biomolekülen mittels Binden der Biomoleküle an eine feste Oberfläche, ein Verfahren zur reversiblen Immobilisierung und Aufreinigung von Biomolekülen mittels Binden der Biomoleküle an eine feste Oberfläche und einen Apparat zur automatisierten Verarbeitung von Biomolekülen mit einer Vorrichtung zur Immobilisierung von Biomolekülen bereitzustellen, welche die aus dem Stand der Technik bekannten nachteiligen Wirkungen vermeiden.
Die Aufgabe wird durch eine Vorrichtung zur reversiblen Immobilisierung von Biomolekülen mit den Merkmalen des unabhängigen Anspruchs 1 , durch ein Verfahren zur reversiblen Immobilisierung von Biomolekülen mit den
Merkmalen des unabhängigen Anspruchs 16 und durch einen Apparat zur automatisierten Verarbeitung von Biomolekülen umfassend eine Vorrichtung zur reversiblen Immobilisierung mit den Merkmalen des unabhängigen Anspruchs 18 gelöst. Die abhängigen Ansprüche beziehen sich auf besonders vorteilhafte
Ausführungsformen der Erfindung.
Erfindungsgemäss wird weiter ein Verfahren zur reversiblen Immobilisierung, insbesondere zur Aufreinigung, von Biomolekülen vorgeschlagen,
durchgeführt mit einer Vorrichtung zur reversiblen Immobilisierung, insbesondere zur Aufreinigung, von Biomolekülen. Das Verfahren kann dabei die folgenden Schritte umfassen. Magnetische Partikel und eine Flüssigkeit, insbesondere eine Flüssigkeit mit Reagenzien, werden in einem Behälter angeordnet. Biomoleküle oder Reagenzien werden an die magnetischen Partikel gebunden, insbesondere reversibel gebunden. Die magnetischen Partikel werden mit einem Magneten im Behälter fixiert. Die Flüssigkeit, insbesondere die Flüssigkeit mit Verunreinigungen, wird aus der Öffnung des Behälters durch Öffnen des Ventils, insbesondere zur Aufreinigung der Biomoleküle, entfernt. Die Biomoleküle werden, z.B. mit einem Lösemittel, von den magnetischen Partikeln abgelöst. Dann können die gelösten
Biomoleküle durch Öffnen des Ventils aus dem Behälter entfernt werden.
Im Rahmen der Erfindung kann der Behälter über eine zweite Öffnung verfügen. Über diese zweite Öffnung kann z.B. Flüssigkeit zugeführt werden, oder das Ventil gesteuert werden. Die zweite Öffnung kann auf der gegenüberliegenden Behälterseite von der Öffnung liegen. Das Ventil kann derart über die zweite Öffnung gesteuert werden, dass über die zweite Öffnung ein Druck auf die Flüssigkeit reguliert wird.
Bei der reversiblen Immobilisierung, insbesondere der Aufreinigung, mit den magnetischen Partikeln werden Behälter verwendet, deren Vertiefungen eine (oder mehrere) Öffnungen, vorzugsweise an der Unterseite, aufweisen, welche dergestalt sind, dass sie eine Ventilfunktion besitzen oder über ein Ventil steuerbar sind, sodass es möglich ist Flüssigkeit in der Vertiefung zu halten oder die Vertiefung durch die Öffnungen zu leeren, wobei die magnetischen Partikel durch den Magnet in der Vertiefung des Behälters gehalten werden. Ausserdem sind die Biomoleküle reversibel an die Partikel bindbar und die magnetischen Partikel können eine vergrösserte Oberfläche im Vergleich zur Behälterwand aufweisen und können auch mitsamt gebundener Biomoleküle aus dem Behälter entfernt werden. Weiter können Biomoleküle selektiv an die Oberfläche der magnetischen Partikel gebunden werden, sodass nur eine Sorte von Biomolekülen aus einer Flüssigkeit gebunden wird.
Die Verwendung von magnetischen Partikeln hat den grossen Vorteil, dass die magnetischen Partikel einfach durch einen Magneten (z.B. Permanent- oder Elektromagnet) beziehungsweise durch ein Magnetfeld in den
Vertiefungen des Behälters fixiert werden können, wodurch eine einfache Abtrennung der Flüssigkeit ermöglicht wird. Ausserdem ist es möglich, dass der Magnet derart beweglich am Behälter angeordnet ist, dass die
magnetischen Partikel während einem Reaktionsschritt im Behälter frei bewegbar sind und während eines Waschschritts, durch ändern der
Magnetposition im Behälter fixiert werden. Insbesondere kann der Magnet derart bewegbar sein, dass der Magnet in einer ersten Position am Behälter angeordnet ist und die magnetischen Partikel fixiert und durch Bewegung des Magneten in eine zweite Position am oder um den Behälter, die magnetischen Partikel bewegbar werden.
Im Rahmen dieser Erfindung ist unter dem Begriff Biomolekül, DNS, RNS, Nukleinsäuren, Proteine, Startsequenzen für Biomoleküle; Zellen und
Zellbestandteile, Monomere oder andere biologisch relevante Moleküle zu verstehen.
Ein Waschschritt ist im Rahmen der Erfindung ein Verfahrensschritt, bei welchem die Flüssigkeit aus den Behältern durch Betätigung des Ventils abgelassen wird und bei welchem so die Verunreinigungen von magnetischen Partikeln mit den angehafteten Biomolekülen abgetrennt werden. Zu einem Waschschritt kann auch Waschen mit einer Waschlösung gehören (Wasser oder andere). Ein Reaktionsschritt ist im Rahmen der Erfindung ein Verfahrensschritt, bei welchem die an die Magnetische Partikel gebundenen Biomoleküle
umgesetzt, an die Partikel gebunden, oder verlängert (Kettenverlängerung, z.B. PCR„Polymerase-Kettenreaktion“) werden.
Unter Reagenzien sind im Rahmen der Erfindung alle Verbindungen,
Moleküle und Flüssigkeiten zu verstehen, welche sich zur Synthese,
Aufreinigung und Immobilisierung/Mobilisierung eignen. Insbesondere
Können Reagenzien auch Biomoleküle und/oder deren Monomere sein.
Eine Verunreinigung ist im Folgenden im Allgemeinen ein Stoff welcher nicht vollständig reagiert ist beziehungsweise nicht an die magnetischen Partikel gebunden ist, das Lösungsmittel, Nebenprodukte und Kontaminationen, sowie ein Gemisch von zwei oder mehrerer der vorrangehend beschriebenen. Insbesondere können Verunreinigungen auch Reagenzien oder Biomoleküle sein.
Eine Flüssigkeit kann im Rahmen der Erfindung eine Lösung sein,
insbesondere ein Reaktionsgemisch aus Biomolekülen und/oder Reagenzien und/oder Verunreinigungen sein.
Im Rahmen der Erfindung ist unter Aufreinigung das Entfernen von
Verunreinigungen von den an den magnetischen Partikeln gebundenen Biomolekülen zu verstehen. Insbesondere kann Aufreinigung dem Entfernen der Flüssigkeit entsprechen, im speziellen dem Entfernen einer Flüssigkeit nach einem Waschschritt oder dem Entfernen der Flüssigkeit zwischen
Reaktionsschritten. Im Rahmen der Erfindung kann unter Aufreinigung auch die Normalisierung von Biomolekülen und das Selektieren von Biomolekülen verstanden werden.
Im Rahmen der Erfindung kann ein Verschlussmechanismus eine
mechanische und/oder elektrische und/oder magnetische Vorrichtung zum Verschliessen und Öffnen des Ventils sein. Es ist im Rahmen der Erfindung aber auch denkbar, dass das erfindungsgemässe Ventil eine Kapillare ist. Dann könnte ein Verschlussmechanismus ein Stoff sein, durch dessen Zugabe zur Flüssigkeit die Viskosität und/oder die Oberflächenspannung dieser Flüssigkeit geändert wird. Bei einer solchen Verschlussmechanismus /Kapillaren-Kombination würde einer Druckänderung die Verringerung der Oberflächenspannung und/oder der Viskosität entsprechen.
Im Rahmen der Erfindung kann ein Druckänderer eine Vorrichtung zum Erzeugen von Druck (Flüssigkeit- und/oder Luftdruck), wie zum Beispiel eine Pumpe, ein Gebläse oder ein Stempel sein. Ein Druckänderer kann aber auch eine Vorrichtung sein, welche eine Folie derart manipuliert, sodass ein Druck auf die Flüssigkeit ausgeübt werden kann. Ein Druckänderer kann weiterhin eine Vorrichtung zum Auseinanderziehen von einem Behälter und einer Auffangvorrichtung sein umso einen, die Flüssigkeit zurückhaltenden
Überdruck zu entlassen. Die Rückhaltekraft des Ventils kann im Rahmen der Erfindung die
Kapillarkraft einer Kapillare sein, der durch eine Folie erzeugte Unterdrück und allgemein ein Unterdrück, die Oberflächenspannung und/oder der
Viskosität einer Flüssigkeit, ein Überdruck insbesondere ein durch ein
Auffangbehälter erzeugter Überdruck, eine durch ein Filter erzeugte
Fluidbarriere, oder eine magnetisch oder mechanische Kraft eines
Schliessmechanismus.
Unter Immobilisierung ist im Rahmen der Erfindung das Binden, insbesondere das reversible Binden der Biomoleküle an die magnetischen Partikel zu verstehen. Ein magnetischer Partikel (auch„magnetic bead“) kann im Folgenden im
Allgemeinen ein Partikel im Mikrometer oder im Millimeterbereich sein. Weiter kann ein magnetischer Partikel porös sein. Ein Biomolekül kann im Folgenden im Allgemeinen über Thiolgruppen und/oder Aminogruppen und/oder
Flydroxygruppen und/oder Carboxylgruppen und/oder Carbonylgruppen und/oder Estergruppen und/oder Nitrilgruppen und/oder Amingruppen und/oder irgendwelchen anderen funktionellen Gruppen an die Oberfläche der magnetischen Partikel gebunden sein.
Ein magnetischer Partikel kann im Rahmen der Erfindung ein beschichteter Nickelpartikel sein oder irgendein anderer ferro- oder paramagnetischer Partikel. Magnetische Partikel haben typischerweise einen, Durchmesser von ungefähr 1 Mikrometer. Unter ungefähr 1 Mikrometer ist im Rahmen der Erfindung 0,5 bis 1 ,5 Mikrometer, insbesondere 0,7 bis 1 ,3 Mikrometer im speziellen 0,9 bis 1 ,1 Mikrometer zu verstehen. Ein Ventil kann im Folgenden im Allgemeinen auch ein Druckventil, ein Stromventil oder ein Rückschlagventil sein, besonders bevorzugt eine
Kapillare und/oder ein Filter und/oder eine Folie und/oder ein Auffangbehälter und/oder ein magnetisch gesteuertes Ventil. Ein Magnet kann im Rahmen der Erfindung ein Permanentmagnet und/oder ein Elektromagnet und/oder ein Supraleiter und/oder ein Ferromagnet und/oder ein Paramagnet sein. Insbesondere kann ein Magnet eine
Vorrichtung sein, welche eine Magnetkraft ausübt.
Im Rahmen der Erfindung kann ein -Messgerät ein Lumineszenz- und
Absorptionsmessgerät oder ein Fluoreszenzmessgerät oder ein UV-Vis- Messgerät oder ein Nanopore-basiertes Messgerät sein.
Die Vorteile der erfindungsgemässen Vorrichtung und des
erfindungsgemässen Verfahrens sind:
- Drastische Reduktion des Pipettenspitzenverbrauchs - Verkürzung der Prozesszeit (da Pipettierschritte entfallen)
- Ein Instrument basierend auf diesem Verfahren kann vergleichsweise platzsparend realisiert werden
- effizient und kostengünstig
- leicht automatisierbar - auch für Vorrichtungen reduzierter Grösse - erlaubt einfache Modifizierung vorhandener Maschinen
- Biomoleküle können immobilisiert aus Probenbehälter entfernt und weiterverarbeitet werden
- Biomoleküle können selektiv gebunden werden - Durch Verwendung von Partikeln wird viel grössere Oberfläche erzeugt
- Verarbeitung kleinerer Volumina
- Keine Restvolumina
- Die Vorrichtung ist einfach in existierende (manuelle, semi- automatisierte oder automatisierte) Arbeitsabläufe integrierbar (kann auf Standartverfahren zur DNS-Aufreinigung aufbauen)
- Kompatibel mit etablierten Partikel-basierten Aufreinigungsprotokollen, sodass die Vorrichtung leicht in existierende Arbeitsabläufe eingefügt werden kann
In der Praxis kann der Verschlussmechanismus ein Druckänderer sein, wobei durch den Druckänderer ein Druck auf die Flüssigkeit derart veränderbar ist, sodass durch den Druck eine Rückhaltekraft des Ventils überwindbar ist. Somit kann das Ventil geöffnet werden. Die Kontrolle des Drucks auf die Flüssigkeit ist wichtig um die Vertiefung bei Bedarf zu leeren. Der Druck kann durch eine Druckkammer die mit den oberen Teil der Vertiefungen,
beziehungsweise des Behälters verbunden ist gesteuert werden (wobei der obere Teil der Teil ist, über den Druck auf die Flüssigkeit ausgeübt werden kann). Bei Verwendung einer Multiwellplate, insbesondere einer
Mikrotitrierplatte, kann durch voneinander unabhängigen Druckkammern (z.B. pro Vertiefung bzw. pro Bereich der Multiwellplate eine Druckkammer) einzelne Bereich oder Vertiefungen unabhängig mit Druck beaufschlagt werden. Hierfür kann eine Druckkammeranordnung mit unabhängigen Druckkammern mit den oberen Teil der Vertiefung, beziehungsweise des Behälters verbunden sein. Die Druckdifferenz kann auch durch Erzeugen eines Unterdrucks an der Aussenseite der Öffnung erzeugt werden. Um die Druckdifferenz zwischen Innen- und Aussenbereich der Vertiefung bzw. des Behälters zu steuern, kann der obere Teil der Vertiefung, beziehungsweise des Behälters und/oder die untere Öffnung verschliessbar sein. Auch reversibles Verschliessen ist denkbar zur längeren Aufbewahrung von Proben oder Reagenzien im Behälter (Eventuell reversibles Verschliessen um eine Multiwellplate, insbesondere eine Mikrotitrierplatte PCR-fähig zu machen).
Bei Verwendung eines Druckänderers entspricht das Öffnen des Ventils einer Erhöhung des Drucks auf die Flüssigkeit beziehungsweise einem erzeugten Unterdrück der an der Öffnung des Behälters auf die Flüssigkeit wirkt. Das Ventil ist immer dann geschlossen wenn keine Flüssigkeit aus dem Behälter durch die Öffnung entfernbar ist (nur wenn noch Flüssigkeit im Behälter vorhanden). Ein Druckänderer kann zum Beispiel über folgende Prinzipien wirken: Hydrostatik, Kapillardruck, Fliehkraft, Gasdruck.
In Ausgestaltung der Erfindung kann der Verschlussmechanismus ein hydrostatischer Druckänderer sein, wobei durch den hydrostatischen
Druckänderer ein hydrostatischer Druck der Flüssigkeit durch Zugabe von Flüssigkeit in den Behälter derart erhöhbar ist, dass durch den
hydrostatischen Druck eine Rückhaltekraft des Ventils überwindbar ist, und somit das Ventil geöffnet werden kann. So ist es möglich einen Teil der Flüssigkeit aus dem Behälter zu entfernen, indem neue Flüssigkeit
zugegeben wird, also der Füllstand des Behälters erhöht wird. Ein hydrostatischer Druckänderer könnte somit eine Zuführvorrichtung für eine Flüssigkeit (zum Beispiel eine Waschflüssigkeit für einen Waschschritt) sein.
In der Praxis kann durch den Verschlussmechanismus eine Polarität und/oder Viskosität und/oder Oberflächenspannung der Flüssigkeit im Behälter veränderbar sein, sodass eine Rückhaltekraft des Ventils überwindbar ist, und somit das Ventil geöffnet werden kann. Die Polarität und/oder Viskosität und/oder Oberflächenspannung der Flüssigkeit können zum Beispiel durch Zugabe von anderen Flüssigkeiten oder Substanzen geändert werden, oder durch Änderung des pFI-Wertes. Somit könnte der Verschlussmechanismus als Zuführeinrichtung für eine Substanz (zum Beispiel Tenside für
Oberflächenspannung; unpolare oder polare Flüssigkeiten; Feststoffe) oder Flüssigkeit ausgestaltet sein. Für eine Änderung der Viskosität wäre auch eine Fleizvorrichtung als Verschlussmechanismus möglich.
In Ausgestaltung der Erfindung kann der Druckänderer den Luftdruck über der Flüssigkeit und/oder an der Öffnung, insbesondere eine an der Unterseite des Behälters angeordnete Öffnung, ändern. So kann das Erzeugen eines
Unterdrucks an der Öffnung, zum Abfliessen der Flüssigkeit führen.
Ausserdem kann eine Erhöhung des Luftdrucks über der Flüssigkeit zum Abfliessen der Flüssigkeit führen. Somit würde durch Erzeugen des
Unterdrucks an der Öffnung und durch Erhöhung des Luftdrucks über der Flüssigkeit, das Ventil geöffnet werden. Mit„ Luftdruck über der Flüssigkeit“ ist der Luftdruck gemeint welcher derart auch die Flüssigkeit einwirkt, dass die Flüssigkeit aus dem Behälter entfernt werden kann.
In Ausgestaltung der Erfindung kann das Ventil der Vorrichtung an der Öffnung angeordnet sein. Das Ventil kann auch die Öffnung sein, wenn z.B. das Ventil eine Kapillare ist, ist die Öffnung der Kapillare auch die Öffnung zum Abführen der Flüssigkeit. Insbesondere kann das Ventil und/oder die Öffnung an der Unterseite des Behälters angeordnet sein.
In der Praxis kann eine Vertiefung der Vorrichtung mehrere Ventile und/oder Öffnungen umfassen. So könnten die Öffnungen auch als eine Art Sieb fungieren, durch welche die magnetischen Partikel nicht durchpassen, aber die Flüssigkeit abfliessen kann. Solch ein Aufbau ist auch möglich wenn mehrere Kapillaren an einer Vertiefung als Ventile vorhanden sind. In Ausgestaltung der Erfindung kann das Ventil der Vorrichtung als eine Kapillare oder als ein Filter oder als eine Folie oder als ein Auffangbehälter ausgeformt sein.
Wenn die Ventilfunktion so realisiert wird, dass die untere Öffnung als dünne Kapillare ausgeformt ist, ist der Kapillardruck ausreichend um eine spontane Entleerung der Kavitäten zu verhindern. Die Flüssigkeit kann nun entfernt werden, indem ein Druckimpuls (durch den Druckänderer) von oben auf die Flüssigkeit gegeben wird, sodass die Flüssigkeit durch die Öffnung entfernt wird (Öffnen des Ventils). Wenn das Ventil als Filter ausgeformt ist, wird die Flüssigkeit durch die Fluidbarriere des Filtermaterials zurückgehalten. Die
Flüssigkeit kann auch hier entfernt werden, indem ein Druckimpuls (durch den Druckänderer) von oben auf die Flüssigkeit gegeben wird, sodass die
Flüssigkeit durch den Filter gepresst wird (Öffnen des Ventils) und durch die Öffnung entfernt wird. Ist das Ventil eine Folie so kann die Folie derart über dem Behälter angeordnet sein, dass ein Gasvolumen zwischen Folie und Flüssigkeit eingeschlossen wird. Nun kann durch Manipulation der Folie (z.B. durch Bewegung der Folie durch einen vom Druckänderer erzeugten Druck) das Gasvolumen zwischen Flüssigkeit und Folie derart komprimiert werden das ein Druck auf die Flüssigkeit ausgeübt wird, der die Flüssigkeit aus der Öffnung presst (Öffnen des Ventils).
In der Praxis kann die Öffnung der Vorrichtung mit einem auf der Flüssigkeit treibbaren Kügelchen verschliessbar sein. So gibt es die Möglichkeit um die Flüssigkeit über die Öffnung zu leeren und danach die Öffnung der Vertiefung zu verschliessen.
In Ausführung der Erfindung ist der Behälter der Vorrichtung eine
Multiwellplate, insbesondere eine Mikrotitrierplatte, mit Vertiefungen.
In Ausgestaltung der Erfindung kann der Druckänderer der Vorrichtung eine Druckkammeranordnung sein, sodass jede Vertiefung einzeln mit Druck beaufschlagbar ist.
Am Ventil oder im Behälter kann ein Messgerät angeordnet sein, sodass am hängenden Tropfen oder bei der Flüssigkeit im Behälter eine Messung durchführbar ist.
In Ausgestaltung der Erfindung kann die Vorrichtung einen Mischer umfassen. Der Mischer kann ein veränderbares Magnetfeld und/oder ein magnetisch bewegbarer Festkörper sein. Ein magnetisch bewegbarer Festkörper kann hierbei ein Rührstab und/oder Magnetrührer sein, welcher durch ein
Magnetfeld in Bewegung gesetzt wird. Bei Verwendung von magnetischen Partikeln kann durch ein veränderbares Magnetfeld eine Bewegung der magnetischen Partikel hervorgerufen werden, wodurch auch ein
Durchmischen zustande kommt.
In der Praxis können auch Vorrichtungen in Reihe geschaltet sein. In der Praxis können die Vorrichtung und das Verfahren für Post-Ligation- Aufreinigung verwendet werden. Erfindungsgemäss wird weiter ein Verfahren zur reversiblen Immobilisierung, insbesondere zur Aufreinigung, von
Biomolekülen vorgeschlagen, durchgeführt mit einer Vorrichtung zur reversiblen Immobilisierung, insbesondere zur Aufreinigung, von
Biomolekülen. Das Verfahren kann dabei die folgenden Schritte umfassen. Magnetische Partikel und eine Flüssigkeit mit Reagenzien werden in einem Behälter angeordnet. Biomoleküle oder Reagenzien zur Synthese von
Biomolekülen werden an die magnetischen Partikel gebunden, insbesondere reversibel gebunden. Die magnetischen Partikel werden mit einem Magneten im Behälter fixiert. Die Flüssigkeit mit Verunreinigungen wird aus der Öffnung des Behälters durch Öffnen des Ventils zur Aufreinigung der Biomoleküle entfernt. Die Biomoleküle werden, z.B. mit einem Lösemittel, von den magnetischen Partikeln abgelöst. Dann können die gelösten Biomoleküle durch Öffnen des Ventils aus dem Behälter entfernt werden.
Das Verfahren kann selbstverständlich multiple Schritte umfassen, in welchen Flüssigkeiten zu- und abgeführt werden müssen, sowie Verunreinigungen abgetrennt werden oder in welchen die Biomoleküle von den magnetischen Partikeln abgelöst werden. So können die aufgereinigten Biomoleküle dispensiert werden, indem sie durch die Öffnung der Vorrichtung, nach Lösen von den magnetischen Partikeln, abgeführt werden.
Wenn die magnetischen Partikel mit einem Magneten im Behälter fixiert sind kann anschliessend die Flüssigkeit durch eine Druckänderung (abhängig von der Ventilart) entfernt werden. Solch ein Ablauf kann nach Abschliessen eines Reaktionsschrittes sinnvoll sein, um entweder einen weiteren Reaktionsschritt durchzuführen oder in einem Waschschritt die Verunreinigungen
abzutrennen. Erfindungsgemäss wird weiter ein Apparat zur automatisierten Verarbeitung von Biomolekülen mit eine Vorrichtung zur reversiblen Immobilisierung, insbesondere zur Aufreinigung von Biomolekülen vorgeschlagen.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher erläutert.
Fig. 1 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur reversiblen
Immobilisierung und Aufreinigung von Biomolekülen
Fig. 2 eine schematische Darstellung eines weiteren
Ausführungsbeispiels einer Vorrichtung zur reversiblen
Immobilisierung und Aufreinigung von Biomolekülen
Fig. 3 eine schematische Darstellung eines weiteren
Ausführungsbeispiels einer Vorrichtung zur reversiblen
Immobilisierung und Aufreinigung von Biomolekülen Fig. 4 ein erstes Ausführungsbeispiel eines Ventils
Fig. 5 ein zweites Ausführungsbeispiel eines Ventils
Fig. 6 ein drittes Ausführungsbeispiel eines Ventils
Fig. 7 eine schematische Darstellung eines weiteren
Ausführungsbeispiels einer Vorrichtung zur reversiblen
Immobilisierung und Aufreinigung von Biomolekülen
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung einer Vorrichtung 1 zur reversiblen Immobilisierung und Aufreinigung von Biomolekülen. Hierbei ist der Behälter als Multiwellplate 21 ausgeführt. Die Vertiefungen 22 der Multiwellplate 21 können mit einer Flüssigkeit 6 befüllt werden. Bei diesem Ausführungsbeispiel sind die magnetischen Partikel 3 in den Vertiefungen 22 der Multiwellplate 21 angeordnet und als eine Ansammlung von magnetischen Partikeln
ausgestaltet. In einem Verfahren zur Verarbeitung von Biomolekülen würde sich eine Flüssigkeit 6 mit den zu verarbeitenden Biomolekülen samt dafür benötigten Reagenzien in den Vertiefungen 22 der Multiwellplate 21 befinden. Die Biomoleküle, welche in der Flüssigkeit 6 befindlich sind, können an die magnetischen Partikel 3 reversibel angeheftet werden (also immobilisiert werden). Die gewünschten Biomoleküle können selektiv an die magnetischen Partikel gebunden werden. Die ungebundenen Verunreinigungen werden dann über die Öffnung entfernt. Ausserdem können die Biomoleküle z.B. an der Oberfläche der magnetischen Partikel 3 verlängert werden (z.B. durch PCR). Nach einer durchgeführten Reaktion müssen während der Reaktion entstandene oder nicht vollständig abreagierte Verunreinigungen, welche sich in der Flüssigkeit 6 befinden, entfernt werden. Hierfür kann durch eine von einem Druckänderer, welcher hier als Druckkammeranordnung 41 ausgeführt ist (hier Vorrichtung welche einen Druck p erzeugt), erzeugten Druck p die Rückhaltekraft des Ventils 20 überwunden werden, indem ein Druck auf die in den Vertiefungen befindliche Flüssigkeit 6 (hier nicht gezeigt) ausgeübt wird. Dadurch kann die Flüssigkeit 6 aus der Multiwellplate 21 entfernt werden, während die Biomoleküle an der Oberfläche der magnetischen Partikel 3 verbleiben. Die magnetischen Partikel werden durch einen Magneten 5 in der Vertiefung 22 der Multiwellplate 21 gehalten.
Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung eines weiteren
Ausführungsbeispiels einer Vorrichtung 1 zur reversiblen Immobilisierung und Aufreinigung von Biomolekülen. Bei dieser Vorrichtung 1 ist im Behälter 2, 21 in der Vertiefung 22 ein treibbares Kügelchen 7 angebracht. Im Zustand A, bei welchem keine Flüssigkeit 6 im Behälter 2, 21 ist ,verschliesst die schwimmende Kugel 7 die Öffnung 23 und das Ventil 20. Das Ventil 20 kann z.B. eine Kapillare sein, bei welcher die Flüssigkeit 6 durch die Kapillarkräfte gehalten wird.
In dem Fall, dass der Behälter 2, 21 als Multiwellplate 21 ausgebildet ist, bei welcher mehrere Vertiefungen 22 nebeneinander angeordnet sind, kann somit beim Leeren der Vertiefungen 22 durch Beaufschlagung mit einem vom Druckänderer (hier Vorrichtung welche einen Druck p erzeugt) erzeugten Druck p (hier nicht gezeigt), ein Druckabfall verhindert werden. Der
Druckabfall kommt zu Stande, wenn eine Vertiefung der Multiwellplate 21 bereits leer ist, also sich im Zustand A befindet, während andere Vertiefungen 22 der Multiwellplate 21 noch mit Flüssigkeit 6 gefüllt sind, sich also im
Zustand B befinden. Der Druckabfall kann verhindert werden, indem die Öffnung 23 einer Vertiefung 22, welche sich im Zustand A befindet, durch das treibbare Kügelchen 7 verschlossen wird.
Im Zustand B, bei welchem die Vertiefung 22 mit Flüssigkeit gefüllt ist, treibt das treibbare Kügelchen 7 an der Oberfläche der Flüssigkeit 6 und erlaubt somit ein Entfernen der Flüssigkeit 6 aus der Öffnung 23 durch
Beaufschlagung mit einem Druck p (hier nicht gezeigt). Im Zustand B wird die Flüssigkeit 6 durch das Ventil 20 in der Vertiefung 22 des Behälters 2, 21 gehalten und kann nicht durch die Öffnung 23 abfliessen. Erst beim Öffnen des Ventils 20 kann die Flüssigkeit 6 aus der Öffnung 23 abfliessen.
Ein treibbares Kügelchen kann z.B. bei einer Vorrichtung nach Fig. 1 verwendet werden.
Fig. 3 zeigt eine schematische Darstellung eines weiteren
Ausführungsbeispiels einer Vorrichtung zur reversiblen Immobilisierung und Aufreinigung von Biomolekülen. Bei diesem Ausführungsbeispiel befindet sich im Behälter 2, 21 eine Flüssigkeit 6 mit magnetischen Partikeln 3. Die
Flüssigkeit 6 wird durch ein Ventil 20 in Form einer Kapillare 201
zurückgehalten. Weiterhin ist in der Vertiefung 22 des Behälters 2, 21 ein Rührstab 81 befindlich. Dieser Rührstab 81 ist dazu geeignet die Flüssigkeit 6 derart in Bewegung zu versetzten, dass die Flüssigkeit 6 bei einem
Reaktionsschritt durchmischt wird. Die Flüssigkeit 6 kann bei einem
Waschschritt durch Beaufschlagung mit einem Druck p (hier nicht gezeigt) schneller abfliessen, wenn die Flüssigkeit 6 durch den Rührstab 81 in
Bewegung gebracht wird.
Der in Fig. 3 gezeigte Rührstab 81 kann selbstverständlich mit jedem beliebigen Ventil 20 kombiniert werden und der Rührstab 81 kann auch als ein anderer magnetisch bewegbarer Festkörper ausgeformt sein.
Fig. 4 zeigt ein erstes Ausführungsbeispiel eines Ventils. Bei diesem Behälter 2, 21 ist das Ventil als Folie 203 ausgeführt. Die Öffnung 23 muss keine Kapillare sein, sondern kann einfach als Kanal ausgestaltet sein. Durch die Folie 203 kann die Flüssigkeit 6 nicht durch die Öffnung 23 aus der Vertiefung 22 des Behälters 2, 21 abfliessen, da die Flüssigkeit durch einen Unterdrück im Behälter gehalten wird. Erst beim Bewegen der Folie 203, wenn sich das Gasvolumen zwischen Folie und Flüssigkeit 6 komprimiert, also ein Druck P3 auf die Flüssigkeit ausgeübt wird, kann die Flüssigkeit 6 durch die Öffnung 23 abfliessen. Die Folie 203 könnte durch einen Druckänderer, derart bewegt werden, sodass die Folie 203 durch einen Druck (hier nicht gezeigt) auf die Folie von der flüssigkeitsabgewandten Seite, ein Senken der Folie 203 in Richtung der Flüssigkeit 6 bewirkt. In einem erfindungsgemässen Verfahren könnte in einem Waschschritt die magnetische Partikel 3 durch einen
Magneten 5 in der Vertiefung 22 gehalten werden, während die Flüssigkeit 6 samt Verunreinigungen beim Bewegen der Folie 203 abfliessen kann
(magnetische Partikel 3 und Magnet 5 siehe Fig. 1 ). Ein Ventil nach Fig. 4 kann selbstverständlich mit einer Vorrichtung 1 nach Fig. 1 , sowie einem treibbaren Kügelchen 7 nach Fig. 2 und einem Rührstab 81 nach Fig 3 kombiniert werden.
Fig. 5 zeigt ein zweites Ausführungsbeispiel eines Ventils. Bei dem Behälter 2, 21 ist das Ventil als Auffangbehälter 204 ausgeführt. Im Auffangbehälter 204 wird derart ein Überdruck P1 erzeugt, dass die Flüssigkeit 6 nicht durch die Öffnung 23 aus der Vertiefung 22 des Behälters 2, 21 abfliessen kann. Erst beim Auseinanderziehen des Behälters 2, 21 und des Auffangbehälters 204, wenn sich der Überdruck P1 an den Umgebungsdruck P2 anpasst, kann die Flüssigkeit 6 durch die Öffnung 23 abfliessen. In einem
erfindungsgemässen Verfahren könnte in einem Waschschritt die
magnetische Partikel 3 durch einen Magneten 5 in der Vertiefung 22 gehalten werden, während die Flüssigkeit 6 samt Verunreinigungen beim
Auseinanderziehen des Behälters 2, 21 und des Auffangbehälters 204 abfliessen kann (magnetische Partikel 3 und Magnet 5 siehe Fig. 1 ). In diesem Ausführungsbeispiel würde ein Druckänderer einer Vorrichtung zum Auseinanderziehen des Behälters 2, 21 und des Auffangbehälters 204 entsprechen, da so der Überdruck P1 auf den Umgebungsdruck P2 geändert wird, wodurch die Flüssigkeit 6 abfliessen kann. Ein Ventil nach Fig. 5 kann selbstverständlich mit einer Vorrichtung 1 nach Fig. 1 , sowie einem Rührstab 81 nach Fig 3 kombiniert werden. Ausserdem ist es möglich, dass eine Druckänderung auch anders impliziert wird. Zum Beispiel kann die
Druckänderung durch eine verschliessbare Öffnung, welche am
Auffangbehälter 204 angeordnet ist, zustande kommen. Fig. 6 zeigt ein drittes Ausführungsbeispiel eines Ventils. Bei dem Behälter 2, 21 ist das Ventil als Filter 202 ausgeführt. Durch den Filter 202 wird die Flüssigkeit 6
zurückgehalten, sodass die Flüssigkeit 6 nicht durch die Öffnung 23 aus der Vertiefung 22 des Behälters 2, 21 abfliessen kann. Erst beim Erzeugen eines Drucks P (hier nicht gezeigt) durch einen Druckänderer (hier eher ein
Druckerzeuger), welcher die Flüssigkeit 6 derart beaufschlagt, dass die Flüssigkeit 6 durch den Filter 202 durchgepresst wird, kann die Flüssigkeit 6 durch die Öffnung 23 abfliessen. In einem erfindungsgemässen Verfahren könnte so in einem Waschschritt die magnetischen Partikel mit einem
Magneten in der Vertiefung 22 gehalten werden, während die Flüssigkeit 6 samt Verunreinigungen beim Beaufschlagen mit Druck abfliessen kann. In diesem Ausführungsbeispiel würde ein Druckänderer einer Vorrichtung zum Erzeugen von Druck entsprechen, da so die Rückhaltekraft des Filters 202 überwunden wird, wodurch die Flüssigkeit 6 abfliessen kann. Ein Ventil nach Fig. 6 kann selbstverständlich mit einer Vorrichtung 1 nach Fig. 1 , sowie einem Rührstab 81 nach Fig 3 kombiniert werden.
Fig. 7 zeigt eine schematische Darstellung eines weiteren
Ausführungsbeispiels einer Vorrichtung zur reversiblen Immobilisierung und Aufreinigung von Biomolekülen. Dieses Ausführungsbeispiel zeigt eine
Reihenschaltung mehrerer Vorrichtungen. So kann eine Flüssigkeit 6 von einem oberen Behälter 2, 21 zu einem unteren Behälter 2, 21 überführt werden, indem durch Betätigung des Ventils 20 die Flüssigkeit von einer Öffnung 23 in den nächsten Behälter 2, 21 Übertritt. Die Ventile 20 der verschiedenen Behälter können alle gleich sein oder alle unterschiedlich oder teilweise unterschiedlich. So könnte z.B. ein erstes Ventil 205 eine Kapillare 201 sein, während ein zweites Ventil 206 ein Filter ist. Es wäre aber auch denkbar, dass ein erstes Ventil 205 eine erste Kapillare 2013 ist, während ein zweites Ventil 206 eine zweite Kapillare 2012 ist. So können die erste und die zweite Kapillare 2012, 2013 unterschiedlich lang und/oder dick sein, wodurch in jedem Behälter 2, 21 eine andere Verweilzeit der Flüssigkeit 6 erreicht wird. Eine Reihenschaltung nach Fig. 7 kann selbstverständlich mit einer
Vorrichtung 1 nach Fig. 1 , sowie einem treibbaren Kügelchen 7 nach Fig. 2 und einem Rührstab 81 nach Fig 3 kombiniert werden. Ausserdem können bei einer Reihenschaltung verschiedene Verfahrensschritte in jeder Ebene der Vorrichtung vorgenommen werden.

Claims

Patentansprüche
1. Vorrichtung (1 ) zur reversiblen Immobilisierung von Biomolekülen, wobei die Vorrichtung (1 ) einen mit einer Flüssigkeit mit Biomolekülen befüllbaren Behälter (2, 21 ) mit einer Öffnung (23) und einem Ventil
(20) umfasst, wobei das Ventil (20) für das kontrollierbare Abfliessen der Flüssigkeit (6) durch einen Verschlussmechanismus geöffnet und geschlossen werden kann,
dadurch gekennzeichnet, dass
magnetische Partikel (3), an welchen die Biomoleküle immobilisierbar sind, insbesondere reversibel immobilisierbar sind, frei bewegbar im Behälter (2, 21 ) angeordnet werden können, und am Behälter (2, 21 ) ein Magnet (5), für das Fixieren der magnetischen Partikel (3) im
Behälter (2, 21 ), angeordnet ist, wobei die Flüssigkeit (6) im offenen Zustand des Ventils (20), durch die Öffnung, (23) aus dem Behälter (2,
21 ) entfernbar ist.
2. Vorrichtung (1 ) nach Anspruch 1 , wobei der Verschlussmechanismus ein Druckänderer ist, und durch den Druckänderer ein Druck (P, P1 ) auf die Flüssigkeit (6) derart veränderbar ist, dass durch den Druck
(P,P1 ) eine Rückhaltekraft des Ventils (20) überwindbar ist, und somit das Ventil (20) geöffnet werden kann.
3. Vorrichtung (1 ) nach Anspruch 1 , wobei durch den
Verschlussmechanismus eine Polarität und/oder Viskosität und/oder
Oberflächenspannung der Flüssigkeit (6) im Behälter veränderbar ist, sodass eine Rückhaltekraft des Ventils (20) überwindbar ist, und somit das Ventil (20) geöffnet werden kann.
4. Vorrichtung (1 ) nach Anspruch 2, wobei der Druckänderer ein hydrostatischer Druckänderer ist, wobei durch den hydrostatischen Druckänderer ein hydrostatischer Druck der Flüssigkeit (6) durch Zugabe von Flüssigkeit in den Behälter (2, 21 ) derart erhöhbar ist, dass durch den hydrostatischen Druck eine Rückhaltekraft des Ventils (20) überwindbar ist, und somit das Ventil (20) geöffnet werden kann.
5. Vorrichtung (1 ) nach Anspruch 2, wobei der Druckänderer den
Luftdruck über der Flüssigkeit oder an der Öffnung, insbesondere eine an der Unterseite des Behälters angeordnete Öffnung, ändert
6. Vorrichtung (1 ) nach einem der vorrangehenden Ansprüche, wobei das Ventil (20) an der Öffnung (23) angeordnet ist. 7. Vorrichtung (1 ) nach einem der vorrangehenden Ansprüche, wobei das
Ventil (20) als eine Kapillare (201 ) oder als ein Filter (202) oder als eine Folie (203) oder als ein Auffangbehälter (204) ausgeformt ist.
8. Vorrichtung (1 ) nach einem der vorrangehenden Ansprüche, wobei die Öffnung (23) mit einem auf der Flüssigkeit (6) treibbaren Kügelchen (7) verschliessbar ist.
9. Vorrichtung (1 ) nach einem der vorrangehenden Ansprüche, wobei an der Öffnung (23) oder im Behälter (2, 21 ) ein Messgerät angeordnet ist, sodass an einem an der Öffnung (23) hängenden Tropfen respektive im Behälter eine Messung durchführbar ist.
10. Vorrichtung (1 ) nach einem der vorrangehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung (1 ) einen Mischer (8, 81 ) umfasst.
11. Vorrichtung (1 ) nach Anspruch 9, wobei der Mischer (8, 81 ) ein veränderbares Magnetfeld und/oder ein magnetisch bewegbarer Festkörper (81 ) ist.
12. Vorrichtung (1 ) nach einem der vorrangehenden Ansprüche, wobei der Behälter (2, 21 ) eine Multiwellplate (21 ), insbesondere eine
Mikrotitrierplatte, mit Vertiefungen (22) ist. 13. Vorrichtung (1 ) nach Anspruch 12, wobei die Vertiefungen (22)
mehrere Ventile (20) und/oder Öffnungen (23) umfassen.
14. Vorrichtung (1 ) nach Anspruch 13, wobei der Druckänderer eine
Druckkammeranordnung (41 ) ist, sodass eine Vertiefung (22) einzeln mit Druck (P,P1 ) beaufschlagbar ist.
15. Vorrichtung (1 ) nach einem der vorrangehenden Ansprüche, wobei mehrere Vorrichtungen (1 ) in Reihe geschaltet sind. 16. Verfahren zur reversiblen Immobilisierung von Biomolekülen,
dadurch gekennzeichnet, dass eine Vorrichtung (1 ) nach einem der Ansprüche 1-15 verwendet wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16,
dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfasst
a) Anordnen von magnetischen Partikeln (5) und einer Flüssigkeit (6) mit Biomolekülen in einem Behälter (2, 21 )
b) Binden, insbesondere reversibles binden, von Biomoleküle an den magnetischen Partikeln (3) c) Fixieren der magnetischen Partikel (3) mit einem Magneten (5) im Behälter (2, 21 )
d) Entfernen der Flüssigkeit (6) aus der Öffnung (23) des Behälters (2, 21 ) durch Öffnen des Ventils (20)
e) Lösen der Biomoleküle von den magnetischen Partikeln (3) f) Entfernen der gelösten Biomoleküle durch Öffnen des Ventils
18. Apparat zur automatisierten Verarbeitung von Biomolekülen umfassend eine Vorrichtung (1 ) nach einem der Ansprüche 1 bis 15.
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