DE19723469A1 - Reaktor für mikrochemische bzw. mikrobiologische Synthesen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft einen Reaktor für mikrochemische bzw. mikrobiologische Synthesen gemäß der Gattung der Patentansprüche. Sie ist insbesondere zur Anwendung auf dem Gebiet der hochparallelen chemischen Synthese bestimmt.

Es sind relativ großlumige Reaktionsgefäße zur Durchführung mikrochemischer Reaktionen bekannt, die aus einem Behälter mit mindestens einer Öffnung bestehen, wobei für Festphasenreaktionen die Öffnungen mit Filtern oder Fritten abgedeckt sein können. Diese dienen der Vereinigung mehrerer Stoffe in fester, gelöster oder flüssiger Form. Zum Durchführen von Reaktionen mit liquiden Komponenten werden die flüssigen Substanzen mit Hilfe einer Pipette in das Reaktionsgefäß gefüllt.

In den letzten Jahren hat sich eine Entwicklung zur Vereinfachung des Laborbetriebs durchgesetzt; sie besteht in der Immobilisierung eines Reaktionspartners. Aufwendige Präzipitations- oder Extraktionsarbeiten sind damit überflüssig. Das Durchführen der Festphasenreaktionen erfordert nur noch die Zufuhr von Lösungen und anschließende Filtrations- oder Absaugschritte, um die in Lösung befindlichen Reaktionspartner wieder zu entfernen. Das Verfahren ist relativ leicht zu automatisieren und eignet sich zur Bewältigung großer Probenzahlen im ml-Volumenbereich. Es wird heutzutage regelmäßig eingesetzt bei biochemischen oder chemischen Umsetzungen wie der Peptidsynthese, der Oligonukleotidsynthese, der kombinatorischen Chemie, Bioassays wie ELISA oder RIA und der Chromatographie im "batch"-Verfahren, wie dem Ionenaustausch bei der DNA-Aufreinigung.

Dabei werden üblicherweise die Flüssigkeiten mittels Pipetten dosiert. Die Festphasen befinden sich in einem Gefäß mit oder ohne Filterboden. Aus der Produkt-Information AMS 422 der Firma Abimed (Postfach 11 11, 40736 Langenfeld) ist ein Einweg-Durchflußreaktor mit eingelegter Fritte bekannt. Dieses System ist nicht für eine Parallelisierung und Automatisierung geeignet. Befindet sich die Festphase im Gefäß mit Filterboden, werden Zentrifugalkräfte oder ein Vakuum angelegt, um die Lösungen von der Festphase zu trennen. Hierbei werden neben den Filtern auch Vorrichtungen zum Auffangen der Flüssigkeiten benötigt. Befindet sich die Festphase im Gefäß ohne Filterboden, werden die Lösungen durch Pipettierschritte entfernt, wobei dafür Sorge zu tragen ist, daß die Festphasen nicht in die Pipetten gelangen. Diese Problematik führte beispielsweise zu der Entwicklung von Perlen mit magnetisierbarem Kern, welche sich durch das Anlegen eines Magnetfeldes zur Gefaßwandung ziehen lassen und somit weniger gefährdet sind, durch den Pipettierschritt erfaßt zu werden.

Bekanntlich erlauben hochparallele chemische Synthesen die Darstellung von Substanzbibliotheken in vergleichsweise sehr kurzer Zeit. Solche Synthesen werden üblicherweise an einem festen Trägermaterial durchgeführt. Dies erleichtert die Aufarbeitung der Proben und das Verschieben des Reaktionsgleichgewichtes. Das Trägermaterial für die Synthese besteht gemeinhin aus chemisch modifizierten Polymerharzkugeln, Polymerharzblöcken oder -schichten, oder Glasperlen bzw. -platten.

Zwei Typen von hochparallelen Syntheseverfahren sind zu unterscheiden: die Synthese in der Mischung und die Synthese von vereinzelten Proben. Mischungsverfahren haben den Nachteil, daß die Information über die Identität der Substanzen bzw. deren Syntheseprotokolle verloren geht und durch Resynthese und/oder aufwendige biologische Testverfahren wieder beschafft werden muß (Dekonvolutionsverfahren).

Einen Ausweg bietet die "mix-and-split" Synthese an. Hierbei werden Substanzbibliotheken mit dem Ziel erzeugt, pro Polymerharzkugel nur eine Substanz darzustellen. Die Identität der Substanz kann abgeleitet werden, wenn genügend Material für eine Analyse erhalten wird. Da die aus einer Perle zu gewinnenden Substanzmengen aber oft sehr gering sind, bzw. für den Bioassay benötigt werden, wurden Kodierungsverfahren entwickelt; in einer Parallelsynthese wird dabei die Reaktionsgeschichte der Perle chemisch auf dem Polymerharz festgehalten.

Demgegenüber stehen Methoden, bei welchen alle Bestandteile des Substanzpools in von vornherein räumlich getrennten Bereichen synthetisiert werden. Das Festphasenträgermaterial wird in einer vorgegebenen zweidimensionalen Anordnung ("array") vorgelegt; das jeweilige Reaktionsprotokoll bzw. die entsprechende Zielstruktur ist üblicherweise durch eine xy-Koordinate definiert. Ein sehr illustratives Beispiel wurde von Fodor et al durch den Aufsatz "Light-Directed, Spatially Adressable Parallel Chemical Synthesis" Sience 251 (1991) pp. 767-773 veröffentlicht. Darin werden mit lichtempfindlichen Schutzgruppen beschichtete Glasträger durch photolithographische Prozesse in tausend mikroskopisch kleine Substanzfelder aufgegliedert.

Andere Verfahren benutzen ebenfalls Glasplatten, oder mit Perlen gefüllte mikrokompartimentierte Siliziumscheiben, "Chips".

Die Synthese auf mit Polymerharz beschichteten Stäben (Pin- Technologie, siehe "Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single ainino acid" H. M. Geysen et al, Proc. Nafl. Acad. Sci. USA 81 (1984) pp. 3998-4002) hat den Vorteil, mit dem weit verbreiteten 96-Kammern-Mikrotiterplattenformat kompatibel zu sein. Die in der Festphasensynthese bereits erprobten und bekannten Trägermaterialien können mit der kommerziellen Variante der Pin- Technik nicht prozessiert werden. Jedoch sind auch schon Pins beschrieben worden, welche mit Glas- oder Polymerperlen gefüllt werden können ("Diversomers: An approach to nonpeptide, nonoligomeric chemical diversity" S. Hobbs De Witt et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) pp. 6909-6913). In all diesen Fällen wirkt sich für die angestrebte Parallelisierung und Automatisierung der Arbeitsschritte ungünstig aus, daß die Pins, Chips oder Röhrchen nur Träger für die feste Phase darstellen; die Flüssigkeitszufuhr ist nicht im System integriert und muß separat durch Eintauchen oder Spülen erfolgen, siehe den Übersichtsartikel "Multiple Peptide Synthesis Methods and Their Applications" G. Jung et al, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 31 (1992) pp 367-383, auch in Angew. Chem. 104 (1992) S. 375 ff.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, einen einfach aufgebauten Reaktor für mikrochemische bzw. mikrobiologische Synthesen zu schaffen, der im Laborbetrieb eine erhebliche Vereinfachung und Beschleunigung der Syntheseschritte sowie eine Verringerung des instrumentellen Aufwandes bei der Synthese ermöglicht und der darüber hinaus für die Laborautomatisierung und die Prozessierung großer Probenzahlen im einem Volumenbereich von 0,0001 bis 100 000 ml besonders geeignet ist.

Gemäß der Erfindung wird diese Aufgabe durch die kennzeichnenden Merkmale des ersten Patentanspruchs gelöst. Die vorliegende Erfindung beinhaltet einen Reaktor, der eine Vereinigung einer Kolbenhubspritze und eines auch relativ großlumig ausführbaren Festphasenreaktions­ gefäßes darstellt.

Es wurde gefunden, daß die Vereinigung und spezielle Ausbildung zweier an sich bekannter Baugruppen in einem Element wesentlich zur Vereinfachung und Beschleunigung von Syntheseprozeßschritten ermöglicht. Eine gesonderte definierte Reaktionsflüssigkeitszufuhr, und weitere nach dem Stand der Technik übliche Baugruppen, wie Zentrifugen, Auffanggefäße, Filter und Absaug- oder Niederschlagsvorrichtungen und deren Bedienung werden durch die Erfindung entbehrlich.

Ein weiterer Vorteil besteht in der verkürzten Reaktionszeit durch die bessere Durchmischung der Reaktanden. Bei der vorgesehenen baulichen Einheit die flüssige Phase beliebig oft aufgenommen und wieder abgegeben werden, die gelösten Reagenzien werden dabei auf besonders effiziente Weise an der Festphase vorbeigeführt. Die Reaktionen sind dadurch wesentlich schneller zum Reaktionsgleichgewicht bei gleichzeitig hohen Ausbeuten zu bringen.

Herkömmliche Filtrations- oder Absaugverfahren lassen dies nicht zu und müssen entweder wesentlich längere Inkubationszeiten in Kauf nehmen oder Maßnahmen ergreifen, um die Festphase im Reaktionsgefäß durch Gasströme, mechanisches Schütteln oder Ultraschall zu bewegen, bzw. in einem Ofen oder Temperierbad oder -block zu erwärmen.

Die Erfindung umfaßt jede Kombination aus chemisch oder biologisch modifizierten Oberflächen innerhalb des Reaktionsgefäßes. Die modifizierte Oberfläche kann Bestandteil eines Bereichs der Reaktorinnenoberfläche sein, oder ein Reaktorbereich kann als Behältnis für Polymerharzperlen oder Glaspartikel dienen. Die Erfindung kann auch Anwendung finden für eine homogene chemische und enzymatische Synthese, sowie für Immunoassays.

Die Erfindung wird nachstehend an Hand schematischer, nicht maßstäblicher Zeichnungen von drei Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine erste Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Reaktors,

Fig. 2 eine zweite Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Reaktors und

Fig. 3 eine modifizierte Ausführungsform nach Fig. 2.

In Fig. 1 ist ein erfindungsgemäßer Reaktor 1 dargestellt, der einseitig einen Aus- bzw. Einlaß 2 aufweist. Der Aus/Einlaß 2 seinerseits ist mit einem Luer-Lock-Anschluß 7 zur Aufnahme einer nicht dargestellten Kapillarnadel versehen. Weiterhin ist dem Aus/Einlaß 2 ein mikroporöser Filter 3 vorgelagert oberhalb dessen reaktionsgefäßinnwändig ein Reaktionsraum 41 vorgesehen ist innerhalb dessen ein reaktiver Träger 4 vorgesehen ist. Dieser Träger 4 kann dabei auf der Reaktionsgefäßinnenwand angeordnet sein, bevorzugt liegt er jedoch in Form von Synthesepartikeln bspw. in Kugelform, wie in den Figuren dargestellt, vor. Dieser Reaktionsraum 41 ist abschließend mit einem zweiten mikroporösen Filter 5, der gegen die Reaktionsgefäßinnenwand gepreßt ist, abgedeckt. Oberhalb dieses Filters 5 ist ein in Pfeilrichtung verschiebbarer Kolben 6 vorgesehen, vermittels dessen eine definierte Reaktionsflüssigkeitsaufnahme durch den Ein/Auslaß vornehmbar ist. Eine Halterung 64 des Kolbens 6 ist für die Aufnahme in eine im übrigen nicht näher dargestellte automatisierte Vorschub- bzw. Rückzugvorrichtung vorgesehen. Der Kolben 6 ist bevorzugt aus einem einem Metall, insbesondere aus Stahl oder Aluminium gefertigt. Am reaktionsgefäßseitigem Ende ist der Kolben 6 mit einem Stempel 60 versehen, der aus einem elastischen Kunststoff mit einem geringen Elastizitätsmodul und chemischer Inertheit gegenüber den zum Einsatz gelangenden Agenzien besteht, bspw. PTFE, welcher dichtend gegen die Reaktionsgefäßinnenwandung drückt. Durch diese Vorrichtung ist durch eine mehrmalig wiederholbare Hub- und Druckbewegung des Kolbens 1 eine dosierte Aufnahme und Abgabe von Reaktionsflüssigkeit und damit ein optimales Vermischen mit den Substanzen des reaktiven Trägers bis hin zum Reaktionsgleichgewicht in einfacher Weise möglich.

In Fig. 2 ist eine grundsätzlich gleiche Bauform wie nach Fig. 1 dargestellt. Die weitere Verbesserung gegenüber Fig. 1 besteht hierbei darin, daß innerhalb des Kolbens 6, bspw. in Form einer Bohrung, wenigstens eine Leitung 62 vorgesehen ist, die einerseits, entsprechend erweitert, mit einem weiteren, im Stempel 60 einseitig bündig abschließenden eingelassenen mikroporösen Filter 61 in Verbindung steht und andererseits kolbenendseitig über einen Anschluß 63 herausgeführt ist. Der Anschluß 63 ist mit einer Gas- und/oder Flüssigkeitszufuhr verbindbar. Auf diese Weise ist es möglich, durch Gasdruckbeaufschlagung den Reaktionsraum 41 vollständig von den i.d.R. teuren Reaktionsflüssigkeiten zu entleeren. Ebenso ist auf diesem Weg über die Leitung 62, oder eine weitere Leitung, aber auch die dosierte Befüllung des Reaktionsraumes 41 mit Reaktionsflüssigkeit gegeben, so daß unter Beibehaltung aller nach Fig. 1 beschriebenen Vorteile auch ein quasi-kontinuierlich arbeitender Reaktor realisierbar ist.

In Fig. 3 ist schließlich eine nach Fig. 2 modifizierte Ausführungsform dargestellt, bei der die Leitung 62 den Kolben 6 mittig durchläuft. In die Leitung 62 ist ein weiterer Druckkolben 65 eingepaßt, der gegen die Wirkung einer Druckfeder 66 verschiebbar ist. Damit ist bei Vorschub des Kolbens 6, wenn der Stempel 60 auf der Fritte 5 aufliegt, der Reaktionsraum 41 mit einem Gasvolumen bei Vorschub des Druckkolbens 65 beaufschlagbar. Die Federkraft der Feder 66 sollte bei Einsatz des erfindungsgemaßen Reaktors in eine handelsübliche Dosierpumpe so bemessen sein, daß eine Druckbeaufschlagung des Druckkolbens 65 erst erfolgt, wenn der Stempel 61 des Kolbens 6 bereits auf der Fritte 5 aufliegt. Eine Ausführung des Reaktors nach Fig. 3 ist konstruktiv besonders einfach realisierbar.

Bei der nicht maßstäblich dargestellten Ausführungsform des Reaktors nach Fig. 3 sollte der zwischen dem Luer-Lock-Anschluß 7 und dem unteren mikroporösen Filter 3, von der Reaktorwandung umschlossene Raum 8 zuzüglich des im Bereich 41 vorhandenen Volumens im Gesamtvolumen nicht größer bemessen sein, als das maximale, durch den Druckkolben 65 zuführbare Gasvolumen.

Je nach Anwendungszweck ist der vorgeschlagene Reaktor bevorzugt für Probenvolumina zwischen 0,0001 und 100 000 ml ausgelegt. Er gewährleistet eine enorme Vereinfachung und Beschleunigung von Arbeitsschritten im Laborbetrieb und eignet sich für die Laborautomatisierung und Prozessierung von großen Probenzahlen. Gegenüber den herkömmlich bekannten Vorrichtungen ist der vorgeschlagene Reaktor, durch die Ausführung des Reaktionsgefäßes und der Frittenmaterialien aus Glas oder einem ahnlich inerten Material, problemlos auch für aggressive Chemikalien einsetzbar. Weiterhin kann der Reaktor in besonders einfacher Weise durch Eintauchen in ein Temperierbad oder Ummantelung mit einem Temperierblock auf beliebige gewünschte Reaktionstemperaturen konstant temperiert werden, was bei den bekannten Vorrichtungen für den vorgesehenen Einsatzzweck nicht oder nur mit einem hohen Aufwand realisierbar ist. Weiterhin liegt es im Rahmen der Erfindung, das Reaktorende im Bereich des Aus/Einlasses mit einem zusätzlichen, nicht dargestellten Schliffansatz zu versehen, um ein Aufsetzen bspw. auf handelsübliche Laborkolben zu ermöglichen.

Bezugszeichenliste

1

Reaktionsgefäß

2

Aus/Einlaß

3

,

5

,

61

mikroporöser Filter

4

reaktiver Träger

41

Reaktionsraum

6

Kolben

60

Stempel

62

Leitung

63

Anschluß

64

Halterung

65

Druckkolben

66

Druckfeder

7

Luer-Lock-Anschluß

8

Raum zwischen

7

und

3

Claims (9)

1. Reaktor für mikrochemische und/oder mikrobiologische Reaktionen, der ein Rektionsgefaß (1) mit einem Aus/Einlaß (2), diesem vorgelagert einen mikroporösen Filter (3) und reaktionsgefäßinnwändig einen reaktiven Träger (4) mit mindestens einem inunobilisierten Reaktionspartner umfaßt, wobei der vom reaktiven Träger (4) eingenommene Reaktionsraum (41) abschließend mit einem zweiten mikroporösen Filter (5) abgedeckt ist und der Reaktionsraum (41) von der Wirkung eines verschiebbaren Kolbens (6; 65) erfaßt ist.

2. Reaktor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Kolben (6) einen gegen das Reaktionsgefäß (1) dichtenden Stempel (60) trägt.

3. Reaktor nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß in den Stempel (60) ein weiterer mikroporöser Filter (61) einseitig bündig abschließend eingelassen ist und der Filter (61) mit wenigstens einer Leitung (62) verbunden ist, die kolbenendseitig über einen Anschluß (63) herausgeführt und mit Mitteln zu einer Gas- und/oder Flüssigkeitzufuhr verbindbar ist.

4. Reaktor nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zum Einsatz gelangenden mikroporösen Filter (3; 5; 61) durch eine Fritte, insbesondere Glasfritte gebildet sind.

5. Reaktor nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgefäß (1) bevorzugt aus einem Glas gefertigt ist und zumindest der Stempel (61) aus einem elastischen Kunststoff mit einem geringen Elastizitätsmodul und chemischer Inertheit gegenüber den zum Einsatz gelangenden Agenzien besteht, wie z. B. PTFE.

6. Reaktor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Ein/Auslaß mit einem Luer-Lock-Anschluß (7) zur Aufnahme einer Kapillarnadel versehen ist.

7. Reaktor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das aufnehmbare Volumen des Reaktionsgefäßes 0,0001 bis 100 000 ml umfaßt.

8. Reaktor nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der verschiebbare Kolben (6) einen zweiten gesondert verschiebbaren Druckkolben (65) beinhaltet.

9. Reaktor nach Anspruch 1 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß ein zwischen dem Luer-Lock-Anschluß (7) und dem mikroporösen Filter (3), von der Reaktorwandung umschlossener Raum (8) zuzüglich des vom Reaktionsraum (41) eingenommenen Volumens bezüglich des von diesen Räumen umschlossenen Volumeninhaltes kleiner bemessen ist, als das maximale, durch den Druckkolben (65) zuführbare Gasvolumen.