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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Matrix
unterstützte
Laser-Desorptions/Ionisations-Analyse
(MALDI-Analyse) ist ein nützliches Werkzeug
zum Aufklären
von Strukturfragen in der Biochemie, Immunologie, Genetik und Biologie.
Proben werden ionisiert und ein Flugzeitanalysator (TOF analyzer
= Time Of Flight analyzer) wird verwendet, um Ionenmassen zu messen.
Die TOF-Analyse beginnt, wenn Ionen gebildet und auf eine konstante
kinetische Energie beschleunigt werden, wenn sie in eine Driftregion
eintreten. Sie kommen an einem Detektor nach Flugzeiten an, die
proportional der Quadratwurzel ihrer Massen sind. Ein Massenspektrum wird
erzeugt, weil Ionen mit unterschiedlicher Masse an dem Detektor
zu unterschiedlichen Zeiten ankommen.
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Die
Massenspektroskopie kann ein leistungsfähiges Werkzeug auf den Gebieten
der Entdeckung und Entwicklung von Arzneimitteln, Genotypenbildung
und Proteom-Forschung sein. Aktuelle Forschungstrends bestehen darin,
immer größer werdende
Probenzahlen mit automatisiertem Handhabungsgerät oder Robotik zu analysieren.
Mengen einzelner Proben bewegen sich von Nanomol-Konzentrationen
bis zu Attomol-Konzentrationen.
Als Ergebnis wird die Apparatur empfindlicher und ein Bedarf existiert,
dass Probenhandhabungsformate miniaturisiert sind, eine hohe Dichtigkeit
aufweisen und wegwerfbar sind.
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Die
Probenvorbereitung vor der Analyse (wie beispielsweise durch MALDI-TOF-MS)
beinhaltet häufig
Entsalzung und Konzentration von Proben (z.B. Peptiden) hinunter
bis zu einem Volumen von 1-2 Mikroliter. Es ist wahrscheinlich,
dass sich diese Volumen mit der Zeit auf Nanoliter-Volumen verringern.
Gleichzeitige Vorbereitung und Analyse von mehreren Proben ist häufig wünschenswert.
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Multivertiefungsplatten
(multiwell plates) wurden zur gleichzeitigen Untersuchung entwickelt, die
typischerweise aus 96, 384 oder 1536 Reaktionsgefäßen oder
Vertiefungen je Platte bestehen.
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Bestimmte
Probenvorbereitungs-Vorrichtungen, wie beispielsweise die von Millipore
Corporation kommerziell verfügbare
ZipTip®-Vorrichtung,
sind ausgezeichnete Werkzeuge zur Probenvorbereitung vor der MALDI-Analyse.
Es gibt einen einzelnen Probenprozessor, der verwendet werden kann,
um Proben punktförmig
auf das MALDI-Target manuell oder durch automatisiertes Gerät aufzutragen.
Genauer gesagt lehren die US-Patente Nr. 6 048 457 und 6 200 474
die Bildung von geformten Membran-Strukturen zur Probenvorbereitung,
die durch Phasenumkehrung eines teilchenbeladenen Polymersystems an
der Gehäuseöffnung gebildet
werden. Das Polymer wird gefällt,
wenn das Gehäuse
(das den löslichen
Polymer/Teilchenlack enthält)
in einem Fällbad (typischerweise
Wasser) eingetaucht wird. Die Einfügung erzeugt einen geringfügigen Flüssigkeitsdruck über die
Lackschicht, so dass das Wasser in den Polymer eindringt, wobei
eine offene schwammähnliche Struktur
bei der Fällung
erzeugt wird. Bei der Polymer-Wasser-Grenzfläche an der Struktur gibt es
jedoch einen semi-permeablen Membranenfilm, der einen hohen Strömungswiderstand
erzeugt. Wenn die Barriere entweder abgerieben oder abgetrennt wird, ist
die resultierende Struktur hochpermeabel. Die resultierende Vorrichtung
ist ausgestaltet, um eine Strömung
unter den niedrigen Differenzdrücken
zu ermöglichen,
die durch einen gemeinsamen handgehaltenen l0μl-Pipettor (z.B. Gilson, Pipetman)
erzeugt wird.
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Für eine Probenverarbeitung
mit hohem Durchsatz würde
es wünschenswert
sein, Mehrvertiefungsplatten für
die Handhabung und Vorbereitung von Proben, wie beispielsweise die
Entfernung von unerwünschten
Salzen und biochemischen Substanzen, zu verwenden, um die Auflösung und
die Empfindlichkeit des Massenspektrums zu verbessern. Die Verdampfung
des Elutionslösungsmittels
kann jedoch problematisch sein. Das Protein und die Peptide müssen in
einem Volumen sein, das so klein wie möglich ist, um ein adäquates MALDI-TOF-Massenspektrum
zu erhalten. Die Erfassung des Elutionsvolumens durch Zentrifugieren
ist möglich,
jedoch schwierig, da sich das Volumen in jeder Vertiefung aufgrund
der schnellen Verdampfung während
des Transfers der Multivertiefungsplatte zu der Zentrifuge und insbesondere
während
des Zentrifugierens verändern
kann. Elutionsmittel, die herkömmlicherweise durch
Unterdruckverfahren gesammelt werden, neigen außerdem dazu, unter Unterdruck
schnell zu verdampfen, womit eine Resuspension erforderlich wird. Außerdem geht
jedes Mal, wenn die Probe transferiert, wie beispielsweise von der
Pipette zu der Sammelplatte, oder suspendiert wird, Probengut aufgrund der
Adhäsion
an den Grenzflächen
dieser Vorrichtungen verloren. Da Probenmengen typischerweise im Femtomol-Bereich
sind, sind Probenverluste unannehmbar. Außerdem ist das Zentrifugieren
für eine Automatisierung
ebenfalls nicht zugänglich,
weil die Platte manuell in die Zentrifuge plaziert und aus dieser
entfernt werden muß.
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Ein
Schlüssel
zum Erreichen einer hohen Empfindlichkeit und von starken MALDI-Signalen
besteht darin, die gebundenen Peptide in einer Konzentration zu
eluieren, die so hoch wie möglich
ist. Dies kann durch Verwenden eines Mindest-Elutionsvolumens und Verringern der
Handhabungsschritte erzielt werden.
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Es
würde sehr
wünschenswert
sein, das Mikrotiter-Plattenformat
zur parallelen Probenvorbereitung zu verwenden, das für eine Automatisierung ohne
Weiteres anpassungsfähig
ist.
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Es
ist daher eine Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung und ein Verfahren
zum punktmäßigen Auftragen
eines kleinen Elutionsmittelvolumens direkt von der Probenvorbereitungs-Vorrichtung
auf ein MALDI-Target bereitzustellen.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung und ein
Verfahren zum direkten punktmäßigen Auftragens
eines Elutionsmittels mit relativ hohen Konzentrationen einer Probe
auf ein MALDI-Target bereitzustellen.
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Diese
und weitere Aufgaben werden durch die folgende Beschreibung offensichtlich.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
Probleme des Stands der Technik wurden durch die Erfindung überwunden,
die eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Einzel- oder Multi-Vertiefungs-Probenvorbereitung
zum Entsalzen, Konzentrieren und Auftragen von Proben vor weiteren Analyse,
wie beispielsweise durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie, bereitstellt. Genauer
gesagt umfasst die Vorrichtung in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform
der Erfindung eine Mehrzahl von Vertiefungen, die jeweils in Fluidkommunikation
mit einer jeweiligen Auslaß-
oder Ablauföffnung
sind, die optional eine dreidimensionale Membranstruktur enthält, die
vorzugsweise eine Mehrzahl von sorptiven Teilchen umfasst, die in
einer porösen
Polymermatrix eingefangen sind, um eine Vorrichtung zu bilden, die im
Stande ist, eine Festkörperphasenextraktion
auszuführen.
Die Vorrichtung ist ausgestaltet, um ein direktes punktmäßiges Auftragen
auf einem MALDI-Target zu ermöglichen,
wodurch ein Transferschritt eliminiert wird.
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Die
Erfindung ist ebenfalls auf ein Verfahren zur Vorbereitung, Auftragung
und Analyse von Proben mit der Vorrichtung der Erfindung gerichtet.
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KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
eine perspektivische Ansicht einer einzelnen Vertiefung einer Multi-Vertiefungsvorrichtung
mit der Verbundstruktur, die im Detail A in Expansion gezeigt ist;
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2A, 2B, 2C und 2D zeigen vier
Schritte des Elutions- und
Transferprozesses in Übereinstimmung
mit der Erfindung;
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3 ist
eine graphische Darstellung, die die Sequenzabdeckung bei verschiedenen
Elutionstechniken vergleicht;
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4A ist
ein Spektrum einer β-Galaktosidase-Probe,
die in eine Miktrotiterplatte mit Unterdruck gemäß dem Stand der Technik eluiert
wurde;
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4B ist
ein Spektrum einer β-Galaktosidase-Probe,
die mit Zentrifugieren in Übereinstimmung
mit dem Stand der Technik eluiert wurde;
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4C ist
ein Spektrum einer β-Galaktosidase-Probe,
die direkt auf ein MALDI-Target in Übereinstimmung mit der Erfindung
eluiert wurde; und
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5 ist
eine Querschnittsansicht einer Vertiefung, die über einem MALDI-TOF-Targetsubstrat positioniert
und mit einem Unterdruckverteiler in Übereinstimmung mit der Erfindung
gekoppelt ist.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Geeignete
Substratmaterialien für
die Probenvorbereitungs-Vorrichtung der Erfindung sind nicht besonders
eingeschränkt
und umfassen Kunststoffe (wie beispielsweise Polyethylen und Polypropylen),
Glas und Metall, wie beispielsweise rostfreier Stahl. Die Substratmaterialien
sollten den Betrieb der Vorrichtung oder die bei der Prozedur verwendeten Chemikalien
nicht beeinträchtigen.
Polyolefine und insbesondere Polypropylen sind bevorzugte Materialien.
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Der
Begriff "Membran", wie er hier verwendet wird,
umfasst permeable und semi-permeable dreidimensionale Strukturen
mit oder ohne Teilchen, die eine Porosität aufweisen, die für die gewünschte Anwendung
geeignet ist. Der Begriff "Verbundstruktur", wie er hier verwendet
wird, umfasst gefüllte
Membranen.
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In 1 wird
eine einzelne Vertiefung (well) 12 einer Probenvorbereitungs-Vorrichtung
gezeigt, die eine Mehrzahl von Vertiefungen, wie beispielsweise
384, aufweist. Eine Vertiefung 12 wird durch eine sich
vertikal erstreckende, fluidundurchlässige Seitenwand 14 und
einen geneigten unteren Abschnitt 13 festgelegt. Die mittleren
und oberen Abschnitte der Vertiefung 12 weisen vorzugsweise
einen gleichmäßigen Durchmesser
auf und sind im wesentlichen im Querschnitt zylindrisch, obwohl
andere Konfigurationen in Betracht gezogen werden und im Schutzumfang
der Erfindung liegen. Der untere Abschnitt der Vertiefung 12 verjüngt sich
vorzugsweise nach unten in der Richtung der Fluidströmung zu
einem unteren Abschnitt 13 hin, der zu der Mitte nach Innen
geneigt ist, wodurch er eine Kegelstumpfkonfiguration aufweist.
Der untere Abschnitt 13 umfaßt einen Trichter 15,
der vorzugsweise zentral in der Vertiefung angeordnet ist. Wie am
besten im Detail A von 1 ersichtlich ist, ist der Trichter 15 eine
Bohrung, die vorzugsweise zylindrisch ist und axial mit der zentralen
Längsachse
der Vertiefung 12 ausgerichtet ist. Die Abmessungen der
Bohrung bestimmen die Abmessungen der darin enthaltenen Membranstruktur, die
ihrerseits teilweise die Eigenschaften der Tröpfchen bestimmen, die sich
beim Strömen
durch die Membranstruktur bilden. Geeignete Bohrungsdurchmesser
liegen etwa zwischen 0,2 bis 2 mm, bevorzugterweise zwischen etwa
0,4 bis etwa 0,8 mm, wobei ein Durchmesser von 0,5 mm bevorzugt
wird. Geeignete Bohrungshöhen
liegen zwischen etwa 0,2 bis 2 mm, wobei 1 mm bevorzugt wird. Mindestens
ein Abschnitt des Trichters 15 umfaßt vorzugsweise eine adsorptive
Membranstruktur 25. Geeignete adsorptive Membranstrukturen
sind an Ort und Stelle gegossene bzw. geformte polymergebundene,
teilchenbeladene adsorptive Membranstrukturen, wie beispielsweise
diejenigen, die aus chromatographischen Körnern zusammengesetzt sind,
die zusammen mit einem Bindemittel haftend gemacht wurden und in
den US-Patenten Nr. 6 048 457 und 6 200 474 offenbart wurden, deren
Offenbarung hiermit durch Bezug aufgenommen sind. Eine derartige
bevorzugte Struktur ist eine dreidimensionale Struktur mit einer
Mehrzahl von sorptiven Teilchen, die in einer porösen Polymermatrix
eingefangen sind und ein Aspektverhältnis (durchschnittlicher Durchmesser
zu durchschnittlicher Dicke) von weniger als etwa 10, vorzugsweise weniger
als etwa 5 aufweisen. Die Struktur 25 kann an den Boden
des Trichters 15 anstoßen
und erstreckt sich in den Körper
des Trichters 15, wobei sie sich vorzugsweise im wesentlichen
durch die gesamte Tiefe des Trichters 15 erstreckt.
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Vorrichtungen
in Übereinstimmung
mit der Erfindung können
eine Mehrzahl von Membranstrukturen beinhalten, die Harzmaterialien
mit unterschiedlichen Funktionsgruppen aufweisen, um Analyten zu
fraktionieren, die sich durch Ladung, Größe, Affinität und/oder Hydrophobie verändern; alternativ kann
eine Mehrzahl von Vorrichtungen verwendet werden, die unterschiedliche
einzelne Funktionsmembranen enthalten, die in Kombination verwendet werden
können,
um ein ähnliches
Ergebnis zu erreichen. Auf ähnliche
Weise kann eine oder mehrere Membranen in ein geeignetes Gehäuse gegossen und
Funktionalität
vor oder nach dem Gießen
hinzugefügt
werden.
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Die
Membranstruktur 25 ist vorzugsweise an dem distalen Ende
des Abflusses 15 angeordnet und weist ein Volumen von etwa
300 nl auf. Der Abfluß weist
vorzugsweise einen kleinen Innendurchmesser auf, wie etwa 0,5 mm,
so dass die Membranstruktur relativ klein ist und daher weniger
Elutionsvolumen erfordert. Bei der bevorzugten Ausführungsform,
bei der die Struktur 25 an das untere offene Ende des Trichters 15 anstößt, wird
die Probenverdünnung
aufgrund der Verringerung oder der Abwesenheit von Totraum minimiert.
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Um
das Elutionsvolumen zu minimieren und die Probe effizient auf dem
Targetsubstrat aufzutragen (d.h. "punktmäßig aufzutragen"), muß der Trichter 15 in
enger Nähe
zu dem Target gehalten werden. Ein geformter Abstandshals oder Schürze 30,
der/die teilweise oder vollständig
jeden Trichter 15 umgibt, ist in der Vorrichtung ausgebildet,
um die Vorrichtung auf dem Substrat zu tragen und einen geeigneten Zwischenraum
oder Abstand "x" zwischen dem Auslaß des Trichters 15 und
den Targetoberflächen 50 beizubehalten.
Vorzugsweise ist dieser Zwischenraum kleiner als der Durchmesser
des Flüssigkeitstropfens 51,
der sich bildet, wenn sich das Elutionsmittel von der Membranenstruktur 25 zu der
Targetoberfläche 50 begibt.
Wenn sich der Tropfen von dem Trichter 15 bildet, wie in 2B gezeigt
ist, berührt
er somit die Targetoberfläche 50 (2C),
bevor er sich von dem Trichter 15 löst. Wenn dies stattfindet,
gibt es eine erhöhte
Oberflächenspannungs-Adhäsion auf
der Targetoberfläche
(beispielsweise aufgrund des Oberflächenunterschieds und der relativen
Hydrophobie der Targetoberfläche),
die den Tropfen von dem Trichter "zieht". Der maximale Dimensionsversatz zwischen
dem Trichterauslaß und
der Targetoberfläche 50 hängt teilweise
von dem Elutionsvolumen und der Art der Elutionslösung ab.
Ein geeigneter Zwischenraum "x" für eine 1
Mikroliter-Elution beträgt
etwa 0,15 bis etwa 0,020 Zoll (etwa 0,5 mm), mit einem maximalen
Zwischenraum von etwa 0,035 Zoll. Ein geeigneter Zwischenraum für eine 2
Mikroliter Elution beträgt
etwa von 0,020 bis etwa 0,030 Zoll, mit einem Maximum von etwa 0,05
Zoll. Zwischenräume,
die das Maximum überschreiten,
ermöglichen nicht
den wirksamen Transfer von Elutionsmittel in einer minimalen (oder
einer vernünftigen)
Menge des Volumens. Wenn der Zwischenraum zu klein ist, wird der
Transfer stattfinden, wobei jedoch die Punkte dazu neigen, groß und unregelmäßig zu sein,
weil der Tropfen nicht vollständig
transferiert wird; er füllt den
Zwischenraum und kann Blasen bilden, wenn Luft durch die Struktur
strömt.
Der Mindestzwischenraum ist derart, dass ein gebildetes Elutionströpfchen die
Targetoberfläche 50 kontaktiert
und sich von dem Trichterauslaß löst, wobei
ein Zwischenraum gelassen wird, so dass das Elutionströpfchen nicht
durch die Luftströmung
durch den Trichter unterbrochen wird. Sobald ein wirksamer Transfer
durchgeführt
ist, trocknen die Punkte 52 auf der Targetoberfläche schnell
unter Unterdruck, wie in 2D dargestellt ist.
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Bei
der gezeigten Ausführungsform
ist der Hals 30 ringförmig
und definiert zweckmäßigerweise ein
durch den Boden der Vertiefung und die Targetoberfläche 50 begrenztes
Volumen, das ermöglicht, dass
Unterdruck den Trichter 15 erreicht. Ein oder mehrere Lüftungslöcher 54 sind
in dem Hals 30 für diesen
Zweck ausgebildet. Ein Fachmann wird erkennen, dass Stäbe oder
andere Strukturen verwendet werden können, um den Zwischenraum zu
erzeugen und sicherzustellen, dass der Trichter negativen Druck
empfangen kann.
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Geeignete
Substrate oder Targets sind diejenigen, die herkömmlicherweise bei der MALDI-TOF-Massenspektrometrie
verwendet werden. Sie sind im wesentlichen planar, leitend und sind
dimensioniert, um in Ionisationskammern des MALDI-Geräts zu passen.
Metallische, wie beispielsweise aus rostfreiem Stahl, sind typisch.
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Bei
ihren Verfahrensaspekten benutzt die Erfindung das oben erläuterte Verdampfungsproblem als
eine Verarbeitungslösung,
und eliminiert einen Transferschritt, der zuvor notwendig war, wenn
herkömmliche
Verfahren verwendet werden. Zu diesem Zweck wird eine Probe in eine
oder mehrere Vertiefungen der Multivertiefungsplatte durch jedes
geeignetes Mittel, wie beispielsweise durch Pipettieren, eingeführt. Die
interessierenden Moleküle
werden durch die in jeder Vertiefung vorhandene Membranstruktur 25 erfaßt. Ein
Waschschritt wird optional ausgeführt. Wie in 2A bis 2C und 5 dargestellt
ist, ist die Platte auf einem Unterdruckverteiler 60 (der
mit einer Dichtung 61 abgedichtet ist) und über einem
planaren MALDI-Targetsubstrat positioniert, das beispielsweise unter
dem Trichterauslaß geeignet
positioniert ist. Um die interessierenden Moleküle aus den Membranenstrukturen
zu eluieren, wird ein Unterdruck (vorzugsweise etwa 5 Zoll Hg) an jede
Vertiefung angelegt, um vorzugsweise eine Druckdifferenz von etwa
2 bis 6 psi zu erzeugen, und ein Elutionslösungsmittel (etwa 1-2 Mikroliter)
wird in jede Vertiefung eingeführt.
Ein zu hoher Unterdruck neigt dazu, Blasen oder ein Sprühen der
Elutionsflüssigkeit
zu verursachen, was ein schlechtes Auftragen von Punkten auf der
Targetoberfläche
ergibt. Ein geeignetes Elutionslösungsmittel,
wie beispielsweise eine Acetonitril/Matrix-Mischung, vorzugsweise
eine 50% Acetonitril/0,1% TFA-Mischung, kann verwendet werden, und
Unterdruck wird angewendet. Das Elutionsvolumen verlässt den Trichter 15 und
kontaktiert das unter dem Trichter positionierte Target und verdampft
schnell auf dem Target, wobei die Probenkristalle analysenfertig
in einem zweckmäßigen Array (entsprechend
dem Array von Vertiefungen 12), wie beispielsweise durch
MALDI, zurückgelassen
werden. Da ein Transferschritt eliminiert wird, werden Verluste
minimiert und die Probenverarbeitungszeit verringert. Die Kristallbildung
ist ausgezeichnet, und die MALDI-Signalempfindlichkeit
wird verbessert.
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BEISPIEL 1
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Ein
Verfahren zum Identifizieren eines unbekannten Proteins besteht
darin, es etwas mit Rindertrypsin zu digerieren, wobei ein eindeutigen
Satz von Peptiden erzeugt wird. Die kollektiven Massen dieser Peptide,
wie sie durch Massenspektrometrie (z.B. MALDI-TOF-MS) bestimmt werden,
stellen einen Fingerprint dar, der in einer Datenbank gesucht werden kann.
Die Qualität
der Datenbank-Übereinstimmung kann
durch verschiedene komplexe Auswertungssysteme bewertet werden.
Ein einfaches Mittel zur Auswertung ist jedoch die Menge der Proteinsequenz,
die durch das Massenspektrum identifiziert werden kann. Dieser Parameter
wird typischerweise auf dem Gebiet als prozentuale Sequenzabdeckung oder
Prozentabdeckung bezeichnet. In den meisten Fällen ist es mit einem Hochleistungs-MALDI-TOF-MS-System möglich, das
auf 50 ppm einer Masseneinheit genau ist, ein Protein mit so wenig
wie etwa 12% seiner Sequenz zu identifizieren.
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3 zeigt
die Sequenzabdeckung, die aus β-Galaktosidase(E.
coli)-Proben (50, 100 und 200 fMol) erhalten wurde, die mit Rindertrypsin
digeriert wurden, zu einem MALDI-TOF-MS-Target durch drei unterschiedliche
Mittel transferiert und analysiert wurden. Für das "indirekte Unterdruck"-Verfahren wurde die Probe von der Platte
in einem Volumen von 15 Mikroliter (50% Acetonitril, das die MALDI-Matrix enthält, z.B. α-Cyano-4-hydroxy-Zimtsäure) mit
einem Unterdruckverteiler (bei 5 Zoll Hg) in eine "V"-Boden- Polypropylen-Miktrotiterplatte mit 96
Vertiefung desorbiert. 15 Mikroliter sind erforderlich, um einen
ausreichend großen
Tropfen zu bilden, der von dem Trichter durch Gravitationskraft
fallen kann. (Volumen mit einer geringeren Menge als diese werden typischerweise
an dem Trichter durch Oberflächenspannung
gehalten.) Von dem gesammelten Volumen (typischerweise 10 Mikroliter
oder weniger) werden zwei Mikroliter durch Pipette zu einem MALDI-TOF-MS-Target
transferiert und getrocknet. Dieses Verfahren stellt eine annehmbare
Sequenzabdeckung mit 200 fmol einer Probe bereit. Die prozentuale
Abdeckung ist jedoch bei niedrigeren Peptidanteilen praktisch nicht
vorhanden. Eine verbesserte Empfindlichkeit für "indirekten" Transfer kann durch Verwenden von weniger
Elutionsmittelvolumen (etwa 2 Mikroliter) erreicht werden. Zentrifugalkraft
(etwa 1500 Xg für
15 Sekunden) muß angewendet
werden, um das kleine Volumen effizient durch die Membran zu treiben,
und dann wird die Gesamtheit des gesammelten Volumens punktmäßig auf
dem Target aufgetragen. Eine annehmbare % Abdeckung kann mit so wenig
wie 50 fmol Protein erhalten werden. Obwohl die Leistung des Verfahrens
gut ist, ist es aufgrund der Notwendigkeit des Zentrifugierens nicht
zur Automatisierung geeignet, und würde für Analysen mit hohem Durchsatz
nicht völlig
brauchbar sein.
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Ein
direkter Transfer (oder Punktauftragung) von der Probenvorbereitungs-Vorrichtung
zu dem MALDI-TOF-MS-Target unter Verwendung von Unterdruck wird
bevorzugt, weil: 1) er einen Handhabungsschritt eliminiert, 2) er
ein minimales Volumen erfordert und 3) vollständig automatisierbar ist. Wie
in 3 ersichtlich ist, liefert dieses Verfahren (direkter Unterdruck)
Ergebnisse für
die % Abdeckung, die mit dem Verfahren des "indirekten Zentrifugierens" vergleichbar sind.
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BEISPIEL 2
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Vergleichbare MALDI-TOF-MS-Spektren
von β-Galaktosidase-Tryptic-Peptiden
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Drei
50 fmol Proben aus β-Galaktosidase
(E. coli) wurden mit Trypsin digeriert, an der Membrane in dem Trichter gebunden
und durch unterschiedliche Verfahren eluiert. 4A zeigt
die Spektren, die erhalten wurden, wenn die Membran in einer Mikrotiter-Plattenvertiefung
mit 15 Mikroliter 50% Acetonitril, das die MALDI-Matrix enthält, mit
Unterdruck (5 Zoll Hg) eluiert und dann auf ein MALDI-TOF-MS-Target punktmäßig aufgetragen
wurde. 4B wurde erhalten, indem die
Membran mit 2 Mikroliter 50% Acetonitril, das die MALDI-Matrix enthält, mit
Zentrifugieren (15 Sekunden @ 1500 Xg) eluiert und dann punktmäßig aufgetragen
wurde (2 Mikroliter). 4C ist ein Spektrum einer Vertiefung,
die durch Unterdruck (5 Zoll Hg) direkt auf das MALDI-TOF-MS-Target
in Übereinstimmung
mit der Erfindung eluiert/punktmäßig aufgetragen
wurde. 4C zeigt die Abdeckung von 23%
verglichen mit 20% mit Zentrifugieren und praktisch keine Abdeckung
mit indirektem Unterdruck.