WO2002071072A2 - Verfahren und vorrichtung zur aufarbeitung von proteinen in gelen - Google Patents

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WO2002071072A2
WO2002071072A2 PCT/EP2002/002334 EP0202334W WO02071072A2 WO 2002071072 A2 WO2002071072 A2 WO 2002071072A2 EP 0202334 W EP0202334 W EP 0202334W WO 02071072 A2 WO02071072 A2 WO 02071072A2
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reaction vessels
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Andreas Köpke
Sascha Thies
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Wita Proteomics Ag
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2550/00—Electrophoretic profiling, e.g. for proteome analysis

Definitions

  • the invention relates to an efficient and automatable method for working up proteins in gels, in which gel fragments with proteins are isolated from the gel and subjected to a protease digestion. After the resulting cleavage peptides have been purified, they can be analyzed using conventional analysis methods, e.g. can be identified by mass spectrometry.
  • the invention further relates to a corresponding device for carrying out the method.
  • Polyacrylamide gel electrophoresis is the most common method of protein separation. In 2-dimensional protein separation, up to 10,000 proteins can be displayed as spots. The identification of this
  • Protein points is the central step in that
  • the proteins in the gels are present in extremely small starting quantities, although it is currently difficult to isolate the smallest protein quantities ( ⁇ 10 fmol) from the gels.
  • initial quantities of 10-100 fmol are isolated, but with a low throughput and high workload.
  • devices are available with which protein output quantities that are> 1 pmol can be recorded (e.g. ABIMED DigestPro from ABIMED Analyze-Technik GmbH, DE., 5-50 pmol).
  • the object of the invention was therefore to develop a fully automatable method and a device for working up proteins in gels, with which even the smallest amounts of protein (preferably ⁇ 10 fmol) can be obtained.
  • This task is accomplished according to the claims.
  • numerous proteins are provided simultaneously, efficiently and as highly concentrated, salt-free peptide mixtures which can then be subjected to a further analysis, for example a mass spectrometric examination.
  • the method according to the invention for working up proteins in gels is characterized in that the protein gel fragments from gels, e.g. from acrylamide gels. These gel fragments with the protein spots are transferred to the corresponding number of reaction vessels in a first microtiter plate, which can be referred to as a filter plate.
  • the bottoms of the reaction vessels of this microtiter plate are designed as a hydrophobic filter membrane.
  • the protein gel fragments in the wells of the filter plate are washed with known solutions and buffers, with the respective solution being sucked off through the hydrophobic filter membrane after each step. They are then subjected to protease digestion by adding a protease solution to the protein gel fragments.
  • the proteins are thereby split into small peptides that bind to the hydrophobic filter material.
  • the digestion solution is suctioned off into the waste container (waste), the majority of the peptides binding to the membrane.
  • Contaminants such as salts can then be removed by sucking washing solutions into the waste container.
  • the first microtiter plate (filter plate) is then placed over a second microtiter plate (collecting plate).
  • the reaction vessels of this collecting plate have conical bottoms and consist of a material that does not adsorb peptides. It is a material made from a highly halogenated plastic, such as polytetrafluoroethylene (Teflon).
  • Teflon polytetrafluoroethylene
  • Reaction vessels of the second microtiter plate preferably made of Teflon.
  • the peptides bound to the filter membranes of the first microtiter plate are eluted by means of hydrophobic elution solutions and applying negative pressure into the reaction vessels of the collecting plate and concentrated in a subsequent step.
  • These peptides can either be sent directly for further analysis, preferably mass spectroscopic examinations, or they are stored temporarily.
  • the hydrophobic filter membranes for the reaction vessels of the first microtiter plate preferably consist of modified silicon materials. Silicon membranes modified with long-chain (C 8 -C 8 ) or aromatic hydrocarbon chains are particularly preferably used.
  • a trypsin solution is preferably used as the protease solution for enzymatic digestion, the incubation of the protein gel fragments with the protease solution preferably being carried out for 4-6 hours, possibly with heating to about 37 ° C.
  • the method is carried out fully automatically, the isolation of the protein gel fragments from the gel and the provision, transfer and exchange of the two microtiter plates using a robot and the addition of washing and incubation solutions using a pipetting robot or a multiple pipetting unit ,
  • Microtiter plate (filter plate) transferred.
  • This The bottom of the microtiter plate has a frit, which consists of silicon modified with preferably C18 alkyl chains.
  • the gel fragment with the protein is treated in various washing steps in order to achieve a cheap incubation solution for protease digestion.
  • the washing solutions are added using a multiple pipetting unit or a pipetting robot.
  • the protease solution is added. After the addition and incubation, all washing solutions are simply suctioned off through the frit into a waste container located thereon. The protein remains in the gel fragment.
  • the protein is split into small peptides that detach from the gel fragment and bind to the hydrophobic filter material when the incubation solution is sucked out through the hydrophobic frit.
  • the salt is advantageously washed away with water.
  • the first microtiter plate is then placed over the second microtiter plate (collecting plate) with conical tubes instead of a waste container.
  • the peptides are eluted in a relatively large volume by means of a hydrophobic washing solution, whereby a complete yield of the bound peptides is achieved.
  • the elution solution is then in the conical and non-peptide adsorbing tubes of the second microtiter plate.
  • the solvent-containing elution solution is then quickly dried, preferably in a vacuum centrifuge, and the peptide mixture is taken up in a few microliters (0.5-2 ⁇ l) and stored or immediately fed to a further analysis, for example a mass spectrometric analysis.
  • the invention further relates to a device for working up proteins in gels.
  • This consists of a temperature-controlled clean air room with a circulating air temperature control unit and comprises a first microtiter plate (1) which is connected to a suction device (2) with a waste container, the bottoms of the reaction vessels of the microtiter plate (1) representing hydrophobic filter membranes.
  • the device also comprises a second microtiter plate (3), which is located in a suction device (4), the reaction vessels of which have conical bottoms and consist of a material which does not adsorb peptides.
  • They are preferably made from a highly halogenated plastic, particularly preferably from polytetrafluoroethylene (Teflon).
  • Teflon polytetrafluoroethylene
  • the device according to the invention comprises a pipetting robot or a multiple pipetting unit (5) for equipping the microtiter plate (1) (filter plate) with washing and buffer solutions.
  • the device is also coupled to a robot with a connecting arm (6).
  • This robot arm is used to remove the microtiter plate (1) (filter plate) from the stock, to transport the plates from one station to the next, and for disposal.
  • the second microtiter plate (3) is inserted with another robot arm and, after the elution, removed and stacked.
  • the main advantage of the invention is in particular the possibility of total automation of the method. The only manual step is if necessary
  • the dried peptide mixtures in the collecting plate (3) can in turn be done by a robot in a few microliters Buffer dissolved and spotted, for example, on the 'target' of a mass spectrometer.
  • the samples can be placed in the sampler of an ESI mass spectrometer.
  • other analytical methods can also be used to identify the cleavage peptides obtained.
  • the protein spot remains a clear one at all times
  • the peptides can be eluted in quite large volumes and thus almost completely.
  • the concentration is achieved by conventional vacuum centrifugation. This is only possible due to the innovative material of the microtiter plate (3) (collecting plate).
  • Another great advantage of the solution according to the invention is the time saving ('hands-on-time') for the laboratory staff through the complete automation.
  • the method and the device also make it possible to identify protein points which are much less concentrated than before, because the proteins can also be analyzed from starting quantities of ⁇ 10 fmol.
  • Buffer 1 200 mM ammonium bicarbonate, approx. PH 8
  • Buffer 2 20 ⁇ g trypsin in 50 ⁇ l reconstitution buffer
  • Buffer A 100mM ammonium bicarbonate, 14mM DTT in 50% AcN
  • Buffer B 100 mM ammonium bicarbonate in water
  • Buffer C 12.5 mM ammonium bicarbonate in 50% AcN
  • Buffer D 25 M ammonium bicarbonate in 50% AcN
  • Buffer T 0.01 ⁇ g trypsin / ⁇ l (25 mM ammonium bicarbonate in 5% AcN)
  • the C18-SD High Performance Extraction filter plate (1) which is integrated in the suction device (2) with waste container, is washed 3 times with 2 ml of solution 1, which is suctioned downwards.
  • the clean air room is heated to 37 ° C by means of a circulating air temperature control unit.
  • the punched-out protein gel fragments are now placed in the reaction vessels of the filter plate (1).
  • Incubation time is aspirated at approx. 0.6 bar for 30 seconds.
  • Incubation time is aspirated at approx. 0.6, after 30 sec the filter plate (1) is sealed with a rubber mat (without interrupting the aspiration) and sucked at approx. 0.1 bar for a further 15 min.
  • the rubber mat is removed, 25 ⁇ l of buffer T are pipetted into each well of the filter plate (1), the plate is sealed airtight with an aluminum sealing foil and incubated for 5 hours (with vibration).
  • the Teflon plate (3) with the peptide solutions therein (here 150 ⁇ l) is centrifuged under vacuum until a negative pressure of approx. 0.1 bar is reached. Then up to approx. 5 ⁇ l of solution 3 are added to each well of the Teflon plate (3).
  • the Teflon plate (3) is sealed with an aluminum sealing foil and shaken intensively at room temperature for about 15 minutes.
  • the peptides that are treated in this way are either fed directly to further analysis or stored at -20 ° C.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufarbeitung von Proteinen in Gelen, indem Gelfragmente mit Proteinen aus dem Gel isoliert, einem Proteaseverdau unterworfen und die entstandenen Spaltpeptide identifiziert werden, wobei die isolierten Protein-Gelfragmente in die entsprechende Anzahl Reaktionsgefäße einer ersten Mikrotiterplatte (Filterplatte) überführt werden, wobei die Böden der Reaktionsgefäße der Mikrotiterplatte als hydrophobe Filtermembran ausgestaltet sind, die Protein-Gelfragmente gewaschen und mit der Proteaselösung inkubiert werden, wobei nach jedem Schritt die jeweilige Lösung durch die Filtermembran abgesaugt wird. Anschließend wird die erste Mikrotiterplatte über einer zweiten Mikrotiterplatte (Auffangplatte) postiert, wobei die Reaktionsgefäße der zweiten Mikrotiterplatte konische Böden aufweisen und aus einem Material bestehen, das keine Peptide adsorbiert, und dann die an den Filtermembranen der ersten Mikrotiterplatte gebundenen Peptide mittels hydrophober Waschlösung unter Anlegen von Druck in die Reaktionsgefäße der zweiten Mikrotiterplatte eluiert und aufkonzentriert werden.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Aufarbeitung von Proteinen in Gelen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein effizientes und automatisierbares Verfahren zur Aufarbeitung von Proteinen in Gelen, bei dem Gelfragmente mit Proteinen aus dem Gel isoliert und einem Proteaseverdau unterworfen werden. Nach Aufreinigung der entstandenen Spaltpeptide können diese mittels an sich üblicher Analysenmethoden, z.B. massenspektrometrisch, identifiziert werden. Gegenstand der Erfindung ist ferner eine entsprechende Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.
Polyacrylamidgelelektrophoresen stellen die gebräuchlichste Methode der Proteinauftrennung dar. In der 2-dimensionalen Proteinauftrennung können dabei bis zu 10,000 Proteine als Punkte (Spots) dargestellt werden. Die Identifikation dieser
Proteinpunkte ist dabei der zentrale Schritt in der
Untersuchung von Unterschieden in der Proteinzusammensetzung
(z.B. zwischen krankem und gesundem Gewebe). Zur
Identifikation eines Proteins wird der interessante Punkt, der mit einem Farbstoff sichtbar gemacht wurde, ausgestanzt und einer enzymatischen Spaltung (meistens durch Zugabe von Trypsin) unterworfen. Die Spaltpeptide werden dabei aus dem Gel ausgeschwemmt. Diese Mischung muss anschließend entsalzen werden, da das Salz bei der weiteren Analyse, z.B. einer massenspektroskopischen Auswertung, stört. Vor allem für die Untersuchung im Electrosprayionisations (ESI) Massenspektrometer ist man auf die Salzfreiheit der Probe angewiesen.
Bisher wurden die Verfahren zur Aufarbeitung von Proteinen in Gelen zum großen Teil manuell durchgeführt . Dabei bestehen die folgenden Schwierigkeiten: • Das Gelfragment kann leicht von der Pipette angesaugt werden, die zum Abnehmen einer Waschlösungen verwendet wird. Dabei kann die Pipette verstopfen bzw. das Protein mit dem Gelfragment verloren gehen. • Die Peptidlösung ist salzhaltig und muss über eine extrem kleine Säule mit hydrophobem Material entsalzt werden um das (Elutions-) Volumen nicht zu groß werden zu lassen und damit die Peptide in der verdünnten Lösung zu verlieren. • Die Peptidlösung ist zu stark verdünnt, so dass die Peptide in einem anschließenden Massenspektrum nicht identifiziert werden können, da s es eine limitierte Auftragsmenge gibt .
• Die Peptide werden an den Gefäßwänden absorbiert und sind einer Analyse nicht mehr zugänglich.
• Die Peptide sind verunreinigt und ergeben keine interpretierbaren MS Spektren
Bekanntermaßen liegen die Proteine in den Gelen in ausgesprochen kleinen Ausgangsmengen vor, wobei zum gegenwärtigen Zeitpunkt auch eine erfolgreiche Isolierung kleinster Proteinmengen (<10 fmol) aus Gelen schwierig ist. Beim manuellen Arbeiten werden zwar- Ausgangsmengen von 10-100 fmol isoliert, aber bei geringem Durchsatz und hohem Arbeitsaufwand. Für die automatische Bearbeitung sind lediglich Vorrichtungen vorhanden, mit denen Protein- Ausgangsmengen erfasst werden können, die >1 pmol sind (z.B. ABIMED DigestPro der ABIMED Analysen-Technik GmbH, DE., 5-50 pmol) .
Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, ein voll automatisierbares Verfahren und eine Vorrichtung zum Aufarbeiten von Proteinen in Gelen zu entwickeln, womit auch kleinste Proteinmengen (vorzugsweise <10 fmol) gewonnen werden können. Diese Aufgabe wird gemäß den Ansprüchen realisiert. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und der Vorrichtung werden zahlreiche Proteine gleichzeitig, effizient und als hochkonzentrierte, salzfreie Peptidmischungen bereitgestellt, die dann einer weiteren Analyse unterworfen werden können, z.B. einer massenspektrometrischen Untersuchung.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Aufarbeitung von Proteinen in Gelen ist dadurch gekennzeichnet, dass die Protein- Gelfragmente aus Gelen, z.B. aus Acrylamidgelen, isoliert werden. Diese Gelfragmente mit den Proteinspots werden in die entsprechende Anzahl Reaktionsgefäße einer ersten Mikrotiterplatte, die als Filterplatte bezeichnet werden kann, überführt. Die Böden der Reaktionsgefäße dieser Mikrotiterplatte sind als hydrophobe Filtermembran ausgestaltet. Die in den Wells der Filterplatte befindlichen Protein-Gelfragmente werden mit an sich bekannten Lösungen und Puffern gewaschen, wobei nach jedem Schritt die jeweilige Lösung durch die hydrophobe Filtermembran abgesaugt wird. Anschließend werden sie einem Protease-Verdau unterzogen, indem eine Proteaselösung zu den Protein-Gelfragmenten zugegeben wird. Die Proteine werden dadurch in kleine Peptide gespalten, welche an das hydrophobe Filtermaterial binden. Nach einer Inkubationszeit wird die Verdaulösung in den Abfallbehälter (Waste) abgesaugt, wobei die Peptide zum Großteil an die Membran binden. Anschließend können Verunreinigungen, wie Salze, durch Hindurchsaugen von Waschlösungen in den Abfallbehälter entfernt werden.
Danach wird die erste Mikrotiterplatte (Filterplatte) über einer zweiten Mikrotiterplatte (Auffangplatte) postiert. Die Reaktionsgefäße dieser Auffangplatte weisen konische Böden auf und bestehen aus einem Material, das keine Peptide adsorbiert. Dabei handelt es sich um ein Material aus einem hochhalogenierten Kunststoff, wie z.B. aus Polytetrafluorethylen (Teflon) . Erfindungsgemäß bestehen die Reaktionsgefäße der zweiten Mikrotiterplatte bevorzugt aus Teflon.
Mittels hydrophober Elutionslösungen und unter Anlegen von Unterdruck in die Reaktionsgefäße der Auffangplatte werden im weiteren Aufarbeitungsverfahren die an den Filtermembranen der ersten Mikrotiterplatte gebundenen Peptide eluiert und in einem anschließenden Schritt aufkonzentriert . Diese Peptideluate können entweder direkt einer weiteren Analyse, vorzugsweise massenspektroskopischen Untersuchungen zugeführt werden oder sie werden zwischengelagert.
Die hydrophoben Filtermembranen für die Reaktionsgefäße der ersten Mikrotiterplatte bestehen vorzugsweise aus modifizierten Siliziummaterialien. Besonders bevorzugt werden mit langkettigen (C8-Cι8) oder aromatischen Kohlenwasserstoffketten modifizierte Siliziummembranen verwendet .
Als Proteaselösung zum enzymatischen Verdau wird bevorzugt eine Trypsinlösung eingesetzt, wobei die Inkubation der Protein-Gelfragmente mit der Proteaselösung vorzugsweise für 4-6 Stunden, ggf. unter Erwärmung auf ca. 37 °C, durchgeführt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsvariante der Erfindung erfolgt das Verfahren vollautomatisch, wobei die Isolierung der Protein-Gelfragmente aus dem Gel sowie die Bereitstellung, Überführung und Auswechslung der beiden Mikrotiterplatten unter Einsatz eines Roboters und die Zugabe von Wasch- und Inkubationslδsungen mittels Pipettierroboter bzw. einer Vielfachpipettiereinheit stattfindet.
Im Detail läuft das Verfahren wie folgt ab: Die Proteinpunkte werden manuell oder mittels eines käuflichen Roboters ausgestochen und in die erste
Mikrotiterplatte (Filterplatte) überführt. Diese Mikrotiterplatte hat als Boden eine Fritte, die aus mit bevorzugt C18 Alkyl-Ketten modifiziertem Silizium besteht. Das Gelfragment mit dem Protein wird in verschiedenen Waschschritten behandelt, um eine günstige Inkubationslösung für den Proteaseverdau zu erreichen. Die Zugabe der Waschlösungen erfolgt dabei mit Hilfe einer Vielfachpipettiereinheit oder eines Pipettierroboters . Im letzten Schritt wird die Proteaselösung zugegeben. Alle Waschlösungen werden nach der Zugabe und Inkubation einfach per Unterdruck durch die Fritte in einen daran befindlichen Abfallbehälter abgesaugt . Das Protein verbleibt noch im Gelfragment. Durch die Inkubation in der Proteaselösung wird das Protein in kleine Peptide gespalten, die sich aus dem Gelfragment lösen und beim Absaugen der Inkubationslösung durch die hydrophobe Fritte an das hydrophobe Filter-Material binden. Vorteilhafterweise wird das Salz mit Wasser weggewaschen. Die erste Mikrotiterplatte wird im Anschluss statt über einen Abfallbehälter über der zweiten Mikrotiterplatte (Auffangplatte) mit konischen Gefäßen platziert. Die Peptide werden mittels hydrophober Waschlösung in einem relativ großen Volumen eluiert, wodurch eine vollständige Ausbeute der gebundenen Peptide erreicht wird. Die Elutionslösung liegt dann in den konischen und nicht Peptid adsorbierenden Gefäßen der zweiten Mikrotiterplatte vor.
Die lösungsmittelhaltige Elutionslösung wird im Anschluss schnell abgetrocknet, bevorzugt in einer Vakuumzentrifuge, und das Peptidgemisch wird in wenigen Mikrolitern (0,5-2 μl) aufgenommen und gelagert bzw. sofort einer weiteren Analyse, zum Beispiel einer massenspektroskopischen Analyse, zugeführt .
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine Vorrichtung zur Aufarbeitung von Proteinen in Gelen. Diese besteht aus einem temperierbaren Reinluftraum mit einer Umluft-Temperiereinheit und umfasst eine erste Mikrotiterplatte (1) , die mit einer Absaugvorrichtung (2) mit Abfallbehälter verbunden ist, wobei die Böden der Reaktionsgefäße der Mikrotiterplatte (1) hydrophobe Filtermembranen darstellen. Außerdem umfasst die Vorrichtung eine zweite Mikrotiterplatte (3) , die sich in einer Absaugvorrichtung (4) befindet, wobei deren Reaktionsgefäße konische Böden aufweisen und aus einem Material bestehen, das keine Peptide adsorbiert. Vorzugsweise sind sie aus einem hochhalogenierten Kunststoff, besonders bevorzugt aus Polytetrafluorethylen (Teflon) . Form und Material der Mikrotiterplatten sind entscheidend.
Desweiteren umfasst die erfindungsgemäße Vorrichtung einen Pipettierroboter bzw. eine Vielfachpipettiereinheit (5) für die Bestückung der Mikrotiterplatte (1) (Filterplatte) mit Wasch- und Pufferlösungen.
Zum bevorzugten vollautomatischen Betrieb ist die Vorrichtung außerdem noch mit einem Roboter mit Verbindungsarm (6) gekoppelt . Dieser Roboterarm dient zur Entnahme der Mikrotiterplatte (1) (Filterplatte) vom Vorrat, zum Plattentransport von einer Station zur nächsten, sowie zur Entsorgung. Mit einem anderen Roboterarm wird die zweite Mikrotiterplatte (3) eingelegt und nach der Elution weggenommen und gestapelt .
Der wesentliche Vorteil der Erfindung liegt insbesondere in der Möglichkeit der totalen Automatisierbarkeit des Verfahrens. Als einziger manueller Schritt erfolgt ggf. die
Abtrocknung der eluierten Peptidmischung in der Auffangplatte
(3) mittels einer Vakuumzentrifuge. Auch dieser Schritt ist jedoch mit einem etwas komplexeren Roboter ausführbar, so dass das Verfahren vollautomatisch durchführbar ist. Die fertig abgetrockneten Peptidmischungen in der Auffangplatte (3) können wiederum von einem Roboter in wenigen Mikrolitern Puffer gelöst und z.B. auf das , Target' eines Massenspektrometers aufgetüpfelt werden. Alternativ kann man die Proben in den Probengeber eines ESI Massenspektrometers geben. Natürlich sind auch andere Analysenmethoden zur Identifizierung der gewonnenen Spaltpeptide einsetzbar.
Die genannten Nachteile des Standes der Technik werden mit dem vorliegenden Verfahren und der erfindungsgemäßen Vorrichtung sämtlich vermieden. • Anders als bei den herkömmlichen Methoden, kann über den
Verbleib des Protein-Spots jederzeit eine eindeutige
Aussage getroffen werden.
• Die Trennung von Gelspots und Peptidlösungen kann erstmalig einfach und vollständig erfolgen. • Das Entsalzen und Waschen der Petpide ist universell und einfach durchführbar.
• Die Elution der Peptide kann in recht großen Volumina und damit annähernd vollständig erfolgen. Die Aufkonzentration wird durch eine herkömmliche Vakuumzentrifugation erreicht. Dies ist nur aufgrund des innovativen Materials der Mikrotiterplatte (3) (Auffangplatte) möglich.
• Es werden sowohl Salze als auch hydrophile Komponenten
(z.B. Acrylamid-Derivate) aus den Peptidlösungen entfernt .
Ein weiterer großer Vorteil der erfindungsgemäßen Lösung ist die Zeitersparnis ( ,hands-on-time' ) für das Laborpersonal durch die vollständige Automatisierung.
Desweiteren ermöglichen Verfahren und Vorrichtung auch wesentlich geringer konzentrierte Proteinpunkte als bisher zu identifizieren, denn die Proteine sind auch aus Ausgangsmengen <10 fmol analysierbar.
Die Erfindung wird anschließend an Ausführungsbeispielen näher erläutert . Beispiel 1
Fig. 1 a) Darstellung der Vorrichtung während des Waschvorgangs b) Darstellung der Vorrichtung während Protease-Verdau und Elution
Legende zur Fig. 1
1 Mikrotiterplatte (Filterplatte) 2 Absaugvorrichtung mit Abfallbehälter
3 Mikrotiterplatte (Auffangplatte)
4 Absaugvorrichtung
5 Pipettierroboter
6 Roboterarm
Beispiel 2
Durchführung eines automatischen Protease-Verdaus
1. Materialien a) Gilson. Pipettier-Roboter „Liquid Handler 215" unter einem Reinluftraum (Haube) b) 2 M3 Empore Vaccuum Manifold Assembly (Absaugvorrichtung für M3 -Filterplatten c) 3M Empore C18-SD High Performance Extraction Disk Plate (Filterplatte = 96er Mikrotiterplatte (1) ) d) Whatman Multichem 96er Mikrotiterplatte (3) , V-Boden, 250 μl, 7701-6250 (Teflon) e) Vakuumzentrifuge Univapo mit Rotor für Mikrotiterplatten, kühlbar f) Umlufttemperiereinheit g) Aluminium-Siegelfolie für Mikrotiterplatten
2. Chemikalien a) Wasser, Millipore b) Acetonitril (AcN) , Spektranal c) Dithiothreitol (DTT) d) Trypsin, modifiziert, Seq.grade, Protana e) Rekonstitutionspuffer von Protana (50 mM Essigsäure) f) Trifluoressigsäure (TFA)
Lösung 1: 50% AcN in Methanol
Lösung 2: 0,2%TFA in Wasser
Lösung 3: 85% AcN, 0,1% TFA in Wasser
Puffer 1: 200 mM Ammoniumbicarbonat , ca. pH 8
(1,58 g Ammoniumbicarbonat in 100 ml Wasser lösen)
Puffer 2: 20 μg Trypsin in 50 μl Rekonstitutionspuffer
Figure imgf000010_0001
Puffer A: 100 mM Ammoniumbicarbonat, 14 mM DTT in 50% AcN
Puffer B: 100 mM Ammoniumbicarbonat in Wasser
Puffer C: 12,5 mM Ammoniumbicarbonat in 50% AcN
Puffer D: 25 M Ammoniumbicarbonat in 50% AcN
Puffer T: 0,01 μg Trypsin/μl (25 mM Ammoniumbicarbonat in 5% AcN)
3. Vorbereitung
Die C18-SD High Performance Extraction Filterplatte (1) , die in die Absaugvorrichtung (2) mit Abfallbehälter integriert ist, wird 3x mit 2 ml Lösung 1 gewaschen, die nach unten abgesaugt wird. Der Reinluftraum wird mittels Umluft- Temperiereinheit auf 37°C temperiert.
Die ausgestanzten Protein-Gelfragmente werden nun in die Reaktionsgefäße der Filterplatte (1) gegeben.
4. Durchführung des Verfahrens
Bei allen Pipettierschritten ist darauf zu achten, dass die Absaugvorrichtung zuvor vollständig belüftet wird. 1) Waschen der .Protein-Gelfragmente und Umpuffern:
a) Schrumpfen: In jedes Well der Filterplatte (1) werden 2 ml Puffer A pipettiert. Nach 15 min
Inkubationszeit wird mit ca. 0,6 bar 30 sec abgesaugt . b) Quellen: In jedes Well der Filterplatte (1) werden 400 μl Puffer B pipettiert. Nach 15 min Inkubationszeit' wird. c) Schrumpfen: In jedes Well der Filterplatte (1) werden 400 μl Puffer C pipettiert. Nach 15 min Inkubationszeit wird mit ca. 0,6 bar 30 sec abgesaugt . d) Quellen: In jedes Well der Filterplatte (1) werden 400 μl Puffer D pipettiert. Nach 15 min Inkubationszeit wird mit ca. 0,6 bar 30 sec abgesaugt . e) Schrumpfen: In jedes Well der Filterplatte (1) werden 400μl Puffer C pipettiert. Nach 15 min
Inkubationszeit wird mit ca. 0,6 abgesaugt, nach 30 sec wird (ohne das Absaugen zu unterbrechen) die Filterplatte (1) mit einer Gummimatte lufticht verschlossen und weitere 15 min bei ca. 0,1 bar gesaugt.
2) Verdau:
Die Gummimatte wird entfernt, in jedes Well der Filterplatte (1) werden 25 μl Puffer T pipettiert, die Platte wird mit einer Aluminium-Siegelfolie luftdicht verschlossen und 5h inkubiert (mit Vibration) .
3) Reinigung:
a) Bindung: In jedes Well der Filterplatte (1) werdem 25 μl Lösung 2 direkt durch die Aluminum- Siegelfolie pipettiert. Danach wird bei ca. 0 , 6 bar abgesaugt . b) Waschen: In jedes Well der Filterplatte (1) werden 400 μl Lösung 2 pipettiert und sofort mit ca. 0,6 bar abgesaugt . c) Elution: Die Filterplatte (1) wird nun in die Absaugvorrichtung (4) überführt, in der sich die Teflonplatte (3) zum Auffangen der Eluate befindet. In jedes Well der Filterplatte (1) werden 3x 50 μl Lösung 3 pipettiert, wobei nach jeder Zugabe mit ca. 0,6 bar in die Teflonplatte (3) abgesaugt wird.
4) Aufkonzentration:
Die Teflonplatte (3) mit den darin befindlichen Peptidlösungen (hier 150 μl) wird unter Vakuum zentrifugiert, bis ein Unterdruck von ca. 0,1 bar erreicht wird. Anschließend werden in jedes Well der Teflonplatte (3) bis ca. 5 μl Lösung 3 zugegeben. Die Teflonplatte (3) wird mit einer Alminium-Siegelfolie verschlossen und bei Raumtemperatur ca. 15 min intensiv geschüttelt.
5) Lagerung bzw. Analyse
Die so behandelten Peptideluate werden entweder direkt einer weiteren Analytik zugeführt oder bei -20°C gelagert.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Aufarbeitung von Proteinen in Gelen, indem Gelfragmente mit Proteinen aus dem Gel isoliert, einem Proteaseverdau unterworfen und die entstandenen Spaltpeptide identifiziert werden, dadurch gekennzeichnet, dass die isolierten Protein-Gelfragmente in die entsprechende Anzahl Reaktionsgefäße einer ersten Mikrotiterplatte (Filterplatte) überführt werden, wobei die Böden der Reaktionsgefäße der Mikrotiterplatte als hydrophobe Filtermembran ausgestaltet sind, die Protein-Gelfragmente gewaschen und mit der Proteaselösung inkubiert werden, wobei nach jedem Schritt die jeweilige Lösung durch die Filtermembran abgesaugt wird, anschließend die erste
Mikrotiterplatte über einer zweiten Mikrotiterplatte
(Auffangplatte) postiert wird, wobei die Reaktionsgefäße der zweiten Mikrotiterplatte konische Böden aufweisen und aus einem Material bestehen, das keine Peptide adsorbiert, und dann die an den Filtermembranen der ersten Mikrotiterplatte gebundenen Peptide mittels hydrophober Waschlösung unter Anlegen von Druck in die Reaktionsgefäße der zweiten Mikrotiterplatte eluiert und aufkonzentriert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als hydrophobe Filtermembran in den Reaktionsgefäßen der ersten Mikrotiterplatte modifiziertes Silizium eingesetzt wird, vorzugsweise mit langkettigen (C8-Cι8) Alkyl- oder aromatischen Kohlenwasserstoffketten modifiziertes Silizium.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, dass als Proteaselösung eine Trypsinlösung eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation der Protein-Gelfragmente mit der
Proteaselösung direkt über der Membran für 4-6 Stunden, vorzugsweise unter Erwärmung auf ca. 37 °C, durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als zweite Mikrotiterplatte eine solche eingesetzt wird, deren Reaktionsgefäße aus hochhalogeniertem Kunststoff, vorzugsweise aus Polytetrafluorethylen, bestehen.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Isolierung der Protein-Gelfragmente aus dem Gel mittels eines Roboters vorgenommen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Zugabe von Wasch- und Inkubationslösungen mittels
Pipettierroboter oder Multikanalpipette vorgenommen wird.
8. Vorrichtung zur Aufarbeitung von- Proteinen aus Gelen, bestehend aus einem temperierbaren Reinluftraum mit eingeschlossener Umluft-Temperiereinheit umfassend eine erste Mikrotiterplatte 1, die mit einer Absaugvorrichtung 2 mit Abfallbehälter verbunden ist, wobei die Böden der Reaktionsgefäße der Mikrotiterplatte 1 hydrophobe Filtermembranen darstellen, und umfassend eine zweite, in einer Absaugvorrichtung 4 befindliche Mikrotiterplatte 3, deren Reaktionsgefäße konische Böden aufweisen und aus einem Material bestehen, das keine Peptide adsorbiert.
Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Pipettierroboter 5 zur Bestückung der
Mikrotiterplatte 1 umfasst sowie mit einem Roboter 6 zum
Plattentransport verbunden ist.
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