DE60115103T2

DE60115103T2 - Biomolekülanalyse auf array-basis

Info

Publication number: DE60115103T2
Application number: DE60115103T
Authority: DE
Inventors: Andrew Sloane; Janice Duff; Malcolm Pluskal; Andrew Gooley
Original assignee: Proteome Systems Ltd
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 2001-03-16
Filing date: 2001-11-30
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2021-12-01
Also published as: WO2002075321A1; US20040115834A1; CN100395551C; EP1377837A1; JP4096118B2; JP2004532400A; AUPR378001A0; DE60115103D1; CN1493001A; ATE310248T1; EP1377837A4; EP1377837B1; KR20030086310A

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die Analyse von Proben von Biomolekülen, insbesondere von Proteinen.
Hintergrund der Erfindung
Es hat in der jüngsten Literatur viele Diskussionen über die Entwicklung eines „Protein-Chips" gegeben. Umfassend ausgedrückt sind dies Protein-Arrays (gewöhnlich als Mikroarrays bezeichnet). Die derzeitige Vision betrifft einen Protein-Mikroarray, der in der Lage sein wird, tausende von Proteinen gleichzeitig zu messen, des weiteren Protein-Protein-Interaktionen, Interaktionen mit kleinen Molekülen und Enzymsubstrat-Reaktionen.
Die neuesten Ansätze zur Entwicklung eines Proteinchips stützen sich auf die Immobilisierung von Proteinen auf einem Trägermaterial, typischerweise unter Verwendung von Oberflächenchemie, um die Proteine zu immobilisieren. Das Trägermaterial für den Chip kann eine Siliziumscheibe sein, jedoch sind andere Materialien, wie etwa Aluminiumscheiben und Glas als Trägermaterial verwendet oder zu entsprechender Verwendung vorgeschlagen worden. Nachdem das Trägermaterial hergestellt worden ist, ist es notwendig, ein Protein-Bindungsmittel, wie etwa einen Antikörper, an dem Chip zu befestigen. Bei einem Ansatz, der von einer kalifornischen Firma, Zyomyx Inc., vorgeschlagen wurde, wird das Trägermaterial mit einem dünnen organischen Film beschichtet, ein Anheftungselement („Tag"), wird an der aufliegenden organischen Schicht befestigt, und ein Protein-Bindungsmittel, wie etwa ein Antikörperfragment oder ein Peptid, wird an das freie Ende des Tags gebunden.
Die derzeitige Strategie besteht darin, Kenntnis über das zu haben, was auf der Chipoberfläche abgelagert werden soll, wie etwa Antikörper, oder in einigen Fällen, bekannte exprimierte Proteine, die einzeln durch Affinitätsbindung gereinigt und dann immobilisiert werden.
Es sind andere Verfahren vorgeschlagen worden, um Antikörper abzulagern. Jedoch ist die Aufgabe, Antikörper oder andere Protein-Bindungsmittel abzulagern, weit davon entfernt, Routine zu sein. Ein weiteres Problem ergibt sich daraus, dass Proteine viel weniger robust sind als DNA, dass sie fragil sind und denaturieren werden, wenn sie harsch behandelt werden. Proteine sind außerdem extrem empfindlich gegenüber den physikalischen und chemischen Eigenschaften des jeweiligen Trägermaterials.
Es gibt erhebliche Nachteile bei den existierenden „Protein-Chips". Zunächst müssen die Proteine an ihrer Position in dem Array an den Chip gebunden werden. Wie oben diskutiert, erfolgt dies typischerweise entweder unter Verwendung aufgereiht angeordneter Antikörper, wie etwa monoklonaler Antikörper, die sich nur langsam und kostenintensiv herstellen lassen, oder unter Verwendung aufgereihter Antigene. Jedoch ist die Spezifität der gebundenen Antigene und insbesondere der gebundenen Antikörper, nicht hoch.
Ein zweites Problem besteht darin, dass die Verwendung eines einzelnen Antikörpers nicht die Tatsache angehen kann, dass ein Protein eine Reihe von Isoformen besitzt. Es ist möglich, dass nicht alle Isoformen biologisch aktiv sind. In diesen Fällen ist es möglich, dass biologisch aktive Isoformen durch nicht-aktive Isoformen überdeckt werden.
Es gibt das große Problem, dass überzählige Proteine in einer Probe ein hohes Hintergrundrauschen durch unspezifische Bindung an den Array verursachen.
Ein Lösungsansatz, die Verwendung rekombinanter Antigene, erzeugt keine authentischen Abwandlungen, da das rekombinante Protein nahezu mit Sicherheit anderen posttranslationalen Modifikationen unterworfen sein wird als das authentische Protein. Daher ist es unmöglich, sicher zu sein, dass die Interaktion auf dem Protein-Chip in irgendeiner Weise eine „reale" Interaktion ist, wie diese zwischen einem authentischen Protein und z.B. einem anderen Protein auftreten würde.
Die vorliegende Erfindung versucht die Probleme der bestehenden Technik, wie sie oben diskutiert wurden, anzugehen und zu verringern.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur gleichzeitigen Durchführung einer Mehrzahl von Analysen bereitgestellt, wie dieses in Anspruch 1 definiert ist.
In einem ersten allgemeinen Aspekt ist die vorliegende Erfindung verbunden mit dem Schritt der Erzeugung einer Anordnung (eines Arrays) von Makromolekülen und der nachfolgenden Übertragung dieser Anordnung von Makromolekülen auf einen Träger. Dieser Schritt erzeugt einen primären Array oder Makroarray. Ein Hauptvorteil dieses Prozesses besteht darin, dass authentische Makromoleküle ohne irgendwelche Chemie für den Immobilisierungsprozess, wie dies für die „Protein-Chips" aus dem Stand der Technik erforderlich ist, angeordnet und immobilisiert werden können.
Der nächste Schritt des Verfahrens der vorliegenden Erfindung „druckt" einen sekundären (oder Mikro-)Array von Reagenzien auf die jeweiligen Koordinaten des erfassten primären Arrays, typischerweise unter Verwendung einer Bilderstellung zur Definition der Koordinaten. Eine Apparatur, die verwendet werden kann, um diese Funktion auszuführen, ist beschrieben im australischen Patent Nr. 722578 mit dem Titel „Analysis of Molecules", das eine Apparatur für die Abbildung eines Arrays von Spots bzw. Flecken auf einem ebenen Träger beschreibt, wobei dieses Bild dann verwendet wird, um einen Druckerkopf zu einem bestimmten Punkt zu lenken, um ein Reagenz auf diesem Punkt aufzutragen.
Der Ausdruck „Makromoleküle" deckt alle Biomoleküle ab, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Peptiden, Sacchariden, Lipiden, Nukleinsäuremolekülen, komplexen Biomolekülen einschließlich Glykoproteinen und Gemischen hiervon.
Die Biomoleküle werden bevorzugt durch Chromatographie aufgetrennt, um einen Array von Proben zu bilden. Die Chromatographie ist bevorzugt Elektrophorese, und, bevorzugter, Elektrophorese, die in einem Polyacrylamidgel durchgeführt wird.
Die Elektrophorese kann in einer Dimension durchgeführt werden, einschließlich isoelektrischer Fokussierung, nativer Polyacrylamid-Gelelektrophorese, und Natriumdodecylsulfat-(SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Alternativ kann die Polyacrylamid-Gelelektrophorese in zwei Dimensionen durchgeführt werden, wobei die erste Dimension durch isoelektrische Fokussierung erfolgt und die zweite Dimension durch native Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
Sofern irgend möglich, ist es bevorzugt, ein nicht-denaturierendes Elektrophorese-Trennverfahren zu verwenden, da dies anstelle denaturierter Proteine einen authentischeren Array nativer Proteine ergibt.
Der Träger kann eine Membran sein, die aus Polyvinylidendifluorid, Nitrocellulose, Nylon, Teflon, Zitex, Polypropylen, PTFE und derivatisierten Formen hiervon mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen besteht. Die Bildanalyse kann die maximale Anzahl von Punkten bestimmen, die praktisch in dem Mikroarray gedruckt werden können; sie kann ebenso die individuelle Punkt-Punkt-Auflösung für jedes Molekül in dem Makroarray bestimmen.
Der Prozess der Identifizierung einer Interaktion, die spezifisch oder unspezifisch ist, wird öffentlich zugänglichen Verfahren folgen.
Jedoch kann man ein singuläres Merkmal des Druckverfahrens verwenden, bei dem nicht-spezifische Interaktionen in Richtung einer äußeren „Korona" (Hofbildung) weggewaschen werden, wogegen spezifische Interaktionen auf die niedergelegten Koordinaten fixiert bleiben. Die Existenz oder das Fehlen spezifischer Interaktion wird somit durch das Fehlen oder Vorliegen eines Hofes offenbart.
Die Detektion des Proteins kann unterstützt werden durch direkte Markierung mit einem Marker oder dergleichen oder durch die Verwendung einer Sandwich-Technik, wie etwa mittels eines fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpers.
Der nächste Schritt im Verfahren ist die Verwendung von Detektionsmitteln, um festzustellen, ob Wechselwirkungen zwischen dem Proteinspot und dem oder den von dem chemischen Drucker aufgetragenen Reagenz/Reagenzien stattgefunden haben. Die Detektion kann durch jedes hierfür geeignete Mittel erfolgen, so etwa durch eine allgemeine Abbildungslinse, etwa mittels CCD, einer Kamera, einem Scanner oder Laser-Scanner, einem Mikroskop oder dergleichen.
Bei einer alternativen Ausführungsform kann ein Detektionsmittel direkt zu jeder Koordinate des Mikroarrays gelenkt werden.
Es wird ins Auge gefasst, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung für eine im Batch-Modus erfolgende Reinigung exprimierter Proteine, die einen Affinitäts-Tag enthalten, verwendet werden kann. So kann ein Satz von beispielsweise 384 Klonen, die jeweils ein spezifisches, aber unterschiedliches His-Tag-Protein exprimieren, über eine IMAC-Säule (immobilisierte Metallaffinitätschromatographie-Säule) gereinigt werden. Das Eluat von der Säule (d.h. alle 384 Klone) kann dann unter Verwendung von 2D-Elektrophorese angeordnet und auf ein Trägermaterial übertragen werden, um so einen nicht-vorbestimmten Array zu erzeugen. Dies steht in direktem Widerspruch zur existierenden Lehre im Stand der Technik, die darauf basiert, eine vorab festgelegte Anordnung aufrecht zu erhalten und somit die Positionsinformation zu bewahren. Ein Vorteil dieses Beispiels besteht darin, dass die Anordnung der exprimierten Proteine ein Mittel zur Qualitätskontrolle des exprimierten Produkts im Vergleich zum vorhergesagten Produkt (beispielsweise dem vorhergesagten Mr und pI im Vergleich zum beobachteten Mr und pI) bereitstellen kann.
Der Hauptvorteil der vorliegenden Erfindung gegenüber dem Stand der Technik besteht darin, dass sie eine Anordnung authentischer Proteine ohne die Notwendigkeit von Oberflächen-Immobilisierungschemie, wie diese bei bestehenden Protein-Chips erforderlich ist, erzeugt.
Bei einem Merkmal kann die Information, die im Bild des primären Arrays enthalten ist, verwendet werden, um den Typ des Mikroarrays zu definieren, der auf den primären Array gedruckt werden soll. Beispielsweise kann die Größe eines bestimmten zu analysierenden Spots verwendet werden, um das Muster und den Abstand der Reagenzien zu bestimmen, die auf diesem Spot verteilt werden sollen. Beispielsweise kann ein 8 × 8-Array von Reagenzien mit 20 Mikron-Tropfen auf einen Spot von 200 Mikron Durchmesser gedruckt werden, wobei die Reagenzspots um 25 Mikron beabstandet sind, wogegen bei einem größeren, z.B. 400 Mikron großen Spot die Reagenzspots um 50 Mikron beabstandet sein können.
Da es eine hinreichend große Genauigkeit bei dem Auftragungssystem gibt, ist es möglich, Arrays sehr hoher Dichte auf einzelne Positionen des primären Arrays zu drucken, und mittels Präzisionsfaser-Optik sollte es möglich sein, Interaktionen in winzigem Abstand zu identifizieren.
Bei einem besonders bevorzugten Merkmal wäre es von Vorteil, multiple proteolytische Enzyme als Mikroarray auf bestimmte Proteinspots des Makroarrays zu drucken. Beispielsweise kann auf einen 500 Mikron Durchmesser aufweisenden Proteinspot ein Mikroarray mit einer Anzahl von Endoproteinase-Enzymen (Trypsin, Endoproteinase LysC, Endoproteinase GluC und Endoproteinase Asp-N, wobei die bevorzugten Proteine Trypsin und GluC sind) mit 200 Mikron-Spots gedruckt werden, die 200 Mikron auseinander liegen (gemessen von Mittelpunkt zu Mittelpunkt). Die Größe des Spots und der Abstand sind hinreichend klein genug, um den durchschnittlichen MALDI-TOF-MS-Stickstoff-Laserstrahl (100 Mikron) so positionieren zu können, dass er nur die Analyten einer bestimmten Enzymreaktion innerhalb eines Spots auf dem Makroarray desorbiert. Der Vorteil dieses Merkmals besteht darin, dass der Mikroarray der Proteinasen zu einer verstärkten Peptidabdeckung, die bei der MALDI-TOF-MS-Analyse des Proteinspots im Makroarray detektiert wird, führen wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Spezifische Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nun rein beispielhaft und unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, von denen:
1 einen Array von Proteinen zeigt, die durch 2D-Elektrophorese aufgetrennt und auf eine feste Trägermembran übertragen wurden;
2 einen chemischen Drucker zeigt, der verwendet wird, um eine Reihe von Mikroarrays aus kleinen Punkten auf einem Proteinspot aufzutragen, der in dem in 1 gezeigten Array identifiziert wurde;
3 eine Nahansicht des in 1 dargestellten Spots zeigt, wobei ein Mikroarray dargestellt ist, der auf diesem Spot aufgetragen ist;
4 eine schematische Darstellung ist, die den Prozess der Informationsgewinnung aus einem Array von Komponenten oder Proben zeigt, wobei dies über die Aufnahme oder Aufzeichnung eines Bildes der Position wenigstens einer Komponente oder Probe in dem Array erfolgt und das aufgezeichnete Bild dazu verwendet wird, um die Manipulation an wenigstens einer Komponente oder Probe in situ zu ermöglichen;
5 eine schematische Darstellung der Gerätschaften zur Abbildung, Manipulation und Analyse wenigstens einer der Komponenten oder Proben eines Arrays von Komponenten oder Proben ist;
die 6a bis 6c eine Apparatur darstellen, um eine Nitrocellulose (NC)-Membran festzuklemmen;
die 7a und 7b den Effekt der Mikroauftragung von TB-negativem oder TB-positivem humanem Serum auf ein 38 kDa TB-Antigen zeigen;
8 den Effekt der Mikroauftragung von TB-negativem oder -positivem humanem Serum auf ein denaturiertes 38 kDa TB-Antigen mit und ohne Direct Blue-Färbung zeigt;
9 einen Membran-Blot B745 zeigt, der mit doppelseitigem Band an einer Axima MALDI Zielplatte befestigt ist; und
10 eine Nahansicht von mit Trypsin und GluC-Endoproteasen verdautem Protein ist, wobei eine Matrix auf der Oberseite niedergelegt ist.
Detaillierte Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform
Bei der vorliegenden Erfindung wird ein Proteingemisch fraktioniert, um überschüssige Proteine zu entfernen, und es wird ein enger Bereich eines pH-Gradienten verwendet, um die Isoformen aufzulösen (1D-Elektrophorese). Der Fraktionierungsprozess kann unter Verwendung eines Multi-Kompartiment-Elektrolysators erfolgen, wie etwa desjenigen, der in der internationalen Patentanmeldung PCT/A000/01391 beschrieben ist. Anstelle einer 1D-Elektrophorese kann die Probe nach der Entfernung überschüssiger Proteine unter Verwendung von 2D-Elektrophorese oder dergleichen in einen Array (10) aufgetrennt werden, wie er in 1 dargestellt ist, und der Array wird dann unter Verwendung von elektrophoretischem Blotting auf eine Membran, wie etwa eine Nitrocellulosemembran, übertragen. Der Array von Proteinen wird nun immobilisiert und ist dann bereit, um wie ein „Chip" behandelt zu werden. Es ist anzumerken, dass der Array nicht vorab festgelegt ist, und das es nicht notwendig ist, zu dem Zeitpunkt, zu dem der Array erzeugt wird, zu wissen, welche Proteine sich an welcher Position des Arrays befinden.
1 zeigt einen Proteinspot 12, der mit einem Ring markiert ist. Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, einen Array von Reagenzien auf den Proteinspot aufzudrucken. Dies erfolgt unter Verwendung des chemischen Druckers, der in der AU 722578 (WO 98/47006) beschrieben ist, und der unten im Bezug auf die 4 und 5 beschrieben ist.
4 zeigt eine schematische Darstellung der Druckersystemfunktion. Das System beinhaltet einen Array 100, ein Bildaufnahmesystem 200, ein Bildanalysesystem 300, einen Computer 400, eine x,y,z-einstellbare Plattform 500, eine Vielzahl chemischer Abgabekontrolleinrichtungen 600, eine Vielzahl von Abgabeköpfen und Reservoirs 700, eine Analysatorkontrolleinheit 800, einen Analysator 900 und eine Datenanalysestation 910.
Der Array 100 wird auf oder unter dem x,y,z-einstellbaren Tisch oder Arm 500 positioniert, und es wird ein Bild 200 aufgenommen und dieses als digitales Bild an den Computer 400 übertragen. Die Interpretation dieses Bildes erfolgt entweder durch ein Bildanalysesystem 300, bei dem die Koordinaten jeder Komponente des Arrays in Werte umgewandelt werden, die die wahren x,y,z-Achsen widerspiegeln. Alternativ hierzu wird das im Computer 400 gespeicherte Bild ohne Interpretation verwendet, und die Koordinaten einer bestimmten Komponente in dem Array 100 werden verwendet, um den x,y,z-einstellbaren Tisch oder Arm 500, der einen Abgabekopf (Düsenvorrichtung) 700 trägt, zu bewegen. Der Abgabekopf 700 steht unter der Kontrolle einer chemischen Abgabekontrolleinheit 600, die über den Computer 400 gesteuert wird, und verteilt ein Reagenz auf der ausgewählten Probe in dem Array 100. Wenn die Behandlung abgeschlossen ist, werden die Koordinaten der behandelten Komponente im Array 100 dazu verwendet, um den x,y,z-einstellbaren Tisch oder Arm 500, der einen Analysator 900 trägt, zu bewegen. Der Analysator 900 steht unter der Kontrolle einer Analysekontrolleinheit 800, die, wenn sie vom Benutzer bzw. Operator über den Computer 400 angesteuert wird, die ausgewählte, behandelte Probe 100 analysiert. Die Analysedaten werden dann über ein Datenanalyse- und Managementsystem 910 gesammelt, das mit den interpretierten Koordinaten jeder Probe in dem Array, die dem Bildanalysesystem 300 entstammen, korreliert ist.
Die x,y,z-einstellbare Plattform, eine chemische Abgabekontrolleinheit, ein Abgabekopf und ein Reservoir, sowie ein Analysator, stehen alle unter der Kontrolle eines Computers, wie dies in 5 gezeigt ist. Der Array 102 ist auf einer Plattform 502 fixiert. Das Bild des Arrays 102 wird über eine Digitalkamera 202 aufgenommen. Der Array 102 wird über einen Kamerablitz oder externe Wolframlampen 206 beleuchtet. Das Bild wird von der Kamera 202 auf den Computer 402 übertragen. Das Bild wird prozessiert und in eine Software „zum Anklicken eines Spots" importiert. Dieser Prozess übersetzt die Bildpixel-Koordinaten in Automatenkoordinaten. Die Software „zum Anklicken eines Spots" wird dann verwendet, um die Abgabevorrichtung 702 über einen x,y-beweglichen Balken 504 zu der ausgewählten Probe in dem Array zu bewegen. Die z-Bewegung der Abgabevorrichtung 702 erfolgt über die Trägereinheit 506 der Abgabevorrichtung. Die Abgabe des Reagenz erfolgt aus dem Reagenzreservoir 508, gesteuert über die Computerkontrolle 402 der chemischen Abgabekontrolleinheit 602, die in direkter Verbindung 604 mit der Abgabevorrichtung 702 steht.
2 zeigt die Abgabevorrichtung 702 in Form eines Druckerkopfes 14, der sich über den Proteinspot 12 bewegt, um Spots des Reagenz auf dem Spot 12 abzulegen. Der Drucker verwendet piezoelektrisches Drucken, um eine sehr kleine Menge an Flüssigkeit (in der Größenordnung von pI) auf dem Spot abzulegen, ohne den Spot dabei zu berühren.
Der Druckerkopf 14 wird unter Verwendung eines zuvor erzeugten Bildes des Arrays, das die xy-Koordinaten für die jeweiligen Spots in dem Array liefert, auf die Spots ausgerichtet, wobei diejenige Technik verwendet wird, die in der AU 722578 beschrieben und oben wiederholt ist.
3 zeigt ein Bild eines 4 × 4-Arrays von Reagenzien, die auf dem Proteinspot 12 abgelagert sind.
Somit stellen die Proteinchips der vorliegenden Erfindung im Gegensatz zur bestehenden Technik authentische Proteinarrays bereit, sowie außerdem die Möglichkeit zur Auflösung von Isoformen-Exemplaren und die Technik zur Entfernung überzähliger Proteine. Eine bestimmte Technik, die anvisiert wird, besteht darin, es im Bezug auf Patienten zu ermöglichen, Antikörper herzustellen und Patientensera auf Protein-Arrays zu drucken.
Die potentiellen Verwendungen der vorliegenden Erfindung beinhalten die Verwendung eines Antikörper-Screenings auf neue Antigene, die Messung von Peptid/Protein-Interaktionen und von Protein/Protein-Interaktionen.
Beispiel 1:
Das Ziel dieses Beispiels bestand darin, eine chemische Drucktechnik für die Mikroverteilung von humanem Serum zu entwickeln, das entweder seronegativ oder seropositiv für Mycobacterium tuberculosis (TB) ist, als einem Ansatz zum Definieren der Immunreaktivität eines Patienten auf TB unter Verwendung eines gereinigten TB-Antigens auf einer Nitrocellulose-Matrix. Es wird ersichtlich sein, dass dieser Ansatz verwendet werden kann, um die Immunreaktivität eines Patienten auf eine Reihe von Zuständen oder Erkrankungen zu definieren, indem man geeignete Antigene verwendet.
Materialien und Methoden 1.1
Humanes Serum, das aus zwei Patienten isoliert worden war, eines davon seronegativ und das andere seropositiv für TB, wurde 1 in 10 verdünnt unter Verwendung von PBS, pH 7,4 + 0,05% (Gewicht/Volumen) Natriumazid + 0,1 Vol.-% Tween-20 (PBS-Waschpuffer (PBS-WB)) und dann durch einen 0,22 μm Spritzenfilter (Millipore, North Ryde, Australien) gefiltert. Es wurden 4 μl einer 370 μg/ml-Lösung an gereinigtem 38 kDa TB-Antigen in PBS, pH 7,4 auf eine Nitrocellulosemembran (Bio-Rad, Hercules, CA) aufgetragen und darauf trocknen gelassen. Die unspezifischen Bindungsstellen auf der Nitrocellulose wurden dann für 15 Minuten unter Verwendung von 0,5% (Gewicht/Volumen) Casein (Sigma, Castle Hill, Australien) in PBS-WB geblockt. Ein 4 × 4-Array mit 100 Tropfen pro Spot für jede Serumprobe wurde dann unter Verwendung einer AB-55-Mikrojet-Vorrichtung (MicroFab Technologies, Plano, Texas), #B0-13-12 mit einer 55 μm-Öffnung, bei einer Frequenz von 240 Hz auf separate TB-Antigenspots mikroaufgetragen. Die Nitrocellulose wurde während der Auftragung des Serums feucht gehalten, indem man sie mit Filterpapier unterlegte, das mit PBS-WB getränkt worden war. Zehn Sekunden nachdem das Serum aufgetragen worden war, wurde die Nitrocellulose unter Verwendung einer Transfer-Pipette mit mehreren Tropfen an PBS-WB gespült. Die Nitrocellulose wurde im Folgenden für eine Stunde mit Anti-Mensch-IgG, das mit FITC konjugiert war (Zymed, San Francisco, CA) in einer 1 in 100-Verdünnung in 0,5% (Gewicht/Volumen) Casein/PBS-WB, pH 7,4 inkubiert, gefolgt von Waschen mit PBS-WB. Das markierte Antigen wurde unter Verwendung eines Bio-Rad FluorS^TM Multi-Imagers (Hercules, CA) detektiert.
Materialien und Methoden 1.2
Das obige Verfahren wurde wiederholt, mit dem Unterschied, dass die Nitrocellulose unter Verwendung der in den 6a bis 6d dargestellten Apparatur mit saugfähigem Gewebe unterlegt wurde. Saugfähiges Gewebepapier wurde unter eine Nitrocellulose-Membran gepackt, die TB-Antigen enthielt. Dieses Material wurde dann insgesamt im Inneren der in den 6a bis 6c dargestellten Apparatur festgeklemmt, wobei der Bereich, auf dem die Auftragung erfolgen sollte, sich exponiert an der kreisförmigen Öffnung 18 befand. Die Gewebepapierunterlage stellte sicher, dass die aufgedruckte Lösung oder jedes aufgetragene kleine Puffervolumen oder Reagenzvolumen unmittelbar durch die Nitrozellulose hindurch in das Gewebepapier gesogen wird, was eine sofortige und spezifische Reaktion ermöglicht. Dieser Ansatz verhindert sowohl das unspezifische Antrocknen von Immunglobulin und somit unspezifische Reaktionen, als auch die Verteilung von spezifischem Antikörper über die Oberfläche der Nitrocellulose (siehe unten). Im Gegensatz zu Verfahren 1 hält diese Vorrichtung die Nitrocellulosemembran während der Auftragung trocken. Die Membran wurde dann mit 1 Tropfen PBS-WB unter Verwendung einer Transfer-Pipette behandelt, gefolgt von der Auftragung des Serums auf das Antigen gemäß obiger Beschreibung.
Die 7a und 7b zeigen die Auswirkung der Mikroauftragung von TB-negativem oder TB-positivem humanem Serum auf ein 38 kDa TB-Antigen. Ein 4 × 4-Array 20 von humanem Serum, das entweder seronegativ (–) oder seropositiv (+) für TB war, wurde auf Nitrocellulose aufgetragen, die 4 μl-Spots mit 1,48 μg an 38 kDa TB-Antigen enthielt. Man unterlegte die Nitrocellulosemembranen entweder mit Filterpapier, das mit PBS-WB befeuchtet war (A) oder mit dicht gepacktem, trockenem Gewebesaugpapier (B). Das markierte Antigen wurde unter Verwendung von FITC-markiertem sekundärem Antikörper detektiert, gefolgt von der Analyse mit einem BIO-RAD FLUOR-S^TM Multi-Imager. Es ist klar erkennbar, dass die Gewebepapier-Packung und die trockene Membran, die in der 7b bei Array 20 gezeigt ist, zu einer verstärkten Empfindlichkeit und Auflösung bei der Antigendetektion führte.
Beispiel 2
Dieses Beispiel betrifft die Entwicklung einer chemischen Drucktechnik für die Mikroverteilung von humanem Serum, das entweder seronegativ oder seropositiv für Mycobacterium tuberculosis (TB) ist, als einen Ansatz zur Definierung der Patientenimmunreaktivität für TB unter Verwendung eines gereinigten TB-Antigens, das der SDS-PAGE unterzogen und durch Elektrotransfer auf Nitrocellulose übertragen wird, mit oder ohne nachfolgende Direct Blue-Färbung.
Materialien und Methoden 2
Es wurden 14,8 μg an 38 kDa TB-Antigen in 200 μl an 1 × nicht-reduzierendem SDS-PAGE Probenpuffer verdünnt. Die Probe wurde dann mittels SDS-PAGE (1,48 μg an Antigen pro Spur) unter Verwendung eines 4–12% (Gewicht/Volumen) Tris-Bis-Polyacrylamid-Gradientengels (Invitrogen, Carlsbad, CA) analysiert, gefolgt von Elektrotransfer auf Nitrocellulose. Zwei Spuren des Blots wurden unter Verwendung von Direct Blue-Färbung sichtbar gemacht (3), während die anderen zwei Spuren nicht angefärbt wurden. Man ließ beide Blots bei Raumtemperatur trocknen und blockte anschließend mit 0,5% (Gewicht/Volumen) Casein in PBS-WB für 15 Minuten. Die Blots wurden dann mit PBS-WB gespült und trocknen gelassen. Beide Blots wurden dann in die in 1 beschriebene Saugvorrichtung eingelegt, und seronegatives und seropositives TB-Serum wurde dann in abwechselnder Weise auf die 38 kDa-Banden des mit Direct Blue angefärbten Blots und des ungefärbten Blots als 1 × 5-Array gemäß obiger Beschreibung aufgetragen. Etwa 10 Sekunden später wurden die Blots mit 2 Tropfen an PBS-WB unter Verwendung einer Transfer-Pipette gewaschen. Es wurden 5 μl an FITC-markiertem sekundärem Antikörper, 1 in 10 mit 0,5% (Gewicht/Volumen) Casein/PBS-WB verdünnt, auf den Blot aufgetragen, 10 Sekunden später gefolgt von zwei Tropfen PBS-WB unter Verwendung einer Transferpipette. Das markierte Antigen wurde unter Verwendung eines BIORAD FluorS^TM Multi-Imagers (Hercules, CA) detektiert.
8 zeigt die Wirkung der Mikroauftragung von TB-negativem oder TB-positivem humanem Serum auf ein denaturiertes 38 kDa TB-Antigen +/– mit oder ohne Direct Blue- Färbung. (A) 38 kDa TB-Antigen, 1,48 μg pro Spur, wurde mittels SDS-PAGE unter Verwendung eines 4–12% Polyacrylamid-Gradientengels aufgetrennt. Das Protein wurde dann mittels Elektrotransfer auf Nitrocellulose übertragen. Zwei dieser Spuren wurden dann mit Direct Blue angefärbt. (B) Nach dem Blocken mit 0,5% (Gewicht/Volumen) Casein/PBS-WB wurde ein 1 × 5-Array von humanem Serum, das entweder für TB seronegativ (Spuren 1 und 3) oder seropositiv (Spuren 2 und 4) war, auf die 38 kDa TB-Antigenbande aufgetragen (gemäß obiger Beschreibung). Die Nitrocellulosemembranen wurden während der Auftragung unter Verwendung der in den 6a bis 6c gezeigten Apparatur mit dicht gepacktem, trockenem Gewebesaugpapier unterlegt. Nur die Spuren 3 und 4 waren vor der Auftragung des Serums mit Direct Blue angefärbt worden (siehe A). Das markierte Antigen wurde unter Verwendung eines FITC-markierten sekundären Antikörpers detektiert, gefolgt von der Analyse mit einem BIO-RAD FLUOR-ST^TM Multi-Imager.
Die derzeitigen Protokolle, die einen chemischen Drucker zur Auftragung von Nanoliter-Volumina an humanem Serum auf ein definiertes, an einer Nitrocellulosemembran immobilisiertes Antigen verwenden, haben sich als sehr erfolgreich erwiesen und stellen ein extrem schnelles (weniger als 1 Minute) Mittel zur Detektion von TB-immunreaktivem IgG bereit. Es wurden kein Hintergrund und keine unspezifische Bindung beobachtet. Die anfänglichen Studien zeigten, dass die Verteilung von Serumantikörper über die Oberfläche einer feuchten Nitrocellulosemembran nach der Auftragung eine geringe Auflösung der Antikörper-Arrays zur Folge hatte. Die Anordnung eines saugfähigen Gewebepapiers unterhalb einer trockenen Nitrocellulosemembran hat dieses Problem wirkungsvoll überwunden und erlaubt nun hochspezifische und gut aufgelöste Antikörper-Arrays.
Beispiel 3
sDieses Beispiel betrifft die Applikation von Enzymen auf Proteinen auf einem Array vor der Matrix-assistierten Laser-Desorptions-Ionisations(MALDI)-Analyse des fragmentierten Proteins in einem Massenspektrometer. Wie bekannt ist, schneiden verschiedene Enzyme Proteine an unterschiedlichen Aminosäurestellen. Einige Enzyme, wie etwa LysC, AspN, ArgC, schneiden nur an einer spezifischen Aminosäurestelle. Dies ist ein Problem bei der MALDI-Analyse, da dies nur wenige große Fragmente produziert, die dazu neigen, kein sehr informatives Spektrum zu ergeben. Andere Enzyme, wie etwa Pepsin und Chymotrypsin, schneiden Proteine an vielen Aminosäurestellen. Die Verwendung dieser Enzyme vor der MALDI-Analyse ist ebenfalls problematisch, da zu viele kleine Fragmente produziert werden, die eine große Anzahl sehr kleiner Peaks im Spektrum erzeugen, was wiederum sehr schwer zu interpretieren ist. Trypsin und GluC spalten an zwei Aminosäurestellen, was dazu neigt, gute Spektren für die Analyse zu ergeben, sodass dies die Enzyme der Wahl bei der MALDI-Analyse sind.
Dennoch, da diese Enzyme nur an spezifischen Aminosäurestellen schneiden, erzeugt die Verwendung eines einzelnen Enzyms eine begrenzte Menge an Information oder Abdeckung des Proteins. Werden jedoch zwei verschiedene Enzyme unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung auf einen Proteinspot in dem Array aufgetragen, so wird dies die Abdeckung des Proteins erhöhen. Entsprechend beschreibt der folgende Versuch die Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung zur Auftragung sowohl von Trypsin als auch von GluC auf zwei humane Proapolipoproteine, um eine verbesserte Abdeckung (d.h. zusammenpassende Peptide) unter Verwendung sowohl von GluC als auch von Trypsin im Vergleich zu Trypsin oder GluC alleine zu erhalten.
Die Zielsetzung dieses Beispiels war die Entwicklung einer chemischen Drucktechnik für die Mikroverteilung multipler Endoproteasen auf gereinigten Proteinen, wobei letztere der SDS-PAGE unterzogen, auf Polyvinyldifluorid-Membranen elektrogeblottet und zur Verbesserung der Protein-Identifizierung mit Direct Blue gefärbt wurden.
Materialien und Methoden
Die Probe bestand aus 36 μl Vollplasma in 7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 2% (Gewicht/Volumen) Chaps und 5 mM Tris. Die Probe wurde mit x Tributylphosphin reduziert und mit z Iodacetamid alkyliert. Die Probe wurde einer Ultraschallbehandlung unterzogen und dann zentrifugiert, wobei der Überstand gesammelt wurde. Die Präfraktionierung erfolgte mittels des Multi-Kompartiment-Elektrolysators (multicompartment electrolyzer, MCE) unter Verwendung von Verfahren, die beschrieben sind in Herbert, B. & Righetti, P. G., „A turning point in proteome analysis: sample prefractionation via multicompartment electrolyzers with isoelectric membranes", Electrophoresis 21, 3639–3648 (2000), dessen gesamter Inhalt hier durch Referenz in Bezug genommen wird.
Trockene 11 cm 5–6 IPG-Streifen wurden für 6 Stunden mit 200 μl an Proteinprobe rehydriert. Die rehydrierten Streifen wurden für 120 kVhr bei einem Maximum von 10.000 V fokussiert. Die fokussierten IPG-Streifen wurden für 20 Minuten in Äquilibrierungspuffer mit 6 M Harnstoff, 2% (Gewicht/Volumen) SDS äquilibriert.
Die äquilibrierten IPG-Streifen wurden in die Ladevertiefungen von 6–15% Gelchips eingesetzt. Die Elektrophorese erfolgte bei 50 mA pro Gel für 1,5 Stunden. Die Proteine wurden bei 400 mA für 1 Stunde und 20 Minuten auf eine Immobilon P^SQ PVDF-Membran elektrogeblottet. Die Proteine wurden dann mit Direct Blue 71 angefärbt.
Der Membranblot wurde dann an einer Axima-CRF-MALDI-TOF MS-Zielplatte befestigt, wobei hierfür 3 M doppelseitiges leitendes Band verwendet wurde (siehe 9). Die spezifizierten Proteinspots wurden dann geblockt, indem man 5 ηl 1% Polyvinylpyrrolidon (PVP) in 50% Methanol, verteilt auf 50 Tropfen, mit einem Durchmesser von 300 μm, auf zwei Positionen mit einem Abstand von 1 mm auf dem einen Proteinspot verteilte. Überschüssiges PVP wurde mit MilliQ weggespült. Es wurden 50 ηl an 200 μg/ml GluC-Endoprotease auf einen der PVP-Spots auf dem Protein aufgetragen, und es wurde eine Menge x an 200 μg/ml Trypsin auf dem verbleibenden PVP-Spot auf demselben Protein aufgetragen. Die Membranplatte wurde dann in eine abgeschlossene Lunchbox mit sehr wenig Wasser eingesetzt, um eine angefeuchtete Umgebung zu schaffen, und bei 37°C für 3 Stunden inkubiert. Nach dem Verdau wurden 100 ηl an 10 mg/ml α-Cyano-Hydroxyzimtsäure in 20% Isopropanol, 20% 2-Butanol, 30% Methanol und 0,5% Ameisensäure auf die verdauten Proteinspots aufgetragen (10). Der Verdau wurde unter Verwendung des Axima CRF MALDI-TOF Massenspektrometers analysiert.
Das vorliegende Verfahren zur Mikroverteilung multipler Endoproteasen zur Steigerung der Aminosäureabdeckung für die Proteinidentifizierung hat sich durch eine kombinierte Abdeckung von 66,67% der zusammenpassenden Peptide im Vergleich zu der 40%igen GluC-Abdeckung und der 46,09%igen Trypsin-Abdeckung, die in unabhängigen Ansätzen erreichbar ist, als erfolgreich erwiesen.
Die verwendete Matrix-Lösung umfasst 20% 2-Butanol, 20% Isopropanol, 30% Methanol, 30% Wasser und 0,1% Tfa (Trifluoressigsäure). Diese Matrix-Lösung hat den Vorteil, dass sie eine geeignete Viskosität besitzt, um stabile Tropfen über eine ausgedehnte Zeitspanne zu verteilen.
Es wird Fachleuten auf dem Gebiet erkennbar sein, dass an der Erfindung zahlreiche Variationen und/oder Modifikationen vorgenommen werden können, wie dies in den spezifischen Ausführungsformen gezeigt ist. Die vorliegenden Ausführungsformen sind daher in jeder Hinsicht als veranschaulichend und nicht als einschränkend zu betrachten.

Claims

Verfahren zur gleichzeitigen Durchführung mehrerer Analysen an mehreren Makromolekülen, wobei die Makromoleküle in einem primären Array aus Spots auf einem Träger vorliegen, wobei das verfahren umfasst: Auftragen mehrerer, ein oder mehrere Reagentien umfassende Zusammensetzungen, so daß jede aufgetragene Zusammensetzung jeweils einen Spot eines sekundären, kleineren Arrays aus Spots bildet, wobei der sekundäre, kleinere Array aus Spots innerhalb eines jeden Spots des primären Arrays aus Makromolekülen liegt; und Nachweisen, ob zwischen den Makromolekülen des primären Arrays und dem Reagens oder den Reagentien in der im sekundären Array aufgetragenen Zusammensetzung Wechselwirkungen stattgefunden haben.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der primäre Array nicht vorbestimmt ist.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei der primäre Array auf einem ebenen Träger ohne Oberflächenimmobilisierungschemie erzeugt wird.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei der primäre Array mittels Chromatographie erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei es sich bei der Chromatographie um Elektrophorese handelt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei es sich bei der Elektrophorese um Polyacrylamidgelelektrophorese handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die Chromatographie in zwei Dimensionen vorliegt, wobei bei der ersten Dimension isoelektrische Fokussierung und bei der zweiten Dimension nichtdenaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese oder Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese eingesetzt wird.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei der primäre Array mittels Chromatographie mit anschließender Übertragung auf eine Membran erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei sich bei der Membran um Polyvinylidendifluorid, Nitrocellulose, Nylon, Teflon^TM, Zitex^TM, Polypropylen, Polytetrafluorethylen oder eine derivatisierte Form eines der vorstehenden Stoffe handelt.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei es sich bei den Makromolekülen um Proteine, Peptide, Saccharide, Lipide, Nukleinsäuremoleküle, Glycoproteine oder Gemische aus einem der vorstehenden Moleküle handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei den Makromolekülen um Proteine handelt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei es sich bei den Makromolekülen um Proteine aus dem Menschen oder aus Tieren handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei es sich bei den Makromolekülen um Antikörper handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei es sich bei den Makromolekülen um Antigene aus Bakterien handelt.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei es sich bei den Reagenzien um Proteine handelt.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Proteine aus dem Menschen oder aus Tieren stammen.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei es sich bei den Reagentien um Antikörper handelt.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei es sich bei den Reagentien um Enzyme handelt.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Enzyme ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Lys-C, Glu-C, Trypsin, Asp-N, Arg-C, Pepsin und Chymotrypsin.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei es sich bei den Enzymen um Trypsin und Glu-C handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei schritt b) unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie durchgeführt wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 1–21, umfassend das Erzeugen des primären Arrays aus Makromolekülen als Spots auf einem Träger.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend: 1. Erzeugen eines primären Arrays aus Makromolekülen; 2. Übertragen des Arrays aus Makromolekülen auf einen Träger.