JP2004532400A - プロテインチップ - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
本発明は、生体分子、特にタンパク質のサンプルの解析に関する。
【背景技術】
【0002】
「プロテインチップ」の開発に関して、近年の文献に多数の記述が存在する。概して、これらは(通称マイクロアレイと呼ばれる)タンパク質アレイである。目下の展望は、数千個のタンパク質を同時に計測したり、タンパク質−タンパク質間相互作用、タンパク質−小分子間相互作用及び酵素基質反応を計測することが可能になるプロテインマイクロチップに向けられている。
【0003】
プロテインチップを開発する現在の手法の多くは、通常、界面化学を利用して基板にタンパク質を固定化させるタンパク質固定化に依拠している。チップ用の基板はシリコンウェハであってもよいが、アルミニウムウェハやガラスなどの他の材料も、基板として使用されたり、使用が提案されている。基板を作成した後、抗体などのタンパク質捕捉物質をチップに張り付ける必要がある。カリフォルニアの一会社であるザイオミックス社(Zyomyx Inc.)によって提案された手法では、基板を薄い有機膜でコーティングし、その表面有機層に張り付けタグを設け、抗体断片やペプチドなどのタンパク質捕捉物質をタグの自由端に結合させる。
【0004】
目下の方策は、抗体、場合によっては、親和性捕捉によって個々に精製された後に固定化される既知の発現タンパク質など、チップ表面上に積層化されているものについて知ることである。
【0005】
抗体を積層化する他の方法も提案されている。しかしながら、抗体又は他のタンパク質捕捉物質を積層化する作業は、単純明快とはいかない。また、タンパク質がDNAよりもはるかにロバスト性に欠け、脆弱で、粗雑に扱うと変性するという点で、問題も生じている。さらに、タンパク質は、基板の物理的化学的特性に対して非常に敏感である。
【0006】
既存の「プロテインチップ」については、大きな欠点が存在する。第1に、タンパク質をアレイの所定位置でチップに結合させる必要がある。上述したように、これは、通常、単クローン抗体群など、製造に時間と費用がかかるアレイ型抗体群か、あるいは、アレイ型抗原群を使用することによって実現される。しかしながら、結合抗原の特異性、特に結合抗体の特異性は高くない。
【0007】
第2の問題は、1つの抗体を使用しても、タンパク質が複数のイソフォームを有するという問題に対処できないことである。イソフォームが生物学的活性状態になるとは限らないこともあり得る。生物学的に活性なイソフォームが不活性のイソフォームに圧倒される可能性もある。
【0008】
1つのサンプル内にリッチなタンパク質が存在する場合には、アレイへの非特異的な結合によって高いバックグラウンド「ノイズ」を発生させるという大きな問題がある。
【0009】
組換え抗原を使用するという解決策では、組換えタンパク質と真正タンパク質との翻訳後修飾がほぼ確実に異なることになるので、真正な修飾が作成されない。したがって、プロテインチップ上での相互作用が、真正タンパク質と、例えば、別のタンパク質との間で発生するような「真の」相互作用であると確信することは到底不可能である。
【発明の開示】
【0010】
本発明は、上述した従来技術の問題に対処し、それを解決するものである。
【0011】
第1の広い態様では、本発明は、高分子アレイを作成し、続いて支持体に上記高分子アレイを転写する工程を有している。この工程では、一次すなわちマクロアレイが作成される。この方法の大きな利点は、従来技術の「プロテインチップ」では必要な固定化処理のための化学反応を用いることなく、真正の高分子を配置固定化できることである。
【0012】
本発明の方法の次の工程では、一般には画像捕捉によって座標を決定することにより、捕捉された一次アレイの各座標上に試薬の二次(すなわちマイクロ)アレイを「プリンティング」する。この機能を実行するのに使用可能な装置は、「分子の解析(Analysis of Molecules)」という名称のオーストラリア特許第722578号に記載されており、この特許には、平坦な支持体上のスポットアレイの画像を捕捉し、その画像を利用してプリントヘッドを特定のスポットまで移動させ、そのスポットに試薬を付与する装置が記載されている。
【0013】
発現高分子には、タンパク質、ペプチド、糖類、脂質、核酸分子、糖タンパクを含む複合生体分子、及びそれらの混合物からなる群から選択された生体分子が含まれる。
【0014】
生体分子は、クロマトグラフィーによって分離され、サンプルのアレイを形成することが好ましい。クロマトグラフィーは、電気泳動であることが好ましく、ポリアクリルアミドゲル内で実行される電気泳動であることがさらに好ましい。
【0015】
上記電気泳動は、等電点電気泳動、天然ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動など、1次元で実行することができる。あるいは、上記ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動は、1次元目を等電点電気泳動によって、2次元目を天然ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動又はSDSポリアクリルアミドゲルによる電気泳動によって2次元で実行される。
【0016】
変性タンパク質ではなく、天然タンパク質のより真正なアレイを作成できるので、できる限り非変性用電気泳動分離法を利用することが好ましい。
【0017】
上記支持体は、二フッ化ポリビニリデン、ニトロセルロース、ナイロン、テフロン、ザイテックス、ポリプロピレン、ポリ四フッ化エチレン、及び1つ以上の官能基を有するそれらの誘導体からなる膜であってもよい。
【0018】
画像解析により、マクロアレイの各分子の個々のスポット間分解能を求めることができるだけでなく、マイクロアレイに実際にプリンティング可能な最大限のスポット数を求めることができる。
【0019】
特異的又は非特異的な相互作用を同定する方法は、公開の方法に従う。
【0020】
しかしながら、非特異的相互作用が外側コロナまで洗い流される一方で、特異的相互作用は付着された座標上に集中したまま残るというこのプリンティング処理特有の特徴を利用することができる。したがって、特異的相互作用が存在するか否かは、コロナの有無によって明らかになる。
【0021】
タンパク質の検出は、マーカーなどによる標識の直付け又は蛍光標識された二次抗体などのサンドイッチ技術の利用によって支援することができる。
【0022】
本方法の次の工程は、検出手段を使用して、タンパク質スポットとケミカルプリンタによって付与された試薬との間に相互作用が発生したか否かを検出することである。検出は、CCDなどの広域捕捉レンズ、カメラ、走査又はレーザ走査、顕微鏡などの適切な手段によって実行してもよい。
【0023】
別の実施形態では、検出手段を、マイクロアレイの各座標まで直接移動させてもよい。
【0024】
本発明の方法は、アフィニティタグを含んだ発現タンパク質をバッチモードで精製するために使用可能であると考えられる。例えば、特異的であるが異なるHisタグタンパク質を発現する例えば384個のクローンからなるバッチを、IMAC(固定化金属アフィニティクロマトグラフィー)カラムで精製してもよい。その後、カラム(すなわち、全384個のクローン)からの溶出物を、二次元電気泳動を用いてアレイ化し、基板に転写して予め指定されていないアレイを作成してもよい。これは、予め指定されたアレイを維持して位置情報を保持することに依拠する従来技術の既存の教示とは正反対である。この例の長所は、発現タンパク質をアレイ化することにより、予測された産物と比較した発現物(例えば、観測されたMr及びpIと比較した予測されたMr及びpI)の品質制御手段が実現されることである。
【0025】
従来技術に対する本発明の主要な長所は、既存のプロテインチップが必要とする表面固定化化学反応を必要とすることなく、真正タンパク質のアレイを作成することである。
【0026】
一特徴によれば、一次アレイの画像に含まれる情報を用いて、一次アレイ上にプリンティングされるマイクロアレイの型を決定することができる。例えば、解析対象の特定のスポットのサイズを利用して、そのスポット上に分注される試薬のパターンと間隔を決定することができる。例えば、直径200ミクロンのスポット上には、20ミクロンの液滴の試薬8x8アレイを試薬スポット間の間隔を25ミクロンにしてプリンティングできる一方、それより大きな例えば400ミクロンのスポットの場合は、試薬のスポット同士は50ミクロンの間隔があけられる。
【0027】
分注装置に十分な精度があるので、一次アレイの個々の位置に非常に高密度のアレイをプリンティングすることが可能であり、精密な光ファイバを用いれば、微小な相互作用も同定可能である。
【0028】
特に好ましい特徴では、マクロアレイの特定のタンパク質スポット上に、マイクロアレイとして多数のタンパク質分解酵素をプリンティングすれば有利である。例えば、直径500ミクロンのタンパク質スポット上には、複数のエンドプロテイナーゼ酵素(トリプシン、エンドプロテイナーゼLysC、エンドプロテイナーゼGluC及びエンドプロテイナーゼAsp-N、好ましい酵素はトリプシンとGluC)からなるマイクロアレイを、200ミクロンサイズのスポットで(中心間で)200ミクロンの間隔を置いてプリンティングされる。そのスポットサイズと間隔は、平均MALDI−TOF質量分析窒素レーザビーム(100ミクロン)をマクロアレイの1スポットの範囲内で1つの特定の酵素反応を有する分析物のみを脱着させるように位置付けるだけの充分に小さいものである。この特徴の利点は、プロテイナーゼのマイクロアレイにより、マクロアレイのタンパク質スポットのMALDI−TOF質量分析時に検出されるペプチドの対象範囲が拡大することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【0029】
本発明の具体的な実施の形態を、図面に基づいて例示として説明する。
【0030】
本発明では、タンパク質の混合物が分画されてリッチなタンパク質が除去され、狭い範囲のpH勾配を利用してイソフォームが分解される(一次元電気泳動)。分画処理は、その内容全てが本明細書に参照の形で盛り込まれている国際特許出願PCT/AU00/01391に記載されているような多室電解槽を用いて行われてもよい。一次元電気泳動の代わりに二次元電気泳動などを利用して、リッチなタンパク質を除去した後のサンプルを図1に示すアレイ(10)に析出してもよく、その後、アレイは、エレクトロブロッティングを用いてニトロセルロース膜などの膜上に転写される。ここで、タンパク質アレイは固定化され、「チップ」の形で取り扱われる準備が整う。なお、アレイは予め指定されているものではなく、アレイが作成された時点でどのタンパク質がアレイ上のどの位置に存在するかを知っている必要はない。
【0031】
図1は、環に囲まれたタンパク質スポット12を示す。この方法の次の工程は、タンパク質スポット上に試薬のアレイをプリンティングすることである。これは、図4及び図5に基づいて以下に説明するオーストラリア特許722578号に記載のケミカルプリンタを用いることによって実現される。
【0032】
図4は、プリンタ装置の機能の概略説明図である。この装置は、アレイ100と、画像収集装置200と、画像解析装置300と、コンピュータ400と、xyz調整プラットフォーム500と、複数の薬剤分注制御部600と、複数の分注ヘッド及び液だめ700と、解析制御部800と、解析装置900と、データ解析ステーション910を備えている。
【0033】
アレイ100は、xyz調整テーブル又はアーム500の上又は下に配置され、画像200が収集されて、ディジタル画像の形でコンピュータ400に転送される。この画像は、画像解析装置300によって解読され、アレイの各成分の座標が、真のx軸、y軸、z軸を反映する値に変換される。あるいは、解読することなく、コンピュータ400内に記憶された画像が使用され、アレイ100内の特定の成分の座標を用いて、分注ヘッド(噴射装置)700を搬送するxyz調整テーブル又はアーム500を移動させる。分注ヘッド700は、コンピュータ400に制御される薬剤分注制御部600に制御され、アレイ100の選択されたサンプル上に試薬を分注する。処理が完了すると、アレイ100内の処理された成分の座標を用いて、解析装置900を搬送するxyz調整テーブル又はアーム500を移動させる。解析装置900は、解析制御部800に制御され、作業者がコンピュータ400を介して選択したときに、選択された処理後のサンプル100を解析する。解析によるデータは、その後、データ解析・管理装置910によって照合され、画像解析装置300からの解読されたアレイ内の各サンプルの座標と関連付けされる。
【0034】
図5に、コンピュータの制御下にある、xyz調整プラットフォーム、薬剤分注制御部、分注ヘッド及び液だめ、並びに解析装置を示す。アレイ102は、プラットフォーム502上に固定されている。アレイ102の画像は、ディジタルカメラ202によって収集される。アレイ102は、カメラのフラッシュ又は外部のタングステンランプ206によって光が照射される。画像は、カメラ202からコンピュータ402に転送される。この画像は、処理され、「スポット上クリック」ソフトウェアに入力される。この処理により、画像の画素座標がロボットの座標に変換される。その後、「スポット上クリック」ソフトウェアを用いて、分注装置702を、xy方向可動バー504を介してアレイ内の選択されたサンプルまで移動させる。分注装置702のz方向の移動は、分注装置支持部506を介する。分注装置702に直接接続(604)された薬剤分注制御部602をコンピュータ制御(402)することによって、試薬だめ508から試薬が分注される。
【0035】
図2は、分注装置702を、タンパク質スポット12上方に移動してタンパク質スポット12上に試薬のスポットを付着させるプリンタヘッド14の形で示す。このプリンタは、圧電プリンティングを利用して、スポットに接触することなく微量(ピコリットルのオーダー)の液体をスポット上面に放出する。
【0036】
プリントヘッド14は、オーストラリア特許722578号に記載された上述の技術を利用してアレイ内の特定のスポットのxy座標を提供する、先に生成されたアレイの画像を利用してスポットに向けられる。
【0037】
図3は、タンパク質スポット12上に付着された4x4試薬アレイの画像を示す。
【0038】
このように、従来技術と大きく異なり、本発明のプロテインチップによれば、真正のタンパク質アレイが提供されるとともに、イソフォームの問題を解決することができ、リッチなタンパク質を除去する技術が実現される。考えられる具体的な技術は、患者に抗体を作らせて、患者の血清をタンパク質アレイ上にプリンティングすることである。
【0039】
本発明の潜在的な用途には、新しい抗原に対する抗体スクリーニングの用途、ペプチド−タンパク質間相互作用及びタンパク質−タンパク質間の相互作用を計測する用途がある。
【実施例1】
【0040】
本実施例の目的は、精製された結核菌(TB)抗原をニトロセルロースのマトリックス上で用いてTBに対する患者の免疫反応性を決定する手法として、TBに対して血清陰性又は血清陽性なヒト血清を微量分注する化学的プリンティング技術を開発することであった。適切な抗原を用いて複数の条件や疾病に対する患者の免疫反応性を決定するためにこの手法を利用できることは、明らかである。
【0041】
(材料及び方法1.1)
一方はTBに対して血清陰性で他方は血清陽性な2人の患者からヒト血清を単離し、それをpH7.4の燐酸緩衝生理食塩水+0.05%(w/v)アジ化ナトリウム+0.1%(v/v)Tween-20(燐酸緩衝生理食塩水−洗浄緩衝液(PBS−WB))を用いて10倍に希釈した後、0.22μmのシリンジフィルタ(オーストラリア国ノースライドのミリポア(Millipore)社製)でろ過した。pH7.4のPBSに38kDa精製TB抗原を370μg/mlで溶解した液4μlをニトロセルロース膜(カリフォルニア州ハーキュリーズのバイオラッド(Bio-Rad)社製)に加えた後、乾燥させた。その後、0.5%(w/v)カゼイン(オーストラリア国キャッスルヒルのシグマ(Sigma)社製)のPBS−WB溶液を使用して、ニトロセルロース上の非特異的結合部位を15分間ブロッキングした。その後、55μmのオリフィスを有するAB-55微量噴射装置(テキサス州プレーノーのマイクロファブ・テクノロジーズ(MicroFab Technologies)社製)#B0-13-12を周波数240Hzで使用して、各血清サンプルの、スポットあたり100滴の4x4アレイを個々のTB抗原スポットに微量噴射した。ニトロセルロースの下にPBS−WBで飽和させたろ紙を敷くことによって、血清注入の間ニトロセルロースを湿潤状態に保った。血清噴射の10秒後、トランスファーピペットを用いて、ニトロセルロースをPBS−WB数滴ですすいだ。引き続いて、二トロセルロースを、フルオレッセインイソチオシアネート(カリフォルニア州サンフランシスコのザイメッド(Zymed)社製)に共役結合された抗ヒト免疫グロブリンGを0.5%(w/v)カゼインのpH7.4PBS−WB溶液に100倍の希釈率で希釈させたもので1時間温置した後、PBS−WBで洗浄した。標識された抗原を、バイオラッド(Bio-Rad)社(カリフォルニア州ハーキュリーズ)のFluorSTM マルチイメージャー(Multi-Imager)を用いて検出した。
【0042】
(材料及び方法1.2)
図6(a)及び図6(b)に示す装置を用いてニトロセルロースの下に吸収性組織を敷くこと以外は、上記の方法を繰り返した。吸収性薄紙は、TB抗原を含んだニトロセルロース膜の下に挿し込まれた。その後、この材料全体を、噴射対象領域を円形オリフィス18から露呈させた状態で図6(a)乃至図6(c)に示す装置の内部に閉じ込めるようにして圧締した。薄紙の下敷きにより、噴射溶液又は付与される少量の緩衝液や試薬を、瞬間的かつ特異な反応を許容する薄紙にニトロセルロースを通して確実に直ちに引き込むことができた。この手法により、免疫グロブリンの非特異的染色、ひいては非特異的反応の両方を防止し、ニトロセルロースの表面を横切って特定の抗体が注入されるのを防止することができた(下記参照)。方法1と異なり、この装置は、噴射中にニトロセルロース膜を乾燥状態に保った。その後、この膜をトランスファーピペットを用いて1滴のPBS−WBで処理した後、上述したように、抗原上に血清を噴射させた。
【0043】
図7(a)及び図7(b)は、38kDaTB抗原上にTB陰性又はTB陽性ヒト血清を微量噴射する効果を示す。TBに対して血清陰性(−)又は血清陽性(+)のヒト血清の4x4アレイ20を、38kDaTB抗原1.48μgの4μlスポットを含んだニトロセルロース上に噴射させた。このニトロセルロース膜の下に、PBS−WBで湿潤させたろ紙(A)又は密着状に挿し込んだ吸収性薄紙(B)を敷いた。フルオレッセインイソチオシアネート標識つき二次抗体を用いて、標識された抗原を検出した後、バイオラッド(Bio-Rad)社のFluorSTM マルチイメージャー(Multi-Imager)で解析した。図7(b)に符号20で示す薄紙パッキン及び乾燥膜により、抗原検出の感度と分解能が向上したことは明らかである。
【実施例2】
【0044】
精製された結核菌(TB)抗原に対して、SDS−PAGEと、その後にダイレクトブルー染色を用いる場合と用いない場合とでニトロセルロースへの電気的転写を行うことによってTBに対する患者の免疫反応性を決定する手法として、TBに対して血清陰性又は血清陽性なヒト血清を微量分注する化学的プリンティング技術の開発。
【0045】
(材料及び方法2)
38kDaTB抗原14.8μgを、等倍のSDS−PAGE非還元サンプル緩衝液を用いて200μlまで希釈させた。その後、サンプルを、4乃至12%(w/v)トリス−ビスポリアクリルアミド勾配ゲル(カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン(Invitrogen)社製)を用いてSDS−PAGE(1レーンあたり抗原1.48μg)により解析した後、ニトロセルロースに電気的に転写させた。ブロットの2つのレーンをダイレクトブルー染色によって可視化する一方(図8)、他の2つのレーンは染色しなかった。両方のブロットともに、室温で乾燥させ、続いて0.5%(w/v)カゼインのPBS−WB溶液で15分間ブロッキングした。その後、両方のブロットをPBS−WBですすぎ、乾燥させた。その後、ブロットを図1に記載の吸着装置内に取り付けた後、血清陰性又は血清陽性のTB血清を、上述したように、1x5アレイの形でダイレクトブルー染色ブロットと非染色ブロットを交互に配した38kDaバンド上に噴射させた。約10秒後に、トランスファーピペットを用いて両ブロットをPBS−WB2滴で洗浄した。その後、0.5%(w/v)カゼインのPBS−WB溶液で10倍に希釈されたフルオレッセインイソチオシアネート標識つき二次抗体5μlをブロットに付与し、その10秒後に、トランスファーピペットを用いてPBS−WB2滴を加えた。標識された抗原をバイオラッド(Bio-Rad)社(カリフォルニア州ハーキュリーズ)のFluorSTM マルチイメージャー(Multi-Imager)で解析した。
【0046】
図8は、ダイレクトブルー染色法を用いて、又は、用いないで、38kDa変性TB抗原+又は−上にTB陰性又はTB陽性ヒト血清を微量噴射する効果を示す。(A)1レーンあたり1.48μgの38kDaTB抗原を、4乃至12%ポリアクリルアミド勾配ゲルを用いてSDS−PAGEにより分離した。その後、タンパク質をニトロセルロース上に電気的に転写させた。その後、レーンのうちの2つをダイレクトブルーで染色した。(B)0.5%(w/v)カゼインのPBS−WB溶液でブロッキングした後、TBに対して血清陰性(レーン1及び3)又は血清陽性(レーン2及び4)のヒト血清1x5アレイを、38kDaTB抗原バンドに対して(上述したように)噴射させた。そのニトロセルロース膜の下に、図6(a)乃至図6(c)に示す装置を用いた噴射の間、密着状に挿し込んだ吸収性乾燥薄紙を敷いた。血清を噴射する前に、レーン3及び4のみをダイレクトブルーで染色した(A)。フルオレッセインイソチオシアネート標識つき二次抗体を用いて、標識された抗原を検出した後、バイオラッド(Bio-Rad)社のFluorSTM マルチイメージャー(Multi-Imager)で解析した。
【0047】
ニトロセルロース膜上に固定化された所定の抗原に対してケミカルプリンタを用いてナノリットル量のヒト血清を注入する現在の手法は、非常に功を奏し、(1分以内で)TB免疫反応性免疫グロブリンGを極めて高速に検出する手段を実現することが分かった。バックグラウンドも非特異的結合も観察されなかった。初期の研究では、噴射後の湿潤したニトロセルロース膜表面を横切って血清抗体が分散することにより、抗体アレイの分解能が低下することが分かった。乾燥したニトロセルロース膜の下に吸収性薄紙を敷くことによって、この問題がほぼ克服され、高特異性で分解能に優れた抗体アレイが実現される。
【実施例3】
【0048】
この実施例は、タンパク質断片を質量分析装置でマトリックス支援レーザ脱着イオン化法(MALDI)により解析する前に、アレイ上のタンパク質に酵素を付与することに関する。周知のように、様々な酵素が、タンパク質を様々なアミノ酸部位で切断する。IysC, AspN, ArgCなどの一部の酵素は、単一の特異なアミノ酸部位でのみ切断を行う。このことは、非常に情報量の多いスペクトルを発生させないようにする数個の大きな断片を生成するので、MALDI解析にとって問題である。ペプシンやキモトリプシンなどの他の酵素は、多数のアミノ酸部位でタンパク質を切断する。MALDI解析の前にこれらの酵素を使用することは、スペクトル中に微小なピークを多数発生させ、解読も非常に困難にする過剰な小断片が発生するという理由によっても問題がある。トリプシンとGluCは、2つのアミノ酸部位で切断を行い、解析にとって適したスペクトルを発生させる傾向があるので、MALDI解析に最適の酵素である。
【0049】
そうではあっても、これらの酵素は特異なアミノ酸部位でのみ切断を行うので、酵素を1種類だけ使用することは、タンパク質に関して限られた量の情報又は限られた対象範囲しか発生させない。しかしながら、本発明の方法を用いてアレイのタンパク質スポット上に2種類の酵素を噴射することにより、タンパク質の対象範囲が増加することになる。以下の実験は、本発明の方法を用いて2個のヒトプロアポリポタンパク質(human proapolipoprotein)上にトリプシンとGluCの両方を噴射して、トリプシンとGluCの両方を用いることによってトリプシン単独又はGluC単独の場合と比べて切断(ペプチドの照合)が向上することを説明している。
【0050】
本実施例の目的は、SDS−PAGEと、ダイレクトブルー染色を用いたポリビニルジフルオリド膜へのエレクトロブロッティングを行った精製タンパク質に対して多数のエンドプロテアーゼを微量分注することによって、タンパク質同定を向上させる化学的プリンティング技術を開発することである。
【0051】
(材料及び方法)
サンプルは、7M尿素、2Mチオ尿素、2%(w/v)CHAPS及び5mMトリスに全血漿を溶解させた液36μlであった。サンプルをXトリブチルホスフィンで還元し、zヨードアセトアミドでアルカリ化した。このサンプルを超音波処理した後、遠心分離して上澄みを集めた。その内容全体が本明細書に参照の形で盛り込まれている、ハーバート、ビー.(Herbert, B)及びリゲッティ、ピー.ジー.(Righetti, P. G.)「プロテオーム解析の転機:等電膜を用いた多室電解槽によるサンプル前分取(A turning point in proteome analysis: sample prefractionation via multicompartment electrolyzers with isoelectric membranes)」エレクトロフォレシス(Electrophoresis)21、3639〜3648(2000)に記載された方法を用いて、多室電解槽(MCE)を使用して前分取を実行した。
【0052】
乾燥した11cmの5−6IPGストリップを、タンパク質サンプル200μlで6時間再水和させた。再水和ストリップを最大10000Vで120kVhrの間等電点電気泳動させた。電気泳動させたIPGストリップを、6M尿素、2%(w/v)SDSを含有する平衡化緩衝液中で20分間平衡化させた。
【0053】
平衡化したIPGストリップを6乃至15%ゲルチップの添加用ウェルに挿入した。ゲルあたり50mAで1.5時間電気泳動を行った。タンパク質を、400mAで1時間20分間イモビロンPSQ PVDF膜上にエレクトロブロッティングさせた。タンパク質をダイレクトブルー71で染色した。
【0054】
その後、3M社の両面導電性テープを用いて、膜ブロットをAxima-CRF MALDI−TOF質量分析ターゲット板に貼り付けた(図9参照)。特定のタンパク質スポットを、各タンパク質スポットの1mm離れた2箇所に直径300μmの液滴50滴で分注される、1%ポリビニルピロリドンの50%メタノール溶液5ηlでブロッキングした。過剰なポリビニルピロリドンをミリQ水ですすいだ。200μg/mlGluCエンドプロテアーゼ50ηlをタンパク質上の一方のポリビニルピロリドンスポット上に噴射し、200μg/mlトリプシン未知量を同じタンパク質の残る一方のポリビニルピロリドンスポット上に噴射した。その後、水分を極力少なくした密閉状のランチボックス内に膜板を置いて加湿環境を作り、37℃で3時間温置させた。タンパク質消化の後、20%イソプロパノール、20%2−ブタノール、30%メタノール及び0.5%蟻酸に10mg/mlのα−シアノ−ヒドロキシ桂皮酸を溶解した液100ηlを、消化タンパク質スポット上に噴射した(図10)。消化物を、Axima-CRF MALDI−TOF質量分析装置を用いて解析した。
【0055】
多数のエンドプロテアーゼを微量分注することによってタンパク質同定のアミノ酸対象範囲を拡大させるこの手順は、GluC及びトリプシンがそれぞれ個別に達成可能なペプチド照合範囲が40%と46.09%であるのに比べて、総計で66.67%のペプチド照合範囲をもたらすことによって、功を奏することが分かった。
【0056】
使用されるマトリックス溶液は、20%2−ブタノール、20%イソプロパノール、30%メタノール、30%水及び0.1%TFA(トリフルオロ酢酸)からなる。このマトリックス溶液は、長期間にわたって安定した液滴を分注するのに適した粘性を有するという利点がある。
【0057】
上記具体的な実施形態に示す発明に対して、大略的に説明した本発明の意図と範囲から逸脱することなく多数の変形及び/又は変更を行い得ることは、当業者であれば理解できるであろう。したがって、本実施形態は、あらゆる点で例示とみなされるべきであり、限定的に解されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【0058】
【図1】図1は、二次元電気泳動によって分離され、固体支持膜上に転写されたタンパク質アレイを示す。
【図2】図2は、図1に示すアレイで同定されたタンパク質スポットの上面に小スポットからなるマイクロアレイ群を付着させるために使用されるケミカルプリンタを示す。
【図3】図3は、図1に示すスポット上に付着されたマイクロアレイを示す接写図である。
【図4】図4は、成分アレイ又はサンプルアレイの少なくとも1つの成分又はサンプルの位置の画像を収集又は記録し、記録された画像を利用して少なくとも1つの成分又はサンプルをその場で操作可能にすることによって成分アレイ又はサンプルアレイの情報を求める過程を示す概略図である。
【図5】図5は、成分アレイ又はサンプルアレイの少なくとも1つの成分又はサンプルを画像化し、操作し、解析する機器の概略図である。
【図6】図6(a)乃至図6(c)は、ニトロセルロース(NC)膜を圧締する装置を示す。
【図7】図7(a)及び図7(b)は、38kDaTB抗原に対してTB陰性又はTB陽性ヒト血清を微量噴射する効果を示す。
【図8】図8は、ダイレクトブルー染色法を用いた場合と用いない場合の、38kDa変性TB抗原に対してTB陰性又はTB陽性ヒト血清を微量噴射する効果を示す。
【図9】図9は、Axima MALDIターゲット板に両面テープで貼着された膜ブロットB745を示す。
【図10】図10は、上面にマトリックスを付着させた、トリプシン又はGluCエンドプロテアーゼで消化されたタンパク質の接写図である。
Claims (16)
- 高分子混合物を解析する方法であって、
支持体上に、高分子を複数のスポットに分離した高分子アレイを作成する工程と、
上記アレイの1つ以上の高分子スポットに1種類以上の試薬からなる二次アレイをプリンティングする工程とを備えた方法。 - 上記スポットに、少なくとも2種類の試薬がプリンティングされる請求項1記載の方法。
- 上記サンプルは、タンパク質、ペプチド、糖類、脂質、核酸分子、糖タンパクを含む複合生体分子、及びそれらの混合物からなる群から選択された生体分子である請求項2記載の方法。
- 上記アレイは、クロマトグラフィーによって作成される請求項1乃至3のいずれかに記載の方法。
- 上記クロマトグラフィーは、電気泳動である請求項4記載の方法。
- 上記電気泳動は、ポリアクリルアミドゲル内で実行される請求項5記載の方法。
- 上記ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動は、一次元目を等電点電気泳動によって、二次元目を天然ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動又はSDSポリアクリルアミドゲルによる電気泳動によって二次元で実行される請求項6記載の方法。
- 上記ゲル内に作成されたアレイは、上記二次アレイをプリンティングする前に、支持膜に転写される請求項7記載の方法。
- 上記支持膜は、二フッ化ポリビニリデン、ニトロセルロース、ナイロン、テフロン、ザイテックス、ポリプロピレン、ポリ四フッ化エチレン、及び1つ以上の官能基を有するそれらの誘導体からなっている請求項8記載の方法。
- 検出手段を使用して、上記高分子スポットと該スポットに付与された試薬との間に相互作用が発生したか否かを検出する請求項1乃至9のいずれかに記載の方法。
- 上記高分子は、タンパク質である請求項1乃至10のいずれかに記載の方法。
- 上記試薬は、LysC、GluC、トリプシン、AspN、ArgC、ペプシン及びキモトリプシンからなる群から選択された酵素である請求項11記載の方法。
- 上記試薬は、トリプシンとGluCである請求項12記載の方法。
- MALDI−TOF質量分析装置で解析用のMALDI−TOF質量分析窒素レーザビームを用いて、膜上の原位置のマクロアレイの1スポットの範囲内で1つの特定の酵素反応を有する分析物を脱着させる工程をさらに備えている請求項12又は13記載の方法。
- 上記高分子アレイは抗原又は抗体からなり、上記試薬はヒト又は動物由来のサンプルからなる請求項1乃至10のいずれかに記載の方法。
- 上記サンプルは、ヒトのサンプルであり、血漿、血清又は組織のサンプルである請求項15記載の方法。
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Family Cites Families (19)
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---|---|---|---|---|
US4452901A (en) * | 1980-03-20 | 1984-06-05 | Ciba-Geigy Corporation | Electrophoretically transferring electropherograms to nitrocellulose sheets for immuno-assays |
US4507233A (en) * | 1981-04-22 | 1985-03-26 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Colored molecular weight marker |
US4877745A (en) * | 1986-11-17 | 1989-10-31 | Abbott Laboratories | Apparatus and process for reagent fluid dispensing and printing |
US5217869A (en) * | 1987-10-13 | 1993-06-08 | Terrapin Technologies, Inc. | Method to produce immunodiagnostic reagents |
US5208458A (en) * | 1991-11-05 | 1993-05-04 | Georgia Tech Research Corporation | Interface device to couple gel electrophoresis with mass spectrometry using sample disruption |
US5587062A (en) * | 1996-01-24 | 1996-12-24 | Shimadzu Corporation | Sample collecting apparatus by gel electrophoresis |
US5958342A (en) * | 1996-05-17 | 1999-09-28 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Jet droplet device |
GB9624927D0 (en) * | 1996-11-29 | 1997-01-15 | Oxford Glycosciences Uk Ltd | Gels and their use |
US6083763A (en) * | 1996-12-31 | 2000-07-04 | Genometrix Inc. | Multiplexed molecular analysis apparatus and method |
US6245331B1 (en) * | 1997-01-02 | 2001-06-12 | New York Univ. Medical Center | Early detection of mycobacterial disease |
AUPO625497A0 (en) * | 1997-04-16 | 1997-05-15 | Macquarie Research Limited | Analysis of molecules |
US6485690B1 (en) * | 1999-05-27 | 2002-11-26 | Orchid Biosciences, Inc. | Multiple fluid sample processor and system |
AUPQ105599A0 (en) * | 1999-06-18 | 1999-07-08 | Proteome Systems Ltd | High resolution maldi analysis |
US6680208B1 (en) * | 1999-11-19 | 2004-01-20 | Becton, Dickinson And Company | Rapid protein identification using antibody mixtures |
GB9928787D0 (en) * | 1999-12-03 | 2000-02-02 | Medical Res Council | Direct screening method |
US6790636B1 (en) * | 2000-06-14 | 2004-09-14 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Rapid fluorescent labeling of tissue for microdissection using fluorescent specific binding agents |
US7094595B2 (en) * | 2000-10-30 | 2006-08-22 | Sru Biosystems, Inc. | Label-free high-throughput optical technique for detecting biomolecular interactions |
AU2002230788A1 (en) * | 2000-12-11 | 2002-06-24 | Hk Pharmaceuticals, Inc. | Multiplexed protein expression and activity assay |
EP1711819A4 (en) * | 2003-12-15 | 2008-04-16 | Univ Pennsylvania Ct For Techn | METHOD AND DEVICES FOR CARRYING OUT REACTIONS ON A TARGET PLATE FOR MALDI MASS SPECTROMETRY |
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006292680A (ja) * | 2005-04-14 | 2006-10-26 | Toyo Kohan Co Ltd | 固体支持体上において相互作用した生体分子を分析する方法およびそのための固体支持体 |
JP2007071879A (ja) * | 2005-09-08 | 2007-03-22 | Agilent Technol Inc | Maldiサンプルプレート撮像ワークステーション |
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