JP2005503558A - タンパク質及び/又はペプチド試料の濃縮 - Google Patents
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Abstract
本発明は、電気濃縮手段(23);各々正又は負に帯電する少なくとも二つの電極(7)(35);及びタンパク質及び/又はペプチド捕獲手段(17)を有してなる、タンパク質及び/又はペプチドを濃縮するためのデバイスに関し、該電気濃縮手段(23)は、ロート形状のキャビティーを有してなり、少なくとも一つの電極が電気濃縮手段の各々の側面に位置するデバイスに関する。本発明は、本発明に基づくデバイスで行うことができる、試料中のタンパク質及び/又はペプチドを濃縮する方法にも関する。
Description
【技術分野】
【0001】
本発明は、少量のペプチドを定量し、同定し、キャラクタリゼーションする前に、それらを生産し、固定化し、続いて取り扱い、化学修飾するために有用なデバイス(又は装置)に関する。本発明は、そのような生産、固定化及び引き続く修飾のための方法も含む。
【背景技術】
【0002】
タンパク質の同定は、タンパク質の消化物からのペプチドのマスに基づく、又は個々のペプチドからのフラグメンテーションスペクトルに基づく、マススペクトルデータを用いるデータベース中のタンパク質を同定する方法を導入することによって根本的に変わった。驚くべきことに、高感度のタンパク質/ペプチド分析及び同定において遭遇する主たる問題点は、分析装置(一般的にマススペクトロメーター、これはペプチドを、アトモルのレベル(又は10−18モルの濃度:attomole level)で順番に並べることができる)の感度に関するものでは通常なく、タンパク質の消化によるペプチドの発生と取り扱いに関するものである。
【0003】
従来技術では、標的タンパク質は、通常二次元ゲル電気泳動(2D−PAGE)又はアフィニティークロマトグラフィーによって分離され、例えば、二次元電気泳動ゲルから一スポットに対して約20μm等の適当な大きさの体積の溶液に回収された。従って、タンパク質は極めて希釈された状態で回収された。例えば、マイクログラムの材料を、50,000MWタンパク質として利用できる場合、濃度(20pmol)は、1μMである。これは、たいていのプロテアーゼのKmよりすこし低い。たとえ今まで通り消化が起こるとしても、極めて遅いプロセスとなるであろう。更に、ナノグラムしか利用できない場合、即ち、ナノスプレイ・イオナイゼーション(nanospray ionisation)を用いる近代的なマススペクトロメーターの感度の範囲に十分に入る20フェムトモル(又は10−15モル:femtomole)しか利用できない場合、タンパク質溶液が希薄すぎるので、消化が有意義な程度で起こらないだろう。
【0004】
従来技術のデバイスの更なる欠点は、通常プラスチック又はガラス製のコンテナ(又は容器)の壁が、極めて容易にペプチドとタンパク質を吸収し、タンパク質/ペプチド溶液がコンテナと接触してから一時間又はその程度の時間で大量のロス(又は損失)を生ずることである。更に、ピペット操作又はクロマトグラフィーシステムに移すこと等の引き続く取り扱い工程の全ては、大きな表面との接触を伴い、劇的に試料のロスを増加させる。
【0005】
上述の方法の一般的なレビュー(又は総説)として、例えば、Staudenmann, W., Dainese Hatt, P., Hoving, S., Lehmann, A., Kertesz, M., and James, P. (1998) Electrophoresis, 19, 901-908. "Sample handling for proteome analysis" を参照されたい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の要約
本発明の一つの目的は、少量のペプチド及び/又はタンパク質の、濃縮、消化及び/又は化学修飾等の、取り扱い性(又はハンドリング性)を向上するデバイス(又は装置)及び方法を提供することである。他の目的は、いずれかの適当な方法によって分析が引き続き行われる表面に、ペプチド及び/又はタンパク質を直接固定化する、そのようなデバイス及び方法を提供することである。更に本発明の別の目的は、コンテナの壁の吸収によるペプチド及び/又はタンパク質のロスを減少させて行うことができ、それによって、デバイス中のペプチド及び/又はタンパク質の長時間の保持を可能とする、上述の取り扱いのためのデバイス及び方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の目的は、添付した特許請求の範囲に記載したデバイス及び方法によって達成することができる。
【0008】
定義
本明細書において、用語「捕獲(capture)」とは、例えばペプチドを、例えば担体(又は支持体:support)に、非共有結合的に結合させることを意味する。
用語「ペプチド及び/又はタンパク質」は、アミノ酸のいずれかの鎖又はそれらの修飾された形態を含むものとして理解すべきである。
【0009】
発明の詳細な説明
本発明の第一の要旨は、試料中のペプチド及び/又はタンパク質を濃縮するためのデバイスであって、そのデバイスは、
広い末端と狭い末端を有するロート形状のキャビティ(又は空洞)を有して成る電気濃縮手段(electroconcentration means);少なくとも二つの電極であって、一の電極は該広い末端の近くに配置され、一の電極は該狭い末端の近くに配置される電極;並びに一又はそれ以上のペプチド及び/又はタンパク質捕獲手段を有して成り、
該捕獲手段は、該狭い末端と、該狭い末端の近くに配置される該一の電極との間に配置されているデバイスである。
好ましい態様において、本発明のデバイスは、シール(又は封止)によって、一緒に保持されたアッセンブリとして提供される。使用の間に、デバイス全体は、泡の発生を防ぐために、およそ2〜3バールで、加圧されたコンテナの中に保持することが好ましい。さもなくば、電気泳動の間に、通路をブロックし、また電流を止める泡が発生し得る。
【0010】
試料を、電気溶離バス(electroelution bath)内に存する電気溶離チャンバー(electroelution chamber)中のデバイスに加えることができる。電気溶離チャンバーを、その後の分析のために、例えば、クランプを用いて、MALDIターゲット等の分析ターゲットに固定することができる。
【0011】
デバイスを製造するために使用する材料の種類は、分析の様式(又はモード)に基づいて、変えることができる。従って、電気溶離バスは、タンパク質吸収度が十分に低いいずれかの材料から製造することができ、プレクシグラス(Plexiglas)等の機械加工しやすいものが好ましい。材料特性に対する同じ基準を、電気濃縮手段にも適用することができる。電極、クランプ、及び分析ターゲットは、例えば、ステンレス鋼又は、金等の貴金属でコートされた金属等の化学的に不活性な金属から製造することができる。シールは、シリコーンゴムチュービング等のいずれかの可撓性の材料であってよい。捕獲手段は、機械的に安定であり、極めて化学的に耐性が高いので、テフロンディスクに埋め込まれたC18シリカ等のトラップ材料(trapping material)を含む。このことから、気相にて、例えば、臭化シアン、ペンタフルオロプロピオン酸及びS−エチルトリフルオロアセテート等の試薬と、化学的消化等の化学反応を行うことが可能となる。しかし、他のトラップ材料を用いることができ、次に用いる分析方法に基づいて、この分野の当業者であれば容易に選択することができる。特定の態様において、試料を、MALDI−TOFマススペクトロメトリーを用いて分析する場合、装置内に所定のポテンシャルで膜を固定しなければならないので、金属片からなる分析ターゲットは、化学的に耐性のある金属から製造される。さもなければ、使用する分析方法に応じて他の材料を用いてよい。一の態様において、分析ターゲットは、加熱要素を含み、消化温度を約37℃に保つことができる。別の態様では、外部加熱源を用いて制御することができる。本発明の有利な特徴は、捕獲手段を保持する各穴の周りに、「歯(teeth)」又は高くした縁(又はエッジ)があってもよいことであり、試薬又は試料のクロスフロー(又は交差流:cross flow)は最小になり又は全くなくなる。他の溶離フォーマット、例えば二重の溶離チャンバーを用いることができる。
【0012】
本発明を行うための一つの態様において、ペプチド及び/又はタンパク質を、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム又は尿素等の界面活性剤又は可溶化剤と平衡状態とし、それらが十分に溶液中に存在するようにする。しかし、他方、ペプチド及び/又はタンパク質は、例えば、2Dのゲルスポット等のゲルスライス中に存在してもよく、又は他のいずれかの担体に非共有結合的に結合していてよい。その後、タンパク質含有試料は、電気濃縮ロート形状ブロックのロート中に配置される。
【0013】
ロート形状のキャビティーの体積は、いずれの体積にも適応させるようにデザイン(又は設計)することができるが、通常使用される試料の体積の範囲に対応する、約0.5〜10mlの体積を用いることが好ましい。ロートの入口のサイズは、厳密なものではないが、ロートの狭い出口末端のサイズは、二つの理由から重要である。第一に、それは、消化されている材料の最終的な濃度を規定するロート形状のキャビティーの出口末端部分の体積であるからである。たいていのタンパク質分解酵素のKmは、5〜50μMの範囲にあるので、タンパク質の消化は、pmol/μlの程度でのみ、有効である。例えば、タンパク質の量が、100フェトムモルの領域にあるならば、ロート形状のキャビティーの狭い末端は、約100nlより小さい体積を有するべきである。当該分野の当業者であれば理解できるように、消化する量が少なくなると、それに比例して小さく成るべきである。第二に、出口の穴の直径は、ペプチド及び/又はタンパク質捕獲エリアを規定し、そのエリアは、分析のために引き続き用いられる。エリアが小さくなると、消化され又は濃縮された材料の濃度が高くなり、それゆえ、例えば、マトリックス−アシスティッド・レーザー・デソープション・アンド・イオニゼーション(又はマトリックス支援レーザー脱離イオン化(matrix-assisted laser desorption and ionization): MALDI)マススペクトロメトリー(MS)、(フッ素ラベル材料用の)フルオリメトリー(fluorimetry)又は検知方法に基づく種々の抗体等の応用の感度が高くなる。最小のサイズは、検知方法によって規定され、MALDI−MSを用いる場合、レーザーのスポットのサイズである。実験的に、最小の有用なサイズ、即ち、MSカットオフ膜(MS cut-off membrane)に近くのロートの最も狭いポイントを規定することができ、この配置では、約30μmである。従って、以下に記載する一つの態様において、デバイスのロート形状のキャビティーの狭い末端の出口の寸法は、構想した分析方法に適応させる。
【0014】
従って、本発明は、極めて少量のペプチド及び/又はタンパク質の濃縮、消化及び/又は化学修飾を可能にするデバイスであって、選択した方法を用いて引き続き分析することができる表面に、それらを直接固定化するデバイスを開示する。
【0015】
本発明に基づいて、分離されたペプチド又はタンパク質の濃度は、約20〜100nl又はそれより低い最終体積に下げることができ、従来技術と比較して、そこでは、消化は、通常、約20μl付近のゲルスポット中で行われ、又は5μl付近を必要とするエレクトロブロッティング(electroblotting)担体上で、行われる。
【0016】
本発明の一の態様において、捕獲手段は、正に及び/又は負に帯電したペプチドを捕獲することができる固定化担体の形態にある。他の態様において、特定の固定化担体は、抗体、アフィボディー(affibody)等を用いて製造することができる。別法では、タンパク質の特定の結合特性を用いることができ、イオン交換又は特定の固定化金属イオンクロマトグラフィー(immobilised metal ion chromatography:IMAC)担体を、酸性、塩基性又はホスホペプチド(phosphopeptide)を捕獲するために使用することができる。
【0017】
本発明のデバイスの有利な態様において、電気濃縮手段のロート形状のキャビティーは、該キャビティーの長軸の方向が本質的に垂直に位置し、狭い末端より広い末端が上となる状態にある。
【0018】
本発明のデバイスを、二つの異なるモード(又は様式)で、操作することができる。これらの態様の第一の態様は、酵素を用いてタンパク質分解を行う場合、又はより高分子量の分子を含む混合物からペプチドを抽出すべき場合に、用いることが好ましい。本発明に基づくデバイスは、更に、ペプチドのパス(又は通路)に配置される半透過性制限膜(semi-permeable restriction membrane)又はサイズカットオフ膜(size cut-off membrane)を、ペプチドが捕獲手段に到達する前に膜を通らなければならないように、有してなる。膜は、セルロースアセテートから製造してよく、穴をより小さくし、機械的及び化学的に構造を安定化するために、例えば、無水酢酸を用いて処理することができる。別法では、例えば、シリカガラス又はアクリロニトリル等のポリマー等の所定の穴のサイズの範囲で作られたいずれかの材料を含み、これらは膜としてよりもむしろデバイスの肝要な部分として作ることができる。
この態様を用いる場合、試料をデバイスに入れ、プロテアーゼ等の酵素を加え、試料を一緒に濃縮する。タンパク質は溶液中に残り、それらは極めて濃縮されるので、酵素によって効果的に消化することができる。例えば、3000 Dalton 付近の分子量カットオフを有する膜(Spectrapore inc. 社製等の多数の市販のものを使用することができる)を、その後タンパク質溶液と捕獲手段との間に配置する。従って、MS/MS分析に基づいて分析できるより小さなペプチドのみが、捕獲手段にてトラップされ、MS分析を妨げるPEG等のポリマー又は大きなタンパク質等のいずれかの大きな分子は、カットオフ膜によって除かれる。タンパク質はカットオフ膜上で濃縮されるが、膜を通過することはできない。しかし、消化される間に放出されるペプチドは、膜を通ることができ、その後取り扱う前に、引き続き捕獲膜上に固定化される。
【0019】
第二の態様において、本発明のデバイスは、膜を用いることなく操作することができる。これは、捕獲したタンパク質又はペプチドを化学薬品を用いて消化しなければならず、濃縮ロートの末端の直径によって、濃縮ファクターを測定することができる場合、特に有利である。この目的のために適する化学薬品は、例えば、臭化シアン、ペンタフルオロプロピオン酸又はS−エチルトリフルオロアセテート等である。例えば、フェムトモル量の材料を消化するために、タンパク質を、通常1fmol/μlの程度から、pmol/μlの程度まで、濃縮しなければならない。
【0020】
従って、一つの態様において、本発明のデバイスは、標識(ラベル又はタグ:tag)されたタンパク質に対して特に適する。この態様において、本発明のデバイスは、相互に離れた二つの捕獲手段を含んでなり、その一つは、修飾されていないペプチドが通過することができるマスク(mask)が先(又は前)に配置されており、他の一つは、修飾されたペプチドが通過することができるマスクが先に配置され、ラダーケミストリー(ladder chemistry)によるペプチドの指紋を生ずるように適合されている。この態様において、標識は、ラダーケミストリーによって生ずるシーケンスであり、それは、当該技術分野の当業者にはよく知られた概念である。ここで好ましく用いられる化学は、よく知られたエドマン分解(Edman degradation)に類似の、チオアセチルチオエステル分解である。より詳細には、効率の悪い、ペプチドのN−末端アミノ酸の20%くらいにセットアップされ、除去される。これを3回繰り返し、約40%の無傷のペプチド1、30%のペプチド1−1アミノ酸、20%の二つのアミノ酸が除去されたもの、10%の一つのアミノ酸が除去されたものを得た。MSのピークの間のマスの相違によって、シーケンス(又は配列)を知ることができる。例えば、親のペプチドのマスが1000、−1aaマスが943、−2aaが830、−3aaが701の場合、シーケンスタグ(sequence tag)は1000、グリシン、ロイシン、グルタミン酸である。
【0021】
有利な態様において、例えば膜担体等の捕獲手段は、フロースルー(flow-through)反応器として用いることができ、極めて少量の材料を高効率で化学的に修飾することができ、及び/又は例えば、マススペクトロメトリー、ファンクショナルアクティビティーアッセイ(functional activity assay)、又はフルオレセンスディテクション(fluorescence detection)による分析のために直接用いることができる。デバイスは、引き続き修飾し及び/又は分析するために、大量のタンパク質を、濃縮し、消化し、膜に固定化することができるように平行して操作することができる。従って、本発明に基づくデバイスは、自動化された手順に特に適し、従来技術の方法と比較して、プロセスの時間とコストを実質的に節約することを可能とする。従って、本発明のデバイスの一の態様において、捕獲手段を、MALDI−MSにて使用するために適合する。
【0022】
下記の実験の部において、本発明に基づくデバイスの一つの実施例を、図面を参照しながらより詳細に説明する。しかし、当該分野の当業者であれば理解できるように、本発明のデバイスを、例えば、シリコンチップとして、アレイとして、単一のユニットとして、使い捨てのユニットとして、再利用可能ユニット等として、別の方式(又は様式)で構成することができる。全ての場合において、原理は、同じままである。即ち、液相のタンパク質の濃縮は、引き続く分析のための固定化表面上で、消化又は捕獲することが可能である。
【0023】
本発明の第二の要旨は、試料中のペプチド及び/又はタンパク質を濃縮するための方法であって、
(a)ペプチド及び/又はタンパク質と消化剤を含んでなる試料を、電気泳動デバイスに供給し、電気溶離バスは、実質的にロート形状のキャビティー内に存在する工程;
(b)該電気溶離バスの側面の各々に配置されている少なくとも二の電極間に電圧を印加し、該ロート形状のキャビティーの狭い末端と、該狭い末端のより近くに配置されている電極との間に配置されている捕獲手段に向けてペプチドを移動させる工程;
(c)少なくとも一度電圧の方向を変えて、正に帯電したペプチドと負に帯電したペプチドの両方が捕獲手段に接触できる振動をもたらす工程;並びに
(d)濃縮されたペプチドを捕獲手段から収集する工程
を含んでなる方法である。
【0024】
電圧(又は電位差)は、ペプチド及びタンパク質がある方向に移動することを引き起こし、移動速度は、サイズに反比例する。タンパク質は、試料中に存在するSDS等の界面活性剤のために、負に帯電するので、それらはそれらがいる場所に実質的にとどまる。消化されると、得られるペプチドは正に又は負に帯電し得る。ゆえに、場合により電圧を逆転しないと、捕獲膜から移動するから、一つの組が失われる。通常、最初の電圧の間の実際の消化は、引き続き行う電圧方向の変更(それは、より頻繁に、例えば、10分毎に行われる)と比較して、より長い時間、例えば、2、3時間続く。しかし、各々の所望の濃縮手順のための、正確な間隔と反応時間を、当該技術分野の当業者であれば、容易に決定することができる。
【0025】
本発明の方法の一つの態様において、消化剤は酵素であり、好ましくはプロテアーゼ(例えば、トリプシン、V8プロテアーゼ、LysC、AspN等)又はグルコシダーゼであり、引き続くグリコ−部分(glyco-portion)の分析の前に、親水性担体上に捕獲するためにO−及びN−結合サッカライド(O-and N-linked saccharide)を放出する。
【0026】
本発明の他の態様において、上述の方法が、ロート形状のキャビティーの狭い末端と捕獲手段との間に、サイズカットオフ膜を導入することによって、タンパク質等のより大きなサイズの分子を、ペプチド等のより小さなサイズの分子から分離する工程を更に含んでなるように、適合される。試料が、デバイスを通って、下流に都合よく流れるように、膜は、消化の間及び消化の終わりにおいて、タンパク質が捕獲手段に到達することを防ぐ。従って、それは、いずれかの大きなフラグメントが膜に来ることを防止する。本明細書において、用語「大きい」とは、所望ではないサイズのフラグメントを意味し、膜のカットオフ値(cut-off value)は、ペプチドの所望のサイズに応じて選択されることが、理解される。
【0027】
本発明の一つの方法において、工程(b)では、試料はロート形状のキャビティーの後、二又はそれ以上の部分に分割され、各々の部分は別々の捕獲手段に向けて送られるが、一の捕獲手段は非修飾ペプチドが通ることができるマスク先(又は前)に置かれ、他の一の捕獲手段は修飾されたペプチドが通ることができる異なるマスクが先に置かれており、更に工程(d)では、非修飾ペプチドが一の捕獲手段から収集され、ペプチドの指紋をもたらす標識されたペプチドは、他の一の捕獲手段から収集される。従って、デバイスについて上述したように、標識を行うことができる。各消化物は、ペプチドの指紋(peptide fingerprint)として知られている一組のペプチドのマスを生ずるので、同じ酵素を用いて消化した場合、これを、同様の理論的な一組のペプチドを生ずるデータベース中のタンパク質を同定するために使用することができる。これは、ペプチドマス指紋法(peptide mass fingerprinting)として知られている。しかし、従来技術では、これは、しばしば信頼することができる同定をするには不十分であるとされてきた。従って、本発明は、一つのペプチド当たり三つのアミノ酸による小さなシーケンスと同様のペプチドの指紋を生ずることを可能とする。これにより、タンパク質をより高い信頼性のレベルで同定することができ、以前より、より効率的に同定することができる。この目的のために詳細には、標識技術を説明する:シーケンスタグを用いる同定のアルゴリズム及びエキゾペプチダーゼ(exopeptidase)を用いてそれらを生じさせる方法については、Korostensky, C., Staudenmann, W., Dainese, P. Hoving, S., Gonnet, G., and James, P. (1998) Electrophoresis, 19, 1933-1940. "An algorithm for the identification of proteins in sequence databases using peptides with ragged N- and C- termini generated by sequential endo- and exopeptidase digestions" を参照されたい。また、化学的に標識(又はタグ)を発生させる方法については、Hoving, S., Muenchbach, M., Quadroni, M., Staudenmann, W., and James, P. (2000) Anal. Chem. 72, 1006-1014. "Multiple N-terminal tag generation from unseparated protein digests using a novel thioester based degradation reaction" を参照されたい。
【0028】
特定の態様においては、ペプチドの指紋は、チオアセチルチオエステル分解(又はデグラデーション)によって生ずる。これは、フェニルイソチオシアネートを用いるエドマン分解、又はイソチオシアネート部分を有するいずれかの他の適切な試薬を用いるエドマン分解によって行うこともできる。
【0029】
本発明の別の態様において、濃縮すべきタンパク質及び/又はペプチドは、ゲル中又は溶液中に存する。別法では、それらは、担体に非共有結合的に結合することができる。酵素を、例えば、電圧を印加する前に電気溶離バス中の試料に加えて、タンパク質をペプチドに消化することができ、またゲルの一部に再水和することができる。
【0030】
本発明の方法の一つの特定の態様は、タンパク質及び/又はペプチド試料の分析に適切であり、工程(d)で得られる捕獲手段を、MALDI−MS等の検出装置に挿入する更なる工程を含んでなる本発明に基づく方法である。
本明細書において、ホスホリレーション(phosphorylation)及びグリコペプチド脱離(glycopeptide elimination)分析を好都合に用いることができる。この目的について詳細には、試験管中で行われるホスホリレーション分析のための方法が、記載されており、Quadroni, Q. (2000) Principles and Practice. Proteome Research: Mass Spectrometry. Specific detection of analysis of phosphorylated peptides by mass spectropetry, pp 187-206. Wiley-Springer Verlag. Ed. James P. を参照されたい。
【0031】
本発明の方法の有利な態様は、上述した本発明に基づくデバイスを用いる。
【0032】
従って、要約すると、本発明の方法の一つの例示的な態様において、タンパク質を含んでなる試料は、始めに、上述したように平衡状態とし、プロテアーゼ等の酵素又は消化薬を加える。電気泳動を、該添加後に開始する。上述したような低分子量カットオフ膜の上に集中させ、その後電圧の極性を例えば、一時間の間に、5分又は10分毎に、一回又は数回反転させる。第一膜を通過できるほど十分に小さいフラグメントは、極めて素早く(それらは小さいので)それらが固定化されるC18膜上に移動する。緩衝剤をバスから除去し、その後好ましくない塩を除去するために固定化担体を通してトップからボトムへ水を通すことが好ましい。一つの態様において、本発明の方法は、デバイスを分解し、選択した測定装置に挿入する、分析工程を含んでなる。例えば、試料をMALDIを用いて測定する場合、担体を転化(invert)し、水中の80%アセトニトリル、1.25%TFA中に、α−シアノ−4−ヒドロキシ−ケイ皮酸、10mg/ml等のMALDIマトリックス(MALDI matrix)約1〜2μlを加え、膜中に流した。担体は、MALDI−MS中に配置するに適する。他の態様では、担体は、ナノ−エレクトロスプレイチップ(nano-electrospray tip)として使用することができる。MALDIターゲットから引き出される各チャンネルの下端は、約10μmの直径の出口を有する鋭い円錐形の形状に作ることができる。本明細書において、用語「鋭い円錐形の形状(sharp conical form)」とは、中央に穴を有する円錐形の形状であって、穴の周囲の出口の地点の壁は、極めて狭く/鋭い、即ちコーンの内側の角度は、45°以下であることが好ましく、30°又はそれ以下であることがより好ましい。高圧液体クロマトグラフィーのラインは、ターゲットを横切ってとめられ、勾配は、HPLC−MS測定が可能なように、変わる(又は流れる)。他の態様は、C18粒子を有する二重のトラップ層(double trapping layer)を始めに用い、その後強いカチオン交換体を用いる。試料をMALDIを用いて始めに測定することができ、その後マトリックスを、強いカチオン交換体と結合したペプチドを残すいずれかの適当な溶媒でそそぎ、例えばTFA又は蟻酸と水中のアセトニトリルとの適当な勾配を用いて、ペプチドを溶離(又は溶出)する。
【0033】
要約すると、本発明は、新規なデバイスと方法を開示し、従来技術の2Dゲルからタンパク質を濃縮するためのゲルベース濃縮系と比較すると、下記の長所を有する:
【0034】
本発明に基づくと、試料を染色(又は着色)する必要がない。従来技術では、タンパク質は、目に見えるようにするために染色しなければならなかった。このことは、特に小さいタンパク質について、固定化の間にロス(又は損失)を生じ、染色工程と脱色工程に時間の浪費を生じる。染料の前面に対するタンパク質の位置を参照することで、たとえタンパク質を、染色することなく収集することができたとしても、これは、信頼できるものでなく、タンパク質の完全な回収を確保するためにゲルのより大きな体積を取り除くことをもたらす。
【0035】
更に、本発明に基づいて、タンパク質は、従来技術の方法と比較して、プロテアーゼと消化剤に容易に接近することができ、ポリマーマトリックス中にトラップされたタンパク質は、プロテアーゼに接近することができないまま残ることができる。
【0036】
従来技術の方法においては、存在する緩衝剤(又は緩衝液)と界面活性剤は、HPLCとMSの分析を妨げ、高感度の分析を行うために除去しなければならず、このことは更にロスを生じさせる。本発明に基づくと、そのような必要はない。
【0037】
最後に、従来技術で必要とされる、引き続くピペット操作工程及び移動工程と、凍結乾燥による濃縮は、更に試料のロスを生じさせる。更に、試料のロスは、特に重大であり、即ち、金属表面上での、例えば、金属製HPLCカラムの内側、カラムの開始端と終端のフリット(frit)、インジェクションバルブ等でのホスホペプチドのロスは、特に重大である。そのようなロスも、本発明に基づいて避けることができる。
【0038】
本発明を、例を参照しながら以下に説明するが、例は本発明を説明するためにのみ記載したものであり、添付した特許請求の範囲によって本発明は限定されると同様に、例は本発明を制限するものとして解釈してはならない。本願明細書のいずれかに記載した全ての参照文献は、参照することによって、本願明細書に組み込まれる。
【実施例】
【0039】
実験の部
例1:消化のためのデバイス
MALDIと共に使用するために特に適合(又は構成)された本発明に基づくデバイスを、図1a)及び1b)を参照しながら以下に説明する。図1a)は、基材5内に形成された実質的に同一の電気濃縮セル(electroconcentration cell)3のアレイ1の部分を通る断面を模式的に示し、図1b)は、図1a)の断面の上からの図を示す。アレイは、いずれかの適当な数のセルを含んでよく、例えば、8行12列、又は10行10列等の多数の行と列を含む格子パターンに配置することが好ましい。図1a)と図1b)に示すそのようなセルの一つの構造を以下説明する。セル3は、該基材5の中に形成された規則正しく成型されたキャビティー3、この例では立方体、として形成することが好ましい。電源(図示せず)と接続された第一電気濃縮電極7が、キャビティー3の下部に設けられている。壁9又は同等物の形状のスペーサー手段は、キャビティー3の中央へ向かって少しの距離を突出し、第一電極7を含むために十分なキャビティー3のベースからある距離をのびて、MALDIターゲットスライド(MALDI target slide)12を支持する。MALDIターゲットスライド12は、例えばステンレス鋼、アルミニウム等の電導性材料の第一及び第二の薄い四角(又は正方形)のシート11、19を含んでなり、第一の下方シート11上に、接触する第二の上方シート19を有して配置される。シート11、19は、例えば、接着、溶接、蝋付け、かしめ、折りたたみ、リベット留め、ボルト固定等のいずれかの適当な手段を用いて結合する。シート11、19は、MALDIターゲットスライド12が、キャビティー3の内側にぴったり合うように、キャビティー3の内壁の長さよりわずかに短い長さの又はそれと同じ長さの側面を有する。MALDIターゲットスライド12を、壁9に配置する場合、MALDIターゲットスライド12の縁の外側を通って液体が流れないように、MALDIターゲットシート11、19、壁9及びキャビティー3の寸法は、適合していることが好ましい。このことを達成するために、必要であれば、シールしてもよい(図示せず)。MALDIターゲット下方シート11は、中央の貫通穴13を有し、それは、下方シート11の上方の表面の円柱状の切り抜き15の方へ通じる。切り抜き15の直径より小さい直径と切り抜き15の高さ以下の高さを有するディスク状の捕獲手段17は、切り抜き15の中に配置される。捕獲手段は、例えば、テフロン(登録商標)膜中のC−18シリカ粒子を含んで成る半透膜の形態であってよく、それは、関与し得る分子を捕獲することができる。次に、上方シート19は、第一シート11の貫通穴13と実質的に同心に配置される中央の貫通穴21を有す。化学的に不活性な絶縁材料、例えばプレクシグラス(登録商標)で作られた電気濃縮ブロック23は、第二の上方シート19上に配置され、接触してシールする。ブロック23が、キャビティー3の内側にぴったり合うように、ブロック23は、キャビティー3の内壁の長さと同じ長さの、又はわずかに短い長さの側面を有する。ブロック23の高さは以下に説明するように消化作用(又は機能)ロートと膜を含むことができるに十分なものである。MALDIターゲットスライド12の上方シート19の上方表面と接触するブロック23の下方表面は、円柱状の中央の切り抜き25を有し、それは下方シート11の切り抜き15と実質的に同心である。切り抜き25は、分子量カットオフ膜、例えば、3000Da分子量カットオフ膜27を含む。ブロック23は、貫通穴13、21と実質的に同心であるチャンネル29を更に有する。チャンネル29は、切り抜き25から伸びており、ブロック23中に形成される逆円錐形状の電気濃縮ロート31の狭い口を形成する。ロート31の上方の広い末端は、ゲル試料33を受け取るに十分に広く、一般的に、直径のサイズが約1〜10mmであり、ロート31は、チャンネル29の直径に先細りしている。第二の電極35は、ブロック23の上方に配置され、バスの流体37に浸されている。バスの流体は、第一電極7が第二電極35と電気的に接触するように、セル3を満たす。
【0040】
デバイス全体は、約2〜3バールの加圧コンテナ中に保持され、電気泳動中の泡の発生が通路をふさぎ、電流を止めることを防止する。
【0041】
分子量カットオフ膜27は、セルロースアセテートから作られ、無水酢酸で処理されることが好ましい。捕獲手段17用のトラップ材料は、テフロンのディスク(「Empore」(登録商標)として既知)内に埋め込まれたC18シリカであってよく、それは、臭化シアン、ペンタフルオロプロピオン酸及びS−エチルトリフルオロアセテート等の試薬を用いて、気相にて、化学的な消化等の化学反応を行うことを可能とする。MALDI−TOFマススペクトルにおいて、装置内に所定の電位で膜を固定しなければならないので、MALDIターゲット(即ち、シート11、19の間に、Empore膜が取り付けられている)は、化学的に耐性の金属で作られている。MALDIターゲットは、加熱要素(図示せず)を含むことができ、消化温度を所望の温度、例えば37℃に保つことができる。分子量カットオフ膜27とC18−テフロン材料は、ターゲット全体をカバーする各々一つの膜である。各々の穴の周囲の「歯」又は高められた縁が膜を保持するので、試薬又は試料のクロスフローはない。
【0042】
タンパク質分解酵素を加えた後、電気泳動を開始する。300Vの電極間電位差を2時間用いることで、低分子量カットオフ膜の上にタンパク質と酵素を集中させる。その後、電圧の極性を5分毎に1時間逆転させた。第一膜27を通過するに十分小さいフラグメントは、(それらは小さいから)極めて素早く、それらが固定化されるC18膜17上に移動する。緩衝剤をバスから除去し、その後塩を除去するために固定化担体の上端から下端まで水を通す。その後デバイスを分解し、MALDIターゲットを逆さにし、水中の80%のアセトニトリル、1.25%のTFA中に、α−シアノ−4−ヒドロキシ−ケイ皮酸、10mg/mlの形態の1〜2μlのMALDIマトリックスを加え、膜17の中に流れ入ることが可能になる。その後、ターゲットを、MALDI−MS中に配置した。この態様において、MALDIターゲットから引き出す各貫通穴の下端は、10μmの直径の出口を有する鋭い円錐形の形状で作られていることが好ましい(尚、説明を明確に行うために、これらの図中の穴は、共通の縮尺で記載されていない)。高圧液体クロマトグラフィーラインが、ターゲットを横切ってとめられており、勾配が変わり、HPLC−MS測定が可能になる。
【0043】
例2:ペプチドの濃縮
ゲルからの試料を可溶化するための条件:
ゲルからカットされたタンパク質は、非固定ゲル(共有結合性蛍光染色又は逆染色)からカットされた場合0.1%のSDSを含み、固定され洗浄された(silver Coomassie etc stains)場合、SDSを含まない。染色されたタンパク質は、3%SDS中に一夜間ゲルを放置することによって、可溶化される。両方のタイプの試料に対するゲル中の最終濃度は、0.001〜0.03%の間である。このことは、吸着を低下するデバイス表面の飽和を助け、タンパク質の移動性を増加させる。
実験の説明:
10種のタンパク質(馬の心臓のチトクロームc、組み換えクジラミオグロビン、カルモジュリン、ウシ属の血清アルブミン、及び大腸菌からの小さな30Sリボソームの6種のサブユニット(30SサブユニットS1、S2、S4、S8、S11及びS16))を、エッペンドルフ管(Eppendorff tube)内の溶液中で又はデバイス中で種々の濃度で消化した。全ての場合において、消化を、エッペンドルフ管中の10μlの体積で、37℃にて、0.001%のSDSと100mMの炭酸水素アンモニウム中の0.1μgのトリプシンを用いて行い、またデバイスに加えた。充填した後、300Vの電圧を2時間印加し、デバイスを37℃に保持した。2時間後、次の4時間の間、10分毎に電圧の極性を逆転した。溶液を、Empore C18膜を通すことよって、溶液消化(solution digestion)を、6時間後に停止した。水中に60%アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸溶液5μlを用いて、ペプチドを溶離した。マトリックスで予めコートされた表面上に、複数回のスポッティングと乾燥によって、5μl全部をMALDIターゲット上に充填し、マススペクトルを測定した。電圧を除去し、デバイス中の固定化担体を通して溶液を流れるようにすることで、デバイス中での消化を止めた。デバイスを分解し、80%アセトニトリル中のマトリックスを、タンパク質と接触していない側の固定化担体上にスポッティングした。
【0044】
【表1】
【0045】
例3:リボソームタンパク質の分離
大腸菌MC4100(F-araD139 D(argF-lac) U169 rpsL150 relA1 deoC1 ptsF25 rpsR flbB5301)を実験室の所蔵品(laboratory collection)から得た。バクテリアを、先に記載した、硫黄を含まない、合成グルコース−ソルト(synthetic glucose-salt)媒体中で、500μMの無機硫酸塩を添加して培養した。培養菌は、ロータリーシェイカー(rotary shaker)(180rpm)上にて37℃で好気性で成長した。成長は、650nmにて分光光度的にモニターした。細胞を、ミッド−エクスポネンシャルフェイス(mid-exponential phase)(A650=0.5)内に、遠心(7000×g、10分間、4℃)により収納し、50mM Tris/HCl、pH7.0を用いて洗浄した。その後、それらを同じ緩衝剤中に再び懸濁させ(1ml当たり0.8gの湿潤質量)、冷却したフレンチ圧力セル(French pressure cell)に135MPaにて通して、3つの通路によって分けた。pH7.5、10mMのTris/HCl10μlを、200μlのペレット毎に加え、その後、20μlの150mMDTTを加えた。DNase I(50μg/ml)とRNase A(10μg/ml)を加え、30分間37℃にて培養した。細胞の破片を遠心(12000×g、30分間、4℃)により除去した。上澄み液を、2時間、45,000rpm、4℃にて遠心沈降した。ペレットを再び5mlの塩濃度の高い緩衝剤(20 mM Tris-HCl, pH 7.0, 400 mM, NH4Cl, 10mM MgAc2, 6mM β−メルカプトエタノール)中に再び懸濁し、7ml17.5%スクロースクッション(scrose cushon)上に層にし、3時間、45,000rpm、4℃にて遠心沈降した。ペレットを再び低Mg2+緩衝剤(10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 30 mM NH4Cl, 0.3mM MgCl2, 6mM β−メルカプトエタノール)中に再び懸濁し、大部分無傷のリボソームを含ませた。MgCl2と酢酸を、最終濃度が各々66mMと67%(v/v)となるように加え、溶液を氷上で、1時間培養した後、10分間10,000rpmにて遠心沈降した。ペレットを同じ溶液に再び溶解し、抽出プロシジャーをもう一度繰り返した。上澄み液を組み合わせて、スピードバック(speed-vac)内で乾燥した。
【0046】
逆相HPLCを用いてリボソームタンパク質を分離する前に、tRNAを抽出した。MgCl2と酢酸を、最終濃度が各々67mMと67%となるようにリボソームに加えた後、氷上で、1時間培養した。混合物を、Sorvall SS-34 ローター内にて、10,000rpmで10分間4℃にて遠心沈降した。この手順をペレットを用いてもう一度繰り返した。上澄み液は合わせて、スピードバック内で濃縮した。タンパク質は、再び3%酢酸に溶解し、エッペンドルフ遠心機(Eppendorff centrifuge)を用いて室温にて10,000rpmで20分間遠心沈降して溶解していない粒子を除去し、分取逆相HPLCシステム(L−6200インテリジェントポンプ、L−4250 UV−VIS検知器、メルク−ヒタチ社、ダルムシュタット、ドイツ:L-6200 Intelligent Pump, L-4250 UV-VIS Detector, Merck-Hitachi AG, Darmstadt, Germany)に注入した。10〜25%B30分間、25〜35%B40分間、35〜36%B30分間、36〜40%B40分間、40〜55%B60分間、55〜90%B40分間の勾配にて2mL/分で(A=0.1%TFA、B=80%アセトニトリル/0.08%TFA)、C18分取カラム(250×21mm、ヌクレオシル(Nucleosil)100〜12μm、マケレイ−ナーゲル社(Macherey-Nagel AG)、エンシンゲン(Oensingen)、スイス)を用いて、運転した。吸光度を220nmにて測定した。2mLのフラクションを収集して、タンパク質の量を、ラウリー(Lowry)の方法を用いて測定し、トリプシンの作用によって生じたフラクションの消化物のHPLC−MS/MS分析を用いて、タンパク質を同定した。
【0047】
例4:フロースルー化学反応器としての固定化膜
シーケンスタギング(sequence tagging):シーケンスタグをするための方法の化学は、Hoving, S., Muenchbach, M., Quadroni, M., Staudenmann, W., and James, P. (2000) Anal. Chem. 72, 1006-1014 に記載されている。分離されていないタンパク質から複数のN−末端タグ(標識又はラベル)の発生は、新規なチオエステル系分解反応を用いて、消化する。
【0048】
図2a)は、基材55内に形成された実質的に同一のフロースルー化学反応器セル53のアレイ51部分を通る模式的な断面図を示す。図2b)は、以下に説明するようなマスキングプレート(masking plate)とMALDIターゲットスライドを示す。アレイ51は、いずれかの適当な数のセルを含んでよく、例えば、5行10列、8行12列、又は10行10列等の多数の行と列を含む格子パターンに配置することが好ましい。図2a)に示すそのようなセル53の一つの構成を以下に説明する。セル53は、該基材55内に規則正しく成形されたキャビティー53、この例では立方体、として形成することが好ましい。キャビティーの寸法は、捕獲手段担体、例えば上述したMALDIターゲットスライド12と同様のMALDIターゲットスライド52の寸法に適合させる。この例では、複数の、例えば二の捕獲手段67Aと67Bを支持する。捕獲手段67Aと67Bは、空間的に離れており、片方の捕獲ターゲット(capture target)から他方へ物質が移動することを防止するために、封止(又はシール手段(図示せず)が設けられている。タグを取り付ける方法のために、上述した図1に関して説明したものと同様にゲル−導入ロートから二つの通路が出ることが認められ、片方の通路は、捕獲手段67Aに導き、他方は捕獲手段67Bに導く。タンパク質は、だいたい二つの捕獲手段67Aと67Bの間で等しく分けられる。次のセル53内での化学的標識取付実験において、一組の捕獲手段の各々の一つ、例えば捕獲手段67Aは、貫通穴を有さないマスキング手段69の部分によってマスクされ、消化を被らないが、他方の捕獲手段67Bは、それの上に配置される貫通穴68を有し、従って消化を被るように、例えば図2b)にて示すような貫通穴68が設けられた不活性なテフロンマスキングプレート69のマスキング手段が、スライド52の上に配置される。より容易なデータ抽出を可能にする標識された位置において親のペプチドを同定する無傷の消化物が存する。図2c)は、図2a)に示されたタイプの測定点に対する100の充填位置77を有するプレート75の上方からの図(縮尺は異なる)を模式的に示す。図2d)は、50の充填位置81を有するプレート75の上からの図(縮尺は異なる)を模式的に示す。上述の説明した態様は、本発明を説明することを意図するものであり、添付した特許請求の範囲によって請求した発明の保護の範囲を何ら制限することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【0049】
【図1a)】図1a)は、タンパク質試料の濃縮−消化を同時に行うための本発明に基づくデバイスのアレイを通る断面の概略図を示す。
【図1b)】図1b)は、図1a)のアレイを上方から眺めた図を示す。
【図2a)】図2a)は、本発明に基づく、フロースルー高効率化学修飾用フロースルー化学セルのアレイを通る断面の概略図を示す。
【図2b)】図2b)は、ターゲットスライド及びマスクの側面からの部分的な断面図を示す。
【図2c)】図2c)は、図2a)に示したタイプの測定点に対する100の充填位置を有するプレートを上方から眺めた概略図を示す。
【図2d)】図2d)は、50の充填位置を有するプレートを上方から眺めた概略図を示す。
【0001】
本発明は、少量のペプチドを定量し、同定し、キャラクタリゼーションする前に、それらを生産し、固定化し、続いて取り扱い、化学修飾するために有用なデバイス(又は装置)に関する。本発明は、そのような生産、固定化及び引き続く修飾のための方法も含む。
【背景技術】
【0002】
タンパク質の同定は、タンパク質の消化物からのペプチドのマスに基づく、又は個々のペプチドからのフラグメンテーションスペクトルに基づく、マススペクトルデータを用いるデータベース中のタンパク質を同定する方法を導入することによって根本的に変わった。驚くべきことに、高感度のタンパク質/ペプチド分析及び同定において遭遇する主たる問題点は、分析装置(一般的にマススペクトロメーター、これはペプチドを、アトモルのレベル(又は10−18モルの濃度:attomole level)で順番に並べることができる)の感度に関するものでは通常なく、タンパク質の消化によるペプチドの発生と取り扱いに関するものである。
【0003】
従来技術では、標的タンパク質は、通常二次元ゲル電気泳動(2D−PAGE)又はアフィニティークロマトグラフィーによって分離され、例えば、二次元電気泳動ゲルから一スポットに対して約20μm等の適当な大きさの体積の溶液に回収された。従って、タンパク質は極めて希釈された状態で回収された。例えば、マイクログラムの材料を、50,000MWタンパク質として利用できる場合、濃度(20pmol)は、1μMである。これは、たいていのプロテアーゼのKmよりすこし低い。たとえ今まで通り消化が起こるとしても、極めて遅いプロセスとなるであろう。更に、ナノグラムしか利用できない場合、即ち、ナノスプレイ・イオナイゼーション(nanospray ionisation)を用いる近代的なマススペクトロメーターの感度の範囲に十分に入る20フェムトモル(又は10−15モル:femtomole)しか利用できない場合、タンパク質溶液が希薄すぎるので、消化が有意義な程度で起こらないだろう。
【0004】
従来技術のデバイスの更なる欠点は、通常プラスチック又はガラス製のコンテナ(又は容器)の壁が、極めて容易にペプチドとタンパク質を吸収し、タンパク質/ペプチド溶液がコンテナと接触してから一時間又はその程度の時間で大量のロス(又は損失)を生ずることである。更に、ピペット操作又はクロマトグラフィーシステムに移すこと等の引き続く取り扱い工程の全ては、大きな表面との接触を伴い、劇的に試料のロスを増加させる。
【0005】
上述の方法の一般的なレビュー(又は総説)として、例えば、Staudenmann, W., Dainese Hatt, P., Hoving, S., Lehmann, A., Kertesz, M., and James, P. (1998) Electrophoresis, 19, 901-908. "Sample handling for proteome analysis" を参照されたい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の要約
本発明の一つの目的は、少量のペプチド及び/又はタンパク質の、濃縮、消化及び/又は化学修飾等の、取り扱い性(又はハンドリング性)を向上するデバイス(又は装置)及び方法を提供することである。他の目的は、いずれかの適当な方法によって分析が引き続き行われる表面に、ペプチド及び/又はタンパク質を直接固定化する、そのようなデバイス及び方法を提供することである。更に本発明の別の目的は、コンテナの壁の吸収によるペプチド及び/又はタンパク質のロスを減少させて行うことができ、それによって、デバイス中のペプチド及び/又はタンパク質の長時間の保持を可能とする、上述の取り扱いのためのデバイス及び方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の目的は、添付した特許請求の範囲に記載したデバイス及び方法によって達成することができる。
【0008】
定義
本明細書において、用語「捕獲(capture)」とは、例えばペプチドを、例えば担体(又は支持体:support)に、非共有結合的に結合させることを意味する。
用語「ペプチド及び/又はタンパク質」は、アミノ酸のいずれかの鎖又はそれらの修飾された形態を含むものとして理解すべきである。
【0009】
発明の詳細な説明
本発明の第一の要旨は、試料中のペプチド及び/又はタンパク質を濃縮するためのデバイスであって、そのデバイスは、
広い末端と狭い末端を有するロート形状のキャビティ(又は空洞)を有して成る電気濃縮手段(electroconcentration means);少なくとも二つの電極であって、一の電極は該広い末端の近くに配置され、一の電極は該狭い末端の近くに配置される電極;並びに一又はそれ以上のペプチド及び/又はタンパク質捕獲手段を有して成り、
該捕獲手段は、該狭い末端と、該狭い末端の近くに配置される該一の電極との間に配置されているデバイスである。
好ましい態様において、本発明のデバイスは、シール(又は封止)によって、一緒に保持されたアッセンブリとして提供される。使用の間に、デバイス全体は、泡の発生を防ぐために、およそ2〜3バールで、加圧されたコンテナの中に保持することが好ましい。さもなくば、電気泳動の間に、通路をブロックし、また電流を止める泡が発生し得る。
【0010】
試料を、電気溶離バス(electroelution bath)内に存する電気溶離チャンバー(electroelution chamber)中のデバイスに加えることができる。電気溶離チャンバーを、その後の分析のために、例えば、クランプを用いて、MALDIターゲット等の分析ターゲットに固定することができる。
【0011】
デバイスを製造するために使用する材料の種類は、分析の様式(又はモード)に基づいて、変えることができる。従って、電気溶離バスは、タンパク質吸収度が十分に低いいずれかの材料から製造することができ、プレクシグラス(Plexiglas)等の機械加工しやすいものが好ましい。材料特性に対する同じ基準を、電気濃縮手段にも適用することができる。電極、クランプ、及び分析ターゲットは、例えば、ステンレス鋼又は、金等の貴金属でコートされた金属等の化学的に不活性な金属から製造することができる。シールは、シリコーンゴムチュービング等のいずれかの可撓性の材料であってよい。捕獲手段は、機械的に安定であり、極めて化学的に耐性が高いので、テフロンディスクに埋め込まれたC18シリカ等のトラップ材料(trapping material)を含む。このことから、気相にて、例えば、臭化シアン、ペンタフルオロプロピオン酸及びS−エチルトリフルオロアセテート等の試薬と、化学的消化等の化学反応を行うことが可能となる。しかし、他のトラップ材料を用いることができ、次に用いる分析方法に基づいて、この分野の当業者であれば容易に選択することができる。特定の態様において、試料を、MALDI−TOFマススペクトロメトリーを用いて分析する場合、装置内に所定のポテンシャルで膜を固定しなければならないので、金属片からなる分析ターゲットは、化学的に耐性のある金属から製造される。さもなければ、使用する分析方法に応じて他の材料を用いてよい。一の態様において、分析ターゲットは、加熱要素を含み、消化温度を約37℃に保つことができる。別の態様では、外部加熱源を用いて制御することができる。本発明の有利な特徴は、捕獲手段を保持する各穴の周りに、「歯(teeth)」又は高くした縁(又はエッジ)があってもよいことであり、試薬又は試料のクロスフロー(又は交差流:cross flow)は最小になり又は全くなくなる。他の溶離フォーマット、例えば二重の溶離チャンバーを用いることができる。
【0012】
本発明を行うための一つの態様において、ペプチド及び/又はタンパク質を、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム又は尿素等の界面活性剤又は可溶化剤と平衡状態とし、それらが十分に溶液中に存在するようにする。しかし、他方、ペプチド及び/又はタンパク質は、例えば、2Dのゲルスポット等のゲルスライス中に存在してもよく、又は他のいずれかの担体に非共有結合的に結合していてよい。その後、タンパク質含有試料は、電気濃縮ロート形状ブロックのロート中に配置される。
【0013】
ロート形状のキャビティーの体積は、いずれの体積にも適応させるようにデザイン(又は設計)することができるが、通常使用される試料の体積の範囲に対応する、約0.5〜10mlの体積を用いることが好ましい。ロートの入口のサイズは、厳密なものではないが、ロートの狭い出口末端のサイズは、二つの理由から重要である。第一に、それは、消化されている材料の最終的な濃度を規定するロート形状のキャビティーの出口末端部分の体積であるからである。たいていのタンパク質分解酵素のKmは、5〜50μMの範囲にあるので、タンパク質の消化は、pmol/μlの程度でのみ、有効である。例えば、タンパク質の量が、100フェトムモルの領域にあるならば、ロート形状のキャビティーの狭い末端は、約100nlより小さい体積を有するべきである。当該分野の当業者であれば理解できるように、消化する量が少なくなると、それに比例して小さく成るべきである。第二に、出口の穴の直径は、ペプチド及び/又はタンパク質捕獲エリアを規定し、そのエリアは、分析のために引き続き用いられる。エリアが小さくなると、消化され又は濃縮された材料の濃度が高くなり、それゆえ、例えば、マトリックス−アシスティッド・レーザー・デソープション・アンド・イオニゼーション(又はマトリックス支援レーザー脱離イオン化(matrix-assisted laser desorption and ionization): MALDI)マススペクトロメトリー(MS)、(フッ素ラベル材料用の)フルオリメトリー(fluorimetry)又は検知方法に基づく種々の抗体等の応用の感度が高くなる。最小のサイズは、検知方法によって規定され、MALDI−MSを用いる場合、レーザーのスポットのサイズである。実験的に、最小の有用なサイズ、即ち、MSカットオフ膜(MS cut-off membrane)に近くのロートの最も狭いポイントを規定することができ、この配置では、約30μmである。従って、以下に記載する一つの態様において、デバイスのロート形状のキャビティーの狭い末端の出口の寸法は、構想した分析方法に適応させる。
【0014】
従って、本発明は、極めて少量のペプチド及び/又はタンパク質の濃縮、消化及び/又は化学修飾を可能にするデバイスであって、選択した方法を用いて引き続き分析することができる表面に、それらを直接固定化するデバイスを開示する。
【0015】
本発明に基づいて、分離されたペプチド又はタンパク質の濃度は、約20〜100nl又はそれより低い最終体積に下げることができ、従来技術と比較して、そこでは、消化は、通常、約20μl付近のゲルスポット中で行われ、又は5μl付近を必要とするエレクトロブロッティング(electroblotting)担体上で、行われる。
【0016】
本発明の一の態様において、捕獲手段は、正に及び/又は負に帯電したペプチドを捕獲することができる固定化担体の形態にある。他の態様において、特定の固定化担体は、抗体、アフィボディー(affibody)等を用いて製造することができる。別法では、タンパク質の特定の結合特性を用いることができ、イオン交換又は特定の固定化金属イオンクロマトグラフィー(immobilised metal ion chromatography:IMAC)担体を、酸性、塩基性又はホスホペプチド(phosphopeptide)を捕獲するために使用することができる。
【0017】
本発明のデバイスの有利な態様において、電気濃縮手段のロート形状のキャビティーは、該キャビティーの長軸の方向が本質的に垂直に位置し、狭い末端より広い末端が上となる状態にある。
【0018】
本発明のデバイスを、二つの異なるモード(又は様式)で、操作することができる。これらの態様の第一の態様は、酵素を用いてタンパク質分解を行う場合、又はより高分子量の分子を含む混合物からペプチドを抽出すべき場合に、用いることが好ましい。本発明に基づくデバイスは、更に、ペプチドのパス(又は通路)に配置される半透過性制限膜(semi-permeable restriction membrane)又はサイズカットオフ膜(size cut-off membrane)を、ペプチドが捕獲手段に到達する前に膜を通らなければならないように、有してなる。膜は、セルロースアセテートから製造してよく、穴をより小さくし、機械的及び化学的に構造を安定化するために、例えば、無水酢酸を用いて処理することができる。別法では、例えば、シリカガラス又はアクリロニトリル等のポリマー等の所定の穴のサイズの範囲で作られたいずれかの材料を含み、これらは膜としてよりもむしろデバイスの肝要な部分として作ることができる。
この態様を用いる場合、試料をデバイスに入れ、プロテアーゼ等の酵素を加え、試料を一緒に濃縮する。タンパク質は溶液中に残り、それらは極めて濃縮されるので、酵素によって効果的に消化することができる。例えば、3000 Dalton 付近の分子量カットオフを有する膜(Spectrapore inc. 社製等の多数の市販のものを使用することができる)を、その後タンパク質溶液と捕獲手段との間に配置する。従って、MS/MS分析に基づいて分析できるより小さなペプチドのみが、捕獲手段にてトラップされ、MS分析を妨げるPEG等のポリマー又は大きなタンパク質等のいずれかの大きな分子は、カットオフ膜によって除かれる。タンパク質はカットオフ膜上で濃縮されるが、膜を通過することはできない。しかし、消化される間に放出されるペプチドは、膜を通ることができ、その後取り扱う前に、引き続き捕獲膜上に固定化される。
【0019】
第二の態様において、本発明のデバイスは、膜を用いることなく操作することができる。これは、捕獲したタンパク質又はペプチドを化学薬品を用いて消化しなければならず、濃縮ロートの末端の直径によって、濃縮ファクターを測定することができる場合、特に有利である。この目的のために適する化学薬品は、例えば、臭化シアン、ペンタフルオロプロピオン酸又はS−エチルトリフルオロアセテート等である。例えば、フェムトモル量の材料を消化するために、タンパク質を、通常1fmol/μlの程度から、pmol/μlの程度まで、濃縮しなければならない。
【0020】
従って、一つの態様において、本発明のデバイスは、標識(ラベル又はタグ:tag)されたタンパク質に対して特に適する。この態様において、本発明のデバイスは、相互に離れた二つの捕獲手段を含んでなり、その一つは、修飾されていないペプチドが通過することができるマスク(mask)が先(又は前)に配置されており、他の一つは、修飾されたペプチドが通過することができるマスクが先に配置され、ラダーケミストリー(ladder chemistry)によるペプチドの指紋を生ずるように適合されている。この態様において、標識は、ラダーケミストリーによって生ずるシーケンスであり、それは、当該技術分野の当業者にはよく知られた概念である。ここで好ましく用いられる化学は、よく知られたエドマン分解(Edman degradation)に類似の、チオアセチルチオエステル分解である。より詳細には、効率の悪い、ペプチドのN−末端アミノ酸の20%くらいにセットアップされ、除去される。これを3回繰り返し、約40%の無傷のペプチド1、30%のペプチド1−1アミノ酸、20%の二つのアミノ酸が除去されたもの、10%の一つのアミノ酸が除去されたものを得た。MSのピークの間のマスの相違によって、シーケンス(又は配列)を知ることができる。例えば、親のペプチドのマスが1000、−1aaマスが943、−2aaが830、−3aaが701の場合、シーケンスタグ(sequence tag)は1000、グリシン、ロイシン、グルタミン酸である。
【0021】
有利な態様において、例えば膜担体等の捕獲手段は、フロースルー(flow-through)反応器として用いることができ、極めて少量の材料を高効率で化学的に修飾することができ、及び/又は例えば、マススペクトロメトリー、ファンクショナルアクティビティーアッセイ(functional activity assay)、又はフルオレセンスディテクション(fluorescence detection)による分析のために直接用いることができる。デバイスは、引き続き修飾し及び/又は分析するために、大量のタンパク質を、濃縮し、消化し、膜に固定化することができるように平行して操作することができる。従って、本発明に基づくデバイスは、自動化された手順に特に適し、従来技術の方法と比較して、プロセスの時間とコストを実質的に節約することを可能とする。従って、本発明のデバイスの一の態様において、捕獲手段を、MALDI−MSにて使用するために適合する。
【0022】
下記の実験の部において、本発明に基づくデバイスの一つの実施例を、図面を参照しながらより詳細に説明する。しかし、当該分野の当業者であれば理解できるように、本発明のデバイスを、例えば、シリコンチップとして、アレイとして、単一のユニットとして、使い捨てのユニットとして、再利用可能ユニット等として、別の方式(又は様式)で構成することができる。全ての場合において、原理は、同じままである。即ち、液相のタンパク質の濃縮は、引き続く分析のための固定化表面上で、消化又は捕獲することが可能である。
【0023】
本発明の第二の要旨は、試料中のペプチド及び/又はタンパク質を濃縮するための方法であって、
(a)ペプチド及び/又はタンパク質と消化剤を含んでなる試料を、電気泳動デバイスに供給し、電気溶離バスは、実質的にロート形状のキャビティー内に存在する工程;
(b)該電気溶離バスの側面の各々に配置されている少なくとも二の電極間に電圧を印加し、該ロート形状のキャビティーの狭い末端と、該狭い末端のより近くに配置されている電極との間に配置されている捕獲手段に向けてペプチドを移動させる工程;
(c)少なくとも一度電圧の方向を変えて、正に帯電したペプチドと負に帯電したペプチドの両方が捕獲手段に接触できる振動をもたらす工程;並びに
(d)濃縮されたペプチドを捕獲手段から収集する工程
を含んでなる方法である。
【0024】
電圧(又は電位差)は、ペプチド及びタンパク質がある方向に移動することを引き起こし、移動速度は、サイズに反比例する。タンパク質は、試料中に存在するSDS等の界面活性剤のために、負に帯電するので、それらはそれらがいる場所に実質的にとどまる。消化されると、得られるペプチドは正に又は負に帯電し得る。ゆえに、場合により電圧を逆転しないと、捕獲膜から移動するから、一つの組が失われる。通常、最初の電圧の間の実際の消化は、引き続き行う電圧方向の変更(それは、より頻繁に、例えば、10分毎に行われる)と比較して、より長い時間、例えば、2、3時間続く。しかし、各々の所望の濃縮手順のための、正確な間隔と反応時間を、当該技術分野の当業者であれば、容易に決定することができる。
【0025】
本発明の方法の一つの態様において、消化剤は酵素であり、好ましくはプロテアーゼ(例えば、トリプシン、V8プロテアーゼ、LysC、AspN等)又はグルコシダーゼであり、引き続くグリコ−部分(glyco-portion)の分析の前に、親水性担体上に捕獲するためにO−及びN−結合サッカライド(O-and N-linked saccharide)を放出する。
【0026】
本発明の他の態様において、上述の方法が、ロート形状のキャビティーの狭い末端と捕獲手段との間に、サイズカットオフ膜を導入することによって、タンパク質等のより大きなサイズの分子を、ペプチド等のより小さなサイズの分子から分離する工程を更に含んでなるように、適合される。試料が、デバイスを通って、下流に都合よく流れるように、膜は、消化の間及び消化の終わりにおいて、タンパク質が捕獲手段に到達することを防ぐ。従って、それは、いずれかの大きなフラグメントが膜に来ることを防止する。本明細書において、用語「大きい」とは、所望ではないサイズのフラグメントを意味し、膜のカットオフ値(cut-off value)は、ペプチドの所望のサイズに応じて選択されることが、理解される。
【0027】
本発明の一つの方法において、工程(b)では、試料はロート形状のキャビティーの後、二又はそれ以上の部分に分割され、各々の部分は別々の捕獲手段に向けて送られるが、一の捕獲手段は非修飾ペプチドが通ることができるマスク先(又は前)に置かれ、他の一の捕獲手段は修飾されたペプチドが通ることができる異なるマスクが先に置かれており、更に工程(d)では、非修飾ペプチドが一の捕獲手段から収集され、ペプチドの指紋をもたらす標識されたペプチドは、他の一の捕獲手段から収集される。従って、デバイスについて上述したように、標識を行うことができる。各消化物は、ペプチドの指紋(peptide fingerprint)として知られている一組のペプチドのマスを生ずるので、同じ酵素を用いて消化した場合、これを、同様の理論的な一組のペプチドを生ずるデータベース中のタンパク質を同定するために使用することができる。これは、ペプチドマス指紋法(peptide mass fingerprinting)として知られている。しかし、従来技術では、これは、しばしば信頼することができる同定をするには不十分であるとされてきた。従って、本発明は、一つのペプチド当たり三つのアミノ酸による小さなシーケンスと同様のペプチドの指紋を生ずることを可能とする。これにより、タンパク質をより高い信頼性のレベルで同定することができ、以前より、より効率的に同定することができる。この目的のために詳細には、標識技術を説明する:シーケンスタグを用いる同定のアルゴリズム及びエキゾペプチダーゼ(exopeptidase)を用いてそれらを生じさせる方法については、Korostensky, C., Staudenmann, W., Dainese, P. Hoving, S., Gonnet, G., and James, P. (1998) Electrophoresis, 19, 1933-1940. "An algorithm for the identification of proteins in sequence databases using peptides with ragged N- and C- termini generated by sequential endo- and exopeptidase digestions" を参照されたい。また、化学的に標識(又はタグ)を発生させる方法については、Hoving, S., Muenchbach, M., Quadroni, M., Staudenmann, W., and James, P. (2000) Anal. Chem. 72, 1006-1014. "Multiple N-terminal tag generation from unseparated protein digests using a novel thioester based degradation reaction" を参照されたい。
【0028】
特定の態様においては、ペプチドの指紋は、チオアセチルチオエステル分解(又はデグラデーション)によって生ずる。これは、フェニルイソチオシアネートを用いるエドマン分解、又はイソチオシアネート部分を有するいずれかの他の適切な試薬を用いるエドマン分解によって行うこともできる。
【0029】
本発明の別の態様において、濃縮すべきタンパク質及び/又はペプチドは、ゲル中又は溶液中に存する。別法では、それらは、担体に非共有結合的に結合することができる。酵素を、例えば、電圧を印加する前に電気溶離バス中の試料に加えて、タンパク質をペプチドに消化することができ、またゲルの一部に再水和することができる。
【0030】
本発明の方法の一つの特定の態様は、タンパク質及び/又はペプチド試料の分析に適切であり、工程(d)で得られる捕獲手段を、MALDI−MS等の検出装置に挿入する更なる工程を含んでなる本発明に基づく方法である。
本明細書において、ホスホリレーション(phosphorylation)及びグリコペプチド脱離(glycopeptide elimination)分析を好都合に用いることができる。この目的について詳細には、試験管中で行われるホスホリレーション分析のための方法が、記載されており、Quadroni, Q. (2000) Principles and Practice. Proteome Research: Mass Spectrometry. Specific detection of analysis of phosphorylated peptides by mass spectropetry, pp 187-206. Wiley-Springer Verlag. Ed. James P. を参照されたい。
【0031】
本発明の方法の有利な態様は、上述した本発明に基づくデバイスを用いる。
【0032】
従って、要約すると、本発明の方法の一つの例示的な態様において、タンパク質を含んでなる試料は、始めに、上述したように平衡状態とし、プロテアーゼ等の酵素又は消化薬を加える。電気泳動を、該添加後に開始する。上述したような低分子量カットオフ膜の上に集中させ、その後電圧の極性を例えば、一時間の間に、5分又は10分毎に、一回又は数回反転させる。第一膜を通過できるほど十分に小さいフラグメントは、極めて素早く(それらは小さいので)それらが固定化されるC18膜上に移動する。緩衝剤をバスから除去し、その後好ましくない塩を除去するために固定化担体を通してトップからボトムへ水を通すことが好ましい。一つの態様において、本発明の方法は、デバイスを分解し、選択した測定装置に挿入する、分析工程を含んでなる。例えば、試料をMALDIを用いて測定する場合、担体を転化(invert)し、水中の80%アセトニトリル、1.25%TFA中に、α−シアノ−4−ヒドロキシ−ケイ皮酸、10mg/ml等のMALDIマトリックス(MALDI matrix)約1〜2μlを加え、膜中に流した。担体は、MALDI−MS中に配置するに適する。他の態様では、担体は、ナノ−エレクトロスプレイチップ(nano-electrospray tip)として使用することができる。MALDIターゲットから引き出される各チャンネルの下端は、約10μmの直径の出口を有する鋭い円錐形の形状に作ることができる。本明細書において、用語「鋭い円錐形の形状(sharp conical form)」とは、中央に穴を有する円錐形の形状であって、穴の周囲の出口の地点の壁は、極めて狭く/鋭い、即ちコーンの内側の角度は、45°以下であることが好ましく、30°又はそれ以下であることがより好ましい。高圧液体クロマトグラフィーのラインは、ターゲットを横切ってとめられ、勾配は、HPLC−MS測定が可能なように、変わる(又は流れる)。他の態様は、C18粒子を有する二重のトラップ層(double trapping layer)を始めに用い、その後強いカチオン交換体を用いる。試料をMALDIを用いて始めに測定することができ、その後マトリックスを、強いカチオン交換体と結合したペプチドを残すいずれかの適当な溶媒でそそぎ、例えばTFA又は蟻酸と水中のアセトニトリルとの適当な勾配を用いて、ペプチドを溶離(又は溶出)する。
【0033】
要約すると、本発明は、新規なデバイスと方法を開示し、従来技術の2Dゲルからタンパク質を濃縮するためのゲルベース濃縮系と比較すると、下記の長所を有する:
【0034】
本発明に基づくと、試料を染色(又は着色)する必要がない。従来技術では、タンパク質は、目に見えるようにするために染色しなければならなかった。このことは、特に小さいタンパク質について、固定化の間にロス(又は損失)を生じ、染色工程と脱色工程に時間の浪費を生じる。染料の前面に対するタンパク質の位置を参照することで、たとえタンパク質を、染色することなく収集することができたとしても、これは、信頼できるものでなく、タンパク質の完全な回収を確保するためにゲルのより大きな体積を取り除くことをもたらす。
【0035】
更に、本発明に基づいて、タンパク質は、従来技術の方法と比較して、プロテアーゼと消化剤に容易に接近することができ、ポリマーマトリックス中にトラップされたタンパク質は、プロテアーゼに接近することができないまま残ることができる。
【0036】
従来技術の方法においては、存在する緩衝剤(又は緩衝液)と界面活性剤は、HPLCとMSの分析を妨げ、高感度の分析を行うために除去しなければならず、このことは更にロスを生じさせる。本発明に基づくと、そのような必要はない。
【0037】
最後に、従来技術で必要とされる、引き続くピペット操作工程及び移動工程と、凍結乾燥による濃縮は、更に試料のロスを生じさせる。更に、試料のロスは、特に重大であり、即ち、金属表面上での、例えば、金属製HPLCカラムの内側、カラムの開始端と終端のフリット(frit)、インジェクションバルブ等でのホスホペプチドのロスは、特に重大である。そのようなロスも、本発明に基づいて避けることができる。
【0038】
本発明を、例を参照しながら以下に説明するが、例は本発明を説明するためにのみ記載したものであり、添付した特許請求の範囲によって本発明は限定されると同様に、例は本発明を制限するものとして解釈してはならない。本願明細書のいずれかに記載した全ての参照文献は、参照することによって、本願明細書に組み込まれる。
【実施例】
【0039】
実験の部
例1:消化のためのデバイス
MALDIと共に使用するために特に適合(又は構成)された本発明に基づくデバイスを、図1a)及び1b)を参照しながら以下に説明する。図1a)は、基材5内に形成された実質的に同一の電気濃縮セル(electroconcentration cell)3のアレイ1の部分を通る断面を模式的に示し、図1b)は、図1a)の断面の上からの図を示す。アレイは、いずれかの適当な数のセルを含んでよく、例えば、8行12列、又は10行10列等の多数の行と列を含む格子パターンに配置することが好ましい。図1a)と図1b)に示すそのようなセルの一つの構造を以下説明する。セル3は、該基材5の中に形成された規則正しく成型されたキャビティー3、この例では立方体、として形成することが好ましい。電源(図示せず)と接続された第一電気濃縮電極7が、キャビティー3の下部に設けられている。壁9又は同等物の形状のスペーサー手段は、キャビティー3の中央へ向かって少しの距離を突出し、第一電極7を含むために十分なキャビティー3のベースからある距離をのびて、MALDIターゲットスライド(MALDI target slide)12を支持する。MALDIターゲットスライド12は、例えばステンレス鋼、アルミニウム等の電導性材料の第一及び第二の薄い四角(又は正方形)のシート11、19を含んでなり、第一の下方シート11上に、接触する第二の上方シート19を有して配置される。シート11、19は、例えば、接着、溶接、蝋付け、かしめ、折りたたみ、リベット留め、ボルト固定等のいずれかの適当な手段を用いて結合する。シート11、19は、MALDIターゲットスライド12が、キャビティー3の内側にぴったり合うように、キャビティー3の内壁の長さよりわずかに短い長さの又はそれと同じ長さの側面を有する。MALDIターゲットスライド12を、壁9に配置する場合、MALDIターゲットスライド12の縁の外側を通って液体が流れないように、MALDIターゲットシート11、19、壁9及びキャビティー3の寸法は、適合していることが好ましい。このことを達成するために、必要であれば、シールしてもよい(図示せず)。MALDIターゲット下方シート11は、中央の貫通穴13を有し、それは、下方シート11の上方の表面の円柱状の切り抜き15の方へ通じる。切り抜き15の直径より小さい直径と切り抜き15の高さ以下の高さを有するディスク状の捕獲手段17は、切り抜き15の中に配置される。捕獲手段は、例えば、テフロン(登録商標)膜中のC−18シリカ粒子を含んで成る半透膜の形態であってよく、それは、関与し得る分子を捕獲することができる。次に、上方シート19は、第一シート11の貫通穴13と実質的に同心に配置される中央の貫通穴21を有す。化学的に不活性な絶縁材料、例えばプレクシグラス(登録商標)で作られた電気濃縮ブロック23は、第二の上方シート19上に配置され、接触してシールする。ブロック23が、キャビティー3の内側にぴったり合うように、ブロック23は、キャビティー3の内壁の長さと同じ長さの、又はわずかに短い長さの側面を有する。ブロック23の高さは以下に説明するように消化作用(又は機能)ロートと膜を含むことができるに十分なものである。MALDIターゲットスライド12の上方シート19の上方表面と接触するブロック23の下方表面は、円柱状の中央の切り抜き25を有し、それは下方シート11の切り抜き15と実質的に同心である。切り抜き25は、分子量カットオフ膜、例えば、3000Da分子量カットオフ膜27を含む。ブロック23は、貫通穴13、21と実質的に同心であるチャンネル29を更に有する。チャンネル29は、切り抜き25から伸びており、ブロック23中に形成される逆円錐形状の電気濃縮ロート31の狭い口を形成する。ロート31の上方の広い末端は、ゲル試料33を受け取るに十分に広く、一般的に、直径のサイズが約1〜10mmであり、ロート31は、チャンネル29の直径に先細りしている。第二の電極35は、ブロック23の上方に配置され、バスの流体37に浸されている。バスの流体は、第一電極7が第二電極35と電気的に接触するように、セル3を満たす。
【0040】
デバイス全体は、約2〜3バールの加圧コンテナ中に保持され、電気泳動中の泡の発生が通路をふさぎ、電流を止めることを防止する。
【0041】
分子量カットオフ膜27は、セルロースアセテートから作られ、無水酢酸で処理されることが好ましい。捕獲手段17用のトラップ材料は、テフロンのディスク(「Empore」(登録商標)として既知)内に埋め込まれたC18シリカであってよく、それは、臭化シアン、ペンタフルオロプロピオン酸及びS−エチルトリフルオロアセテート等の試薬を用いて、気相にて、化学的な消化等の化学反応を行うことを可能とする。MALDI−TOFマススペクトルにおいて、装置内に所定の電位で膜を固定しなければならないので、MALDIターゲット(即ち、シート11、19の間に、Empore膜が取り付けられている)は、化学的に耐性の金属で作られている。MALDIターゲットは、加熱要素(図示せず)を含むことができ、消化温度を所望の温度、例えば37℃に保つことができる。分子量カットオフ膜27とC18−テフロン材料は、ターゲット全体をカバーする各々一つの膜である。各々の穴の周囲の「歯」又は高められた縁が膜を保持するので、試薬又は試料のクロスフローはない。
【0042】
タンパク質分解酵素を加えた後、電気泳動を開始する。300Vの電極間電位差を2時間用いることで、低分子量カットオフ膜の上にタンパク質と酵素を集中させる。その後、電圧の極性を5分毎に1時間逆転させた。第一膜27を通過するに十分小さいフラグメントは、(それらは小さいから)極めて素早く、それらが固定化されるC18膜17上に移動する。緩衝剤をバスから除去し、その後塩を除去するために固定化担体の上端から下端まで水を通す。その後デバイスを分解し、MALDIターゲットを逆さにし、水中の80%のアセトニトリル、1.25%のTFA中に、α−シアノ−4−ヒドロキシ−ケイ皮酸、10mg/mlの形態の1〜2μlのMALDIマトリックスを加え、膜17の中に流れ入ることが可能になる。その後、ターゲットを、MALDI−MS中に配置した。この態様において、MALDIターゲットから引き出す各貫通穴の下端は、10μmの直径の出口を有する鋭い円錐形の形状で作られていることが好ましい(尚、説明を明確に行うために、これらの図中の穴は、共通の縮尺で記載されていない)。高圧液体クロマトグラフィーラインが、ターゲットを横切ってとめられており、勾配が変わり、HPLC−MS測定が可能になる。
【0043】
例2:ペプチドの濃縮
ゲルからの試料を可溶化するための条件:
ゲルからカットされたタンパク質は、非固定ゲル(共有結合性蛍光染色又は逆染色)からカットされた場合0.1%のSDSを含み、固定され洗浄された(silver Coomassie etc stains)場合、SDSを含まない。染色されたタンパク質は、3%SDS中に一夜間ゲルを放置することによって、可溶化される。両方のタイプの試料に対するゲル中の最終濃度は、0.001〜0.03%の間である。このことは、吸着を低下するデバイス表面の飽和を助け、タンパク質の移動性を増加させる。
実験の説明:
10種のタンパク質(馬の心臓のチトクロームc、組み換えクジラミオグロビン、カルモジュリン、ウシ属の血清アルブミン、及び大腸菌からの小さな30Sリボソームの6種のサブユニット(30SサブユニットS1、S2、S4、S8、S11及びS16))を、エッペンドルフ管(Eppendorff tube)内の溶液中で又はデバイス中で種々の濃度で消化した。全ての場合において、消化を、エッペンドルフ管中の10μlの体積で、37℃にて、0.001%のSDSと100mMの炭酸水素アンモニウム中の0.1μgのトリプシンを用いて行い、またデバイスに加えた。充填した後、300Vの電圧を2時間印加し、デバイスを37℃に保持した。2時間後、次の4時間の間、10分毎に電圧の極性を逆転した。溶液を、Empore C18膜を通すことよって、溶液消化(solution digestion)を、6時間後に停止した。水中に60%アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸溶液5μlを用いて、ペプチドを溶離した。マトリックスで予めコートされた表面上に、複数回のスポッティングと乾燥によって、5μl全部をMALDIターゲット上に充填し、マススペクトルを測定した。電圧を除去し、デバイス中の固定化担体を通して溶液を流れるようにすることで、デバイス中での消化を止めた。デバイスを分解し、80%アセトニトリル中のマトリックスを、タンパク質と接触していない側の固定化担体上にスポッティングした。
【0044】
【表1】
【0045】
例3:リボソームタンパク質の分離
大腸菌MC4100(F-araD139 D(argF-lac) U169 rpsL150 relA1 deoC1 ptsF25 rpsR flbB5301)を実験室の所蔵品(laboratory collection)から得た。バクテリアを、先に記載した、硫黄を含まない、合成グルコース−ソルト(synthetic glucose-salt)媒体中で、500μMの無機硫酸塩を添加して培養した。培養菌は、ロータリーシェイカー(rotary shaker)(180rpm)上にて37℃で好気性で成長した。成長は、650nmにて分光光度的にモニターした。細胞を、ミッド−エクスポネンシャルフェイス(mid-exponential phase)(A650=0.5)内に、遠心(7000×g、10分間、4℃)により収納し、50mM Tris/HCl、pH7.0を用いて洗浄した。その後、それらを同じ緩衝剤中に再び懸濁させ(1ml当たり0.8gの湿潤質量)、冷却したフレンチ圧力セル(French pressure cell)に135MPaにて通して、3つの通路によって分けた。pH7.5、10mMのTris/HCl10μlを、200μlのペレット毎に加え、その後、20μlの150mMDTTを加えた。DNase I(50μg/ml)とRNase A(10μg/ml)を加え、30分間37℃にて培養した。細胞の破片を遠心(12000×g、30分間、4℃)により除去した。上澄み液を、2時間、45,000rpm、4℃にて遠心沈降した。ペレットを再び5mlの塩濃度の高い緩衝剤(20 mM Tris-HCl, pH 7.0, 400 mM, NH4Cl, 10mM MgAc2, 6mM β−メルカプトエタノール)中に再び懸濁し、7ml17.5%スクロースクッション(scrose cushon)上に層にし、3時間、45,000rpm、4℃にて遠心沈降した。ペレットを再び低Mg2+緩衝剤(10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 30 mM NH4Cl, 0.3mM MgCl2, 6mM β−メルカプトエタノール)中に再び懸濁し、大部分無傷のリボソームを含ませた。MgCl2と酢酸を、最終濃度が各々66mMと67%(v/v)となるように加え、溶液を氷上で、1時間培養した後、10分間10,000rpmにて遠心沈降した。ペレットを同じ溶液に再び溶解し、抽出プロシジャーをもう一度繰り返した。上澄み液を組み合わせて、スピードバック(speed-vac)内で乾燥した。
【0046】
逆相HPLCを用いてリボソームタンパク質を分離する前に、tRNAを抽出した。MgCl2と酢酸を、最終濃度が各々67mMと67%となるようにリボソームに加えた後、氷上で、1時間培養した。混合物を、Sorvall SS-34 ローター内にて、10,000rpmで10分間4℃にて遠心沈降した。この手順をペレットを用いてもう一度繰り返した。上澄み液は合わせて、スピードバック内で濃縮した。タンパク質は、再び3%酢酸に溶解し、エッペンドルフ遠心機(Eppendorff centrifuge)を用いて室温にて10,000rpmで20分間遠心沈降して溶解していない粒子を除去し、分取逆相HPLCシステム(L−6200インテリジェントポンプ、L−4250 UV−VIS検知器、メルク−ヒタチ社、ダルムシュタット、ドイツ:L-6200 Intelligent Pump, L-4250 UV-VIS Detector, Merck-Hitachi AG, Darmstadt, Germany)に注入した。10〜25%B30分間、25〜35%B40分間、35〜36%B30分間、36〜40%B40分間、40〜55%B60分間、55〜90%B40分間の勾配にて2mL/分で(A=0.1%TFA、B=80%アセトニトリル/0.08%TFA)、C18分取カラム(250×21mm、ヌクレオシル(Nucleosil)100〜12μm、マケレイ−ナーゲル社(Macherey-Nagel AG)、エンシンゲン(Oensingen)、スイス)を用いて、運転した。吸光度を220nmにて測定した。2mLのフラクションを収集して、タンパク質の量を、ラウリー(Lowry)の方法を用いて測定し、トリプシンの作用によって生じたフラクションの消化物のHPLC−MS/MS分析を用いて、タンパク質を同定した。
【0047】
例4:フロースルー化学反応器としての固定化膜
シーケンスタギング(sequence tagging):シーケンスタグをするための方法の化学は、Hoving, S., Muenchbach, M., Quadroni, M., Staudenmann, W., and James, P. (2000) Anal. Chem. 72, 1006-1014 に記載されている。分離されていないタンパク質から複数のN−末端タグ(標識又はラベル)の発生は、新規なチオエステル系分解反応を用いて、消化する。
【0048】
図2a)は、基材55内に形成された実質的に同一のフロースルー化学反応器セル53のアレイ51部分を通る模式的な断面図を示す。図2b)は、以下に説明するようなマスキングプレート(masking plate)とMALDIターゲットスライドを示す。アレイ51は、いずれかの適当な数のセルを含んでよく、例えば、5行10列、8行12列、又は10行10列等の多数の行と列を含む格子パターンに配置することが好ましい。図2a)に示すそのようなセル53の一つの構成を以下に説明する。セル53は、該基材55内に規則正しく成形されたキャビティー53、この例では立方体、として形成することが好ましい。キャビティーの寸法は、捕獲手段担体、例えば上述したMALDIターゲットスライド12と同様のMALDIターゲットスライド52の寸法に適合させる。この例では、複数の、例えば二の捕獲手段67Aと67Bを支持する。捕獲手段67Aと67Bは、空間的に離れており、片方の捕獲ターゲット(capture target)から他方へ物質が移動することを防止するために、封止(又はシール手段(図示せず)が設けられている。タグを取り付ける方法のために、上述した図1に関して説明したものと同様にゲル−導入ロートから二つの通路が出ることが認められ、片方の通路は、捕獲手段67Aに導き、他方は捕獲手段67Bに導く。タンパク質は、だいたい二つの捕獲手段67Aと67Bの間で等しく分けられる。次のセル53内での化学的標識取付実験において、一組の捕獲手段の各々の一つ、例えば捕獲手段67Aは、貫通穴を有さないマスキング手段69の部分によってマスクされ、消化を被らないが、他方の捕獲手段67Bは、それの上に配置される貫通穴68を有し、従って消化を被るように、例えば図2b)にて示すような貫通穴68が設けられた不活性なテフロンマスキングプレート69のマスキング手段が、スライド52の上に配置される。より容易なデータ抽出を可能にする標識された位置において親のペプチドを同定する無傷の消化物が存する。図2c)は、図2a)に示されたタイプの測定点に対する100の充填位置77を有するプレート75の上方からの図(縮尺は異なる)を模式的に示す。図2d)は、50の充填位置81を有するプレート75の上からの図(縮尺は異なる)を模式的に示す。上述の説明した態様は、本発明を説明することを意図するものであり、添付した特許請求の範囲によって請求した発明の保護の範囲を何ら制限することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【0049】
【図1a)】図1a)は、タンパク質試料の濃縮−消化を同時に行うための本発明に基づくデバイスのアレイを通る断面の概略図を示す。
【図1b)】図1b)は、図1a)のアレイを上方から眺めた図を示す。
【図2a)】図2a)は、本発明に基づく、フロースルー高効率化学修飾用フロースルー化学セルのアレイを通る断面の概略図を示す。
【図2b)】図2b)は、ターゲットスライド及びマスクの側面からの部分的な断面図を示す。
【図2c)】図2c)は、図2a)に示したタイプの測定点に対する100の充填位置を有するプレートを上方から眺めた概略図を示す。
【図2d)】図2d)は、50の充填位置を有するプレートを上方から眺めた概略図を示す。
Claims (14)
- 広い末端と狭い末端を有するロート形状のキャビティー(33)を含んで成る電気濃縮手段(23);少なくとも二の電極(7,35)であって、一の電極(35)は該広い末端の近くに配置され、別の一の電極(7)は該狭い末端の近くに配置される電極;並びに一又はそれ以上のタンパク質及び/又はペプチド捕獲手段(17)を含んで成る、試料中のタンパク質及び/又はペプチドを濃縮するためのデバイスであって、
該捕獲手段(17)は、該狭い末端と該狭い末端の近くに配置される該一の電極との間に配置されているデバイス。 - 捕獲手段(17)は、正及び/又は負に帯電したペプチドを捕獲することができる固定化担体の形態である請求項1に記載のデバイス。
- 電気濃縮手段(23)のロート形状のキャビティー(33)は、該キャビティーが本質的に垂直に位置し、広い末端が狭い末端より高い位置となるような状態にある請求項1又は2に記載のデバイス。
- ペプチドから未消化のタンパク質を分離できる、又はサイズが小さいペプチドからサイズが大きいペプチドを分離できる、捕獲手段(17)の上に配置されているサイズカットオフ膜(27)を更に含んで成る請求項1〜3のいずれかに記載のデバイス。
- 相互に離れた二つの捕獲手段(67A,67B)を含んで成り、一方は非修飾ペプチドが通ることを可能とするマスクが先に配置されており、他方は修飾されたペプチドが通ることを可能とするマスクが先に配置されている請求項1〜3のいずれかに記載のデバイス。
- 捕獲手段は、MALDI−MS又はMALDI−TOFに用いるために適合している請求項1〜5のいずれかに記載のデバイス。
- (a)本質的にロート形状のキャビティーの中に電気溶離バスが存在する電気泳動デバイスに、タンパク質及び/又はペプチド及び消化剤を含んで成る試料を供給する工程;
(b)該電気溶離バスの側面の各々に配置されている少なくとも二の電極間に電圧を印加し、該ロート形状のキャビティーの狭い末端と、該狭い末端のより近くに配置されている電極との間に配置されている捕獲手段に向けてペプチドを移動させる工程;
(c)少なくとも一度電圧の方向を変えて、正に帯電したペプチドと負に帯電したペプチドが捕獲手段に接触できる振動をもたらす工程、及び
(d)濃縮されたペプチドを捕獲手段から収集する工程
を含んで成る、試料中のタンパク質及び/又はペプチドを濃縮する方法。 - 消化剤は、酵素である請求項7に記載の方法。
- ロート形状のキャビティーの狭い末端と捕獲手段との間に、サイズカットオフ膜を導入することによって、タンパク質等の大きなサイズの分子を、ペプチド等の小さなサイズの分子から分離する工程を、更に含んで成る請求項7又は8に記載の方法。
- 工程(b)において、ロート形状のキャビティーの後、試料は、二又はそれ以上の部分に分割され、各部分は別々の捕獲手段に向けて送られ、一の捕獲手段は非修飾ペプチドが通過することができるマスクが先に置かれており、もう一つの捕獲手段は修飾されたペプチドが通過することができるマスクが先に置かれ、
工程(d)において、一の捕獲手段から非修飾ペプチドが収集され、もう一つの捕獲手段からペプチドの指紋をもたらす標識されたペプチドが収集される請求項7又は8に記載の方法。 - ペプチドの指紋は、チオアセチルチオエステル分解によって生ずる請求項10に記載の方法。
- 濃縮すべきタンパク質及び/又はペプチドは、ゲル中に又は溶液中に存在する請求項7〜11のいずれかに記載の方法。
- タンパク質及び/又はペプチド試料の分析に適し、工程(d)で得られる捕獲手段を、MALDI−MS又はMALDI−TOF等の検出装置内に挿入する工程を更に含んで成る請求項7〜12のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のデバイスを使用する請求項7〜13のいずれかに記載の方法。
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