CN1493001A - 基于阵列的生物分子分析方法 - Google Patents

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Abstract

一个大分子阵列(100)(主阵列)，例如通过二维电泳得到的蛋白质，随后通过电印迹或类似方法转移到支撑膜(102)。捕捉主阵列的图像(202)，确定在主阵列中的各种大分子点的坐标(402)。该过程的下一个步骤是用皮升(p1)分配器(702)将一种或多种试剂或化学物质的第二(或微)阵列印到主阵列的一个或多个点/坐标上。如果大分子为蛋白质，则试剂可以是酶，例如胰蛋白酶或GluC等。使用两种不同的酶，将它们沉积到同一个点的不同坐标上，这将在不同的氨基酸位点分开蛋白质，并且当该点在MALDI－TOF质谱仪中分析时，将提供蛋白质中多肽的增加的分布或匹配。

Description

基于阵列的生物分子分析方法
技术领域
本发明涉及生物分子样品的分析，特别是蛋白质。
背景技术
在最近的文献中关于“蛋白质芯片”的发展的讨论已经很多了。广意上讲，这些是蛋白质阵列(一般称作微阵列)。以目前的想象蛋白质微阵列将能够同时检测几千个蛋白质、蛋白质-蛋白质间的相互作用、小分子间相互作用和酶底物反应。
目前多数研究是开发一种基于将蛋白质固定在基板上的蛋白质芯片，典型地是用表面化学来固定蛋白质。芯片的基板可以是硅晶片，但是例如铝晶片和玻璃等其它材料也已经用作或提出用作该基板。基板制备之后，需要在芯片上附着蛋白质捕获剂，例如抗体。在由一个加利福尼亚的公司，ZyomyxInc.，提出的一项研究中，用薄的有机膜涂覆基板，将附着用的标记物加在有机层上面，例如抗体片段或多肽等，蛋白质捕获剂则键合在标记物的自由末端。
目前的策略是在芯片表面用什么来形成涂层，例如抗体，或者在某些情况下，用亲和捕捉分别纯化了的已知的表达蛋白，并随后固定。
还提出了其它涂层抗体的方法。但是，涂层抗体或其它蛋白质捕获剂的任务还很复杂。进一步的问题在于蛋白质不象DNA那样牢固，并且易断裂，如果不小心处理它们，则会变性。蛋白质对于特定基板的物理和化学特性还极其敏感。
现有的“蛋白质芯片”的主要缺点如下。首先，蛋白质必须键合在芯片上阵列的位置中。如上所述，这通常使用排成阵列的抗体，例如，制造缓慢并昂贵的单克隆抗体或使用排成阵列的抗原来实现。但是，键合的抗原和键合的抗体的特异性不高。
第二个问题是单一抗体的使用不能显现蛋白质具有多种异构体的问题。可能不是所有的异构体都具有生物活性。存在生物活性异构体被非活性异构体所掩盖的可能性。
主要问题是在样品中的大量蛋白质由于与阵列的非特定键合而产生高背景“噪声”。
一个解决方案，重组抗原的使用，并不产生可信的修饰，因为重组蛋白质将几乎肯定会对真正的蛋白质产生不同的翻译后修饰。因此，不能确信在蛋白质芯片上的相互作用就类似于在真正的蛋白质和，例如，其它蛋白质之间发生的“真正的”相互作用。
本发明试图应对并缓和上面讨论的现有技术的问题。
发明内容
在本发明的第一方面包括产生大分子的阵列并随后将大分子阵列转移到支撑物上的步骤。该步骤产生一个主阵列或宏阵列。该工艺的一个主要优点是可以排列和固定真正的大分子，而没有任何在现有技术的“蛋白质芯片”中所需的固定过程的任何化学方法。
本发明工艺的下一个步骤是一般通过使用图像捕获来定义坐标，将试剂的第二(或微)阵列“打印”到捕获的主阵列的每个坐标上。执行该功能的设备在标题为“分子分析(Analysis of Molecules)”的澳大利亚专利No 722578中作了介绍。其中描述了一种设备用于捕捉在平面支撑物上的点的阵列的图像，并用该图像驱动打印头到特定的点以便将试剂涂覆到该点。
大分子在此指包括了任何从由蛋白质、多肽、糖类、脂类、核酸分子、包括糖蛋白的复杂生物分子及其混合物构成的组中选择的任何生物分子。
生物分子最好用色谱法分离，以形成样品阵列。色谱法最好是电泳，更优选在聚丙烯酸胺凝胶中进行的电泳。
电泳可以在一维中进行，包括采用等电聚焦电泳、自然聚丙烯酰胺凝胶电泳和十二烷基磺酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳。或者，聚丙烯酰胺凝胶电泳可在二维中进行，第一维为等电聚焦电泳，第二维为自然聚丙烯酰胺凝胶电泳或SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
只要可能，最好利用非变性电泳分离工艺，因为这将产生更为可靠的自然阵列，而不是变性的蛋白质。
支撑物可以是由聚偏二氟代乙烯、硝化纤维素、尼龙、特氟隆、zitex、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)及其具有一个或多个功能基的衍生物制成。
图像分析可以确定在微阵列中可以实际打印的点的最大数量，并且确定在宏阵列中每种分子的各自点-点的分辨率。
识别相互作用是特异的或非特异的工艺为采用公有领域的方法。
但是，可以应用打印过程中一个独特的性质：非特异性相互作用被冲洗而形成外部晕圈，而特异性相互作用仍集中在沉积的坐标上。因此，特异性相互作用的存在或其它情况可通过是否存在晕圈而揭示出来。
蛋白质可以用标记物等直接标记，或用夹层技术，例如第二抗体荧光标记来检测。
在该工艺中的下一个步骤，使用检测装置检测是否在蛋白质点和由化学打印机涂覆的一种或多种试剂之间发生了相互作用。检测可以由任何合适的方法进行，例如球形捕捉透镜如CCD、照相机、扫描或激光扫描、显微镜方法等。
在可选实施例中，可以直接驱动检测装置到微阵列的每一个坐标。
可以预见，本发明的工艺可用于批量方式纯化含有亲合标记的表达蛋白质。例如，一批比如384克隆表达的特定但不同的His-标记可在IMAC(固定金属亲合色谱(immobilished metal affinity chromatography))柱上纯化。然后，柱的洗出液(即，所有384克隆)可以用二维电泳排成阵列并转移到基板，从而产生非预先确定阵列。这直接与现有技术的依赖于保持预先确定的阵列并保持位置信息的教义相矛盾。该例子的一个优点是表达蛋白质的阵列将通过与预知产品的比较来提供对表达产品的质量控制(例如，预测的Mr和pI与观察到的Mr和pI相比)。
本发明与现有技术相比的主要优点是产生真正的蛋白质阵列而不需要已有的蛋白质芯片所需的用于表面的化学固定。
在一个特征中，包含在主阵列的图像中的信息可以用于限定打印在主阵列上的微阵列的类型。例如，分析的特定点的尺寸可以用来确定类型，以及分配到点上的试剂的间隔。例如，具有20微滴的试剂的8×8阵列可以打印到具有200微米直径的点上，试剂点间隔25微米，或者打印道更大的400微米的点，上试剂点间隔50微米。
由于在沉积系统中具有足够的精度，所以可以在主阵列的各个位置上打印非常高密度的阵列，并且精确的光学纤维应当能够识别微小相互作用。
在一个特殊的优选特性中，将多个蛋白水解酶作为微阵列放在宏阵列的特定的蛋白质点上将是有利的。例如，在500微米直径的蛋白质点上，多种蛋白内切酶(胰蛋白酶、LysC内切酶、GluC内切酶和Asp-N内切酶，优选酶为胰蛋白酶和GluC)的微阵列打印为间隔200微米的200微米大小的点群(中心到中心)。点的尺寸和间隔足够小，从而通常MALDI-TOF-MS氮激光束(100微米)可以定位，从而只释放出在宏阵列的点中的一个特定酶反应的分析物。该特征的优点是在MALDI-TOF-MS对宏阵列蛋白质的点进行分析的过程中，多种蛋白酶的微阵列将增加多肽覆盖范围。
附图说明
下面将只通过例子的方式并结合附图介绍本发明的特定实施例，其中：
图1示出了已经被二维电泳分离并转移到支撑膜上的蛋白质阵列；
图2示出了用于在图1所示的阵列中已识别的蛋白质点的上面沉积一系列微阵列小点的化学打印机；
图3示出了图1中所示的一个点的放大，在该点上沉积了一个微阵列；
图4是一个概要的示意图，示出了通过得到或记录在阵列中的至少一个组分或样品位置的图像以从复合物或样品的点阵获得信息的过程，并利用记录的图像以便允许至少一个组分或样品的原位操作。
图5是用于成像、操作和分析复合物或样品阵列中的至少一个组分或样品的设备的概要的图示。
图6A到6C示出了用来夹紧硝化纤维膜的设备；
图7A和7B示出了在38kDa TB抗原上的微喷射(micro-jetting)抗TB阴性或阳性的人血清的结果；
图8示出了在有或没有直接蓝着色(Direct Blue Staining)的变性的38kDa TB抗原上微喷射抗TB阴性或阳性的人血清的结果；
图9示出了用双面胶带粘附到Axima MALDI目标片上的膜印迹B745；以及
图10是由沉积在其上的矩阵中的胰蛋白酶和GluC内切酶消化的蛋白质的放大图。
具体实施方式
在本发明中，分馏蛋白质的混合物以去掉大量多余的蛋白质并在窄范围的pH梯度下，以溶解异构体(一维电泳)。可以使用多室电解槽(multicompartment electrolyser)进行分馏工艺，正如在国际专利申请NoPCT/AU00/01391中所介绍的，引入其整个内容作为参考。代替一维电泳，将去掉多余蛋白质的样品用二维电泳分离，形成如图1所示的阵列(10)，然后用印迹电泳将阵列转移到例如硝化纤维的膜上。现在蛋白质阵列被固定并且准备作为“芯片”处理。应当注意，阵列不是预先确定的，并且不需要在当时就确定所产生的阵列中哪种蛋白质位于阵列上的哪个位置。
图1示出了圈出的蛋白质点12。该工艺的下一个步骤是在蛋白质点上印上试剂阵列。这通过使用在AU 722578中介绍的化学打印机来实现，下面参考图4和5来介绍。
图4示出了打印机系统功能的概要图示。系统包括阵列100、图像采集系统200、图像分析系统300、计算机400、x、y、z可调平台500、多化学药剂分配控制单元600、多头分配和贮存器700、分析仪控制单元800、分析仪900和数据分析站910。
阵列100定位在x、y、z可调平台上面或臂500的下面，得到图像200并作为数字图像传送到计算机400。该图像或者由图像分析系统300将阵列的每个组分的坐标转换为反映真正的x、y、z的值；或者，不进行转换，用存储在计算机400中的图像，使在阵列100中的一个特定组分的坐标驱动装载有分配头(喷射装置)700的x、y、z可调平台或臂500。由计算机控制的化学分配控制单元600控制分配头700，在阵列100中选定的样品上分配试剂。当完成处理时，使用在阵列100中的被处理组分的坐标移动装载有分析仪900的x、y、z可调平台或臂500。分析仪900在分析控制单元800的控制之下，当操作人员通过计算机400选定它时，分析仪900对处理过的选定的样品100进行分析。数据分析和管理系统910校对分析得到的数据，该系统与来自图像分析系统300在阵列中的每个样品的等同转换坐标相关联。
如图5所示，x、y、z可调平台、化学药剂分配控制单元、分配头和贮存器以及分析仪，都在计算机的控制之下。阵列102固定到平台502上。通过数码相机202得到阵列102的图像。阵列102由照相机的闪光灯或外部的钨灯206照明。图像从照相机202传送到计算机402。图像处理并输入到“click-on-a-spot”软件。该处理将图像像素坐标翻译成自控装置坐标。然后用“click-on-a-spot”软件通过x、y移动杆504驱动分配装置702移动到阵列中被选定的样品。通过分配装置支撑单元506在z轴方向移动分配装置702。直接与分配装置702连接604的化学分配控制单元602通过计算机402的控制从试剂贮存器508分配试剂。
图2示出了分配装置702以打印机头14的形式移动到蛋白质点12上方，在点12上沉积试剂点。打印机利用压电打印，在不接触点的情况下，在点上面留下非常少量的液体(p1数量级)。
使用在AU 722578中介绍的并在上面重复的技术，打印头14利用之前产生的阵列图象所提供的阵列中特定点的x、y坐标而直接移动到这些点上。
图3示出了沉积在蛋白质点12上的4×4的试剂阵列的图像。
因此，与现有技术相比，本发明的蛋白质芯片提供真正的蛋白质阵列、具有解析异构体问题的能力和去除多余蛋白质的技术。一个特定的被正视(envisage)的技术是使患者产生抗体并将患者的血清打印到蛋白质阵列上。
使用本发明的用途还包括用抗体来筛选新抗原、测定多肽/蛋白质的相互作用和蛋白质/蛋白质的相互作用。
实施例1
本实施例的目的是在硝化纤维的基板上用纯化的结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis(TB))抗原来确定患者对TB的免疫反应的研究中开发一种用来微分配人血清的化学打印(chemical printing)技术，该血清对于TB即可能呈血清反应阴性也可能为阳性。应当理解，该方法可以通过使用适当的抗原将患者的免疫反应明确为多种条件和疾病。
材料和方法1.1
由两个患者分离的人类血清，其中一个对TB的血清反应阴性，另一个为阳性，分别用pH 7.4，加入0.05％(w/v)叠氮化钠、0.1％(v/v)Tween-20的PBS(PBS缓冲洗液(PBS-WB))稀释10倍，然后通过0.22μm注射过滤器(Millipore，North Ryde，Australia)过滤。将4μl的370μg/ml的纯化的38kDa TB抗原的PBS溶液，pH7.4，涂覆到硝化纤维膜(Bio-Rad，Hercules，CA)上，然后使其干燥。然后，在硝化纤维上的非特定结合点用0.5％(w/v)的酪蛋白(Sigma，Castle Hill，Australia)PBS-WB溶液封闭。随后用AB-55微喷射装置(MicroFab Technologies，Piano，Texas)在240Hz的频率下用具有55μm孔的#B0-13-12将每个血清样品以每点100滴的4×4阵列喷射到分离的TB抗原点上。在分配血清时用浸有PBS-WB的滤纸垫在下面使硝化纤维膜保持湿润。血清喷射十秒后，用移液管滴几滴PBS-WB轻轻冲洗硝化纤维膜。随后在稀释100倍的0.5％(w/v)的酪蛋白/PBS-WB中孵育硝化纤维膜1小时，使抗人IgG与FITC(Zymed，San Francisco，CA)结合，再用PBS-WB冲洗。用Bio-Rad FluorSTM Multi-Imager(Hercules，CA)检测被标记的抗原。
材料和方法1.2
重复上述方法，除了使用图6A到6D中所示的设备在硝化纤维下面垫吸收棉纸。将吸收棉纸填满在含有TB抗原的硝化纤维下面。该材料随后全部夹在图6A到6C所示的设备内部，将要喷射的区域暴露在圆孔18上。虑及瞬间或特定反应，棉纸衬垫物保证喷射的溶液或者任何涂覆的小体积缓冲液或试剂能马上透过硝化纤维进入棉纸。该方法既防止免疫球蛋白的非特定干燥和由此发生的非特定反应，还防止分配的特定抗体穿过硝化纤维的表面(参看下面)。与方法1相比，在喷射期间该装置保持硝化纤维膜干燥。然后用移液管滴一滴PBS-WB处理膜，随后如上所述将血清喷射到抗原上。
图7A和7B示出了微喷射抗TB阴性或阳性人类血清到38kDa TB抗原上的效果。TB血清反应阴性(-)或血清反应阳性(+)的人类血清的4×4阵列20喷射到含有1.48μg的38 kDa TB抗原的4μl点的硝化纤维上。用被PBS-WB浸湿的滤纸(A)或紧紧塞满的干燥的吸收棉纸(B)垫在硝化纤维膜下面。用标记为FITC的第二抗体检测标记的抗原，随后用BIO-RADFLUOR-STM Multi-Imager分析。这清楚的表明填塞棉纸和如图7B的20所示的干燥的膜导致抗原检测敏感性和分辨率的提高。
实施例2
用SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)纯化的TB抗原并电转移到硝化纤维上用或不用随后的直接蓝着色(Direct Blue staining)来定义患者对TB的免疫反应性的研究中，开发一种用来微分配人血清的化学打印技术，该血清对于结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis(TB))即可能呈血清反应阴性也可能为阳性。
材料和方法2
1.48μg的38 kDa TB抗原用x1 SDS-PAGE非减少样品缓冲液稀释到200μl。随后使用4-12％(w/v)Tris-Bis聚丙烯酰胺梯度凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)通过SDS-PAGE分析样品(每行1.48μg抗原)，随后电转移到硝化纤维上。使用直接蓝着色可以看到两行印迹(图3)，同时另外两行没有着色。两种印迹在室温下干燥，并随后用0.5％(w/v)的酪蛋白/PBS-WB溶液封闭15分钟。然后用PBS-WB冲洗两种印迹，并干燥。随后印迹安放到图1所示的吸入装置中，然后TB血清反应阴性或血清反应阳性的血清以如上所述的1×5阵列喷射到交替的直接蓝着色和没有着色的印迹的38kDa带上。大约10秒后，用移液管滴两滴PBS-WB清洗印迹。用移液管滴两滴PBS-WB之后10秒，5μlFITC标记的第二抗体用0.5％(w/v)的酪蛋白/PBS-WB稀释10倍，涂覆到印迹上。用BIORAD FluorSTM Multi-Imager(Hercules，CA)检测标记的抗原。
图8所示为喷射TB阴性或阳性人类血清到用或不用直接蓝着色的38kDa TB抗原+/-上的效果。(A)38 kDa TB抗原，每行1.48μg，用4-12％的聚丙烯酰胺梯度凝胶通过SDS-PAGE分离。然后蛋白质电传送到硝化纤维上。随后其中的两行被直接蓝着色。(B)用0.5％(w/v)的酪蛋白/PBS-WB溶液封闭之后，TB血清反应阴性(1和3行)或血清反应阳性(2和4行)的人类血清的1×5阵列喷射(如上所述)到38 kDa TB抗原带上。使用如图6A到6C中所示的设备进行喷射期间，用紧紧塞满的干燥的吸收棉纸垫在硝化纤维膜下面。在喷射血清(A)之前只有第3和第4行被直接蓝着色。用FITC标记的第二抗体检测标记的抗原，随后用BIO-RAD FLUOR-STMMulti-Imager分析。
目前，使用化学打印机分配纳升(nanolitre)体积的人类血清以限定固定在硝化纤维膜上的抗原的方案已经证明非常成功，并提供检测TB-免疫反应性IgG极其迅速的方法(少于1分钟)。没有观察到背景或非特定结合。最初的研究证明在喷射后血清抗体散布到潮湿的硝化纤维膜的表面，而产生低分辨率抗体阵列。在干燥的硝化纤维膜下面的铺衬吸收棉纸有效的克服了这个问题，并且现在允许高特异的和解析良好的抗体阵列。
实施例3
本实施例涉及用矩阵辅助的激光解吸附离子化(MALDI)分析在质谱仪中的蛋白质片段之前对阵列上应用蛋白质-酶反应。众所周知，不同的酶在不同的氨基酸位点切开蛋白质。一些酶，例如lysC、AspN、ArgC只在一个特定的氨基酸位点切开蛋白质。这在MALDI分析中是一个问题，因为它只能产生几个大的片段，不能产生非常有用的信息光谱。其它酶，例如，胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶在许多氨基酸位点切开蛋白质。在MALDI分析之前使用这些酶也有问题，因为产生了太多的小片段，他们将在光谱中产生大量非常小的峰，这也非常难以分析。胰蛋白酶和GluC在两个氨基酸位点切开蛋白质，这将产生较好的可用于分析光谱，因此选择用为在MALDI分析中的酶。
虽然如此，因为这些酶只在特定的氨基酸位点分开蛋白质，所以使用单个酶只能产生蛋白质的有限数量的信息和覆盖的范围。但是，使用本发明的方法将两种不同的酶喷射到阵列中的蛋白质点上将增加对蛋白质的覆盖范围，并且下面的实验介绍了本发明的方法的使用，喷射胰蛋白酶和GluC到两个人前载脂蛋白上以得到改善的覆盖范围(匹配的多肽)，并将使用GluC和胰蛋白酶与单独使用胰蛋白酶或单独使用GluC相比较。
本实施例的目的是开发用于微分配多个蛋白内切酶到经过SDS-PAGE的纯化的蛋白质上并电印迹到具有直接蓝着色的聚二氟代乙烯的膜上以改善蛋白质识别的化学打印技术。
材料和方法
样品为36μl在7M尿素、2M硫脲、2％(w/v)Chaps和5mM Tris的全血浆。样品用X三丁基膦还原，用z碘乙酰胺烷基化。将样品超声，然后离心分离，收集上清液。在多室电解槽中进行预分馏，采用Herbert，B.和Righetti，P.G.所描述的方法：一个蛋白质代谢分析中的转变点：等电位膜通过多室电解槽进行样品的预分馏(A turning point in proteome analysis：sampleprefractionation via multicompartment electrolyzers with isoelectricmembranes)电泳(Electrophoresis)21，3639-3648(2000)。其整个内容在此引入作为参考。
干燥的11cm长5-6IPG带在200μl蛋白质样品中再水化的6小时。再水化的带在最大为10000V的条件下聚焦120kVhr。聚焦的IPG带在含有6M尿素、2％(w/v)SDS的平衡缓冲液中平衡20分钟。
平衡的IPG带插入到6-15％凝胶粉的装料管(loading well)中。在每个凝胶50mA的条件下进行电泳1.5小时。蛋白质在400mA下经过1小时20分钟电印迹到Immobilon PSQ PVDF(聚偏二氟代乙烯)膜上。用直接蓝71着色蛋白质。
然后膜印迹用3M双面导电胶带粘附到Axima-CRF MALDI-TOF MS目标盘上(参考图9)。特定的蛋白质点用5ηl含有1％的聚乙烯吡咯烷酮的50％甲醇封闭，在一个蛋白质点上在以间隔1mm的两个位置上分配直径300μm的50个的液滴。过多的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)用MilliQ轻轻冲洗。50ηl 200μg/ml的GluC蛋白内切酶喷射到在蛋白质上的一个PVP点上，一定量的200μg/ml的胰蛋白酶喷射到同一个蛋白质上的剩余的PVP点上。然后膜片放入密封的午餐盒中，加入极少量水，以创造一个湿润的环境，并在37℃下孵育3小时。消化之后，将100ηl溶于20％异丙醇、20％2-丁醇、30％甲醇以及0.5％甲酸中的10mg/ml的α-氰基-羟基肉桂酸(α-cyano-hydroxycinnamic)喷射到消化的蛋白质点上(图10)。用Axima CRF MALDI-TOF的质谱仪分析分解的片段。
目前用微分配多种蛋白内切酶来增加氨基酸的覆盖范围以识别蛋白质的过程已经证明是成功的，其匹配的多肽的联合覆盖范围达到66.6％，而单独用gluC和单独用胰蛋白酶则分别达到的40％和46.09％相。
所用的基体溶液包括20％的2-丁醇、20％的异丙醇、30％的甲醇、30％的水以及0.1％的Tfa(三氟醋酸)。该基体溶液具有适当的粘度以便在延长的时间段内分配稳定的液滴的优点。
本领域的技术人员应当明鉴，对于本发明可以进行大量的变化和/或改进，如特定实施例中所示，而不脱离如明白介绍的本发明的精神和范围。因此，本实施例在所有的方面只作为说明而不是限定。

Claims (16)

1、一种大分子混合物的分析方法，包括以下步骤：
在具有分隔为多个点的大分子的支撑物上产生大分子的阵列；以及
将一个或多个试剂的第二阵列打印到在阵列中的一个或多个大分子点上。
2、根据权利要求1的方法，其中至少两种不同的试剂被打印到该点上。
3、根据权利要求2的方法，其中样品为从由蛋白质、多肽、糖类、脂类、核酸分子、包括糖蛋白的复杂生物分子和其混合物构成的组中选择的生物分子。
4、根据上述任何一个权利要求的方法，其中阵列由色谱法产生。
5、根据权利要求4的方法，其中色谱法为电泳。
6、根据上述任何一个权利要求的方法，其中电泳是在聚丙烯酰胺凝胶中进行的。
7、根据权利要求6的方法，其中聚丙烯酰胺凝胶电泳在两维中进行，第一维为等电聚焦电泳，第二维为自然聚丙烯酰胺凝胶电泳或SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
8、根据权利要求7的方法，其中在打印第二阵列之前将在凝胶体中产生的阵列转移到支撑膜上。
9、根据权利要求8的方法，其中支撑膜是由聚偏二氟代烯、硝化纤维、尼龙、特氟隆、zitex、聚丙烯、PTFE及其具有一个或多个功能基的衍生物制成。
10、根据上述任何一个权利要求的方法，其中进一步包括：
使用检测方法，以检测是否在大分子点和试剂间或涂覆到点的试剂间发生了相互作用。
11、根据上述任何一个权利要求的方法，其中大分子为蛋白质。
12、根据权利要求11中的方法，其中试剂是从由lysC、GluC、胰蛋白酶、AspN、ArgC、胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶构成的组中选择的酶。
13、根据权利要求12中的方法，其中试剂包括胰蛋白酶和GluC。
14、根据权利要求12或13中的方法，进一步包括步骤：
在膜上的宏阵列的一个点中用MALDI-TOF-MS氮激光束原位释放一个特定酶反应的被分析物，以用于在MALDI-TOF质谱仪中分析。
15、根据权利要求1到10中任何一个权利要求的方法，其中大分子阵列包括抗原或抗体，试剂包括来自人类或动物的样品。
16、根据权利要求15中所要求的方法，其中样品为来自人类的样品，并包括血浆、血清或组织样品。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101308141B (zh) * 2007-05-16 2012-08-29 陕西北美基因股份有限公司 一种分析糖蛋白的方法
CN104297331A (zh) * 2014-09-09 2015-01-21 武汉品生科技有限公司 一种应用于胆碱及脂类分子定性定量分析检测和高通量筛选增强试剂盒及其制备
CN104321646A (zh) * 2012-05-31 2015-01-28 通用电气健康护理生物科学股份公司 电泳系统以及分离和识别方法
CN104350372A (zh) * 2012-08-09 2015-02-11 斯坦福大学托管董事会 用于制备供显微镜分析的生物样本的方法和组合物
CN112354571A (zh) * 2019-07-11 2021-02-12 北京理工大学 一种多维微流控电泳芯片及检测装置，检测方法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AUPO625497A0 (en) 1997-04-16 1997-05-15 Macquarie Research Limited Analysis of molecules
US20050019942A1 (en) * 2001-03-16 2005-01-27 Proteome Systems Ltd. Array-based biomolecule analysis
EP1591783B1 (en) * 2004-04-28 2008-02-20 Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wissenschaften E.V. Method for detection and analysis of macromolecular complexes
JP2006292680A (ja) * 2005-04-14 2006-10-26 Toyo Kohan Co Ltd 固体支持体上において相互作用した生体分子を分析する方法およびそのための固体支持体
US7495231B2 (en) * 2005-09-08 2009-02-24 Agilent Technologies, Inc. MALDI sample plate imaging workstation
DE102011109063B3 (de) * 2011-07-28 2012-12-20 NMI Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut an der Universität Tübingen Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen
JP6250040B2 (ja) * 2012-05-18 2017-12-20 シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッドＳｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ． 魚眼レンズ・アナライザ

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4452901A (en) * 1980-03-20 1984-06-05 Ciba-Geigy Corporation Electrophoretically transferring electropherograms to nitrocellulose sheets for immuno-assays
US4507233A (en) * 1981-04-22 1985-03-26 Oriental Yeast Co., Ltd. Colored molecular weight marker
US4877745A (en) * 1986-11-17 1989-10-31 Abbott Laboratories Apparatus and process for reagent fluid dispensing and printing
US5217869A (en) * 1987-10-13 1993-06-08 Terrapin Technologies, Inc. Method to produce immunodiagnostic reagents
US5208458A (en) * 1991-11-05 1993-05-04 Georgia Tech Research Corporation Interface device to couple gel electrophoresis with mass spectrometry using sample disruption
US5587062A (en) * 1996-01-24 1996-12-24 Shimadzu Corporation Sample collecting apparatus by gel electrophoresis
US5958342A (en) * 1996-05-17 1999-09-28 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Jet droplet device
GB9624927D0 (en) * 1996-11-29 1997-01-15 Oxford Glycosciences Uk Ltd Gels and their use
EP2295988A2 (en) * 1996-12-31 2011-03-16 High Throughput Genomics, Inc. Multiplexed molecular analysis apparatus and its fabrication method
US6245331B1 (en) * 1997-01-02 2001-06-12 New York Univ. Medical Center Early detection of mycobacterial disease
AUPO625497A0 (en) * 1997-04-16 1997-05-15 Macquarie Research Limited Analysis of molecules
US6485690B1 (en) * 1999-05-27 2002-11-26 Orchid Biosciences, Inc. Multiple fluid sample processor and system
AUPQ105599A0 (en) * 1999-06-18 1999-07-08 Proteome Systems Ltd High resolution maldi analysis
US6680208B1 (en) * 1999-11-19 2004-01-20 Becton, Dickinson And Company Rapid protein identification using antibody mixtures
GB9928787D0 (en) * 1999-12-03 2000-02-02 Medical Res Council Direct screening method
US6790636B1 (en) * 2000-06-14 2004-09-14 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Rapid fluorescent labeling of tissue for microdissection using fluorescent specific binding agents
US7118710B2 (en) * 2000-10-30 2006-10-10 Sru Biosystems, Inc. Label-free high-throughput optical technique for detecting biomolecular interactions
EP1343914A2 (en) * 2000-12-11 2003-09-17 HK Pharmaceuticals, Inc. Multiplexed protein expression and activity assay
US7598033B2 (en) * 2003-12-15 2009-10-06 University Of Pennsylvania Method and devices for running reactions on a target plate for MALDI mass spectrometry

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101308141B (zh) * 2007-05-16 2012-08-29 陕西北美基因股份有限公司 一种分析糖蛋白的方法
CN104321646A (zh) * 2012-05-31 2015-01-28 通用电气健康护理生物科学股份公司 电泳系统以及分离和识别方法
CN104350372A (zh) * 2012-08-09 2015-02-11 斯坦福大学托管董事会 用于制备供显微镜分析的生物样本的方法和组合物
CN104350372B (zh) * 2012-08-09 2018-03-02 斯坦福大学托管董事会 用于制备供显微镜分析的生物样本的方法和组合物
CN104297331A (zh) * 2014-09-09 2015-01-21 武汉品生科技有限公司 一种应用于胆碱及脂类分子定性定量分析检测和高通量筛选增强试剂盒及其制备
CN112354571A (zh) * 2019-07-11 2021-02-12 北京理工大学 一种多维微流控电泳芯片及检测装置，检测方法
CN112354571B (zh) * 2019-07-11 2022-02-11 北京理工大学 一种多维微流控电泳芯片及检测装置，检测方法

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