CN1955307A

CN1955307A - 可目视化生物芯片的制备方法

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Publication number: CN1955307A
Application number: CN 200510096269
Authority: CN
Inventors: 李铮; 陈超; 崔亚丽; 唐金凡; 尚昆
Original assignee: XIDA BEIMEI GENE CO Ltd SHANXI
Current assignee: Shaanxi Baimei Gene Co., Ltd.
Priority date: 2005-10-28
Filing date: 2005-10-28
Publication date: 2007-05-02
Anticipated expiration: 2025-10-28
Also published as: CN100587076C

Abstract

本发明涉及一种可目视化生物芯片的制备方法。其步骤包括(1)制备金磁微粒标记的被标记物：1)金磁微粒的预处理，2)被标记物的预处理，3)被标记物固定化反应，4)清洗，5)保存；(2)制备可目视化的生物芯片：将取制备好的金磁微粒标记的核酸探针加入离心管，稀释，再加于基因芯片表面上；(3)该基因芯片经杂交、洗涤、离心干燥后，浸入到银增强溶液中，单质银沉积到金磁微粒表面上。本发明解决了背景技术中使用成本高，检测、分析结果不准确的技术问题。

Description

可目视化生物芯片的制备方法

技术领域

本发明以金磁微粒作为标记试剂，实现可目视化检测的生物芯片。具体涉及一种可目视化生物芯片的制备方法。

背景技术

生物芯片是近10年在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术。它主要是指通过微加工和微电子技术在固体芯片表面构建微型生物化学分析系统，以实现对生命机体的组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类以及其他生物组分进行准确、快速、大信息量的检测。目前常见的生物芯片分为三大类：即基因芯片、蛋白芯片、糖生物芯片。生物芯片的主要特点是高通量、微型化和自动化。生物芯片上高度集成了成千上万密集排列的分子微阵列，使人们能够在很短时间内分析大量的生物分子，快速准确地获取样品中的生物信息，其检测效率是传统检测手段所不能比拟的。

基因芯片基于核酸探针互补杂交技术，核酸探针是一段人工合成的碱基序列，在核酸探针上连接一些可检测的物质，根据碱基互补的原理，利用基因探针到基因混合物中识别特定基因。基因芯片又称DNA芯片、DNA微阵列，其上集成的分子微阵列实际是网格状密集排列的基因探针。通过已知碱基顺序的DNA片段，结合碱基互补序列的单链DNA，确定相应的序列，通过这种方式可识别异常基因或其产物等。

基因芯片技术主要包括：芯片微阵列的制备、样品的制备、样品的荧光标记和信号的检测及分析。蛋白芯片、糖生物芯片的原理与基因芯片相似，不同之处主要有二：其一，蛋白芯片上固定的分子是蛋白质，如抗原或抗体等；糖生物芯片上固定的分子是糖，如单糖、寡糖、多糖等。其二，检测原理是依据蛋白与蛋白、蛋白与核酸、蛋白与糖、蛋白与其它分子的相互作用。目前最常用的芯片信号检测方法是将芯片置于芯片扫描仪中，采集各反应点的荧光强弱和荧光位置，经相关软件分析图像，获得有关生物信息。

虽然生物芯片技术在基因表达分析、基因诊断、药物筛选及序列分析等诸多领域已呈现出广阔的应用前景。但现有生物芯片的制备技术仍存在如下缺点：

1检测上多以荧光检测为主，要使用荧光标记试剂及共聚焦激光检测扫描仪。荧光标记试剂和共聚焦激光检测扫描仪价格均较昂贵，导致使用成本昂贵。

2技术停留于实验阶段，难以普及推广应用，整体成本过高，实用性差。

3利用胶体金作为标记试剂，进行银离子还原后单质银沉积信号放大DNA芯片技术的研究处于起步阶段，不前尚不成熟。

4采用胶体金标记生物大分子后，过剩的胶体金不能除去掉，标记物难以纯化，标记量不确定，使检测、分析的结果不准确。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可目视化生物芯片的制备方法，其解决了背景技术中使用成本高，检测、分析结果不准确的技术问题。

本发明的设计方案是：

一种可目视化生物芯片的制备方法，其特殊之处在于：该方法的实现步骤包括

1)制备金磁微粒标记的被标记物

(1)金磁微粒的预处理：取金磁微粒，置于离心管中，加入偶联缓冲液，用手摇匀，磁性分离，弃上清；

(2)被标记物的预处理：取被标记物巯基修饰的核酸探针，用pH6.0～7.0的偶联缓冲液稀释，加入离心管中，使巯基修饰的核酸探针与金磁微粒的物质的量之比为1∶3；

(3)被标记物固定化反应：将离心管置于空气振荡器中，在摄氏30～40℃，反应1～2小时；磁性分离，弃上清，得到金磁微粒标记的核酸探针；

(4)清洗：向离心管中加入pH6.0～7.0的清洗缓冲液，摇匀，磁性分离，弃上清；再加入pH6.0～7.0的清洗缓冲液，摇匀，磁性分离，弃上清；

(5)保存：向离心管中加入pH6.0～7.0的保存缓冲液，在摄氏2-6℃保存；

2)制备可目视化的生物芯片

(1)取制备好的金磁微粒标记的核酸探针加入离心管，再加入pH6.0～7.0的保存缓冲液，稀释金磁微粒标记的核酸探针至100nM；

(2)取15～60μL稀释的金磁微粒标记的核酸探针，加于基因芯片表面上；

(3)该基因芯片经杂交、洗涤、离心干燥后，浸入到银增强溶液中10～20分钟，单质银沉积到金磁微粒表面上。

上述偶联缓冲液以采用为0.1M的乙酸三乙铵缓冲液为佳；以采用0.3M的NaCl、10mM的磷酸盐、0.01％叠氮化钠的缓冲液为宜；也可采用或碳酸盐缓冲液；或乙酸盐缓冲液等。

上述保存缓冲液和清洗缓冲液均以采用0.3M的NaCl、10mM的磷酸盐、叠氮化钠的缓冲液为宜；也可采用磷酸盐缓冲液；或碳酸盐缓冲液；或乙酸盐缓冲液等。

上述被标记物的固定化反应中，离心管置于空气振荡器中的反应温度以摄氏37℃为宜；所述保存金磁微粒标记的核酸探针的温度以摄氏4℃为宜。

1)制备金磁微粒标记的被标记物

(2)被标记物的预处理：取被标记物抗体/蛋白，用pH6.0～7.0的偶联缓冲液稀释至0.1～0.4mg/mL，加入离心管中；

(3)被标记物固定化反应：将离心管置于空气振荡器中，在摄氏30～40℃，反应15～25分钟；磁性分离，取上清液，得到金磁微粒标记的抗体/蛋白；

(5)封闭：向离心管中加入封闭液，将离心管置于空气振荡器中，在摄氏30～40℃，反应40～80分钟，磁性分离，弃上清；

(6)清洗：向离心管中加入清洗缓冲液，摇匀，磁性分离，弃上清，完成一次清洗；再重复清洗2次；

(7)保存：向离心管中加入pH6.0～7.0的保存缓冲液，在摄氏2-6℃保存；

2)制备可目视化的生物芯片

(1)取制备好的金磁微粒标记的抗体/蛋白加入离心管，加于抗体芯片或蛋白芯片表面；

(2)将抗体芯片或蛋白芯片孵育40～80分钟；

(3)再将抗体芯片或蛋白芯片洗涤、离心干燥后，浸入到银增强溶液中10～20分钟，单质银沉积到金磁微粒表面上。

上述被标记物的预处理中，取被标记物抗体/蛋白，用pH7.0的偶联缓冲液稀释至0.25mg/mL，再加入离心管中为宜。

上述偶联缓冲液以采用0.1M的NaHCO为宜；亦可采用0.5M的NaCl，或0.5M的磷酸盐，或0.5M的碳酸盐，或0.5M的乙酸盐等。

上述封闭液可采用加入1mg/ml的脱脂奶粉或牛血清白蛋白的磷酸盐、碳酸盐或乙酸盐等。

上述清洗缓冲液以采用0.5％的含吐温-20 1×磷酸盐为宜；亦可采用碳酸盐或乙酸盐等。

上述保存缓冲液以采用0.3M的NaCl、10mM的磷酸盐、叠氮化钠的缓冲液为宜；亦可采用磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液或乙酸盐缓冲液。

本发明具有以下优点：

1.检测灵敏度高，与荧光法检测相当。

2.制备的生物芯片能够长期保存。

3.制作、检测需要的费用均较低，易于普及、推广应用。

4.用金磁微粒作为标记试剂，可目视观测。

5.制备、检测操作简便，快速，使用灵活。

附图说明

图1为本发明制备基因芯片的原理示意图。

图2为本发明制备蛋白/抗体芯片的原理示意图。

图3为本发明制备糖生物芯片的原理示意图。

图4为本发明基因芯片的结果示意图。

具体实施方式

本发明以金磁微粒作为标记试剂，分别标记巯基修饰的核酸探针、蛋白及抗体，分别用于基因芯片、蛋白质芯片、抗体芯片以及糖芯片等生物芯片上，再把生物芯片浸入到银增强溶液中，银离子还原后，单质银沉积到金磁微粒表面上，实现可目视化检测。也可用普通平板扫描仪对生物芯片进行扫描，得到信号数据，再对数据进行分析。

以金磁微粒作为标记试剂，主要是利用金磁微粒金表面静电吸附的物理特性，与如修饰的核酸，蛋白质，脂类等多种生物大分子结合，形成金磁微粒-核酸复合物，金磁微粒-蛋白复合物等。利用金磁微粒的磁性内核进行磁性分离，得到纯化的复合物。参见图1-3。金磁微粒在银离子还原后单质银的沉积中起着有效的核的作用，具有显著的信号放大作用，所以，可用肉眼进行观测，也可用普通平板扫描仪扫描。

实施例一、金磁微粒标记巯基修饰的核酸探针的制备方法：

1)金磁微粒的预处理：取200μL金磁微粒1mg，置于离心管中，加入偶联缓冲液400μL，用手摇匀，磁性分离2分钟，弃上清。

2)被标记物的预处理：取被标记物巯基修饰的核酸探针，用偶联缓冲液稀释，加入离心管中。巯基修饰的核酸探针和金磁微粒按物质的量之比为1∶3。

3)被标记物固定化反应：将离心管置于空气振荡器中，在摄氏37℃，反应1-2小时；磁性分离2分钟，弃上清。得到金磁微粒标记的核酸探针。

4)清洗：向离心管中加入清洗缓冲液400μL，摇匀，磁性分离2分钟，弃上清；再加入400μL清洗缓冲液，摇匀，磁性分离2分钟，弃上清。

5)保存：加入1mL的0.3M的NaCl、10mM的磷酸盐、0.01％叠氮化钠的保存缓冲液pH7.0，4℃保存备用。大约可保存2月以上。

制备可目视化的生物芯片：

1)取制备好的金磁微粒标记的核酸探针加入离心管，再加入0.3M的NaCl、10mM的PBS、0.01％叠氮化钠的保存缓冲液pH7.0，把金磁微粒标记的核酸探针浓度稀释至100nM。

2)取15～60μL稀释的金磁微粒标记的核酸探针，加于基因芯片表面上。

3)该基因芯片经杂交、洗涤、离心干燥后，浸入到银增强溶液中10～20分钟，银离子还原，单质银沉积到金磁微粒表面上。在基因芯片上可看到黑色的斑点，参见图4。

实施例二、金磁微粒标记抗体/蛋白的制备方法：

2)被标记物的预处理：将抗体/蛋白，如牛血清(BSA)抗体/牛血清白蛋白，用偶联缓冲液稀释至0.25mg/mL，取400μL稀释后的抗体溶液加入离心管中。

3)被标记物固定化反应：将离心管置于空气振荡器中，在摄氏37℃，反应20分钟；磁性分离2分钟，取上清液。得到金磁微粒标记的抗体/蛋白。

4)清洗：向离心管中加入清洗缓冲液400μL，摇匀，磁性分离2分钟，弃上清；再加入400μL 1×磷酸盐缓冲液，摇匀，磁性分离2分钟，弃上清。

5)封闭：向离心管中加入1mL封闭液，将离心管置于空气振荡器中，在摄氏37℃，反应1小时，磁性分离2分钟，弃上清。

6)清洗：向离心管中加入800μL 0.5％的含吐温-20 1×磷酸盐清洗清洗缓冲液，摇匀，磁性分离2分钟，弃上清，完成一次清洗；重复清洗3次。

7)保存：加入1mL的0.3M的NaCl、10mM的磷酸盐、0.01％叠氮化钠的保存缓冲液pH7.0，4℃保存备用。大约可保存2周。

制备可目视化的生物芯片：

1)取15～60μL制备好的金磁微粒标记的抗体/蛋白加入离心管，加于抗体芯片或蛋白芯片表面上。

2)将抗体芯片或蛋白芯片孵育1小时；洗涤、离心干燥后，浸入到银增强溶液中10～20分钟，银离子还原，单质银沉积到金磁微粒表面上。在抗体芯片或蛋白芯片上可目视到黑色的斑点，参见图4。

Claims

1.一种可目视化生物芯片的制备方法，其特征在于：该方法的实现步骤包括

1)制备金磁微粒标记的被标记物

2)制备可目视化的生物芯片

2.根据权利要求1所述的可目视化生物芯片的制备方法，其特征在于：所述的偶联缓冲液为0.1M的乙酸三乙铵缓冲液；或0.3M的NaCl、10mM的磷酸盐、0.01％叠氮化钠的缓冲液；或碳酸盐缓冲液；或乙酸盐缓冲液。

3.根据权利要求1或2所述的可目视化生物芯片的制备方法，其特征在于：所述的保存缓冲液和清洗缓冲液均为0.3M的NaCl、10mM的磷酸盐、叠氮化钠的缓冲液；或磷酸盐缓冲液；或碳酸盐缓冲液；或乙酸盐缓冲液。

4.根据权利要求3所述的可目视化生物芯片的制备方法，其特征在于：所述的被标记物的固定化反应中，离心管置于空气振荡器中的反应温度是摄氏37℃；所述保存金磁微粒标记的核酸探针的温度是摄氏4℃。

5.一种可目视化生物芯片的制备方法，其特征在于：该方法的实现步骤包括

1)制备金磁微粒标记的被标记物

2)制备可目视化的生物芯片

(2)将抗体芯片或蛋白芯片孵育40～80分钟；

6.根据权利要求5所述的可目视化生物芯片的制备方法，其特征在于：所述被标记物的预处理中，取被标记物抗体/蛋白，用pH7.0的偶联缓冲液稀释至0.25mg/mL，加入离心管中。

7.根据权利要求6所述的可目视化生物芯片的制备方法，其特征在于：所述的偶联缓冲液为0.1M的NaHCO；或0.5M的NaCl；或磷酸盐；或碳酸盐；或乙酸盐。

8.根据权利要求7所述的可目视化生物芯片的制备方法，其特征在于：所述的封闭液为加入1mg/ml的脱脂奶粉或牛血清白蛋白的磷酸盐、碳酸盐或乙酸盐。

9.根据权利要求8所述的可目视化生物芯片的制备方法，其特征在于：所述的清洗缓冲液为0.5％的含吐温-20 1×磷酸盐；或碳酸盐或乙酸盐。

10.根据权利要求9所述的可目视化生物芯片的制备方法，其特征在于：所述的保存缓冲液为0.3M的NaCl、10mM的磷酸盐、叠氮化钠的缓冲液；或磷酸盐缓冲液；碳酸盐缓冲液；或乙酸盐缓冲液。