CN1743845A - 一种蛋白芯片的检测方法 - Google Patents

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许丹科
刘志红
何为
韩欢欢
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Abstract

本发明公开了一种蛋白芯片的检测方法。本发明所提供的蛋白芯片的检测方法，包括如下步骤：1)用生物素标记的待测蛋白二抗、待测蛋白与蛋白芯片进行杂交；或者直接以生物素标记的待测蛋白与蛋白芯片进行杂交；2)加入胶体金标记的亲和素再与蛋白芯片进行杂交，加入银显色增强试剂进行反应，检测反应生成的银颗粒。本发明方法的检测灵敏度已达到、部分已超过荧光检测的灵敏度，而无需采用昂贵的荧光检测设备和荧光标记物，成本低廉。

Description

一种蛋白芯片的检测方法
技术领域
本发明涉及蛋白芯片的检测方法。
背景技术
生物芯片是近年来发展起来的一种新的生物检测技术，包括基因芯片、蛋白芯片、组织芯片等，具有高速度、高通量、高效率等优点。与基因芯片检测技术相比，蛋白芯片的检测具有以下几个难点：不同蛋白质之间从电荷状况到空间结构均有较大的差异，给样品标记带来较大困难；蛋白质无法扩增放大的特点使得检测灵敏度要求很高；反应模式的复杂多样给芯片的平行检测造成困难。目前，蛋白芯片的常用检测方法主要有如下几种：
1、荧光检测法
这种方法相对成熟，大部分基因芯片均采用这种方法进行检测。但是，该方法需要激发光源和高精度的分光系统，所用的仪器和荧光染料价格昂贵，运行成本高。
2、化学发光检测法
这也是蛋白芯片常用的一种检测方法，但是，一般所检测的蛋白样品的浓度低，需要高灵敏度的CCD(电耦合器件)，同时化学发光的标记物价格也相当昂贵。
3、金属标记物检测法
也有文献(CN 1390955A)报道了一种金属标记物检测蛋白芯片的方法，在该检测方法中蛋白样品采用金属直接标记，其缺点是蛋白样品易于失活且标记率较低，标记操作比较复杂。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏、简单、通用的蛋白芯片检测方法。
本发明所提供的蛋白芯片的检测方法，包括如下步骤：
1)用生物素标记的待测蛋白二抗、待测蛋白与蛋白芯片进行杂交；或者直接以生物素标记的待测蛋白与蛋白芯片进行杂交；
2)加入胶体金标记的亲和素与蛋白芯片进行杂交，然后，再加入银显色增强试剂进行反应，检测反应生成的银颗粒。
其中，生物素标记的待测蛋白二抗或生物素标记的待测蛋白按如下步骤进行制备：
在待测蛋白二抗或待测蛋白的溶液中加入生物素，混匀反应，反应后透析得到生物素标记的待测蛋白二抗或生物素标记的待测蛋白。
所述标记过程中，待测蛋白二抗或待测蛋白的溶液浓度为1～10mg/ml，所述生物素的终浓度为0.1～5mg/ml。标记可在室温下进行。
本发明方法能应用于肝脏疾病诊断的蛋白芯片检测，此时待测蛋白可为肝炎病毒抗原、肝癌抗原或与肝脏疾病相关的抗原蛋白等。所用的蛋白芯片含有肝炎病毒的抗体，肝癌抗原的抗体或与肝脏疾病相关的抗原蛋白的抗体等。
生物素是一种有机小分子，它具有性质稳定，标记后对蛋白所产生的空间阻碍作用小，标记率高等特点。本发明利用生物素作为联系蛋白/抗体与信号分子的桥梁，与采用将纳米金属直接标记蛋白方法相比，生物素法能使蛋白保持更好的活性，从而达到高的检测灵敏度；利用生物素能与亲和素产生很强的特异性作用的特性，使用胶体金标记的亲和素将胶体金试剂特异性地结合至目标物上，而且由于生物素对蛋白质的高标记率使得目标物可以同时结合多个胶体金分子，可以大大提高银增强剂的显色效果，从而实现对蛋白质的高灵敏检测，检测限可达到1ng/ml以下。本发明方法操作简单，可以采用直接标记待测物的方法或者采用夹心法(先标记二抗，再进行杂交)，能同时对多个抗原实现直接的检测。本发明的检测灵敏度已达到、部分已超过荧光检测的灵敏度，而无需采用昂贵的荧光检测设备和荧光标记物，成本低廉。
附图说明
图1为荧光检测法的检测结果照片；
图2为本发明方法的检测结果照片；
图3为CEA抗原检测的灰度值与浓度的关系图；
图4为AFP抗原检测的灰度值与浓度的关系图；
图5为HBsAg抗原检测灰度值与浓度的关系图；
图6A-图6G分别为人铁蛋白、触球蛋白、铜蓝蛋白、纤连蛋白、α-抗胰蛋白、IgA和IgM的相对灰度值与蛋白浓度的关系图。
具体实施方式
实施例1、本发明方法与荧光法检测的对照实验
一、实验方法
1、蛋白芯片制备
蛋白芯片的制备方法参见文献(何为，许丹科，刘志红等。分析化学，2005，33：37-40)，所用抗人白蛋白单克隆抗体购自于南方医科大学。
2、待测样品的生物素标记
待测人白蛋白(人白蛋白为南方医科大学提供)用PBS缓冲液配制成1mg/ml浓度，在此溶液中加入生物素并使其终浓度为0.5mg/mL。混均后反应4小时后加入NH4Cl，浓度为50mmol/L，室温下放置10分钟。取100微升溶液放入透析器中，室温下搅拌透析7小时后，样品取出备用。反应时所需各种不同浓度的人白蛋白样品由此储存液稀释配制。
3、芯片杂交
将抗体蛋白芯片放入芯片反应盒中，加入各种浓度的生物素标记待测人白蛋白样品100微升，与芯片反应1小时。清洗后加入胶体金标记的亲合素试剂(Sigma公司，美国)50μL，在芯片上形成胶体金-抗原-抗体复合物。
4、实验结果检测
芯片清洗后，加入银显色增强试剂与抗体蛋白芯片反应15分钟，利用金颗粒可催化银离子还原成金属银原理，在胶体金表面形成可通过目测法观察到的银颗粒，并用CCD摄像装置检测图像，数据采用软件处理可获得各点的灰度值。
同时，以荧光检测法作为对照实验：在荧光检测法对照实验中，以Cy5亲和素荧光标记物(Sigma公司，美国)取代胶体金标记的亲合素试剂，其余步骤同于上述实验。在芯片上形成Cy5-抗原-抗体复合物。反应结果采用荧光扫描检测仪(PE公司，美国)检测其荧光值。
二、实验结果
荧光检测法的检测结果照片如图1所示：该蛋白芯片分为8个独立的反应区域，每个区域含有三排固定的蛋白抗体：上排为阴性对照点，中间为抗白蛋白抗体，下排为阳性对照点；8个反应区加入的样品浓度分别为：A：100ug/ml；B：20ug/ml；C：4ug/ml；D：800ng/ml；E：160ng/ml；F：32ng/ml；G：6.4ng/ml；H：1.28ng/ml。
本发明方法检测结果照片如图2所示：蛋白芯片分为8个独立的反应区域，每个区域含有五排固定蛋白抗体：第一排为阳性对照点，第二排阴性对照点，第三至第五排为抗白蛋白抗体；8个反应区加入的样品浓度分别为：A：125ng/ml；B：63ng/ml；C：32ng/ml；D：16ng/ml；E：8ng/ml；F：4ng/ml；G：2ng/ml；H：1ng/ml。
对比两个实验结果表明：本发明方法通过生物素直接标记样品，并通过银增强途径可以使蛋白芯片具有很高的检测灵敏度，对于所测试的人白蛋白最低检测浓度可达到0.1ng/mL；而对照的荧光法检测实验显示，其最低检测浓度约为6ng/ml左右。
实施例2、甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)的同时检测
1、制备抗体蛋白芯片
蛋白芯片的制备方法参见文献(何为，许丹科，刘志红等，分析化学，2005，33：37-40)，所用的抗癌胚抗原(anti-CEA)及抗甲胎蛋白(anti-AFP)抗体均购自US Biological公司(美国)。
2、二抗的生物素标记
将甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)的二抗蛋白(抗癌胚抗原及抗甲胎蛋白二抗均购自US Biological公司)用PBS缓冲液配制成浓度为10mg/ml的待标记溶液。在此溶液中加入生物素使其终浓度为0.5mg/mL，混均后反应4小时。反应完成后加入NH4Cl，浓度为50mmol/L。室温下放置10分钟。取100微升溶液放入透析器中，室稳下搅拌透析7小时后，样品取出备用。
3、芯片杂交
将抗体蛋白芯片放入芯片反应盒内，加入不同浓度待测的甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)样品(US Biological公司)100微升(CEA浓度为0、0.1、0.5、1、5、10、50、100ng/ml；AFP浓度为0、0.1、0.5、2.5、12.5、62.5ng/ml)。与芯片反应1小时后，加入生物素标记的二抗50μL，孵育1小时；用PBS缓冲液清洗后加入胶体金标记的亲合素试剂(Sigma公司，美国)50μL，在芯片上形成胶体金-抗原-抗体复合物。
4、实验结果检测
用PBS缓冲液清洗芯片后，加入银显色增强试剂50μL与抗体蛋白芯片反应15分钟，利用金颗粒可催化银离子还原成金属银原理，在胶体金表面形成可通过目测法观察到的银颗粒，并用CCD摄像装置检测图像，数据采用软件处理可获得各点的灰度值
各检测点的灰度与添加样品的浓度关系分别如图3和图4所示，图3为CEA抗原检测的灰度值与浓度的关系图，图4为AFP抗原检测的灰度值与浓度的关系图。由图可见，利用生物素标记的二抗，采用夹芯式杂交方式，本发明方法具有较高的检测灵敏度，对癌胚抗原(CEA)及甲胎蛋白(AFP)的检测限能分别达到0.1ng/ml与0.5ng/ml。实验中显示两者同时具有很好的特异性。
实施例3、乙型肝炎病毒的检测
1、制备乙型肝炎病毒抗体芯片
蛋白芯片的制备方法参见文献(何为，许丹科，刘志红等。分析化学，2005，33：37-40)，所用的乙肝表面抗原(HBsAg)及抗乙肝表面抗原(anti-HBsAg)购自北京科卫试剂公司。
2、乙肝表面抗原二抗的生物素标记
将乙肝表面抗原二抗(anti-HBsAg，购自北京科卫试剂公司)用PBS缓冲液配制成浓度为4mg/ml的待标记溶液，在此溶液中加入生物素并使其终浓度为2mg/mL，混均后反应4小时。反应完成后加入NH4Cl浓度为50mmol/L，室温下放置10分钟。取100微升溶液放入透析器中，室稳下搅拌透析7小时后，样品取出备用。
3、芯片杂交
将抗体蛋白芯片放入芯片反应盒中，加入不同浓度的待测乙肝病毒表面抗原(HBsAg)样品(北京科卫试剂公司)100微升(浓度为0、0.1、1、10、100、1000ng/ml)，与芯片反应1小时后，加入生物素标记的二抗孵育1小时。芯片清洗后加入胶体金标记的亲合素试剂(Sigma公司，美国)50μL。在芯片上形成胶体金-抗原-抗体复合物。
4、检测
清洗芯片后，加入银显色增强试剂与抗体蛋白芯片反应15分钟，利用金颗粒可催化银离子还原成金属银原理，在胶体金表面形成可通过目测法观察到的银颗粒。并用CCD摄像装置检测图像，数据采用软件处理可获得各点的灰度值。
HBsAg抗原检测灰度值与浓度的关系图如图5所示。实验结果表明，利用生物素标记的二抗，采用夹芯式杂交方式，本发明方法建立的金属银增强方法具有较高的检测灵敏度，对乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的检测限达到0.5ng/ml。
实施例4、与肝脏疾病相关的其他标志物(人铁蛋白、α-抗胰蛋白、铜蓝蛋白、IgM、IgA、纤连蛋白和触球蛋白等)的直接标记检测法
一、实验方法
1、蛋白芯片制备
抗人铁蛋白、抗α-抗胰蛋白、抗铜蓝蛋白、抗IgM、抗IgA、抗纤连蛋白和抗触球蛋白等抗体购自US Biological公司(美国)，蛋白芯片的制备方法参见文献：何为，许丹科，刘志红等。分析化学，2005，33(1)：37-40.
2、待测样品的生物素标记
待测样品人铁蛋白、α-抗胰蛋白、铜蓝蛋白、IgM、IgA、纤连蛋白和触球蛋白等购自Sigma公司(美国)。待测样品用PBS缓冲液配制，在此溶液中加入生物素使其终浓度为0.5mg/mL。混均后反应4小时，反应完成后加入NH4Cl浓度为50mmol/L，室温下放置10分钟。取100微升溶液放入透析器中，室稳下搅拌透析7小时后，样品取出备用。
3、芯片杂交
将抗体蛋白芯片放入自制的芯片反应盒中，加入不同浓度的生物素标记待测样品100微升(样品中各个蛋白的浓度值见图6A-图6G数据)，与芯片反应1小时；清洗后加入胶体金标记的亲合素试剂(Sigma公司，美国)，在芯片上形成胶体金-抗原-抗体复合物。
4、实验结果检测
清洗芯片后，加入银显色增强试剂与抗体蛋白芯片反应15分钟，利用金颗粒可催化银离子还原成金属银原理，在胶体金表面形成可通过目测法观察到的银颗粒，并用CCD摄像装置检测图像，数据采用软件处理可获得各点的灰度值。
二、实验结果
人铁蛋白、触球蛋白、铜蓝蛋白、纤连蛋白、α-抗胰蛋白、IgA和IgM的相对灰度值与蛋白浓度的关系分别如图6A-图6G所示。本发明方法对上述蛋白的检测灵敏度如表1所示。
表1.本发明方法对蛋白的检测灵敏度
  蛋白种类   检测限(ug/ml)
  人铁蛋白   0.11
  触球蛋白   0.08
  铜蓝蛋白   0.15
  纤连蛋白   0.15
  IgM   0.15
  IgA   0.2
  a胰酶蛋白   0.04
结果表明，在采用生物素直接标记蛋白，并用金属银增强检测的方法能较为灵敏地检测多种与肝脏疾病相关的蛋白抗原，显示了本方法的简便、灵敏、通用等诸多优势。

Claims (5)

1、一种蛋白芯片的检测方法，包括如下步骤：
1)用生物素标记的待测蛋白二抗、待测蛋白与蛋白芯片进行杂交；或者直接以生物素标记的待测蛋白与蛋白芯片进行杂交；
2)加入胶体金标记的亲和素与蛋白芯片进行杂交，然后，再加入银显色增强试剂进行反应，检测反应生成的银颗粒。
2、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述生物素标记的待测蛋白二抗或生物素标记的待测蛋白按如下步骤进行制备：在待测蛋白二抗或待测蛋白的溶液中加入生物素，混匀反应，反应后透析得到生物素标记的待测蛋白二抗或生物素标记的待测蛋白。
3、根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述标记过程中，待测蛋白二抗或待测蛋白的溶液浓度为1～10mg/ml，所述生物素的终浓度为0.1～5mg/ml。
4、根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：所述待测蛋白为肝炎病毒抗原、肝癌抗原或与肝脏疾病相关的抗原蛋白。
5、根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述能检测待测蛋白的蛋白芯片含有肝炎病毒的抗体，肝癌抗原的抗体或与肝脏疾病相关的抗原蛋白的抗体。
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