CN101126759B

CN101126759B - 塑料试管蛋白芯片、其制备方法及应用

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Publication number: CN101126759B
Application number: CN2007101518361A
Authority: CN
Inventors: 王琳; 孙民富
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-09-21
Filing date: 2007-09-21
Publication date: 2011-05-11
Anticipated expiration: 2027-09-21
Also published as: CN101126759A

Abstract

本发明公开了一种塑料试管蛋白芯片、其制备方法及应用。本发明还公开了主要以该塑料试管蛋白芯片为主要组分的检测试剂盒以及该试剂盒在诊断或检测疾病中的应用。本发明塑料试管蛋白芯片引入多种疾病检测指标，检测疾病的准确性大为提高。此外，本发明蛋白芯片还具有高灵敏度、高重复性、高稳定性、高信号性、可适于大量样本、简便、安全、价格便宜等优点。

Description

塑料试管蛋白芯片、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白芯片，尤其涉及一种塑料试管蛋白芯片、其制备方法及其在检测疾病中的应用；本发明还涉及主要以该塑料试管蛋白芯片为主要组分的诊断试剂盒、该试剂盒的制备方法及在检测疾病中的应用，属于生物芯片领域。

背景技术

生物芯片技术是九十年代中期兴起的一项新兴生物技术，因其可在一次反应中进行多种信息的平行分析，而受到众多研究者的瞩目，迅速在诸多生物学领域得到应用。生物芯片技术按检测对象分类，主要分为基因芯片和蛋白芯片两类。

基因芯片主要用于基因表达分析、基因组比较分析、多态性分析以及疾病的基因诊断等。由于基因芯片在人类基因组计划的研究工作中的重要作用，此技术在短短几年内得到了长足的发展。但基因芯片技术成本高，芯片的制备比较复杂，样品的准备与标记较为繁琐，且其信号检测的灵敏度也有待于进一步提高，这些问题使得目前对该技术的应用大多停留在实验室研究阶段，离临床检验及疾病诊断的普及性应用还有一段距离。

蛋白芯片是一项更为前沿的技术。它通过固定于支持介质上的多种蛋白质构成的微阵列，直接检测特定功能物质(标志性蛋白)。目前对蛋白芯片的研究和应用所采用的固相载体是无机片基或有机化合物片基，无机片基包括半导体硅片、玻璃片、微孔硅片、微孔玻璃片等，优选玻璃片；有机片基包括醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚丙烯膜等，优选硝酸纤维素膜。

现在，人类基因组计划即将完成，生物科学的研究重心即将从基因组研究转向蛋白质组的研究。蛋白芯片以其特有的优势，可为现代医学诊断学提供高效、便捷、准确的临床检测手段，对疑难病症的确诊及恶性疾病(如肿瘤)的早期诊断和及时治疗有重大的意义。此技术的成熟和应用必将在新世纪的疾病诊断和治疗，新型药物开发，探索疾病的分子机理等生命科学相关领域有巨大的应用前景。

现在的检测尿液、血清及其它体液的方法很多，检测方式大致包括ELISA、放射性同位素标记、金标、荧光、化学发光、时间分辨荧光等形式，检测的材料有酶标板、试剂条、试管、硅化玻璃等多种，多应用在检测体液中疾病性标志蛋白、激素、流行病毒、细胞因子等指标。这些方法均是在抗原抗体反应的基础上，采用酶、同位素、胶体金、荧光基团、镧性元素等不同标记形式，进行定量或定性检测。然而，现有的检测方法大多是单指标检测，信息量小，而且均有其局限性(如标记步骤复杂、试剂和仪器昂贵、操作烦琐、灵敏度低、易污染等)。

发明内容

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种含有多个疾病检测指标可并行检测疾病的塑料试管蛋白芯片，该塑料试管蛋白芯片用于检测疾病具有准确性和灵敏度高、高重复性、高稳定性等优点。

本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种含有多个疾病检测指标可并行检测疾病的塑料试管蛋白芯片，包括塑料试管片基和固定于该芯片上的蛋白质，所述的塑料试管(塑料试管基片表面活性集团为环氧基或醛基化三维聚合物，可通过共价/扩散吸附原理将蛋白质固定)大小为0.5ml-5ml，基片大小为0.2-3cm²；其中，所述的蛋白质能与体内某一疾病的至少两种标志蛋白特异结合。

优选的，蛋白质在基片上分布的密度范围是25-200点/cm²，一个点为一种蛋白质，每个点的点样量为0.1-10ng。

其中，所述的能够与体内疾病性标志蛋白特异结合的蛋白质可以是抗原、抗体、受体、配体，多肽药物等，例如可以是乳腺癌抗原(CA15-3)，胃肠癌抗原(CA19-9)，卵巢癌抗原(CA125)，细胞角质素19(CYFRA21-1)，糖类抗原72-4(CA72-4)，糖类抗原-50(CA-50)，磷癌相关抗原(SCC)，癌胚抗原(CEA)，前列腺特异性抗原(PSA)，游离前列腺特异性抗原(E-PSA)，甲胎蛋白(AFP)，游离B人绒毛膜促性激素，铁蛋白，B2微球蛋白，神经元特异性烯醇化酶(NSE)等。

例如为了检测胰腺癌，可以在基片上除固定CA19-9外，再加上CA125、CA50及DU-PAN，可把检出率提高到90％以上；再如为了检测肺癌，制备塑料试管蛋白芯片，除了在基片上固定CEA外，还再基片上固定NSE、CEA、SCC等蛋白，诊断的特异性和灵敏度显著提高。

本发明中所述的“受体”术语指细胞膜上或细胞内能识别生物活性分子(药物、毒素、神经递质和激素、抗原和细胞粘附分子等)并与之相结合的生物大分子。它们能将生物活性分子产生的信息传递到效应器，从而引起相应的生物效应。这些生物大分子多数是蛋白质，个别的是糖脂。

所述的“配体”术语是能与受体特异结合的生物活性分子(即药物、毒素、神经递质和激素、抗原和细胞粘附分子等)。抗原和抗体由于其免疫上的特殊功能，可单独归为一类。

本发明中所述的受体和配体均是蛋白质。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种制备上述塑料试管蛋白芯片的方法。

本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种制备上述塑料试管蛋白芯片的方法，包括：

使用芯片自动点样系统，通过物理吸附或共价结合的方式，将能够与体内疾病性标志蛋白特异结合的多种蛋白质按照下述要求分别固定在塑料试管上：密度分布范围：25-200点/cm²；每个点的点样量为0.1-10ng，一个点为一种蛋白质。

优选的，一种制备上述塑料试管蛋白芯片的方法，包括：

(1)将所要固定的能够与体内疾病性标志蛋白特异结合的蛋白质分别以一定浓度(最少1μg/μl)溶解于pH值为6-10.0的PBS缓冲液中；

(2)用芯片自动点样系统将溶解于PBS缓冲液中的蛋白质点制在塑料试管片基上，点样密度范围是25-200点/cm²，一个点为一种蛋白质，蛋白质点样量的范围为0.1-10ng/点；其中，塑料试管大小为0.5ml-5ml，基片大小为0.2-3cm²；

(3)放置过夜；用封闭液将蛋白芯片封闭10分钟-1小时；

(4)密封保存于惰性气体中，即得。

其中，步骤(3)所述的封闭液优选为含1％-10％奶粉(milk powder)(RothGmbH)的PBS溶液，其pH值为6-10.0。

本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种主要以上述塑料试管蛋白芯片为主要组分的检测疾病的试剂盒，该试剂盒含有多个指标可并行检测疾病。

本发明所要解决的又一个技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种多指标并行检测疾病的试剂盒，包括：上述的塑料试管蛋白芯片；生物素标记液；链亲和素反应液；产生并增强化学发光反应的组合物；蛋白芯片的洗涤液；被检蛋白质的标准品(如actin)；封闭液。

其中，所述蛋白芯片的洗涤液含有PBS和0.05-0.2％的Tween20，pH值在6.0-9.0之间；

所述的链亲和素反应液优选为耦联纳米；

所述的产生并增强化学发光反应的组合物指起始剂(initiator)和增强剂(enhancer)；

被检测标准品可用actin蛋白，或每种芯片上蛋白质对应结合的被检测蛋白质(应在体液中被检测到)以一定浓度混合配制成，此标准品与蛋白芯片的结合，经过一系列反应，产生的光信号在一个可比的范围内。

所述封闭液中含有1-20％BSA或1-20％牛奶粉。

其中洗涤液配方为：pH值在6.0至9.0之间PBS洗涤液其中含0.1-0.5％Tween20，封闭液的作用是使固相载体的其他部位不能结合蛋白质，从而保证实验数据的准确性。

本发明的多指标并行检测疾病的试剂盒的使用方法如下：

1、用PBS稀释液将待测的体液上清液稀释，一般稀释5-20倍，使待测蛋白质浓度为0.5-2mg/ml，取1-2.5μl of NHS-succinimid-Biotin(SIGMA)(100μg/μl in ultra pure DMSO；water free)，溶于25-100ul待测蛋白质在200-550rpm和20-37度下振摇20-30分钟，反应形成A-labelled；

2、吸取含2-20％BSA(SIGMA)标记蛋白，照每平方厘米蛋白芯片约50ul的体积滴加到蛋白芯片塑料试管中在200-550rpm下20-30温度作用20-30分钟；使体液中的特定蛋白质(A-labelled)与固定于蛋白芯片上的特异性蛋白(B)起反应，形成稳定复合物B-A-labelled；

3、吸干反应液，将蛋白芯片放在洗涤液PBS-T中振摇3-6分钟，重复二到三次；

4、吸取0.2-5ul纳米金溶液(BRITISH BIOCELL，PLANO公司)加入上述蛋白芯片塑料试管中，在200-550rpm下20-30温度作用20-30分钟；复合物B-A进一步与多蛋白混合液中的特异性结合蛋白C反应，形成稳定复合物B-A-labelled-C；

5、吸干反应液，将蛋白芯片放在洗涤液中振摇3-6分钟，重复二到三次；

6、将20-100ul增强剂和20-100ul初始剂(BRITISH BIOCELL，PLANO公司)加入上述蛋白芯片塑料试管中，通过塑料试管蛋白芯片仪(clondiag公司)于每30秒-1分钟的设置频率连续记录5min-1hr并通过计算机监控和保存；数据处理采用Partisian IconoClust软件(clondiag公司)定量计算；如采用标准品作对照，则被检测样品对标准品有强烈信号差异，表明该指标呈阳性。

本发明所用到的浓度单位除非特指均为W/V。

本发明所述用于多指标并行检测的蛋白芯片其一个显著的特点是引入多种疾病指标，使得检测的准确性大大增加。现有的疾病指标绝大多数是非特异性指标，不仅多个标示物含量在同一疾病同时显著升高，而且同一标志物含量在多种疾病皆会升高，这种情况导致疾病诊断上会出现误诊。就拿肿瘤的检测来说，现有的疾病标志性蛋白均是非特异性指标。就连公认的原发性肝癌指标AFP(甲胎蛋白)对肝癌的检出率只有70％左右，并且AFP在某些睾丸癌、畸胎癌、胃癌、胰腺癌等患者血清中也有明显增高。因此提出了多种标志物联合检测的必要性。如胰腺癌：CA19-9检出率约60％，加上CA125、CA50及DU-PAN则可把检出率提高到90％以上。再如肺癌：单用CEA对肺癌诊断已有较高的特异性，但如加上NSE、唾液酸、CEA、SCC则特异性更高。

本发明所述用于多指标并行检测的蛋白芯片的另一个优点是灵敏度高，利用化学发光反应和增强发光反应使得本蛋白芯片可检测每毫升体液中含量仅有1pg的目标蛋白。这使得一些特异性高但在体液中含量很低的蛋白指标可以被用于临床检测，从而扩大了临床检测指标的选择范围。

此外，本发明的蛋白芯片还具有高重复性(因试管芯片掌控性好，重复性好)、高稳定性(4℃可稳定放置2年；37℃可稳定放置1周)、高信号性、可适于大量样本、简便(大约2小时内完成实验)、安全(比现在使用的荧光芯片无放射性，无污染)、价格便宜(比现在使用的荧光芯片便宜)等优点。

附图说明

图1塑料蛋白芯片与待测样品在不同反应时间的结果示意图。

图2用塑料蛋白芯片检测待测样品的数字化结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例

试验材料：与体内疾病性标志蛋白特异结合的蛋白质：通过采集来自临床肿瘤病人的血清，选用肿瘤系列抗体：乳腺癌抗(CA15-3)，胃肠癌抗原(CA19-9)，卵巢癌抗原(CA125)，细胞角质素19(CYFRA21-1)，糖类抗原72-4(CA72-4)，糖类抗原-50(CA-50)，磷癌相关抗原(SCC)，癌胚抗原(CEA)，前列腺特异性抗原(PSA)，游离前列腺特异性抗原(E-PSA)，甲胎蛋白(AFP)(0-300ng/ml)，甲胎蛋白(AFP)(0-1000ng/ml)，游离B人绒毛膜促性激素，铁蛋白，B2微球蛋白，神经元特异性烯醇化酶(NSE)。

实施例1试剂盒的制备

1、蛋白芯片的制备

(1)将CA19-9、、CA50及DU-PAN分别以最少不低于1μg/μl的浓度溶解于pH值为6-10.0的PBS缓冲液中；

(2)用芯片自动点样系统将溶解于PBS缓冲液中的蛋白质分别点制在塑料试管片基上，点样密度范围是25-200点/cm²，一个点为一种蛋白质，蛋白质点样量的范围为0.1-10ng/点；其中，塑料试管大小为0.5ml-5ml，基片大小为0.2-3cm²；

(3)放置过夜；用封闭液(含1％-10％奶粉的PBS溶液，pH值为6-10.0)将蛋白芯片封闭10分钟-1小时；

(4)密封保存于惰性气体中，即得蛋白芯片。

2、试剂盒的组装

试剂盒包括：塑料试管蛋白芯片；蛋白芯片的洗涤液(洗涤液含有PBS和0.05-0.2％的Tween20，pH值在6.0-9.0之间)；生物素标记液；链亲和素反应液；起始剂和增强剂；actin；封闭液。将上述各组分分别包装后，装入到试剂盒，即得。

试验例1试剂盒的临床检测试验

检测方法：

1.按常规方法提取蛋白：用pH7.4 PBS稀释液将待测的蛋白稀释，一般稀释5-20倍，使待测蛋白质浓度为0.5-2mg/ml，取2μl of NHS-succinimid-Biotin(SIGMA)(100μg/μl in ultra pure DMSO；water free)，溶于25ul待测蛋白质在550rpm和30温度下振摇20分钟，反应形成A-labelled.

2.吸取含10％BSA标记蛋白，照每平方厘米蛋白芯片约50ul的体积滴加到蛋白芯片塑料试管中在550rpm下30温度作用20分钟.使体液中的特定蛋白质(A-labelled)与固定于蛋白芯片上的其特异性蛋白(B)起反应，形成稳定复合物B-A-labelled.；

3.吸干反应液，将蛋白芯片放在洗涤液pH7.4PBS-T(1％)中振摇3-6分钟，重复二到三次。

4.吸取1ul纳米金溶液(BRITISH BIOCELL，PLANO公司)入上述蛋白芯片塑料试管中，在550rpm下30温度作用20分钟。复合物B-A进一步与多蛋白混合液中的特异性结合蛋白C反应，形成稳定复合物B-A-labelled-C；

5.吸干反应液，将蛋白芯片放在pH7.4PBS-T(0.05％吐温-20)；洗涤液中振摇3-6分钟，重复二到三次。

6.50ul增强剂和50ul初始剂(BRITISH BIOCELL，PLANO公司)加入上述蛋白芯片塑料试管中，通过塑料试管蛋白芯片仪(clondiag公司)于每30秒-1分钟的设置频率连续记录5min-1hr并通过计算机监控和保存。数据处理采用Econuclust软件(clondiag公司)定量计算；

检测结果表明：本发明试剂盒检测胰腺癌的准确率达到97.5％。

Claims

1.一种检测疾病的试剂盒，所述试剂盒包括，塑料试管蛋白芯片、NHS-succinimid-Biotin、链亲和素纳米金溶液、产生并增强化学发光反应的组合物、蛋白芯片的洗涤液、被检蛋白质的标准品和封闭液，所述塑料试管蛋白芯片包括塑料试管基片和固定于该基片上的蛋白质，塑料试管大小为0.5ml-5ml，基片大小为0.2-3cm²，所述蛋白质为CA19-9、CA125、CA50及DU-PAN，所述方法包括：

(1)、用PBS稀释液将待测的体液上清液稀释5-20倍，使待测蛋白质浓度为0.5-2mg/ml，取1-2.5μl of NHS-succinimid-Biotin溶于25-100ul待测蛋白质在200-550rpm和20-37温度下振摇20-30分钟，反应形成A-labelled；

(2)、吸取含2-20％BSA标记蛋白，按照每平方厘米蛋白芯片50ul的体积滴加到蛋白芯片塑料试管中在200-550rpm下20-30温度作用20-30分钟；使体液中的特定蛋白质A-labelled与固定于蛋白芯片上的特异性蛋白B起反应，形成稳定复合物B-A-labelled；

(3)、吸干反应液，将蛋白芯片放在洗涤液PBS-T中振摇3-6分钟，重复二到三次；

(4)、吸取0.2-5ul链亲和素纳米金溶液加入上述蛋白芯片塑料试管中，在200-550rpm下20-30温度作用20-30分钟；复合物B-A进一步与待测蛋白质中多蛋白混合液中的特异性结合蛋白C反应，形成稳定复合物B-A-labelled-C；

(5)、吸干反应液，将蛋白芯片放在洗涤液中振摇3-6分钟，重复二到三次；

(6)、将20-100ul增强剂和20-100ul初始剂加入上述蛋白芯片塑料试管中，通过塑料试管蛋白芯片仪于每30秒-1分钟的设置频率连续记录5min-1hr并通过计算机监控和保存；数据处理采用Partisian IconoClust软件定量计算；如采用标准品作对照，则被检测样品对标准品有强烈信号差异，表明该指标呈阳性。

2.根据权利要求1所述的检测疾病的试剂盒，其特征在于：所述的固定于该基片上的蛋白质按照下述特征固定在塑料试管的基片上：分布密度是25-200点/cm²，一个点为一种蛋白质；蛋白质点样的量是0.1ng/点-10ng/点。

3.根据权利要求1所述的检测疾病的试剂盒，其特征在于，所述塑料试管蛋白芯片按照以下步骤制备：

(1)将所要固定的蛋白质溶解于pH值为6-10.0的PBS缓冲液中；

(2)用芯片自动点样系统将溶解于PBS缓冲液中的蛋白质点制在塑料试管基片上，点样密度范围是25-200点/cm²，一个点为一种蛋白质，蛋白质点样量的范围为0.1-10ng/点；其中，塑料试管大小为0.5ml-5ml，基片大小为0.2-3cm²；

(3)放置过夜；用封闭液将蛋白芯片封闭10分钟-1小时；

(4)密封保存于惰性气体中，即得。

4.根据权利要求1所述的检测疾病的试剂盒，其特征在于：所述的洗涤液含有PBS和0.05-0.2％的吐温20，pH值在6.0-9.0之间；所述的产生并增强化学发光反应的组合物为起始剂和增强剂；所述封闭液中含有1-20％BSA或1-20％牛奶粉。

5.根据权利要求1所述的检测疾病的试剂盒，其特征在于：被检测标准品为actin蛋白。