CN102435655A

CN102435655A - 基于场效应晶体管的肿瘤诊断仪及其检测方法

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Publication number: CN102435655A
Application number: CN2011102601447A
Authority: CN
Inventors: 徐成; 李秋红; 许志; 张恩迪; 陈立宝; 王太宏
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2011-09-05
Filing date: 2011-09-05
Publication date: 2012-05-02

Abstract

一种基于场效应晶体管的人肿瘤的快速诊断装置，由场效应晶体管生物芯片、微流体通道进样封装系统、电子检测系统三部分组成。利用半导体制作工艺在硅衬底上构建一对源、漏电极和在源、漏两极间的半导体沟道，在沟道上共价修饰硅烷试剂作为连接分子，连接某肿瘤标志物的特异性抗体蛋白，然后用聚二甲基硅氧烷构建的微流体通道与硅衬底紧密贴合封装，最后将源、漏两电极与一套信号检测系统相连。可通过对人血液中的肿瘤标记物的检测，实现快速、准确、早期地诊断出患者是否患有某种癌症，是一种集成化、高通量、便携式的肿瘤诊断装置。

Description

基于场效应晶体管的肿瘤诊断仪及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种利用场效应集晶体管快速、早期诊断人是否患有癌症的装置和检测方法。

背景技术

癌症对人类健康和生命的威胁很大。它和心血管疾病一起，已成为医学上的两大难关。全世界60亿人口中，每年约有700万人新患癌症，每年约有500多万人死于癌症，几乎每6秒钟就有一名癌症患者死亡。近年来，我国癌症的发病率呈上升趋势，恶性肿瘤居城市人口死因的首位。随着医学的进步和发展，诊断方法不断进步可以使大约80-90％的癌症得到确诊，而且，1/3的癌症患者能在早期发现。世界卫生组织作出的最新权威性结论：癌症患者如果能早期发现，治愈率可达80％以上。因此，早期肿瘤诊断已成为全世界医务人员长期以来极尽全力研究的重要方向。

肿瘤标志物(Tumor Marker)：是由肿瘤细胞产生的，存在于细胞、组织或体液中，能用化学或免疫方法定量的、能证实癌肿存在(或在某一脏器存在)的、能监测肿瘤治疗和预后的物质。这些物质必须在正常人中不存在或者是在癌肿患者中出现的水平显著高于正常人。如：癌胚抗原CEA(carcinoembryonic antigen)，是一种可溶性糖蛋白，胚胎期主要存在于胎儿的胃肠管、胰腺和肝脏。胃肠道恶性肿瘤时可见血清CEA升高，在乳腺癌、肺癌及其他恶性肿瘤中也可出现表达，并分泌于体液中。CEA是一个结肠癌标记物，CEA与CA242联合应用目前被认为是对结肠癌的最佳标记物的搭配。在整个直肠癌治疗其间，CEA是一个有效的监视指标，是发现复发的理想指标，其敏感性高于X线和直肠镜。又如：PSA(prostate-specific antigen)，前列腺特异抗原，是前列腺癌最敏感的肿瘤标志物，在判断前列腺癌体积时要优于前列腺酸性磷酸酶。它对早期没有症状的前列腺癌的诊断很有意义。正常情况下，PSA是由前列腺上皮细胞分泌产生的一种丝氨酸蛋白酶，是一种糖蛋白，直接分泌到前列腺导管系统内。它的正常功能是邦助精液凝块水解液化，与男性生育力有关。正常的前列腺导管系统周围存在着一种血-上皮之间的屏障，避免了前列腺上皮产生的PSA直接进入血液之中，从而维持了血液中PSA的低浓度。一般认为，血清PSA小于4.0ng/ml为正常，PSA大于10ng/ml则患前腺癌的危险性增加。当前列腺发生癌时就破坏了血-上皮之间的屏障，而癌分泌的PSA亦多了，致使PSA直接进入血内，癌的恶性程度越高，对于正常前列腺组织破坏越大，血清中PSA越高。

除了人血液中某些特定的肿瘤标志物代表着肿瘤将要或者已经产生外，还有一些特定蛋白也有预示疾病的功效，检测这些蛋白对于疾病的早期诊断、防治，也非常有意义。可以通过相同的方法为本装置检测到。如急性心肌梗死(AMI)是临床常见的急性多发病，正确诊断及时救治对挽救濒死心肌，改善预后降低急性期病死率和死亡率具有重要意义。心肌肌钙蛋白(Cardiac Troponin，CTn)是心肌收缩的调节蛋白，存在于心肌收缩蛋白的细肌丝上。肌钙蛋白的作用之一是把原肌凝蛋白(Tropomyosin)附着于肌动蛋白(Action)上，三者共同组成细肌丝。心脏损伤如AMI的早期，心肌细胞未坏死，但细胞膜破坏，游离形式的心肌肌钙蛋I白进入组织间隙，经淋巴回流入血。血清心肌肌钙蛋白I于6小时升高，其后肌原纤维不断崩解破坏，固定形式的心肌肌钙蛋白I不断释放，血清水平于18-24小时达高峰。所以在AMI时释放入血是心肌损伤的特异性标志物，并具有灵敏度高，在血中出现时间早，诊断窗口时间长等优点。此外CTn在预测梗塞面积，评价溶栓疗效，AMI愈后心功能判定，不稳定心绞痛愈后评估等方面也具有重要的临床价值。

传统的生物医学检测血液中的蛋白或者DNA的方法一般是用ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)酶联免疫吸附试验或者PCR(Polymerase Chain Reaction)聚合酶链式反应，这些检测方法大多对实验条件要求较高，需要特定的实验设备或仪器(如PCR仪)，且过程繁琐，试剂昂贵，不利于高通量、快速、廉价、现场检测肿瘤标记物。

所以开发一种能够早期、快速、灵敏、微量(少于1毫升)检测人血液中的肿瘤标志物的装置与方法具有重要的意义。为了满足以上对人体肿瘤标志物或者血液中一些重要的疾病标志性蛋白质检测，我们设计了一种集合了场效应晶体管的高灵敏、集成化特性与针对某特异标志物的抗原-抗体高特异性的血液检测仪，可以用来检测人血液中的各种肿瘤标志物及含量。基于纳米材料构建的场效应晶体管生物芯片，能够直接、超灵敏的检测到人血液中的微量的肿瘤标志物，从而突破了传统检测方法的束缚，且装置构建简单、便携，可实现快速、现场检测人体内的肿瘤标志物。具有实时灵敏、快速便携、高通量、集成化、自动化等特点，是诊断人是否患癌症、是否有肿瘤病灶的极佳方法与装置。

发明内容

本发明的主要目的是构建一套只利用待测者微量的血液，就能够快速、灵敏、准确地诊断人是否患有癌症或是否有肿瘤的病灶的装置和方法。本方法能够解决现有的传统方法的不足之处，更简单廉价、快速灵敏检测人血液中的肿瘤标志物。利用生物学的免疫反应捕获肿瘤标志物，快速准确，具有特异性，结合场效应晶体管这一物理学器件进行信号检测，使得本装置更易于集成化、自动化、高通量的检测样本，适合于当今社会癌症、肿瘤发病现象越来越普遍化，需要对数量巨大的样本对于高通量、快速检测。

本发明提供了一种新型的肿瘤标志物的检测方法，其原理是：将待检测者的血液收集在一普通的容器中，经过一个简单的稀释、纯化过程，再通入与场效应晶体管检测芯片整合的PDMS(聚二甲基硅氧烷)微流体通道中，当流过场效应晶体管的敏感沟道材料时，如果有目标肿瘤标记物，即会与修饰在沟道上的特异性抗体结合，吸附在沟道上面，由于肿瘤标志物多数是蛋白或DNA，他们在人的血液中多数是带负电的，所当他们吸附在半导体场效应晶体管的沟道上时，会对场效应晶体管产生电场的作用，减弱或加强半导体沟道的耗尽，从而影响载流子的迁移速率或者浓度，所以会有电流的增加或者减弱，产生一定程度的电信号。肿瘤标志物的含量越高，这种电信号越强。且场效应晶体管输出的电学信号易于被电脑识别。本装置和方法流动进样、即时检测，检测完毕后样品流出、再通入一定量的洗涤缓冲溶液数十秒，即可进行下一样品的诊断检测，是对人血液中的肿瘤标记物的快速、准确、高通量的检测方法。

本发明的技术方案之一是，构建了用于肿瘤标记物的检测的场效应晶体管的生物芯片(如图1)，其构建步骤为：

(1)将各种材料的纳米线或薄膜通过一定方法置于有SiO₂绝缘层的硅衬底上，作为场效应晶体管的沟道。

(2)通过磁控溅射等方式在沟道的两侧，构建出长1至2厘米、宽5毫米、厚200纳米左右的金属电极，作为场效应晶体管源极、漏极。

(3)两电极距离50至100微米。

(4)构建好芯片后，在沟道处滴加质量分数为1％的APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)或GPTMS(γ(2，3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷))有机连接试剂，修饰反应3小时。

(5)修饰上有机连接试剂后，在沟道处再滴加含有针对某种特定肿瘤标记物的抗体蛋白溶液，反应1小时。即得到具有检测肿瘤标记物能力的场效应晶体管生物芯片。

本发明的技术方案之二是，提供了一种肿瘤标记物的检测装置与方法，其组成和作用为：

(1)用于装纳人血液的容器瓶及其连接软管。容器的下端开一小口，连接上带有机械阀门如铁夹的塑料或硅胶软管。本部分装置的作用在于装容人的血液，下一步检测时即可打开控制液流的机械阀门，让容器里的血液通过软管流入与聚二甲硅氧烷整合的场效应晶体管生物芯片检测装置。所有的容器、软管等装置均进行灭菌、消毒处理，确保不让其他病原微生物或杂质影响检测结果。

(2)与软管相连接的聚二甲基硅氧烷微流体芯通道。它与修饰好某肿瘤标志物抗体的场效应晶体管芯片紧密粘合。采用可塑的聚二甲基硅氧烷高分子聚合物材料与场效应晶体管芯片紧密贴合的目的在于构建出一个可以进样品溶液、流过晶体管沟道、再流出溶液的密闭通道，这样易于控制液流方向与线路。流出微流体通道后再连接一烧杯，当做废液池。

(3)场效应晶体管生物芯片。在场效应晶体管的敏感沟道部分修饰上肿瘤标志物抗体，再连接外部的测量、检测设备，当含有肿瘤标志物的溶液流经场效应晶体管的沟道部分时，溶液中的肿瘤标志物分子就会与修饰在沟道上的抗体特异性的结合，由于肿瘤标志物大多是蛋白或者核酸，它们在溶液中带电性，结合在沟道上后会对半导体沟道内的载流子产生电场的作用，会增强或减弱半导体的耗尽，从而改变场效应晶体管源极、漏极间的电学信号，可以被测量仪器所检测到。

本发明的技术方案之三是构建了与场效应晶体管生物芯片整合的微流体通道，其构建的步骤、方法是：其制备方法为，利用半导体光刻工艺，在硅衬底上构建一条长数厘米，宽100微米、深50微米的凸起的SU-8光刻胶作用模板，然后将液态的聚二甲基硅氧烷与一定剂量的固化剂混合后覆盖于模板上。随后放入真空干燥箱，真空状态，90度下加热20分钟后取出。将凝固的聚二甲基硅氧烷块与模板分离，再与硅衬底紧密贴合即构建完成。

本肿瘤标志物检测装置与方法的可行性和灵敏度来源于场效应晶体管生物芯片对于患者血液中微量的带一定电性的肿瘤标志物的敏感响应，本方法的选择性来源于固定在场效应晶体管沟道上的通过一般生物方法制备的针对某种肿瘤标志物的抗体，通过固定不同种类的抗体，可实现对不同部位肿瘤的特异性诊断。本方法能实现快速性、便携性现场诊断的原因是场效应晶体管生物芯片和电子检测系统易于小型化、集成化、耗能低，且可重复利用，适合于在缺少常规生物医学检测实验室设备条件下进行快速诊断。本装置和方法易于自动化、高通量诊断样本的原因是，场效应晶体管输出的电学信号易于被电脑快速识别，且流动进样、即时检测，检测完毕后样品流出、再通入一定量的洗涤缓冲溶液数十秒，即可进行下一样品的诊断检测，使本装置易于实现自动化、高通量诊断大量样品。

本发明方法与装置的突出特点与显著进步在于：

(1)本发明基于的场效应晶体管生物芯片，构建材料灵活多变，可以是有机薄膜、无机金属氧化物材料，构建方法和抗体连接的方法都简单易行。如若使用某些生物相容性好的有机材料(如石墨烯)作为沟道，抗体蛋白可无需中介直接连接在晶体管上，大大降低诊断时间和成本。

(2)本发明基于的场效应晶体管生物芯片，在检测时利用聚二甲基硅氧烷微流体通道和SiO₂钝化层对电极和芯片进行保护，有效提高芯片使用率和重复性。

(3)本方法可构建数个场效应晶体管阵列，可一次性直接检测人血液中的数种肿瘤标记物，高效、快速，取血量微小(几十微升即可)，减少患者的痛苦。

(4)本方法由于使用纳米级的有机、无机半导体材料构建场效应晶体管生物芯片，可实现灵敏、快速检测，灵敏度比传统方法提高10³到10⁶，检测时间在1分钟内就能完成。实时、快速，无需荧光或其他分子标记物。

(5)本方法将场效应晶体管与现在高发的癌症的普及化检测结合起来，制备出的检测仪，输出电信号，易于集成化、自动化、廉价检测，适合对样本数量巨大的癌症普查检测。

附图说明

图1是本发明所述方法场效应晶体管生物芯片检测血液中肿瘤标志物的原理图。

图1标记含义见下表：

附图1标记	含义	附图1标记	含义
				1	源极	2	电极钝化层
3	半导体沟道	4	抗体
				5	肿瘤标志物	6	连接剂GPTMS
7	漏极	8	SiO₂氧化层
				9	硅衬底

具体实施方式一

基于ITO(Indium Tin Oxides，氧化铟锡)薄膜晶体管生物芯片的血液中前列腺特异抗原PSA的诊断装置：

(1)通过等离子体增强化学气相沉积法(Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition，PECVD)法用SiH₄和O₂作为反应气体，在硅衬底上沉积一层基于固态电解质的多孔二氧化硅层。

(2)再通过磁控溅射的方法，在0.5Pa的纯氩气的环境下，用一个特制的部分镂空掩模板的掩盖，控制掩模板在硅衬底上方50微米，溅射ITO做成源极、漏极和沟道。没有掩盖的地方即溅射成较厚的ITO源极、漏极，被掩盖的地方由于掩模板距硅衬底有50微米，所以会形成一层较薄的ITO薄层，作为场效应晶体管的沟道。在芯片的边缘刮去多孔二氧化硅层，露出硅衬底即做成栅极。

(3)将ITO薄膜晶体管器件用乙醇、丙酮洗净，再将沟道部分用双氧水和氨水混合溶液处理10分钟。接着在沟道上滴加上GPTMS溶液反应3小时。再滴加前列腺特异抗原的抗体，反应1小时。再通入牛血清白蛋白封闭，缓冲溶液洗涤即可得到具有检测前列腺特异抗原能力的场效应晶体管生物芯片

(4)制做PDMS微流体通道，通道长5厘米，宽100微米，深50微米，并将微流体通道与前面制备好的场效应晶体管生物芯片紧密贴合，保证溶液流经通道时，不会从通道的两侧漏液。

(5)将微流体通道的入口接上塑料或橡胶软管，再与装有待检测者样品的容器相连，微流体通道的出口也接上软管，通往废液池。场效应晶体管的源极、漏极与电子检测装置通过导线相连接。

(6)将不含有和含有前列腺特异抗原的两种样品依次通过软管流入微流体通道，通过生物修饰的场效应晶体管的沟道部分，可观测到电流信号发生变化。可根据此信号快速、准确分辨该患者是否患有前列腺癌症或是否有肿瘤病灶。

具体实施方式二

基于SnO₂纳米线晶体管生物芯片的血液中心肌肌钙蛋白的诊断装置：

(1)采用水热法或CVD(Chemical Vapor Deposition)合成作为场效应晶体管沟道的SnO₂纳米线等一维金属氧化物材料。

(2)场效应晶体管的绝栅层是硅衬底上的一层致密的二氧化硅。

(3)采用光刻和磁控溅射的方法SnO₂纳米线两端制备出金属电极，作为源极、漏极，再在芯片的边缘刮去二氧化硅层，露出硅衬底即做成栅极。

(3)将SnO₂纳米线器件用乙醇、丙酮洗净，再将沟道部分用双氧水和氨水混合溶液处理10分钟。接着在沟道上滴加上GPTMS溶液反应3小时。再滴加心肌肌钙蛋白的抗体，反应1小时。再通入牛血清白蛋白封闭，缓冲溶液洗涤即可得到具有检测急性心肌梗死能力的场效应晶体管生物芯片

(6)将不含有和含有心肌肌钙蛋白的两种样品依次通过软管流入微流体通道，通过生物修饰的场效应晶体管的沟道部分，可观测到电流信号发生变化。可根据此信号快速、准确判断、预测该患者是否有出现急性心肌梗死等心脏疾病的可能。

Claims

1.一种基于场效应晶体管生物芯片的诊断血液中肿瘤标志物的装置和方法，其特征是以功能化修饰的场效应晶体管生物芯片为核心，加上辅助进液、出液的PDMS(聚二甲基硅氧烷)微流体通道和电子检测系统组成，能够检测人血液中的某种微量特定肿瘤标志物的含量。

2.如权利1所述的场效应晶体管的生物芯片，其特征是在硅衬底上利用半导体工艺制造的金属性的源极电极、漏极电极和和连接在源极和漏极电极间的半导体沟道。半导体敏感材料沟道可以是硅纳米线、碳纳米管、SnO₂纳米线、TiO₂纳米线、GaN纳米线、石墨烯纳米带、有机物薄膜中的一种或几种。源极电极和漏极电极上钝化一层SiO₂以适应在水溶液中的检测。

3.如权利1所述的场效应晶体管的生物芯片，其特征在于：所述的半导体沟道可以是一根或由多条组成的阵列。

4.如权利1所述的功能化修饰的场效应晶体管，其特征在于晶体管的半导体沟道上通过有机连接剂APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)或GPTMS(γ(2，3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷)等的中介作用，将某种肿瘤标记物的抗体蛋白连接在半导体敏感沟道上面。

5.如权利1所述的场效应晶体管的生物芯片能够检测人血液中的特定肿瘤标志物的含量的原理是指，将针对某种肿瘤标志物的抗体蛋白修饰在半导体敏感沟道上面，当取待检测者的血液，通过微流体通道，流过连接有抗体的沟道时，抗体可以和肿瘤标志物发生特异性的结合，吸附在沟道上面，由于肿瘤标志物大多数是蛋白或DNA，他们在人的血液中是带负电的，所当他们吸附在沟道上时，会对半导体沟道产生电场的作用，减弱或加强沟道的耗尽，从而影响载流子的迁移速率或者浓度，最终会有电流的增加或者减弱，从而检测系统检测到电信号的变化。

6.如权利3所述的针对某种肿瘤标志物的抗体，其来源可用常规的生物学制备单克隆抗体的方法事先制备，再修饰在场效应晶体管的沟道上。

7.如权利1所述的辅助进液、出液的PDMS微流体通道，其特征是由PDMS构建的，控制液体流动范围和方向的，与硅衬底紧密贴合的长方体块状物，与硅衬底贴合的一面上有长数厘米，宽50微米到1毫米、深50微米到100微米的凹陷下去的通道，当与硅衬底紧密贴合时，即构建出了一个介于硅衬底与PDMS块之间的密闭通道，在通道入口和出口处再各接一塑料或硅胶软管。整个微流体通道装置的作用是控制样品流入检测装置，并让液流缓慢、有序地流过场效应晶体管的沟道部分，再流出至废液池。

8.如权利6所述的辅助进液、出液的PDMS微流体通道，其制备方法为，利用半导体光刻工艺，在硅衬底上构建一条长数厘米，宽100微米、深50微米的凸起的SU-8光刻胶作用模板，然后将液态的PDMS加入一定剂量的固化剂后覆盖与模板上，随后放入真空干燥箱，真空状态、90度下加热20分钟后取出，将凝固的PDMS块与模板分离，再与硅衬底紧密贴合即构建完成。

9.如权利1所述的电子检测系统，主要由能在场效应晶体管的三个电极端(源极、漏极、栅极)给予电压的电源装置和一个电流表构成。