CN102830233B - 一种基于硝酸纤维素膜的elisa反应方法 - Google Patents

一种基于硝酸纤维素膜的elisa反应方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于硝酸纤维素膜的ELISA反应方法，其具体包括如下步骤：(1)取在硝酸纤维素膜上点好一抗样品的蛋白芯片，加好待测样本；(2)置于摇床37℃，转速：150～350rpm，振荡温育30min；(3)洗涤芯片；(4)加酶标二抗；(5)置于摇床37℃，转速：150～350rpm，振荡温育30min；(6)洗涤芯片；(7)加化学发光底物；(8)用芯片阅读仪检测光信号强度。本发明是通过提高抗原抗体温育反应中摇床的转速，达到了使抗原抗体充分反应的效果，表现在提高抗原抗体温育反应时的摇床转速后，芯片实验检测结果显示信号明显提高。

Description

一种基于硝酸纤维素膜的ELISA反应方法
技术领域
本发明涉及免疫生物技术领域，具体涉及一种基于硝酸纤维素膜上固定特殊蛋白质而成蛋白芯片的反应方法。
背景技术
蛋白芯片技术的基本原理是将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片。ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay)的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学的许多领域。
双抗体夹心法，它是检测抗原最常用的ELISA，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原。其基本工作原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的，因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比(在方法可检测范围内)。测定复合物中的酶作用于加入的底物后的信号值，即可确定待测抗原含量。本发明所使用的蛋白芯片检测的基本原理即为双抗体夹心法。具体方法如下：
(1).将肿瘤标志物一抗通过点样仪定量有序地点在硝酸纤维素膜上；
(2).用封闭液封闭已点样的硝酸纤维素膜；
(3).加待检样本及标准品，温育；
(4).洗去未结合的抗原抗体；
(5).加酶标二抗，温育；
(6).洗去未结合的酶标二抗；
(7).加化学发光底物；
(8).用芯片阅读仪检测光信号值；
(9).通过标准曲线计算待检样本抗原含量。
以上生化反应过程中，提高抗原抗体反应的充分性至关重要。影响抗原抗体反应充分性的因素较多，其中，抗原抗体反应条件起着重要作用。目前采用的抗原抗体温育反应时摇床转速为100rpm，这个转速条件下，抗原抗体反应不够充分，从而需要增加酶标二抗的用量来提高检测信号值，这不仅增加了原料成本而且增加酶标二抗的用量会带来诸如使本底值升高等一些负面影响。
发明内容
本发明所要解决的技术问题提供一种基于硝酸纤维素膜上固定特殊蛋白质而成蛋白芯片的反应方法。该方法通过提高抗原抗体温育反应过程中摇床的转速，达到了使抗原抗体充分反应的效果，表现在提高抗原抗体温育反应时的摇床转速后，芯片实验检测结果显示信号明显提高。
本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现：
一种基于硝酸纤维素膜的ELISA反应方法，具体包括如下步骤：
(1)取在硝酸纤维素膜上点好一抗样品的蛋白芯片，加好待测样本；
(2)置于摇床(型号为HDYC-2004C)37℃，转速：150～350rpm，振荡温育30min；
(3)洗涤芯片；
(4)加酶标二抗；
(5)置于摇床37℃，转速：150～350rpm，振荡温育30min；
(6)洗涤芯片；
(7)加化学发光底物；
(8)用芯片阅读仪检测光信号强度。
有益效果：本发明通过适当提高抗原抗体温育时的摇床转速，使抗原抗体反应更加充分，从而提高了检测信号强度。在其他条件相同的情况下，适当提高摇床转速后芯片检测信号值为原有摇床转速条件下芯片检测信号值的2～4倍。
具体实施方式：
以下对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
通过对比不同转速下的抗原抗体温育效果，达到优化反应条件的目的：
实施例1
(1)取在硝酸纤维素膜上点好一种肿瘤标志物单克隆抗体AFP一抗样品的蛋白芯片，向反应孔内加100ul浓度A、批号B的AFP抗原；
(2)置于摇床(型号为HDYC-2004C)37℃，转速：150rpm，振荡温育30min；
(3)用洗涤液洗涤4次；
(4)向反应孔内加100ul浓度C和批号D的酶标二抗AFP-HRP；
(5)置于摇床37℃，转速：150rpm，振荡温育30min；
(6)用洗涤液洗涤4次；
(7)向反应孔内加20ul化学发光底物，静置1min；
(8)将该芯片置于芯片阅读仪内读取光信号值。
实施例2
(1)取在硝酸纤维素膜上点好一种肿瘤标志物单克隆抗体AFP一抗样品的蛋白芯片，向反应孔内加100ul浓度A、批号B的AFP抗原；
(2)置于摇床(型号为HDYC-2004C)37℃，转速：200rpm，振荡温育30min；
(3)用洗涤液洗涤4次；
(4)向反应孔内加100ul浓度C和批号D的酶标二抗AFP-HRP；
(5)置于摇床37℃，转速：200rpm，振荡温育30min；
(6)用洗涤液洗涤4次；
(7)向反应孔内加20ul化学发光底物，静置1min；
(8)将该芯片置于芯片阅读仪内读取光信号值。
实施例3
(1)取在硝酸纤维素膜上点好一种肿瘤标志物单克隆抗体AFP一抗样品的蛋白芯片，向反应孔内加100ul浓度A、批号B的AFP抗原；
(2)置于摇床(型号为HDYC-2004C)37℃，转速：250rpm，振荡温育30min；
(3)用洗涤液洗涤4次；
(4)向反应孔内加100ul浓度C和批号D的酶标二抗AFP-HRP；
(5)置于摇床37℃，转速：250rpm，振荡温育30min；
(6)用洗涤液洗涤4次；
(7)向反应孔内加20ul化学发光底物，静置1min；
(8)将该芯片置于芯片阅读仪内读取光信号值。
实施例4
(1)取在硝酸纤维素膜上点好一种肿瘤标志物单克隆抗体AFP一抗样品的蛋白芯片，向反应孔内加100ul浓度A、批号B的AFP抗原；
(2)置于摇床(型号为HDYC-2004C)37℃，转速：300rpm，振荡温育30min；
(3)用洗涤液洗涤4次；
(4)加酶标二抗；
(5)置于摇床37℃，转速：300rpm，振荡温育30min；
(6)用洗涤液洗涤4次；
(7)向反应孔内加20ul化学发光底物，静置1min；
(8)将该芯片置于芯片阅读仪内读取光信号值。
实施例5
(1)取在硝酸纤维素膜上点好一种肿瘤标志物单克隆抗体AFP一抗样品的蛋白芯片，向反应孔内加100ul浓度A、批号B的AFP抗原；
(2)置于摇床(型号为HDYC-2004C)37℃，转速：350rpm，振荡温育30min；
(3)用洗涤液洗涤4次；
(4)加酶标二抗；
(5)置于摇床37℃，转速：350rpm，振荡温育30min；
(6)用洗涤液洗涤4次；
(7)向反应孔内加20ul化学发光底物，静置1min；
(8)将该芯片置于芯片阅读仪内读取光信号值。
实施例6
(1)取在硝酸纤维素膜上点好一种肿瘤标志物单克隆抗体AFP一抗样品的蛋白芯片，向反应孔内加100ul浓度A、批号B的AFP抗原；
(2)置于摇床(型号为HDYC-2004C)37℃，转速：100rpm，振荡温育30min；
(3)用洗涤液洗涤4次；
(4)加酶标二抗；
(5)置于摇床37℃，转速：100rpm，振荡温育30min；
(6)用洗涤液洗涤4次；
(7)向反应孔内加20ul化学发光底物，静置1min；
(8)将该芯片置于芯片阅读仪内读取光信号值。
本发明实施例中的实施例6为空白对照，即为目前普遍的LISA反应方法，实施例1～6的膜实验结果如表1所示：
表1
  实施例   1   2   3   4   5   6
  信号值   1723   2300   3250   2506   2123   800
从这一结果可以看出，在抗原抗体温育时一定程度地提高其所处摇床转速可以提高芯片实验检测结果显示信号值，从而达到增强反应灵敏度的作用。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (1)

1.一种基于硝酸纤维素膜的ELISA反应方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)取在硝酸纤维素膜上点好一抗样品的蛋白芯片，加好待测样本；
(2)置于摇床37℃，转速：250rpm,振荡温育30min；
(3)洗涤芯片；
(4)加酶标二抗；
(5)置于摇床37℃，转速：250rpm,振荡温育30min；
(6)洗涤芯片；
(7)加化学发光底物；
(8)用芯片阅读仪检测光信号强度。
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