CN102621301B - 一种基于硝酸纤维素膜的蛋白芯片封闭液的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于硝酸纤维素膜的蛋白芯片封闭液的制备方法，该方法是在目前普遍采用的封闭液配方的基础上增添两种适当浓度的非离子表面活性剂形成的，从而使芯片检测信噪比提高，进而可在一定范围内降低酶标二抗的用量使本底值及材料成本都降低。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于硝酸纤维素膜的蛋白芯片封闭液的制备方法。
背景技术
蛋白芯片技术的基本原理是将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上，经过封闭液封闭，干燥之后成为检测用的芯片。然后，用带有特定标记的蛋白质或其他成份与芯片作用，经漂洗将未能与芯片上的蛋白质结合的成份洗去，再利用各种信号捕捉技术，测定芯片上各点的信号强度，通过信号强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系，由此达到测定各种蛋白质功能或含量的目的。
其中封闭液的作用是将载体上非目的蛋白位点即非特异性位点予以封闭，降低生化反应中的非特异性结合从而降低本底，提高灵敏度和特异性；封闭液的成分通常包括糖类、蛋白质等，依据产品种类的不同，封闭液的成分也不尽相同。目前，基于硝酸纤维素膜的蛋白芯片封闭液主要以一定浓度的蔗糖和BSA为组成成分。
蛋白芯片在医疗诊断领域可以利用抗原抗体间的相互作用来达到对与疾病相关蛋白含量的检测目的。双抗体夹心法，它是检测抗原最常用的ELISA，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原。其基本工作原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的,因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比(在方法可检测范围内)。测定复合物中的酶作用于加入底物后的信号值，即可确定待测抗原含量。
双抗体夹心法的具体步骤如下：（1）.将肿瘤标志物一抗通过点样仪定量有序地点在硝酸纤维素膜上；（2）.用封闭液封闭已点样的硝酸纤维素膜；（3）.加待检样本及标准品，温育；（4）.洗去未结合的抗原抗体；（5）.加酶标二抗，温育；（6）.洗去未结合的酶标二抗；（7）.加化学发光底物；（8）.用芯片阅读仪检测信号强度值；（9）.通过标准曲线计算待检样本抗原含量。
以上双抗体夹心法具体步骤中，提高底物化学发光信噪比至关重要。而提高化学发光信噪比可以着眼于对检测仪的改进，同时也应该关注生物材料及生化反应本身。对于生化反应本身，在一定范围内，提高信号值可以通过提高酶标二抗的用量来实现，但是存在一定的弊端，如：增加酶标二抗的用量会增大本底值，同时也会很大程度增加材料成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有双抗体夹心法中所使用的封闭液存在的不足而提供一种基于硝酸纤维素膜的蛋白芯片封闭液的制备方法。本发明的方法是在目前普遍采用的封闭液的基础上添加一定浓度的非离子表面活性剂，例如tween20和tween60。其中，tween20可以使BSA、蔗糖等其它封闭液组分能更有效地对膜上非点样位点发挥封闭作用，用以降低生化反应过程中的蛋白质非特异性吸附；tween60可以调节封闭液的粘稠度并协助tween20发挥更为积极的作用。tween20与tween60按照一定浓度配合使用能提高封闭液的封闭效果，为蛋白芯片体系的生化反应提供更加优越的微环境条件，使蛋白芯片体系的生化反应活力得到增强，从而使检测信号值增加。
本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现：
一种基于硝酸纤维素膜的蛋白芯片封闭液的制备方法，其特征在于，是在封闭液加入非离子表面活性剂tween20和tween60。
本发明所述的基于硝酸纤维素膜的蛋白芯片封闭液的制备方法，是将重量百分比4%蔗糖和重量百分比2.5%的BSA溶于一定量的0.1MpH7.4的磷酸缓冲液中，再向其中加入重量百分比0.025%～2.0%的tween20和0.001%～0.032%ttween60以及0.02%叠氮钠，搅拌均匀，过滤后即可。
在本发明的一个优选实施例中，所述tween20的重量百分比为0.05%～0.4%，tween60的重量百分比为0.002%～0.016%。
在本发明的一个优选实施例中，所述tween20的重量百分比为0.1%,tween60的重量百分比为0.004%；或者所述ween20的重量百分比为0.2%，tween60的重量百分比为0.008%。
有益效果：本发明的一种基于硝酸纤维素膜的蛋白芯片封闭液的制备方法，通过所添加的非离子表面活性剂tween20和tween60，使封闭液的封闭效果得以提高，为生化反应提供了更好的微环境条件，增强了蛋白芯片体系的生化反应活力，从而提高了信噪比。在其他条件相同的情况下，添加了tween20和tween60的封闭液封闭的芯片信噪比为现用封闭液封闭芯片信噪比的2～4倍，如此一来，要达到原来信号值要求，可以在一定范围内降低酶标二抗的使用量，从而既能降低本底值又能节约材料成本。
具体实施方式：
以下对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
通过对比添加不同浓度梯度的tween20与tween60时的信噪比，达到优化添加浓度的目的：
实施例1
（1）称取40g蔗糖和25g的BSA，放入洁净的烧杯中；
（2）量取1000ml的0.1M pH7.4的磷酸缓冲液置于烧杯中，搅拌使固体充分溶解；
（3）待固体充分溶解后，加0.25ml tween20，0.01ml tween60于烧杯中，搅拌均匀；
（4）称取0.2g叠氮钠加入该烧杯中，并继续搅拌混匀；
（5）待完全混匀后，用不锈钢过滤器过滤待用。
实施例2
（1）称取40g蔗糖和25g的BSA，放入洁净的烧杯中；
（2）量取1000ml的0.1M pH7.4的磷酸缓冲液置于烧杯中，搅拌使固体充分溶解；
（3）待固体充分溶解后，加0.5ml tween20，0.02ml tween60于烧杯中，搅拌均匀；
（4）称取0.2g叠氮钠加入该烧杯中，并继续搅拌混匀；
（5）待完全混匀后，用不锈钢过滤器过滤待用。
实施例3
（1）称取40g蔗糖和25g的BSA，放入洁净的烧杯中；
（2）量取1000ml的0.1M pH7.4的磷酸缓冲液置于烧杯中，搅拌使固体充分溶解；
（3）待固体充分溶解后，加1ml tween20，0.04ml tween60于烧杯中，搅拌均匀；
（4）称取0.2g叠氮钠加入该烧杯中，并继续搅拌混匀；
（5）待完全混匀后，用不锈钢过滤器过滤待用。
实施例4
（1）称取40g蔗糖和25g的BSA，放入洁净的烧杯中；
（2）量取1000ml的0.1M pH7.4的磷酸缓冲液置于烧杯中，搅拌使固体充分溶解；
（3）待固体充分溶解后，加2ml tween20，0.08ml tween60于烧杯中，搅拌均匀；
（4）称取0.2g叠氮钠加入该烧杯中，并继续搅拌混匀；
（5）待完全混匀后，用不锈钢过滤器过滤待用。
实施例5
（1）称取40g蔗糖和25g的BSA，放入洁净的烧杯中；
（2）量取1000ml的0.1M pH7.4的磷酸缓冲液置于烧杯中，搅拌使固体充分溶解；
（3）待固体充分溶解后，加4ml tween20，0.16ml tween60于烧杯中，搅拌均匀；
（4）称取0.2g叠氮钠加入该烧杯中，并继续搅拌混匀；
（5）待完全混匀后，用不锈钢过滤器过滤待用。
实施例6
（1）称取40g蔗糖和25g的BSA，放入洁净的烧杯中；
（2）量取1000ml的0.1M pH7.4的磷酸缓冲液置于烧杯中，搅拌使固体充分溶解；
（3）待固体充分溶解后，加8ml tween20，0.32ml tween60于烧杯中，搅拌均匀；
（4）称取0.2g叠氮钠加入该烧杯中，并继续搅拌混匀；
（5）待完全混匀后，用不锈钢过滤器过滤待用。
实施例7
（1）称取40g蔗糖和25g的BSA，放入洁净的烧杯中；
（2）量取1000ml的0.1M pH7.4的磷酸缓冲液置于烧杯中，搅拌使固体充分溶解；
（3）待固体充分溶解后，称取0.2g叠氮钠加入该烧杯中，并继续搅拌混匀；
（4）待完全混匀后，用不锈钢过滤器过滤待用。
经过对比观察可以看出，实施例1-7封闭液封闭的芯片在制备过程中除了封闭液成份发生变化外，其他制备方法一致。其中实施例7为不添加tween20和tween60的阴性对照组，同时它也目前普遍采用的封闭液的制备方法相同。
待各实施例的配置液配置完成后，用这7组封闭液封闭抗体AFP，结合以硝酸纤维素膜为主要素材的膜免疫反应，对比tween20和tween60不同添加量对最终信噪比的影响，从而优选出最终浓度。
具体步骤如下：
1、取实施例1-7封闭液封闭的芯片向反应孔内加100ul相同浓度和批号的AFP抗原；
2、置于摇床100rpm，37℃温育30min；
3、用相同洗涤液洗涤4次；
4、向反应孔内加100μl相同批号的酶标二抗AFP-HRP，其中实施例1～6酶标二抗AFP-HRP的浓度为a/2，而对实施例7，设计两组不同的酶标二抗AFP-HRP的浓度，一组为a/2，一组为a；
5、置于摇床100rpm，37℃温育30min；
6、用相同洗涤液洗涤4次；
7、向反应孔内加20μl化学发光底物，静置1min；
8、将该芯片置于芯片阅读仪内读取光信号值及本底值，结果如表1所示。
表1
图像内两个亮点即为点样量一致的两个平行点，它们是目的蛋白AFP化学发光后被芯片阅读仪所捕获的图像，亮点的亮度越大表明信号值越高，反之越低；亮点周围区域即为硝酸纤维素膜上非特异位点，该区域越亮表明本底越高，反之越低。对比实施例1～6与作为阴性对照的实施例7的两组信号值/本底值（即为信噪比），可以发现实施例3中的信噪比最高，且实施例1～6中的信噪比甚至高于两倍于它酶标二抗用量的阴性对照组。
从这一结果可以看出，添加了tween20和tween60的封闭液相比目前普遍采用的封闭液，在后面的免疫反应中表现出更高的信噪比，有效的增强了信噪比，减少了酶标二抗的使用量，从而降低了检测成本。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (4)
1.一种基于硝酸纤维素膜的蛋白芯片封闭液的制备方法，其特征在于，是在包含蔗糖和BSA的封闭液加入非离子表面活性剂tween20和tween60，其中tween20添加的重量百分比为0.025％～2.0％，tween60添加的重量百分比为0.001％～0.032％。
2.如权利要求1所述的基于硝酸纤维素膜的蛋白芯片封闭液的制备方法，其特征是将重量百分比4％蔗糖和重量百分比2.5％的BSA溶于一定量的0.1MpH7.4的磷酸缓冲液中，再向其中加入重量百分比0.025％～2.0％的tween20和0.001％～0.032％tween60以及0.02％叠氮钠，搅拌均匀，过滤后即可。
3.如权利要求2所述的基于硝酸纤维素膜的蛋白芯片封闭液的制备方法，其特征是，所述tween20的重量百分比为0.05％～0.4％，tween60的重量百分比为0.002％～0.016％。
4.如权利要求2所述的基于硝酸纤维素膜的蛋白芯片封闭液的制备方法，其特征是，所述tween20的重量百分比为0.1％,tween60的重量百分比为0.004％；或者所述tween20的重量百分比为0.2％，tween60的重量百分比为0.008％。
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