CN112986555A - 一种gpc-3化学发光试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种GPC‑3化学发光试剂盒，属于生物检测技术领域，该GPC‑3化学发光试剂盒所述试剂盒包括：磁珠稀释液试剂，所述磁珠稀释液试剂的组分包括：包被GPC‑3捕获抗体的金磁微粒和第一稀释液；所述包被GPC‑3捕获抗体的金磁微粒的固相载体为微米级金磁微粒，所述金磁微粒包含金磁微粒内核和以金属纳米粒子修饰的外壳。本发明通过采用微米级的金磁微粒作为固相载体，将巯基活化后的GPC‑3捕获抗体固定在金磁微粒表面的载体上，再加入纯化的酶标二抗，双抗体夹心法测试，通入化学发光底物AMPPD，对GPC‑3的进行定量检测；采用本发明的一种GPC‑3化学发光试剂盒进行GPC‑3的测量，可检测的GPC‑3最低浓度低，灵敏度高、线性范围更宽，样本相关性好。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，特别涉及一种GPC-3化学发光试剂盒。
背景技术
GPC-3(Glypican-3)是Glypican家族中的一员，属于膜性硫酸乙酰肝素多糖蛋白。在哺乳动物的胚胎期，GPC3通过影响多个分子信号通路而对组织器官的发育起到重要的调控作用，其功能缺失将导致过度生长和畸变综合征(SGBS)。成人GPC-3的异常表达与多种肿瘤的发生发展关系密切。GPC-3在肝细胞癌(HCC)中表达上调，与HCC的生物学特性相关，在肝癌的早期诊断、生物治疗和预后评估中具有良好的应用前景。
目前现有文献公开报道中GPC-3物质的检测方法为ELISA方法和化学发光的检测方法检测血清中GPC-3的含量。传统的化学发光检测方法中，需要对抗原或抗体进行标记，存在着以下的缺陷问题包括：一是标记步骤复杂、费力、耗时，且需要专业的或操作熟练的人员；二是标记后的抗体或抗原分子生物活性降低，限制了线性范围和灵敏度等分析性能；三是通常采用夹心免疫分析，需要引入标记二抗分子，操作过程较为复杂、耗时，且分析成本较高：四是抗体或抗原分子上能够标记的酶数量有限。综上，现有的GPC-3物质的检测方法存在步骤复杂、费力、耗时；检测线性范围受限制，能够标记的酶数量低，使检测灵敏度低等缺陷。
因此，本领域技术人员致力于开发一种GPC-3化学发光试剂盒，旨在解决现有技术中GPC-3检测过程中抗原或抗体进行标记后生物活性降低，限制了线性范围和灵敏度低的缺陷。
发明内容
鉴于上述问题，提出了本发明以便提供一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的一种GPC-3化学发光试剂盒。
为实现上述目的，本发明实施例提供一种GPC-3化学发光试剂盒，所述试剂盒包括：磁珠稀释液试剂，
所述磁珠稀释液试剂的组分包括：包被GPC-3捕获抗体的金磁微粒和第一稀释液；所述包被GPC-3捕获抗体的金磁微粒中的金磁微粒的制备方法包括：
获取氯金酸水溶液；
将裸磁微球溶液进行稀释，稀释后依次滴加入所述氯金酸水溶液和还原剂，获得第一反应溶液；
在搅拌条件下，加热所述第一反应溶液至沸腾，并保持一定时间的沸腾状态，后冷却至室温，获得表面修饰胶体金层的金磁微粒。
可选的，将裸磁微球溶液进行稀释，稀释后依次滴加入所述氟金酸水溶液和还原剂，获得第一反应溶液，包括：
将裸磁微球溶液与稀释剂按体积比1∶10进行稀释，稀释后依次滴加入所述氯金酸水溶液和还原剂，获得第一反应溶液；
所述裸磁微球溶液、所述氟金酸水溶液和所述还原剂的体积比为10∶2∶1，所述第一反应溶液中的氯金酸浓度是所述氯金酸水溶液浓度的0.02倍。
可选的，所述氯金酸水溶液和所述还原剂的滴加时间总和不大于45min。
可选的，所述包被GPC-3捕获抗体的金磁微粒的制备方法包括：
将第一GPC-3抗体溶液和硫醇类还原剂混合，并在室温下反应25-35min，以打开所述GPC-3抗体重链之间的二硫键，除杂后加入偶联缓冲液，获得第一活化GPC-3抗体溶液；
将所述第一活化GPC-3抗体溶液与所述金磁微粒混合，后置于温度为35℃～39℃且恒温条件下进行反应，反应结束后洗除与金磁微粒非牢固结合的抗体，获得包被GPC-3捕获抗体的金磁微粒。
可选的，所述包被GPC-3捕获抗体的金磁微粒和所述第一稀释液的体积比为1∶18～22。
可选的，所述第一稀释液组分包括：100mM PB，0.1％(重量)Tween20，0.5％(重量)BSA，0.1％(重量)PC-300，所述第一稀释液的pH值为7.2-7.8。
可选的，所述试剂盒还包括：酶标二抗稀释液试剂，
所述酶标二抗稀释液试剂的组分包括：酶标二抗和第二稀释剂；所述酶标抗体复合物的制备方法包括：
将第二GPC-3抗体和抗体活化剂混合并进行活化反应，室温条件下活化至少20min，反应结束后纯化去杂，获得第二活化GPC-3抗体；
将免疫酶和酶活化剂混合并进行活化反应，室温条件下活化至少15min，反应结束后纯化去杂，获得活化免疫酶；
将所述第二活化GPC-3抗体与所述活化免疫酶混合并加入MgCl2溶液，在2-8℃温度下反应至少12h，反应结束后纯化去杂，获得酶标抗体复合物。
可选的，所述酶标二抗包含酶标抗体复合物和甘油，所述酶标二抗包含酶标抗体复合物和所述甘油的体积比为1∶0.8～1.2，所述免疫酶为碱性磷酸酶。
可选的，所述酶标二抗和所述第二稀释剂的体积比为1∶480～520。
可选的，所述第二稀释剂的组分包括：100mM的Tris，0.9％(重量)NaCl，4mMMgCl2，0.4mM ZnCl2，0.1％(重量)PC-300，1％(重量)BSA，5％(重量)胎牛血清，所述第二稀释剂的PH值为6.2-6.8。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明的一种GPC-3化学发光试剂盒，通过采用微米级的金磁微粒作为固相载体，将巯基活化后的GPC-3捕获抗体固定在金磁微粒表面的载体上，再加入纯化的酶标二抗，双抗体夹心法测试，通入化学发光底物AMPPD，即可对GPC-3的进行定量检测；与传统的96孔聚苯乙稀平板，以金属纳米粒子修饰的金磁微粒作为免疫反应的固相载体有着许多优势：该金磁微粒通过表面基团的修饰，可与抗体或抗原靠疏水作用、静电作用形成牢固稳定的偶联物即免疫磁巧，比微孔板的结合效率更高；同时拥有较大的比表面积，为免疫反应提供更充分的反应环境；超顺磁性使其分离过程更加快速高效；结合胶体金属技术，形成了一种新的磁性复合微粒，即金磁微粒，这种新型材料继承了金磁微粒原本的超顺磁可分离性等优势，同时又具有胶体金属可与含氨基、琉基等功能基团的抗体快速结合的能力；
本申请金磁微粒作为抗体的固相载体，直接一步法实现包被，偶联率高，有利于生物蛋白的大量修饰以提高检测的灵敏度，检测线性范围宽。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例中的附图，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明实施例中的包被GPC-3捕获抗体的金磁微粒的制备方法示意图；
图2是本发明实施例中的实施例2的线性范围检测数据图；
图3是本发明实施例中的实施例4的临床相关性检测数据图；
其中，图2中，a为实施例2的检测数据线、b为对比例2的检测数据线。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
下面将结合实施例、对照例及实验数据对本申请的一种GPC-3化学发光试剂盒进行详细说明。
实验材料：
a.裸磁微球(微米级)：购于JSR公司；氯金酸购于Sigma
b.GPC-3捕获抗体：为鼠单抗，采用SDS-PAGE法，纯度应＞95％，浓度应＞5mg/mL；
c.GPC-3捕获抗体：为鼠单抗，采用SDS-PAGE法，纯度应＞95％，浓度应＞5mg/mL；
d.碱性磷酸酶AP。
实施例1、
(1)磁珠包被抗体制备：
原料的准备：
氯金酸水溶液的配制：将氯金酸溶于去离子纯化水中溶解，配成2.5×10-2M的水溶液，置于4℃备用，有效期3个月。
制备金磁微粒前先将玻璃仪器用重铬酸洗液浸泡过夜后用去离子水清洗烘干。
首先，取10mL裸磁微球溶液用去离子纯化水稀释至100mL于三口烧瓶中，通过加料管缓慢匀速滴加2mL的氯金酸溶液，使氯金酸的最终浓度为5.0×10-4M，通过另一个加料管缓慢匀速滴加1mL还原剂硼氢化钠溶液，两种溶液于45分钟内滴加完毕后，立即加热反应液至沸腾，并保持沸腾状态1小时，停止搅拌，冷却至室温，即可得到表面修饰胶体金层的金磁微粒。
吸取质量1mg的金磁微粒加入2mL离心管中，通过磁性分离架分去上清，后用0.5mL的磁珠清洗液(100mM MES，0.05％Tween20，pH6.0)进行磁性分离洗涤3次，去除上清液；
同时另取一2mL离心管吸取一定质量的GPC-3抗体溶液，加入5mM的DDT二硫苏糖醇，混匀室温反应30min，以打开抗体重链之间的二硫键，用脱盐柱除去多余的还原剂，测蛋白浓度定容，加入1×偶联缓冲液使总体积为200μL，混匀。
GPC-3抗体的包被：
将上述活化的抗体溶液200μL，全部加入清洗后去掉上清的金磁微粒管中，混匀后放入常温180rpm结合孵育30min，反应结束后用500μL的1×PBST洗涤缓冲液重复清洗3次，洗去与金磁粒微粒非牢固结合的抗体，磁分去上清。
封闭：
取1mL灭活的碱性磷酸酶作为封闭剂加入上述离心管中，混匀后放入恒温(37℃)培养箱中180rpm结合孵育1h，之后放置2-8℃静置10h，最后用500μL的1×PBST洗涤缓冲液重复清洗3次，洗去多余的封闭剂和与金磁微粒非牢固结合的物质，磁分去上清。
保存：
向封闭后的免疫磁珠加入1mL保存液，混匀后放置2-8℃保存备用。
(2)酶标抗体制备：
取0.5mg的抗体，加入0.2mL抗体活化剂溶液(100mM Tris，0.3％NaGl，5mM EDTA，10mg/mL2IT交联剂)，室温下活化20min，用分子筛层析方式纯化，得到活化后的抗体；
取0.4mg的碱性磷酸酶，加入0.2mL酶活化剂(100mM Tris，0.3％NaGl，5mM EDTA，5mg/mLSMCC交联剂、DMF)，室温下反应15min，用分子筛层析方式纯化，得到活化后的碱性磷酸酶；
将活化后的抗体与活化后的碱性磷酸酶按质量比1∶0.8混合，加入0.01mL的1MMgCl2，在2-8℃条件下反应12h，反应结束后用分子筛纯化，得到酶标二抗体复合物；
按照1∶1的体积加入甘油保存，得到酶标记后的抗体R，保存在-20℃条件下。
(3)磁珠稀释液试剂和酶标二抗稀释液试剂制备：
磁珠稀释液试剂：将磁珠包被后的抗体用M稀释液(100mM PB，0.1％Tween20，0.5％BSA，0.1％PC-300，pH为7.5)按照1：20的比例进行稀释，得到磁珠稀释液试剂。
酶标二抗稀释液试剂：将酶标记后的抗体用R稀释液(100mM的Tris，0.9％NaCl，4mM MgCl2，0.4mM ZnCl2，0.1％PC-300，1％BSA，5％胎牛血清，pH为6.5)按照1∶500的比例进行稀释，得到酶标二抗稀释液试剂。
(4)校准品制备：
将GPC-3抗原用校准品稀释液(50mM Tris，0.9％NaCl，0.2％Tween20，0.2％酪蛋白，1％BSA，0.1％PC-300，pH为7.5)配制成0ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL的浓度。
实施例2、
(1)磁珠包被抗体制备：
原料的准备：
氯金酸水溶液的配制：将氯金酸溶于去离子纯化水中溶解，配成2.5×10-2M的水溶液，置于4℃备用，有效期3个月。
制备金磁微粒前先将玻璃仪器用重铬酸洗液浸泡过夜后用去离子水清洗烘干。
首先，取10mL裸磁微球溶液用去离子纯化水稀释至100mL于三口烧瓶中，通过加料管缓慢匀速滴加2mL的氯金酸溶液，使氯金酸的最终浓度为5.0×10-4M，通过另一个加料管缓慢匀速滴加1mL还原剂硼氢化钠溶液，两种溶液于45分钟内滴加完毕后，立即加热反应液至沸腾，并保持沸腾状态1小时，停止搅拌，冷却至室温，即可得到表面修饰胶体金层的金磁微粒。
吸取质量1mg的金磁微粒加入2mL离心管中，通过磁性分离架分去上清，后用0.5mL的磁珠清洗液(100mM MES，0.05％Tween20，pH6.0)进行磁性分离洗涤3次，去除上清液；
同时另取一2mL离心管吸取一定质量的GPC-3抗体溶液，加入10mM的TCEP，混匀室温反应30min，以打开抗体重链之间的二硫键，用脱盐柱除去多余的还原剂，测蛋白浓度定容，加入1×偶联缓冲液使总体积为200μL，混匀。
GPC-3抗体的包被：
将上述活化的抗体溶液200μL，全部加入清洗后去掉上清的金磁微粒管中，混匀后放入常温180rpm结合孵育30min，反应结束后用500μL的1×PBST洗涤缓冲液重复清洗3次，洗去与金磁粒微粒非牢固结合的抗体，磁分去上清。
封闭：
取1mL灭活的碱性磷酸酶作为封闭剂加入上述离心管中，混匀后放入恒温(37℃)培养箱中180rpm结合孵育1h，之后放置2-8℃静置10h，最后用500μL的1×PBST洗涤缓冲液重复清洗3次，洗去多余的封闭剂和与金磁微粒非牢固结合的物质，磁分去上清。
保存：
向封闭后的免疫磁珠加入1mL保存液，混匀后放置2-8℃保存备用。
(2)酶标抗体制备：
取0.5mg的抗体，加入0.2mL抗体活化剂溶液(100mM Tris，0.3％NaCl，5mM EDTA，10mg/mL2lT交联剂)，室温下活化10min，用分子筛层析方式纯化，得到活化后的抗体；
取0.4mg的碱性磷酸酶，加入0.2mL酶活化剂(100mM Tris，0.3％NaCl，5mM EDTA，5mg/mLSMCC交联剂、DMF)，室温下反应10min，用分子筛层析方式纯化，得到活化后的碱性磷酸酶；
将活化后的抗体与活化后的碱性磷酸酶按质量比1：0.5混合，加入0.01mL的1MMgCl2，在2-8℃条件下反应10h，反应结束后用分子筛纯化，得到酶标二抗体复合物；
按照1∶1的体积加入甘油保存，得到酶标记后的抗体R，保存在-20℃条件下。
(3)磁珠稀释液试剂和酶标二抗稀释液试剂制备：
磁珠稀释液试剂：将磁珠包被后的抗体用M稀释液(100mM PB，0.1％Tween20，0.5％BSA，0.1％PC-300，pH为7)按照1：10的比例进行稀释，得到磁珠稀释液试剂。
酶标二抗稀释液试剂：将酶标记后的抗体用R稀释液(100mM的Tris，0.9％NaCl，4mM MgCl2，0.4mM ZnCl2，0.1％PC-300，1％BSA，5％胎牛血清，pH为6)按照1∶300的比例进行稀释，得到酶标二抗稀释液试剂。
(4)校准品制备：
将GPC-3抗原用校准品稀释液(50mM Tris，0.9％NaCl，0.2％Tween20，0.2％酪蛋白，1％BSA，0.1％PC-300，pH为7.5)配制成Ong/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL的浓度。
实施例3、
(1)磁珠包被抗体制备：
原料的准备：
氯金酸水溶液的配制：将氟金酸溶于去离子纯化水中溶解，配成2.5×10-2M的水溶液，置于4℃备用，有效期3个月。
制备金磁微粒前先将玻璃仪器用重铬酸洗液浸泡过夜后用去离子水清洗烘干。
首先，取10mL裸磁微球溶液用去离子纯化水稀释至100mL于三口烧瓶中，通过加料管缓慢匀速滴加2mL的氯金酸溶液，使氯金酸的最终浓度为5.0×10-4M，通过另一个加料管缓慢匀速滴加1mL还原剂硼氢化钠溶液，两种溶液于45分钟内滴加完毕后，立即加热反应液至沸腾，并保持沸腾状态1小时，停止搅拌，冷却至室温，即可得到表面修饰胶体金层的金磁微粒。
吸取质量1mg的金磁微粒加入2mL离心管中，通过磁性分离架分去上清，后用0.5mL的磁珠清洗液(100mM MES，0.05％Tween20，pH6.0)进行磁性分离洗涤3次，去除上清液；
同时另取一2mL离心管吸取一定质量的GPC-3抗体溶液，加入1mM的2-Mercaptoethanol(β-ME)(2-巯基乙醇)，混匀室温反应30min，以打开抗体重链之间的二硫键，用脱盐柱除去多余的还原剂，测蛋白浓度定容，加入1×偶联缓冲液使总体积为200μL，混匀。
GPC-3抗体的包被：
将上述活化的抗体溶液200μL，全部加入清洗后去掉上清的金磁微粒管中，混匀后放入常温180rpm结合孵育30min，反应结束后用500μL的1×PBST洗涤缓冲液重复清洗3次，洗去与金磁粒微粒非牢固结合的抗体，磁分去上清。
封闭：
取1mL灭活的碱性磷酸酶作为封闭剂加入上述离心管中，混匀后放入恒温(37℃)培养箱中180rpm结合孵育1h，之后放置2-8℃静置10h，最后用500μL的1×PBST洗涤缓冲液重复清洗3次，洗去多余的封闭剂和与金磁微粒非牢固结合的物质，磁分去上清。
保存：
向封闭后的免疫磁珠加入1mL保存液，混匀后放置2-8℃保存备用。
(2)酶标抗体制备：
取0.5mg的抗体，加入0.2mL抗体活化剂溶液(100mM Tris，0.3％NaCl，5mM EDTA，10mg/mL2IT交联剂)，室温下活化30min，用分子筛层析方式纯化，得到活化后的抗体；
取0.4mg的碱性磷酸酶，加入0.2mL酶活化剂(100mM Tris，0.3％NaCl，5mM EDTA，5mg/mLSMCC交联剂、DMF)，室温下反应30min，用分子筛层析方式纯化，得到活化后的碱性磷酸酶；
将活化后的抗体与活化后的碱性磷酸酶按质量比1∶1混合，加入0.01mL的1MMgCl2，在2-8℃条件下反应14h，反应结束后用分子筛纯化，得到酶标二抗体复合物；
按照1∶1的体积加入甘油保存，得到酶标记后的抗体R，保存在-20℃条件下。
(3)磁珠稀释液试剂和酶标二抗稀释液试剂制备：
磁珠稀释液试剂：将磁珠包被后的抗体用M稀释液(100mM PB，0.1％Tween20，0.5％BSA，0.1％PC-300，pH为8)按照1：30的比例进行稀释，得到磁珠稀释液试剂。
酶标二抗稀释液试剂：将酶标记后的抗体用R稀释液(100mM的Tris，0.9％NaGl，4mM MgCl2，0.4mM ZnCl2，0.1％PC-300，1％BSA，5％胎牛血清，pH为7)按照1∶600的比例进行稀释，得到酶标二抗稀释液试剂。
(4)校准品制备：
将GPC-3抗原用校准品稀释液(50mM Tris，0.9％NaGl，0.2％Tween20，0.2％酪蛋白，1％BSA，0.1％PC-300，pH为7.5)配制成Ong/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL的浓度。
试验例1、
灵敏度检测：
将上述实施例1-3的配制成磁珠稀释液试剂和酶标二抗稀释液试剂混合，通入化学发光底物AMPPD，用GPC-3校准品进行定标；测试GPC-3的零值校准品及低值样本(0.05ng/mL；0.5ng/mL；)梯度稀释样本；每个实施例样品测试重复3次取平均值；计算灵敏度系数；
对比例1、
采用与试验例1相同的操作，使用市场现有的GPC-3测试试剂盒，测试GPC-3的零值校准品及低值样本梯度稀释样本；测试重复3次取平均值；计算灵敏度系数；
灵敏度系数的计算方法为：
信噪比＝S2/S0、S3/S0，信噪比越大灵敏度越高。
将上述实施例1和对比例1的检测结果对比，如下表1所示：
表1
从表1数据可知，采用本申请技术方案进行的试验例1的灵敏度优于对比例1的灵敏度；
试验例2、
线性范围检测：
将上述实施例1的配制成磁珠稀释液试剂和酶标二抗稀释液试剂混合，通入化学发光底物AMPPD，用GPC-3校准品进行定标；测试GPC-3的高值样本梯度稀释的样本，稀释倍数分别为1/64、1/32、1/16、1/8、1/4、1/2；计算线性相关系数；
对比例2、
采用与试验例2相同的操作，使用市场现有的GPC-3测试试剂盒，高值样本梯度稀释的样本，计算线性相关系数；
线性相关系数的计算方法为：用接近线性区间下限的低浓度样本稀释接近线性区间上限的高浓度样本，混合成至少6个稀释浓度(xi)。用试剂盒分别测定以上样本，每个稀释浓度测定3次，分别求出每个稀释浓度检测结果的均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以检测结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。计算线性回归的相关系数(r)，按公式(1)计算，其结果应符合2.1.8的要求。
将上述试验例2和对比例2的检测结果对比，如下表2及附图2所示：
表2
从表2数据及附图2图形可知，试验例2的相关系数R2为0.9964，大于对比例2的相关系数0.974；说明，采用本发明方法实施例1进行的试验例2的检测GPC-3的线性范围更宽。
试验例3、
最低检测浓度的灵敏度检测：
将上述实施例1的配制成磁珠稀释液试剂和酶标二抗稀释液试剂混合，通入化学发光底物AMPPD，用GPC-3校准品进行定标；测试GPC-3的低值样本梯度稀释样本；记录检测到的GPC-3样本的最低浓度数值；实验检测记录数值如衰3所示：
表3
从表3数据可知，使用本发明实施1的一种GPC-3化学发光试剂盒进行的试验例3对GPC-3进行检测，可检测到的GPC-3最低浓度为0.02ng/mL，检测灵敏度高。
测定结果的平均值(M)和标准差(SD)，按公式(2)和公式(3)计算变异系数(CV)。
式中：
Xi——系列测定值；
M——测定均值；
n——测定次数；
SD——标准差；
CV--变异系数。
试验例4、
样本相关性检测：
将上述实施例1的配制成磁珠稀释液试剂和酶标二抗稀释液试剂混合，通入化学发光底物AMPPD，用GPC-3校准品进行定标；测试GPC-3的不同浓度且覆盖线性范围的样本，测试结果与R&D的ELISA酶免试剂盒进行比较；结果如附图3所示，
从附图3数据可知，采用本发明实施例1的一种GPC-3化学发光试剂盒进行的试验例4对GPC-3进行检测，与R&D的ELISA酶免试剂盒进行比较，其相关性R2为0.9894，表明样本相关性好。
综上所述，从试验例1-4及其对应对比例数据可知，采用本发明一种GPC-3化学发光试剂盒对GPC-3进行检测，可检测的GPC-3最低浓度可达0.02ng/mL，灵敏度高、线性范围更宽，与R&D的ELISA酶免试剂盒进行比较，样本相关性好。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种GPC-3化学发光试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：磁珠稀释液试剂，
所述磁珠稀释液试剂的组分包括：包被GPC-3捕获抗体的金磁微粒和第一稀释液；所述包被GPC-3捕获抗体的金磁微粒中的金磁微粒的制备方法包括：
获取氯金酸水溶液；
将裸磁微球溶液进行稀释，稀释后依次滴加入所述氯金酸水溶液和还原剂，获得第一反应溶液；
在搅拌条件下，加热所述第一反应溶液至沸腾，并保持一定时间的沸腾状态，后冷却至室温，获得表面修饰胶体金层的金磁微粒。
2.根据权利要求1所述的一种GPC-3化学发光试剂盒，其特征在于，将裸磁微球溶液进行稀释，稀释后依次滴加入所述氯金酸水溶液和还原剂，获得第一反应溶液，包括：
将裸磁微球溶液与稀释剂按体积比1∶10进行稀释，稀释后依次滴加入所述氯金酸水溶液和还原剂，获得第一反应溶液；
所述裸磁微球溶液、所述氯金酸水溶液和所述还原剂的体积比为10∶2∶1，所述第一反应溶液中的氯金酸浓度是所述氯金酸水溶液浓度的0.02倍。
3.根据权利要求2所述的一种GPC-3化学发光试剂盒，其特征在于，所述氯金酸水溶液和所述还原剂的滴加时间总和不大于45min。
4.根据权利要求1所述的一种GPC-3化学发光试剂盒，其特征在于，所述包被GPC-3捕获抗体的金磁微粒的制备方法包括：
将第一GPC-3抗体溶液和硫醇类还原剂混合，并在室温下反应25-35min，以打开所述GPC-3抗体重链之间的二硫键，除杂后加入偶联缓冲液，获得第一活化GPC-3抗体溶液；
将所述第一活化GPC-3抗体溶液与所述金磁微粒混合，后置于温度为35℃～39℃且恒温条件下进行反应，反应结束后洗除与金磁微粒非牢固结合的抗体，获得包被GPC-3捕获抗体的金磁微粒。
5.根据权利要求1所述的一种GPC-3化学发光试剂盒，其特征在于，所述包被GPC-3捕获抗体的金磁微粒和所述第一稀释液的体积比为1∶18～22。
6.根据权利要求1或5所述的一种GPC-3化学发光试剂盒，其特征在于，所述第一稀释液组分包括：100mM PB，0.1％(重量)Tween20，0.5％(重量)BSA，0.1％(重量)PC-300，所述第一稀释液的pH值为7.2-7.8。
7.根据权利要求1所述的一种GPC-3化学发光试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：酶标二抗稀释液试剂，
所述酶标二抗稀释液试剂的组分包括：酶标二抗和第二稀释剂；所述酶标抗体复合物的制备方法包括：
将第二GPC-3抗体和抗体活化剂混合并进行活化反应，室温条件下活化至少20min，反应结束后纯化去杂，获得第二活化GPC-3抗体；
将免疫酶和酶活化剂混合并进行活化反应，室温条件下活化至少15min，反应结束后纯化去杂，获得活化免疫酶；
将所述第二活化GPC-3抗体与所述活化免疫酶混合并加入MgCl2溶液，在2-8℃温度下反应至少12h，反应结束后纯化去杂，获得酶标抗体复合物。
8.根据权利要求7所述的一种GPC-3化学发光试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗包含酶标抗体复合物和甘油，所述酶标二抗包含酶标抗体复合物和所述甘油的体积比为1∶0.8～1.2，所述免疫酶为碱性磷酸酶。
9.根据权利要求7所述的一种GPC-3化学发光试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗和所述第二稀释剂的体积比为1∶480～520。
10.根据权利要求7或9所述的一种GPC-3化学发光试剂盒，其特征在于，所述第二稀释剂的组分包括：100mM的Tris，0.9％(重量)NaCl，4mM MgCl2，0.4mM ZnCl2，0.1％(重量)PC-300，1％(重量)BSA，5％(重量)胎牛血清，所述第二稀释剂的PH值为6.2-6.8。
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| CN202110186406.3A CN112986555B (zh) | 2021-02-07 | 2021-02-07 | 一种gpc-3化学发光试剂盒 |
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