CN102539738B - 一种适配体修饰的纳米银及其试剂盒与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适配体修饰的纳米银，它以直径为10～30nm的纳米银球为内核，银球外表面键合有适配体链和寡核苷酸链。本发明还公开了上述适配体修饰的纳米银的制备方法、包含该适配体修饰的纳米银的试剂盒、及该适配体修饰的纳米银在制备检测IgE的试剂中的应用。利用本发明的纳米银材料进行IgE的检测，灵敏度高，检测时间短(大约2-3h)，操作简单易行，检测结果可视化，无需特殊昂贵的检测仪器，目视即可达到孔内半定量检测。成本低廉，可实现大批量检测，适于推广使用。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测IgE的适配体修饰的纳米银及其试剂盒与应用。
背景技术
过敏反应是现代社会中常见的一大类疾病，其发生的原因是进食或接触各种环境中的变应原引起的，这些反应中大都是由IgE免疫球蛋白E引起的I型超敏反应。对血清样本中IgE的检测，可以帮助进行医疗诊断。
正常人血清中IgE含量极低，约为50ng/mL，常用的检测IgE的方法有放射免疫吸附法和酶联免疫吸附法。
放射免疫吸附试验(RAST)是将抗IgE抗体吸附到固相载体上用以检测血清IgE的方法，临床常用双抗体夹心法，多以滤纸为载体。将抗IgE抗体偶联到经溴化氟活化的滤纸上，使其与待检血清及IgE参考标准进行反应；洗涤后加入125I标记的抗人IgE抗体，再经洗涤后测定滤纸片的放射活性，其测定值与标本中的IgE含量呈正相关。RAST是目前公认的检测型变态反应的有效方法之一，具有特异性强、敏感性高、影响因素少、对患者安全等优点；不但有助于过敏性哮喘的诊断，对寻找变应原也有重要价值。但是RAST也有许多缺点：费用昂贵、花费时间长、放射性同位素易过期而且污染环境、不同来源试剂盒的参比血清不同而不易相互比较、待检血清含有相同特异性IgG时可干扰正常结果。
酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清IgE时也常用双抗体夹心法，ELISA法与RAST有相似的优点，而且还有独特的长处，如没有同位素污染，酶标抗体可长期保存，操作方便，敏感性也很高，在临床上应用较多。但每个孔的反应时间对结果的重复性很重要，如果使用超过一块微孔板时要求分别重复测量标准曲线，这无疑增加了操作者的工作量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题，是提供一种适用于IgE检测的适配体修饰的纳米银材料。
本发明还要解决的技术问题，是提供包含上述纳米银材料的试剂盒，用于IgE的检测。
本发明最后要解决的技术问题，是提供上述试剂盒在检测IgE中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种适配体修饰的纳米银，它以直径为10～30nm的纳米银球为内核，银球外表面键合有适配体链和寡核苷酸链；
其中，所述的适配体链为：5’-SH-AAAAAAAAAAAAAAA GGGGC ACGTT TATCCGTCCC TCCTA GTGGC GTGCC CC；
其中，所述的寡核苷酸链为：5’-SH-AAAAAAAAAAAAAAA-生物素。
上述适配体修饰的纳米银的制备方法，它包括如下步骤：
(1)在冰浴条件下，将2-20mmol/L硝酸银溶液逐滴加入至1-10倍体积量的3-30mmol/L硼氢化钠溶液中，不断搅拌至反应完全，继续搅拌至室温，得到纳米银溶液，常温保存；
(2)将适配体和寡核苷酸按摩尔比(1～99)∶(1～9)加入步骤(1)得到的纳米银溶液中，静置4～48小时，适配体和寡核苷酸的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为(1-1000)∶1；
所述的适配体，其核苷酸序列(如SEQ ID No：1所示)为：
5’AAAAA AAAAA AAAAA GGGGC ACGTT TATCC GTCCC TCCTA GTGGCGTGCC CC 3’，其5’端由巯基(SH-)修饰；
所述的寡核苷酸，其核苷酸序列(如SEQ ID No：2所示)为：
5’AAAAAAAAAAAAAAA 3’，其5’端由巯基(SH-)修饰，3’端由生物素(biotin)标记；
(3)向步骤(2)得到的混合体系中加入PBS缓冲溶液，静置2～20小时，PBS溶液的加入体积为步骤(2)得到的混合体系体积的5～20％；
(4)向步骤(3)得到的混合体系中加入氯化钠溶液，静置1～10小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤1～4次，氯化钠溶液每次加入体积为待加入的混合体系体积的1～10％；
(5)将步骤(4)得到的混合体系静置12～48小时，取上清液；
(6)将步骤(5)得到的上清液经离心去除上清，取沉淀加入PBS缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤2～4次，PBS溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.1～5倍；最后离心得到的沉淀用PBSM溶液重悬即得备用探针。
步骤(2)中，适配体和寡核苷酸按摩尔比优选为99∶1或9∶1或1∶1或1∶9或1∶99；最优选为1∶99；静置时间优选为12-36h，最优选为18h；适配体和寡核苷酸的总摩尔量与纳米银摩尔量之比优选为(10-100)∶1，最优选为100∶1。
步骤(3)中，PBS缓冲溶液的浓度优选为0.01-0.1M，最优选为0.01M；PBS缓冲溶液的加入体积优选为步骤(2)得到的混合体系体积的5-10％，最优选为10％；静置时间优选为5-10h，最优选为6h。
步骤(4)中，氯化钠溶液的浓度优选为0.1-10mol/L，最优选为2mol/L；氯化钠溶液每次加入体积优选为待加入的混合体系体积的1-5％，最优选为2％；静置时间优选为2-4h，最优选为3h。
步骤(5)中，静置时间优选为24-36h，最优选为24h。
步骤(6)中，PBS缓冲溶液的浓度优选为0.01-0.1M，最优选为0.01M；PBS溶液每次的加入体积优选为待加入的沉淀体积的1-2倍，最优选为2倍；所述的离心条件为0-37℃、8000-20000rpm条件下离心10-30分钟，优选的离心条件为14℃、15000rpm条件下离心15分钟。PBSM溶液配方为0.1×PBS、0.1MNaCl和1mM MgCl2。
上述适配体修饰的纳米银在制备检测IgE的试剂中的应用。
一种用于检测IgE的试剂盒，包含如下试剂：
PBS及Tween-20(用于配制洗涤液)；
羊抗人IgE(底物)；
链霉亲和素(内标底物)；
适配体修饰的纳米银(探针)；
银增强试剂A和银增强试剂B(显色液)；银增强试剂A主要成分为硝酸银，银增强试剂B主要成分为氢醌(即对苯二酚)；银增强试剂A和银增强试剂B购自于Sigma-Aldrich公司。
牛血清白蛋白溶液(用于配制样品稀释液、阴性对照物及封闭液)；
上述用于检测IgE的试剂盒在检测IgE中的应用。
利用上述检测IgE的试剂盒检测IgE含量的具体方法，依次顺序包括如下步骤：
(1)配制溶液：
洗涤液：将20×PBS用二次水稀释20倍至1×PBS，加入0.05％体积比的Tween-20即得PBST洗涤液；
探针稀释液PBSM：0.1×PBS+0.1M NaCl+1mM MgCl2；
样品稀释液：将0.1g牛血清白蛋白溶解于100mL 1×PBS溶液中即得1mg/ml BSA样品稀释液；
封闭液：将1g牛血清白蛋白溶解于100mL 1×PBS溶液中即得10mg/ml BSA封闭液；
底物：用1mg/ml BSA配制所需浓度的羊抗人IgE；
探针：用PBSM溶液配制所需浓度的探针；
显色液：将银增强试剂A和银增强试剂B按体积比1∶1的混合液；
(2)将底物和阴性对照物分别在多孔的酶标板上点样，40nL/点，4℃条件下固定过夜；
(3)每孔加入10～200μL封闭液，在20-37℃条件下封闭1～3小时，用洗涤液荡洗5～15min，洗涤3～4次，拍干；
(4)每孔加入10～200μL待测样品，在20-37℃条件下反应1～3小时，用洗涤液荡洗5～15min，洗涤3～4次，拍干；
(5)每孔加入浓度为0.1-1nM纳米银探针溶液，在37℃条件下反应1～3小时，用洗涤液荡洗5～15min，洗涤3～4次，并用去离子水冲洗3～4次，拍干；
(6)每孔加入10～200μL显色液，避光反应5～30min，去离子水冲洗3～4遍，拍干；
(7)用CCD生物芯片扫描仪扫描，根据得到的灰度值信号利用外标曲线法得出样品的浓度。
利用检测IgE的试剂盒检测IgE含量的另一具体方法，依次顺序包括如下步骤：
(1)配制溶液：
洗涤液：将20×PBS用二次水稀释20倍至1×PBS，加入0.05％体积比的Tween-20即得PBST洗涤液；
探针稀释液PBSM：0.1×PBS+0.1MNaCl+1mMMgCl2；
样品稀释液：将0.1g牛血清白蛋白溶解于100mL 1×PBS溶液中即得1mg/ml BSA样品稀释液；
封闭液：将1g牛血清白蛋白溶解于100mL 1×PBS溶液中即得10mg/ml BSA封闭液；
底物：用1mg/ml BSA配制所需浓度的羊抗人IgE；
内标底物：用1mg/ml BSA配制所需浓度的链霉亲和素；
探针：用PBSM溶液配制所需浓度的探针。
显色液：将银增强试剂A和银增强试剂B按体积比1∶1的混合液；
(2)将底物、内标底物和阴性对照物分别在多孔的酶标板上点样，40nL/点，4℃条件下固定过夜；
(3)每孔加入10～200μL封闭液，在20-37℃条件下封闭1～3小时，用洗涤液荡洗5～15min，洗涤3～4次，拍干；
(4)每孔加入10～200μL待测样品，在20-37℃条件下反应1～3小时，用洗涤液荡洗5～15min，洗涤3～4次，拍干；
(5)每孔加入浓度为0.1-1nM纳米银探针溶液，在20-37℃条件下反应1～3小时，用洗涤液荡洗5～15min，洗涤3～4次，并用去离子水冲洗3～4次，拍干；
(6)每孔加入10～200μL显色液，避光反应5～30min，去离子水冲洗3～4遍，拍干；
(7)用CCD生物芯片扫描仪扫描，根据得到的灰度值信号分别得出不同浓度的IgE样品和链霉亲和素信号值，做出内标曲线，用同样的方法测得样品的信号值，通过其在内标曲线上的位置得出样品中IgE浓度。
上述两种检测IgE的方法中，第一种方法，直接外标法定量，第二种方法可以同时外标法定量和内标法半定量检测，若只需内标法半定量时，可以减少操作，减低成本。
步骤(5)中，IgE及探针反应时间优化数据见图1。其中，a：IgE反应时间的优化，最优时间选择60min；b：探针反应时间的优化，最优时间选择为60min。
有益效果：利用本发明的纳米银材料进行IgE的检测，灵敏度高，检测时间短(大约2-3h)，操作简单易行，检测结果可视化，无需特殊昂贵的检测仪器，目视即可达到孔内半定量检测。成本低廉，可实现大批量检测，适于推广使用。
附图说明
图1为IgE及探针反应时间优化数据图。其中，a：IgE反应时间的优化，最优时间选择60min；b：探针反应时间的优化，最优时间选择为60min。
图2为探针表征图。其中，a：1)AgNPs的紫外图谱2)离心后的探针紫外图谱；b：探针显色前的扫描电镜图；c：探针显色后的扫描电镜图。
图3为修饰纳米银时，适配体和寡核苷酸比例优化。检测IgE的浓度为500ng/mL，100ng/mL，10ng/mL和空白对照。
图4为探针的特异性及稳定性考察数据图。其中，a：特异性考察实验数据；b：探针稳定性考察数据。
图5为20个实际血清样品用该法测得的数据与速率散射比浊法测得的数据进行对照。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：纳米银溶液的制备。
在冰浴条件下，将40mL 2mmol/L的硝酸银溶液逐滴加入至80mL 3mmol/L硼氢化钠溶液中，不断搅拌至反应完全，继续搅拌至室温，即可得到纳米银溶液。
实施例2：纳米银溶液的制备。
在冰浴条件下，将40mL 10mmol/L的硝酸银溶液逐滴加入至40mL 30mmol/L硼氢化钠溶液中，不断搅拌至反应完全，继续搅拌至室温，即可得到纳米银溶液。
实施例3：纳米银溶液的制备。
在冰浴条件下，将40mL 20mmol/L的硝酸银溶液逐滴加入至400mL 10mmol/L硼氢化钠溶液中，不断搅拌至反应完全，继续搅拌至室温，即可得到纳米银溶液。
实施例4：适配体修饰的纳米银的制备。
将实施例1制得的1mL(1nM)纳米银溶液、10μL(1μM)适配体和90μL(1μM)寡核苷酸混合放置18h。加入110μL 1×PBS。静置6h后，加入2mol/L氯化钠溶液22μL，然后静置3h，再加入2mol/L氯化钠溶液21μL。放置24h后，取上清液离心，14℃，15000r/min，15min，离心后去除上清，沉淀加入1×PBS缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤2次，每次15min，14℃，转速为15000r/min，最后离心得到的沉淀用3000μLPBSM溶液重悬，室温保存备用；PBSM溶液配方为0.1×PBS、0.1M NaCl和1mMMgCl2。
其中，所述的适配体，其核苷酸序列(如SEQ ID No：1所示)为：
5’AAAAA AAAAA AAAAA GGGGC ACGTT TATCC GTCCC TCCTA GTGGCGTGCC CC 3’，其5’端由巯基(SH-)修饰；
所述的寡核苷酸，其核苷酸序列(如SEQ ID No：2所示)为：
5’AAAAAAAAAAAAAAA 3’，其5’端由巯基(SH-)修饰，3’端由生物素(biotin)标记；
适配体及寡核苷酸均由上海生工生物工程有限公司合成。
通过本实施例制备得到的探针表征图见图2。
制备纳米生物探针时，需控制适配体寡核苷酸的配比，实验筛选了五个配比，分别为99∶1，9∶1，1∶1，1∶9，1∶99，最优配比为1∶9.具体数据见图3。
实施例5：适配体修饰的纳米银的制备。
同实施例4的制备方法，所不同的是，1mL(10nM)纳米银溶液、10μL(1μM)适配体和90μL(1μM)寡核苷酸混合放置18h。加入55μL 1×PBS。静置20h后，加入2mol/L氯化钠溶液22μL，静置2h，再加入2mol/L氯化钠溶液21μL，静置2h，再加入2mol/L氯化钠溶液22μL，放置36h后，取上清液离心，14℃，15000r/min，15min，离心后去除上清，沉淀加入1×PBS缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤3次，每次15min，14℃，转速为15000r/min，最后离心得到的沉淀用3000μL PBSM溶液重悬。
实施例6：用于检测IgE的试剂盒。
一种用于检测IgE的试剂盒，该试剂盒包含如下试剂：
PBS(购自上海生工生物工程有限公司)及Tween-20(购自天津科美有限公司)用于配制洗涤液；
羊抗人IgE(底物)购自美国Biological；
牛血清白蛋白、链霉亲和素(内标底物)购自北京博奥森生物技术有限公司；
适配体修饰的纳米银(探针)实施例4或5的方法合成；
银增强试剂A、B(显色液)购自Sigma-Aldrich；
所有溶液均用高纯水配制。
实施例7：检测IgE的方法I。
利用实施例6的试剂盒检测标准样本中的IgE含量的方法：
(1)配制溶液：
洗涤液：将20×PBS用二次水稀释20倍至1×PBS，加入0.05％体积比的Tween-20即得PBST洗涤液；
探针稀释液PBSM：0.1×PBS+0.1M NaCl+1mM MgCl2；
样品稀释液：将0.1g牛血清白蛋白溶解于100mL 1×PBS溶液中即得1mg/ml BSA样品稀释液；
封闭液：将1g牛血清白蛋白溶解于100mL 1×PBS溶液中即得10mg/ml BSA封闭液；
底物：用1mg/ml BSA配制所需浓度的羊抗人IgE；
探针：用PBSM溶液配制所需浓度的探针；
显色液：将银增强试剂A和银增强试剂B按体积比1∶1的混合液；
(2)将底物和阴性对照物在多孔的酶标板上点样，40nL/点，底物，阴性对照物分开点样，制备成一定矩阵，4℃条件下固定过夜；
(3)每孔加入40μL封闭液，在37℃条件下封闭1小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3次，拍干；
(4)每孔加入40μL待测样品，在37℃条件下反应1小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3次，拍干；
(5)每孔加入浓度为0.3nM纳米银探针溶液，在37℃条件下反应2小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3次，并用去离子水冲洗3次，拍干；
(6)每孔加入40μL显色液，避光反应10min，去离子水冲洗三遍，拍干；
(7)用CCD生物芯片扫描仪扫描，根据得到的灰度值信号分别得出不同浓度的IgE样品和链霉亲和素信号值，做出内标曲线。
本实施例方法中，对探针的特异性及稳定性进行了考察。数据见图4。其中，a：特异性考察实验数据；b：探针稳定性考察数据。从图中可看出探针在此方法中具有良好的特异性，其他蛋白不会干扰。另外，同一批探针在30天内用该方法测定标准样品的结果非常稳定。由此可说明此方法的可靠性。
实施例8：检测IgE的方法II。
利用实施例6的试剂盒检测血清样品中的IgE含量的另一种方法：
(1)配制溶液：
洗涤液：将20×PBS用二次水稀释20倍至1×PBS，加入0.05％体积比的Tween-20即得PBST洗涤液；
探针稀释液PBSM：0.1×PBS+0.1MNaCl+1mM MgCl2；
样品稀释液：将0.1g牛血清白蛋白溶解于100mL 1×PBS溶液中即得1mg/ml BSA样品稀释液；
封闭液：将1g牛血清白蛋白溶解于100mL 1×PBS溶液中即得10mg/ml BSA封闭液；
底物：用1mg/ml BSA配制所需浓度的羊抗人IgE；
内标底物：用1mg/ml BSA配制所需浓度的链霉亲和素；
探针：用PBSM溶液配制所需浓度的探针。
显色液：将银增强试剂A和银增强试剂B按体积比1∶1的混合液；
(2)将底物、内标底物和阴性对照物在多孔的酶标板上点样，40nL/点，底物与内标底物，阴性对照物分开点样，制备成一定矩阵，4℃条件下固定过夜；
(3)每孔加入40μL封闭液，在37℃条件下封闭1小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3次，拍干；
(4)每孔加入40μL待测血清样品，在37℃条件下反应1小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3次，拍干；
(5)每孔加入浓度为0.3nM纳米银探针溶液，在37℃条件下反应2小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3次，并用去离子水冲洗3次，拍干；
(6)每孔加入40μL显色液，避光反应10min，去离子水冲洗三遍，拍干；
(7)用CCD生物芯片扫描仪扫描，根据得到的灰度值及建立好的内标曲线，计算出待测样品中IgE的浓度。
用本实施例方法对20个血清样品进行测定，得到的数据与南京军区总医院用速率散射比浊法测定的数据进行比较，结果吻合，r＝0.97。详细数据可见图5。
Claims (5)
1.一种适配体修饰的纳米银，其特征在于，它以直径为10～30nm的纳米银球为内核，银球外表面键合有适配体链和寡核苷酸链；
其中，所述的适配体链为：5’-SH-AAAAA AAAAA AAAAA GGGGC ACGTT TATCCGTCCC TCCTA GTGGC GTGCC CC；
其中，所述的寡核苷酸链为：5’-SH-AAAAA AAAAA AAAAA-生物素。
2.权利要求1所述的适配体修饰的纳米银的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(1)在冰浴条件下，将2-20mmol/L硝酸银溶液逐滴加入至1-10倍体积量的3-30mmol/L硼氢化钠溶液中，不断搅拌至反应完全，继续搅拌至室温，得到纳米银溶液；
(2)将适配体和寡核苷酸按摩尔比(1～99):(1～9)加入步骤(1)得到的纳米银溶液中，静置4～48小时，适配体和寡核苷酸的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为(1-1000):1；
所述的适配体，其核苷酸序列为：5’AAAAA AAAAA AAAAA GGGGC ACGTTTATCC GTCCC TCCTA GTGGC GTGCC CC3’，其5’端由巯基修饰；
所述的寡核苷酸，其核苷酸序列为：5’AAAAA AAAAA AAAAA3’，其5’端由巯基修饰，3’端由生物素标记；
(3)向步骤(2)得到的混合体系中加入PBS缓冲溶液，静置2～20小时，PBS缓冲溶液的加入体积为步骤(2)得到的混合体系体积的5～20%；
(4)向步骤(3)得到的混合体系中加入氯化钠溶液，静置1～10小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤1～4次，氯化钠溶液每次加入体积为待加入的混合体系体积的1～10%；
(5)将步骤(4)得到的混合体系静置12～48小时，取上清液；
(6)将步骤(5)得到的上清液经离心去除上清，取沉淀加入PBS缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤2～4次，PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.1～5倍；最后离心得到的沉淀用PBSM溶液重悬即得备用探针。
3.根据权利要求2所述的适配体修饰的纳米银的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述的离心条件为8000～20000rpm条件下离心10～30分钟。
4.权利要求1所述的适配体修饰的纳米银在制备检测IgE的试剂中的应用。
5.一种用于检测IgE的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含如下试剂：
磷酸盐缓冲液、Tween-20、羊抗人IgE、链霉亲和素、银增强试剂A和银增强试剂B、牛血清白蛋白溶液、如权利要求1所述的适配体修饰的纳米银探针。
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