JP2005508495A - 分子の迅速かつ高感度の検出法 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
発明の背景
本発明は、医学的試料、産業的試料、または環境的試料に含まれる顕微鏡的および超顕微鏡的標的の同定に関する。
【0002】
概説
低濃度の分子標的を検出し、列挙し、および同定することは、常用の医学分野、産業分野、および環境分野における診断の基礎である。例えば試料は、感染因子、癌細胞、ホルモン、製造段階の混入物、および汚染物質に由来する分子を検出する目的で解析される。
【0003】
低濃度の分子を検出する、数多くの多様で強力な常用の検出法が市販されているが、試験のレパートリーにはギャップが未だ存在する。このようなギャップの一部は2001年に発生したバイオテロ攻撃後に明らかとなったものである。例えば、数種類の薬剤を曝露時点において同時にスクリーニングするための迅速で超高感度で費用効果が高く、またユーザーフレンドリーな試験について、未対処の要求が存在する。医療および産業のいずれにおいても、非医療従事者によって現場で実施可能な、迅速で高感度で、また使いやすい診断試験が存在しないことで進展が阻まれている。
【0004】
以下の説明では、常用の医学的診断を中心に述べる。類似の方法は、産業分野および環境分野における応用で用いられる。
【0005】
免疫学的方法
免疫学的試験、すなわち免疫アッセイ法は医学的診断で広く用いられている。抗体と、抗体に対応する標的(抗原と呼ばれる)との相互作用に基づく免疫アッセイ法では、大きさが小さいもの(例えば乱用薬物)から大きいもの(例えばHIVタンパク質)に至る広範囲の分子が検出される。血清検査は、免疫学的アッセイ法であり、抗原を直接調べるのではなく、過去の抗原曝露に対する宿主の免疫応答を対象とする。すなわち血清検査では、抗原に対する宿主抗体の存在が調べられる。大規模な自動化された中央研究所システムから、店頭で購入可能な妊娠テストに至る、数多くの免疫アッセイ法の系が利用されている。このような試験には、凝集アッセイ法、沈降アッセイ法、酵素結合免疫アッセイ法、直接蛍光アッセイ法、免疫組織学的試験、補体結合アッセイ法、血清検査、免疫電気泳動アッセイ法、および迅速な「ストリップ」試験(例えばラテラルフロー試験やフロースルー試験)を含む広範囲の形態が含まれる。免疫学的試験は極めて単純で迅速の場合がある。したがって、理想的な試験のいくつか(診療所や、患者自身によって家庭で実施可能な試験)は免疫学的試験である。市販されている迅速な免疫学的試験の欠点の一つは、感度の低さ(insensitive)である。
【0006】
市販の高感度の免疫アッセイ法の要求は数年以内に増すと考えられる。ヒトゲノムプロジェクトおよびプロテオームプロジェクトの最初の大きな見返りの一つは、癌、心血管系疾患、および神経疾患などの疾患状態の診断に用いられる数多くの新しいマーカーの存在であろう。このようなマーカーは、血液、尿、および固形組織などの臨床試料中に微量で存在する可能性がある。多く含まれるタンパク質マーカー(例えばPSA、ミオグロビン、および抗体など)に適した市販の迅速な免疫アッセイ法試験は、低濃度で存在するタンパク質の実質的な部分の検出には不適当な場合がある。
【0007】
遺伝学的方法
遺伝学的方法は、生物体およびウイルスから核酸分子を検出および同定するための一般的で強力なツールである。核酸の増幅に基づく、細胞およびウイルスの核酸量を超高感度で検出および識別する革命的に新しい方法が最近開発されている。例えば市販の試験法では、少数の超顕微鏡的なHIVウイルス粒子(例えば50粒子/ml)から核酸を検出可能である。増幅法には、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、核酸配列ベース増幅(NASBA)、転写介在型増幅法(Transcription Mediated Amplification;TMA)、およびローリングサークル増幅(RCA)などが含まれる。
【0008】
核酸の増幅に基づく試験には、常用の臨床および市販の診断法の開発を妨げるいくつかの欠点がある。このような試験は一般に、微生物培養試験と比べてかなり高額の費用がかかり、使用者の熟練が要求され、厳密な試料調製プロトコルで行われ、時間のかかる増幅段階が通常必要とされ、汚染および偽陽性に対して脆弱であり、多くの臨床試料中に存在して偽陰性結果の元となる阻害物質に対する感度が高い酵素学的段階が存在し、また多重化応用における再現性の問題に遭遇することがある。また、微生物培養法のように、これらの方法は、重要なクラスの非核酸標的(例えば毒素、ホルモン、乱用薬物、およびタンパク質)の検出には適していない。
【0009】
生化学的方法、化学的方法、および物理的方法
顕微鏡的標的および超顕微鏡的標的の高感度検出のための他の手法には、フローサイトメトリー、質量分析、バイオセンサー、吸光分光法(absorbance spectroscopy)、蛍光偏光法、蛍光変動分光法(fluorescence fluctuation spectroscopy)、電気泳動、およびクロマトグラフィーなどがある。これらの方法の大部分は、典型的には高い費用と熟練を要することから、基礎研究領域における使用にとどまっている。
【0010】
臨床診断検査室で有用であることが証明されている方法の一つがフローサイトメトリーである。フローサイトメトリー法は、標識プローブ(例えば着色剤、抗体、または核酸)との結合能力に基づいて、特定の細胞の種類を定量的に検出するために用いられている。個々の細胞または粒子を、狭いチャンネルにそれぞれ強制的に流し、レーザー光を照射する。蛍光の発光、および大きさ/形状に関する情報を、生物体/粒子によって生じたスペクトルおよび光散乱を解析することで集める。この方法で、1分間に数千個の細胞または粒子を解析することができる。例えば、フローサイトメトリーによって、エイズ患者のリンパ球の複数のクラスの集団の大きさを定量することができる。タンパク質や核酸などの非細胞性分子を検出および同定可能な高度に多重化されたフローサイトメトリー法がLuminex社から市販されている(米国特許第5,981,180号)。フローサイトメトリー法の欠点には、高額の費用がかかること、作業者の高い能力が求められること、大量の試料を解析できないこと(感度の制限)などがある。
【0011】
バイオセンサー法も、高感度の分子検出法として有望である。バイオセンサーでは、生物学的反応(例えば抗体と抗原の結合)を検出可能なシグナルに変換する物理的方法が利用される。分子検出で広く用いられているバイオセンサーでは、表面プラズモン共鳴が利用されている(Mullett, W.M.ら(2000)、Methods 22:77-91)。Thermo BioStar社による光学的免疫アッセイ法(Schultze, D.ら(2001)、Eur J Clin Microbiol Infect Dis 20:280-3)では、光学的干渉の原理を元に、抗原抗体結合が検出される。BARC社のバイオセンサー法では、1種類の磁性微粒子のタグの付けられた解析物の磁気抵抗検出(ハードディスク記憶装置に使用されている技術と同等)が利用されている(Edelstein, R.L.ら、Biosens Bioelectron 14:805-13、2000)。
【0012】
ポイントオブケア(point-of-care)およびオンサイト法
ポイントオブケア試験によって、専門家および消費者は、専用の中央検査室外で診断試験を行うことができる。ポイントオブケア診断は、インビトロ診断において極めて速く成長しつつある領域の一つである。典型的なポイントオブケア試験の実施場所には、病院内における患者のベッドサイド、臨床検査室、ナーシングホーム、公立および私立の診療所、大学の医療センター、矯正施設、救急車両、職場や家庭などが含まれる。数多くのポイントオブケア試験が近年導入されており、その一部は極めて成功している。市販のポイントオブケア試験は、以下の対象を調べる複数のカテゴリーに分類されている:(1)代謝物(例えばグルコースおよび尿素)、無機分子、薬剤、および血液ガス;(2)巨大分子およびホルモン;ならびに(3)疾患作用因子(例えば細菌、ウイルス、寄生生物)。
【0013】
比較的高い濃度(例えば血液中グルコース濃度)で存在する解析物に関しては極めて良好な結果が得られているが、少量の標的分子を対象とした開発途上のポイントオブケア試験には問題がある。このような問題は、以下の2つの相互に拮抗する産物要求性が組み合わされることに起因するところが大きい:(1)超高感度であることを含む、試験の過酷な仕様に適合する優れた技術の必要性、ならびに(2)非熟練者によって遂行可能な低コストで、ユーザーフレンドリーで、また携帯可能な試験であることの必要性。
【0014】
いくつかの市販の、または新しい超高感度のポイントオブケア試験は、それほど感度が高くない市販の試験に用いられている形態の応用である。例えばResponse Biomedical社は、蛍光着色マイクロビーズ標識を利用した、同社のRAMPプラットフォームを元にした10分間のストリップ試験(またはラテラルフロー試験)を販売している(Brooks, D.E.ら(1999)、Clin Chem 45:1676-1678)。同様に、Biosite社による迅速なストリップ試験では、乱用薬物、心臓マーカー、および感染因子を検出対象とする(Landry, M.L.ら(2001)、J Clin Microbiol 39:1855-8)。
【0015】
核酸増幅に基づくポイントオブケア試験は、その複雑性と高額の費用がかかることから開発が困難であった。一つのシステムにCepheid社によるSmart Cyclerシステムがある。炭疽菌(B. anthracis)を対象とした別の核酸増幅試験が、Mayo ClinicとRoche社によって共同開発されている(Light Cycler;Makino, S.I.ら(2001)、Lett Appl Microbiol 33:237-40)。これらのシステムには、PCR法に固有の長所と短所がある。増幅法は、解析感度がかなり高く、また適度に迅速に実施できる。例えばSmart Cyclerシステムでは1時間以内に結果が得られる(Belanger, S.D.ら(2002)、Journal of Clinical Microbiology 40:1436-40)。解析対象物は、核酸を含むものに制限され(例えば、タンパク質毒素および低分子量分子の試験は除く)、試料の阻害によって偽陰性の結果が生じる恐れがあり、高度に多重化された試験は問題が多く、試験の実施には熟練者が必要とされ、また試験の実施には高額の費用がかかる。
【0016】
バイオセンサーを元にしたポイントオブケアの手法も、かなりの技術的仕様を低コストおよびユーザーフレンドリーであることと組み合わせうることから有望視されている。例えば、インフルエンザウイルスなどの病原体を調べることが可能なThermo Biostar社のOIA技術は、ウイルス抗原との結合に応じて光学的干渉が変化するために色が変化する、光学的に活性な表面をもつバイオセンサーが中心的な役割を果たしている(Rodriguez, W.J.ら(2002)、Pediatr Infect Dis J 21:193-6)。
【0017】
新たな手法の一部は、多重化の向上を中心に据えている。例えばBiosite社は、並列性の高い(highly parallel)キャピラリマイクロ流体免疫アッセイ法システムを開発中である。Somalogic社による手法では、アプタマーアレイを用いて、数千または数万種の解析対象物を対象に試料が解析される(Brody, E.N.ら(1999)、Mol Diagn 4:381-8)。Nanogen社によるNanoChip(Ewalt, K.L.ら(2001)、Anal Biochem 289:162-72)電子アレイも、生物テロの作用因子の検出に応用されている。数百種の解析対象物をスクリーニングする試験は薬剤開発に明らかに有用であるが、このレベルの多重化がポイントオブケア試験に重要な役割を果たすか否かということは、それほど明らかではない。
【0018】
ポイントオブケア試験の感度を改善するための新しいさまざまな標識/検出戦略は、細菌戦作用因子の試験をも対象としている。Orasure社の新しい定量的な乱用薬物試験では、UPT(上方変換リン光体法;up-converting phosphor technology)粒子が用いられている(Niedbala, R.S.ら(2001)、Anal Biochem 293:22-30)。Navy社のBARC法では、特殊な解析物を対象とした試料の高感度解析のために磁性粒子および検出器が用いられている(Edelstein, R.L.ら(2000)、Biosens Bioelectron 14:805-13)。量子ドットナノ結晶(Quantum Dot;Wang, C.ら(2001)、Science 291:2390-2)、および共鳴光散乱粒子(Genicon;Yguerabide, J.ら(2001)、J Cell Biochem Suppl:71-81)を含む他の新しい標識法も、ポイントオブケア試験の感度を高める可能性がある。
【0019】
分子診断の未知の要求
曝露時点において第一対応者による、また建物の空気および水の供給の常用の自動スキャニングによる、効率のよい細菌戦作用因子の検出には極めて重要で未だ対処されていない要求がある。同様に、高感度のオンサイト試験が存在しないことから、臨床患者は、性感染症病原体に関する高感度試験をオンサイトで受けられないでおり、また術後患者は、血液感染に対する迅速で高感度のスクリーニングを受けられないでいる。このようなギャップを埋めるための新しい技術の要求は、疾患(癌、感染症、および心血管系疾患など)の新しい診断マーカーがゲノムおよびプロテオームプロジェクトから必然的に得られることから、これまでになく高まる可能性がある。
【発明の開示】
【0020】
発明の概要
本発明は、医学的試料、産業的試料、および環境的試料に含まれる分子標的を迅速かつ高感度に同定するための効率的な方法を提供する。本発明は、標的分子を標識し、次に大面積画像化で画像を得る。本発明に基づく診断試験は、迅速で、超高感度で、定量的で、多重化され、また自動化が可能である。この試験では、試料の調製が最小限に抑えられ、かつ核酸増幅または細胞培養が必要ない。さまざまな感染因子(例えば細菌、ウイルス、真菌、および寄生生物)、ならびに分子(例えばタンパク質、DNA、RNA、ホルモン、および薬剤)を本発明の試験で検出することができる。本発明に基づく試験では、高感度の核酸の増幅試験、ユーザーフレンドリー性、および免疫アッセイ法の速さ、ならびに微生物学的試験によって提供される費用効果および定量性がもたらされると考えられる。本発明は、迅速で超高感度で費用効果に優れ、また携帯式の試験を可能とすることによって、ポイントオブケアまたはオンサイトの診断における未知の重要な要求を解決する。したがって本発明は、診断レパートリーに存在するギャップを埋めながら、現在の診断技術における最良の点を具体化する。
【0021】
低濃度の標的分子を迅速かつ優れた費用効果で検出する本発明の能力は、強度の高い標識、迅速な反応動力学を促す形態、および在庫のある市販品の要素から作製される装置の使用、または装置を全く使用しないことのいずれかに基づく大面積画像化を組み合わせることで得られる利点に由来する。表1に本発明の利点の一部を示す。
【0022】
(表1)
【0023】
本発明は、低濃度の標的分子を、強度の高いシグナルを発生する標的特異的な粒子または複合体で標識することで検出する。このような複合体には、特定の標的に対する親和性とシグナル発生の2つの機能がある。これらの機能は、複合体上に存在する2つの部分である、標的分子と特異的に結合するカテゴリー結合分子と、および対象粒子の検出に使用されるシグナル発生部分の作用で達成される。特徴的サイン(signature)(例えば放出光の特定の波長)をもつ強度の高いシグナルを発生する標識によって、迅速で超高感度の検出が可能となり、また真陽性とアーティファクト(例えば蛍光塵粒子(fluorescent dust))の効率的な識別も可能となる。また蛍光着色粒子、光散乱粒子、量子ドット粒子、リン光体、および酵素コーティング粒子を含む、さまざまなシグナル発生複合体を使用することができる。これらの粒子は、次に蛍光、化学発光、および比色を含む、さまざまな種類のシグナルを発生する場合がある。同様に、抗体、核酸、リガンド、およびアプタマーを含む、さまざまなカテゴリー結合分子を使用することができる。
【0024】
本発明は分子を検出するので、可溶性分子、およびウイルス、細菌、または動物や植物の細胞などの大きな標的の一部である分子の両方を含む標的の範囲は広い。本発明で対処可能な診断上の問題の範囲は、抗体、核酸、アプタマー、およびリガンドを含む、さまざまな種類の標的特異的分子を使用できることによっても拡げられる。
【0025】
大容量中に存在する少数の標的分子を検出することは、臨床試料、環境的試料、および製造段階で発生する試料を調べる場合に必要条件となる。本発明による、低濃度の標的分子を求めて多量の試料を調べる能力は、部分的には、「個々の顕微鏡的なシグナル発生粒子を拡大することなく」検出する能力に拠っている。非拡大検出によって、少数の粒子を求めて大面積を1枚の画像で調べることが可能となる。大面積の画像を得ることは、次に、大容量の試料を効率的に解析する本発明の能力の鍵となる。大容量中に存在する標識粒子を、高倍率の顕微鏡またはマイクロ流体で検出する際には、労力を要する濃縮段階、または数千枚の画像の解析を必要とする場合がある。顕微鏡的ビームを用いて少数の粒子をスキャンする方法は、大面積に適用する場合には極めて長い時間を要し、高額の費用がかかる。
【0026】
個々の顕微鏡的標識を列挙することは、本発明に基づく試験で得られる結果に頑健性を加える。分子標的を解析するいくつかの大面積画像化とは対照的に、本発明は一般に、個々のシグナルを小さな近傍領域と直接比較する。この比較により、大面積中におけるシグナルとバックグラウンドを統合する方法と比較して、標識された標的分子をわずかに含む試料のシグナル/バックグラウンド比が改善される。
【0027】
個々の標識粒子を検出することで得られる別の利点は、試験の感度を、試験形態の大きさの拡大と比例して試料の容量を増すことによって、速度を犠牲にすることなく高められることである(38ページの実施例8の「結果」を参照)。
【0028】
大面積の画像中の個々のシグナルを列挙することは、偽陽性結果の出現確率を小さくもする(実際の標的分子が存在しない場合、偽陽性結果は陽性試験結果となる)。このような列挙法は、試料中の分子(例えばATP、抗原、または核酸)の総数を測定する方法などの、一つの統合シグナルを検出する方法と比較して利点となる。シグナルを発生する任意のアーティファクトは、シグナルの統合に依存する方法を用いると偽陽性を生じる場合がある。これについては、個々のシグナルが100蛍光単位を発生する482個の陽性のシグナルを含む試料を考慮されたい。統合的方法の結果は一つの数値となる(48,200蛍光単位)。同等の数の蛍光単位を発生するアーティファクト(例えば大きな蛍光塵粒子)は識別不可能な場合がある。これとは対照的に本発明は、1個の大きな蛍光塵粒子と482個の陽性シグナルを容易に識別することができる。
【0029】
本発明で構築される試験は、極めて低濃度から高濃度に至る広範囲の濃度の標的分子を検出可能である。本発明のこの検出範囲が広いという特徴によって使用者は、検出範囲が狭い手法では必要とされることの多い試料調製段階(例えば複数回の希釈)をスキップすることができる。
【0030】
本発明に基づく試験では、単純で、装置を組む必要がなく、費用効果に優れた単回使用のストリップ試験から、無人連続環境モニタリング用の高性能の自動化されたベンチトップシステムに及ぶ範囲の、さまざまな有用な形態を用いることができる。特に重要な点は、本発明が、試験の反応速度(例えば、標的分子と標的特異的標識の結合速度)を最大化する形態に適合することである。例えば結合反応は、本発明のいくつかの態様で使用される多孔性膜で迅速に進む。
【0031】
視覚的検出、フィルムを用いる検出、および電気的検出を含む、さまざまな検出法を本発明で使用することができる。検出法の範囲が広いことは、診断上の問題および試験場所の幅の広さをカバーする上で利点となる。例えば、携帯型システムの場合、大きさと重量を最小化することは利点となる。装置の必要性を最小化したり、またはなくしたりする本発明の態様は、携帯性の確立に特に有用である。
【0032】
他の特徴および利点は、以下の説明および特許請求の範囲から明らかになる。
【0033】
「標的分子」という表現は、試料中に存在する可能性のある分子、また存在が本発明による検討対象となる分子を意味する。標的分子は、別個の分子の場合があるほか、試料中の他の分子、細胞、または材料と物理的に結合している場合がある。例えば、真菌病原体のカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)を検出する試験は、この生物のゲノムに固有の3種類の異なるDNA配列を検出する場合がある。これら3種の配列は、この真菌のゲノムと物理的に結合している場合であっても、別個の標的分子であるとみなされる。
【0034】
標的分子の「カテゴリー」という表現は、共通の一つまたは複数の特性を有し、本発明によって構築された試験の目的に関して同一であるとみなされる複数の標的分子を意味する。例えば、ある試験のカテゴリーは、エイズの原因となるウイルスのエンベロープタンパク質である場合がある。これについては例えば、全HIVウイルスのエンベロープタンパク質をHIV-1とHIV-2を区別することなく検出するように設計された試験を考慮されたい。このような場合、標的分子のカテゴリーは、HIV-1およびHIV-2の両方のエンベロープタンパク質を含む。別の試験目的はHIV-1とHIV-2を識別することである場合がある。この場合、各種のHIVのエンベロープタンパク質は、異なるカテゴリーとみなされる場合がある。あるいは、上記の標的分子の定義における、カンジダ・アルビカンスに対応する3種類のDNAプローブを考慮されたい。試験の目的が、カンジダ・アルビカンスを検出することである場合、3種類のプローブは、試験の目的に関して同一であるとみなされる。これは3種類のプローブが、カンジダ・アルビカンスに特異的に結合するという共通の性質をもつためである。したがって、これら3種類の標的分子は、標的分子の同じカテゴリーに含まれるとみなされる場合がある。
【0035】
標的分子の「非重複カテゴリー」という表現は、和集合(union)が空集合である標的分子のカテゴリーを意味する。すなわち、どのカテゴリーの要素も、他のどの集合の要素ではない。例えばIL-2、トロンビン、PSA、およびミオグロビンのカテゴリーは非重複カテゴリーである。
【0036】
複数のカテゴリーを検出および同定する試験は(常にではなく)一般に、標的分子の複数の非重複カテゴリーを検出する。これについては例えば、血液中のHIV、HCV、およびHBVの各ウイルスを同定するように設計された試験を考慮されたい。このような試験は、標的分子の3種類の非重複カテゴリー(各1種が3種類のウイルスのそれぞれに対応する)を区別するために設計される場合がある。
【0037】
試験の「カテゴリー複雑度」という表現は、試験で検出される標的分子の非重複カテゴリーの数を意味する。
【0038】
「カテゴリー特異的結合部位」という表現は、「特異的結合条件」でカテゴリー結合分子に特異的に結合する標的分子上の部位、および試験で同定される特定のカテゴリーの要素である標的分子を、同カテゴリーの要素ではないが試験試料中に存在する可能性のある標的分子と識別する、標的分子上の部位を意味する。すなわち、このような部位は典型的には、あるカテゴリーの全要素に存在し、また典型的には非重複カテゴリーの任意の要素には存在しない。カテゴリー特異的結合部位は「カテゴリー特異的結合分子」に「特異的に結合する」。
【0039】
これについては例えば、抗体のカテゴリー結合分子に特異的に結合するHIVウイルスのエンベロープタンパク質上のエピトープ(抗原部位)を考慮されたい。このような標的分子はウイルスのエンベロープタンパク質であり、またカテゴリー特異的結合部位はエンベロープタンパク質上のエピトープである。
【0040】
試験が、分類群の特徴である標的分子のカテゴリーに関して試料をスキャンする場合、カテゴリー特異的結合部位は、試験試料中に存在する可能性のある、対象分類群の全要素の標的分子上に典型的に存在するが、試験試料中に存在する可能性のある他の分類群の全要素には典型的に存在しない部位の一つである。一例として、特定のモノクローナル抗体に結合するHIV膜タンパク質上の部位が挙げられる。
【0041】
あるいは、試験は、異なる分類群の要素と共有するカテゴリー特異的結合部位を求めて試料をスキャンする場合がある。この種類のカテゴリー特異的結合部位の例には、抗生物質耐性をもたらす、病原性をもたらす、または生存能を示す、さまざまな巨大分子(例えばDNA)、および遺伝子、mRNA、ならびにタンパク質などがある。カテゴリー特異的結合部位は、より大きな分子または複合体の一部であることが多い。例えば、カテゴリー特異的ゲノム配列は、試験でカテゴリー特異的結合部位として使用することができる。このようなカテゴリー特異的結合部位は、(1)カテゴリー特異的でない領域、(2)カテゴリー特異的結合部位の領域(ただし試験がスキャンしない領域)、および(3)試験がスキャンする、特定のカテゴリー特異的配列である他の領域を含む場合がある、かなり大きなゲノムの一部である。
【0042】
あるカテゴリーの要素である、例えば80%、90%、95%、または99%を超える標的分子には存在するが、同じクラスの他のすべてのカテゴリーの要素である、例えば80%、90%、95%、または99%を超える標的分子には存在しない結合部位は、カテゴリー特異的結合部位とみなされる。この際、カテゴリー特異的結合部位が、特に大きな意味なく、または例外的に、対象カテゴリーの要素である標的分子に存在しない場合がある点に留意されたい。同様に、カテゴリー特異的結合部位は、特に大きな意味なく、または例外的に、カテゴリーの要素ではない標的分子に存在する場合がある。これについては例えば、本質的にすべての大腸菌には存在するが、他の細菌種には存在しないタンパク質上の部位を考慮されたい。数百万個の細菌のうち1個に満たない細胞においてあり得る状況であるが、ある変異によってタンパク質が産生されなくなると、このマーカーは大腸菌のこの株には存在しないことになる。このようなタンパク質上の部位はそれでも、カテゴリー特異的結合部位とみなされる。あるいは、同じタンパク質の遺伝子を、ある株の異なる種の細菌に組換えDNA技術で、または天然の手段(例えばウイルスの形質導入)で移す。この場合、大腸菌群の要素ではない細菌株は、それでも大腸菌特異的結合部位とみなされる部位を発現する可能性がある。
【0043】
「カテゴリー結合分子」という表現は、カテゴリー特異的結合部位に「特異的に結合する」分子または分子複合体を意味する。カテゴリー結合分子の例には、ゲノムDNAとハイブリダイズする核酸プローブ;タンパク質上の部位に特異的に結合するようにインビトロで選択された(「進化した」)核酸アプタマー;細胞抗原または血清タンパク質に結合する抗体;ならびに、ホルモン受容体またはアビジンなどの結合分子に特異的に結合する上皮成長因子またはビオチンなどのリガンドなどがある。2種類のカテゴリー結合分子は、別個のカテゴリー特異的結合部位、または非重複カテゴリー特異的結合部位と結合する場合に異なると判断される。カテゴリー結合分子は、その分子組成にしたがって、例えばカテゴリー結合オリゴヌクレオチド、プローブ、抗体、リガンドなどと呼ばれる場合がある。
【0044】
「捕捉分子」という表現は、表面、膜、または粒子ではない他の基材に安定に結合した状態にあるカテゴリー結合分子を意味する。
【0045】
標的分子のカテゴリーに「特異的に結合する」カテゴリー結合分子という表現は、ある試験のスキャン対象のカテゴリーの要素である本質的にすべての標的分子と、特定の「結合条件」では結合するが、試料中に存在する可能性が高い本質的に他の分子とは結合しないカテゴリー結合分子を意味する。スキャン対象のカテゴリー中で標的分子と結合状態にあるカテゴリー結合分子の数は、このカテゴリーに存在しない標的分子と結合状態にある数と比較して典型的には2倍、5倍、10倍、または50倍を上回る。
【0046】
「結合条件」という表現は、カテゴリー結合分子とカテゴリー特異的結合部位との特異的な結合を達成するために試験で用いられる条件を意味する。例えば、カテゴリー結合分子がカテゴリー特異的DNAプローブの場合、特定の試験の結合条件は、ストリンジェントなDNAハイブリダイゼーション条件の場合がある。適切なストリンジェントなDNAハイブリダイゼーション条件は、当業者によく知られているようにプローブの性質に依存する。例えば、長さが500塩基より大きい典型的なDNAプローブの場合、適切な結合条件(ハイブリダイゼーション用語で通常「洗浄条件」と呼ばれる)は0.2×SSC中で65℃である。抗体と抗原を結合させる場合、典型的な結合条件はPBS-TB中で室温である。
【0047】
カテゴリー結合分子の「ファミリー」という表現は、標的分子の特定のカテゴリーと特異的に結合するカテゴリー結合分子の集合を意味する。C型肝炎ウイルスのコアタンパク質に対するポリクローナル抗体調製物は、カテゴリー結合分子のファミリーを含む。これは、このポリクローナル抗体調製物が、同じカテゴリーの標的分子(HCVコアタンパク質)に特異的に結合する複数の異なる抗体を含むためである。ポリクローナル抗体は一般に、同じカテゴリーの標的分子に結合する複数の異なるカテゴリー結合分子を通常含むので、カテゴリー結合分子のファミリーを含む。これについては、アフィニティ精製を行わない限り、ポリクローナル抗体調製物が、典型的には、標的分子の選択されたカテゴリーに結合しない抗体も含み、また動物の抗体レパートリーが動物の感染歴によって決定されるために他のカテゴリーに結合する抗体を含む可能性があることに留意すべきである。したがってポリクローナル抗体は好ましくは、アフィニティ法で精製される。
【0048】
あるファミリーのカテゴリー結合分子は、同じカテゴリーのいくつかの標的分子に結合するが、他の分子とは結合しない可能性がある。これについては例えば、HIV-2のエンベロープタンパク質とは交差反応しないHIV-1のエンベロープタンパク質特異的抗体、およびHIV-1のエンベロープタンパク質とは交差反応しないHIV-2特異的抗体を考慮されたい。仮にHIVが試験で、HIV-1またはHIV-2であるかということを区別することなく、ひとつのカテゴリーとして検出される場合、2種類の抗体の混合物は、同じシグナル特性をもつシグナル発生部分で標識される場合がある。2種類の抗体調製物の混合物である、カテゴリー結合分子のこのファミリーを試験で使用する場合は、HIV-1またはHIV-2のいずれが存在するかという同じシグナルが得られる(仮にこの例で、抗体を用いてHIV標的分子を検出ゾーン内の部位で捕捉する場合には、抗HIV-1捕捉抗体および抗HIV-2捕捉抗体の混合物が同部位で使用されることに留意されたい)。
【0049】
カテゴリー結合分子のファミリーの別の例は、すべての大腸菌O157:H7株には存在するが、他のグループの細菌の要素には存在しない80のカテゴリー特異的ゲノムDNA配列の集合である。このカテゴリー結合分子のファミリーは、グループとして、適切に調製された大腸菌O157:H7細胞とハイブリダイズ可能であるが、他のカテゴリーの細胞とはハイブリダイズしない。
【0050】
カテゴリー結合分子の「非重複ファミリー」という表現は、各ファミリーが、標的分子の非重複カテゴリーの集合内の1つ、かつ唯一の標的分子のカテゴリーと特異的に結合する、カテゴリー結合分子のファミリーを意味する。すなわち、カテゴリー結合分子の非重複ファミリーの集合は、標的分子の非重複カテゴリーの合同集合(congruent set)にマップされる。例えば4種類のUSP有害生物(objectional organism)である大腸菌、サルモネラ(Salmonella)、シュードモナス(Pseudomonas spp.)、および黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)を特徴づける標的分子をスキャンする試験では、標的分子の非重複カテゴリーが4種類存在する。このような試験は、4種類の異なる非交差反応性ポリクローナル抗体(各抗体が標的分子のカテゴリーの一つに特異的に対応する)を統合する可能性がある。したがってこの試験は、カテゴリー結合分子の4種類の非重複ファミリーを含む。ある試験における、カテゴリー結合分子の非重複ファミリーは、カテゴリー結合分子のアンサンブルと呼ばれる(以下の定義参照)。
【0051】
「カテゴリー結合分子のアンサンブル」という表現は、特定の試験用に混合物中に混合された、カテゴリー結合分子の一つまたは複数の非重複ファミリーの集合を意味する。標的分子の複数の非重複カテゴリーをスキャンする試験は、一つのカテゴリーあたり、カテゴリー結合分子の一つのファミリーを含む。これらのファミリーを含む、カテゴリー結合分子の全体集合は、アンサンブルと呼ばれる。例えば、5種類の上気道ウイルス(RSV、A型インフルエンザ、B型インフルエンザ、パラインフルエンザ、およびアデノウイルス)の存在を、5種類のウイルス特異的モノクローナル抗体を用いてスキャンする試験を考慮されたい。これら5種類のモノクローナル抗体は、カテゴリー結合分子の5種類の非重複ファミリーを含む。抗体の連結集合は、カテゴリー結合分子のアンサンブルである。
【0052】
アンサンブルの「カテゴリー結合分子の複雑度」という表現は、アンサンブル中の異なるカテゴリー結合分子の数を意味する。例えば仮にカテゴリー結合分子の集団が、234種類のオリゴヌクレオチドプローブからなる場合、この集合のカテゴリー結合分子の複雑度は234となる。
【0053】
アンサンブルの「ファミリー複雑度」という表現は、アンサンブル中の、カテゴリー結合分子の非重複ファミリーの数を意味する。ファミリー複雑度は、アンサンブル中の各ファミリーに由来するカテゴリー結合分子の結合に必要とされる標的分子の最少値と同値である。ある試験のファミリー複雑度は、試験のカテゴリー複雑度(試料がスキャンされる異なるカテゴリーの数)と一致する。一般に、ファミリー複雑度は、試験に使用される異なるシグナル特性の数とも一致する。これについては、4種類のヒトサイトカインタンパク質(顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-4(IL-4)、および腫瘍壊死因子-α(TNF-α))を検出するように設計された標的分子-特異的抗体のアンサンブルを考慮されたい。4より小さい標的分子のサブセットは、アンサンブル内の各抗体と結合するのに十分であり得ないため、アンサンブルのファミリー複雑度は4である。別の例としては、3つのファミリーのプローブからなるDNAプローブのアンサンブルを考慮されたい。一つのファミリーは、12の大腸菌特異的カテゴリー結合DNA配列の集合からなり、別のファミリーは、10のロタウイルスのカテゴリー結合DNA配列の集合からなり、さらに別のファミリーは、15のジアルジア(Giardia)のカテゴリー結合DNA配列の集合からなる。このプローブ集団のファミリー複雑度は3である。というのは、標的分子の3つのカテゴリー(大腸菌、ロタウイルス、およびジアルジアに特異的な標的分子)が、アンサンブル内のすべてのプローブに結合するために必要とされるからである。
【0054】
「シグナルエレメント」という表現は、検出可能なシグナルを直接発生する分子または粒子を意味する。「直接発生する」という表現は、シグナルエレメントが検出可能なシグナルの直接の供給源、または重要な調節因子であることを意味する。したがって、仮にシグナルが蛍光体から発生する光子の場合、蛍光体は光子の直接の供給源であり、したがってシグナルエレメントである。シグナルがRLS粒子によって散乱された光子の場合、RLS粒子はシグナルエレメントである。あるいはシグナルが、酵素西洋ワサビペルオキシダーゼの発色性沈殿物から伝達または散乱された光の場合、この発色性産物はシグナルエレメントである。
【0055】
シグナルエレメントの特徴は、各部分が、特徴に関して全体と同等の(強度については必ずしも同等ではない)シグナルを発生するような部分へと、このようなエレメントが分割できないことである。したがって、直径2 nMの量子ドットは、分割されて、結果として生じるナノ結晶の特性(放出スペクトル)を変化させるのでシグナルエレメントである。フルオレセインなどの蛍光色素を染み込ませた5 μmの粒子はシグナル発生エレメントではない。というのは、この各部分が、完全な粒子に匹敵するシグナル発生特性をもつように、部分に分割される可能性があるからである。これとは対照的に、分子フルオレセインはシグナル発生エレメントである。シグナル発生酵素(例えばルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ)の検出可能な産物もシグナルエレメントとみなされる。このようなシグナルエレメント(または、前駆体からシグナルエレメントへの化学変換が起きる場合は、シグナルエレメントの前駆体)は、拡散性物質、不溶性産物、および/または不安定中間体の場合がある。例えば、酵素アルカリホスファターゼは、化学発光基質CDP-Star(NEN;カタログ番号NEL-601)を、光子を放出する「シグナルエレメント」である活性化産物に変換する。
【0056】
「シグナル発生部分」という表現は、1個または複数のシグナルエレメントを含むか、または産生する(酵素の場合)分子、粒子、または物質、またカテゴリー結合分子と結合可能な分子、粒子、または物質を意味する。シグナル発生部分は、カテゴリー結合分子に共有結合的または非共有結合的のいずれかにより、かつ直接的または間接的(例えば、1個または複数のアダプターもしくは「化学リンカー」部分を介して、または同じ粒子に結合する両方の部分によって)のいずれかにより結合可能である。シグナル発生部分の例には、カルボキシル化された量子ドット;核酸プローブまたは抗体プローブと結合するように改変されたテキサスレッド(Texas Red)などの蛍光体;ストレプトアビジンでコーティングされた蛍光ポリスチレン粒子(ビオチン化されたカテゴリー特異的結合タンパク質と結合可能);反復核酸配列を含むローリングサークル複製産物(各反復配列は、蛍光的に修飾されたヌクレオチドを末端に有し、またカテゴリー特異的結合オリゴヌクレオチドを5'端に含む複数のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズ可能)などがある。シグナル発生部分は、物理的に異なるエレメントを含む場合がある。例えば場合によっては、シグナル発生部分は、カテゴリー結合分子(例えば抗体)と結合する酵素(例えばアルカリホスファターゼ)である。アルカリホスファターゼの基質(例えばNEN社のCDP-Star、またはRoche社のBM Purple)が、シグナルエレメント(例えば、光子を放出する不安定な中間体、または沈殿性発色性産物)である産物に変換されるとシグナルが発生する。カテゴリー結合分子、酵素シグナル発生部分、および基質が時間差で反応系に適用されることは珍しくない。
【0057】
「シグナル発生部分複合体」という表現は、複数のシグナル発生部分および複数のカテゴリー結合分子を含む物理的実体を意味する。シグナル発生部分複合体中における、シグナル発生部分とカテゴリー結合分子の物理的結合は安定でなければならない(例えば、シグナル発生部分およびカテゴリー結合分子の、複合体との結合の平均半減期はPBS中で4℃で少なくとも1日であるべきである)。シグナル発生部分複合体の例としては、標的分子特異的抗体とアルカリホスファターゼの2種類の分子の数千個でコーティングされたポリスチレン微粒子を考慮されたい。このようなシグナル発生部分複合体は、結合状態の抗体カテゴリー結合分子を介して標的分子と結合する。発色性アルカリホスファターゼ基質(シグナルエレメント;例えばRoche社のBM Purple)とインキュベートすると、視認可能な色の着いたスポットが生じる場合がある。あるいは、同じシグナル発生部分複合体を、化学発光性または蛍光性のアルカリホスファターゼ基質のいずれかとインキュベートすると、化学発光シグナルまたは蛍光シグナルのいずれかを発生する。シグナル発生部分複合体の別の例には、フルオレセイン標識抗体と結合した金ナノ粒子、ならびにオリゴヌクレオチドのカテゴリー結合分子、および過酸化水素を添加することで化学発光するアクリジニウムエステルの両方と結合したラテックス粒子などがある。
【0058】
「粒子」という表現は、大きさが50ミクロンより大きい基質を意味する。粒子の集団またはバッチの大きさは、粒子の標本における直交寸法の最長対の平均測定値として定義される。直交寸法の最長対とは、その長さの和が、粒子の全てのこのような和に対する最大値であるような、粒子の直交寸法の対である。2個の粒子の標本の直交寸法の最長対が、それぞれ1ミクロン×2ミクロンと、2ミクロン×3ミクロンの場合、直交寸法の最長対の平均測定置は2ミクロン[(1+2+2+3)/4=2ミクロン]である。粒子標本の直交寸法の最長対の平均測定値は例えば、50ミクロン未満、20ミクロン未満、または5ミクロン未満である。
【0059】
多くの粒子が、固体の複数の特徴を有する。しかし、強固でない分子骨格または分子複合体も粒子であると定義される。例えば、デンドリマーや他の分枝状分子構造は粒子であるとみなされる。同様にリポソームも粒子とみなされることがある。粒子は着色できるほか、シグナルエレメントと結合させることができる。粒子は、その寸法または幾何学的位置を反映した用語で言及される場合がある。例えばナノスフェア、ナノ粒子、またはナノビーズは、任意の軸に沿った長さが1ミクロン未満である粒子に関して用いられる。同様に、マイクロスフェア、マイクロ粒子、またはマイクロビーズという表現は、任意の軸に沿った長さが1 mmに満たない粒子を意味する用語として用いられる。粒子の例には、ラテックス粒子、ポリアクリルアミド粒子、マグネタイトマイクロ粒子、鉄流体(ferrofluids)(磁気ナノ粒子)、量子ドットなどがある。
【0060】
「標識粒子」という表現は、標的分子に特異的に結合してシグナルを発生可能な粒子を意味する。標識粒子は、シグナル発生部分とカテゴリー結合分子の両方と結合する。
【0061】
「標的分子:標識粒子複合体」という表現は、1個または複数の標的分子が特異的に結合された標識粒子を意味する。
【0062】
「標識比」という表現は、接触段階における標的分子と標識粒子の比を意味する。例えば1×107個の標識粒子を1×106個の標的分子を含む試料と接触させる場合、標識比は10である。標識比を計算する目的で、標識粒子に特異的に結合可能な標的分子のみを考慮する。例えば、物理的に隔絶されている標的分子(例えば、細胞成分内に隔離されている分子)は計算に含まれない。
【0063】
シグナルエレメントまたはシグナル部分の「シグナル特性」という表現は、他のシグナルエレメント、またはシグナル発生部分との識別に有用な、シグナルエレメントのシグナル発生部分から発生するシグナルの一つの局面または複数の局面を意味する。例えば、フルオレセインおよびローダミンで標識されたシグナル発生部分のシグナル特性は「蛍光」である。ラジオトランスポンダーのシグナル特性は「ラジオ周波数」である。光シグナル発生特性の例は、蛍光、光散乱、リン光、反射、吸光、化学発光、および生物発光である。光シグナル発生特性の後者の2例を除くすべては、外部照射(例えば白色光源、レーザー光源、または昼光)に依存する。これとは対照的に、化学発光および生物発光は外部光源に依存しないシグナル発生特性である。
【0064】
シグナルエレメントまたはシグナル発生部分の「クラス」という表現は、他のシグナルエレメント、またはシグナル発生部分との識別に有用な、シグナルの特定の質を意味する。例えば、赤色色素で標識されたリポソームは、別の色で着色されたリポソームと区別される。この場合、赤色がクラスとなる。特定のラジオ周波数シグナルを伝えるマイクロトランスミッターの場合、マイクロトランスミッターと他のマイクロトランスミッターを区別するラジオ周波数シグナルの質が、シグナルエレメントのクラスとなる。
【0065】
「シグナルサイン」という表現は、ある試験で標的分子のカテゴリーと結合するシグナル発生部分の組み合わせのシグナル発生の特徴的な質を意味する。4種類の抗体と結合した状態の標的分子で、1種がフルオレセイン分子と結合し、残りの3種がローダミン分子と結合している場合、シグナルサインは、フルオレセインおよびローダミンの重み付きの吸収および放出のスペクトルが組み合わされた値で表される。
【0066】
試験、または標識されたカテゴリー結合分子の集団の「シグナル複雑度」という表現は、試験で、またはアンサンブルとの結合によって異なって標識されうる、標的分子のカテゴリーの数を意味する。あるいは、シグナル複雑度は、標的分子の各カテゴリーの要素が存在する場合に生じると予想される、異なる「シグナルサイン」の数と定義される。一部の試験の場合、カテゴリー結合分子の集団のシグナル複雑度は、試験でスキャンされるカテゴリーの数と同じである。複数のカテゴリーをスキャンする他の試験は、一つのシグナル複雑度しかもたない場合がある。
【0067】
「選択力」という表現は、標的分子の捕捉、単離、移動、または隔離に用いられる力を意味する。選択力の例には、重力、磁力、電位、遠心力、求心力、浮遊密度、および圧力などがある。標的分子は、標的分子のみに作用する選択力によって動かされる。あるいは、選択力は、選択部分と結合した状態の標的分子に特異的に作用する場合がある。(以下の定義参照)。
【0068】
標的分子を動かす選択力の応用の例には、標的分子の遠心;磁性粒子と結合した状態の標的分子の磁気選択;金属粒子で標識された標的分子の重力沈降;ならびに真空濾過による多孔性膜上における標的分子の沈着などがある。選択力が使用される他の例については以下の実施例で説明する。
【0069】
「選択部分」という表現は、カテゴリー結合分子と結合可能であり、かつ選択力によって選択的に捕捉、単離、移動、または隔離される能力をカテゴリー結合分子にもたらす、原子、分子、粒子、または他の実体を意味する。カテゴリー結合分子:選択部分複合体が、標的分子と特異的に結合している場合、標的分子は一般に、選択力によって選択的に捕捉、単離、移動、または隔離される場合がある。選択的であるということは、選択部分および結合体にかかる選択力による移動に対する感受性が、選択部分が結合していない状態の実体をしのいで優先的にもたらされることを意味する。
【0070】
常磁性粒子およびフェリチンは、選択部分の例である。溶液中で沈降する高密度シリカ(dense silica)粒子も、選択部分の例である。これらの粒子は、カテゴリー結合分子でコーティングされ、かつ微生物の標的分子と結合すると、標的分子を水溶液中に沈めることにより、結合状態の標的分子を、他の試料の未結合状態の成分から分離することができる。
【0071】
「選択特性」という表現は、選択部分の捕捉、選択、または移動に有用な、選択部分の一つの局面または複数の局面を意味する。例えば、常磁性粒子の選択特性は「磁性」である。水溶液中に速やかに沈降するシリカ粒子の選択特性は「質量」である。
【0072】
「ほぼ平面の」表面または基質という表現は、表面上の任意1 mm×1 mmの四角内の点から、仮想的平面上の最も近い点までの距離を測定したときに、平均距離の絶対値が50マイクロメートル未満であるような、仮想的平面と平行に整列可能な表面を意味する。
【0073】
「検出表面」という表現は、本発明のいくつかの態様で標的分子が沈積する、ほぼ平面の基質の表面を意味する。光シグナル発生特性を用いる態様では、仮に検出表面が光学的に透明な場合、検出は、検出表面のどちらかの面を介して達成される。検出表面が不透明の場合、検出は、標的分子が沈積する、検出表面の面を介して達成される。
【0074】
「検出面積」という表現は、本発明によって同時に解析される検出表面または検出ゾーンの面積を意味する。検出面積は典型的には、最も長い直線寸法が1 mmより長く、例えば5 mm、10 mm、または15 mmより長い。例えば、集光レンズ(collection lens)およびCCDチップを含む光学装置によって同時に画像が得られるガラススライドの断面は0.8 cm×0.5 cmと測定されうる。この場合、検出面積は0.4 cm2である。
【0075】
「検出ゾーン」という表現は、標的分子を検出することが可能な容積を意味する。検出ゾーンは、検出面積と同じ寸法を有するが、標識粒子を検出かつ同定することが可能な深度に対応する深度を有する。したがって検出ゾーンの深度は、陽性シグナルの評価に使用される閾値基準に依存する。光学的検出を行う場合は、検出ゾーンの深度は、場の光学的深度に依存する。
【0076】
検出面積の「最長寸法」という表現は、検出面積の外周の2点間に引くことができる最大長の線を意味する。例えば仮に検出面積が0.3 cm×0.4 cmの長方形の場合、検出面積の最長寸法は対角線の0.5 cmである。仮に検出面積が、半長軸の長さが7 mmで半短軸の長さが2.5 mmの楕円の場合、検出面積の最長寸法は14 mmである。
【0077】
「大面積検出」または「大面積画像化」という表現は、検出面積(検出器によって同時に解析される面積)が標的分子と比較してかなり大きい、顕微鏡的標的分子を検出する方法を意味する。大面積検出の検出面積の少なくとも1本の長さ寸法は1 mm以上である。これとは対照的に、顕微鏡的標的分子は実質的により小さく、典型的には少なくとも2本の直交寸法が50 μm未満である。大面積検出の例には、CCDカメラによる直径9 mmの検出面積の画像化;長さ寸法が1 cmであるCCDラインスキャナーを用いたスキャニングによる、2 cm×1 cmの長方形の画像化;微生物標的分子を含む4 cm×4 cmのフィルターの、写真用フィルム上への直接露光による画像化;および迅速なラテラルフローストリップ試験における、1 cm×3 cmの試験面積上の顕微鏡的標的分子に対応する有色スポットの視覚的検出などがある。
【0078】
顕微鏡的標的分子の検出を対象に試料をスキャンするが大面積検出を用いない手法はいくつかある。この例には、フローサイトメトリー、固相レーザーマイクロビームスキャニングサイトメトリー、液相スキャニング(Tibbeら、Nat Biotechnol 17:1210-3、1999に記載)、およびスライド上における複数の強力な顕微鏡視野の調査/画像化などの手法が含まれる。
【0079】
「結合した」または「安定に結合した」という表現は、結合の平均半減期がPBS中4℃で少なくとも1日である2つの実体間の物理的結合を意味する。これについては例えば、ポリスチレン粒子に対する受動的タンパク質吸収の複合体の場合を考慮されたい。複数の異なるクラスの吸収タンパク質が存在する。一部のタンパク質は、数か月の半減期で安定に表面に結合する。吸着タンパク質の外層上に緩く結合したタンパク質などの他のタンパク質は、粒子と安定に結合した状態にない場合があり、数時間以内に浸出する場合がある。
【0080】
「画像増強装置」または「画像管」という表現は、Inoue, Shinyaら、「Video microscopy:the fundamentals」(Plenum Press、New York、1997;p.665)の用語解説の頁で定義されるように、光シグナルを増幅する装置を意味する:「感度を高めるために(光ファイバーまたはレンズによって)ビデオカメラ管と接続した装置。この増強装置は真空管であり、具体的には、真空管に焦点を結ぶ画像にしたがって電子を放出する光電陰極を前端部に、電子レンズ、および/または後部に位置するリン光体に電子を集める1個または複数のマイクロチャンネルプレート、ならびに電子のエネルギーを高める高電圧加速器を有する。一つの段階または複数の段階の場合がある。同類のさまざまな画像増強装置は、同じ文献の第8章に詳述されている。
【0081】
検出面積の区画で標的分子を「同時に検出する」という表現は、ほぼ平面の検出表面の区画に由来するシグナルを1段階で検出することを意味する。検出面積における標的分子のCCDチップによる大面積画像化、視覚的検出、または光ダイオードベースのシグナル統合は、同時検出の例である。
【0082】
「静止期」にある標的分子という表現は、動かない状態の標的分子を意味する。例えば、ガラススライド上に固定された標的分子は静止期にある。マイクロタイターディッシュのウェル底面の一定の位置に、カテゴリー結合分子によって捕捉された標的分子は静止期にある。たとえこのような標的分子が表面に固定されておらず、また水力学的な力または他の力によって動かされる場合があっても、検出/画像化中であれば標的分子は静止期にあるとみなされ、10秒を超える間隔をおいて撮影された連続画像によって、本質的に同じ標的分子が、本質的に同じ相対位置に検出される。フローサイトメトリー応用における標的分子は静止期にない。しかし、ラテラルフロー試験の固相試験ゾーンに結合した状態の抗体によって捕捉された標的分子は静止期にある。
【0083】
「同質(homogenous)アッセイ法」または「同質免疫アッセイ法」という表現は、反応物が、アッセイ法完了後の産物から物理的に除去されないアッセイ法または免疫アッセイ法を意味する。
【0084】
「同定」という表現は、ある標的分子が要素であるカテゴリーを決定することを意味する。これについては例えば、標的分子の複数のカテゴリー(それぞれが試料中に存在する可能性がある)をスキャンするラテラルフロー試験を考慮されたい。特定のカテゴリーに属する標的分子は、対応するカテゴリー特異的な抗体が結合した状態の膜の領域で捕捉される。膜ゾーンが捕捉抗体を含むことはわかっているので、捕捉が起きるゾーンによって標的分子が同定される。
【0085】
「試料」という表現は、標的分子の存在に関して本発明によってスキャンされる材料を意味する。
【0086】
「連結依存性多型プローブ対」という表現は、ゲノムとハイブリダイズする際に多型部位に隣接する、一組のオリゴヌクレオチドカテゴリー結合分子(この一組は複数のオリゴヌクレオチドを含む)を意味する。対の一つのオリゴヌクレオチドは、ゲノム多型部位の一方の側にゲノム配列に相補的な配列を含み、もう一つのオリゴヌクレオチドは、多型部位のもう一方の側に相補的な配列を含む。このような一組のオリゴヌクレオチドは、ゲノムと隣接してハイブリダイズすると、標的部位における対立遺伝子または遺伝子型が、多型プローブのオリゴヌクレオチドの隣接配列と合致する場合にのみ、相互に効率的に連結されうる。連結依存性多型プローブ対の構造および用途を図18および図19に示す。一般に多型プローブのグループは、特定部位の各対立遺伝子に対応するように合成される。多型プローブは、シグナル発生部分、選択部分、化学的なスペーサーまたはつなぎ鎖(tether)、タグ、増幅部位、およびハプテンを含む、さまざまな機能的部位を含む場合がある。SNPプローブの使用例については、実施例14および実施例15を参照されたい。
【0087】
「伸長依存性多型プローブ」という表現は、プローブの3'端が、試験で検出される多型部位と数ヌクレオチドの範囲にあるが、多型部位と塩基対を生じるように、ある配列とハイブリダイズするように設計された核酸カテゴリー結合分子を意味する。伸長依存性多型プローブの、鋳型に依存した伸長は、多型部位における対立遺伝子に依存してプローブを異なって標識するために使用される。これについては例えば、オリゴヌクレオチドの3'端が多型部位にすぐ隣接するように、鋳型鎖上の「A」または「C」のいずれか一方を有する、多型部位のすぐ隣とハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドを考慮されたい。ハイブリッドを、緑色放出性蛍光体で標識されたTTP、および赤色蛍光体で標識されたdGTPを、DNAポリメラーゼの存在下で適切な条件でインキュベートすることで、鋳型鎖の対立遺伝子に依存してプローブが異なって標識される。
【0088】
「対立遺伝子特異的なハイブリダイゼーションプローブ」という表現は、特定の条件で、異なる核酸の対立遺伝子と区別をしてハイブリダイズするオリゴヌクレオチドカテゴリー結合分子を意味する。例えば12塩基のオリゴヌクレオチドが、正確な合致を含むDNA断片と効率的にハイブリダイズするが、オリゴヌクレオチドの12塩基中11塩基で合致を含む同じヌクレオチドがDNA断片と効率的にハイブリダイズできない条件を、当業者であれば決定することができる。
【0089】
「直接視検出」という表現は、装着型矯正レンズ以外の器具を必要とすることのない視覚的検出を意味する。例えば、直接視検出で、金ナノ粒子の赤みを帯びた反射シグナルを、いくつかの迅速なラテラルフロー試験で検出することができる。
【0090】
「光電検出器」という表現は、光シグナルを電気シグナルに変換する人工の装置または機器を意味する。光電検出器の例には、CCD検出器、光電子増倍管検出器、および光ダイオード検出器(例えばなだれ光ダイオード)などがある。
【0091】
「照射する」という表現は、電磁放射線を当てることを意味する。さまざまな波長の電磁放射線を用いて照射することが可能である。これには例えば、X線、UV、可視領域、または赤外領域のスペクトルの波長を当てることが含まれる。照射される放射線が、必ずしも可視域にはないことに留意されたい。
【0092】
「光シグナル発生特性」を有するシグナルエレメントまたはシグナル発生部分という表現は、光子の放出、反射、散乱、屈折、吸収、捕捉、もしくは再配向、または光子の挙動の他の任意の調節もしくは組み合わせによって検出可能なシグナルエレメントまたはシグナル発生部分を意味する。光シグナル発生特性を有するシグナルエレメントまたはシグナル発生部分のいくつかの例には、蛍光体であるテキサスレッド(Texas Red)(蛍光シグナル発生特性);CDP-Star(化学発光シグナル発生特性);ルシフェラーゼ(生物発光シグナル発生特性);共鳴光散乱粒子(光散乱シグナル発生特性);BM Purple(光吸収または発色性シグナル発生特性);および上方変換リン光体(2個の長波長光子の吸収および1個の短波長光子の放出)などがある。
【0093】
「[数値]×[溶液名]」という表現は、溶液(水を除く)の濃度の[数値]倍で溶液の組成物を含む水溶液を意味する。例えば10×EEは、10 mM EDTA/100 mM EPPSを含む(EE、すなわち1×EEは、1 mM EDTA/10 mM EPPSを含む)。
【0094】
EEは、1 mM EDTA/10 mM EPPSの溶液を意味する。各成分を混合する前に、両成分の共役酸をNaOHでpH 8.0に合わせる。
【0095】
HYBは、1 M NaCl、50 mM EPPS(pH 8.0)、2%ブロッキング試薬(Boehringer Mannheim);0.5% v/v Tween、20 μg/ml 酵母tRNA(Sigma)を含むハイブリダイゼーションに使用される溶液を意味する。
【0096】
UBB(ユニバーサル結合緩衝液)は、250 mM NaCl、50 mM EPPS(pH 8.0)、2%ブロッキング試薬(Boehringer Mannheim);0.5% v/v Tween、20 μg/ml 酵母tRNA(Sigma)を含むさまざまな種類のカテゴリー結合分子(抗体や核酸など)の結合混合物に有用な溶液を意味する。
【0097】
BB(ブロッキング緩衝液)は、100 mM EPPS(pH 8.0)/150 mM NaCl/2%ブロッキング試薬(Boehringer Mannheim)を含む。
【0098】
PBは、0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.4)を意味する。
【0099】
PBSは、120 mM NaCl、2.7 mM KCl、および10 mM リン酸緩衝液(ナトリウム塩)(pH 7.4)を含むリン酸緩衝食塩水溶液を意味する。
【0100】
PBS-Bは、PBS中0.1% BSA(IgG Free;Sigmaカタログ番号A-7638)を意味する。
【0101】
PBS-Tは、PBS中0.05% Triton X-100(Sigmaカタログ番号X-100)を意味する。
【0102】
PBS-TBは、PBS/0.1% BSA/0.05% Triton X-100を意味する。
【0103】
PBTは、PBS/0.1% BSA(IgG Free;Sigmaカタログ番号A-7638)/0.05% Tween-20(Sigmaカタログ番号X-100)を意味する。
【0104】
LBは、細菌を成長させるためのルリアブロス(Luria Broth)を意味し、調製法は以前に記載されている(Ausubel 1987、前述)。
【0105】
SSCは、HClでpH 7.0に調節された150 mM NaCl/15 mM Na3 クエン酸を意味する。
【0106】
MESは、2-[N-モルホリノ]エタンスルホン酸を意味する。
【0107】
MESBは、0.05 MのMES(2-[N-モルホリノ]エタンスルホン酸)(pH 6.1)を意味する。
【0108】
EDACは、(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドを意味する。
【0109】
連結緩衝液は、10 mM MgCl2/50 mM Tris-HCl/10 mM ジチオスレイトール/1 mM ATP/25 μg/μl ウシ血清アルブミンを意味する。
【0110】
APは、アルカリホスファターゼを意味する。
【0111】
BALは、肺胞洗浄液を意味する。
【0112】
BSAは、ウシ血清アルブミンを意味する。
【0113】
CCDは、電荷結合素子を意味する。
【0114】
CFTRは、嚢胞性線維症膜貫通型コンダクタンス制御因子を意味する。
【0115】
Cfuは、コロニー形成単位を意味する(生細菌細胞の数に対応する細菌濃度の尺度)。
【0116】
CMVは、サイトメガロウイルスを意味する。
【0117】
FITCは、フルオレセインイソチオシアネートを意味する。
【0118】
HBVは、B型肝炎ウイルスを意味する。
【0119】
HCVは、C型肝炎ウイルスを意味する。
【0120】
HIVは、ヒト免疫不全ウイルスを意味する。
【0121】
Pfuは、プラーク形成単位を意味する(感染性ウイルス粒子の数に対応するウイルス濃度の尺度)。
【0122】
PNAは、ペプチド核酸を意味する。
【0123】
RSVは、呼吸器合胞体ウイルスを意味する。
【0124】
TCID50は、フラスコ内の50%が感染を示す組織培養感染用量を意味する。
【0125】
XhoLは、
の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを意味する。
【0126】
XhoRは、
の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを意味する。
【0127】
オリゴヌクレオチド配列は、文書に表記する際には、特に指定しない限りにおいて5'→3'方向に表記する。
【0128】
特に明記しない限りにおいて、本明細書に記載された微生物株は、American Type Culture Collection(ATCC、Manassas、VA)から得られる。
【0129】
発明の詳細な説明
発明の概要
本発明は、低濃度の標的分子の検出を目的として、最小限に処理された試料を対象に、迅速かつ良好な費用効果でスキャンする。本発明によって提供される顕著な特徴は、最新の強度の高い標識段階、費用効果に優れた画像化法、および非拡大大面積検出を組み合わせた新しい診断法に基づく。
【0130】
大面積中に散在する少数の顕微鏡的標識を検出するために非拡大画像化を使用する段階を図1に図示する。図1に示す態様では、各標識粒子より大きい面積の画像を得るためにデジタルカメラ(CCDチップ)を使用する。CCDチップは、感光性ピクセルエレメントのアレイを含む。検出面積中のある位置で「光を放つ」粒子に由来する光は、CCDチップの対応位置におけるピクセルエレメントに影響を及ぼす。エンドユーザーは、試料中の粒子の数に関する情報を、CCDチップから得られた画像データ(照射されたピクセルの数および強度)を処理するコンピュータから受け取る。
【0131】
本発明で用いられる原理をさらに詳しく理解するためには、特定の態様を考慮することが役立つ。図1は、血液試料中のヒトタンパク質サイトカインIL-2の量を定量する方法を示す。光学的に透明なベースを有するマイクロタイターディッシュのウェルを、IL-2分子上のある部位に結合する抗体でコーティングする。IL-2分子を含む1滴の血液をウェルに添加する。蛍光粒子(分子フルオレセインで着色)もウェルに添加する。これらの粒子も、IL-2に特異的に結合する抗体でコーティングする(ただし同抗体は、捕捉抗体が結合する部位とは異なる部位に結合する)。血液中のIL-2分子が、蛍光ビーズと捕捉抗体の両方に結合して、ウェルの底で「サンドイッチ」が形成される。サンドイッチ形成の結果は、蛍光ビーズがウェルの底に結合することである。IL-2が存在しない場合にはサンドイッチは形成されず、ウェルの底に結合する蛍光ビーズは存在しない。血液中のIL-2が多いほど、多くのビーズがIL-2でコーティングされ、より多くのビーズがウェルの底に結合する。次の段階では、これらのビーズの画像を得て、その数を数え上げる。
【0132】
フルオレセインの励起範囲の光でウェルの底(検出面積)を照射することで、ウェルの底に結合している蛍光ビーズによって蛍光放出が誘導される。粒子の蛍光像を収集し、放出光をCCDチップの表面に、拡大することなく当てる。各粒子に由来する蛍光は、1個のピクセル、または少数のクラスターのピクセルに影響を及ぼし、電気シグナルを局在化させる。シグナルはCCDチップからコンピュータへ伝えられ、画像ファイルの状態で保存される。画像解析ソフトウェアが、ウェルの底に結合したビーズの数を、粒子に由来する光に反応したピクセルクラスター数を数えることで列挙する。
【0133】
本発明は、数種類の形態、標識法、カテゴリー結合分子、および検出法を用いる試験を構築するために使用することができる。しかし、このような試験には、共通した複数の重要な特徴がある。本発明の多くの態様に共通した段階および処理を以下に説明する。
【0134】
本発明の一般的な方法は以下の段階を含む:
段階1:試験上の問題を定式化し、試料、試験形態、および1個または複数のカテゴリー結合分子を選択する段階
段階2:標識粒子を調製する段階
段階3:試料中の標的分子を標識粒子に結合させる段階
段階4:標的分子:標識粒子複合体を選択または捕捉する段階
段階5:選択または捕捉された標的分子:標識粒子複合体を検出することで、試料中に存在する標的分子を同定および定量する段階
【0135】
段階1:試験上の問題を定式化し、試料、試験形態、および1個または複数のカテゴリー結合分子を選択する段階
本発明の試験によって解答を得るべき問題を定式化することが、本発明に基づく新しい検出法を作るための最初の段階である。産業微生物学者および臨床微生物学者が対処しなければならない重要な問題の数例を表2に示す。試験上の問題を明確にすることは一般に、検討しなければならない試料(例えば環境中の水、尿、または薬学的最終産物)の種類を決定することである。試料の種類および容量は、試験形態を選択する上で重要なパラメータである。
【0136】
(表2)
【0137】
試験の形態は、試料容量、試料内容(粒子または細胞の存在)、標的のカテゴリー数、使用者の能力段階、費用制約条件を始めとする複数の因子を元に選択される。例には、新しい形態に加えて、周知のラテラルフロー形態およびマイクロタイターディッシュ形態などがある。さまざまな形態を以下の実施例で概説する。
【0138】
試験上の問題を定式化すると、標的分子のカテゴリーが明らかになる。これらは、試験で検出される分子である。低分子量分子(例えば乱用薬物)のパネルの検出、または心血管系疾患のタンパク質マーカーの検出のために試料を調べる試験の場合、標的分子は単に、それぞれ乱用薬物またはタンパク質マーカーである。より複雑な標的(細菌病原体または白血病と関連するタンパク質を含む白血病細胞など)を対象とした試料を調べる試験の場合、標的分子は、標的に特徴的な分子、または標的に特異的な分子である。
【0139】
標的分子のカテゴリーが明らかになれば、カテゴリー結合分子を選択する。カテゴリー結合分子は、標的分子に特異的に結合する。本発明は、さまざまな標的分子に適した多様なカテゴリー結合分子を支持する。例えば、さまざまな標的分子(例えばホルモン、炭水化物、およびタンパク質)を対象としたカテゴリー結合分子として抗体を使用することができる。個人の遺伝子構成を決定する際は、例えばDNAオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【0140】
段階2:標識粒子を調製する段階
光学的に拡大することのない、または高価な装置を組む必要のない、個々の顕微鏡的標的分子を検出する本発明の能力は、標的分子を高いシグナル強度で特異的に標識する段階に依存する。標識段階は、カテゴリー結合分子の結合を介して標識粒子を標的分子に特異的に結合させることによって達成される。標識粒子には、シグナルの発生と特異的な結合という2つの機能性がある。さまざまな粒子状成分、シグナル発生部分、およびカテゴリー結合分子を用いて、これらの機能をもつ標識粒子を調製することができる。
【0141】
段階1で選択された標的分子に結合する標識粒子を調製するためには、カテゴリー結合分子を、当業者に周知の多様な方法で粒子に結合させる(例えばHermanson, G.、Bioconjugate Techniques(Academic Press、1996)、および以下の特定の実施例を参照)。ときにシグナル発生部分を、同じセットの結合法で(例えば酵素シグナル発生部分用に)粒子に結合させる。
【0142】
数多くの種類のシグナル発生部分を用いることで、粒子が、任意の試験に適切な種類の強力なシグナルを放出可能となる。例えば、ポリスチレンビーズ(例えば直径1ミクロン)などの微粒子を、蛍光色素で着色して、蛍光強度の強い粒子を作製することができる。蛍光的に着色されたポリスチレン微粒子(例えば直径1 μm)を数百万の蛍光体シグナル発生エレメントに組み入れることができる。あるいは粒子を、蛍光、化学発光、または視認可能な着色産物の生成を触媒可能なアルカリホスファターゼなどの酵素シグナル発生部分に結合させることができる。他の種類の標識粒子には、量子ドットや共鳴光散乱粒子などがある。このような低分子量の粒子を、より大きな粒子と複合体化させて、シグナル強度およびシグナル複雑度を高めることもできる。
【0143】
数多くの異なるカテゴリーの標的分子を同時にスキャン可能な本発明の能力は、標的分子の異なるカテゴリーに由来するシグナルを識別する能力に基づく。本発明は、標的分子のカテゴリーを2つの一般的な方法で識別する。シグナル弁別と呼ばれる一つの方法では、カテゴリー結合分子の各カテゴリー特異的ファミリーを、固有のシグナル特性をもつようにシグナル発生部分で標識する。多数の異なるシグナル特性(高い「シグナル複雑性」)を生成および検出する能力によって、標的分子の数多くのカテゴリーをスキャンする試験(高多重化試験)の構築が可能となる。標的分子の複数のカテゴリーを識別するもう一つの方法である幾何学的弁別は、標的分子の異なるカテゴリーを、検出面積の異なる領域に沈着させる段階に拠っている。シグナル発生部分のシグナル特性に依存しない場合のある幾何学的弁別は例えば、多重化ラテラルフロー試験に用いられる。幾何学的弁別については、以下の段階4で説明する。
【0144】
本発明は、蛍光、散乱光、偏光、熱放射、化学発光、および放射能を含む、さまざまな種類の「シグナル特性」を使用する場合がある。さまざまなシグナル特性を用いるシグナル発生部分および検出スキームの例を以下に示す。シグナル特性には、複数のシグナルのクラスがある。例えば、シグナル特性が蛍光である場合、さまざまな特徴的な放出スペクトルが、シグナルのクラス(例えば赤色蛍光、緑色蛍光、および青色蛍光)を含む。あるいは、さまざまな濃度の同じ蛍光体で着色された赤色蛍光微粒子も、シグナル特性として蛍光を利用するが、この場合、粒子のさまざまな強度はシグナル特性のクラスを含む。すなわち蛍光強度は、あるグループの粒子を別のグループの粒子と識別するシグナル特性の質である。
【0145】
高い「シグナル複雑度」を達成することは、数多くの種類の標的分子をスキャンする特定の試験(「カテゴリー複雑度」が高い試験)を開発する上で重要である。
【0146】
高いシグナル複雑度の達成
混合物中の識別可能な標識(またはシグナル発生部分)の数は「シグナル複雑度」と呼ばれる。多重性の高い試験では、シグナル複雑度が高いシグナル発生部分を使用することは有利に作用する場合がある。シグナル複雑度を高くするために本発明で用いられる3つの一般的な方法は、(1)個別標識、(2)コンビナトリアル標識、および(3)比率標識である。
【0147】
1.個別標識では、異なるプローブファミリーのプローブに、実験中に他のすべてのシグナル発生部分の存在における検出が容易な一つのシグナル発生部分のタグをつける。これまで、高いシグナル複雑度で個別標識を達成することは困難であった。この問題の生じる原因は、ほとんどの標識法が光学的シグナル(例えば発色性、蛍光、もしくは化学発光のシグナル)、または放射標識を用いることにある。光学的シグナルのスペクトルバンド幅、および現行装置で検出可能なシグナルの範囲が制限されているために、光学的シグナルで解像可能なシグナル複雑度はかなり小さい。例えば、放出スペクトルが異なる数10個の蛍光体の解像は、スペクトルが重複するために現在不可能である。個別標識に使用可能な一つの方法ではマイクロトランスポンダーを使用する(例えば米国特許第6,001,571号)。各マイクロトランスポンダーは、異なる電波サインを放出する。したがって、個別標識を対象としたマイクロトランスポンダー、および他の未開発の方法による標識は、本発明とともに使用される可能性がある。
【0148】
2.本発明で使用される高いシグナル複雑度を達成するための別の方法は、コンビナトリアル標識法の使用である。コンビナトリアル標識は、比較的少数の異なるシグナル発生部分を用いて高いシグナル複雑度を達成する手法である。この方法では、「異なる組み合わせ」のシグナル発生部分を、異なる標的に結合させる。現在、蛍光体は、分子診断に好んで用いられるクラスのシグナル部分である。しかし、(励起スペクトルと放出スペクトルの重複に由来する大部分で生じる)複数の異なる蛍光体の解析段階にかかわる複雑さを考慮すれば、現在実際的な方法は、約7種またはこれ以下の従来の蛍光体を組み入れることだけである。組み合わせて使用することで、7種類の蛍光体を使用して127種類の異なるシグナル(N個の蛍光体で2N-1の組み合わせが得られる)を発生させることができる。高いシグナル複雑度は、他の種類のシグナル発生部分を用いてコンビナトリアル標識で達成することもできる。例えば、異なる色素を含浸させた粒子、異なる別個のサイズのクラスに分類される粒子、または異なる比のシグナルを放出するトランスポンダーを、この方法で使用することができる。蛍光体を用いるコンビナトリアル標識は、ヒトの核型分析に最近良好に適用されている(Speicherら1996、前掲;Schrockら、1996、前掲)。コンビナトリアル標識実験を解析するための装置およびソフトウェアは市販されている。
【0149】
3.高いシグナル複雑度は、比率標識法(Fultonら、1997、前掲)を用いることでも得られる。比率標識では、コンビナトリアル標識と同様に、比較的少数の異なるシグナル発生エレメントを用いることで、多くの異なる種類のシグナル発生部分が生じる。コンビナトリアル標識とは対照的に、比率標識におけるシグナル発生部分は、シグナル発生エレメントの比によって区別される。例えば、励起/発光の特性が異なる2種類の蛍光体XとYを用いて、ポリスチレン粒子を着色することができる。さまざまな相対濃度の蛍光体([X]、[Y])を異なる一群の粒子に適用する。例えば、8種類の異なる濃度のXと、8種類の異なる濃度のYを用いて、64クラスの識別可能な粒子を生じるあらゆる組み合わせ(X1Y1、X1Y2、X8Y7、X8Y8)で粒子を着色することができる。少数のシグナルの種類しか使用する必要がないので、比率標識では装置を単純化できる。蛍光体以外で、また非光学的シグナルエレメントを含むシグナルエレメントを用いることで、非標識法で高いシグナル複雑度が得られる場合もある。
【0150】
段階3:試料中の標的分子を標識粒子と結合させる段階
試料中の標的分子を標識粒子と結合させる、この方法および形態は、試料の種類、標的分子の性質、および試験の選択された形態に依存する。
【0151】
本発明の重要な属性は、迅速で簡単な試料調製プロトコルとの互換性である。実際に多くの応用で、試料の調製は必要とされない。この事実は、酵素阻害物質を除去するために厳密な試料調製手順が必要な核酸増幅ベースの手法などの、他の高感度診断法をしのぐ大きな利点である。例えば、可溶性分子マーカーを検出するために試料を調べる試験は、標識粒子との結合前に、任意の試料調製を必要としない場合がある。標的分子が、大きな複合体の一部であるか、または大きな複合体中に隔離されている一部の試験では、より大きな複合体を、試料調製段階の一部として解離させることができる。例えば、HIVウイルスの内部に存在するウイルスコアタンパク質の存在を調べる試験の場合、界面活性剤を用いてウイルス粒子を解離させることができる。同様に遺伝子解析の場合は、一般に核酸標的分子を含む細胞を(例えば、さまざまな化学的処理または物理的処理によって)分解して開き、2本鎖DNAを変性させて核酸ハイブリダイゼーションを可能とする。
【0152】
本発明で用いられるさまざまな形態には、標識粒子と、試料中の標的分子の迅速な結合を可能とする利点がある。例えば、大量の標識粒子と、液体試料中の標的分子を接触させることは、標的分子が通常、衝突が起こる前に反応チャンバーの一端に拡散する典型的なELISA形態と比較して衝突をかなり速く誘導する。迅速な結合の動力学も、接触段階が多孔性膜内で進む試験形態(例えばラテラルフロー試験)の特徴である。
【0153】
段階4:標的分子:標識粒子複合体を選択または捕捉する段階
選択段階には、標的分子:標識粒子複合体を非結合状態の標識粒子から分離すること、標的分子:標識粒子複合体を検出ゾーン(例えば、いくつかの態様における光学的システムの焦平面)中に沈着すること、試料材料を標的分子:標識粒子複合体から除去すること、ならびに(いくつかの試験形態で)標識標的分子の特定のカテゴリーを、検出面積の異なる領域に局在させることを含む複数の重要な機能がある。
【0154】
試料を固体基質に固定させてから結合段階へ進むアッセイ法の場合、非結合状態のカテゴリー結合分子、およびシグナル発生部分は一般に洗浄して除去する。この例には、インサイチューハイブリダイゼーション、および免疫細胞化学的方法を用いる応用がある。
【0155】
他の試験形態は、液相中、例えばマイクロタイターウェル中で実行される。一部の試験では、マイクロタイターウェルの検出表面上の分子を捕捉するために、標的分子:標識粒子複合体と捕捉分子の結合を介して選択段階を行う。このような試験では、拡散が捕捉分子との接触を行う手段となる。他の応用では、標的分子/カテゴリー結合分子/シグナル発生部分の複合体を表面上に沈着させる。標的分子複合体を表面上に沈着させる方法には、遠心、濾過、重力沈降、磁気選択、またはカテゴリー結合分子(例えば捕捉抗体)が結合した表面との結合などがある。例えば磁気分離などの場合によっては、異なる部分、選択部分が使用される。選択部分の例には、カテゴリー特異的抗体でコーティングされた磁気微粒子がある。非結合状態のカテゴリー結合分子およびシグナル発生部分は一般に液相中に留まるので除去可能である。しかし、検出手順(例えば光学的画像化)が固体表面を狭い被写界深度で選択的に解析する場合は、非結合状態の材料(焦点面の外側に存在する)は、除去する必要がない場合がある。
【0156】
いくつかの応用では、選択手順を組み合わせることが有用である。例えば、試料を一定の孔径をもつ膜で濾過してから、標識粒子に接触させることができる。例えば、大きさが約0.5〜5ミクロンの粒子のみを通過させるフィルターシステムを、不詳の細菌の存在を検出するために使用することができる。このような試験は、例えばチロシンを含む任意のタンパク質に結合する標識粒子に基づく場合がある。他の大きさの範囲を選択することで、不詳のウイルス、遊離タンパク質、または真核細胞を対象とした試験が可能となる場合がある。
【0157】
ラテラルフロー形態およびフロースルー形態は、おそらくポイントオブケア試験における最も成功した試験形態である。これらの形態では、吸水性膜(bibulous membrane)における毛細管流動の利点が利用される。これらの形態では一般に、捕捉分子(表面に結合した状態のカテゴリー結合分子)を用いて標的分子:標識粒子複合体が選択される。非結合状態の標識粒子は、毛管作用によって捕捉ゾーンから流れ出す。膜ベースのアッセイ法の別の重要な利点は、幾何学的弁別を用いた多重化が容易であることである。
【0158】
幾何学的弁別は、(多重化試験で)標的分子の複数のカテゴリーの検出を目的に試料を調べる際の重要な方法である。幾何学的弁別には、シグナル複雑度の高い多重化試験(段階2参照)と比較したときに、多重化試験の場合に一つのシグナル特性しか必要ないという利点がある。幾何学的弁別を用いる典型的な免疫アッセイ法では、異なるカテゴリー特異的捕捉抗体を、検出ゾーン内の異なる面積に沈着させる(例えば、ラテラルフロー試験における異なるストライプ、またはフロースルー試験またはマイクロタイターウェルベースの試験における異なるスポット)。したがって、標的分子の異なるカテゴリーが、捕捉ゾーンの、異なる所定の領域で捕捉される。捕捉抗体に類似した捕捉部分の他の種類には、抗原、リガンド、および核酸がある。マイクロ流体チャネルを用いる形態や、「捕捉スレッド」(捕捉分子でコーティングされた薄いストリップの材料)を用いる形態を含む他の形態も幾何学的弁別に使用することができる。
【0159】
段階5:選択または捕捉された標的分子:標識粒子複合体を検出することで、試料中に存在する標的分子を同定および定量する段階
この段階では、検出ゾーンに結合する標的分子:標識粒子複合体の大面積画像化解析で、試料中の標的分子が検出、同定、また定量される。この段階そのものは一般に、画像化、画像解析、およびレポート作成の段階を含む。
【0160】
本発明は、「顕微鏡的」標識粒子を「拡大せずに」検出することができる。このような強力な特性は、微小なコロニーから放出された光子を、光検出器アレイの少数のピクセル中に誘導する強度の高い標識法、および効率の高い光学系によって支持される。低拡大画像化は、大面積の画像化を促進し、ひいては大量の試料のスキャニングを促す。
【0161】
使用される画像化法は、段階2で選択されるシグナルの発生の種類に依存する。例えば、画像化過程は、シグナル発生に用いられる光学的特性またはシグナル発生特性に依存して異なる。いくつかのシグナル特性(例えば反射率、蛍光、光散乱、または吸光)の場合、検出ゾーン内の複合体には光源を照射しなければならない。他の特性(例えば化学発光や熱放射)の場合は、照射は必要ない。
【0162】
個々の標識粒子の検出は、通常定量的で超高感度である。数量化は、写真もしくはデジタル画像中の個々の標識粒子を手作業で数えることで、またはデジタル化された画像の自動画像解析を行うことで達成できる。試料全体におけるシグナル強度を統合することでも標的細胞を定量可能である。シグナルの統合は、高濃度の標的細胞を含む試料に特に有用である。このような場合、同時発生的なシグナルを分解することは常に可能というわけではない。
【0163】
標識粒子のサインを解読することで、標的細胞の多数のカテゴリーの同定が可能となる。この段階の重要な目的は、標的分子:標識粒子複合体のサインを決定することで、試料中の標的細胞のカテゴリーを同定することである。
【0164】
図1に示したCCDカメラをベースとしたイメージャーは、蛍光をシグナル特性として用いる場合に大面積画像化に有用な装置である。この装置を用いて、以下の例の多くのデータを収集した。励起光は、強度の高い白色光源(1000 W Xenonアークランプ、モデルA-6000、Photon Technology社、Monmouth Junction、NJ)から光を液体光導体(コア直径5 mm、モデル380、Photon Technology社、Monmouth Junction、NJ)に引き込むことで供給される。液体光導体は、励起フィルターホイール(BioPoint FW、Ludl Electronics、Hawthorne、NY)へ光を伝え、フィルターを通過したビーム(例えば直径9 mmまたはこれ以上)を、標識粒子を含む検出表面に導く。この装置で、さまざまな構成(例えば、多孔性膜、顕微鏡スライド、カバースリップ、もしくはチューブ、または平坦で光学的に透明な底面をもつウェル上、または内部)で標識粒子を検出することができる。入射光が検出表面を照らして、標的細胞内の蛍光を促す。放出された蛍光の一部が、集光効率の高いレンズシステムで集められ、放出フィルターホイール(BioPoint FW、Ludl Electronics)を通してCCDカメラ(Orca II、Hamamatsu、Bridgewater、NJ)に伝えられる。光学系の設計および構築は、当業者に周知の原理および手順に基づく。
【0165】
本発明は、他の種類の光検出器および他の構成を組み入れることもできる。画像化システムの感度は、より高い感度のカメラ(例えば、低温に冷却されたカメラや、背面薄板化型チップを用いるカメラ)を選ぶことで高められる。あるいは、検出感度および解像度を、ラインスキャニングシステム(例えばBT Image Array;Hamamatsu))を使用することで高めることができる。ラインスキャニングでは、リニアCCD、または光ダイオードアレイ(例えば1×500ピクセル、または1×1000ピクセル)を用いて画像を得る。一次元の解像度は、アレイ要素の数に対応し、二次元は一般に、試料スライドをリニアアレイの下で垂直方向に動かすことで得られる。要素は少ないので、類似の高感度リニアアレイは典型的には、エリア形態CCDカメラと比較してそれほど高価ではない。
【0166】
図3に示された装置を構成して、X-Y位置決めステージ(BioPoint XY、Ludl Electronics)を用いて実験試料を励起光学系および収集光学系の上を動かすことで複数の試料を測定することができる。Image-ProおよびImage-Proアドインで、すべての装置の要素および画像獲得を制御する。フィルターホイールは、ScopeProアドイン(Media Cybernetics、Baltimore MD)、およびStageProアドイン(Media Cybernetics、Baltimore MD)のハンドルステージによる位置決めによって動かし、カメラコントロールは、Hamamatsu Orca IIドライバー(Hamamatsu、Bridgewater、NJ)で行う。Image-Pro Plusも、後述する画像の処理および解析に使用される。
【0167】
白色光照射を行う本発明の態様では、個々の蛍光体について最適な励起ピークを提供するスペクトルフィルターを使用する。白色光スペクトルは広いので、さまざまな蛍光体を選択して、放出スペクトルの重複を除くことができる。典型的には、白色光照射装置で達成可能なスポットの大きさ(例えば2 mm〜5 mm)が大面積画像化に適している。フィルターの交換は比較的簡単で自動化可能であり、また白色光システムは適合性が高いため、同じ装置を用いて、個別の一群の蛍光体を用いる試験の実施が可能となる。
【0168】
図3に示すシステムの集光効率は、収集対物レンズと集光レンズの2つの要素からなる特注の収集光学系を組み入れることで最大となる。集光対物レンズは集光効率が高く(≧f#/1.2)を有し、比較的平行なビームを発する。集光レンズは、集光対物レンズに由来する光出力を捉え、これをCCDの検出表面に集中させる。このレンズは2つの部分から設計されており、フィルターホイールを集光レンズの経路に挿入することができる。本発明のある態様の場合、例えばフィルター交換を必要としない態様では、高い集光効率を達成するためにテーパーのついた光ファイバー束を含めることが望ましい場合がある。光ファイバー束は、試料の近くに光を集める繊維と、光をCCDチップに直接導くチャンネルを含む。あるいは本発明は、(背面薄板化型CCDチップの背面に対する感度を高めるために)試料をCCDチップに直接適用するか、またはCCDチップの極めて近傍に適用する直接近位検出で、シグナルを極めて高感度に検出することができる。
【0169】
白色光を用いる上述のマルチスペクトルシステムに加えて、発明者らは、非拡大大面積画像化用の単色蛍光画像化システムを開発した。図4に示すシステムでは、532 nmのFrequency-Doubled Diode Laser(50 mW、モデル#BWT-50E、B&W Tek、Newark、DE)によって励起光が供給される。この検出で用いる色は1色なので、フィルターホイールは必要ない。1枚の励起フィルターが、レーザー出力(モデルHQ532/10x、Chroma Technology、Brattleboro、VT)から調和スペクトル(harmonic spectra)を除去し、また1枚の発光フィルター(モデルHQ620/60m、Chroma Technology、Brattleboro、VT)によって、特定波長のみをCCDカメラへ伝えることが可能となる。このシステムでは画像を得るために、上述の機器に代えて比較的安価なCCDカメラ(モデルKX-2E、Apogee CCD、Auburn、CA)を使用することもできる。この装置は、複数のレーザーおよびフィルターセットを装着することで、多色解析に容易に対応させることができる。
【0170】
本発明に組み入れられたCCDカメラは一般に、カメラのノイズ発生を最小限に抑えるために、10秒〜約2分間(カメラの感度に依存)の十分な統合時間で、-5℃〜-50℃の温度に冷却する。一般に統合時間が長くなると、蛍光体から長時間かけてから放出された光子の収集を可能となることで感度が高くなる。長い統合時間はラインスキャニングには適していないが、量子効率が極めて高く、高感度な背面薄板化型リニアアレイが利用可能である。
【0171】
本発明は、シグナルを検出および解読する目的で干渉計ベースのスペクトル画像化を使用することもできる(Schrock, E.、1997、前掲)。この手法では、シグナル発生部分によって放出または散乱された光が2つの経路に分けられ、プリズムを通り(異なる波長が異なる距離を通ることになる)、また再結合させて干渉パターンを生じさせることができる。干渉パターンのフーリエ解析によって、画像の各点におけるスペクトログラフが得られる。
【0172】
携帯型システムを必要とする応用を含むポイントオブケア応用の場合、本発明は、重量および大きさが最小となるように構成することができる。一部の態様では、装置を組み立てる必要が全くない(例えば、標識粒子を色の検出によって可視化する場合)ほか、装置を(例えば電気的検出器に代えてインスタントフィルムを使うことで)大きく単純化することができる。望ましいならば、フィルム上に集めた画像を、データ保管およびデジタル画像解析の目的で、市販のスキャナーでデジタル化することができる。あるいは、近位画像化(光検出器を検出ゾーンに対して基本的に反対側に配置する)により、光学系なしに光検出器を使用することができる。携帯性を最大とするために、非照射依存のシグナル発生特性(例えば化学発光)をもつ標識粒子を用いることで光源を除くことができる。
【0173】
デジタル画像を得る本発明の態様では、コンピュータソフトウェアで標的標識粒子を同定および定量する。異なるクラスの蛍光シグナル発生部分を用いる典型的なアッセイ法では、このようなソフトウェアが、適切な蛍光体特異的な画像に重ね合わせ、どのサインまたはシグナルの組み合わせが各標的標識粒子から放出されたかということを決定することで標的細胞を同定し、ならびに試料中に存在する標的標識粒子の各カテゴリーを列挙する。このようなソフトウェアでは以下の機能も可能な場合がある:(1)照射の不均一性を修正すること、(2)逆重畳積分マトリクスにより蛍光のクロストークを修正すること、(3)位置合わせマーク(例えば基質上に位置するもの)を用いて画像を並べること、(4)参照表(look up table)と比較して試料中の画像を得た各標識粒子にIDコードを割り当てること;(5)画像を得た試料のバーコードを記録することして試料を同定すること;ならびに(6)出力データ、画像、およびバーコードを、例えばウェブブラウザインターフェイスで問い合わせ可能なデータベースに自動的に保存すること。市販の画像解析パッケージを用いることで、これらの機能を入手できる。多色画像解析用のソフトウェアパッケージを使用することができる(例えばImage-Pro、Media Cybernetics;MetaMorph、Universal Imaging;MatLab;The MathWorks)。
【0174】
以下に示す多くの例で収集された蛍光データの解析に使用されたソフトウェアパッケージおよび方法について、本明細書で概説することは有用である。検出表面の画像を得ることで、蛍光対象物および/または全蛍光シグナルの数が決定される。蛍光を検出ゾーンからCCDカメラで得て、ピクセルの位置および強度の記録を含むTIFF(Tagged Image File Format)画像ファイルに保存した。3つの方法でアッセイ法の結果を定量した。画像を得た検出ゾーンの統合されたシグナル全体を、全ピクセルに由来する蛍光シグナルを合計することで決定した。試料に由来する統合されたシグナルを、陰性対照のシグナルと比較した。統合されたシグナル全体を測定することは、数多くの標的分子を含む試料について特に有用である。第2の方法は、検出ゾーン内の蛍光対象物を数えることであった。第3のアプローチは、蛍光対象物に含まれる全ピクセルの強度を(画像中の全ピクセルの強度を合計するのではなく)統合することであった。すべての画像解析はImage-Proバージョン4.0(Media Cybernetics、Silver Springs、MD)を用いて行った。
【0175】
IPP Image-Proのマクロ言語を用いることで、上述の有用性を自動化して、複数の画像の同時バッチ処理が可能となる。またデータを、ユーザー定義による他のIPPスクリプトで操作することができる。例えば、ある大きさ(面積)または強度の上下の対象物を含めたり除外したりすることができる。これは、塵の除去に有用なツールとなりうる。対象物の定義(例えば受け入れ基準および拒絶基準)を決定する画像解析に重要な他のパラメータは、応用によって変わり、適宜最適化すべきである。
【0176】
本発明のさまざまな局面は、上述の段階を結びつけて自動化することができる。これについては、薬学分野で使用される注射用水、または臨床的尿試料などの液体試料を解析する応用を考慮されたい。このような自動化システムによって、試料を自動的に収集し、標識粒子と接触させ、選択段階を適用し、画像を得て解析し、ならびに結果を報告できると考えられる。あるいは本発明の個々の機能を自動化することができる。例えば、容器を画像化装置に自動的に据えたり外したりするモジュール、および自動合焦用のモジュールをシステムに組み込むことができる。
【0177】
実施例
以下の例は、さまざまな応用と関連して使用するための、本発明のさまざまな態様を実施するための技術的詳細を提供するものであり、制限する意図はない。
【0178】
実施例1.電気的検出、インスタントフィルムによる検出、および特別の装置を使用しない視覚的検出による、拡大を伴わない各顕微鏡的標識粒子の検出
背景および目的
低濃度の標的分子を定量する本発明の能力は、部分的には、大きな検出面積中に存在する「個々の」顕微鏡的標的分子を、高倍率の拡大を行うことなしに検出および列挙する本発明の能力に基づく。この実施例の目的は、これを本発明がCCD光検出器アレイ、インスタントフィルム、および単純な視覚的検出などのさまざまな検出手段で達成可能であることを示すことにある。
【0179】
これらの実験に用いる標識粒子は、抗体および酵素アルカリホスファターゼでコーティングされたラテックス粒子とした。膜上に配置したビーズを、化学発光または発色(紫色)産物をそれぞれ生じるアルカリホスファターゼの基質の化学発光基質または発色性基質のいずれかによって処理した。化学発光標識粒子が付着した膜の画像は電気的に、またはインスタントフィルムを用いて得た。また発色性標識粒子が付着した膜は肉眼で観察した。
【0180】
実験方法
抗体分子および酵素分子でコーティングされた粒子を、ビオチン化アルカリホスファターゼ(5 μlの2.9 mg/mlストック;Pierce;カタログ番号29339)、およびビオチン化ヤギ抗大腸菌O157抗体(5 μlの1.0 mg/mlストック;Kirkeguard and Perry Laboratories;カタログ番号01-95-90)の両方を、ストレプトアビジンでコーティングされた粒子(108個の粒子;Bangs;0.95 μm、非蛍光性;カタログ番号CP01N)に添加することで作製した。この容積をPBSを添加して100 μlとした。30分のインキュベート後に粒子を2回洗浄した。洗浄は、微量遠心(3000 g、5分)による粒子の沈降と、これに続く上清の廃棄、および粒子のPBS(100 μl)への再懸濁からなる。二重にコーティングされた粒子の作製後に、このビーズを約50個、および500個となるように希釈した。各希釈物の3つの複製と、ビーズを含まない対照を用意し、それぞれをPBS(50 ml)に添加し、0.2 μm孔径のニトロセルロース膜を真空ポンプおよびプラスチックファネルカップ(Millipore Microfil V User Guide、PF07114、Rev A 3/00)を用いて濾過した。BM Purpleアルカリホスファターゼ基質(500 μl;Roche;カタログ番号1442074)を1セットのフィルターに添加した。別のフィルターセットにCDP-star(500 μl;NEN;カタログ番号NEL-601)を加えた。BM Purpleの1時間のインキュベート後に膜を水で洗浄し、残存するBM Purpleを除去して膜を風乾した。CDP-star膜を、SpotLightカメラ(Boston Probes;カタログ番号DT10000)に、製造業者の指示書通りに据え、ASA 2000フィルム(Boston Probes;カタログ番号DT20000)を2分間感光した。次に同じフィルターを非拡大大面積画像化で観察した。Image-Pro Plusソフトウェア、バージョン4.1(Media cybernetics)を用いてCCDイメージャーから画像を得て処理した。
【0181】
結果
図5は、カテゴリー特異的結合分子および酵素シグナル発生部分と結合した二機能性粒子が、発色性または化学発光性のシグナルエレメントのいずれかを用いて検出可能であることを示す。単一標識粒子を肉眼であっても観察できる能力は、各標識粒子上に多数の酵素分子が存在することに起因する。この例は、簡単でユーザーフレンドリーで費用効果が高く、また特別の機器を必要としない超高感度のポイントオブケア試験を提供する可能性を本発明が秘めていることを示す。
【0182】
実施例2.非拡大大面積画像化による少数の細菌の検出
背景および目的
この実施例は、本発明を使用して、ユーザーフレンドリーなラテラルフローアッセイ法形態、および非拡大大面積画像化で少数の細菌を迅速に検出できることを示す。ラテラルフローアッセイ法は、診断分野で20年以上にわたって用いられている。このような単純なアッセイ法は、抗原:抗体相互作用による、特定の標的(または分析物)の存在の検出に拠っている。ラテラルフロー用のストリップは単純ではあるが、多くの診断分野において、ELISA免疫アッセイ法および核酸増幅法と匹敵するほどの感度がない。
【0183】
この実施例では、細菌溶解物(大腸菌O157:H7)のさまざまな希釈物を、標識粒子を含む結合体パッド(conjugate pad)(大腸菌O157:H7特異的抗体でコーティングされた蛍光着色ラテックス粒子)、捕捉抗体ライン、および標的分子を含まない標識粒子と結合する捕捉抗体を含む陽性対照ラインを含む多孔性膜ストリップに適用した。試験を実施後に、大面積非拡大画像化で捕捉ラインおよび対照ラインの画像を得た。
【0184】
実験方法
ラテラルフロー試験ストリップを、ラテラルフローキット(Millipore;High Flow Mid Range Assembly Kit、カタログ番号HFMIDAK015)中に含まれる指示書にしたがって組み立てた。手短に説明すると、吸い上げパッド(wicking pad)、結合体パッド、および試料パッドをラテラルフロー膜上に配置し、これを接着性支持カード(adhesive support card)に接続した。以下の2ラインの捕捉抗体を、膜ストリップを越えて、膜(吸い上げパッドから5〜10 mm)に適用して、抗体ラインを作製した。一つは、大腸菌O157:H7のライン(捕捉ライン;8 cmのラインあたり10 μlの1 mg/ml溶液、BioTrace アフィニティ精製済み;Kirkegaard & Perry Laboratories、カタログ番号01-95-90)で、もう一つは、陽性対照のライン(対照ライン;8 cmのラインあたり10 μlの1 mg/ ml溶液、Jackson Immuno Research Laboratories社;ビオチン抗ヤギIgG、カタログ番号115-165-146)。このラインを、使用前に乾燥させた(少なくとも15分)。ストレプトアビジン標識蛍光ビーズ(Bangs Laboratories社、カタログ番号CP01F-5121)を、ビーズ(1.23×1011/mlを10 μl、抗体(1.0 μg/mlストックを10 μl)、およびPBS(80 μl))と組み合わせて混合(1.5時間/室温)することで、ビオチン抗大腸菌O157:H7抗体(BioTrace、アフィニティ精製済み;Kirkegaard & Perry Laboratories、カタログ番号01-95-90)で標識した。次にビーズを遠心し(5000 g、10分)、PBS-B(100 μl)に再懸濁した。抗大腸菌抗体でコーティングした蛍光ビーズ(2 μl)を各ストリップの結合体パッドに添加した。ホルムアミドで固定された大腸菌O157:H7細胞(Strain DEC 3B、Pennsylvania State UniversityのTom Whittam博士、109細胞/ml)のストックをPBSで段階希釈した。次に段階希釈液(100 μl)を溶解溶液(100 μlの200 mM NaOH/1% SDS)に添加し、3分間静置した。PBS-B(800 μl)を添加して溶解溶液を中和した。試験試料(溶解後の大腸菌希釈液を100 μl)を、PBS-TB(50 μl)と混合し、試験ストリップの試料パッドに添加した。この試料は試料パッドを通って、蛍光ビーズが試料フロー中に統合された結合体パッドに移動した。次に同試料は、捕捉ラインおよび対照ラインを介して試験膜中に、そして最終的に吸い上げパッド中に進んだ。アッセイ法(約15分)を行った後に、ストリップをCCDベースのイメージャー(「詳細な説明」の段階5に記載、図3参照)上に配置することで、細菌が照射源およびCCDチップに面するようにして膜の画像を得た。このストリップの画像を非拡大大面積画像化で得た。この画像をImage-Proソフトウェアで解析した。
【0185】
結果
図6は、細菌を検出する目的のラテラルフロー試験の結果を示す。図は、代表的なストリップの捕捉ラインおよび対照ラインの画像を示す。左側のストリップは、細菌を含まない陰性対照試料の解析結果を示す。陰性対照を、1000個と10,000個の大腸菌をそれぞれ含む中央および右側のストリップと比較すると、細菌数の増加に伴い、捕捉ラインに由来するシグナルも高まることが明らかである。下の棒グラフは、添加した大腸菌数に関して5回の反復実験の平均から得られたシグナルを示す。誤差バーは、反復シグナル間における3標準偏差誤差を示す。このデータは、検出限界が、市販の試験法と比較して10〜100倍高感度である1000個の細菌であることを示す。
【0186】
実施例3.低濃度のタンパク質を非拡大大面積画像化で検出する目的の超高感度ラテラルフロー試験
背景および目的
タンパク質マーカーを対象とする、より高感度で迅速な試験に関しては、未だ対処されていない要求が存在する。この実施例は、ユーザーフレンドリーなラテラルフローアッセイ法形態、蛍光標識粒子、および非拡大大面積画像化により、低濃度のタンパク質(IL-2)を迅速に検出する目的に本発明を使用することを示す。試料に含まれる低濃度の標的タンパク質を検出および定量することは、ヒト疾患(例えば癌および心血管系疾患)の新たなマーカーの発見に伴い、より重要になりつつある。
【0187】
実験方法
ラテラルフロー試験ストリップを、実施例2と同様に組み立てた。抗体を膜に適用し、IL-2特異的捕捉ライン(Pharmingen、カタログ番号554424)、および陰性対照ライン(Jackson Immuno Research Laboratories社;ビオチン抗マウスIgG、カタログ番号115-165-146)を膜上に吸い上げパッドから5〜10 mmの距離に作製した。このラインを、使用前に乾燥させた(少なくとも15分)。ストレプトアビジン標識蛍光ビーズ(Bangs Laboratories社、カタログ番号CP01F-5121)を、ビーズ(1.23×1011/ml を10 μl、抗体(1.0 μg/mlストックを10 μl))とPBS(80 μl)を混合する(1.5時間/室温)ことで、ビオチン抗IL-2抗体(Pharmingen;カタログ番号554426)で標識した。次にこのビーズを遠心し(5000 g、10分)、PBS-B(100 μl)に再懸濁した。抗IL-2抗体でコーティングした蛍光ビーズ(2 μl)を、各ストリップの結合体パッドに添加した。IL-2のストック溶液(Pharmingen;Recombinant Mouce IL-2、カタログ番号550069)をPBS-Bで段階希釈した。試験試料(IL-2希釈物を100 μl)をPBS-TB(50 μl)と混合し、試験ストリップの試料パッドに添加した。試験を実施した後に(約15分)、ストリップの画像を実施例2に記載の手順で得た。この画像をImage-Proソフトウェアで解析した。
【0188】
結果
図7は、IL-2を対象としたラテラルフロー試験の結果を示す。図は、代表的な試験ストリップの捕捉ラインおよび対照ラインの画像を示す。左側のストリップは陰性対照(IL-2非添加)を示す。陰性対照を、2 pg/mlと20 pg/mlのIL-2をそれぞれ含む試料である中央および右側のストリップと比較すると、IL-2量の増加に伴い、捕捉ラインに由来するシグナルも高まることが明らかである。下の棒グラフは、添加したIL-2量に関して5回の反復実験の平均から得られたシグナルを示す。誤差バーは、反復シグナル間における3標準偏差誤差を示す。このデータは、試験がIL-2を、市販の試験法と比較して10〜100倍高感度である2 pg/mlの濃度で検出可能なことを示す。
【0189】
実施例4.血清中の低濃度のタンパク質を非拡大大面積画像化で検出する目的の超高感度ラテラルフロー試験
背景および目的
複合試料に関して標的分子を検出することは、多くの応用で重要である。この実施例は、血清中に低濃度で含まれるIL-2の、迅速でユーザーフレンドリーなラテラルフロー形態および非拡大大面積画像化による検出に本発明を用いることを示す。後述する実験では、血清中のIL-2を、蛍光標識粒子を用いて検出した。
【0190】
実験方法
ラテラルフロー試験ストリップを、実施例3と同様に組み立てた。抗体を膜に適用し、IL-2特異的捕捉ライン(Pharmingen、抗IL-2モノクローナル抗体、カタログ番号554424)、および対照ライン(Jackson Immuno Research Laboratories社;ビオチン抗マウスIgG、カタログ番号115-165-146)を吸い上げパッドから5〜10 mmの距離に作製した。このラインを、使用前に風乾させた(少なくとも15分)。ストレプトアビジン標識蛍光ビーズ(Bangs Laboratories社、カタログ番号CP01F-5121)のビオチン抗IL-2抗体(Pharmingen;カタログ番号554426)による標識を、ビーズ(10 μlの1.23×1011/mlストック)、抗体(10 μlの1.0 μg/mlストック)、およびPBS(80 μl)を混合する(室温で1.5時間)ことで行った。次にこのビーズを遠心し(5000 g、10分)、PBS-B(100 μl)に再懸濁した。抗IL-2でコーティングした蛍光ビーズ(2 μl)を、各ストリップの結合体パッドに添加した。IL-2のストック溶液(Pharmingen;組換え型マウスIL-2、カタログ番号550069)を、血清(Fitzgerald Laboratories;正常ヤギ血清、カタログ番号88-NG22)で段階希釈した。試験試料(IL-2希釈物を100 μl)をPBS-TB(50 μl)と混合し、試験ストリップの試料パッドに添加した。試験を実施した後に(約15分)、ストリップの画像を実施例2に記載の手順で得た。この画像をImage-Proソフトウェアで解析した。
【0191】
結果
図8は、血清中のIL-2を対象としたラテラルフロー試験の結果を示す。図は、代表的な試験ストリップの捕捉ラインおよび対照ラインの画像を示す。左側のストリップは陰性対照を示す。陰性対照を、中央(20 pg/ml)および右側(200 pg/ml)のストリップと比較すると、IL-2量の増加に伴い、捕捉ラインに由来するシグナルも高まることが明らかである。下の棒グラフは、添加したIL-2量に関して5回の反復実験の平均から得られたシグナルを示す。誤差バーは、反復シグナル間における3標準偏差誤差を示す。このデータは、本発明が血清中のIL-2を20 pg/ mlの濃度で検出可能なことを示し、また同アッセイ法が、複合試料中であっても極めて低濃度の標的タンパク質を検出可能なことを示す。
【0192】
実施例5.タンパク質および細菌の多重検出を非拡大大面積画像化で検出する目的の超高感度ラテラルフロー試験
背景および目的
標的分子のパネルの存在を調べる試験の要求は大きい。この実施例は、性感染症の原因となる、さまざまな微生物、乱用薬物のパネル、および一連の細菌戦作用因子の検出を目的に試料を調べる試験である。この実施例は、低濃度の大腸菌およびIL-2を、ユーザーフレンドリーなラテラルフローアッセイ法形態、蛍光標識粒子、および非拡大大面積画像化で、迅速かつ同時に検出するために本発明が用いられることを示す。
【0193】
実験方法
ラテラルフロー試験ストリップを、実施例2と同様に組み立てた。抗体を膜に適用し、大腸菌O157:H7(BioTraceアフィニティー精製; Kirkegaard & Perry Laboratories、カタログ番号01-95-90)、およびIL-2(Pharmingen、カタログ番号554424)の捕捉ラインならびに対照ライン(Jackson Immuno Research Laboratories社;ビオチン抗ヤギIgG、カタログ番号115-165-146)を吸い上げパッドから5〜10 mmの距離に作製した。このラインを、使用前に乾燥させた(少なくとも15分)。IL-2蛍光ビーズ(IL-2ビーズの作製手順については実施例3を参照)、および大腸菌蛍光ビーズ(大腸菌ビーズの作製手順については実施例2を参照)の両方(各2 μl)を、各ストリップの結合体パッドに添加した。試験試料(100 μlの大腸菌またはIL-2の希釈物)をPBS-TB(50 μl)と混合し、試験ストリップの試料パッドに添加した。試験を実施した後に(約15分)、ストリップの画像を実施例2に記載の手順で得た。この画像をImage-Proソフトウェアで解析した。
【0194】
結果
図9は、非拡大大面積画像化による多重化ラテラルフロー試験の結果を示す。図は(左から右へ)、大腸菌とIL-2の両方を含む試料、大腸菌のみを含む試料、IL-2のみを含む試料、大腸菌とIL-2のいずれも含まない試料が適用された試験ストリップの捕捉ラインおよび対照ラインの画像を示す。この図は、ラテラルフロー試験が、複数の標的分子を同じアッセイ法で検出可能なことを示す。
【0195】
実施例6.低濃度のウイルスを非拡大大面積画像化で検出する目的の超高感度のラテラルフロー試験
目的
この実施例は、本発明が、ユーザーフレンドリーなラテラルフロー形態、および非拡大大面積画像化による少数のウイルス粒子の迅速な検出にどのように使用可能かということを示す。後述する実験では、溶解したインフルエンザウイルスの希釈物を含む試料を、蛍光標識粒子および大面積画像化で検出する。
【0196】
実験方法
ラテラルフロー試験ストリップを、実施例2と同様に組み立てる。抗体ラインの作製を、A型インフルエンザ特異的捕捉ライン(QED、カタログ番号1302)、および対照ライン(Jackson Immuno Research Laboratories社;ビオチン抗マウスIgG、カタログ番号115-165-146)の両方を膜上に吸い上げパッドから5〜10 mmの距離に適用することで行う。このラインを、使用前に乾燥させる(少なくとも15分)。ストレプトアビジン標識蛍光ビーズ(Bangs Laboratories社;カタログ番号CP01F-5121)のビオチン抗A型インフルエンザ抗体(Virostat;カタログ番号1307)による標識を、ビーズ(10 μlの1.23×1011/mlストック)、抗体(10 μlの1.0 μg/mlストック)、およびPBS(80 μl)を混合する(1.5時間/室温)ことで行う。次にこのビーズを遠心し(5000 g、10分)、PBS-B(100 μl)に再懸濁する。抗A型インフルエンザでコーティングした蛍光ビーズ(2 μl)を、各ストリップの結合体パッドに添加する。精製済みのA型インフルエンザ(Advanced Biotechnologies社:A型インフルエンザ/PR/8/34(H1N1)、カタログ番号10-210-000)のストック溶液を溶解し(Aoyagi, K.、C. Ohueら(1999). J Clin Microbiol 37(6):1802-8)、PBS-Bで段階希釈する。試験試料(IL-2希釈物を100 μl)をPBS-TB(50 μl)と混合し、試験ストリップの試料パッドに添加する。試験を実施した後に(約15分)、ストリップの画像を実施例2に記載の手順で得る。この画像をImage-Proソフトウェアで解析する。
【0197】
実施例7.低濃度のタンパク質をインスタントフィルムで検出するため目的の超高感度化学発光ラテラルフロー試験
目的
超高感度ポイントオブケア試験には、未だ対処されていない要求がある。理想的には、このような試験は携帯性に優れ、費用のかかる装置を必要としない。この実施例は、低濃度のサイトカインタンパク質IL-2が、費用効果の高いインスタントフィルムによる検出、強度の高い化学発光標識粒子、およびユーザーフレンドリーなラテラルフロー形態によって検出可能なことを示す。
【0198】
実験方法
ラテラルフロー試験ストリップを、実施例2と同様に組み立てた。抗体ラインの作製を、IL-2特異的捕捉ライン(Pharmingen;カタログ番号554424)、および対照ライン(Jackson Immuno Research Laboratories社;ビオチン抗マウスIgG、カタログ番号115-165-146)の両方を膜片上(吸い上げパッドから5〜10 mm)に適用することで行った。このラインを、使用前に乾燥させた(少なくとも15分)。ストレプトアビジン標識ビーズ(Bangs Laboratories社;カタログ番号CP01F-5121)のビオチン抗IL-2抗体(Pharmingen;カタログ番号554426)、およびビオチンアルカリホスファターゼ(Pierce;カタログ番号29339)による標識を、ビーズ(10 μlの1.23×1011/ml)、抗体(10 μlの1.0 μg/mlストック)、ビオチン標識AP(10 μlの1 mg/mlストック)、およびPBS(70 μl)を混合する(1.5時間/室温)ことで行った。次にこのビーズを遠心し(5000 g、10分)、PBS-B(100 μl)に再懸濁した。抗IL-2でコーティングされたAPビーズ(2 μl)を、各ストリップの結合体パッドに添加した。IL-2のストック溶液(Pharmingen;組換え型マウスIL-2、カタログ番号550069)を、血清PBSで段階希釈した。試験試料(IL-2希釈物を100 μl)をPBS-TB(50 μl)と混合し、試験ストリップの試料パッドに添加した。試験を実施した後に(約15分)、ストリップに化学発光検出試薬(Pierce;Lumiphos、カタログ番号34150)を染み込ませた。短時間のインキュベート(約5分)後に、ストリップの画像をインスタントフィルム(VWR;Polaroid Polapan Type 667、カタログ番号GRP0617538)で得た。次に同インスタントフィルムをスキャナーで読み取った(Hewlett Packard;HP scanjet 7400c、カタログ番号C7713A)。
【0199】
結果
図10は、化学発光標識粒子およびインスタントフィルム検出によるラテラルフロー試験の結果を示す。代表的な試験ストリップの捕捉ラインおよび対照ラインを示す。IL-2を含む試料(左から右へ:0、20、200、および2000 pg/ml)を適用したストリップを比較すると、IL-2量の増加に伴い、捕捉ラインに由来するシグナルも高まることがわかる。このデータは、本発明が、わずか20 pg/mlの濃度のIL-2をインスタントフィルムを用いて検出可能であることを示す。したがって、この試験は、超高感度で、迅速で、実施が容易で、また極めて安価である。
【0200】
変形例
他のフィルム(通常の写真用フィルムおよびX線フィルムを含む)を使用することができると考えられる。露光後のフィルムを、安価な市販のスキャナーでデジタル化することで、画像解析ソフトウェアで解析可能な画像が得られると考えられる。アルカリホスファターゼに代えて、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの他の化学発光試薬を使用することができると考えられる。CDP-star(Applied Biosystems;カタログ番号T2307)またはSignal West Pico(Pierce;カタログ番号34080)を含む、他の多くの化学発光基質を使用することができると考えられる。BM Purple(Roche;カタログ番号1442074)などの発色性基質を用いて比色アッセイ法を開発することもできると考えられる。
【0201】
実施例8.低濃度のタンパク質を非拡大大面積画像化で検出する目的の超高感度、非膜ベースのラテラルフローアッセイ法
目的
この実施例では、従来のラテラルフローストリップに代えて多孔性の「捕捉スレッド」を用いる本発明の態様による、タンパク質の迅速で超高感度の検出法について説明する。この形態では、粒子が検出面積を介して経路を通過しなければならない膜の膨張が最小限に抑えられる。捕捉スレッド形態には、いずれも試験の感度を高める以下の2つの主な利点がある:(1)大きな試料容積を効率的に処理できること、および(2)より強いシグナルを発生する、より大きな標識粒子を使用できること。
【0202】
図11は、この実施例で使用される装置の構成を示す。試料ゾーン内にロードした試料は、結合体パッド中を側方に流れる。装置の遠位端に位置する吸収パッドに吸われた試料は、アッセイスレッドを流れる検出用ビーズを可溶化し、移動させる。後述する実験では、IL-2の希釈物を、IL-2に特異的な蛍光標識粒子、IL-2と結合する捕捉スレッド、および陽性対照スレッドを含む結合体パッドを含むスライドに適用した。
【0203】
実験方法
試験系を以下の手順でガラススライド上に組み立てた(図11を参照)。抗体ストライプを2枚のラテラルフロー膜片(Millipore;Hi-Flow Plus、カタログ番号HF13502)(3 mm×25 mm)に適用した。捕捉スレッドストライプは、捕捉抗体(Pharmingen;抗IL-2モノクローナル抗体、カタログ番号554424、8 cmあたり10 μlの1 mg/ml溶液)、および対照抗体(Jackson Immuno Research Laboratories社;ビオチン抗マウスIgG、カタログ番号115-165-146、8 cmあたり10 μlの1 mg/ml溶液)を含むようにした。乾燥後(15分)、このスレッドをガラススライド(VWR;カタログ番号48300-025)の端から10 mm(対照スレッド)、および13 mm(捕捉スレッド)に配した。ガラスファイバーメッシュ(Millipore;ガラスファイバー結合体パッド、カタログ番号HFMIDAK015の一部)の一片を切断し(3 mm×25 mm)、ガラススライドの端から20 mmの位置に配した。1枚の吸収紙(50 mm×25 mm)をスライドの端に配した。第2のガラススライドを、捕捉スレッド、ガラスファイバー、および吸収紙の上に配し、ガラススライドの一端が、ガラスファイバー片のすぐ上にあって、かつもう一端が吸収紙に重なるようにした。ストレプトアビジン標識蛍光ビーズ(Bangs Laboratories社;カタログ番号CP01F-5121)のビオチン抗IL-2抗体(Pharmingen;カタログ番号554426)によるコーティングを、ビーズ(10 μlの1.23×1011/ml)、抗体(10 μlの1.0 μg/mlストック)、およびPBS(80 μl)を回転しながら混合する(1.5時間/室温)ことで行った。次にこのビーズを遠心し(5000 g、10分)、PBS-B(100 μl)に再懸濁した。抗IL-2でコーティングした蛍光ビーズ(2 μl)を、各アッセイスライドの結合体パッドに添加した。IL-2のストック溶液(Pharmingen;組換え型マウスIL-2、カタログ番号550069)を、(最終濃度が0、20、200 pg/mlとなるように)PBS-Bで段階希釈した。試験試料(1 mlの0、20、および200 pg/ml希釈物)を、試験スライドの試料充填ゾーンに添加した。試験を実施した後(15分)に、ストリップの画像を実施例2に記載の手順で得た。この画像をImage-Proソフトウェアで解析した。
【0204】
結果
図12に試験の結果を示す。図は、IL-2(0、20、および200 pg/ml)を含む試料に適用した試験の捕捉スレッドおよび対照スレッドの画像を示す。この結果は、この試験がIL-2を20 pg/mlの濃度で検出可能なことを示す。また、捕捉スレッドに見られる、濃度依存性の斑状の外見は、各標識粒子の画像が得られたことを意味する。
【0205】
この試験では、従来のラテラルフロー装置に通常ロードされる容量の5〜10倍の容量を使用したが、このアッセイ法は、従来の「低容量」ラテラルフロー試験を上記実施例で行った場合と、ほぼ同じ時間で終了した。捕捉スレッドの長さを延長することで、さらに大きな容量を解析できると考えられる。スレッドを長くすることで感度を高める能力は、個々の標識粒子を検出する本発明の能力の副次的結果である。個々の標識粒子を検出する場合は、捕捉ラインまたは捕捉スレッドの長さを延長すること、および試料容量を増すことで、バックグラウンドの増加を抑えつつ、より多くのシグナルが得られる(陽性シグナルを含む場合と同等のサイズの領域において、関連するバックグラウンド強度が測定可能であることに留意されたい)。これとは対照的に、統合シグナル強度を測定する試験は、バックグラウンドがシグナルと比例して大きくなるので、捕捉ラインの大きさを増しても改善しない。
【0206】
実施例9.タンパク質分子の非拡大大面積画像化および固相捕捉免疫アッセイ法による高感度検出
概説
この実施例では、非拡大大面積画像化でIL-2タンパク質標的体を検出した。IL-2分子は、抗体でコーティングしたマイクロタイターディッシュのウェル表面に吸着させた抗体によって捕捉された。次に、異なる抗IL-2抗体でコーティングされた蛍光粒子を、表面に固定されたIL-2分子と結合させた。非拡大大面積画像化で、個々の粒子:IL-2複合体が検出された。
【0207】
実験設計
96ウェルプレート(光学的に透明なプラスチックの底面;Greiner America社;カタログ番号55896)を、ビオチン化BSA(Sigma;カタログ番号A-8549;200 μg/mlのビオチン化BSA(溶媒は2 M炭酸水素ナトリウム)、pH 10の50 μl)でコーティングした。このプレートを室温で一晩インキュベートした。翌日、PBS(200 μl)を各ウェルに添加した後に吸引してウェルを「洗浄」した。次に、ビオチン化BSAでコーティングされたウェルを、ストレプトアビジン/PBS溶液(Jackson Labs;カタログ番号016-000-084;100 μg/ml溶液を50 μl)でさらにコーティングし、室温で一晩インキュベートした。翌日、ウェルを上述の手順で洗浄した。次に、ビオチン:ストレプトアビジンでコーティングされたウェルを、ビオチン化ラット抗マウスIL-2抗体(50 μlの0.5 mg/ml溶液;Pharmingen;カタログ番号554426)でコーティングした。このウェルに蓋をかぶせ、室温で3.5時間攪拌した。インキュベート後にウェルをPBS-B(Sigma;カタログ番号A-7638)/0.05% triton×100(Sigma/X-100)で3回洗浄した。次にウェルをBlock Aid(150 μl;Molecular Probe;カタログ番号B-10710)でブロック処理した後に、室温で40分間インキュベートした。Block Aidをデカントして捨て、ELISA希釈液(50 μl;Pharmingen;カタログ番号2728KD)を各ウェルに添加した。IL-2標準(150 pg/ml;Pharmingen;カタログ番号27316E)を、標準希釈物(Pharmingen;カタログ番号2708KD)により10倍の増分で段階希釈し、50 μlの各希釈液を別個のウェルに添加した。このプレートを室温で2時間インキュベートした。インキュベート後に、受動的吸着でラット抗マウスIL-2抗体(Pharmingen;カタログ番号18161D)をコーティングした抗体コート赤色蛍光粒子(106;Molecular Probe;1 μm;硫酸塩;580/605 nm;カタログ番号F-8851)を各ウェルに添加した。抗体を、ビーズの表面硫酸基に受動的に吸着させるために、粒子(62.5 μl;固形分2%;Molecular Probeカタログ番号F8851、1 μm、赤色蛍光(580/605))を、遠心(5分;10,200×g;Eppendorf Centrifugeモデル5417C、Eppendorf Swinging Bucket RotorモデルA-12-11)して繰り返し(3回)洗浄し、粒子ペレットを再懸濁した(1 ml PBS/0.15 M NaCl)。この粒子ペレットを、PBS(125 μl、固形分1%の濃度の場合)に再懸濁した後に、精製抗体(1 nmol抗体/mg 粒子の比の場合、1.25 nmol)をボルテックスしながら滴下して添加した。この懸濁物を、25℃で2時間、回転しながらインキュベートした後に、4℃で一晩インキュベートした。粒子を洗浄し(上述の手順で3回繰り返すが、遠心後にPBS-TBに再懸濁する)、PBS-TB(200 μl)に再懸濁し、回転しながらインキュベートした(30分、25℃)。粒子を上述の手順で2回洗浄し、PBS-TB(濃度が固形分1%の場合、125 μl)に再懸濁した。受動的にコーティングしたビーズ(107個)を添加後に、ウェルを室温で1時間インキュベートした。このプレートを1×ELISA洗浄溶液(200 μl;20×ストックから希釈したもの;Pharmingen;カタログ番号2605KC)で6回洗浄した後に、水で1回洗浄した。蛍光を、赤色蛍光粒子の場合は、テキサスレッド光学的フィルターセット(Chrome、励起560/55 nm、放出645/75 nm)を用いてGPSイメージャーで画像化して検出した。Image-Pro Plusソフトウェア、バージョン4.1(Media cybernetics)を用いて実施例2記載の手順でCCDイメージャーから画像を得て処理した。イメージャーで検出された陽性シグナルを、同じフィルターセットを装着したAxioplan II蛍光顕微鏡(Carl Zeiss社、Thornwood、NY)を用いて粒子であることを確認した。
【0208】
結果
図13は、固相捕捉アッセイ法でIL-2が検出されることを示す。IL-2の濃度の低下に伴い、抗IL-2抗体でコーティングされた蛍光粒子(白いスポットとして見える)の数も減少する。IL-2を含まない陰性対照と比較すると、このアッセイ法の感度(陰性対照の平均を上回る2標準偏差で定義)は約1.5 pg/mlとなる。この結果は、IL-2を対象としたELISA試験と同等である。
【0209】
実施例10.タンパク質分子の非拡大大面積画像化および液相捕捉による高感度検出
概説
この実施例では、上記実施例と同様に、非拡大大面積画像化でIL-2タンパク質標的体を検出した。ただし、この場合は、IL-2分子が、液相中で抗体でコーティングされた粒子の対と結合した状態にあった。上記実施例と同様に、一方の粒子は蛍光性であり、もう一方の粒子は磁性である。粒子:分析物複合体は、磁力によって平面検出ゾーンに沈着する。このような複合体の画像を、前述の非拡大大面積画像化で得る。
【0210】
実験手順
抗IL-2磁性粒子の作製を、活性トシル基を有する磁性粒子を、IL-2に対するモノクローナル抗体(ラット抗IL-2、Pharmingen;カタログ番号18161D)と結合させることで行った。磁性粒子(30 mg/ml;100 μl;Dynal、Oslo、Norway、Dynaparticles M-280 Tosylactivated、カタログ番号140.03)を、粒子の磁気分離を用いて遠心チューブ(1.5 ml)中でPBで洗浄し(3回、各1 ml)、続いて上清を除去した(特記するものを除いて、この実施例におけるすべての磁気分離は、Polysciences社;カタログ番号8MB4111Sの装置を用いて行った)。粒子をPB(70 μl)に再懸濁した。IL-2に対するモノクローナル抗体(60 μg;Pharmingen;カタログ番号18161D)を磁性粒子(70 μl)と、遠心チューブ(1.5 ml)内で混合し、軽くボルテックスした。この反応物を、(特に指定しない限り約30 rpmで)回転しながら37℃で20分間インキュベートした。20分後に、BSA(IgGを含まない)を、最終濃度が0.1%になるように添加し、回転しながら37℃で一晩インキュベートした。この磁性粒子をPBS-Bで2回洗浄した(各1 ml;磁気分離)。磁性粒子を緩衝液(0.1%(w/v) BSA(IgGを含まない)を添加した0.2 M Tris pH 8.5)に再懸濁し、回転しながら37℃で4時間インキュベートした。最後に、磁性粒子を(磁気分離によりPBS-B中で)2回洗浄し、再懸濁した(最終濃度はPBS-B中に固形分1%とした)。磁気ビーズを作製後、IL-2標準(150 pg/ml;Pharmingen;カタログ番号27316E)を10倍の増分で段階希釈した。別々の1.5 mlのチューブで、20 μlの各希釈物を、ラット抗IL-2抗体でコーティングされた磁性粒子、およびビオチン標識ラット抗マウスIL-2(Pharmingen;カタログ番号554426)でコーティングされた赤色蛍光粒子(108粒子;Molecular Probes;1 μm;硫酸塩;580/605 nm;カタログ番号F-8851)と混合した(受動的吸収コーティングに関しては実施例9を参照)。粒子:IL-2懸濁液(120 μl)をBlock Aid(60 μl;Molecular Probes;カタログ番号B-10710)と混合し、30秒間、超音波処理した(設定8;550 Sonic Dismembrator;Misonix)。超音波処理後に、追加のBlock Aid(60 μl)を添加してチューブを混合した。次に、このチューブを、室温で1時間、混合しながらインキュベートした。インキュベート後に、チューブをPBS-TBで3回洗浄した。洗浄は、磁性粒子:IL-2:蛍光粒子サンドイッチをチューブの片側へ誘引する磁気分離と、これに続く吸引による上清の除去からなる。各洗浄後にPBS-TB(50 μl)を添加した。アリコートを、光学的に透明なプラスチック底のプレート(Greiner America社;カタログ番号655896)に添加した。赤色蛍光粒子を対象とした、テキサスレッド光学的フィルターセット(Chrome/励起560/55 nm、放出645/75 nm)を用いたCCDイメージャーによる画像化で蛍光を検出した。Image-Pro Plusソフトウェア、バージョン4.1(Media cybernetics)を用いて、CCDイメージャーから画像を取り込んで処理した。CCD画像化で検出された陽性シグナルを、同じフィルターセットを装着したAxioplan II蛍光顕微鏡(Carl Zeiss社、Thornwood、NY)を用いて粒子であることを確認した。
【0211】
結果
図14は、固相アッセイ法でIL-2が検出されることを示す。IL-2の濃度の低下に伴い、抗IL-2抗体でコーティングされた蛍光粒子(白いスポットとして見える)の数も減少する。IL-2を含まない陰性対照と比較すると、このアッセイ法の感度(陰性対照の平均を上回る2標準偏差として定義される)は約1.5 pg/mlとなる。
【0212】
実施例11.複数のヒトサイトカインを非拡大大面積画像化で検出する免疫アッセイ法
サイトカインは細胞間連絡に不可欠な媒介物質であり、免疫応答の基礎となる細胞ダイナミクスの調節に中心的な役割を果たす。これらのタンパク質の組み合わせが複雑なことと、低濃度で存在することは、病原性微小環境の特徴である。したがって、サイトカインの高感度多重検出法が研究および臨床解析に求められている。この実施例では、本発明を用いて、このような試験を構築する。この実施例では、個々のタンパク質分子は、拡大を行うことなく検出される。マイクロタイターウェルに結合した状態の抗体を用いてタンパク質分子を捕捉し、次に実施例9に記載したように、高い強度の蛍光粒子と結合させることで標識する。
【0213】
図15は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-4(IL-4)、および腫瘍壊死因子-α(TNF-α)の4種類のサイトカインを調べるアッセイ法のスキームを示す。この実施例で開発された試験は、以下の重要な差以外は従来の試験(多重化ウイルス)と形式的に同等である。このアッセイ法の標的は、(ウイルスではなく)タンパク質分子なので、(ウェル表面と結合する)捕捉抗体、および(蛍光粒子と結合する)検出抗体は、標的上の非重複エピトープを認識できなければならない。
【0214】
蛍光粒子およびウェルと抗サイトカイン抗体との結合
業者から入手した標準抗サイトカイン抗体対(非重複エピトープを有する)については文献に詳しく記載されている(Carson, R.T.ら、J Immunol Methods 227:41-52、1999)。
【0215】
抗体は、受動的吸収によって、マイクロタイターディッシュのウェルに、1ウェルあたり4つの隣接した個別のスポット中に結合した状態にある(一つの抗体について1スポット)。各抗ウイルス抗体を、96ウェルマイクロタイタープレート(Greiner America;カタログ番号55896)のウェルにスポットし(1 μl;1 μg/μl)、加湿チャンバー(Boekel Slide Moat;モデル 240000)内で室温で2時間インキュベートする。次にウェルを実施例9に記載された手順で洗浄してブロック処理する(あるいは、この実施例では、抗体の等モルの混合物を同質混合物としてウェルに結合させることができることに留意されたい)。
【0216】
色でコード化されたサイトカイン特異的蛍光粒子の作製を、異なる放出スペクトルを有する蛍光着色されたポリスチレン粒子を、抗サイトカイン検出抗体(Carsonら、1999、前掲に詳述)で、上記実施例に記載の手順によりコーティングすることで行う。蛍光粒子は以下のようにコード化されている:GM-CSF特異的粒子=黄緑色、IL-2特異的粒子=橙色、IL-4特異的粒子=深紅色、およびTNF-α特異的粒子=赤外領域。これら4種類の抗体でコーティングされた粒子を混合し、上記実施例に記載の手順で調製する。上記実施例に示すように、各ウイルスを対象に同じ種類の蛍光粒子を使用することも可能である。
【0217】
標準曲線
サイトカイン濃度を統合アッセイシグナルに関連づける標準曲線を作成する。各サイトカインの10倍希釈物を10 pg/ml〜10 μg/mlの濃度で含む試料(200 μl;溶媒はPBS-TB;3つ組で実施)を、スポットされた捕捉抗体を含むマイクロタイターディッシュの各ウェルに添加する。30分後にウェルをPBS-TB(200 μl;4回)で洗浄する。混合されたサイトカイン特異的粒子(200 μl)をウェルに添加し、遠心機(Beckman Allegra 6;GH-3.8ローター;1200 g)で軽く遠心して、ウェルの底面を粒子でコーティングする。粒子を室温で10分間インキュベートした後に、非結合状態の粒子を洗浄して除去する(200 μlのPBS-TBによる3回の洗浄、各洗浄溶液を5回の再ピペッティングで攪拌する)。次に、各スポットに結合した状態の粒子の数、色、および累積強度を決定する。次にウェルの画像を得て、CCDイメージャーで実施例2記載の手順で解析を行う(ただし、適切なフィルターセット(黄緑色:励起Chroma HQ480/40×および放出Chroma HQ535/50m;橙色:励起Chroma HQ535/50Xおよび放出Chroma HG610/75m;深紅色:励起Chroma HQ560/55x、および放出Chroma HQ645/75m;ならびに赤外:励起Chroma HQ710/75xおよび放出Chroma HQ810/90m)を用いて複数の画像を得る)。ウイルスを、結合状態の粒子が吸着するスポットで同定する。診断上のさらなる頑健性は、アッセイ法が成功する場合に、予測される色の粒子のみが特定のスポットと吸着するという事実によって得られる。
【0218】
未同定試料中のサイトカインの検出
サイトカインであるGM-CSF、IL-2、IL-4、および/またはTNF-αを含む、または含む可能性がある試料(200 μl)を、スポットされた捕捉抗体を含むマイクロタイターディッシュのウェルに添加する。この試料を上述の手順で処理して解析する。これらのサイトカインの濃度を、4種類のサイトカイン特異的捕捉抗体スポットに対応する定量されたシグナルを標準曲線と比較する補間法で推定する。
【0219】
実施例12.全(結合状態+遊離状態)サイトカインIL-2の非拡大大面積画像化による競合的免疫アッセイ法
標的体が非重複カテゴリー特異的結合部位(例えばエピトープ)をもたない場合には、競合的免疫アッセイ法を行う。これは一般に、乱用薬物(例えばコカイン)、化学汚染物質(例えばPCB)、またはホルモン(例えばトリヨードサイロニン)などの低分子量分子解析物を対象に行われる。競合的免疫アッセイ法は、標的分子上の1個のエピトープのみが抗体に「接近可能な」場合、例えば低分子量のタンパク質ホルモンまたはサイトカインが、より大きな結合タンパク質または受容体に結合する状態、また大きく取り込まれる状態の場合にも有用である。
【0220】
競合的免疫アッセイ法では、標的体と対照的に、2か所の異なる結合部位を有する標的体の類似体の捕捉が測定されるので、基本的な免疫アッセイ法の手順で測定可能である。試料中の標的体は、捕捉部位をめぐって類似体と競合しうる。したがって、類似体の捕捉の程度は、試料中の標的体の濃度の関数となる。
【0221】
この実施例では、競合的免疫アッセイ法形態で、全サイトカインIL-2(結合状態のIL-2と遊離状態のIL-2)を調べる本発明を用いて構築されたアッセイ法について説明する。競合的免疫アッセイ法の概略を図16に示す。
【0222】
IL-2の競合的免疫アッセイ法
IL-2の競合的免疫アッセイ法を、市販のキット(Chemicon;カタログ番号CYT111)を用いて、かつ製造業者が推奨するプロトコル(変更点については後述)にしたがって実施する。このキットは、マイクロタイターディッシュ中の溶液を発色させる一般的な免疫アッセイ法の代表的なものである。色の強度は、試料中の分析物の量を示し、また結合状態の酵素:抗体結合体の累積作用の結果である。本発明を用いて構築されたこの試験は、従来の競合的免疫アッセイ法とは異なる。第1に、個々の標的(この場合はIL-2:ビオチン結合体)の画像は、蛍光ストレプトアビジンでコーティングされた粒子と結合させることで得る。第2に、結合状態の蛍光粒子の画像を、ウェルの上部から色変化の分光光度的な決定により得るのではなく、光学的に透明なウェルの底面から得る。蛍光粒子は顕微鏡的(約1 μm)であるが、画像化は拡大を行わずに実施される。
【0223】
個々の結合事象の画像化には平坦で光学的に透明なウェルの底面が必要なので、適切なマイクロタイタープレートを、市販のキットに付属する二次抗体でコーティングしたプレートに代えて用いる。底面が光学的に透明な96ウェルマイクロタイタープレート(Greiner Labs;カタログ番号:665097)を、マウス抗インターロイキン2抗体(Chemicon;カタログ番号MAB1018)で文献(Coliganら、1994、6.22.1、前掲)記載の手順でコーティングする。
【0224】
市販のキットでは、ストレプトアビジン:アルカリホスファターゼ結合体を用いて、結合状態のIL-2:ビオチン結合体を、発色性のアルカリホスファターゼ基質の反応を介して検出される。この実施例では、ストレプトアビジンでコーティングされた蛍光粒子(Molecular Probes;カタログ番号8775;直径1 μm;赤色蛍光)を、ストレプトアビジン:アルカリホスファターゼ結合体に代えて用いる。
【0225】
(市販キットに含まれる)標準品、および未知試料の両方を対象とした競合的免疫アッセイ法は、以下の例外を含む市販キットの製造業者の推奨事項にしたがって処理される。試料は、ウェルの底面が光学的に透明なプレート上で処理される(上記参照)。製造業者のプロトコル通りにストレプトアビジン:アルカリホスファターゼ結合体を添加する時点において、ストレプトアビジンでコーティングされた蛍光粒子を添加する(100 μl;PBS-T中107個の粒子/ml)。次に、実施例11に記載の手順でこのアッセイ系を処理して画像を得る。ウェルの画像を得るための励起用の光学的フィルター(Chrome HQ560/55x)、および放出用の光学的フィルター(Chrome HQ645/75m)を蛍光粒子の光学的特性(励起/発光:580/605)にしたがって選択する。
【0226】
実施例13.ディップスティック形態および非拡大大面積画像化による核酸分子の高感度検出
概説
この実施例では、非拡大大面積画像化を行って、アビジン標識蛍光ビーズに特異的に結合されたビオチン化DNAを検出する。単純であるが高感度のディップスティックアッセイ法を行うことで、蛍光ビーズと、ナイロン膜に結合した状態のビオチン化λDNAの迅速な結合が達成された。このアッセイ法形態は、ポイントオブケアの遺伝子検査に有用な可能性がある。
【0227】
実験設計
ビオチン化λDNAを、10倍希釈(1 μg〜10 pg)してナイロン膜(0.2 μm孔径;Pall Biodyne A;カタログ番号28152-409)上にスポットした。同じフィルター上に、陰性対照試料(1 μgの非ビオチン化λDNA)を沈着させた。このDNAを、UVクロスリンカー(Stratagene)を用いて膜に架橋した。この膜を、BB緩衝液(50 μl)で室温で30分処理して膜を飽和させることによってブロックした。次に膜を風乾した。ブロック後に、膜の一端を、1.5 mlのチューブ内にアビジンでコーティングされた1012個のテキサスレッド蛍光ビーズ(0.45 μm;Spherotech;カタログ番号VFP-0562-5)を含む溶液中に浸した。この溶液は、毛管作用により膜上を、ピーク高さ(ストリップの長さの約4分の3)に至るまで移動した。DNAのスポットは、対象溶液のピーク高さの十分下に位置するようにストリップ上に配した。この膜を次にPBS-TB(35 ml)で室温で10分間洗浄した。蛍光を、赤色蛍光ビーズの検出に適したテキサスレッド光学的フィルターセット(Chroma;励起560/55 nm、放出645/75 nm)とともにCCDイメージャーを用いた画像化で検出した。Image Pro Plusソフトウェア、バージョン4.1(Media cybernetics)を用いて、CCDイメージャーから画像を取り込んで処理した。イメージャーで検出された陽性シグナルを、同じフィルターセットを装着したAxioplan II蛍光顕微鏡(Carl Zeiss社、Thornwood、NY)を用いてビーズであることを確認した。
【0228】
結果
図17は、非拡大大面積画像化で、一つのスポット内に約106個の分子のレベルでDNA分子が検出されることを示す。100 pgのビオチン化λDNAを含むスポットは、1 μgの非ビオチン化λDNAを含む陰性対照と比較して有意に強いシグナルを発生する。推定用量反応を図に示す。スポット中のDNAが増えるほど、蛍光ビーズ(図では白いスポットとして見える)数も増える。
【0229】
変形例
この試験の重要な変形例は、特定のハイブリダイゼーションプローブをカテゴリー結合分子として使用することである。このようなプローブは、他のさまざまな実施例に記載されているように、直接的または間接的に標識される場合がある。同様に、特定のカテゴリーのRNA分子の発現を測定する試験を、このアッセイ法形態で開発できる可能性がある。
【0230】
実施例14.一塩基多型の遺伝子型を決定する試験
一塩基多型(SNP)の検出は、応用領域(例えば医学および農学)、ならびに基礎生物学領域の両方において現代遺伝学の応用として重要である。この実施例では、同質で非増幅性の形態を用いて、鎌状赤血球貧血を生じる共通の変異が見られる部位において患者の遺伝子型を決定する新しい試験法を考案するための本発明の応用について説明する。この試験では、プローブの一方を磁性粒子で標識し、もう一方を蛍光粒子で標識する、オリゴヌクレオチド連結アッセイ法を行う。
【0231】
オリゴヌクレオチド連結アッセイ法用の標識プローブ
SNPの遺伝子型を決定するオリゴヌクレオチド連結アッセイ法では、「定常」オリゴヌクレオチドと「対立遺伝子特異的」オリゴヌクレオチドの2種類のオリゴヌクレオチド部分を用いる。定常オリゴヌクレオチドは、磁性粒子で3'端が標識されている。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、蛍光粒子で5'端が標識されている(異なる対立遺伝子には異なる色の粒子が使用される)。定常オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの5'端が多型ヌクレオチドに隣接するように、対象座位において一方の鎖とハイブリダイズするように設計される。「対立遺伝子特異的」オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドと定常オリゴヌクレオチドの両方が相補的核酸鎖とハイブリダイズする場合に、一塩基多型に対応する3'端のヌクレオチドが、定常オリゴヌクレオチドの5'端のヌクレオチドと隣接するように、対象座位とハイブリダイズする。
【0232】
定常オリゴヌクレオチド
を、3'アミノ基の修飾(Midland Certified Scientific Reagent社)で合成し、またポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs)を用いて製造業者の仕様にしたがって酵素作用で5'端をリン酸化する。鎌形赤血球および野生型の対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドである
および
を、5'アミノ基の修飾で合成する。この際、オリゴヌクレオチドが二極性であることに留意する必要がある。つまり、一方(アミノ修飾に対して遠位、下線部)は、グロビン遺伝子とハイブリダイズし、もう一方(アミノ修飾に対して近位)は、スペーサーまたはつなぎ鎖として機能する。スペーサーを、粒子に(アミノ基を介して)結合するオリゴヌクレオチドの末端と、ゲノムDNAとハイブリダイズすることになるオリゴヌクレオチドの一部との間に組み込むことで、ハイブリダイゼーション効率が高まる場合がある。
【0233】
オリゴヌクレオチドと粒子の結合
末端アミノ基で修飾されたオリゴヌクレオチドを、上述した(実施例10)トシル化学で粒子と共有結合的に連結させる。定常オリゴヌクレオチドを、その3'アミノ基を介して、トシル活性化磁性粒子(2.8 μm;Dynal;カタログ番号140.03)と連結させる。鎌形赤血球の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを、赤色蛍光粒子(200 nm;Molecular Probes;カタログ番号F-8811)と連結し、また野生型の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを、緑色蛍光粒子(200 nm;Molecular Probe;カタログ番号F-8810)と、5'のアミノ基を介して連結させる。連結、洗浄、およびブロック処理後に、オリゴヌクレオチドでコーティングした粒子を、最終濃度が2%となるように混合する。
【0234】
同質オリゴヌクレオチド連結アッセイ法
ヒトDNAを、軟膜血液分画から精製する(Sambrook, J.ら、Molecular Cloning A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、NY、2001))。精製ヒトゲノムDNA(12 μlのEE中に1 μg)を、100℃で3分間加熱して変性させ、氷浴上で急冷した後に、5 μlのオリゴヌクレオチドでコーティングした粒子混合物、および2 μlの10×連結緩衝液(New England Biolabs)と混合し、50℃で1時間かけてアニーリングさせる。T4 DNAリガーゼ(400 u/μlを1 μl;New England Biolabs)を添加し、連結反応を37℃で1時間かけて進める。陰性対照試料をディッシュの別のウェルに添加する。陰性対照は、EEがヒトDNAに代えて使用されている点以外は実験試料と組成が同一である。陰性対照を実験試料と同様に処理する。この試料にEE(120 μl)を添加して200 μlに希釈する。黒色インク(50 μl;Black No.17、Pelikan、Hanover、Germany)を、底面が光学的に透明な96ウェルマイクロタイターディッシュ(Greiner Labs;カタログ番号665097)のウェルに添加する。このマイクロタイターディッシュを、平面状の磁石(Dexter Magnetics、LifeSep、96F)の上に15分間置く。次にディッシュを、CCDイメージャーの上方へ向けて静かに動かし(図3)、アッセイ対象および対照を含むウェルの底面を連続的に画像化する。次に画像を、画像解析ソフトウェアパッケージ(Image-Pro Plusソフトウェア、バージョン 4.1;Media Cybernetics)を用いて実施例2に記載の手順で解析する。陰性対照試料の底面の画像上の緑色粒子および赤色粒子の数は、バックグラウンドの粒子数を示す。この数を、実験試料の底部の画像上における同様の色の粒子の数から差し引く。緑色粒子に対する赤色粒子の比で、鎌形赤血球の遺伝子座における遺伝子型が決定される。仮に赤色粒子(変異型対立遺伝子)に対する緑色粒子(野生型対立遺伝子)の比が高い(<90%)場合、遺伝子型はホモ接合の野生型である。仮に比が小さい(<10%)場合は、遺伝子型は鎌形赤血球対立遺伝子についてホモ接合である。また比がおよそ1:1の場合は、遺伝子型は鎌形赤血球対立遺伝子についてヘテロ接合である。
【0235】
変形例
このスキームの数多くの変形例を組み入れることができる。ゲノムDNAまたは細胞RNAの増幅産物も、オリゴヌクレオチドプローブが連結に先だってアニーリングする鋳型として使用することができる。他の標識法を使用することもできる。例えば、選択部分(この実施例では磁性粒子)を、ストレプトアビジンまたは抗ジゴキシゲニン抗体を捕捉試薬として用いる(例えば表面または磁性粒子上に固定する)ことで、選択部分として機能可能なハプテン(例えばビオチンまたはジゴキシゲニン)と置換することができる。同様に、シグナル発生部分は、一つまたは複数のさまざまなシグナル発生特性(例えば蛍光、化学発光、生物発光、ラジオ周波数、大きさなど)をもつ場合がある。選択部分と同様に、シグナル発生部分を直接的(例えば共有結合的)に、または間接的に対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドに連結させることができる。例えば、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドをビオチンで修飾することが可能であり、かつ蛍光標識されたストレプトアビジンを間接的に結合し、シグナル発生部分として使用することができる。あるいは、蛍光粒子などのシグナル発生部分、または磁性粒子などの選択部分を、核酸ハイブリダイゼーションによる粒子と、ゲノムDNAとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド上のタグ相補部分の結合を可能とするタグ配列でコーティングすることができる。後者の場合のように、標識が間接的である場合、アッセイ法は、ゲノムDNAとの連結が最初に達成され、次に標識部分および/またはシグナル発生部分がオリゴヌクレオチドと関連する(連結および脱連結する)ように構築することができる。この方法は、連結反応の効率を立体的または動力学的に低める可能性のある大きな標識部分を用いる際に有利な可能性がある。また、ゲノムまたは細胞RNAを、連結が起こる鋳型として使用することができる。
【0236】
実施例15.ラテラルフロー形態および非拡大大面積画像化による非増幅多重SNP解析
現代の医学遺伝学および薬理ゲノム学の重要な目標は、患者のゲノムプロファイルを迅速に入手することである。遺伝マーカーは、疾患(例えば乳癌やハンチントン病)の早期警告となる場合があるほか、どの薬剤に患者が良好に反応する可能性が高いかということを示す場合がある。一塩基多型(SNP)は、ゲノム上に多く存在することから、またヒトの多くの遺伝疾患が点突然変異に起因することから、医学的に重要な遺伝マーカーである。
【0237】
迅速で、多重性が高く、また高価でない技術の開発は、応用医学遺伝学における現在の目標である。この実施例では、本発明を用いて、以上の属性をもつ試験を構築する。(DNAの増幅を必要としない)このようなアッセイ法は、3種類の異なる遺伝子(β-グロビン、α-アンチトリプシン、および嚢胞性線維症膜貫通型コンダクタンス制御因子(CFTR))のヌクレオチド多型の遺伝子型を検出する目的でヒトのDNA試料をスキャンする。
【0238】
技術の概要
上記の実施例で述べたように、このアッセイ法では、オリゴヌクレオチド連結アッセイ法でSNP対立遺伝子を調べる。しかし、この実施例では、ラテラルフロー試験で連結産物を検出する。この形態によって、一つのシグナル発生部分だけを用いて数多くの標的分子(この場合はSNP)の試験が促進される。この形態における、多くの標的SNP対立遺伝子を検出する能力は、膜上の既知部位に固定された異なる捕捉オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションによって標的を識別する能力に起因する。
【0239】
この試験は、図18および図19に示した2つの段階に分けることができる。第1の段階は、オリゴヌクレオチド連結アッセイ法である(図18の上)。上記実施例に示したように、対立遺伝子特異的な連結用に設計されたオリゴヌクレオチド対は、変性ゲノムDNAとハイブリダイズして連結される。このアッセイ法の第2の段階では、連結した1本鎖産物を、ラテラルフロー装置に適用し、同装置上で1本鎖産物が、相補的な捕捉オリゴヌクレオチドタグと遭遇してハイブリダイズする(図18の下)。強度の高い化学発光シグナルを放出する結合状態の粒子の作用によって、捕捉された各オリゴヌクレオチドの画像がCCDイメージャーで得られる(図19)。
【0240】
オリゴヌクレオチド
この実施例では、β-グロビン、α-アンチトリプシン、およびCFTRの3種類の遺伝子のヌクレオチド多型の遺伝子型が決定される。一組のオリゴヌクレオチドを、遺伝子型を決定する対象の各遺伝子座位について合成する。上記実施例に示したように、各組は1種類の定常オリゴヌクレオチドと、1種類または複数の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを含む。ゲノムDNAの対応する鎖とハイブリダイズすると、定常オリゴヌクレオチドおよびヌクレオチド多型と相補的な「1種類」の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドが連結する。
【0241】
オリゴヌクレオチドの組を、以下の違いを除いて上記実施例における組と同様に設計する。各対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは2極性であり、一方は前述したようにゲノム配列に対応する。しかし、この実施例では、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを、隣接する固有のタグ配列で合成する。
【0242】
1回の反応で複数のプローブによる同等のハイブリダイゼーションを促進するために、相補性を有する機能性セグメントの溶解温度(Tm;定義参照)がほぼ等しくなるようにオリゴヌクレオチドを設計する。多くの部分に分かれたオリゴヌクレオチドは、好ましくは長さが約20ヌクレオチドであり、Tmは60±2℃である。表3に示したようなオリゴヌクレオチドを用いる、標的変異およびオリゴヌクレオチド連結アッセイ法は文献に記載されている(Nickerson, D.A.ら、Proc Natl Acad Sci USA 87:8923-7、1990)。
【0243】
(表3)実施例15におけるヌクレオチド多型の遺伝子型決定用のオリゴヌクレオチド
a 命名法は文献(Nickensonら、1990、前掲)に拠る。
b オリゴヌクレオチド配列は5'→3'方向に記載されている;b=ビオチン;p=5'リン酸。
c ゲノム配列を下線で示す(非下線配列はタグ配列を示す)。
d 捕捉オリゴヌクレオチドは、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド中における対応するタグ配列部分と相補的である(対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド中の非下線部セグメント)。
【0244】
捕捉オリゴヌクレオチドの膜への結合
捕捉オリゴヌクレオチド(表3)を、プラスチックを裏張りしたニトロセルロースフィルター(孔径3 μm;Schleicher & Schuell)に、以前に記載されたように(Rule, G.S.ら、Clinical Chemistry 42:1206-9、1996)(ただしこの実施例では、複数の捕捉オリゴヌクレオチドを使用する点が異なる)適用して結合させる。Ruleらの文献に記載されているように、第1のラインを、フィルターの下端から1 cm離れた点に適用する。それに続く捕捉オリゴヌクレオチドのラインを、3 mm隔てて平行に適用する(フィルターの下端と前のラインから離す)。フィルターを0.5 mm×8 cmのストリップ(オリゴヌクレオチドのラインを長さ寸法に対して垂直とする)に切断する。
【0245】
オリゴヌクレオチド連結アッセイ法
オリゴヌクレオチド混合物(各オリゴヌクレオチドを1 nM)、およびヒトゲノムDNA(1 μg)を、14 μlの連結緩衝液(定義参照)中に混合する。この混合物を、サーマルサイクラー(Perkin Elmer、GeneAmp PCR System 9700)中で95℃(3分)で加熱して変性させた後に37℃に冷却する(最大下降傾斜率は5%)。T4 DNAリガーゼ(1 μlの400 u/μl酵素;New England Biolabs;酵素濃度は付着末端単位で表す)を反応系に添加し、これを次に37℃で1時間インキュベートする。
【0246】
反応を停止させ、ヒートブロックで1分間100℃に加熱してDNAを変性させる。この試料を、氷浴に漬けて0℃に急冷した後に、HYB(定義参照)で150 μlに希釈する。
【0247】
アルカリホスファターゼとアビジンでコーティングされた粒子の結合
ストレプトアビジンでコーティングされた粒子(直径0.95 μm;Bangs Labs;カタログ番号CP01N)を、ビオチン化アルカリホスファターゼ(Pierce;#29339)でコーティングし、アルカリホスファターゼ分子の最大数の約半分だけが結合するようにする。このような粒子は、遊離のストレプトアビジン部分を介してビオチン化標的分子に結合する能力を保持している。部分的なコーティングは、ストレプトアビジンでコーティングされた粒子を、ビオチン化アルカリホスファターゼと、1個の粒子あたり約1×104個のビオチン化アルカリホスファターゼ分子の比となるようにインキュベートすることで達成される。この比は、ビオチン化アルカリホスファターゼの、粒子上のビオチン化アルカリホスファターゼ結合部位の飽和に必要な粒子に対する最小比を決定することで、各ロットの粒子に対して経験的に決定されている。次に、この比の一部(例えば1/2)を用いて粒子をコーティングする。粒子を飽和させるのに必要な粒子に対するビオチン化アルカリホスファターゼの最小比は、ビオチン化アルカリホスファターゼの段階希釈物を一定数の粒子と結合させ、遊離のビオチン化アルカリホスファターゼをスピン濾過(spinX;Costar;#8161)で除去し、粒子を回収し、およびナイロンフィルター(GeneScreen;NEN)上における1個の粒子の化学発光シグナルをCDP-star(CDP-Star;NEN)およびX線フィルムルミノグラフィーで測定することで決定される。
【0248】
ストレプトアビジンでコーティングされた粒子(2×109粒子)をビオチン化アルカリホスファターゼで、上述の手順で決定されたビオチン化アルカリホスファターゼ:粒子比(例えば104)で部分的にコーティングする。コーティング反応(100 μl)は、EEN/0.1%BSA中で室温で1時間かけて行う。粒子をスピン濾過(spinX;costar;#8161)で洗浄し(3×500 μl EEN)、EEN(200 μl)中に回収する。
【0249】
クロマトグラフィーおよび検出
クロマトグラフィーを、Ruleら(1996、前掲)の方法に従い37℃で行う。オリゴヌクレオチド連結アッセイ法の反応物(150 μl)を10×75 mmのポリスチレン試験チューブに入れる。次に、ニトロセルロースストリップを同チューブに入れ、ストリップの底(ストリップに適用される第1のオリゴヌクレオチドストライプは下端から1 cm上方に来るようにする)を、オリゴヌクレオチド連結アッセイ法溶液中に入れる。20分後にストリップをチューブから除去し、HYB溶液(50℃)で3回洗浄する(各5分)。このフィルターを粒子(1 mlのEEN中にビオチン化アルカリホスファターゼでコーティングされた粒子108個)で覆い、室温で1時間インキュベートする。遊離の粒子をフィルターから洗い流す(5×10 ml EENを用いて激しく攪拌しながら洗浄する)。フィルターをCDP-Star(NEN)で覆い、X線フィルムを用いてルミノグラフィーを行う。露光前に、フィルターの角を蛍光テープ(Glogos(商標) II Autorad Markers、Stratagene、カタログ番号420201)で明確にマークし、露光後のX線フィルムを鋳型と並べて、フィルター上における、さまざまなSNPラインの位置がわかるようにする。粒子と1個の捕捉されたSNP分子の結合によって生じる化学発光シグナルは、標的DNA中に特定のSNP遺伝子型が存在することを示す。
【0250】
別の態様
蛍光標識および光散乱標識を含む、他の種類の標識を使用することができる。同様に、さまざまな装置(例えばCCDカメラ、発色性検出、インスタントフィルムなど)をシグナル検出に使用することができる。非吸収性基質(例えばガラススライド)などの他の種類の基質を使用することができる。フロースルー試験形態も可能である。このアッセイ法は、ラテラルフローアッセイ法において吸収性フィルターを使用するのではなく、マイクロ流体形態(例えばFlow-Thru Chip(商標)システム;Gene-logicを使用)を使用することもできる。この場合、捕捉プローブを、(連結状態および非連結状態)のオリゴヌクレオチドプローブが通過するマイクロ機械化チャンネルの壁上に位置参照可能な(addressable)幾何学的位置に(すなわち既知の順序で)固定する。
【0251】
他の態様
本出願で言及されたすべての特許、特許出願、および出版物は、参照として本明細書に組み入れられる。本発明の他の態様は、本明細書および本明細書に記載された本発明の手順を考慮することで当業者に明らかになると思われる。本明細書および実施例はあくまで例示的であるとみなされ、本発明の真の範囲および趣旨は特許請求の範囲で示されることが意図される。本明細書に記載された方法に適合可能な他の態様の例は、いずれも参照として本明細書に組み入れられる2002年9月6日に出願された米国特許出願第_____号(「細胞およびウイルスの迅速かつ高感度の検出」)、および2002年9月6日に出願された米国特許出願第_____号(「複製する細胞の迅速かつ高感度の検出」に記載されている。
【0252】
他の態様は特許請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【0253】
【図1】個々のシグナル発生粒子を対象とした、CCDアレイによる非拡大大面積画像化の原理 本発明により、抗IL-2抗体(カテゴリー結合分子)でコーティングされた蛍光標識粒子は、血液中でIL-2タンパク質分子(標的分子)と結合した状態にある。結果として生じる複合体は、マイクロタイターディッシュのウェルの底面で捕捉抗体と結合状態にある。未結合状態の標識粒子は除去される。照射を行うことで、捕捉された標識粒子が蛍光を発し、CCDチップのピクセルに影響を及ぼす光子を放出する。標識粒子の数と位置は、自動画像解析で解釈される。この図は単純化したものであり、光学的要素および他のハードウェアを記載していない。
【図2】マイクロタイターウェルの形態による、タンパク質に関する血液試料の試験 個々の標識粒子の画像化が標的分子(この場合はタンパク質)の検出にどのように用いられるかということを示す。
【図3】大面積画像化用のCCD画像化装置 図示したCCDベースのイメージャーは、実施例に記載されている多くのデータを収集するために使用された(「詳細な説明」の段階6を参照)。励起光は、高い強度の白色光源(1000ワットのキセノンアークランプ、モデルA 6000、Photon Technology社、Monmouth Junction、NJ)から、光を液体光導体(liquid light-guide)(コア直径5 mm、モデル380、Photon Technology社、Monmouth Junction、NJ)に導入することで提供される。液体光導体は、光を励起フィルターホイール(BioPoint FW、Ludl Electronics、Hawthorne、NY)へ運び、フィルターを透過したビーム(典型的には直径9 mm)を、標識された標的分子を含む検出表面に向ける。この装置は、さまざまな検出表面(例えば多孔性膜、顕微鏡用スライド、マイクロタイターディッシュ、カバースリップ、および平坦で光学的に透明な底面を有するチューブ)上で、標識された標的分子を検出することができる。入射光が検出表面を照らし、カテゴリー結合分子を介して標的分子に結合し、かつ光学的に透明な表面上に沈着されたシグナル発生部分において蛍光を誘導する。放出された蛍光の一部は、集光効率の高いレンズ系によって集められ、放出フィルターホイール(BioPoint FW、Ludl Electronics)を介してCCDカメラ(Orca II、Hamamatsu、Bridgewater、NJ)に伝えられる。
【図4】非拡大大面積画像化用のCCD画像化システム 光が検出表面(この図ではマイクロタイタープレートのウェルの底面として示す)上に、収集光学系の側方から角度をつけて導かれる、照射角度可変型CCDイメージャーを示す。角度は、集光効率が最適となるように、また集光レンズが入射ビームに及ぼす障害を避けるように選択される。この構成の利点は、試料ホルダーの底面からの反射が集光レンズによって収集されず、このため蛍光バックグラウンドノイズに寄与しないことである。
【図5】電気的検出、インスタントフィルムによる検出、および特別の装置を使用しない視覚的検出による、拡大を伴わない各顕微鏡的標識粒子の検出(実施例1) 広い検出面積を対象に、さまざまな検出法で、拡大することなく各顕微鏡的標識粒子を検出可能な本発明の能力を示す。アルカリホスファターゼでコーティングされた各標識粒子が、インスタントフィルム、CCDカメラ、および特別の装置を使用しない視覚的検出で検出された。肉眼で観察できる同じ色のスポットを、デジタルカメラで得た画像の中央のパネルに示す。
【図6】少数の細菌の検出を目的とした、非拡大大面積画像化による超高感度ラテラルフロー試験(実施例2) 非拡大大面積画像化による超高感度ラテラルフロー試験の結果を示す。捕捉ラインおよび対照ラインの画像を、アッセイ系に添加した異なる数の大腸菌を用いてさまざまな試験ストリップから示す。棒グラフから、大腸菌数の増加に伴い、捕捉ラインに由来するシグナルも高まることがわかる。この図は、試料中の少数の細菌を検出できる能力を示す。
【図7】低濃度のタンパク質の検出を目的とした、非拡大大面積画像化による超高感度ラテラルフロー試験(実施例3) サイトカインタンパク質IL-2を対象とした、ラテラルフロー形態および非拡大大面積画像化による超高感度試験の結果を示す。この図では、捕捉ラインおよび対照ラインの画像が、アッセイ系に添加された、異なる濃度のIL-2を含む異なる試験ストリップから観察される。棒グラフから、IL-2数の増加に伴い、捕捉ラインに由来するシグナルも高まることがわかる。この図は、試料中の低濃度のタンパク質を検出できる能力を示す。
【図8】血清中の低濃度のタンパク質の検出を目的とした、非拡大大面積画像化による超高感度ラテラルフロー試験(実施例4) 血清中のIL-2を対象としたラテラルフロー試験の結果を示す。この図では、代表的な試験ストリップに由来する捕捉ラインおよび対照ラインの画像を示す。左側のストリップは陰性対照を示す。陰性対照を中央(20 pg/ml)、および右側(200 pg/ml)のストリップと比較すると、IL-2量の増加に伴い、捕捉ラインに由来するシグナルも高まることがわかる。下の棒グラフは、IL-2の添加量に関した5回の反復実験の平均から得られたシグナルを示す。誤差バーは、反復実験で得られたシグナル間における3標準偏差誤差を示す。このデータは、本発明が、血清に含まれる20 pg/mlのIL-2を検出可能であることを示し、このアッセイ法が、複合試料の場合でも、極めて低濃度の標的タンパク質を検出することを示す。
【図9】タンパク質および細菌の多重検出を目的とした、非拡大大面積画像化による超高感度ラテラルフロー試験(実施例5) 非拡大大面積画像化による多重ラテラルフロー試験の結果を示す。この図は、大腸菌およびIL-2の両方を含む試料、大腸菌のみをを含む試料、IL-2のみを含む試料、および大腸菌もIL-2のいずれも含まない試料(左から右へ)が適用された試験ストリップに由来する捕捉ラインおよび対照ラインの画像を示す。この図は、ラテラルフロー試験が高感度であることを示し、複数の標的分子を同じアッセイ法で検出可能なことを示す。
【図10】低濃度のタンパク質の検出を目的とした、インスタントフィルムの使用による超高感度化学発光ラテラルフロー試験(実施例7) 化学発光標識粒子の使用、およびインスタントフィルムによる検出による、ラテラルフロー試験の結果を示す。代表的な試験ストリップに由来する捕捉ラインおよび対照ラインを示す。IL-2(左から右へ:0、20、200、および2000 pg/ml)を含む試料を適用したストリップの比較から、IL-2量の増加に伴い、捕捉ラインに由来するシグナルも高まることがわかる。このデータから、本発明がIL-2をインスタントフィルムを用いてわずか20 pg/ mlの低濃度で検出可能であることがわかる。したがって、この試験は、超高感度で、迅速で、実施が容易で、かつ極めて安価な方法である。
【図11】捕捉スレッドを用いて標的分子:標識粒子複合体を選択する試験装置の略図(実施例8) この実施例で使用される装置の構成を示す。試料を試料ゾーンに充填すると、試料は側方に流れて結合体パッドに至る。この装置の遠位端に位置する吸収パッドから吸われた試料は、アッセイスレッドを流れる検出用ビーズを可溶化して移動する。
【図12】タンパク質の検出を目的とした、捕捉スレッド形態による超高感度試験(実施例8) 捕捉スレッド試験の結果を示す。この図は、IL-2(0、20、および200 pg/ml)を含む試料を適用した試験に由来する捕捉スレッドおよび対照スレッドの画像を示す。結果から、この試験が20 pg/mlのIL-2を検出可能であることがわかる。また、捕捉スレッドに見られる、濃度依存性の斑状の外観は、各標識粒子の画像が得られたことを意味する。
【図13】非拡大大面積画像化および固相捕捉免疫アッセイ法によるタンパク質分子の高感度検出(実施例9) ヒトタンパク質サイトカインIL-2の検出を目的として、タンパク質を捕捉するために固相に結合した状態の抗体を用いる、試料をスキャンする試験の結果を示す。マイクロタイタープレートのウェルは、抗IL-2抗体でコーティングした。IL-2標準の希釈物をウェルに添加した。1時間のインキュベート後に、結合状態にない全粒子を洗浄して除去し、抗IL-2でコーティングした蛍光粒子をウェルに添加した。洗浄後、結合状態の粒子を、拡大することなくCCDイメージャーで可視化した。陰性対照(抗アデノウイルス粒子のパネル)は、極めて少数の粒子がウェル内に残っていることを示している。IL-2パネルでは、IL-2標準の濃度の上昇に伴い、シグナルが高まることが認められる。シグナルは、抗IL-2でコーティングされたウェル、IL-2、および抗IL-2標識粒子の相互作用に基づく。グラフは、アッセイ法の感度(陰性対照の平均を上回り、かつそれ未満の2標準偏差として定義される)を示し、IL-2の濃度は感度と関係する範囲に含まれる。
【図14】非拡大大面積画像化および液相捕捉によるタンパク質分子の高感度検出(実施例10) ヒトタンパク質サイトカインIL-2の検出を目的として、「二重ビーズ」液相サンドイッチ法で試料をスキャンする試験の結果を示す。IL-2標準の希釈物を、抗IL-2でコーティングした磁性粒子および蛍光粒子と混合した。2時間のインキュベート後に、磁性粒子および任意の結合状態の粒子を他の材料から分離し、マイクロタイタープレートへ移し、拡大することなくCCDイメージャーで可視化した。陰性対照(IL-2粒子を含まないパネル)は、ウェル中に粒子がほとんど残っていないことを示す。IL-2のパネルでは、IL-2標準の濃度の上昇に伴ってシグナルの増加が認められる。IL-2のパネルから、抗IL-2でコーティングされた数千個の蛍光粒子が、IL-2との相互作用のために磁性粒子に捕捉されたことがわかる。グラフは、アッセイ法の感度(陰性対照の平均を上回る2標準偏差として定義)を示し、またIL-2濃度が感度と関連することを示す。
【図15】複数のヒトサイトカインを非拡大大面積画像化で検出する免疫アッセイ法(実施例11) マイクロタイターディッシュ中の複数のタンパク質を超高感度で検出するための免疫アッセイ法の戦略を示す。
【図16】全サイトカインIL-2(結合状態および遊離状態)の検出を目的とした、非拡大大面積画像化による競合的免疫アッセイ法(実施例12) 競合的免疫アッセイ法のスキームを示す。マイクロタイターディッシュのウェルは、遊離状態および結合状態のIL-2の両方において曝露されるエピトープと結合する抗IL-2捕捉抗体でコーティングされている。試料を、試料に含まれるサイトカインと、捕捉抗体との結合をめぐって競合するIL-2:ビオチン結合体と混合する。IL-2:ビオチン結合体と結合するストレプトアビジンでコーティングされた蛍光粒子も同混合物に含まれる。この蛍光粒子は、結合体が捕捉抗体部位をめぐって試料中のサイトカインと競合する規模でウェルに結合する。したがって、結合状態の蛍光粒子の数は、試料中の全サイトカインの濃度を反映する。ウェルの底を対象とする非拡大大面積画像化で、蛍光粒子が捕捉抗体と結合する規模が定量される。
【図17】ディップスティック形態および非拡大大面積画像化による核酸分子の高感度検出(実施例13) この図は、ディップスティック形態および非拡大大面積画像化でウイルスDNAを検出するアッセイ法の結果を示す。ビオチン化ウイルスDNAの希釈物をナイロン膜上にスポットした。陰性対照として、非ビオチン化ウイルスのDNAもスポットした。特異的でない結合が生じないようにブロッキング処理を行った後に、アビジンでコーティングされた赤色蛍光ビーズを含む溶液中に膜ストリップを浸した。ビーズを含む溶液は、毛管作用で膜上を上方へ移動し、この過程で、フィルターに結合した状態のDNAと接触した。膜の洗浄後に、CCDベースの非拡大大面積画像化で解析を行った。図の画像中の明るいスポットは、1枚の膜ストリップ上の異なるDNAスポットから得られた蛍光シグナルを示している。各スポットのDNAのコピー数を、各画像の右側に示す。左側の図は、DNAスポットがディップスティック上にどのように配置したかということを示す。
【図18】ラテラルフロー形態および非拡大大面積画像化による非増幅多重SNP解析:オリゴヌクレオチドの連結および試料の適用 この図は、実施例15に記載された試験の最初の段階を示す(試験の最終段階は図19に示す)。対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドの対はゲノムDNAとハイブリダイズする。対の一方の要素をビオチン化する(図中、黄色の三角印で示したオリゴヌクレオチド)。対のもう一方の要素は、一塩基多型に対応する末端ヌクレオチドを有し、固有の多型特異的なオリゴヌクレオチドタグ(図中、明確な塩基(A、T、G、またはC)を有するオリゴヌクレオチド)を有する。連結後、このオリゴヌクレオチドをラテラルフロークロマトグラフィーストリップに適用する。オリゴヌクレオチドタグ配列は、ラテラルフロー膜上のストライプ中に並列するタグ相補物とハイブリダイズする。ゲノムDNA中に存在する多型に対応するタグ配列のみが、ビオチン化オリゴヌクレオチドと連結する。したがって、ゲノムDNA試料中の多型に対応するタグ相補物のストライプのみが、ビオチン化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする。
【図19】ラテラルフロー形態および非拡大大面積画像化による非増幅多重SNP解析:検出 実施例15に記載された試験の最終段階を示す(試験の最初の段階は図18に示す)。図18に示したように、ラテラルフロークロマトグラフィーの後に、ビオチン分子は、ゲノムDNA試料の遺伝子型に対応するタグを含む膜上のストライプと結合する。ストライプのこのパターンは、(ビオチン部分と結合する)ストレプトアビジンおよびアルカリホスファターゼで同時コーティングされている粒子との結合によって検出される。化学発光産物を生じるアルカリホスファターゼの基質を添加後、ビオチン化オリゴヌクレオチドを含むストライプをCCDイメージャーで検出する。
Claims (116)
- 以下の段階を含む、試料中の標的分子を検出する方法:
a.標的分子を標識粒子と接触させる段階(標識比は100未満)、および
b.検出ゾーンで個々の標的分子:標識粒子複合体を同時に検出する段階。 - 複合体が検出ゾーンに、1 mm2の検出面積あたり10個未満の複合体密度でランダムに分散している、請求項1記載の方法。
- 標的分子が検出ゾーンに、1 mm2の検出面積あたり1個未満の複合体密度でランダムに分散している、請求項2記載の方法。
- 検出が、5倍を超える拡大を伴わない、請求項1記載の方法。
- 検出が、2倍を超える拡大を伴わない、請求項4記載の方法。
- 検出が、1倍を超える拡大を伴わない、請求項5記載の方法。
- 検出が、0.2倍を超える拡大を伴わない、請求項6記載の方法。
- 標的分子がタンパク質である、請求項1記載の方法。
- 標的分子が核酸である、請求項1記載の方法。
- 標的分子が、100 kD未満の分子量を有する、請求項1記載の方法。
- 標的分子が、10 kD未満の分子量を有する、請求項10記載の方法。
- 標的分子が、1 kD未満の分子量を有する、請求項11記載の方法。
- 検出段階が、標的分子の複数の非重複カテゴリーを検出および同定する、請求項1記載の方法。
- 標的分子上のカテゴリー特異的結合部位が、天然抗体もしくは組換え抗体またはアプタマーと特異的に結合する部位である、請求項1記載の方法。
- 標的分子上のカテゴリー特異的結合部位が、DNA、RNA、またはPNAのプローブと特異的に結合する部位である、請求項1記載の方法。
- 標的分子上のカテゴリー特異的結合部位が、一塩基多型を含む核酸多型であるか、またはそのすぐ隣に位置する、請求項1記載の方法。
- 試料が、多細胞生物から得られる液体または組織を含む、請求項1記載の方法。
- 試料が、動物の体液または組織を含む、請求項17記載の方法。
- 試料がヒトに由来する、請求項18記載の方法。
- 試料が非ヒト脊椎動物に由来する、請求項18記載の方法。
- 試料が、以下からなる群の一部分であるか、または以下からなる群の一部分に由来する、請求項18記載の方法:呼吸器、泌尿生殖器、生殖管、中枢神経系、尿、血液、皮膚、血漿、血清、唾液、創傷組織、創傷滲出物、生検、糞便、および固形組織の試料。
- 試料が植物に由来する、請求項1記載の方法。
- 試料が、環境中の空気もしくは水、または環境に曝露された表面、物体、もしくは生物の試料採取によって得られる、請求項1記載の方法。
- 試料が、以下からなる群から選択されるか、由来するか、または得られる、請求項1記載の方法:
ヒトもしくは動物における、薬理学的製品、化粧品、血液製剤、または局所用もしくは内服用の他の産物の製造における原材料、最終材料、または中間材料;食品または飲料の製造における原材料、中間材料、または最終材料;医学的装置またはインビトロ診断装置の製造における原材料、中間材料、または最終材料;化学製品;産業的表面;装置;および機器。 - 選択法を用いて複合体を検出表面に沈着させ、かつ選択法が、磁気選択、遠心、沈降、および濾過からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 試料を、カテゴリー結合分子に結合する磁性粒子と接触させる段階を含む、請求項25記載の方法。
- 選択法の一つを用いて、選択部分を使用することなく標的分子を検出ゾーンに沈着させる、請求項25記載の方法。
- 標的分子を液体中で、液体の平均密度より平均密度が大きい標的分子特異的選択部分と接触させ、続いて重力、遠心力、または求心力を用いて検出表面上に沈着させる、請求項25記載の方法。
- 試料を処理して、試料を液化し、かつ/またはホモジナイズする、請求項1記載の方法。
- 接触させる段階が液相で行われる、請求項1記載の方法。
- 接触させる段階が、液相と固相の界面で行われる、請求項1記載の方法。
- 試料を処理して、標的分子以外の物質または物体を除去する、請求項1記載の方法。
- 接触させる段階の前に、標的分子を検出表面上に固定する、請求項1記載の方法。
- 標的分子を、検出ゾーンの基材または基質に結合された状態のカテゴリー結合分子によって、検出ゾーン内に特異的に結合させる、請求項1記載の方法。
- 標的分子を、検出ゾーンの基材または基質に対して化学結合を形成することによって、検出ゾーン内に特異的に結合させる、請求項1記載の方法。
- 標的分子を、風乾、加熱固定、および化学的固定からなる群より選択される段階によって検出ゾーンに固定する、請求項1記載の方法。
- 標的分子上のカテゴリー特異的結合部位が、標識粒子による接触に利用可能となるように試料を処理する、請求項1記載の方法。
- 非結合標識粒子を、検出する段階の前に複合体から除去する、請求項1記載の方法。
- 標識粒子が光シグナル発生特性を有し、検出ゾーンに存在しない標識粒子によって放出されたシグナルを吸収するために、コロイド状物質もしくは可溶性物質が添加される、請求項1記載の方法。
- 試料を、標的分子のさまざまな非重複カテゴリーの存在に関して並行して試験される個々のアリコートに細分する、請求項1記載の方法。
- 各アリコートを、カテゴリー結合分子の異なる非重複ファミリーと結合された標識粒子の集団と接触させる、請求項40記載の方法。
- 試料を、標的体の非重複カテゴリーに特異的に結合するカテゴリー結合分子の異なるファミリーと連続的に接触させる、請求項40記載の方法。
- 検出表面が、固体ガラス、固体プラスチック、マイクロタイタープレートのウェルの表面、吸水性膜、プラスチックストリップ、キャピラリチューブの表面、マイクロ流体チャンバーの表面、およびマイクロ流体チャネルの表面からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- ラテラルフロークロマトグラフィーを含む、請求項1記載の方法。
- 一連の試料に対して自動的に繰り返される、請求項1記載の方法。
- 試料を、検出するための手段を含む装置に自動的に装填する、請求項45記載の方法。
- 物理的に関連付けられ、かつ検出する手段を含む装置に自動的かつ連続的に装填される一連の検出ゾーンに、試料を自動的に沈着させる、請求項45記載の方法。
- 複合体を照射して、検出可能なシグナルを発生させる、請求項1記載の方法。
- 複合体の照射の結果として放出、散乱、反射、または吸収される光を検出する、請求項1記載の方法。
- 検出する段階が蛍光を検出する、請求項1記載の方法。
- 検出する段階が化学発光を検出する、請求項1記載の方法。
- 複合体を照射する手段が、1種類または複数の種類のレーザーを含む、請求項1記載の方法。
- 複合体を照射する手段が1種類または複数の種類の発光ダイオードを含む、請求項1記載の方法。
- 複合体を照射する手段が白色光源を含む、請求項1記載の方法。
- 複合体を照射する手段が、複合体を検出するのに適した波長の光を試料に照射するように適合させた、1種類または複数の種類の光学的フィルターを含む、請求項1記載の方法。
- 標的体を照射する手段が、標識粒子を検出するのに適した波長の光を試料に照射するように適合させた、1種類または複数の種類の光学的フィルターを含む、請求項1記載の方法。
- 放出、散乱、伝達、または吸収される光を検出する手段が、標識粒子の照射に由来するシグナルを検出するように適合させた光学的フィルターを含む、請求項1記載の方法。
- 検出する段階が照射を使用しない、請求項1記載の方法。
- 検出する段階が熱放射を検出する、請求項1記載の方法。
- 検出する段階が光学的吸収度を検出する、請求項1記載の方法。
- 光学的吸収度が赤外領域にある、請求項60記載の方法。
- 検出する段階が蛍光偏光を検出する、請求項1記載の方法。
- 検出する段階が光学的反射率を検出する、請求項1記載の方法。
- 検出する段階が光の散乱を検出する、請求項1記載の方法。
- 検出する段階がラマン散乱を検出する、請求項1記載の方法。
- 標識粒子の大きさが20ミクロン未満である、請求項1記載の方法。
- 標識粒子の大きさが10ミクロン未満である、請求項66記載の方法。
- 標識粒子の大きさが5ミクロン未満である、請求項67記載の方法。
- 標識粒子の大きさが1ミクロン未満である、請求項68記載の方法。
- 標識粒子の大きさが100 nm未満である、請求項69記載の方法。
- 標識粒子の大きさが10 nm未満である、請求項70記載の方法。
- 標識粒子が、ラテックス粒子、シリカ粒子、量子ドット、共鳴光散乱粒子、上方変換リン光体、または主に金もしくは銀で構成される粒子である、請求項1記載の方法。
- 標識粒子が酵素シグナル発生部分でコーティングされている、請求項1記載の方法。
- 標識粒子が、粒子容積の1立方ミクロンあたりの酵素シグナル発生部分の平均密度が2に等しいか、またはこれより大きい酵素シグナル発生部分を含む、請求項73記載の方法。
- 標識粒子が、アルカリホスファターゼ酵素または西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素であるシグナル発生部分を含む、請求項1記載の方法。
- 標識粒子が、試料とあらかじめ接触させたカテゴリー結合分子に結合する、請求項1記載の方法。
- 標識粒子が、有機性蛍光体、上方制御リン光体、ランタニド、量子ドット、および非蛍光基質から蛍光産物を生じる酵素からなる群より選択されるシグナル発生部分を含む、請求項1記載の方法。
- シグナル発生部分を含む標識粒子が、蛍光シグナル特性を有し、かつ以下からなる群より選択されるシグナル発生部分で着色されるか、または同シグナル発生部分と結合された粒子である、請求項1記載の方法:有機性蛍光体、上方制御リン光体、ランタニド、量子ドット、および非蛍光基質から蛍光産物を生じる酵素。
- 標識粒子が、蛍光シグナル発生特性を有するシグナル発生部分を含む、請求項1記載の方法。
- 標識粒子が、化学発光シグナル発生特性を有するシグナル発生部分を含む、請求項1記載の方法。
- 分子がアクリジニウムエステルである、請求項80記載の方法。
- 標識粒子が、発色性シグナル発生特性を有するシグナル発生部分を含む、請求項1記載の方法。
- 標識粒子が、光散乱特性を有するシグナル発生部分を含む、請求項1記載の方法。
- シグナル発生部分が、光散乱シグナル発生特性を有する、請求項1記載の方法。
- カテゴリー結合分子と標的分子上のカテゴリー特異的結合部位との複合体の形成を可能とする条件下で、試料をカテゴリー結合分子を含む標識粒子と接触させる、請求項1記載の方法。
- カテゴリー結合分子が抗体を含む、請求項85記載の方法。
- カテゴリー結合分子がアプタマーを含む、請求項85記載の方法。
- カテゴリー結合分子が核酸またはペプチド核酸を含む、請求項85記載の方法。
- カテゴリー結合分子がリガンドを含む、請求項85記載の方法。
- カテゴリー結合分子が、分子量が100 kD未満の分子を含む、請求項85記載の方法。
- カテゴリー結合分子が、分子量が10 kD未満の分子を含む、請求項90記載の方法。
- カテゴリー結合分子が、分子量が1 kD未満の分子を含む、請求項91記載の方法。
- 標識粒子がさまざまな集団を含み、各集団は、カテゴリー結合分子の異なる非重複ファミリーと結合される、請求項1記載の方法。
- 各ファミリーが、検出ゾーンの区画に安定に結合したカテゴリー結合分子のファミリーにも特異的に結合する標的分子のカテゴリーと特異的に結合し、検出ゾーンに結合される各ファミリーは、別個の部位に結合され、該部位は検出する段階で区別される、請求項93記載の方法。
- 標識粒子の各集団が、同じシグナル発生クラスおよびサインを有する、請求項94記載の方法。
- 各集団が、別個のシグナル発生サインまたはシグナル発生クラスを有する、請求項93記載の方法。
- 標識粒子の集団のシグナルサインを区別するように適合させた光学的フィルターを含む、請求項96記載の方法。
- カテゴリー結合分子のファミリーが、1より大きいファミリー複雑度を有する、請求項93記載の方法。
- カテゴリー結合分子のファミリーが、5以上のファミリー複雑度を有する、請求項93記載の方法。
- カテゴリー結合分子のファミリーが、10以上のファミリー複雑度を有する、請求項93記載の方法。
- カテゴリー結合分子のファミリーが、20以上のファミリー複雑度を有する、請求項93記載の方法。
- 検出する段階が、試料を自動的に追跡するためのバーコードまたはこれと同等の標識である容器内で行われる、請求項1記載の方法。
- 検出する段階が、同じ表面の複数の画像の配列を容易にするために、位置合わせマークを有する表面上で行われる、請求項1記載の方法。
- 検出ゾーンの特定領域の領域内で対照マークまたは対照細胞を検出する、請求項1記載の方法。
- 放射、散乱、伝達、または吸収される光を検出する手段が、複合体の照射に由来するシグナルを検出するように適合された光学的フィルターを含む、請求項1記載の方法。
- 検出する段階が、光電検出器の使用を含む、請求項1記載の方法。
- 検出する段階が、光電アレイ検出器の使用を含む、請求項1記載の方法。
- 光電検出器がCCD検出器またはCMOS検出器を含む、請求項107記載の方法。
- 放射、散乱、または吸収される光を検出する手段が、画像増強装置を含まない、請求項1記載の方法。
- 検出する段階が、光電子増倍管検出器の使用を含む、請求項1記載の方法。
- 検出する段階が、光ダイオード検出器の使用を含む、請求項1記載の方法。
- 標的分子を検出および同定する手段が、感光性フィルムを含む、請求項1記載の方法。
- 検出する段階が、直接視検出を含む、請求項1記載の方法。
- 標的分子の数が、検出する段階で得られた画像を解析することによって、検出する段階から推定される、請求項1記載の方法。
- 標的分子のカテゴリーが、画像解析ソフトウェアを用いて検出する段階から推定される、請求項1記載の方法。
- 画像解析ソフトウェアが、複合体から発生したシグナルを他のシグナルと識別する機能をさらに含む、請求項115記載の方法。
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