DE102014220306B3 - Automatisches Verfahren zur Beobachtung von Zellkulturwachstum - Google Patents
Automatisches Verfahren zur Beobachtung von Zellkulturwachstum Download PDFInfo
- Publication number
- DE102014220306B3 DE102014220306B3 DE102014220306.6A DE102014220306A DE102014220306B3 DE 102014220306 B3 DE102014220306 B3 DE 102014220306B3 DE 102014220306 A DE102014220306 A DE 102014220306A DE 102014220306 B3 DE102014220306 B3 DE 102014220306B3
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- image
- cell culture
- nutrient medium
- microscope
- growth
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn - After Issue
Links
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 41
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 32
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 4
- 238000001454 recorded image Methods 0.000 claims description 5
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 claims 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 26
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000002313 adhesive film Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000011244 combinatorial administration Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002952 image-based readout Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/48—Automatic or computerized control
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Computer Hardware Design (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Multimedia (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Bei dem erfindungsgemäß automatisierten Verfahren zur Beobachtung von Zellkulturwachstum, insbesondere von Bakterienwachstum wird eine Aufnahmeschale (24) mit einem Nährmedium (38) bereitgestellt, auf und/oder in das eine Zellkultur, insbesondere eine mit Bakterien versetzte Probe menschlichen oder tierischen Gewebes wie z.B. Blut, welche zusätzlich ein oder mehrere Reagenzien, insbesondere Antibiotika enthält, appliziert ist. Ein Mikroskop (10) mit Kamera (18) und entlang der optischen Achse (20) verfahrbaren Bildaufnahmeebene wird bereitgestellt und die Aufnahmeschale (24) zur Beobachtung eines potentiellen Wachstums der Zellkultur wird in dem Nährmedium (38) in das Mikroskop (10) verbracht. In vorgebbaren zeitlichen Abständen im insbesondere einstelligen Minutenbereich wird mittels der Kamera (18) des Mikroskops (10) ein Bild des Nährmediums (38) aufgenommen, indem mittels des verfahrbaren Trägers (14) und/oder der Aufnahmeoptikeinheit (16) die Bildaufnahmeebene entlang der optischen Achse (20) durch das Nährmedium (38) hindurch verfahren wird, pro Bildaufnahmeebene ein Bild aufgenommen wird und mittels einer Bildauswerte-Software aus der Gruppe der aufgenommenen Bilder das kontrastreichste Bild des Nährmediums (38) oder ein Bild des Nährmediums (38) mit für die nachfolgend genannte automatische Bildweiterverarbeitung ausreichendem Kontrast automatisch ausgewählt und gegebenenfalls gespeichert wird. Mittels der Bildauswerte-Software wird anhand des ausgewählten Bildes automatisch die Größe der von der Zellkultur eingenommenen Fläche ermittelt. Anhand der Größen der von der Zellkultur eingenommenen Flächen der jeweiligen ausgewählten Bilder wird ermittelt, ob die Zellkultur wächst oder nicht.
Description
- Die Erfindung betrifft ein automatisches Verfahren zur insbesondere Echtzeitverfolgung von Zellkulturwachstum und insbesondere von Bakterienwachstum.
- Es existieren verschiedene Anwendungsgebiete, bei denen es von Interesse ist, ein Zellkulturwachstum möglichst in Echtzeit beobachten zu können. Als ein Beispiel sei die Bestimmung von Antibiotika-Resistenz/Wirksamkeit genannt.
- Das konventionelle Verfahren zur Bestimmung von Antibiotika-Resistenzen bzw. zur Bestimmung der Wirksamkeit von Antibiotika basiert auf einer makroskopischen Betrachtungsweise. Dieses Verfahren bedarf einer relativ großen Dauer, da Wachstumsbeurteilungen erst dann erfolgen können, wenn Bakterienkolonien mit dem bloßen Auge zu erkennen sind. Dies kann zwischen 6 bis 24 Stunden der Fall sein, was in zeitkritischen Fällen nicht tolerabel ist.
- Unter der Bezeichnung VITEK®2 existiert ein alternatives, semiautomatisches Verfahren für die schnelle Empfindlichkeitstestung von Mikroorganismen. Hierbei wird eine Transmissionsoptik eingesetzt. Die Menge von eine Probe durchscheinendem Licht gibt dabei Rückschlüsse auf das Zellkulturwachstum. Je stärker das Wachstum ist, desto weniger intensiv ist das transmittierte Licht. Allerdings liefert auch dieses Verfahren zuverlässig erste Ergebnisse leider erst frühestens nach einigen Stunden.
- Die beiden zuvor genannten Verfahren sind nicht in der Lage, die Wirkung von Antibiotika auf einzelne Zellen zu bestimmen, sondern erfordern eine Vielzahl von zu beobachtenden Zellen bzw. die Trübung einer Bakteriensuspension.
- Aufgabe der Erfindung ist es, ein automatisiertes Verfahren zur Beobachtung von Zellkulturwachstum, insbesondere von Bakterienwachstum, anzugeben, bei dem die Wachstumsbeurteilung wesentlich schneller als bei bekannten Verfahren möglich ist.
- Zur Lösung dieser Aufgabe wird mit der Erfindung ein automatisiertes Verfahren zur Beobachtung von Zellkulturwachstum, insbesondere von Bakterienwachstum vorgeschlagen, wobei bei dem Verfahren
- – eine Aufnahmeschale mit einem Nährmedium bereitgestellt wird, auf und/oder in das eine Zellkultur, insbesondere eine mit Bakterien versetzte Probe menschlichen oder tierischen Gewebes wie z.B. Blut, welche zusätzlich ein oder mehrere Reagenzien, insbesondere Antibiotika enthält, appliziert ist,
- – ein eine optische Achse aufweisendes Mikroskop mit Kamera und einem längs der optischen Achse automatisch verfahrbaren Träger für die Aufnahmeschale und/oder einer längs der optischen Achse automatisch verfahrbaren Aufnahmeoptikeinheit bereitgestellt wird,
- – die Aufnahmeschale zur Beobachtung eines potentiellen Wachstum der Zellkultur in dem Nährmedium in das Mikroskop verbracht wird,
- – in vorgebbaren zeitlichen Abständen im insbesondere einstelligen Minutenbereich mittels der Kamera des Mikroskops ein Bild des Nährmediums aufgenommen wird, indem mittels des verfahrbaren Trägers und/oder der Aufnahmeoptikeinheit des Mikroskops die Bildaufnahmeebene entlang der optischen Achse durch das Nährmedium hindurch verfahren wird, pro Bildaufnahmeebene ein Bild aufgenommen wird und mittels einer Bildauswerte-Software aus der Gruppe der aufgenommenen Bilder das kontrastreichste Bild des Nährmediums oder ein Bild des Nährmediums mit für die nachfolgend genannte automatische Bildweiterverarbeitung ausreichendem Kontrast automatisch ausgewählt und gegebenenfalls gespeichert wird,
- – mittels der Bildauswerte-Software anhand des ausgewählten Bildes automatisch die Größe der von der Zellkultur eingenommenen Fläche ermittelt wird und
- – anhand der Größen der von der Zellkultur eingenommenen Flächen der jeweiligen ausgewählten Bilder ermittelt wird, ob die Zellkultur wächst oder nicht.
- Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Bildverarbeitungs-Software eingesetzt, die zur Auswertung von in zeitlichen Abständen automatisch aufgenommenen Bildern der Zellkultur eingesetzt wird. Ein Nährmedium mit der Zellkultur wird in eine insbesondere miniaturisierte Aufnahmeschale appliziert. Das Nährmedium enthält ein oder mehrere Reagenzien, insbesondere Antibiotika. Bei der Zellkultur handelt es sich insbesondere um Bakterien, die auf ihre Antibiotika-Resistenz oder anhand derer die Wirksam eines Antibiotikums getestet werden sollen.
- Die in zeitlichen Abständen erfolgende automatische Bilderstellung geschieht mit Hilfe eines (insbesondere Auflicht- oder Durchlicht-)Mikroskops mit Kamera und einer Aufnahmeoptikeinheit sowie einem Träger für die Aufnahmeschale, die relativ zueinander längs der optischen Achse insbesondere in Kleinstschritten verfahrbar sind. Dies ermöglicht es, die Bildaufnahmeebene stets automatisch derart zu wählen, dass möglichst kontrastreiche Bilder von der Zellkultur aufgenommen werden können. Hierzu wird die Bildaufnahmeebene durch Verfahren der Aufnahmeoptikeinheit und/oder des Trägers längs der optischen Achse durch das Nährmedium hindurch bewegt, wobei in den unterschiedlichen Bildaufnahmeebenen jeweils ein Bild aufgenommen wird. Durch eine nachfolgende oder zeitgleich ablaufende Bildverarbeitung wird möglichst das kontrastreichste Bild ermittelt und ausgewählt. Alternativ reicht es möglicherweise aus, aus der Gruppe der jeweils aufgenommenen Bilder eines der kontrastreichsten auszuwählen, solange der Kontrast ausreichend groß ist, um die nachfolgend genannte Bildauswertung durchführen zu können. Derartige Bildverarbeitungen werden z.B. in Autofokus-Kameras eingesetzt und können dementsprechend bei der Erfindung genutzt werden.
- Zwecks Auswählens des kontrastreichsten Bildes oder des Bildes mit für die nachfolgende Bildweiterverarbeitung ausreichendem Kontrast kann entweder zunächst für jede angefahrene Bildaufnahmeebene ein Bild aufgenommen und gespeichert sowie das Auswählen anschließend erfolgen oder das als erstes aufgenommene Bild als das bis dahin kontrastreichstes Bild ermittelte Bild abgespeichert werden, um jedes weitere aufgenommene Bild mit dem abgespeicherten Bild zu vergleichen und, wenn es kontrastreicher ist als das abgespeicherte Bild, als das bis dahin kontrastreichstes ermittelte Bild abzuspeichern.
- Durch ein weiteres Bildverarbeitungs-Softwaremodul kann nun das jeweils ausgewählte Bild im Hinblick auf die Größe der von der Zellkultur eingenommenen Fläche automatisch untersucht werden. Damit lässt sich also quasi in Echtzeit das Wachstum der Zellkultur beobachten. Ein Beispiel einer hierfür geeigneten Software ist in Andreas Pippow, Stefan Borbe, Sebastian Röse, Stefan Precht, Thomas Berlage, "Zellteilungsdauer im High-Content-Screening bestimmen", Laborwelt, Nr. 1/2012, S. 33 und 34, und Thomas Berlage, Andreas Pippow, "Neues Potential für die Pharmaforschung", GIT Labor-Fachzeitschrift, 10/2013, S. 630 bis 635, beschrieben
- Ein wesentliches Merkmal der Erfindung ist die Möglichkeit der automatischen Bildaufnahme bei möglichst optimalem Kontrast, wofür es der Verfahrbarkeit der Aufnahmeoptikeinheit und/oder des Trägers des Mikroskops wie bei einer Autofokus-Funktion bedarf. Die Bildaufnahmeebene muss zwecks Aufnahme von kontrastreichen Bildern allein deshalb schon von Zeit zu Zeit nachgeführt werden, weil das Nährmedium im Laufe der Zeit verdunsten könnte und somit sich der Nährmedium-Spiegel in der Aufnahmeschale verändert.
- Das Mikroskop weist zweckmäßigerweise einen entlang der optischen Achse insbesondere in kleinen Stufen von wenigen zig µm verfahrbaren Träger für die Aufnahmeschale auf. Man könnte auch darüber nachdenken, die Aufnahmeoptikeinheit des Mikroskops längs der optischen Achse zu verfahren, was aber wesentlich aufwendiger ist als das Verfahren des Trägers. Hierbei bedarf es eines Antriebs, der ein Verfahren in zweckmäßigerweise Kleinstschritten erlaubt.
- In weiterer zweckmäßiger Ausgestaltung der Erfindung kann vorgesehen sein, dass anhand der Größen der von der Zellkultur eingenommenen Flächen der jeweiligen ausgewählten Bilder ermittelt wird, ob die Zellkultur wächst und, wenn ja, mit welcher Wachstumsrate.
- Wie bereits oben erwähnt, ist davon auszugehen, dass zu den jeweiligen Zeitpunkten, zu denen das nächste möglichst kontrastreiche Bild aufgenommen werden soll, sich auch die Bildaufnahmeebene gegenüber der jeweils früheren Position verändert hat. Aus Gründen der Zeiteinsparung kann es statt des jeweiligen zur Erzielung eines möglichst kontrastreichen Bildes erfolgenden Durchfahrens der Bildaufnahmeebene durch das Nährmedium von Vorteil sein, wenn der Bereich, innerhalb dessen die Bildaufnahmeebene in dem Nährmedium zur Ermittlung des Bildes des Nährmediums mit größtem Kontrast oder zur Ermittlung eines Bildes des Nährmediums mit einem für die Ermittlung der Größe der Fläche der Zellkultur ausreichendem Kontrast auf den Bereich um die Position der Bildaufnahmeebene des zeitlich letzten Bildes oder eines der zeitlich vorherigen Bilder beschränkt wird. Hierbei wird davon ausgegangen, dass sich die Bildaufnahmeebene, in der das vermeintlich schärfste Bild aufgenommen werden kann, von einem Aufnahmezeitpunkt zum nächsten Aufnahmezeitpunkt kaum verändert. Allerdings kann das jeweils vollständige Durchfahren der Bildaufnahmeebene durch das Nährmedium zu den einzelnen Bildaufnahmezeitpunkten deshalb erforderlich sein, weil die Autofokus-Einheit aufgrund äußerer Einflüsse, beispielsweise thermischer Einflüsse oder Vibrationen, seit dem letzten Bildaufnahmezeitpunkt verjustiert ist.
- Wie bereits oben erwähnt, ist es aus verschiedenen Gründen zweckmäßig, eine möglichst kleinformatige Aufnahmeschale zu verwenden. Eine Möglichkeit ist es, eine miniaturisierte Aufnahmeschale zu verwenden, die zwei Folien mit einem zwischen diesen angeordneten Rahmen aufweist. Bei den beiden Folien handelt es sich beispielsweise um Objektträgergläser. Der Rahmen umgibt dabei einen Aufnahmeraum, der durch den Rahmen selbst seitlich und durch die beiden Folien nach oben und nach unten geschlossen ist. In diesen Aufnahmeraum wird dann das Nährmedium (z.B. Agar) appliziert, welches mit den zu beobachtenden Zellkulturen und einem oder mehreren Reagenzien versetzt ist.
- Wie sich aus dem Obigen ergibt, ist also Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein automatisiertes Verfahren zur Echtzeitverfolgung von Bakterienwachstum bzw. von Zellkulturwachstum bzw. von Wachstum von Mikroorganismen. Das Verfahren basiert auf der Verwendung eines Mikroskops, welches in definierten Zeitabständen, unterstützt durch eine Autofokus-Einheit, Aufnahmen von mit den Zellkulturen bewachsenen, insbesondere miniaturisierten Wachstumsflächen (Nährmedium) erstellt. Die Aufnahmen bzw. Bilder werden anschließend von einer Bildverarbeitungs-Software vorverarbeitet und analysiert, um letztendlich anhand der Größe der Fläche der Bilder, die zu den jeweiligen Zeitpunkten aufgenommen und ausgewertet worden sind, eine Wachstumskurve oder eine andere Art der Repräsentation des Wachstums der Zellkultur zu erstellen.
- Bei dem erfindungsgemäß automatisierten Verfahren zur Beobachtung von Zellkulturwachstum, insbesondere von Bakterienwachstum wird also eine Aufnahmeschale mit einem Nährmedium bereitgestellt, auf und/oder in das eine Zellkultur, insbesondere eine mit Bakterien versetzte Probe menschlichen oder tierischen Gewebes wie z.B. Blut, welche zusätzlich ein oder mehrere Reagenzien, insbesondere Antibiotika enthält, appliziert ist. Ein Mikroskop mit Kamera und entlang der optischen Achse verfahrbaren Bildaufnahmeebene wird bereitgestellt und die Aufnahmeschale zur Beobachtung eines potentiellen Wachstums der Zellkultur wird in dem Nährmedium in das Mikroskop verbracht. In vorgebbaren zeitlichen Abständen im insbesondere einstelligen Minutenbereich wird mittels der Kamera des Mikroskops ein Bild des Nährmediums aufgenommen wird, indem Bildaufnahmeebene entlang der optischen Achse durch die Aufnahmeschale das Nährmedium hindurch verfahren wird, pro Bildaufnahmeebene ein Bild aufgenommen wird und mittels einer Bildauswerte-Software aus der Gruppe der aufgenommenen Bilder das kontrastreichste Bild des Nährmediums oder ein Bild des Nährmediums mit für die nachfolgend genannte automatische Bildweiterverarbeitung ausreichendem Kontrast automatisch ausgewählt und gegebenenfalls gespeichert wird. Mittels der Bildauswerte-Software wird anhand des ausgewählten Bildes automatisch die Größe der von der Zellkultur eingenommenen Fläche ermittelt. Anhand der Größen der von der Zellkultur eingenommenen Flächen der jeweiligen ausgewählten Bilder wird ermittelt, ob die Zellkultur wächst oder nicht.
- Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Echtzeitverfolgung von Bakterienwachstum auf der Ebene von Bakterienkolonien sowie auf zellulärer Ebene, was bedeutet, dass einerseits durch die Beobachtung einer Wachstumsflächenzunahme schnell eine Wachstumskurve abgeleitet werden kann und andererseits zusätzlich die Zellteilung jedes einzelnen Individuums verfolgt werden kann. Dies ermöglicht eine Beschleunigung gegenüber konventionellen Resistenztests, die Bereitstellung eines neuen Ansatzes für die beispielsweise Antibiotika-Forschung sowie die automatisierte Verfolgung von Bakterienwachstum/Bakterienteilung über kurze und lange Zeiträume.
- Die Wirkungen und Vorteile der Erfindung lassen sich wie folgt zusammenfassen:
- – Durch den Einsatz von optimierten, miniaturisierten Wachstumsflächen wird eine automatisierte, mikroskopische Verfolgung des Wachstums auf zellulärer Ebene ermöglichst. Zusätzlich werden durch die Miniaturisierung der Wachstumsfläche Reagenzien und Probematerial eingespart, was einen wirtschaftlichen Vorteil gegenüber der konventionellen Methode mit sich bringt.
- – Durch die Verwendung einer Autofokus-Einheit des Mikroskops wird eine automatisierte Erstellung von Aufnahmen/Bildern in bestimmten Zeitabständen möglich. Ohne die Autofokus-Einheit wäre ein manuelles Nachfokussieren vor jeder neuen Aufnahme nötig, was eine Automatisierung zuwiderlaufen würde.
- – Durch die Erstellung von Wachstumskurven aus der von beispielsweise Bakterien bewachsenen Fläche kann die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) von Antibiotika signifikant, nämlich in 2 bis 3 Stunden statt, wie konventionell, in 5 bis 24 Stunden, beschleunigt werden.
- Neben der Erstellung einer Wachstumskurve anhand einer auf Vorder-/Hintergrunderkennung basierten Flächenbestimmung basiert die Erfindung ferner auf der Verwendung einer auf Kontraststärke ausgerichteten Autofokus-Funktion und der Verwendung insbesondere miniaturisierter Wachstumsflächen (beispielsweise auf Agarbasis oder einer anderen Nährmediumbasis).
- Anwendungsfälle für das erfindungsgemäße Verfahren sind die
- – Beobachtung von (bakteriellen) Zellteilungen,
- – Bestimmung von Antibiotika-Resistenzen,
- – Beobachtung des Einflusses diverser Stoffe auf das Bakterienwachstum bzw. die Zellteilungen und
- – Beobachtung des Einflusses kombinatorischer Antibiotika-Gabe auf das Bakterienwachstum bzw. die Zellteilungen.
- Bildverarbeitungs-Software zur automatischen Ermittlung der Größe von ausgewählten Bereichen eines Bildes wie im vorliegenden Fall der von der Zellkultur eingenommenen Fläche, ist grundsätzlich bekannt. Ein Beispiel ist die unter der Bezeichnung ZETA von der Anmelderin entwickelte Software (siehe auch die beiden oben angegebenen Nichtpatentliteraturstellen).
- Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Zeichnung näher erläutert. Im Einzelnen zeigen dabei:
-
1 schematisch eine Darstellung eines erfindungsgemäß verwendbaren Auflicht-Mikroskops, -
2 eine Vergrößerung der Objektträgeranordnung mit miniaturisierter Aufnahmeschale, -
3 schematisch das Funktionsprinzip zur automatischen Ermittlung des kontrastreichsten Bildes, -
4 Beispiele für Aufnahmen der wachsenden Zellkultur zu verschiedenen Zeitpunkten A, B und C und die diesen Aufnahmen entsprechenden, aufgearbeiteten Bilder zur Vordergrund/Hintergrunderkennung zwecks automatischer Zellkultur-Flächenermittlung und -
5 drei Beispiele für erfindungsgemäß erstellte Wachstumskurven. - In
1 ist ein in diesem Ausführungsbeispiel Auflicht-Mikroskop10 gezeigt, das einen Mikroskopkörper12 mit Auflicht-Beleuchtungseinheit13 und einem insbesondere in Kleinstschritten längs der optischen Achse des Mikroskops verfahrbaren Träger14 (verfahrbarer Z-Tisch) aufweist. Der Mikroskopkörper12 umfasst ferner eine Aufnahmeoptikeinheit16 und eine Kamera18 . Die optische Achse ist bei20 angedeutet. - Alternativ zu dem Auflicht-Mikroskop kann nach der Erfindung auch ein Durchlicht-Mikroskop eingesetzt werden. Die Positionierung der in diesem Fall einzusetzenden Durchlicht-Beleuchtungseinheit ist gestrichelt bei
22 gezeigt. Auf dem Träger14 befindet sich eine Aufnahmeschale24 , die in2 in größerem Maßstab gezeigt ist. Die Aufnahmeschale24 weist einen unteren Objektträger26 und ein Deckglas28 als insbesondere zwei Folien oder Scheiben30 ,31 auf, zwischen denen ein insbesondere als doppelseitiger Klebefilm32 ausgebildeter Rahmen34 angeordnet ist. Dieser Rahmen34 definiert in seinem Innern den Aufnahmeraum36 für ein Nährmedium38 (bei dem es sich beispielsweise um Agar handelt), auf dem Bakterien40 wachsen. Das Nährmedium ist mit einem Reagenz, wie beispielsweise einem Antibiotikum versehen. Die Bakterien40 können Teil beispielsweise einer Blutprobe, die es zu untersuchen gilt, sein. - In
3 ist das Funktionsprinzip der automatischen Ermittlung des kontrastreichsten Bildes, welches zu einem bestimmten Zeitpunkt nach Beginn des Bakterienwachstums aufgenommen wird, dargestellt. Mittels des in Kleinstschritten verfahrbaren Trägers14 wird die Bildaufnahmeebene durch die Aufnahmeschale24 hindurch verfahren. Dabei wird pro Schritt ein Bild aufgenommen. Abgefragt wird dabei die Kontraststärke in verschiedenen Z-Positionen. In3 ist dies am Beispiel der Aufnahme einer Bakterienkultur aus Staphylococcus aureus gezeigt. Das Diagramm der3 zeigt die Kontraststärke (in A.U.) in Abhängigkeit von der Z-Position (in µm). Beispielhaft sind drei Bilder mit den ihnen zugeordneten Kontraststärken gezeigt. -
4 zeigt Beispiele für die Vordergrund/Hintergrunderkennung durch die bereits oben erwähnte ZETA-Software der Anmelderin am Beispiel einer Escherichia Coli (E.coli)-Wachstumsanalyse. Die obere Reihe (A–C) zeigt die Originalbilder, wobei A den Anfang einer Zeitreihe darstellt, B nach etwa einer Stunde und C nach 6 Stunden aufgenommen ist. Die zweite, untere Reihe (A'–C') zeigt die entsprechenden Vordergrund/Hintergrunderkennungen als Schwarz-Weiß-Darstellungen. -
5 schließlich zeigt drei Beispiele für erfindungsgemäß ermittelte Bakterienwachstumskurven eines antibiotischen Resistenztests E.coli für LB-Medium (siehe Kurve42 ), für Ampicillin (siehe Kurve44 ) und für Kanamycin (siehe Kurve46 ).
Claims (8)
- Automatisches Verfahren zur Beobachtung von Zellkulturwachstum, insbesondere von Bakterienwachstum, wobei bei dem Verfahren – eine Aufnahmeschale (
24 ) mit einem Nährmedium (38 ) bereitgestellt wird, auf und/oder in das eine Zellkultur, insbesondere eine mit Bakterien versetzte Probe menschlichen oder tierischen Gewebes wie z.B. Blut, welche zusätzlich ein oder mehrere Reagenzien, insbesondere Antibiotika enthält, appliziert ist, – ein eine optische Achse (20 ) aufweisendes Mikroskop (10 ) mit Kamera (18 ) und einem längs der optischen Achse (20 ) automatisch verfahrbaren Träger (14 ) für die Aufnahmeschale (24 ) und/oder einer längs der optischen Achse (20 ) automatisch verfahrbaren Aufnahmeoptikeinheit (16 ) bereitgestellt wird, – die Aufnahmeschale (24 ) zur Beobachtung eines potentiellen Wachstum der Zellkultur in dem Nährmedium (38 ) in das Mikroskop (10 ) verbracht wird, – in vorgebbaren zeitlichen Abständen im insbesondere einstelligen Minutenbereich mittels der Kamera (18 ) des Mikroskops (10 ) ein Bild des Nährmediums (38 ) aufgenommen wird, indem mittels des verfahrbaren Trägers (14 ) und/oder der Aufnahmeoptikeinheit (16 ) des Mikroskops (10 ) die Bildaufnahmeebene entlang der optischen Achse (20 ) durch das Nährmedium (38 ) hindurch verfahren wird, pro Bildaufnahmeebene ein Bild aufgenommen wird und mittels einer Bildauswerte-Software aus der Gruppe der aufgenommenen Bilder das kontrastreichste Bild des Nährmediums (38 ) oder ein Bild des Nährmediums (38 ) mit für die nachfolgend genannte automatische Bildweiterverarbeitung ausreichendem Kontrast automatisch ausgewählt und gegebenenfalls gespeichert wird, – mittels der Bildauswerte-Software anhand des ausgewählten Bildes automatisch die Größe der von der Zellkultur eingenommenen Fläche ermittelt wird und – anhand der Größen der von der Zellkultur eingenommenen Flächen der jeweiligen ausgewählten Bilder ermittelt wird, ob die Zellkultur wächst oder nicht. - Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass anhand der Größen der von der Zellkultur eingenommenen Flächen der jeweiligen ausgewählten Bilder ermittelt wird, ob die Zellkultur wächst und, wenn ja, mit welcher Wachstumsrate.
- Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt des Durchfahrens der Bildaufnahmeebene durch die Aufnahmeschale (
24 ) und das Nährmedium (38 ) durch Verfahren von optischen Elementen der Aufnahmeoptikeinheit (16 ) des Mikroskops (10 ) längs der optischen Achse (20 ) und/oder durch Verfahren des die Aufnahmeschale (24 ) aufweisenden Trägers (14 ) längs der optischen Achse (20 ) des Mikroskops (10 ) erfolgt. - Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Bereich, innerhalb dessen die Bildaufnahmeebene in dem Nährmedium (
38 ) zur Ermittlung des Bildes des Nährmediums (38 ) mit größtem Kontrast oder zur Ermittlung eines Bildes des Nährmediums (38 ) mit einem für die Ermittlung der Größe der Fläche der Zellkultur ausreichendem Kontrast auf den Bereich um die Position der Bildaufnahmeebene des zeitlich letzten Bildes oder eines der zeitlich vorherigen Bilder beschränkt wird. - Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufnahmeschale (
24 ) zwei Folien, insbesondere Objektträger (26 ) und Deckglas (28 ), mit einem zwischen diesen angeordneten Rahmen (34 ) aufweist, wobei der von dem Rahmen (34 ) umgebene Bereich den Aufnahmeraum (36 ) der Aufnahmeschale (24 ) bildet. - Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass anhand der Größen der von der Zellkultur eingenommenen Flächen der jeweiligen ausgewählten Bilder eine Wachstumskurve erstellt wird.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass zum Auswählen des kontrastreichsten Bildes oder zum Auswählen des Bildes mit für die nachfolgende Bildweiterverarbeitung ausreichendem Kontrast entweder zunächst für jede angefahrene Bildaufnahmeebene ein Bild aufgenommen und gespeichert wird und das Auswählen anschließend erfolgt oder das als erstes aufgenommene Bild als das bis dahin kontrastreichstes ermittelte Bild abgespeichert wird und jedes weitere aufgenommene Bild mit dem abgespeicherten Bild verglichen wird und, wenn es kontrastreicher ist als das abgespeicherte Bild, als das bis dahin kontrastreichste ermittelte Bild abgespeichert wird.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroskop (
10 ) ein Auflicht- oder Durchlichtmikroskop ausgewählt wird.
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE102014220306.6A DE102014220306B3 (de) | 2014-10-07 | 2014-10-07 | Automatisches Verfahren zur Beobachtung von Zellkulturwachstum |
US15/516,284 US20170267967A1 (en) | 2014-10-07 | 2015-05-11 | Automatic method for monitoring cell culture growth |
ES15723473.3T ES2656681T3 (es) | 2014-10-07 | 2015-05-11 | Método automático para la observación del crecimiento de cultivos celulares |
EP15723473.3A EP3149150B1 (de) | 2014-10-07 | 2015-05-11 | Automatisches verfahren zur beobachtung von zellkulturwachstum |
PCT/EP2015/060297 WO2016055169A1 (de) | 2014-10-07 | 2015-05-11 | Automatisches verfahren zur beobachtung von zellkulturwachstum |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE102014220306.6A DE102014220306B3 (de) | 2014-10-07 | 2014-10-07 | Automatisches Verfahren zur Beobachtung von Zellkulturwachstum |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE102014220306B3 true DE102014220306B3 (de) | 2015-09-03 |
Family
ID=53189796
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE102014220306.6A Withdrawn - After Issue DE102014220306B3 (de) | 2014-10-07 | 2014-10-07 | Automatisches Verfahren zur Beobachtung von Zellkulturwachstum |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20170267967A1 (de) |
EP (1) | EP3149150B1 (de) |
DE (1) | DE102014220306B3 (de) |
ES (1) | ES2656681T3 (de) |
WO (1) | WO2016055169A1 (de) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107881107B (zh) * | 2017-11-15 | 2023-06-06 | 中国航天员科研训练中心 | 自动细胞培养设备的图像采集系统 |
JPWO2019176048A1 (ja) * | 2018-03-15 | 2021-02-25 | オリンパス株式会社 | 細胞画像処理装置 |
CN110195014A (zh) * | 2019-06-10 | 2019-09-03 | 张洌 | 一种用于微生物检验对病原菌的动态生长监测仪 |
CN110684657A (zh) * | 2019-10-18 | 2020-01-14 | 天晴干细胞股份有限公司 | 造血干细胞集落自动计数装置及集落计数方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010129532A2 (en) * | 2009-05-05 | 2010-11-11 | Trustees Of Boston University | Method and device for rapid detection of bacterial antibiotic resistance/susceptibility |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9313052D0 (en) * | 1993-06-24 | 1993-08-11 | Mini Agriculture & Fisheries | Detection of microbial growth |
JP2004537712A (ja) * | 2000-10-18 | 2004-12-16 | バーチャル・アレイズ・インコーポレーテッド | 多重細胞分析システム |
CN100436574C (zh) * | 2001-09-06 | 2008-11-26 | 基因描绘系统有限公司 | 复制细胞的快速检测 |
US20040029266A1 (en) * | 2002-08-09 | 2004-02-12 | Emilio Barbera-Guillem | Cell and tissue culture device |
TWI427709B (zh) * | 2003-05-05 | 2014-02-21 | Nanosys Inc | 用於增加表面面積之應用的奈米纖維表面 |
DE102006007197B4 (de) * | 2006-02-10 | 2011-09-15 | Technische Universität Dresden | Anordnung für optische Beobachtungseinrichtungen zur Untersuchung von Zellkulturen |
JP5307539B2 (ja) * | 2006-05-31 | 2013-10-02 | オリンパス株式会社 | 生体試料撮像方法および生体試料撮像装置 |
US10529003B2 (en) * | 2008-04-07 | 2020-01-07 | Mohammad A. Mazed | Optical biomodule for detection of diseases at an early onset |
CA2722348A1 (en) * | 2008-04-23 | 2009-10-29 | Symphogen A/S | Methods for manufacturing a polyclonal protein |
CA2756316C (en) * | 2009-03-23 | 2017-04-11 | The University Of Chicago | Methods for preventing and treating radiation-induced epithelial disorders |
EP2384363A2 (de) * | 2009-04-22 | 2011-11-09 | Pan-Systech GmbH | Vorrichtung zur automatisierten, parallelisierten kultivierung von zellen |
US9207196B2 (en) * | 2010-11-17 | 2015-12-08 | Vanderbilt University | Transmission electron microscopy for imaging live cells |
EP2708890B1 (de) * | 2012-09-14 | 2015-11-18 | Molecular Devices (New Milton) Ltd | Verfahren zum Auswählen einer monoklonalen Zellenkolonie |
DE102012022603B3 (de) * | 2012-11-19 | 2014-05-08 | Acquifer Ag | Vorrichtung und Verfahren zur Mikroskopie einer Vielzahl von Proben |
DE102012223128B4 (de) * | 2012-12-13 | 2022-09-01 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Autofokusverfahren für Mikroskop und Mikroskop mit Autofokuseinrichtung |
JP6578291B2 (ja) * | 2013-10-30 | 2019-09-18 | ミリカ・ラディシック | 三次元組織培養のためのデバイス及び方法 |
-
2014
- 2014-10-07 DE DE102014220306.6A patent/DE102014220306B3/de not_active Withdrawn - After Issue
-
2015
- 2015-05-11 EP EP15723473.3A patent/EP3149150B1/de active Active
- 2015-05-11 ES ES15723473.3T patent/ES2656681T3/es active Active
- 2015-05-11 US US15/516,284 patent/US20170267967A1/en not_active Abandoned
- 2015-05-11 WO PCT/EP2015/060297 patent/WO2016055169A1/de active Application Filing
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010129532A2 (en) * | 2009-05-05 | 2010-11-11 | Trustees Of Boston University | Method and device for rapid detection of bacterial antibiotic resistance/susceptibility |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
FREDBORG, M. [u.a.]: Real-time optical antimicrobial susceptibility testing. J. Clin. Microbiol. (2013) 51 (7) 2047-53 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2656681T3 (es) | 2018-02-28 |
WO2016055169A1 (de) | 2016-04-14 |
EP3149150B1 (de) | 2017-11-22 |
EP3149150A1 (de) | 2017-04-05 |
US20170267967A1 (en) | 2017-09-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Wu et al. | Spatially isotropic four-dimensional imaging with dual-view plane illumination microscopy | |
DE102013112596B4 (de) | Anordnung zur Lichtblattmikroskopie | |
EP2356505B1 (de) | Auflösungsgesteigerte mikroskopie | |
DE102011051042B4 (de) | Abtastmikroskop und Verfahren zur lichtmikroskopischen Abbildung eines Objektes | |
DE102014220306B3 (de) | Automatisches Verfahren zur Beobachtung von Zellkulturwachstum | |
DE102014107933B4 (de) | Verfahren zur mikroskopischen Abbildung von Proben an Böden von mit Fluid befüllten Töpfchen einer Mikrotiterplatte | |
EP2912510A1 (de) | Mikroskop mit mindestens einem beleuchtungsstrahl in form einer lichtscheibe | |
WO2017215707A2 (de) | Verfahren zum digitalen aufnehmen einer probe durch ein mikroskop | |
DE102012020240A1 (de) | Mikroskop und Verfahren zur SPIM Mikroskopie | |
DE102013021542A1 (de) | Mikroskop und Verfahren zur SPIM Mikroskopie | |
DE102010035104A1 (de) | Vorrichtung und Verfahren zur automatischen Fokussierung für die Mikroskopie schwach leuchtender Substrate | |
DE102010036709A1 (de) | Einrichtung und Verfahren zur mikroskopischen Bildaufnahme einer Probenstruktur | |
WO2018172161A1 (de) | Mikroskop und verfahren zum abbilden eines objekts | |
DE102013112600A1 (de) | Optisches Übertragungssystem und Mikroskop mit einem solchen Übertragungssystem | |
DE19825947A1 (de) | Forensisches Mikroskop, insbesondere zur Schriftprüfung | |
DE112014006537T5 (de) | Verfahren zum Überwachen der Differenzierung in Herzmuskelzellen | |
DE102017217380A1 (de) | Immersionsvorrichtung zur dynamischen Anpassung eines Mediums an eine Probe | |
DE102011055639B4 (de) | Verfahren und Vorrichtung zur simultanen Multikanal- und Multimethoden-Akquisition von synchronisierten Parametern in systemübergreifenden Fluoreszenzlebensdaueranwendungen | |
DE102016108226A1 (de) | Mikroskop | |
EP1496387B1 (de) | Verfahren zum Betrieb eines Laser-Scanning-Mikroskops, wobei Bilder einer Probe verglichen und aus dem Ergebnis Steuersignale abgeleitet werden | |
DE102011055426A1 (de) | Mikroskopieverfahren zur Erkennung biologischer Zielobjekte | |
DE102005036326A1 (de) | Verfahren und Vorrichtung zur Analyse von biologischen Objekten | |
EP2594601A1 (de) | Optode | |
DE102005036529A1 (de) | Verfahren zur lagegetreuen Abbildung eines Objektes | |
EP3921619B1 (de) | Verfahren zur lasermikrodissektion |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
R012 | Request for examination validly filed | ||
R016 | Response to examination communication | ||
R018 | Grant decision by examination section/examining division | ||
R026 | Opposition filed against patent | ||
R120 | Application withdrawn or ip right abandoned | ||
R028 | Decision that opposition inadmissible now final |