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Die Erfindung betrifft ein automatisches Verfahren zur insbesondere Echtzeitverfolgung von Zellkulturwachstum und insbesondere von Bakterienwachstum.
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Es existieren verschiedene Anwendungsgebiete, bei denen es von Interesse ist, ein Zellkulturwachstum möglichst in Echtzeit beobachten zu können. Als ein Beispiel sei die Bestimmung von Antibiotika-Resistenz/Wirksamkeit genannt.
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Das konventionelle Verfahren zur Bestimmung von Antibiotika-Resistenzen bzw. zur Bestimmung der Wirksamkeit von Antibiotika basiert auf einer makroskopischen Betrachtungsweise. Dieses Verfahren bedarf einer relativ großen Dauer, da Wachstumsbeurteilungen erst dann erfolgen können, wenn Bakterienkolonien mit dem bloßen Auge zu erkennen sind. Dies kann zwischen 6 bis 24 Stunden der Fall sein, was in zeitkritischen Fällen nicht tolerabel ist.
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Unter der Bezeichnung VITEK®2 existiert ein alternatives, semiautomatisches Verfahren für die schnelle Empfindlichkeitstestung von Mikroorganismen. Hierbei wird eine Transmissionsoptik eingesetzt. Die Menge von eine Probe durchscheinendem Licht gibt dabei Rückschlüsse auf das Zellkulturwachstum. Je stärker das Wachstum ist, desto weniger intensiv ist das transmittierte Licht. Allerdings liefert auch dieses Verfahren zuverlässig erste Ergebnisse leider erst frühestens nach einigen Stunden.
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Die beiden zuvor genannten Verfahren sind nicht in der Lage, die Wirkung von Antibiotika auf einzelne Zellen zu bestimmen, sondern erfordern eine Vielzahl von zu beobachtenden Zellen bzw. die Trübung einer Bakteriensuspension.
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Aufgabe der Erfindung ist es, ein automatisiertes Verfahren zur Beobachtung von Zellkulturwachstum, insbesondere von Bakterienwachstum, anzugeben, bei dem die Wachstumsbeurteilung wesentlich schneller als bei bekannten Verfahren möglich ist.
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Zur Lösung dieser Aufgabe wird mit der Erfindung ein automatisiertes Verfahren zur Beobachtung von Zellkulturwachstum, insbesondere von Bakterienwachstum vorgeschlagen, wobei bei dem Verfahren
- – eine Aufnahmeschale mit einem Nährmedium bereitgestellt wird, auf und/oder in das eine Zellkultur, insbesondere eine mit Bakterien versetzte Probe menschlichen oder tierischen Gewebes wie z.B. Blut, welche zusätzlich ein oder mehrere Reagenzien, insbesondere Antibiotika enthält, appliziert ist,
- – ein eine optische Achse aufweisendes Mikroskop mit Kamera und einem längs der optischen Achse automatisch verfahrbaren Träger für die Aufnahmeschale und/oder einer längs der optischen Achse automatisch verfahrbaren Aufnahmeoptikeinheit bereitgestellt wird,
- – die Aufnahmeschale zur Beobachtung eines potentiellen Wachstum der Zellkultur in dem Nährmedium in das Mikroskop verbracht wird,
- – in vorgebbaren zeitlichen Abständen im insbesondere einstelligen Minutenbereich mittels der Kamera des Mikroskops ein Bild des Nährmediums aufgenommen wird, indem mittels des verfahrbaren Trägers und/oder der Aufnahmeoptikeinheit des Mikroskops die Bildaufnahmeebene entlang der optischen Achse durch das Nährmedium hindurch verfahren wird, pro Bildaufnahmeebene ein Bild aufgenommen wird und mittels einer Bildauswerte-Software aus der Gruppe der aufgenommenen Bilder das kontrastreichste Bild des Nährmediums oder ein Bild des Nährmediums mit für die nachfolgend genannte automatische Bildweiterverarbeitung ausreichendem Kontrast automatisch ausgewählt und gegebenenfalls gespeichert wird,
- – mittels der Bildauswerte-Software anhand des ausgewählten Bildes automatisch die Größe der von der Zellkultur eingenommenen Fläche ermittelt wird und
- – anhand der Größen der von der Zellkultur eingenommenen Flächen der jeweiligen ausgewählten Bilder ermittelt wird, ob die Zellkultur wächst oder nicht.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Bildverarbeitungs-Software eingesetzt, die zur Auswertung von in zeitlichen Abständen automatisch aufgenommenen Bildern der Zellkultur eingesetzt wird. Ein Nährmedium mit der Zellkultur wird in eine insbesondere miniaturisierte Aufnahmeschale appliziert. Das Nährmedium enthält ein oder mehrere Reagenzien, insbesondere Antibiotika. Bei der Zellkultur handelt es sich insbesondere um Bakterien, die auf ihre Antibiotika-Resistenz oder anhand derer die Wirksam eines Antibiotikums getestet werden sollen.
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Die in zeitlichen Abständen erfolgende automatische Bilderstellung geschieht mit Hilfe eines (insbesondere Auflicht- oder Durchlicht-)Mikroskops mit Kamera und einer Aufnahmeoptikeinheit sowie einem Träger für die Aufnahmeschale, die relativ zueinander längs der optischen Achse insbesondere in Kleinstschritten verfahrbar sind. Dies ermöglicht es, die Bildaufnahmeebene stets automatisch derart zu wählen, dass möglichst kontrastreiche Bilder von der Zellkultur aufgenommen werden können. Hierzu wird die Bildaufnahmeebene durch Verfahren der Aufnahmeoptikeinheit und/oder des Trägers längs der optischen Achse durch das Nährmedium hindurch bewegt, wobei in den unterschiedlichen Bildaufnahmeebenen jeweils ein Bild aufgenommen wird. Durch eine nachfolgende oder zeitgleich ablaufende Bildverarbeitung wird möglichst das kontrastreichste Bild ermittelt und ausgewählt. Alternativ reicht es möglicherweise aus, aus der Gruppe der jeweils aufgenommenen Bilder eines der kontrastreichsten auszuwählen, solange der Kontrast ausreichend groß ist, um die nachfolgend genannte Bildauswertung durchführen zu können. Derartige Bildverarbeitungen werden z.B. in Autofokus-Kameras eingesetzt und können dementsprechend bei der Erfindung genutzt werden.
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Zwecks Auswählens des kontrastreichsten Bildes oder des Bildes mit für die nachfolgende Bildweiterverarbeitung ausreichendem Kontrast kann entweder zunächst für jede angefahrene Bildaufnahmeebene ein Bild aufgenommen und gespeichert sowie das Auswählen anschließend erfolgen oder das als erstes aufgenommene Bild als das bis dahin kontrastreichstes Bild ermittelte Bild abgespeichert werden, um jedes weitere aufgenommene Bild mit dem abgespeicherten Bild zu vergleichen und, wenn es kontrastreicher ist als das abgespeicherte Bild, als das bis dahin kontrastreichstes ermittelte Bild abzuspeichern.
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Durch ein weiteres Bildverarbeitungs-Softwaremodul kann nun das jeweils ausgewählte Bild im Hinblick auf die Größe der von der Zellkultur eingenommenen Fläche automatisch untersucht werden. Damit lässt sich also quasi in Echtzeit das Wachstum der Zellkultur beobachten. Ein Beispiel einer hierfür geeigneten Software ist in Andreas Pippow, Stefan Borbe, Sebastian Röse, Stefan Precht, Thomas Berlage, "Zellteilungsdauer im High-Content-Screening bestimmen", Laborwelt, Nr. 1/2012, S. 33 und 34, und Thomas Berlage, Andreas Pippow, "Neues Potential für die Pharmaforschung", GIT Labor-Fachzeitschrift, 10/2013, S. 630 bis 635, beschrieben
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Ein wesentliches Merkmal der Erfindung ist die Möglichkeit der automatischen Bildaufnahme bei möglichst optimalem Kontrast, wofür es der Verfahrbarkeit der Aufnahmeoptikeinheit und/oder des Trägers des Mikroskops wie bei einer Autofokus-Funktion bedarf. Die Bildaufnahmeebene muss zwecks Aufnahme von kontrastreichen Bildern allein deshalb schon von Zeit zu Zeit nachgeführt werden, weil das Nährmedium im Laufe der Zeit verdunsten könnte und somit sich der Nährmedium-Spiegel in der Aufnahmeschale verändert.
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Das Mikroskop weist zweckmäßigerweise einen entlang der optischen Achse insbesondere in kleinen Stufen von wenigen zig µm verfahrbaren Träger für die Aufnahmeschale auf. Man könnte auch darüber nachdenken, die Aufnahmeoptikeinheit des Mikroskops längs der optischen Achse zu verfahren, was aber wesentlich aufwendiger ist als das Verfahren des Trägers. Hierbei bedarf es eines Antriebs, der ein Verfahren in zweckmäßigerweise Kleinstschritten erlaubt.
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In weiterer zweckmäßiger Ausgestaltung der Erfindung kann vorgesehen sein, dass anhand der Größen der von der Zellkultur eingenommenen Flächen der jeweiligen ausgewählten Bilder ermittelt wird, ob die Zellkultur wächst und, wenn ja, mit welcher Wachstumsrate.
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Wie bereits oben erwähnt, ist davon auszugehen, dass zu den jeweiligen Zeitpunkten, zu denen das nächste möglichst kontrastreiche Bild aufgenommen werden soll, sich auch die Bildaufnahmeebene gegenüber der jeweils früheren Position verändert hat. Aus Gründen der Zeiteinsparung kann es statt des jeweiligen zur Erzielung eines möglichst kontrastreichen Bildes erfolgenden Durchfahrens der Bildaufnahmeebene durch das Nährmedium von Vorteil sein, wenn der Bereich, innerhalb dessen die Bildaufnahmeebene in dem Nährmedium zur Ermittlung des Bildes des Nährmediums mit größtem Kontrast oder zur Ermittlung eines Bildes des Nährmediums mit einem für die Ermittlung der Größe der Fläche der Zellkultur ausreichendem Kontrast auf den Bereich um die Position der Bildaufnahmeebene des zeitlich letzten Bildes oder eines der zeitlich vorherigen Bilder beschränkt wird. Hierbei wird davon ausgegangen, dass sich die Bildaufnahmeebene, in der das vermeintlich schärfste Bild aufgenommen werden kann, von einem Aufnahmezeitpunkt zum nächsten Aufnahmezeitpunkt kaum verändert. Allerdings kann das jeweils vollständige Durchfahren der Bildaufnahmeebene durch das Nährmedium zu den einzelnen Bildaufnahmezeitpunkten deshalb erforderlich sein, weil die Autofokus-Einheit aufgrund äußerer Einflüsse, beispielsweise thermischer Einflüsse oder Vibrationen, seit dem letzten Bildaufnahmezeitpunkt verjustiert ist.
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Wie bereits oben erwähnt, ist es aus verschiedenen Gründen zweckmäßig, eine möglichst kleinformatige Aufnahmeschale zu verwenden. Eine Möglichkeit ist es, eine miniaturisierte Aufnahmeschale zu verwenden, die zwei Folien mit einem zwischen diesen angeordneten Rahmen aufweist. Bei den beiden Folien handelt es sich beispielsweise um Objektträgergläser. Der Rahmen umgibt dabei einen Aufnahmeraum, der durch den Rahmen selbst seitlich und durch die beiden Folien nach oben und nach unten geschlossen ist. In diesen Aufnahmeraum wird dann das Nährmedium (z.B. Agar) appliziert, welches mit den zu beobachtenden Zellkulturen und einem oder mehreren Reagenzien versetzt ist.
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Wie sich aus dem Obigen ergibt, ist also Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein automatisiertes Verfahren zur Echtzeitverfolgung von Bakterienwachstum bzw. von Zellkulturwachstum bzw. von Wachstum von Mikroorganismen. Das Verfahren basiert auf der Verwendung eines Mikroskops, welches in definierten Zeitabständen, unterstützt durch eine Autofokus-Einheit, Aufnahmen von mit den Zellkulturen bewachsenen, insbesondere miniaturisierten Wachstumsflächen (Nährmedium) erstellt. Die Aufnahmen bzw. Bilder werden anschließend von einer Bildverarbeitungs-Software vorverarbeitet und analysiert, um letztendlich anhand der Größe der Fläche der Bilder, die zu den jeweiligen Zeitpunkten aufgenommen und ausgewertet worden sind, eine Wachstumskurve oder eine andere Art der Repräsentation des Wachstums der Zellkultur zu erstellen.
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Bei dem erfindungsgemäß automatisierten Verfahren zur Beobachtung von Zellkulturwachstum, insbesondere von Bakterienwachstum wird also eine Aufnahmeschale mit einem Nährmedium bereitgestellt, auf und/oder in das eine Zellkultur, insbesondere eine mit Bakterien versetzte Probe menschlichen oder tierischen Gewebes wie z.B. Blut, welche zusätzlich ein oder mehrere Reagenzien, insbesondere Antibiotika enthält, appliziert ist. Ein Mikroskop mit Kamera und entlang der optischen Achse verfahrbaren Bildaufnahmeebene wird bereitgestellt und die Aufnahmeschale zur Beobachtung eines potentiellen Wachstums der Zellkultur wird in dem Nährmedium in das Mikroskop verbracht. In vorgebbaren zeitlichen Abständen im insbesondere einstelligen Minutenbereich wird mittels der Kamera des Mikroskops ein Bild des Nährmediums aufgenommen wird, indem Bildaufnahmeebene entlang der optischen Achse durch die Aufnahmeschale das Nährmedium hindurch verfahren wird, pro Bildaufnahmeebene ein Bild aufgenommen wird und mittels einer Bildauswerte-Software aus der Gruppe der aufgenommenen Bilder das kontrastreichste Bild des Nährmediums oder ein Bild des Nährmediums mit für die nachfolgend genannte automatische Bildweiterverarbeitung ausreichendem Kontrast automatisch ausgewählt und gegebenenfalls gespeichert wird. Mittels der Bildauswerte-Software wird anhand des ausgewählten Bildes automatisch die Größe der von der Zellkultur eingenommenen Fläche ermittelt. Anhand der Größen der von der Zellkultur eingenommenen Flächen der jeweiligen ausgewählten Bilder wird ermittelt, ob die Zellkultur wächst oder nicht.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Echtzeitverfolgung von Bakterienwachstum auf der Ebene von Bakterienkolonien sowie auf zellulärer Ebene, was bedeutet, dass einerseits durch die Beobachtung einer Wachstumsflächenzunahme schnell eine Wachstumskurve abgeleitet werden kann und andererseits zusätzlich die Zellteilung jedes einzelnen Individuums verfolgt werden kann. Dies ermöglicht eine Beschleunigung gegenüber konventionellen Resistenztests, die Bereitstellung eines neuen Ansatzes für die beispielsweise Antibiotika-Forschung sowie die automatisierte Verfolgung von Bakterienwachstum/Bakterienteilung über kurze und lange Zeiträume.
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Die Wirkungen und Vorteile der Erfindung lassen sich wie folgt zusammenfassen:
- – Durch den Einsatz von optimierten, miniaturisierten Wachstumsflächen wird eine automatisierte, mikroskopische Verfolgung des Wachstums auf zellulärer Ebene ermöglichst. Zusätzlich werden durch die Miniaturisierung der Wachstumsfläche Reagenzien und Probematerial eingespart, was einen wirtschaftlichen Vorteil gegenüber der konventionellen Methode mit sich bringt.
- – Durch die Verwendung einer Autofokus-Einheit des Mikroskops wird eine automatisierte Erstellung von Aufnahmen/Bildern in bestimmten Zeitabständen möglich. Ohne die Autofokus-Einheit wäre ein manuelles Nachfokussieren vor jeder neuen Aufnahme nötig, was eine Automatisierung zuwiderlaufen würde.
- – Durch die Erstellung von Wachstumskurven aus der von beispielsweise Bakterien bewachsenen Fläche kann die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) von Antibiotika signifikant, nämlich in 2 bis 3 Stunden statt, wie konventionell, in 5 bis 24 Stunden, beschleunigt werden.
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Neben der Erstellung einer Wachstumskurve anhand einer auf Vorder-/Hintergrunderkennung basierten Flächenbestimmung basiert die Erfindung ferner auf der Verwendung einer auf Kontraststärke ausgerichteten Autofokus-Funktion und der Verwendung insbesondere miniaturisierter Wachstumsflächen (beispielsweise auf Agarbasis oder einer anderen Nährmediumbasis).
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Anwendungsfälle für das erfindungsgemäße Verfahren sind die
- – Beobachtung von (bakteriellen) Zellteilungen,
- – Bestimmung von Antibiotika-Resistenzen,
- – Beobachtung des Einflusses diverser Stoffe auf das Bakterienwachstum bzw. die Zellteilungen und
- – Beobachtung des Einflusses kombinatorischer Antibiotika-Gabe auf das Bakterienwachstum bzw. die Zellteilungen.
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Bildverarbeitungs-Software zur automatischen Ermittlung der Größe von ausgewählten Bereichen eines Bildes wie im vorliegenden Fall der von der Zellkultur eingenommenen Fläche, ist grundsätzlich bekannt. Ein Beispiel ist die unter der Bezeichnung ZETA von der Anmelderin entwickelte Software (siehe auch die beiden oben angegebenen Nichtpatentliteraturstellen).
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Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Zeichnung näher erläutert. Im Einzelnen zeigen dabei:
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1 schematisch eine Darstellung eines erfindungsgemäß verwendbaren Auflicht-Mikroskops,
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2 eine Vergrößerung der Objektträgeranordnung mit miniaturisierter Aufnahmeschale,
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3 schematisch das Funktionsprinzip zur automatischen Ermittlung des kontrastreichsten Bildes,
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4 Beispiele für Aufnahmen der wachsenden Zellkultur zu verschiedenen Zeitpunkten A, B und C und die diesen Aufnahmen entsprechenden, aufgearbeiteten Bilder zur Vordergrund/Hintergrunderkennung zwecks automatischer Zellkultur-Flächenermittlung und
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5 drei Beispiele für erfindungsgemäß erstellte Wachstumskurven.
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In 1 ist ein in diesem Ausführungsbeispiel Auflicht-Mikroskop 10 gezeigt, das einen Mikroskopkörper 12 mit Auflicht-Beleuchtungseinheit 13 und einem insbesondere in Kleinstschritten längs der optischen Achse des Mikroskops verfahrbaren Träger 14 (verfahrbarer Z-Tisch) aufweist. Der Mikroskopkörper 12 umfasst ferner eine Aufnahmeoptikeinheit 16 und eine Kamera 18. Die optische Achse ist bei 20 angedeutet.
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Alternativ zu dem Auflicht-Mikroskop kann nach der Erfindung auch ein Durchlicht-Mikroskop eingesetzt werden. Die Positionierung der in diesem Fall einzusetzenden Durchlicht-Beleuchtungseinheit ist gestrichelt bei 22 gezeigt. Auf dem Träger 14 befindet sich eine Aufnahmeschale 24, die in 2 in größerem Maßstab gezeigt ist. Die Aufnahmeschale 24 weist einen unteren Objektträger 26 und ein Deckglas 28 als insbesondere zwei Folien oder Scheiben 30, 31 auf, zwischen denen ein insbesondere als doppelseitiger Klebefilm 32 ausgebildeter Rahmen 34 angeordnet ist. Dieser Rahmen 34 definiert in seinem Innern den Aufnahmeraum 36 für ein Nährmedium 38 (bei dem es sich beispielsweise um Agar handelt), auf dem Bakterien 40 wachsen. Das Nährmedium ist mit einem Reagenz, wie beispielsweise einem Antibiotikum versehen. Die Bakterien 40 können Teil beispielsweise einer Blutprobe, die es zu untersuchen gilt, sein.
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In 3 ist das Funktionsprinzip der automatischen Ermittlung des kontrastreichsten Bildes, welches zu einem bestimmten Zeitpunkt nach Beginn des Bakterienwachstums aufgenommen wird, dargestellt. Mittels des in Kleinstschritten verfahrbaren Trägers 14 wird die Bildaufnahmeebene durch die Aufnahmeschale 24 hindurch verfahren. Dabei wird pro Schritt ein Bild aufgenommen. Abgefragt wird dabei die Kontraststärke in verschiedenen Z-Positionen. In 3 ist dies am Beispiel der Aufnahme einer Bakterienkultur aus Staphylococcus aureus gezeigt. Das Diagramm der 3 zeigt die Kontraststärke (in A.U.) in Abhängigkeit von der Z-Position (in µm). Beispielhaft sind drei Bilder mit den ihnen zugeordneten Kontraststärken gezeigt.
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4 zeigt Beispiele für die Vordergrund/Hintergrunderkennung durch die bereits oben erwähnte ZETA-Software der Anmelderin am Beispiel einer Escherichia Coli (E.coli)-Wachstumsanalyse. Die obere Reihe (A–C) zeigt die Originalbilder, wobei A den Anfang einer Zeitreihe darstellt, B nach etwa einer Stunde und C nach 6 Stunden aufgenommen ist. Die zweite, untere Reihe (A'–C') zeigt die entsprechenden Vordergrund/Hintergrunderkennungen als Schwarz-Weiß-Darstellungen.
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5 schließlich zeigt drei Beispiele für erfindungsgemäß ermittelte Bakterienwachstumskurven eines antibiotischen Resistenztests E.coli für LB-Medium (siehe Kurve 42), für Ampicillin (siehe Kurve 44) und für Kanamycin (siehe Kurve 46).
