JPWO2019176048A1 - 細胞画像処理装置 - Google Patents

Abstract

培養中の細胞を経時的に撮影することにより取得された複数の画像について、取得された画像間において共通する複数の測定領域を抽出する測定領域抽出部（５３）と、測定領域抽出部（５３）によって抽出された各測定領域に含まれる細胞の増殖速度を算出する増殖速度算出部（５４）と、増殖速度算出部（５４）によって算出された増殖速度と、各測定領域の位置情報とを対応づけて記憶する記憶部（５５）とを備える細胞画像処理装置（５１）である。

Description

本発明は、細胞画像処理装置に関するものである。

ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞などの万能細胞の制作過程では、遺伝子の導入や発現に失敗して、万能細胞の特性を持たない細胞が多数発生する。再生医療等に応用するには、万能細胞の特性を持たない細胞を取り除き、万能細胞のみを抽出する必要がある。
例えば、ｉＰＳ細胞になっているか否かを見極めるには、多能性を持つ細胞が発現しているＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１等の未分化マーカと呼ばれるタンパク質を、ｑＰＣＲ法あるいは免疫染色法により検査する方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。

特開２０１４−１００１４１号公報

しかしながら、これらの方法はコストおよび時間がかかるため、細胞の選別は、培養作業者が、位相差顕微鏡下において、複数回分裂した細胞の集まりであるコロニーの形状を観察し、作業者の経験、培養条件およびコロニー同士を比較するなどして、ｉＰＳ細胞になっていそうなコロニーを選別することを感覚的に行っており手間がかかっていた。
特に、コロニーが小さい場合には形状の差異も小さく、ｉＰＳ細胞であるか否かの見極めが困難であった。

本発明は、培養容器内に存在している特定の細胞を効率的に抽出することができる細胞画像処理装置を提供することを目的としている。

本発明の一態様は、培養中の細胞を経時的に撮影することにより取得された複数の画像について、該画像間において共通する複数の測定領域を抽出する測定領域抽出部と、該測定領域抽出部により抽出された各前記測定領域に含まれる前記細胞の増殖速度を算出する増殖速度算出部と、該増殖速度算出部により算出された前記増殖速度と、各前記測定領域の位置情報とを対応づけて記憶する記憶部とを備える細胞画像処理装置である。

本態様によれば、複数の画像が入力されると、測定領域抽出部により各画像において共通する複数の測定領域が抽出される。そして、時間間隔を空けて取得された２枚の画像において共通する測定領域内における細胞の単位時間当たりの増減を示す増殖速度が増殖速度算出部により算出される。このようにして算出された増殖速度は、その増殖速度に対応する測定領域の位置情報と対応づけて記憶部に記憶される。

これにより、観察者が手動で、あるいは装置が自動的に、いずれかの画像におけるいずれかの測定領域を指定すると、当該測定領域における細胞の増殖速度に近似する増殖速度を有する測定領域を確認することができる。
すなわち、観察者が画像を見ながら、特定の細胞、例えば、万能細胞が存在している測定領域であると判断して観察を行った場合に、当該測定領域と同様の増殖速度を有する他の測定領域を簡易に抽出することができる。つまり、特定の増殖速度を有する細胞を選んで観察を行うことができ、コロニーの大きさにかかわらず、培養容器内に存在している特定の細胞を効率的に抽出することができる。

上記態様においては、前記記憶部に対応づけて記憶されている前記増殖速度と前記測定領域の位置情報とを対応づけて表示する表示部を備えていてもよい。
この構成により、表示部により表示された増殖速度により測定領域を簡易に選んで観察を行うことができる。

また、上記態様においては、前記記憶部が、前記増殖速度算出部により算出された前記増殖速度に応じた複数のグループに区分して記憶してもよい。
この構成により、同一グループに属する測定領域を簡易に特定することができ、観察を容易にすることができる。

また、上記態様においては、前記表示部が、いずれかの前記画像を表示するとともに、前記測定領域を前記グループ毎に色分けして表示してもよい。
この構成により、同一グループに属する測定領域を色により簡易に特定することができ、観察を容易にすることができる。

また、上記態様においては、前記表示部が、前記増殖速度に応じた色で前記測定領域を色分けして表示してもよい。
この構成により、測定領域をヒートマップで表示することができ、増殖速度の相違を認識し易くして細胞の選別を精度よく行うことができる。

また、本発明の他の態様は、プロセッサとメモリとを備え、前記プロセッサが、培養中の細胞を経時的に撮影することにより取得された複数の画像について、該画像間において共通する複数の測定領域を抽出するとともに、抽出された各前記測定領域に含まれる前記細胞の増殖速度を算出し、前記メモリが、算出された前記増殖速度と、各前記測定領域の位置情報とを対応づけて記憶する細胞画像処理装置である。

本発明によれば、培養容器内に存在している特定の細胞を効率的に抽出することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る細胞画像処理装置を示すブロック図である。 図１の細胞画像処理装置により抽出される測定領域の一例を示す図である。 図１の細胞画像処理装置により増殖速度と位置情報とを対応づけて表示する表示例を示す図である。 図３と同様の他の表示例を示す図である。 図３と同様の他の表示例を示す図である。 指定された特定の測定領域における細胞数の時間変化のグラフを示す図である。 図１の細胞画像処理装置により同時に表示される全体画像、動画および細胞数の時間変化のグラフの一例を示す図である。 画像を取得する観察装置を示す全体構成図である。 図８の観察装置における照明光学系の一部を示す斜視図である。 図９の照明光学系におけるライン光源の一例を示す側面図である。 図１０Ａのライン光源を光軸方向に見た正面図である。 図９の照明光学系におけるライン光源の他の例を示す図である。 図８の観察装置の対物光学系群を示す図である。 図１２の対物光学系群における対物光学系の配列を示す図である。 図１２の対物光学系群における開口絞りの配列を示す図である。 図１２の対物光学系群の像面におけるラインセンサの配置を示す図である。 図９の照明光学系におけるライン光源、シリンドリカルレンズおよびプリズムの配置を示す図である。 偏斜照明の作用を説明する図である。 図１７の偏斜照明によって照明された試料の画像の一例を示す図である。 試料の一例を示す図である。 図８の観察装置によって取得された図１９Ａの試料の２次元画像を示す図である。 図１９Ｂの画像を反転処理およびつなぎ合わせ処理することにより得られた画像を示す図である。 図８の観察装置の他の態様におけるライン光源の配置を示す図である。

本発明の一実施形態に係る細胞画像処理装置５１について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞画像処理装置５１は、観察装置（図８参照）１００によって取得された複数の画像を処理する装置であって、図１に示されるように、観察装置１００から時系列に入力されてくる画像を記憶する画像記憶部５２と、画像間において共通する複数の測定領域を抽出する測定領域抽出部５３と、抽出された各測定領域に含まれる細胞の増殖速度を算出する増殖速度算出部５４と、算出された増殖速度と、各測定領域の位置情報とを対応づけて記憶する情報記憶部（記憶部）５５とを備えている。測定領域抽出部５３および増殖速度算出部５４はプロセッサによって構成され、画像記憶部５２および情報記憶部５５はメモリあるいは記憶媒体等によって構成されている。

測定領域抽出部５３は、観察装置１００から入力されてきたいずれかの画像において複数の測定領域を設定し、観察装置１００から入力されてきた他の画像において、設定された測定領域と共通する測定領域を抽出する。例えば、図２に示されるように、画像Ｇの端縁を基準として画像Ｇを分割することにより、等しい大きさの矩形からなる複数の測定領域Ｒを設定し、他の画像Ｇにおいても同様に画像Ｇの端縁を基準として等しい大きさの矩形からなる共通の測定領域Ｒを抽出すればよい。

他の画像としては、測定領域Ｒを設定した画像Ｇに時間的に近接する画像Ｇ、例えば、前後に取得された画像Ｇを選択する。
増殖速度算出部５４は、選択された２以上の画像Ｇにおいて共通の測定領域Ｒ内における細胞数を測定し、細胞数の単位時間当たりの変化量として増殖速度を測定領域Ｒ毎に算出する。
まず、測定領域Ｒ内におけるエッジ検出や輪郭追跡により、細胞Ｘと細胞Ｘ以外との境界を抽出し、その境界が閉じているものを細胞ＸあるいはコロニーＹとして認識し、その大きさから細胞ＸとコロニーＹとを区別する。

そして、細胞Ｘと認識したものについてはカウントして、細胞数とする。コロニーＹとして認識されたものについてはそのコロニーＹの画素数から面積を算出し、単一の細胞Ｘの平均的な面積で除算することにより、細胞数を算出する。測定領域Ｒ内の全ての細胞ＸおよびコロニーＹの細胞数を合計して、測定領域Ｒにおける細胞数を算出する。

２つの画像Ｇの共通する全ての測定領域Ｒにおいて算出された細胞数の差分を、当該画像Ｇ間の時間差で除算することによって増殖速度を算出することができる。
情報記憶部５５は、抽出された測定領域Ｒの代表点の座標（位置情報）と当該測定領域Ｒについて算出された増殖速度とを対応づけて記憶する。

このように構成された本実施形態に係る細胞画像処理装置５１の作用について以下に説明する。
観察装置１００により、所定の時間間隔をあけて容器（培養容器）１における培養面の２枚の画像Ｇが取得されると、取得された画像Ｇが細胞画像処理装置５１に送られる。

本実施形態に係る細胞画像処理装置５１によれば、送られて来たいずれかの画像Ｇにおいて測定領域Ｒが設定され、設定された測定領域Ｒに共通する測定領域Ｒが他の画像Ｇから抽出される。すなわち、２枚の画像Ｇにおいて、対応する複数の測定領域Ｒが設定される。

そして、設定された各測定領域Ｒについて、増殖速度算出部５４によって増殖速度が算出され、算出された増殖速度と当該増殖速度を有する測定領域Ｒの位置情報とが対応づけられて情報記憶部５５に記憶される。

したがって、観察者が、画像Ｇを観察して、画像Ｇ内の一の測定領域Ｒにおいて特定の細胞Ｘの存在を確認した場合には、当該測定領域Ｒにおける増殖速度と同等の増殖速度が対応づけられている測定領域Ｒを観察することにより、確認された特定の細胞Ｘと同等の性質を有する細胞Ｘについて選択的に観察することができる。

すなわち、画像Ｇ内の全ての箇所を逐次観察する場合と比較して、観察したい特定の細胞Ｘと同等の性質を有する細胞Ｘを選んで観察することができ、時間と手間をかけずに、特定の細胞Ｘを選別することができる。また、増殖速度によって特定の細胞Ｘを選別するので、コロニーＹの大きさが小さい場合であっても、細胞Ｘを精度よく選別することができるという利点がある。

なお、本実施形態においては、増殖速度と測定領域Ｒの位置情報とを対応づけて情報記憶部５５に記憶することに止めているが、本実施形態においては、情報記憶部５５に記憶された増殖速度と測定領域Ｒの位置情報とを対応づけて表示する表示部を備えていてもよい。
例えば、図３に示されるように、表示部が、観察装置１００から送られて来たいずれかの画像Ｇを表示するとともに、画像Ｇに重畳して、測定領域Ｒを増殖速度に応じて色分けして、表示することにしてもよい。また、図４に示されるように、画像Ｇと重畳することなく、測定領域Ｒのみを色分けして、表示してもよい。これにより、測定領域Ｒ毎の増殖速度をヒートマップによって表示することができる。

また、本実施形態においては、測定領域抽出部５３が、画像Ｇの端縁を基準として画像Ｇを分割することにより、等しい大きさの矩形からなる複数の測定領域Ｒを設定したが、これに代えて、画像Ｇ上の任意の位置に、任意の大きさの矩形からなる複数の測定領域Ｒを設定してもよい。この場合には、画像Ｇ間において近い位置の細胞ＸおよびコロニーＹを同一領域と推定してもよい。また、画像Ｇ間でマッチング処理を行って共通の測定領域Ｒを抽出することにしてもよい。また、画像Ｇ内に写っている容器あるいは標識を基準として測定領域Ｒを抽出してもよい。

また、コロニーＹそのものを測定領域Ｒとして抽出してもよい。
この場合においては、エッジ検出あるいは輪郭追跡により、境界を認識することによって、境界が閉じているものを細胞ＸやコロニーＹとして認識し、その大きさから細胞ＸとコロニーＹとを区別すればよい。

この場合においても、画像Ｇ間において近い位置の細胞Ｘおよびコロニーを同一領域と推定してもよい。また、画像Ｇ間でマッチング処理を行って共通の測定領域Ｒを抽出することにしてもよい。
この場合には、コロニーＹ毎に増殖速度が算出され、図５に示されるように、コロニーＹ毎に増殖速度で色分けされて表示されるので、観察者はさらに効率的に細胞Ｘを選別して、観察することができるという利点がある。

また、コロニーＹそのものを測定領域Ｒとする場合に、コロニーＹの面積、形状、テクスチャなどから複数のパラメータによって測定領域Ｒとするか否かを決定してもよい。これにより、目的に即したコロニーＹのみを測定対象とすることができる。

また、細胞Ｘの種類あるいは培養の目的に応じて選択基準を変えてもよい。これにより、目的に即したコロニーＹを選択することができる。この場合には、選択基準のテーブルを備えていれば、選択基準の切替を容易に行うことができる。また、選択基準は観察者が適宜設定できることにしてもよい。

また、複数のコロニーＹが合体したコロニーＹ、複数の細胞種からなるコロニーＹ、あるいはコロニーＹを含まない領域を予め測定領域Ｒを設定する範囲から除外してもよい。
また、観察者がいずれかの画像Ｇにおいて、いずれかの測定領域Ｒを指定したときに、図６に示されるように、指定された測定領域Ｒにおける細胞数の時間変化を示すグラフを表示することにしてもよい。

さらに、観察者がいずれかの画像（全体画像）Ｇにおいて、いずれかのコロニーＹを指定したときに、指定されたコロニーＹが含まれる測定領域Ｒの時間変化を示す動画を表示することにしてもよい。すなわち、いずれかの全体画像ＧにおいてコロニーＹが指定された場合に、コロニーＹが指定された全体画像Ｇを基準として過去および未来の複数の全体画像における対応するコロニーＹを含む部分画像Ｈを切り出して、古い画像から順に所定時間間隔で切り替えて表示すればよい。

指定したコロニーＹを動画表示する場合に、コロニーＹの中心位置を算出し、各画像Ｇにおいて抽出されたコロニーＹの中心位置を動画の中心する範囲で全体画像Ｇから部分画像を切り出すことにしてもよい。動画再生中にコロニーＹの移動によるブレが少なくなり、コロニーＹの時間変化を視認しやすくすることができる。

また、コロニーＹの動画表示を行う場合には、図７に示されるように、指定されたコロニーＹを含む部分画像Ｈを表示した全体画像Ｇと、全体画像Ｇから切り出した部分画像Ｈの動画と、指定したコロニーＹにおける細胞Ｘの増殖の時間変化を示すグラフとが同時に表示されることが好ましい。細胞Ｘの増殖の時間変化を示すグラフには、表示されている動画の時刻を表す時刻表示、例えば、直線（あるいは矢印等）が示されていることが好ましく、当該時刻表示を時間軸方向にスライドさせることによって、表示されている動画の時刻を切り替えることにしてもよい。

また、増殖速度と測定領域Ｒの位置情報とを対応づけて情報記憶部５５に記憶する際に、増殖速度の近似する測定領域Ｒをグルーピングして、記憶することにしてもよい。この場合に、統計手法の１つであるクラスター分析あるいは予め定められた境界値に基づいて、増殖速度の近似する測定領域Ｒをグルーピングしてもよい。

ここで、細胞Ｘの全体画像Ｇを取得する観察装置１００の一例について説明する。
観察装置１００は、図８に示されるように、試料Ａを収容した容器１を支持するステージ２と、該ステージ２に支持された試料Ａに照明光を照射する照明部３と、試料Ａを透過した照明光をラインセンサ１３によって検出して試料Ａの画像Ｇを取得する撮像部４と、試料Ａに対する撮像部４の焦点の位置を調整するフォーカス調整機構５と、撮像部４をラインセンサ１３の長手方向に直交する走査方向に移動させる走査機構６とを備えている。照明部３、撮像部４、フォーカス調整機構５、走査機構６およびラインセンサ１３はステージ２によって上面を閉塞された筐体１０１内に密封状態に収容されている。

以下の説明において、撮像部４の光軸（対物光学系１１の光軸）に沿う方向をＺ方向、走査機構６による撮像部４の走査方向をＸ方向、ラインセンサ１３の長手方向をＹ方向とするＸＹＺ直交座標系を用いる。観察装置１００は、図８に示されるように、Ｚ方向が鉛直方向となり、Ｘ方向およびＹ方向が水平方向となる姿勢に配置される。

容器１は、細胞培養用のフラスコまたはディッシュのような、全体的に光学的に透明な樹脂から形成された容器であり、互いに対向する上板１ａおよび底板１ｂを有している。試料Ａは、例えば、培地Ｂ中で培養される細胞である。上板１ａの内側の面は、照明光をフレネル反射する反射面となっている。
ステージ２は、水平に配置された平板状の載置台２ａを備え、載置台２ａ上に容器１が載置される。載置台２ａは、照明光を透過させるように光学的に透明な材質、例えばガラスからなる。

照明部３は、ステージ２の下方に配置され斜め上方に向けてライン状の照明光を射出する照明光学系７を備え、上板（反射部材）１ａおいて照明光が斜め下方に反射されることにより、斜め上方から照明光を試料Ａに照射する。

具体的には、照明光学系７は、図９に示されるように、撮像部４の側方に配置され照明光を撮像部４に向かってＸ方向に発するライン光源８と、該ライン光源８から発せられた照明光を平行光束に変換するシリンドリカルレンズ（レンズ）９と、シリンドリカルレンズ９から射出された照明光を上方へ偏向するプリズム（偏向素子）１０とを備えている。

ライン光源８は、光を射出する射出面を有する光源本体８１と、該光源本体８１の射出面上に設けられた照明マスク８２とを備えている。照明マスク８２は、Ｚ方向に延びる短辺と、Ｙ方向に延び短辺よりも長い長辺とを有する長方形の開口部８２ａを有する。射出面から発せられた光が開口部８２ａのみを透過することによって、Ｙ方向に長手方向を有するライン状の横断面（照明光の光軸に交差する断面）を有する照明光が生成される。

図１０Ａ、図１０Ｂおよび図１１は、ライン光源８の具体的な構成の一例を示している。
図１０Ａおよび図１０Ｂのライン光源８において、光源本体８１は、Ｙ方向に一列に配列したＬＥＤからなるＬＥＤ列８１ａと、ＬＥＤ列８１ａから発せられた光を拡散する拡散板８１ｂとを備えている。照明マスク８２は、拡散板８１ｂの射出側の面上に設けられている。

図１１のライン光源８において、光源本体８１は、光拡散性光ファイバ８１ｃと、該光ファイバ８１ｃに光を供給する、ＬＥＤまたはＬＳＤ（Ｓｕｐｅｒｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｄｉｏｄｅ）のような光源８１ｄとを備えている。光拡散性光ファイバ８１ｃを用いることにより、ＬＥＤ列８１ａを用いた場合に比べて、照明光の光強度の均質性を高めることができる。

シリンドリカルレンズ９は、Ｙ方向に延びＺ方向のみに湾曲する曲面をライン光源８とは反対側に有する。したがって、シリンドリカルレンズ９は、Ｚ方向に屈折力を有し、Ｙ方向に屈折力を有しない。また、照明マスク８２は、シリンドリカルレンズ９の焦点面または該焦点面の近傍に位置している。これにより、照明マスク８２の開口部８２ａから射出された発散光束の照明光は、シリンドリカルレンズ９によってＺ方向のみ曲げられて、Ｚ方向に一定の寸法を有する光束（ＸＺ平面において平行光束）に変換される。

プリズム１０は、シリンドリカルレンズ９の光軸に対して４５°の角度をなして傾斜し、シリンドリカルレンズ９を透過した照明光を上方へ偏向する偏向面１０ａを有する。偏向面１０ａにおいて偏向された照明光は、載置台２ａおよび容器１の底板１ｂを透過し、上板１ａにおいて反射されて試料Ａを上方から照明し、試料Ａおよび底板１ｂを透過した照明光が撮像部４に入射する。

撮像部４は、一列に配列された複数の対物光学系１１を有する対物光学系群１２と、該対物光学系群１２によって結ばれた試料Ａの光学像を撮影するラインセンサ１３とを備えている。
各対物光学系１１は、図１２に示されるように、物体側（試料Ａ側）から順に、第１レンズ群Ｇ１、開口絞りＡＳ、および第２レンズ群Ｇ２を備えている。複数の対物光学系１１は、図１３に示されるように、光軸をＺ方向に平行に延ばしてＹ方向に配列され、同一面上に光学像を結ぶ。したがって、像面には、Ｙ方向に一列に並ぶ複数の光学像Ｉが形成される（図１５参照。）。開口絞りＡＳも、図１４に示されるように、Ｙ方向に一列に配列する。

ラインセンサ１３は、長手方向に配列された複数の受光素子を有し、ライン状の１次元画像を取得する。ラインセンサ１３は、図１５に示されるように、複数の対物光学系１１の像面上にＹ方向に配置されている。ラインセンサ１３は、像面に光学像Ｉを結んだ照明光を検出することによって、試料Ａのライン状の１次元画像を取得する。

隣接する対物光学系１１の間には隙間ｄが生じる。Ｙ方向において試料Ａの像に切れ目が無い画像を得るために、対物光学系群１２は以下の２つの条件を満たす。
第１の条件は、各対物光学系１１において、図１２に示されるように、入射瞳位置が最も試料Ａ側に位置する第１レンズ群Ｇ１よりも像側に位置することである。これは、開口絞りＡＳを第１レンズ群Ｇ１の像側焦点よりも物体側に配置することによって実現している。第１の条件を満たすことにより、焦点面から第１レンズ群Ｇ１に近付くにつれて軸外主光線が対物光学系１１の光軸に近付くので、走査方向に垂直な方向（Ｙ方向）の実視野Ｆが第１レンズ群Ｇ１の直径φよりも大きくなる。したがって、隣接する２つの対物光学系１１の視野がＹ方向に互いに重なり合い、視野の欠けがない試料Ａの光学像が像面に形成される。

第２の条件は、図１２に示されるように、各対物光学系１１の物体面から像面への投影横倍率の絶対値が１倍以下であることである。第２の条件を満たすことにより、像面には、複数の対物光学系１１によって結ばれた複数の光学像ＩがＹ方向に互いに重なり合うことなく配列する。したがって、ラインセンサ１３は、複数の対物光学系１１による複数の光学像Ｉを互いに空間的に分離して、撮像することができる。投影横倍率が１倍よりも大きい場合、Ｙ方向に隣接する２つの光学像Ｉが像面において互いに重なり合ってしまう。

第２の条件を満たす場合であっても、実視野Ｆよりも外側を通る光が隣接する光学像に重なることを確実に防止するために、像面の近傍に照明光の透過範囲を規制する視野絞りＦＳを設けることが好ましい。

対物光学系群１２の一例を以下に示す。
入射瞳の位置（第１レンズ群Ｇ１の最も物体側の面から入射瞳までの距離）２０．１ｍｍ
投影横倍率 −０．７５６倍
実視野Ｆ ２．６６ｍｍ
第１レンズ群Ｇ１のレンズ直径φ ２．１ｍｍ
第１レンズ群Ｇ１のＹ方向のレンズ間隔ｄ ２．３ｍｍ
視野の重なり幅Ｄ ０．３６ｍｍ（＝２．６６／２−（２．３−２．６６／２））

ここで、照明部３は、撮像部４の光軸に対して斜め方向から試料Ａに照明光を照射する偏斜照明を行うように構成されている。具体的には、図１６に示されるように、照明マスク８２は、上述したようにシリンドリカルレンズ９の焦点面またはその近傍に位置し、かつ、照明マスク８２の短辺の中心はシリンドリカルレンズ９の光軸に対して距離Δだけ下側に偏心している。これにより、プリズム１０からは、ＸＺ平面内においてＺ方向に対して傾斜する方向に照明光が射出される。そして、略水平な上板１ａにおいて反射された照明光は、ＸＺ平面内においてＺ方向に対して斜めに試料面（対物光学系１１の焦点面）に入射し、試料Ａを透過した照明光は斜めに対物光学系１１に入射する。

シリンドリカルレンズ９によって平行光束に変換された照明光は、照明マスク８２が短辺方向に幅を有しているので、角度分布を有する。このような照明光が対物光学系１１に斜めに入射すると、図１４において二点鎖線で示されるように、光軸側に位置する一部のみが開口絞りＡＳを通過して像面に到達し、光軸に対して外側に位置する他の部分は開口絞りＡＳの外縁によって遮られる。

図１７は、試料Ａとして高い屈折率を有する細胞を観察する際の偏斜照明の作用を説明する図である。図１７において対物光学系１１を左から右へ移動させるものとする。照明光の入射角度が対物光学系１１の取り込み角と同等である場合、試料Ａが存在しない領域を透過した光線ａ，ｅおよび試料Ａの表面に略垂直に入射した光線ｃは、ほとんど屈折されることなく、入射瞳の辺縁の近傍を通過し、像面に到達する。このような光線ａ，ｃ，ｅは、像面において中くらいの明るさの光学像を結ぶ。

図１７において試料Ａの左端を透過した光線ｂは、外側に屈折され、入射瞳の外側に達し、開口絞りＡＳによってケラレる。このような光線ｃは、像面において暗い光学像を結ぶ。図１７において試料Ａの右端を透過した光線ｄは、内側に屈折され、入射瞳の辺縁よりも内側を通過する。このような光線ｄは、像面においてより明るい光学像を結ぶ。上記の結果、図１８に示されるように、一方の側が明るく、他方の側に影が付き立体的に見える高コントラストの試料Ａの画像が取得される。

対物光学系１１に斜めに入射した照明光のうち、一部が開口絞りＡＳを通過し、他の部分が開口絞りＡＳにおいて遮られるような角度分布の照明光を有するために、対物光学系１１に入射する際の照明光の光軸に対する入射角度は、下記の条件式（１）および（２）を満たすことが好ましい。
θｍｉｎ ＞ ０．５ＮＡ （１）
θｍａｘ ＜ １．５ＮＡ （２）
θｍｉｎは、対物光学系１１の光軸に対する照明光の入射角度の最小値（最も光軸側に位置する光線の入射角度）、θｍａｘは、対物光学系１１の光軸に対する照明光の入射角度の最大値（光軸に対して最も径方向外側に位置する光線の入射角度）、ＮＡは対物光学系１１の開口数である。

上記観察装置１００による観察において条件式（１）および（２）を満たすときにコントラストの高い試料Ａの画像Ｇが取得されることが実験的に確認されている。条件式（１）および（２）を満たすためには、シリンドリカルレンズ９の焦点距離Ｆｌと照明マスク８２の開口部８２ａの短辺の長さＬが、下記の条件式（３）を満たすことが好ましい。
Ｌ ＞ （θｍａｘ−θｍｉｎ）Ｆｌ （３）

さらに、プリズム１０の偏向角（対物光学系１１の光軸に対する偏向面１０ａの傾斜角度）が４５°である場合、シリンドリカルレンズ９の光軸に対する照明マスク８２の短辺の中心位置のシフト量（偏心距離）Δは、下記の条件式（４）を満たすことが好ましい。
Δ＝ＮＡ／Ｆｌ （４）
プリズムの偏向角が４５°でない場合には、偏向角の４５°からのずれ量に応じてΔが補正される。具体的には、偏向角が４５°よりも大きい場合には、Δをより大きくし、偏向角が４５°よりも小さい場合には、Δをより小さくする。

条件式（１）〜（４）を満たすことによって、試料Ａが細胞のような位相物体であっても高いコントラストの付いた画像Ｇを取得することができる。条件式（１）〜（４）を満たさない場合には、試料Ａのコントラストが低下する。

フォーカス調整機構５は、例えば図示しない直動アクチュエータによって、照明光学系７および撮像部４を一体的にＺ方向に移動させる。これにより、静止したステージ２に対する照明光学系７および撮像部４のＺ方向の位置を変更し、試料Ａに対する対物光学系群１２の焦点合わせを行うことができる。

走査機構６は、例えばフォーカス調整機構５を支持する直動アクチュエータによって、フォーカス調整機構５と一体的に撮像部４および照明光学系７をＸ方向に移動させる。
なお、走査機構６は、撮像部４および照明光学系７ではなく、ステージ２をＸ方向に移動させる方式で構成されていてもよく、撮像部４および照明光学系７と、ステージ２との両方をＸ方向に移動可能に構成されていてもよい。

次に、観察装置１００の作用について、容器１内で培養中の細胞である試料Ａを観察する場合を例に挙げて説明する。
ライン光源８からＸ方向に発せられたライン状の照明光は、シリンドリカルレンズ９によって平行光束に変換され、プリズム１０によって上方に偏向され、光軸に対して斜め上方に射出される。照明光は、載置台２ａおよび容器１の底板１ｂを透過し、上板１ａにおいて斜め下方に向けて反射され、試料Ａ、底板１ｂおよび載置台２ａを透過し、複数の対物光学系１１によって集光される。各対物光学系１１の内部を斜めに進む照明光は、開口絞りＡＳにおいて部分的にケラレ、一部のみが開口絞りＡＳを通過することにより、陰影の付いた試料Ａの光学像を像面に結ぶ。

像面に形成された試料Ａの光学像は、像面に配置されたラインセンサ１３によって撮像されて試料Ａの１次元画像が取得される。撮像部４は、走査機構６の作動によってＸ方向に移動しながら、ラインセンサ１３による１次元画像の取得を繰り返す。これにより、底板１ｂ上に分布する試料Ａの２次元画像が取得される。

ここで、各対物光学系１１によって像面に結ばれる像は倒立像になる。したがって、例えば、図１９Ａに示される試料Ａの２次元画像を取得した場合、図１９Ｂに示されるように、各対物光学系１１に対応する部分画像Ｐにおいて像が倒立する。この像の倒立を補正するために、図１９Ｃに示されるように、各部分画像Ｐを走査方向に垂直な方向に反転する処理が行われる。

対物光学系１１の投影横倍率の絶対値が１よりも大きい場合、各部分画像Ｐの縁部の視野は、隣接する部分画像Ｐの縁部の視野と重複する。この場合には、図１９Ｃに示されるように、縁部を互いに重なり合わせて部分画像Ｐをつなぎ合わせる処理が行われる。各対物光学系１１の投影横倍率が１倍である場合、このようなつなぎ合わせ処理は不要となる。

このように、ラインセンサ１３を試料Ａに対して走査して試料Ａの２次元画像を取得するライン走査型の観察装置１００において、偏斜照明を用いることによって、細胞のような無色透明の位相物体であっても高いコントラストの付いた画像Ｇを取得することができるという利点がある。また、容器の上板１ａを反射部材として利用し、照明部３、撮像部４、フォーカス調整機構５および走査機構６の全てをステージ２の下方に集約することによって、コンパクトな装置を実現することができるという利点がある。

さらに、照明部３、撮像部４、フォーカス調整機構５および走査機構６の全てをステージ２の下方の筐体内に密封状態に収容しているので、高温多湿のインキュベータ内に収容することができ、インキュベータ内で試料Ａの培養を行いながら、経時的に画像Ｇを取得することができる。

また、対物光学系群１２の近傍に配置されたプリズム１０によって、上板１ａの低い容器１にも対応することができる。
すなわち、上板１ａの位置が低い容器１を使用する場合、上述した条件式（１）〜（４）を満たすためには、照明部３からの照明光の射出位置を、対物光学系群１２の光軸に近付ける必要がある。しかし、対物光学系群１２のレンズや枠等が邪魔となり、対物光学系群１２の近傍にライン光源８を配置することは難しい。

そこで、図１６に示されるように、プリズム１０を、載置台２ａと対物光学系群１２との間に挿入して、対物光学系群１２の上部、かつ、光軸からわずかに径方向にずれた位置に配置し、ライン光源８を対物光学系群１２から水平方向に離れた位置に配置する。これにより、対物光学系群１２の光軸の近傍から斜め上方に向けて照明光を射出することができる。

上板１ａの位置が高い容器１を使用する場合、偏斜照明によってコントラストの付いた試料Ａの光学像を得るためには、対物光学系群１２の光軸から離れた位置から照明光が斜め上方に射出される。したがって、図２０に示されるように、プリズム１０を省略して、ライン光源８から斜め上方に向けて照明光が射出される位置に、ライン光源８を配置してもよい。

さらに、上板１ａの高さが同一である容器１しか使用しない場合には、試料面、反射部材の反射面（上板１ａ）および照明光学系７の相対位置関係が変化しないので、試料Ａへの照明光の照射角度は一定となる。したがって、この場合には、図２０に示されるように、プリズム１０とシリンドリカルレンズ９を省略してもよい。

照明光を反射するための反射部材として容器１の上板１ａを利用することとしたが、これに代えて、容器１の上方に設けた反射部材によって照明光を反射する方式で構成してもよい。

また、本実施形態においては、表示部が、画像Ｇに重畳した色分けによって位置情報に対応づけて増殖速度を表示することとしたが、これに代えて、位置情報と増殖速度とを数値によって対応づけて表示することにしてもよい。

また、本実施形態においては、コロニーＹの高さ寸法を測定および算出した情報と組み合わせたコロニーＹの選別をユーザに提示してもよい。これにより、より精度の高いコロニーＹの選別に関わる情報をユーザに提供することができる。
また、本実施形態においては、観察装置１００として、ライン状に撮影するものを例示したが、これに代えて、スクエア状に撮影するものを採用してもよい。

５１ 細胞画像処理装置
５２ 画像記憶部（メモリ）
５３ 測定領域抽出部
５４ 増殖速度算出部（プロセッサ）
５５ 情報記憶部（メモリ、記憶部）
Ａ 試料（細胞）
Ｇ 画像
Ｒ 測定領域
Ｘ 細胞

Claims (6)

1. 培養中の細胞を経時的に撮影することにより取得された複数の画像について、該画像間において共通する複数の測定領域を抽出する測定領域抽出部と、
   該測定領域抽出部により抽出された各前記測定領域に含まれる前記細胞の増殖速度を算出する増殖速度算出部と、
   該増殖速度算出部により算出された前記増殖速度と、各前記測定領域の位置情報とを対応づけて記憶する記憶部とを備える細胞画像処理装置。
2. 前記記憶部に対応づけて記憶されている前記増殖速度と前記測定領域の位置情報とを対応づけて表示する表示部を備える請求項１に記載の細胞画像処理装置。
3. 前記記憶部が、前記増殖速度算出部により算出された前記増殖速度に応じた複数のグループに区分して記憶する請求項２に記載の細胞画像処理装置。
4. 前記表示部が、いずれかの前記画像を表示するとともに、前記測定領域を前記グループ毎に色分けして表示する請求項３に記載の細胞画像処理装置。
5. 前記表示部が、前記増殖速度に応じた色で前記測定領域を色分けして表示する請求項２に記載の細胞画像処理装置。
6. プロセッサとメモリとを備え、
   前記プロセッサが、培養中の細胞を経時的に撮影することにより取得された複数の画像について、該画像間において共通する複数の測定領域を抽出するとともに、抽出された各前記測定領域に含まれる前記細胞の増殖速度を算出し、
   前記メモリが、算出された前記増殖速度と、各前記測定領域の位置情報とを対応づけて記憶する細胞画像処理装置。

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