CN100436574C - 复制细胞的快速检测 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种通过利用大范围成像检测原位细胞分裂形成的微观集落，从而有效、快速且灵敏地计数活细胞的方法。基于本发明的微生物计数实验解决了临床和工业微生物学中的一个重要难题-采用传统方法检测所需的长时间-同时保留了以微生物培养为基础的传统方法的关键优势。本发明的实施方案包括不利用标记试剂检测细胞微集落的非破坏性无菌方法。这些方法可以产生用于微生物鉴定和确定抗微生物抗性的纯培养物。

Description

复制细胞的快速检测
发明背景
本发明涉及对医学、工业和环境样本中存在的复制细胞，尤其是微生物细胞(如细菌、酵母和霉菌)的检测、计数与鉴定。微生物培养由于具有很多引人注目的特点，因此是这些市场(markets)的主导方法。本发明解决了微生物培养的主要缺陷-获得结果所需要的时间长-同时保留了该方法的优势。
用于检测和计数微生物的微生物培养
19世纪到20世纪间，出现了一种关于细菌、酵母和霉菌在引起传染性疾病，以及确定食品和饮料品质方面所扮演角色的认识。初期，发展出微生物培养这种有效的方法，以检测少量微生物。微生物培养通过利用微生物迅速且大量增殖的倾向，从而实现了对微生物简单地目视检测。例如，当把过小而令肉眼难以发现的单个细菌细胞(约百万分之一米)接种入营养肉汤中时，便可在不超过24小时的时间内令肉汤变得明显浑浊。
被称为微生物计数或集落计数的相关微生物培养技术量化了样本中的微生物细胞数量。基于原位微生物复制的微生物计数方法通常获得的是对应于样本中每个微生物细胞的一个可目测“集落”。因此，计数可见集落便可使微生物学家准确测定样本中的微生物细胞数量。为进行微生物计数，需要将细菌细胞分散在培养皿中的营养琼脂表面(“琼脂平板”)，并于适合原位细菌复制的条件下进行培养。无法目测的个体微生物重复地复制，在祖代微生物细胞所附着的物理位点产生大量相同的子代微生物。子细胞仍然与原始细胞共同定位(基本相邻)，从而群体子细胞(可能生长为数千万、数亿的细胞)最终得以在平板上形成可见集落。
计数微生物集落的电子方法已有所发展。但是与通过肉眼进行的传统计数方法相比，大多数这种自动集落计数基本上未提高灵敏度或缩短获得结果所需的时间。集落计数器利用了多种光学方法检测集落，包括检测微集落固有光学特性(如U.S.Patent No：3,493,772；U.S.Patent No：3,811,036；U.S.Patent No：5,290,701；Arkin，A.P.，等(1990)；Biotechnology(NY)8：746-9)以及环绕集落的基质中pH指示剂分子的颜色变化(U S.Patent No.5,510,246)。利用染色剂或探针标记集落的方法也有所发展，将于下文论述。
即使是在一个多世纪之后，事实也证明微生物培养是一种非常成功的方法，该方法仍然主导了医学微生物学和工业微生物学中的质量控制检验(如药品、食品和饮料生产)。该方法经济、相对简单并且超灵敏。微生物培养的灵敏度可见于针对绞细牛肉(ground beef)中食物来源病原体的常规检验中。采用微生物培养可以在25克绞细牛肉中检测到单个微观细菌性病原体细胞。微生物培养的另一个优势在于其能够检测大范围的具有医学和工业意义的微生物。
原位细菌复制的一个优势是可以生成纯粹或纯系细胞群体(被称为纯培养物、克隆或集落)。纯培养物是相同祖细胞来源的相同活细胞的大量集合。对鉴定微生物和确定抗生素抗性的方法而言，纯培养物是必需的。由于细菌性病原体通常是伴随非致病性细菌从非无菌的临床样本(如粪便或创伤)中分离而得，其中该非致病性细菌可能比该病原细胞还要多，因此医学微生物学严重依赖着纯培养。纯微生物培养物的分离在工业微生物学中也是重要的。例如，药物和化妆品生产商必须检验其产品是否存在微生物污染物。污染微生物的纯培养物被用于微生物鉴定，可以确定一个生产批次是否必须被抛弃，并有助于调查工业过程中的污染源。
  采用微生物培养的微生物计数优势●超灵敏性●定量●产生纯培养物●单次实验中可以检测并计数多种类型微生物●可以选择性地培养微生物●仅检测复制细胞●经济●简单且易于进行劣势●慢●人工操作和分析●并非所有微生物均是可培养的
表1
选择性培养微生物的能力是鉴定微生物和确定对抗菌剂，如抗生素的抗性及敏感度的一种基本工具。选择性培养利用了不同微生物需要不同生长条件的事实。这些差异起因于微生物菌株在其生化组成方面存在差异的事实，其中生化组成方面的差异是其固有遗传差异导致的。例如，一种类型的微生物可能在含有可支持其生长的单一碳源，糖类山梨糖醇的营养培养基上生长，而另一种类型的微生物则不能。选择性生长在食品工业中是重要的。例如，通过将样本接种至只适合沙门氏菌生长，而不适合其它食品微生物的培养基中，便可以观测到食品样本中是否含有特定食品病原体-沙门氏菌。
同样，选择性培养被用于确定哪一种抗生素在杀伤分离自细菌性脑膜炎患儿脊髓液的细菌菌株方面最为有效。以纯细菌培养物(来源自营养琼脂平板的纯系集落)接种含不同浓度多种抗生素的生长培养基。最佳抗生素疗法是通过监测微生物在不同抗生素存在条件下生长的能力而确定的。通过在固体营养琼脂培养基表面的选择性生长，从而确定抗生素抗性和灵敏度的方法是另一种常用方法。例如，在Kirby-Bauer法中，将含有不同抗生素的小滤纸圆片置于营养琼脂平板表面上，该平板已包被有临床样本来源的细菌纯培养物。从该滤纸片向外放射状扩散出一个抗生素梯度。对高水平抗生素具有抗性的细菌生长在滤纸片边缘。而对该抗生素非常敏感的细菌则如果不远离滤纸片边缘便不能生长。平板培养(通常持续一或两天)结束后，微生物学家通过测定滤纸片周围的无生长圈或区域的宽度，便可确定该细菌对抗生素的抗性水平。相关方法，“E”试验(Hardy Diagnostics)利用了含有梯度抗生素的方形条带。通过测定可使条带附近细菌持续复制的条带上最高抗生素浓度的点，便可确定细菌的抗性水平。
微生物培养的最大缺点是慢-需耗时以产生目测所需的细胞数量。微生物培养所需的长生长期在保健和工业两方面都是一个重要难题。例如，因为需要若干天培养并鉴定引起患者血液感染的微生物，因此在抗真菌疗法开始之前，真菌血液感染患者可能已死亡。某些感染物，如引起结核病的细菌，通常需要在培养中生长数周。检测结核分枝杆菌所需的长时间可能致使结核病患者传染许多人患上这一高度接触性传染病，或者令未患结核病的患者遭受到无谓的检疫隔离。
在食品生产中，长的检验周期会加剧食品腐败，或者导致检验物料在后继加工步骤中不恰当的转移。缓慢的微生物培养也会对生物药品和疫苗的生产产生不利影响。在这些应用中，生产过程通常需要将几个批次集中。由于长的微生物培养检验环节，以及贯穿生产过程的物料转移需要，有时直到批次集中环节才检出被污染批次。如果随后发现被污染批次与未被污染批次混合在一起，则整个库的混合批次都必须被抛弃。
微生物培养的其它缺点，如繁重的人工操作，以及不能培养某些微生物，则被认为不如需要的长时间所带来的难题严重。例如，即使已经引入了自动接种和分析设备，人工操作方法仍然主导了微生物计数。环境中发现的大部分类型微生物不能在实验室内生长。不过，这种微生物通常对人类无害，或者在工业生产过程中已被破坏，因此在大多数应用中被忽视了。然而，具有重要医学价值的若干重要例外包括难以或不可能培养可引起性病或肺炎的细菌菌株，诸如衣原体。幸运的是，有可选的不依赖培养的方法可以应用在这些情况中(见下文)。
快速微生物培养计数方法
用于更为快速计数微生物的若干微生物培养方法已有所发展。一种快速微生物培养方法是使细菌细胞沉积在包被有营养培养基的显微镜载玻片上。由于显微镜可以检测到由少量细胞分裂而形成的微集落，所以采用显微镜检验会比肉眼更早检测到微生物的生长。不过，在检验含少量微生物细胞的大样本方面，该方法并不有效，因为在显微镜视野中仅能观测非常小体积的样本。显微镜方法的低灵敏度通常限制了其检测每毫升含有超过一万个细菌细胞的样本的效果-这些方法的灵敏性远低于传统微生物培养。
电子成像系统的出现带动了许多自动“集落计数器”的发展。尽管这些计数器中的大部分被设计为通过使集落计数过程自动化而达到帮助使用者的目的，而且并未缩短获得结果所需的时间，某些系统仍然证实了其在集落大到肉眼轻易可见的程度之前检测集落的能力。例如，Colifast快速微集落计数器(Colifast)可以在大肠型细菌肉眼可见之前数小时便检测到荧光标记的小集落。Colifast系统通过利用营养琼脂培养基中所包含的荧光化合物(一种直到被大肠型细菌代谢才具有荧光性的物质)实现了增强的检测。
最近，采用生物荧光标记快速计数微生物集落的系统已经商品化。MicroStar系统(Millipore)利用了微集落中的细胞ATP通过系统所应用荧光素酶和底物的作用而发光的特性。该方法基本上缩短了检测时间。MicroStar成像系统也可与标记探针结合应用以鉴定特定细菌(Stender，H.等，J Microbiol Methods 46：69-75(2001))。该系统的一个缺点是该检测方法杀死了微生物，妨碍了集落来源的纯培养物的分离。并且该系统也需要昂贵的图象增强组件。
Boston Probes发展了一种检测含特定细菌的微集落的即成底片方法(Perry-O-Keefe，H.等Journal of Applied Microbiology 90：180-9(2001))。即采用微生物特异PNA探针标记膜上的微生物微集落，其中该探针附带有可产生化学发光信号的酶。继而使该膜经由X射线照射或将其置于即成底片上以成像。该方法在一次试验中仅限于观测一种特定微生物。类似方法采用的是荧光标记的PNA探针和阵列式扫描仪(Stender，H.等Journal of Microbiological Methods 45：31-9(2001))。这些方法比传统培养方法事实上需要更多的专业技术。
无需培养微生物的快速微生物计数
最快速的微生物计数方法摒弃了微生物培养。医学和工业微生物学家通常仅感兴趣于计数有活力的微生物-只有活微生物才在微生物培养期间具有复制能力。因此，为了实现最大效果，无需依赖细胞复制而检测个体细胞的方法必须通过利用生理学替代物用于细胞复制，以区分活微生物与死亡微生物(如Nebe-von-Caron，G.等，J MicrobialMethods 42：97-114，2000；Mignon-Godefroy，K.等，Cytometry 27：336-44，1997)。采用染料对细胞进行染色，以测定通常与复制能力相关的生物化学特性(如酯酶活性或生物化学呼吸作用)。已知符合规章标准并通过传统平板培养方法被认为无菌的样本中常常含有数千个细胞对替代物的生物化学活性表现为阳性，因此替代物方法的验证与制定存在难题。
直接检测活细胞的系统的一个实例是ScanRDI系统(Chemunex)。ScanRDI计数的是通过利用激光扫描技术由荧光酯酶底物染色的微生物细胞(U.S.Patent No：5,663,057；Mignon Godefroy，K.等，Cytometry27：336-44，1997)。激光扫描系统(包括利用光电倍增管(PMTs)的光学收集系统)可以捕捉滤膜的图象，并检测到单个标记细胞。该系统除了照明并探寻微观区域(通常4-14μm)以外，还可以逐光束扫描，以覆盖宏观区域(如25mm直径圆)。该系统被设计用于检测具有完整膜和活性酯酶的细胞。这种细胞的数量与可以在生长培养基上形成集落的细胞数量是相关的。不过，该方法常常导致实质性的“过量计数”-即超过传统培养检测所得的细胞数量(Costanzo，S.等(2002)PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology56：206-219)。ScanRDI系统的另一个缺点是在染色过程中杀死了微生物，从而妨碍了检测微生物产生纯培养物。最后，用于细胞计数的激光扫描系统复杂且昂贵(几十万美圆)，使得其难以证明其适合常规微生物学应用。其它激光扫描系统也已商品化(Miraglia，S.等，JBiomol Screen 4：193-204，1999；Tibbe，A.G.等，Nat Biotechnol 17：1210-3，1999；Kamentsky，L.，2001，Laser Scanning Cytometry.In Cytometry，Z.Darzynkiewicz，H.Crissman和J.Robinsnon编.Methods in Cell BiologyVol.63，Part A，3rd ed，Series Eds.L.Wilson和P.Matsudaira.(SanDiego：Academic Press))。
流式细胞计数法是另一种无需依赖细胞复制而快速计数微生物的有效方法(Alvarez-Barrientos，A.等，Clin Microbiol Rev 13：167-195，2000)。单个生物体或颗粒被迫流经狭窄通路，一次一个地经过激光束。除计数以外，通过分析生物体所引发的荧光放射和光散射，还可以搜集到关于尺寸/形状和成分的信息。每分钟可以分析数千个单细胞或颗粒。通过将荧光标记的种类特异抗体或核酸探针与固定的生物体结合，便可以利用流式细胞仪鉴定病原体(Alvarez-Barrientos，2000，同上)。
通过将荧光标记的种类特异抗体或核酸探针与固定的生物体结合，便可以利用流式细胞仪鉴定病原体(Alvarez-Barrientos，2000，同上)。一种特定类型的单个细胞通常是分析对象。流式细胞计数法已被广泛用于定量检测特定细胞类型，并且以细胞与标记探针，通常是抗体或核酸的结合能力为基础。例如，利用流式细胞计数法定量AIDS患者体内几类淋巴细胞的群体尺寸。流式细胞计数法是一种比传统培养更为复杂且昂贵的方法。尽管比传统培养快速，但流式细胞计数法仍然不具有可与传统方法比较的检测范围。传统微生物培养可以检测0.1升水中的一个细菌细胞，而流式细胞计数法只有当细胞数量水平高于上述水平数千倍时才最为有效。此外，微生物对象通常被检测所用的染色方法杀死，从而丧失产生纯培养物的能力。
采用显微镜成像以显现并直接计数微生物是可以快速并相对简单地实现的(Amann，R.I.等，Microbiological Reviews 59：143-69，1995)。在临床诊断实验室内，使荧光标记抗体与固定样本反应的直接荧光实验(DFA)是一种常用方法。例如，采用革兰氏染色剂对怀疑含有细菌的待检验物进行常规染色。同样，为检验结核分枝杆菌，需对样本进行抗酸性染色。该技术的缺点是其比微生物培养的灵敏性低数千倍。低灵敏度是由于高放大倍数所显现的是小视野。而只有存在高浓度靶细胞的情况下，小视野中才可能含有靶细胞。因此，例如采用荧光原位杂交对唾液中的细菌性病原体所进行的可靠鉴定需要数滴含有大约4×105个细胞/ml或更多细胞的唾液。在医学上常见的重要感染中所获的临床样本可能含有的细菌浓度低于100个细胞/ml-该浓度并未高到足以期望在高倍数显微镜视野中发现细胞的程度。
Hamamatsu公司的研究人员已经研制了一种利用大范围非放大成像，确实具有足够灵敏度以检测单个细菌细胞的系统(Masuko，M.等，FEMS Microbiol Lett 67：231-8，1991；Masuko，M.等，FEMS MicrobiolLett 65：287-90，1991；Yasui，T.等，Appl Environ Microbiol 63：4528-33，1997)。单个微观靶细胞的大范围成像是通过利用与光学纤维系统、图象增强器、图象处理器相连的超灵敏光子计数CCD照像机实现的。该系统的一个缺点是由于组合了图象增强器及相连光学元件所带来的高额费用。此外，与微生物培养方法不同，该系统不能检测任何微生物、区分活微生物与死亡微生物，或生成纯培养物。
通过定量确定细胞的分子组成的快速微生物计数
在上半个世纪，基于微生物分子组成检测并鉴定微生物的许多方法都有所发展。尽管这些方法中的若干基本上比微生物培养快，但均未提供对微生物学家而言可谓关键的所有培养特征。例如，尽管适用于微生物的很多免疫测定方法已经商品化，但该技术本身并不能定量，且灵敏性远低于微生物培养，并且在单次检验中不如可检测多种类型微生物的培养有效。或者如另一个实例，核酸扩增法可以和微生物培养法一样灵敏，但不能区分活细胞与死亡细胞，并且不能提供适用于检验抗生素敏感度的纯培养物。利用电泳、质谱分析和色谱的生物化学分析方法(如适用于脂肪酸、核酸或蛋白质)可以有效地鉴定微生物，但这种方法通常不适用于计数微生物，并且对常规微生物诊断而言通常太昂贵且复杂。
微生物计数尚未满足的需要
总之，微生物培养主导了目前的微生物计数实验。微生物培养所具有的重要优势是简单、超灵敏、经济且定量，但其显著的缺点是慢。在保健和生产方面，获得结果所需的长时间是主要的代价。更为快速的方法已得到发展，但在改进获得结果所需时间的问题同时，却牺牲了微生物培养的一种或多种关键优势。
因此，对检验而言，需要一种比传统微生物培养快速，还保留了传统方法的关键优势的方法。
发明概述
本发明通过利用大范围成像检测来自原位细胞分裂的微观集落，从而实现了对活细胞有效、快速且灵敏的计数。基于本发明的微生物计数实验解决了临床和工业微生物学中的一个重要难题-传统方法检测所需的长时间-同时保留了基于微生物培养的传统方法的关键优势。本发明的实施方案包括无需标记试剂检测细胞微集落的非破坏性无菌方法。这些方法可以获得适用于鉴定微生物和确定抗生素抗性的纯培养物。
本发明以检测样本中活靶细胞的方法为特征，该方法包括将样本中存在的活靶细胞提供在检测区(detection zone)内，该检测区包括密度不超过每平方毫米检测面积(detection area)100个靶细胞的检测面积，使靶细胞通过原位复制形成一个或多个微集落；检测一个或多个微集落，其中该一个或多个微集落是细胞复制产生的；其中该检测面积的最长线性维度(dimension)大于1mm；该检测面积内，细胞是随机分散且固定的；该检测法检测的一个或多个微集落所具有的平均尺寸在至少两个正交维度上不超过50微米；并且该一个或多个微集落中的细胞在检测步骤之后仍然保留复制能力。
本发明进一步以检测靶细胞微集落的方法为特征，该方法包括将靶细胞提供在检测区内，其中该检测范围内，细胞是任意分散且固定的；使靶细胞通过原位复制形成一个或多个微集落，其中至少一个微集落所含靶细胞不超过100个；以及利用不超过5倍的放大倍数检测一个或多个微集落的一种或多种自然出现的光学特性。
本发明也以检测靶细胞微集落所用的设备为特征，该设备包括光学分辨率不超过20微米、被围圆(encircled)能量值超过每个像素70％的光电阵列探测器；照明光源，其中该装置能够照明并同时使至少一个尺寸≥1cm的检测范围成像，并且该装置光学放大不超过5倍。
本发明的优势
本发明多种实施方案的若干优势列于表2中。
  实施方案   优势
  ●微集落的无试剂荧光检测与计数   -对公认实践的改动最小-更快和更低的风险调节方式-物品的低成本-系统简单-实现了非破坏性检验(下文)
  ●为检测活微集落优化的收集性光学元件   -检测时间短
  ●膜上单个活微集落的非放大性大范围成像   -可以超灵敏检测-具有大的动态范围-允许宽范围的样本体积-在低滴度下具有高的信号：背景比
  ●非破坏性计数(即微生物未被杀死)   -可以产生纯培养物-可以鉴定微生物-可以检测抗生素抗性-可内部验证(下文)
  ●与传统可见集落的内部比较   -与验证方法等效性的有效证明
  ●使无菌(封闭)一次性器皿中的活微集落成像   -可以多重读取-假阳性最小化
  ●独特地区分生长微生物与人工产物的方法和软件   -更高的检测可靠性，特异性-可以检测复杂样本
表2
本发明获得结果所需时间之所以短是因为本发明具有可检测仅含一小部分细胞的微集落的能力，而这个能力是传统方法所必需的。由于细胞复制需要时间，因此与采用传统计数方法检测大的可见集落的速度相比，采用本发明检测小的微集落获得结果速度快。为检测小的微集落，本发明采用了有效信号生成与信号检测方法的组合。
超灵敏度-其检测大样本中少量微观细胞的能力-部分是因为大范围成像的应用。例如，本发明可以无需放大地检测微观集落。该特征使得我们可以观测大范围从而检测到单幅图象中的微集落。大范围成像对本发明有效分析大样本体积的能力而言是关键的。例如，采用膜过滤可以使大体积样本中的微生物污染物沉积在膜上。本发明利用微集落的大范围非放大成像，可以有效地分析整个膜。与之相比，采用高放大倍数显微镜估计相同滤器上的微集落可能需要数千幅图象。
有效计数大范围中的少量微集落的能力也源于本发明具有利用可比较目标信号与局部背景的成像方法的能力。对含有很少细胞的样本而言，这一能力与将大范围内的总信号与背景集成的方法相比，提高了信号与背景的比率。
本发明计数生长微集落的特有能力实现了对含有很少细胞的样本的分析可靠性。因此，与检测单一集成信号的方法，如量化所存在生物分子(如ATP、抗原或核酸)的方法相比，本发明可以减少假阳性。当采用仅依赖于集成信号的方法时，任何可引发信号的人工产物均可能造成假阳性。假设一个样本含有482个微生物细胞，每个细胞可产生100个荧光单位。集成方法的结果是一个数量(48,200个荧光单位)。可产生近似数量荧光单位的人工产物，例如大的荧光尘粒可能是不可区分的。不过，本发明可以容易地区分单个大荧光尘粒与482个独立生长的微集落。
对区分来自无生命物质的假阳性信号与来自不能在实验条件下生长细胞的假阳性信号而言，检测生长中的微集落是一种有效的方法。例如，假设一个实验是检测培养皿中固体生长培养基上所覆膜上的微生物微集落。本发明的一种实施方案中，是于检测范围内的微生物生长成为微集落之前，使检测范围成像。如果该检测区域内存在若干荧光尘粒或自身荧光性哺乳动物细胞，若干阳性信号在该“起始时间”图象中将是明显的。在培育培养皿，使微生物开始复制之后，获取另一图象。当两幅图象在寄存器内排列时，便可将相应于微集落的阳性信号与假阳性信号区分开来，因为“起始时间”图象和培养之后的图象中均存在假阳性信号(通常无变化)。只有生长中的微集落会随着时间而出现。为确认是微集落信号，可以在培育期间的多个时间点获取图象并进行比较。只有生长中的微集落会随着时间在信号强度和尺寸上有所增加。
与采用现有技术方法构建的实验相比，采用本发明所构建的实验具有大的动态范围。因此，例如，基于本发明设计的实验可以检测单幅图象中的1～106个微集落。与之相比，当滤膜(47mm直径)上沉积有大约30～150个集落时，传统微生物计数方法才最为有效。新计数方法(如Chemunex’s ScanRDI和Millipore’s MicroStar)的动态范围也有限。
为实现有效信号的产生，本发明可以利用微集落的固有光学特性(如自身荧光性、反射率或者光散射)或多种外部应用的标记试剂。利用一系列光学特性和标记方法的能力使重要的微生物学实验得以建立。例如，对计数样本中总微生物含量的实验而言，采用检测微集落普遍具备的特性(如自身荧光或红外线吸收)的方法是有效的。对食品加工过程中腐败可能性的确定，以及药物生产中的成品出厂检验而言，这种实验都是至关重要的。本发明的一种重要实施方案采用了基于检测细胞自身荧光的无试剂体系，以检测小的微生物微集落。该实施方案提供了一种简单、非破坏性、无菌的微生物计数方法。为检测特定类型的细胞，可以采用种类特异标记试剂。例如，可采用与单核细胞增多性李氏菌特异结合的荧光标记抗体以检测该重要食品病原体细胞来源的微集落。
与传统微生物培养类似，本发明可以利用选择性条件下测定微生物生长的诊断能力。例如，为确定对抗生素的细菌抗性，可以在已经预置有抗生素圆片的生长培养基上培养细菌。圆片附近非生长区的尺寸决定了抗生素抗性。可以利用本发明更为快速地检测该区域的尺寸。同样，可以利用本发明快速地检测选择性培养基上的特定微生物的生长情况。
本发明另一项源于非破坏性计数的优势是简化了必需的实验验证环节，在该环节中，新方法显示与“金标准”方法等效。本发明通过内部比较新旧方法，促进了其与“金标准”培养实验的等效性。简言之，在早期时间点，使来自样本中微生物的微集落成像之后，可以重新培育样本持续一定时间，该时间段是采用传统目测集落方法时所必需的。以这种方式便可以内部比较本发明的微集落计数与传统方法对微集落后期所形成的相同集落的计数。
下文的描述和权利要求将凸显本发明的其它特征和优势。
靶细胞意指可能存在于样本中，通过本发明检验其是否存在的细胞。
靶细胞的种类(category)意指对采用本发明所构建实验的目的而言，被认为是一致的多个靶细胞。
假设一个实验被设计用于检测大肠杆菌细菌的任意菌株。对该实验的目的而言，种类“大肠杆菌”将因此包括大肠杆菌种中的任何细菌。可以设计该实验用于检测大肠杆菌种中的任何细菌，而无需进行区分。非大肠杆菌的细菌和其它靶细胞将不能在该实验中被检测出来，或者可以被检测出来，但被鉴定为非大肠杆菌家族成员。与此相比，假设一个实验被设计用于检测大肠杆菌种的亚群，病原体大肠杆菌O157:H7。该情况中，亚群大肠杆菌O157:H7便是靶细胞的一个种类。在该亚群，即种类“大肠杆菌O157:H7”中的细菌可以被不加区分地检测出来。大肠杆菌O157:H7亚群中不含的大肠杆菌则不能被该实验检测出来，因而不在大肠杆菌O157:H7种类中。
种类不需要如上述内容那样在分类学上相关。例如，可以将实验设计用于检测可产生一种特定蛋白质的细菌种类，该蛋白质在赋予该细菌种类抗生素万古霉素抗性方面是必需的。该蛋白质可能是由并非密切相关，即属于完全不同种类成员的细菌菌株产生。不过，一个种类中的万古霉素抗性菌株可能与相同种类中的万古霉素敏感菌株非常密切相关。例如，可产生vanA蛋白质(对实现万古霉素抗性而言是重要的)的细菌种类包括肠球菌属和葡萄球菌属中的万古霉素抗性细菌，不过多数肠球菌和葡萄球菌并不被包括在该种类内。因此，从该情况可以看出，对本实验目的而言，该种类包括了由于一个共同特征而被认为一致的靶细胞，该情况中的共同特征是分子组成(种类特异结合位点)，而不是共同的种系发生(系统)关系。
靶细胞的非重叠种类意指并集为空集的几组靶细胞。即所有大肠杆菌细菌的种类，假单胞菌属中所有细菌的种类，和所有真菌的种类是非重叠种类。即任何一个种类中的成员均非其它任一种类中的成员。
实验的种类复杂度意指本实验中所检测到的非重叠种类的数量。
种类特异结合位点意指靶细胞上的一个位点，该位点可在特异结合条件下与种类结合分子特异结合，并且可以区分作为实验中待鉴定的特定种类成员的靶细胞与非该种类成员但也可能存在于该检验样本中的靶细胞。即该位点典型地存在于一个种类的所有成员中，并且典型地不存在于非重叠种类的任何成员中。种类特异结合位点与种类特异结合分子特异结合。
如果实验观测(scan)一份样本以确定构成分类群的靶细胞种类，种类特异结合位点存在于该分类群基本上所有的成员当中，而并非存在于检验样本可能存在的其它分类群基本上所有的成员当中。
可选地，实验可以观测样本以检测不同分类群成员所共有的种类特异结合位点。该类型种类特异结合位点的实例包括多种大分子(如DNA)和基因、mRNAs、赋予细菌抗生素抗性、病毒性或者指示活力的蛋白质。种类特异结合位点通常是较大分子或复合物的一部分。例如，在实验中可采用种类特异基因组序列作为种类特异结合位点。该种类特异结合位点是更大基因组的一部分，其中该基因组含有(1)非种类特异的部分；(2)该实验不能观测到的种类特异结合位点部分；以及(3)其它部分，即该实验可观测到的独特种类特异序列。
具有下列特征的结合位点被认为是种类特异结合位点，即该结合位点存在于例如80％、90％、95％或超过99％的一类靶细胞当中，该类靶细胞是一个种类的成员，而在例如80％、90％、95％或超过99％的另一类靶细胞当中是缺乏的，该类靶细胞则是相同分类中所有其它种类的成员。应当指出，种类特异结合位点可以在作为该种类成员的靶细胞当中一般或特别缺乏。同样，种类特异结合位点可以在非该种类成员的靶细胞当中一般或特别存在。例如，假设一个蛋白质位点存在于基本上所有的大肠杆菌细菌中，而在其它细菌种类中未出现。如果，正如可能在数百万个细菌中不超过一个的细胞上发生的情况，突变使得该蛋白质不再被产生，则该标记将不再存在于该菌株的大肠杆菌中。不过，该蛋白质位点仍然被认为是种类特异结合位点。可选地，通过重组DNA技术或自然途径(如通过病毒转导)将相同蛋白质的基因转移至不同种类细菌的一个菌株中。该情况中，非大肠杆菌种类成员的细菌菌株将表达仍然被认为是大肠杆菌特异结合位点的蛋白质。
种类结合分子意指与种类特异结合位点特异结合的分子或分子复合物。种类结合分子的实例包括可与基因组DNA杂交的核酸探针；在体外被选择或“检出”与蛋白质上的位点特异结合的核酸适体(aptamer)；与细胞抗原或血清蛋白质结合的抗体；与激素受体或诸如抗生物素蛋白的结合分子特异结合的配体，如表皮生长因子或生物素。如果两个种类结合分子可分别与独特且非重叠种类特异结合位点结合，则认为这两个种类结合分子是截然不同的。根据分子组成，可以将种类结合分子称为，例如种类结合寡核苷酸、探针、抗体、配体等。
与一个种类的靶细胞特异结合的种类结合分子意指在特定结合条件下，可与基本上所有作为实验所观测到的种类成员的靶细胞结合，而基本上不可与非该种类成员但可能存在于样本中的靶细胞结合的种类结合分子。可被所观测到种类中的靶细胞结合的种类结合分子数量与被非该种类的靶细胞结合的种类结合分子数量相比，典型的前者超过后者的两倍、五倍、十倍或超过五十倍。
结合条件意指实验所用来实现种类结合分子与种类特异结合位点特异结合的条件。例如，当种类结合分子为种类特异DNA探针时，适用于特定实验的结合条件可能是严格DNA杂交条件。如本领域技术人员所熟知的，合适的严格DNA杂交条件取决于该探针的属性。例如，对长度大于500个碱基的典型DNA探针而言，合适的结合条件(在杂交术语中通常被称为“洗涤条件”)是65℃下、0.2X SSC中。对抗体与抗原的结合而言，典型的结合条件是室温下、PBS-TB中。
种类结合分子家族意指与特定种类靶细胞特异结合的一组种类结合分子。
由于多克隆抗体通常包含与相同种类靶细胞结合的多个独特种类结合分子，因此多克隆抗体通常构成了种类结合分子的家族。应当指出，如果不利用亲和纯化，多克隆抗体制备物将典型地也含有不与选定种类的靶细胞结合的抗体，并且可能含有与其它种类靶细胞结合的抗体。其它抗体的存在是因为动物抗体的所有组成部分是由该动物的感染历史所决定的。因此，多克隆抗体优选地通过亲和法进行纯化。一个家族中的种类结合分子可能与该种类中的若干靶细胞结合，而不与其它靶细胞结合。
种类结合分子家族的另一个实例是出现在所有大肠杆菌O157:H7菌株中，而未出现在其它细菌群体成员中的一组80个种类特异基因组DNA序列。该种类结合分子家族可作为一个群体与经过适当处理的大肠杆菌O157:H7细胞杂交，而不可与其它种类细胞杂交。家族可以包括不同类型的种类结合分子。例如，上述家族的种类结合分子也可以包括与O157抗原特异结合的单克隆抗体，以及与内膜毒蛋白质(一种毒性因子)结合的单克隆抗体。种类结合分子家族可以含有任意数量的种类结合分子(即一个或多个)。
种类结合分子的非重叠家族意指几个种类结合分子家族，其中的每个家族均可与一组非重叠种类中的一个，且仅与一个种类特异结合。即种类结合分子的一组非重叠家族对应到非重叠种类的相同组。例如，在观测4USP有害生物大肠杆菌、沙门氏菌、假单胞菌属某些种和金黄色葡萄球菌的实验中，这四种生物均为非重叠种类。该实验可能合并有四种不同的非交叉反应的多克隆抗体，每种抗体均特异于该实验种类中的一种。因此，该实验包含了四个非重叠家族的种类结合分子。实验中非重叠家族的种类结合分子被称为种类结合分子的集合。
种类结合分子集合(ensemble)意指被合并在特定实验所用混合物中的一组种类结合分子，包含有一个或多个非重叠家族。观测靶细胞的多个非重叠种类的实验包括了每个种类的一个种类结合分子家族。包含这些家族的整组种类结合分子被称为一个集合。
一个集合的种类结合分子复杂度意指一个集合中独特的种类结合分子或部分的数量。例如，如果一个种类结合分子集合包括234个寡核苷酸探针，则该集合的种类结合分子复杂度为234。
一个集合的家族复杂度意指一个集合中种类结合分子的非重叠家族的数量。该家族复杂度与结合一个集合中每个家族来源的种类结合分子所需的靶细胞的最少数量相同。实验的家族复杂度与实验的种类复杂度一致-即，样本中所被观测到的独特种类的数量。通常，该家族复杂度也与实验所采用的独特信号标记的数量一致。
信号元(element)意指直接产生一个可检测信号的分子或颗粒。术语“直接产生”指信号元是可检测信号的直接来源或重要调节物的事实。因此，如果该信号是由荧光团所引发的光子，则该荧光团即为该光子的直接来源，则因而为信号元。如果该信号是由RLS颗粒所散射的光子，则RLS微粒为信号元。可选地，如果该信号是由辣根过氧物酶的生色沉淀产物所透射或散射的光，则该生色产物为信号元。
信号元的一个特征是其不能被分割为几部分，以使每一部分均产生一个可与总信号比较(在特征上，无需在强度上)的信号。因此，2nM直径的量子点是一个信号元，因为随着对其的分割，便改变了所获相应纳米晶体的特征(放射光谱)。一个含有荧光染料，诸如荧光素的5μm颗粒不是发信号元，因为其可以被分割为几部分，而每一部分均具有可与整个颗粒相比较的发信号特征。与之相比，分子荧光素则是发信号元。信号产生酶(如荧光素酶、碱性磷酸酶、辣根过氧物酶)的可检测产物也被认为是信号元。这种信号元(或者是当存在一个从前体到信号元的化学转化时的其前体)可以是可扩散物质、不溶产物和/或不稳定中间物质。例如，碱性磷酸酶将化学发光底物CDP-Star(NEN；编号NEL-601)转化为一种活性产物，该产物即为光子发射信号元。
发信号部分意指包含或产生(在酶的情况中)一个或多个信号元，并且被结合到、或者可以被结合到种类结合分子的分子、颗粒或物质。该发信号部分可以共价或非共价地，以及直接或间接地(例如，通过一个或多个转接物或“化学连接物”部分)附着到种类结合分子上。发信号部分的实例包括羧化的量子点；荧光团，如被改良用于结合核酸探针或抗体探针的Texas Red；抗生物素蛋白链菌素包被的荧光聚苯乙烯颗粒(可以被结合到生物素化的种类特异结合蛋白质)；含有重复核酸序列的滚环状复制产物，每个产物均可被杂交到若干连有荧光修饰核苷酸的寡核苷酸，并且在5’末端均含有种类特异结合寡核苷酸。发信号部分可以包含物理上独特的成分。例如，在某些情况中，该发信号部分是与种类结合分子(例如抗体)结合的一种酶(如碱性磷酸酶)。当碱性磷酸酶的底物(如CDP-Star或者分别获自NEN和Roche的BM紫)被转化为本身是信号元的产物(如发射光子的不稳定中间物质，或者可沉淀的生色产物)时，便产生了信号。对种类结合分子、酶学发信号部分以及底物而言，被应用在不同时间的反应当中是常见的。
发信号部分复合体意指包含超过一个发信号部分和超过一个种类结合分子的物理单元。发信号部分复合体中，该发信号部分与种类结合分子的物理相联必须是稳定的(如4℃下，在PBS中，该发信号部分与种类结合分子连同该复合体所具有的平均半衰期应至少为一天)。发信号部分复合体的一个实例是假设由两种类型：靶细胞特异抗体和碱性磷酸酶的数千个分子包被的聚苯乙烯微粒。该发信号部分复合体是通过所结合的抗体种类结合分子与靶细胞结合。当采用生色碱性磷酸酶底物(信号元；如BM紫，Roche)进行培育时，便可以产生肉眼可观测到的着色斑点。可选地，当采用化学发光或荧光碱性磷酸酶底物培育相同的发信号部分复合体时，可以产生化学发光或荧光信号。发信号部分复合体的其它实例包括：与荧光素标记抗体结合的纳米金颗粒，以及与寡核苷酸种类结合分子和吖啶酯二者结合的胶乳微粒，其中吖啶酯是在添加过氧化氢后才能化学发光。
信号元或信号部分的信号特征意指由信号元或发信号部分所产生信号的一个或几个方面，这些方面有助于区分该信号元或发信号部分与其它信号元或发信号部分。例如，由荧光素和若丹明标记的发信号部分的信号特征为荧光性。无线电应答器的特征是射频。光子发信号特征的实例为荧光性、光散射、磷光、反射率、吸光度、化学发光性和生物发光性。除了后两个实例以外，其它的光子发信号特征均取决于外部照明(如白光源、激光源或日光)。与之相比，化学发光性与生物发光性则是不依赖外部光源的发信号特征。
信号元或发信号部分的类别(class)意指该信号的独特性质，该性质有助于区分该信号元或发信号部分与其它信号元或发信号部分。例如，将由红色染料标记的脂质体与不同染色的脂质体区分开。红色即其类别。对传播特定射频信号的微发射机而言，可区分该微发射机与其它微发射机的射频信号的性质便构成了该信号元的类别。
信号标记(signature)意指实验中发信号部分与一个种类的靶细胞结合而成的结合体的独特发信号性质。与四种类型抗体结合的靶细胞，即其中一个与荧光素分子结合，其它三个与若丹明分子结合的靶细胞所具有的信号标记是通过荧光素与若丹明的组合加权吸光度和发射光谱进行描述的。
实验或标记的种类结合分子集合的信号复杂度意指在该实验中或者通过与该集合结合从而可以被独特标记的靶细胞种类的数量。可选地，将该信号复杂度定义为如果存在每个种类靶细胞的一个成员便可预期将出现的独特信号标记的数量。对某些实验而言，种类结合分子集合的信号复杂度与实验所观测到的种类数量相同。其它实验中，虽然观测到许多种类，但可能具有的信号复杂度仅为一。
选择力意指用于捕获、分离、移动或隐蔽靶细胞的力。选择力的实例包括重力、磁力、电势、离心力、向心力、浮力密度和压力。仅通过作用在靶细胞上的选择力便可以移动靶细胞。可选地，选择力可以特异地作用在与选择部分相联的靶细胞(见下文定义内容)。
移动靶细胞的选择力的应用实例包括：离心靶细胞；磁选择结合有磁性颗粒的靶细胞；重力沉降标记有金属颗粒的靶细胞；通过真空过滤使靶细胞在多孔膜上沉积。
选择部分(selection moiety)意指可以被结合到种类结合分子，并且使种类结合分子可以被选择力选择性地捕获、分离、移动或隐蔽的原子、分子、颗粒或细胞。当种类结合分子：选择部分复合体特异地结合到靶细胞上时，通常可以通过选择力将该靶细胞选择性地捕获、分离、移动或隐蔽。选择性指优先使选择部分及相连细胞对选择力的作用敏感，而不是与选择部分不相连的细胞。
顺磁性颗粒和铁蛋白是选择部分的实例。沉入溶液中的致密石英颗粒是另一种类型的选择部分。当这种颗粒包被有种类结合分子，并与微生物靶细胞结合时，便可使该靶细胞沉入水溶液中，从而将该结合的靶细胞与样本中的其它未结合组分分离开。
选择性特征意指选择部分的一个或几个方面，这些方面有助于捕获、选择或移动该选择部分。例如，顺磁性颗粒的选择性特征为磁性。快速沉入水溶液的石英颗粒的选择性特征为质量。
大致平坦的表面或底物意指可以与一个虚平面平行排列的平面，从而在测量从该平面上任意一个1mm×1mm正方形中的点到虚平面上最近点的距离时，平均距离的绝对值小于50微米。
检测表面意指可沉积靶细胞的大致平坦的底物表面。在利用光子发信号特征的实施方案中，如果该检测表面是光学透明的，则可以经由该检测表面的任意一面进行检测。如果该检测表面是不透明的，则经由该检测表面可沉积靶细胞的一面进行检测。
检测面积意指由检测装置同时取样的检测表面的面积。例如，由包括收集透镜和CCD芯片在内的光学装置同时成像的载玻片部分可能测量为0.8cm×0.5cm。则该检测面积为0.4cm2。
检测区意指特定容积，该容积内复制中的靶细胞可通过检测装置被检测到。该检测区的尺寸与检测面积相同，除此之外，还具有一个深度，与该深度对应的是可检测并识别来自复制中的靶细胞的信号的深度。因此该检测区的深度取决于计算正信号所用的阈值标准。当采用光检测时，该检测区的深度取决于视野的光学深度。
检测面积的最长尺寸意指可以在检测区周边上的两点之间所画出的最长线。例如，如果该检测区是0.3cm×0.4cm的方形，则该检测面积的最长尺寸是其0.5cm长的对角线。如果该检测面积是半长轴为7mm长，半短轴为2.5mm长的一个椭圆，则该检测面积的最长尺寸为14mm。
大范围检测或大范围成像意指检测微观靶细胞的方法，其中该检测面积(由检测装置同时分析的面积)远大于该靶细胞或微集落的尺寸。大范围检测的检测面积至少有一个线性尺寸≥1mm。与之相比，微观集落基本上较小，在至少两个正交维度上典型地尺寸不超过50μm。大范围检测的实例包括采用CCD像机成像一个直径为9mm的检测面积；采用具有1cm长尺寸的线性阵列检测器扫描成像一个2cm×1cm的方形；采用直接曝光照相底片的方法成像一个4cm×4cm的滤膜。
若干检测样本中微集落的技术，并未采用大范围检测。实例包括固相激光微束扫描细胞计数，以及在载玻片上具有多个大功率显微视野的显微镜检验。
结合的或稳定相联的意指两个实体之间的物理相联，其中4℃下，该联结在PBS中的平均半衰期最少为一天。假设，例如蛋白质被动吸附到聚苯乙烯颗粒的复杂情况。存在若干不同种类的被吸附蛋白质。某些蛋白质与表面稳定相连，且半衰期为数月。其它蛋白质，如松散结合在被吸附蛋白质外层的蛋白质，则不能与颗粒稳定相连，在几小时内便可浸出。
颗粒意指沿任意轴所测量尺寸均不超过1mm的刚性基质(即至少具有固体的某些特征)。颗粒可以掺杂有信号元或者与信号元结合。颗粒通常被称为颗粒或者是可反映其尺寸或几何形状的术语。例如，采用的术语纳米球、纳米颗粒或纳米珠指沿任意给定轴所测量尺寸均小于1微米的颗粒。同样，采用的术语微球、微粒或微珠指沿任意给定轴所测量尺寸均小于1毫米的颗粒。颗粒实例包括乳胶颗粒、聚丙烯酰胺颗粒、磁性微粒、铁磁流体(磁性纳米颗粒)、量子点等。
图象增强器或图象摄像管意指放大光子信号的装置，如Inoué，Shinya等，Video microscopy：the fundamentals(Plenum Press，New York，1997；p.665)所定义的“一种与摄像管(通过纤维光学元件或透镜)相连，以提高灵敏度的装置。该增强器为一个电子管，该电子管具有一个位于其前端可以根据聚焦其上的图象发射电子的光电阴极，和位于其后端可将电子聚焦在荧光屏上的电子透镜和/或微通道片，以及一个可提高电子能的高压加速器。可以是单级或多级”。同一文献的章节8中具体描述了若干种这样的图象增强器。
在一部分检测面积内的同时检测意指在同一步骤中对来自一部分基本平坦的检测表面的信号所进行的检测。利用CCD芯片、目视检测或者光电二极管基础的信号集成对检测面积中的目标进行大范围成像便是同时检测的实例。
鉴定意指确定靶细胞所属的一个或几个种类。
样本意指本发明所观测以确定是否存在靶细胞的材料。
直接目视检测意指除了耐磨校正透镜以外，不借助仪器所进行的目视检测。
光电检测器意指可以将光信号转换为电信号的人造装置或设备。光电检测器的实例包括CCD检测器、光电倍增管检测器和光电二极管检测器，如雪崩光电二极管。
被围圆能量或被围方形(ensquared)能量意指来自无穷小光源，并被捕获在光学探测仪阵列的一个像素上的光子百分比。
热辐射意指黑体辐射。
细胞自身荧光性或自身荧光性意指由于天然固有的细胞组成，如NADH和氧化的黄素蛋白的荧光性，从而使细胞表现出的荧光性。由于重组荧光蛋白质，如绿色荧光蛋白质的存在而表达荧光的细胞则不被认为具有自身荧光性。
原位复制意指靶细胞在本来所处位置上进行的复制，所以其子细胞基本上仍然与祖代靶细胞共同定位。例如，细菌在营养琼脂平板上的体外生物学培养中，使单个分散的细菌沉积在平板上，并在适合细菌复制的条件下进行培育。某个位点中的细菌的复制便形成也可以进行复制的子细胞。所有细胞仍然与原始细胞共同定位(基本相邻)，最终在平板上形成可见集落。之前存在单个细胞的位置，当前出现的便是含有超过107个细胞的集落。
靶细胞的微集落意指彼此处于物理相邻位置，位于(或者固定于)一个表面上的一组靶细胞，是经由单个祖代靶细胞以原位体外复制为基础的扩增所产生的纯系后代。微集落通常过小而不能被肉眼观察到(如直径不超过50微米)。
任何类型的分裂靶细胞均可以在特定情况中形成微集落，该特定情况可以导致靶细胞的纯系后代在物理上共同定位。例如，微集落可以包含动物或植物细胞、真菌或细菌。
照明意指具有电磁辐射的照射。不同波长的电磁辐射均可用于照明。包括，例如波长在光谱的X射线、UV、可见光或红外线范围内的辐射。应当指出，照明辐射未必在可见光范围内。
具有光子发信号(photonic signaling)特征的信号元或发信号部分意指通过光子的发射、反射、散射、折射、吸收、捕获、或重定向或光子行为的任何其它调节或组合便可以检测到的信号元或发信号部分。具有光子发信号特征的信号元或发信号部分的若干实例包括：荧光团Texas Red(荧光发信号特征)；CDP-Star(化学发光发信号特征)；荧光素酶(生物发光发信号特征)；共振光散射颗粒(光散射发信号特征)；BM紫(光吸收或生色发信号特征)；和正转化换磷光体(两个长波长光子的吸收与一个较短波长光子的发射)。
‘数字’X‘溶液名称’意指含有成分为溶液名称，且浓度为溶液(除水以外)浓度的数字倍数的水溶液。例如10X EE含有10mMEDTA/100mM EPPS(EE，或1X EE，含有1mM EDTA/10mM EPPS)。
EE即1mM EDTA/10mM EPPS溶液。将二者混合之前，采用NaOH将两个组分的共轭酸调整为pH 8.0。
PB即pH7.4，0.1M磷酸钠缓冲液。
PBS即磷酸盐缓冲的盐水溶液，含有：120mM NaCl、2.7mM KCl和pH7.4的10mM磷酸盐缓冲液(钠盐)。
PBS-B即在PBS中含有0.1％BSA(IgG Free；Sigma Cat.No.A-7638)
PBS-T即在PBS中含有0.05％Triton X-100(Sigma Cat.No.X-100)
PBS-TB即PBS/0.1％BSA/0.05％Triton X-100
PBT即PBS/0.1％BSA(IgG Free；Sigma Cat.No.A-7638)/0.05％Tween-20(Sigma Cat.No.X-100)
LB即用于培养细菌的Luria Broth，如前所述制备(Ausubel 1987，同上)。
SSC即150mM NaCl/15mM柠檬酸三钠，经由HCl调整为pH7.0。
EDAC即(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基))碳化二亚胺
TSA即胰酶豆琼脂(Becton Dickinson/Difco；cat.num.236950)。
TSB即BactoTM胰酶豆肉汤(Becton Dickinson cat.num.211822)。
AP即碱性磷酸酶。
BSA即牛血清白蛋白。
CCD即电荷耦合装置。
Cfu即集落形成单位(与活细菌细胞数量对应的细菌浓度单位)。
FITC即荧光素异硫氰酸盐。
PNA即肽核酸。
如果没有另外指出，该说明书中所描述的微生物菌株均获自American Type Culture Collection(ATCC)，Manassas，VA。
附图简述
图1.传统微生物培养需要很多世代的细胞分裂。
传统微生物培养获得结果所需要的时间之所以长，是因为需要时间以生成肉眼可观察的足量微观靶细胞。
图2.通过检测微集落快速检测微生物生长的概念
本发明通过使微集落成像的方法，实现了对生长细胞的快速计数，其中该微集落所含细胞比利用传统方法肉眼检测的大集落所含的细胞少。本发明之所以快是由于所需要的世代比传统方法少。
图3.用于大范围成像的CCD成像装置
该图所描绘的以CCD为基础的成像仪被用于收集实例中所描述的大量数据(也见详述部分的第5步)。一个实例中，是通过将来自高强度白光源(1000 Watt Xenon are lamp，Model A-6000，PbotonTechnology Incorporated，Monmouth Junction，NJ)的光导入流体光导(5mm内径，Model 380，Photon Technology Incorporated，MonmouthJunction，NJ)，从而提供了激发光。该流体光导将光传送至一个激发滤光轮(BioPoint FW，Ludl Electronics，Hawthorne，NY)，并引导过滤光束(典型的直径为9mm)投射在含有标记靶细胞的检测表面上。该检测表面为微量滴定板孔的光学透明底部。不过，相同设备可以检测位于多种检测表面(如显微镜载玻片、盖玻片以及具有光学透明平底的管子)上的标记靶细胞。入射光穿透该检测表面，在发信号部分中引发荧光，其中该发信号部分是经由种类结合分子与靶细胞结合，并沉积于该光学透明表面上。一部分发射的荧光被一个高效收集透镜系统所收集，并经由一个发射滤光轮(BioPoint FW，Ludl Electronics)被透射到CCD照像机(Orca II，Hamamatsu，Bridgewater，NJ)。
图4.用于非放大性大范围成像的CCD成像系统
该图显示了具有角度照明配置的CCD成像仪，其中光是从收集光学元件的一侧以一个角度被导入并投射在检测表面(此处显示为微量滴定板的孔底部)上。该角度是经过选择的，可最优化收集效率，并且避免了收集透镜对入射光束的遮挡。该配置的优势是来自样本架底部表面的反射不会被收集透镜收集，因而不会出现荧光背景干扰。
图5.利用非放大性大范围成像对微集落的无试剂检测
该图说明了一种不采用标记试剂计数生长细菌的快速方法。微集落中靶细胞的固有自身荧光是通过利用基于CCD的非放大性大范围成像而得以检测的。该无试剂方法的优势包括其简易性、无破坏性以及广泛的适用性。可选地，与靶细胞特异结合位点结合的标记试剂(如荧光抗体或核酸探针)可以被用于检测含有靶细胞的微集落。
图6.利用非放大性大范围成像对细菌微集落的检测与鉴定(实施例1)
该图显示了一种通过利用基于CCD的非放大性大范围成像使标记的微集落成像，以检测微集落的一种快速、简易且灵敏的方法。该实施例中，为形成微集落，需使单细胞复制若干代。微集落是由SyberGreen I或FITC标记抗体标记的。图7中，上排照片显示的是0小时的单细胞。底排照片显示的是培育3小时后形成的微集落。由于位于集落形成细胞最初所附着位点上的细胞数量的增加，使通过CCD成像检测到的目标的尺寸及信号均随着时间有实质性的增加。
图7.利用非放大性大范围成像对细菌微集落基于自身荧光的检测(实施例2)
该图说明了一种通过利用基于CCD的非放大性大范围成像使细胞自身荧光信号成像，以检测微集落的一种快速、简易且灵敏的方法。单个分散细胞沉积在滤膜上，于37℃，生长培养基上培育5.25小时。与另外制备并同样成像的无细菌沉积的滤膜(右幅照片)相比，微集落(由单个分散细胞的纯系生长形成)产生了实质性的自身荧光信号(左幅照片)。
图8.一种利用与传统培养方法的内部比较验证快速无试剂微生物计数实验的简易方法(实施例3)
该图证明了一种简易方法，该方法显示微集落计数等效于传统方法。利用对微集落自身荧光的非破坏性检测，使得本发明所检测的微集落可以被再次培育，直至其发育成为可利用传统可见集落计数方法检测的大集落。应当指出，微集落所形成的斑点图样(左幅照片)与可见集落所形成的斑点图样(右幅照片)相符，便表明两种方法的等效性。
图9.利用非放大性大范围成像检测自身荧光微集落的检测准确度及限度(实施例4)
该图显示了当样本含极低水平靶细胞时，确定本发明准确度的方法。对101个滤器中的每一个而言，通过计数自身荧光微集落所获得的结果与通过传统方法所获得的结果相同。
图10.测定利用无试剂非放大性成像快速检测的自身荧光细菌微集落中的微生物细胞数量(实施例5)
该图显示的是利用大肠杆菌微集落的大范围成像，由大肠杆菌微集落所产生的信号(顶部照片)。底部照片中利用高倍数显微镜成像的三个微集落与上部照片中利用本发明成像的三个微集落相符。每幅图片下方标有每个微集落中的细菌数量(45、48和50个细胞)。该图证明利用无试剂非放大性大范围成像可以检测含少量大肠杆菌细胞的微集落。
图11.基于CCD、非放大性、大范围成像检测并鉴定一份环境水样本中的细菌微集落(实施例6)
该图显示通过利用本发明对来自查尔斯河水中的细菌集落的检测，对细菌生长的分析结果。细菌细胞被收集在混合纤维素酯滤器上。将该滤器置于R2A琼脂平板上，于32.5℃培育74小时。利用白光的反射系数和自身荧光性，在不同时间点使滤器成像。在反射图象中鉴定并计数直径大于或等于0.55mm的大集落。也可以确定自身荧光微集落形成可检测大集落的时间点。在不同时间点，标绘出74小时中可检测的大集落与自身荧光微集落的百分数。
图12.基于CCD、非放大性、大范围成像检测细菌微集落的方法与计数样本中细菌的传统倒平板培养方法之间的相关性(实施例7)
该图比较了利用本发明和传统倒平板微生物培养方法计数自身荧光微集落所获得的结果。
图13.无试剂计数实验的动态范围及线性(实施例8)
该图显示了通过利用本发明检测自身荧光微集落，对动态范围和线性的分析结果。
图14.无需稀释样本进行的抗菌防腐效果检验(实施例9)
该图显示了分别利用本发明和传统方法所获得的可比较的抗菌防腐效果。该比较显示本发明可以通过避免对数百个样本稀释物的分析需要，从而节省该实验大部分人力与花费。
图15.利用非放大性大范围成像对热应力(heat-stressed)生物制品基于自身荧光的检测(实施例10)
该图显示了在分别利用本发明和传统倾倒平板方法对热应力生物指示细胞进行的计数之间的相关性。将该生物指示剂脂肪嗜热杆菌应用在多种热应力情况中。利用CCD基础大范围成像测定微集落自身荧光性，可见大集落则通过直观计数。彼此相对地标绘出两种方法的结果，显示出好的相关性。不过与传统方法相比，本发明所需要的稀释物基本上较少。
图16.对绞细牛肉中存在的细菌微集落基于自身荧光的检测(实施例11)
该图分别显示了来源自绞细牛肉中存在的微生物的自身荧光微集落与大集落的检测时间。随时间跟踪微集落的出现，该微集落于48小时所形成大集落的100％可以通过本发明于16小时便检测到。这表明，与传统方法相比，本发明可以显著缩短获得结果所需要的时间。
图17.磁选择，继而进行微集落检测(实施例12)
该流程图显示了对靶细胞的磁选择，继而使其原位生长，并利用本发明对微集落自身荧光性进行的检测。
图18.采用非特异磁选择，继而利用非放大性大范围成像检测微集落的方法对复杂样本中的细菌进行的检测(实施例12)
该图显示了从全血中磁捕获金黄色葡萄球菌的试验结果。利用包被有可结合细菌的广泛反应试剂混合物的磁性颗粒从血液样本中选择出该细菌。过滤、平板接种并培育(6小时)后，利用非放大性大范围成像检测自身荧光微集落。培育该滤膜过夜。之后，再次使该滤膜成像(未显示图象)，并核实6小时微集落的位置已形成大集落，排除微集落被误认为是尘埃或其它微粒的可能性。
图19.快速抗菌敏感度检验流程图(实施例13)
该图说明了一种通过利用基于CCD非放大性大范围成像检测微集落的出现，从而检验细菌菌株对抗生素的敏感度的快速方法。对所示细菌菌株而言，当该细菌在抗生素存在(右列)条件下生长时，不能形成微集落，便说明其对该抗生素敏感。未经过生长条件下的培育的细菌也不能生长(左列)。如预期当在抗生素存在的生长条件下培育该菌株时，检测到其生长(中列)。
图20.快速抗菌敏感度检验(实施例13)
该图显示了抗菌敏感度检验结果，该检验比较了在含有抗生素的琼脂平板上微集落形态的两种细菌菌株(一种对抗生素四环素具有敏感性，另一种则对其具有抗性)的生长情况。将每种菌株来源的细菌细胞过滤至聚碳酸酯膜上，置于含四环素的LB琼脂平板中，并于37□培育三小时(标为“3小时”的图片栏)。将同样方法制备的另一个滤膜置于含四环素的LB琼脂平板中，于室温下培育时间不超过5分钟(标为“0小时”的图片栏)。固定这些滤膜并利用核酸染色剂对其染色。对含有已培育三小时的细菌的膜进行CCD成像(标为“3小时CCD”的图片栏)，在含有抗性菌株的膜上检测到微集落生长，而含有敏感性菌株的膜上则未检测到微集落的生长。通过高倍数荧光显微镜证实在含有抗性菌株的滤膜上存在微集落的生长，而含有敏感菌株的滤膜上则不存在微集落的生长(标为“3小时显微镜”的图片栏)。如预期，未于生长条件下培育的滤膜的CCD图象中未检测到微集落的存在(标为“0小时CCD”的图片栏)，通过高倍数荧光显微镜也仅检测到几个单独分散的细胞。利用计算机图象分析以量化膜的CCD成像结果(柱状图表)。含有由抗性菌株形成的微集落的膜所产生的强度约比含有敏感菌株的膜所产生的强度高25倍。该实验结果显示利用非放大性大范围成像检测微集落是一种检验抗菌敏感度的快速且灵敏的方法。
图21.利用圆片扩散(disk diffusion)法和非放大性大范围成像的快速抗菌敏感度检验(实施例14)
该图显示了抗菌敏感度圆片扩散实验的结果，该实验比较了两种细菌菌株(一种为敏感菌株，另一种为抗性菌株)的生长情况。在扩散圆片上或邻近位置的自身荧光微集落生长5小时后便可以被检测到，与标准过夜生长所需时间相比，该方法大大缩短了检测时间。左图显示的是四环素抗性菌株的生长接近扩散圆片，而同时右图显示的是缺乏四环素敏感菌株的生长。培育该圆片扩散平板过夜。比较24小时的抑制环带与5小时的环带。24小时的抑制环带与5小时的微集落结果相同，这表明与传统方法相比，本发明可以更快地获得可比较的结果。
图22.利用E-testTM和非放大性大范围成像的快速抗菌敏感度检验(实施例15)
该图显示了抗菌敏感度实验的结果，该实验利用含有抗生素四环素的EtestTM条带，比较了两种细菌菌株(一种为敏感菌株，另一种为抗性菌株)的生长情况。将细菌细胞涂布于TSA平板上。将E-testTM条带直接加入平板中，并于37℃培育。生长在E-testTM条带上或邻近位置的自身荧光微集落生长5小时后便可以被检测到。左图显示的是第5小时生长于条带256μg/ml处的抗性菌株。右图显示的是第5小时在邻近条带2μg/ml处具有一个抑制区的敏感菌株。24小时的抑制区与5小时区域是可比较的，这表明采用本发明所获更为快速的结果与较慢的传统方法所获结果是可比较的。
发明详述
发明综述
本发明快速并经济地分析经过最低程度处理的生长细胞的样本。本发明与传统细菌培养方法均通过检测细菌“集落”的形成测定了细胞生长情况(图1)，其中“集落”即单个细胞经过连续细胞分裂所形成的成簇相连细胞。不过，本发明对细胞生长情况的检测速度远快于传统微生物培养，因为其检测的微集落所出现的阶段早于传统微生物培养目测的大集落所出现的阶段(图2，图8)。通过利用与微生物培养相同的方法原理，本发明可以在保留传统方法的优势同时仍然能够显著缩短获得结果所需的时间。
对特定实施方案及应用的检验有助于理解本发明是如何检测微集落的。例如，假设将一个可以计数水中微生物的实验应用在可注射药物的生产中。通过使液体经过一个多孔膜，从而浓缩并固定水样(100ml)中的微生物。将含有微生物的膜置于一次性培养皿中的营养生长培养基上。于32℃培育微生物，使其复制并形成微集落。使光投射在膜表面，促使微集落中的细胞自发荧光。该自身荧光信号来源自细胞中存在的生物分子(如NADH和氧化的黄素蛋白)。继而电子成像该自身荧光微集落。来源自个体微集落的光照射到位于CCD阵列光电检测器上的一个像素或一小簇相邻像素。通过图象处理软件立即计算自发荧光微集落的数量，并报告使用者。应当指出，除了本发明检测结果较快且自动化以外，该方法与传统微生物培养一致。
由于本发明的实施方案是非破坏性的(即未杀伤或损害微生物)，因此所检测的微集落可以生长为纯培养物。这些纯培养物可以被用于鉴定微生物，并且对临床样本而言，可用于确定抗菌抗性和敏感度。非破坏性检测也简化了对该方法与传统微生物计数方法等效性的验证。采用本发明检测微集落之后，可以简单地再培育培养皿，以使微集落继续生长一段时间，该时间段是形成传统微生物培养检测方法可目测到的大集落所需要的时间。对本发明检测的微集落与微集落进一步生长所形成可见集落的数量和位点的比较，有利于确定本发明与传统方法的等效性。
本发明也可被用于构建采用多种形式、标记方法、种类结合分子及检测方法的实验。不过这些实验所具有的若干关键特征是共有的。为本发明诸多实施方案所共有的步骤及方法在下文有所描述。
本发明应用的一般形式包括如下步骤：
步骤1：阐明实验问题，选择样本、待检测细胞种类、生长条件及发信号特征
步骤2：使细胞目标物(target)沉积在检测范围内
步骤3：使细胞复制以形成微集落
步骤4：任选地标记微集落
步骤5：计数微集落
在基于本发明构建新应用的过程中，阐明有待该实验解决的问题是第一步。表3列出了工业及临床微生物学家必提的重要问题的若干实例。实验问题的阐明通常定义了必检验的样本类型(如绞细牛肉、临床尿样或药物成品)。选择使靶细胞沉积在检测范围内方法的过程中，样本类型和体积是重要的参数(见步骤2)。实验问题的阐明也定义了应用中必检测的细胞类型或种类(如需氧细菌、酵母或霉菌、假单胞菌、大肠杆菌O157:H7或无名脊髓液分离物)。
  基于本发明的实验所解答问题的实例●尿样中的细菌数量能够指示尿路感染吗？●患者血样含有活的传染性微生物吗？●哪一种抗生素最适于治疗患有细菌性脑膜炎的特定病人？●在25g肉中存在多少需氧细菌？●绞细牛肉样本中含有许多食品来源的病原体大肠杆菌017:H7的细胞吗？●环境空气样本中存在多少酵母和霉菌细胞？●10g不需处方即可合法出售(OTC)的药片中存在多少假单胞菌细胞？●可注射药品的某批成品是无菌的吗？●在啤酒的产品样本中存在多少酵母细胞？
表3
定义了待检测或计数的细胞类型之后，选择条件以促进细胞在检测范围内的生长。可使细胞复制进行的重要参数包括：生长培养基的成分、选择性试剂如抗生素的存在、温度、氧气及其它气体水平。如果可能，选择可以促进待检测细胞的生长，而对其它类型细胞无作用的生长条件。例如，用于检测酵母和霉菌的培养基通常含有可以抑制其它更快速生长的细菌微生物生长情况的成份。
由待检测细胞产生可检测信号的方法也必须选定。信号的选定取决于待检测微集落中的细胞类型、可能形成微集落的其它细胞类型，以及预期存在于样本中的背景类型。假设一个测定药物生产成品中需氧细菌总量的实验；例如用于隐形眼镜的洗涤溶液。由于该样本中可能存在广谱的数千个环境微生物，因此信号产生方法必须非常全面。某些这种方法依赖于微集落的固有光学特性，如微集落自身荧光性、反射率或红外线吸收。该方法实现了无需利用试剂的快速微集落检测，即本发明的一个重要优势。利用例如微集落自身荧光性产生无试剂信号的方法基本上简化了实验方法，实现了无菌样本处理，并使得采用“金标准”方法所用的相同培养基和一次性实验用品所进行的快速实验成为可能。可选地，可以采用染色剂标记由靶细胞形成的微集落。
采用染色剂和特异探针计数特定种类的靶细胞
在探询一系列诊断学问题的应用中，可以采用可与靶细胞分子组成结合的染色剂或探针。可被用于检测宽范围靶细胞(如所有需氧细菌)的染色剂实例包括核酸染色剂(如碘化丙啶或Syber Green(Molecular Probes))，和针对酶活的染色剂(如荧光酯酶染色剂)。为标记较窄范围种类的靶细胞，可以采用与目标特异分子组成结合的标记探针。例如，可以采用与仅存在于食品病原体大肠杆菌O157:H7表面上的分子特异结合的荧光标记抗体，以检测食品样本中的致病微集落。
因此，为检测一种靶细胞的存在，本发明可以采用与种类特异分子组成特异结合的分子。存在于靶细胞上的种类特异分子组成被称为种类特异结合位点，与其特异结合的分子被称为种类结合分子。为检测种类结合分子的结合情况，通常是使可检测标记，或发信号部分附着于该种类结合分子。应当指出，种类特异结合位点是可能存在于待检验样本中的靶细胞的一个特性。与之相比，种类结合分子是在一种诊断试验试剂盒所提供的一种试剂。
本发明的一个优势是可以采用广谱的种类结合分子。该特征是重要的，因为采用了不同类型的种类结合分子以探询不同类型的诊断学问题(如广泛界水平的筛选对狭窄亚种水平的鉴定)。种类结合分子(也往往被称为探针)的分类包括：核酸(寡核苷酸、适体、克隆序列、基因组DNA、RNA等)；与核酸相关的化学变体，如肽核酸(PNA)；抗体；酶(可结合目标底物)；非酶蛋白质，如抗生物素蛋白(结合目标分子生物素)；与细胞组分特异结合的分子(如与肌动蛋白结合的毒伞素，或者与抗生物素蛋白结合的生物素)；染料和染色剂(如亚丙基、金胺-若丹明、或SYTO17)；配体(如与表皮生长因子受体特异结合的表皮生长因子)；以及利用体外发育技术(如Zhang等，Nat.Biotech.18：71-74，2000)选择的多肽或核酸结合试剂。
种类结合分子可以整合其它功能区或修饰。例如，种类结合分子通常共价地或非共价地与发信号部分(即一个标记区，如荧光团或一个着色微粒)或选择部分(如磁性颗粒或固体表面)相连。可选地，种类结合分子可以被连接到适配物部分，反过来该连接有利于其它功能部分的连接。有时该种类结合分子具有双重不可分的功能。例如，可以采用碘化丙啶核酸染色剂作为种类结合分子(如可能是酵母中的细胞核酸的种类特异结合位点)，而同时，采用结合的染料作为发信号部分(即其可以在与种类特异结合位点结合时发出荧光)。基于本发明的实验可以整合多于一类的种类结合分子(如抗体和核酸染色剂，或者抗体和寡核苷酸)。
最简单的实验采用了单一类型的种类结合分子，以观测单一种类的靶细胞。例如，针对结核分枝杆菌的实验可以采用与位于结核分枝杆菌表面的种类特异结合位点特异结合的单克隆抗体。另一个实例中，当筛选尿路感染时，单一种类为“所有细胞”-或者，如果人类细胞被裂解，则为“所有非人类细胞”-和单一类型的种类结合分子可以是核酸染色剂(如碘化丙啶)。
种类结合分子家族是与相同种类靶细胞成员结合的一组独特的种类结合分子。例如，针对丙型肝炎病毒引发的多克隆抗体便是一个抗体家族，因为就HCV而言，该多克隆抗体包含了可与相同种类靶细胞特异结合的多个种类结合分子。种类结合分子家族的另一个实例是一组存在于所有大肠杆菌O157:H7菌株中，而未出现在其它细菌群体成员中的80个种类特异基因组DNA序列。该种类结合分子家族可以作为一个群体与经过适当处理的大肠杆菌O157:H7细胞杂交，而不与其它类型细胞杂交。
为检测多个种类的靶细胞，一个实验应该包括若干种类结合分子家族，并且一个种类结合分子家族对应一个种类的靶细胞。一组种类结合分子家族被称为一个种类结合分子集合。例如，针对肺炎或者滥用药物的实验必须将诸多种类的靶细胞彼此区分开来。对应每个种类的靶细胞，采用一个种类结合分子家族。就肺炎检验而言，可以采用与位于可引起肺炎的微生物表面上的种类特异抗原反应的抗体集合。该种类结合分子集合中的一个家族可能包含了来源自兔宿主体内所引发抗血清的免疫球蛋白部分的多克隆抗体，以及直接由肺炎链球菌引发的多克隆抗体。另一个家族可能包含重组抗体或由腺病毒外壳蛋白直接引发的单克隆抗体。
通过一个集合，即种类复杂度所检验的独特群体或种类靶细胞数量是由该集合中的种类结合分子家族数量反映的。反过来，一个集合中的家族数量可以通过一个被称为集合的“最少种类来源”的数量而得以准确定义。家族复杂度是必须与来自该实验集合中每个种类结合分子家族的成员结合的特定靶细胞的最小数量。例如，假设一个种类特异抗体集合，用于同时检验唾液样本，以确定结核分枝杆菌、军团菌属某些种和厌酷球孢子菌的存在。该集合的家族复杂度为3，因为分别来源自每个病原体种类，且必须与该集合中每个种类结合分子家族的成员结合的靶细胞个数的最小值为3。本发明在单次实验中鉴定广谱靶细胞种类的能力，与其利用具有大的家族复杂度的种类结合分子集合检测样本的能力存在因果关系。
结合本发明应用的种类结合分子在某一方面应具有特异性，即其应在实验条件下与指定靶细胞结合，而不与该实验应区分的其它类型靶细胞，或该检验样本中的其它可能组成结合。因此，在针对上呼吸道疾病细菌感染的检验中，应对种类结合分子进行筛选，以排除与上呼吸道的普通(共生)微生物组成交叉反应的潜在的种类结合分子
下述实例包括了用于获得并表征种类结合分子的代表性方法。
本发明之所以能够分析样本以检测多种全异种类的靶细胞，是因为其可以区分来源于不同种类靶细胞的信号。本发明通过采用发信号部分标记每个种类特异家族的种类结合分子，以使其具有独特的信号标记，从而区分了诸多种类。产生并检测大量独特信号标记(即高信号复杂度)的能力实现了对可以分析诸多种类靶细胞的实验(即高度多元实验)的构建。
本发明可以利用多种类型的信号特征，包括：荧光、散射光、光偏振、化学发光和放射性。发信号部分与利用多种信号特征的检测流程的实例如下文所述。在一个信号特征内可以有多个信号分类。例如，如果该信号特征为荧光，则该信号分类包括了多种特征发射光谱(如红色荧光、绿色荧光和蓝色荧光)。其它实例中，假设红色荧光微粒是经由不同浓度的相同荧光团而着色的。该情况中，荧光即信号特征，但不同强度的颗粒构成了多个种类的信号特征，即荧光强度是可以将一个颗粒群体与其它颗粒群体区分开来的信号特征的特性。
下述实例说明了可结合本发明应用的多种发信号部分。发信号部分可以包括单纯的荧光团、正调节磷光体、天然荧光蛋白质(如绿色荧光蛋白及其相关物)、染料、酶：底物体系(产生变色或化学发光)、荧光微粒、光散射颗粒、磁性颗粒或无线电发射微装置。
对发展某些可检测多种类型靶细胞的试验(即具有高的种类复杂度的实验)而言，获得高的信号复杂度是关键的。
获得高信号复杂度
混合物中的可区分标记(或发信号部分)的数量被称为信号复杂度。就高度多元试验而言，采用具有高信号复杂度的发信号部分有时候是有利的。可连同本发明应用以获得高信号复杂度的的三种普遍方法为：(1)独特标记，(2)组合标记，以及(3)比例标记。
1.就独特标记而言，使不同探针家族的探针与单个发信号部分相连，其中该单个发信号部分可以在该实验所有其它发信号部分存在的条件下被轻易地检测到。迄今，实现高信号复杂度的独特标记仍然是困难的。该难点的存在是由于大部分标记方法采用了光学信号(如生色、荧光、化学发光)或放射性标记，并且由于光学信号的光谱带宽，以及通过现有设备可检测信号的有限范围，均使得利用光学信号可分辨的信号复杂度相当少。例如，目前，分辨具有独特发射光谱的许多荧光团是不可能的，因为其所具有的光谱是重叠的。
2.本发明所采用获得高信号复杂度的另一条途径是应用组合标记方法。组合标记是一种利用相对少量的独特发信号部分实现高信号复杂度的技术。采用该方法，是使独特组合的发信号部分与不同目标结合。目前，就分子诊断学而言，荧光团是采用较多的一类信号部分。不过，考虑到在对多重独特荧光团的分析中所涉及的复杂因素(存在于激发光谱与发射光谱重叠的大部分光谱中)，目前可行的只是组合大约七种或更少的常规荧光团。不过，组合中采用的七种荧光团可以被用于产生127种独特信号(N个荧光团产生2N-1种组合)。通过利用其它类型的发信号部分进行组合标记也可以实现高的信号复杂度。例如，该方法可以利用含有不同染料的颗粒、属于不同不连续尺寸等级的颗粒，或发射独特无线电信号的发射应答器。目前，采用荧光团的组合标记已被成功地应用于人类染色体核型分析(Speicher等，1996，同上；
Figure C0282209700451
等，1996，同上)。用于分析组合标记实验的设备及软件是可商业提供的。
3.采用比例标记方法也可以获得高信号复杂度(Fulton等，1997，同上)。同组合标记一样，比例标记也是采用相对少量的独特发信号元产生多种独特类型的发信号部分。不过，与组合标记相比，比例标记中的发信号部分是通过发信号元的比例得以区分的。例如，可以采用两种具有不同激发/发射特征的荧光团，X和Y以使聚苯乙烯颗粒着色。应用不同相对浓度的荧光团([X]、[Y])区分几组颗粒。例如，可以采用8个不同浓度的X和8个不同浓度的Y使所有组合(X1Y1、X1Y2、X8Y7、X8Y8)中的颗粒着色，便产生64种可区分颗粒。比例标记简化了使用仪器，因为其仅需利用少量的信号类型。采用比例标记方法，也可以利用除了荧光团以外，而包括非光学信号元在内的信号元以产生高信号复杂度。
产生强信号以利于检测微集落
当然，所需的信号强度水平取决于信号特征的类型，以及检测方法/使用仪器(见下文)。
可以采用标记种类结合分子的多种方法实现必需的灵敏度。一种最优化信号强度的方法是采用高荧光性的发信号部分标记目标分子。例如，量子点、荧光染色纳米球和聚合荧光团分子均可以产生强荧光信号。将大量信号元合并可以提高发信号部分的荧光强度。例如，荧光纳米球(～20nm直径；Molecular Probes)可以产生相当于大约180个荧光素分子的信号。荧光染色聚苯乙烯微粒(如1μm直径)可以整合数百万个荧光团发信号元。将多个荧光团整合进与核酸种类结合分子相联的信号部分的方法是，在克隆的种类特异序列的PCR扩增期间，整合进荧光团-dNTP结合物。将多个荧光团整合进核酸种类结合分子的可选方法包括采用：树状聚合物、分支DNA、或者与多个信号部分结合的滚环模板、或者连有大量聚合荧光团标记的核苷酸的方法。使种类结合分子与多个发信号部分结合也可以增强信号强度。例如，通过使大量发信号酶(如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)与纳米颗粒结合，也可以实现信号扩增。
获得强信号的另一种方法是使每个细胞结合大量标记的种类结合分子。该结合可以通过多种方式实现，包括：采用多个种类结合分子(在相同靶细胞中识别多个种类特异结合位点)或通过选择与靶细胞中高度表达的靶分子结合的种类结合分子。例如，通过使大量独特抗原决定部位结合在微生物靶细胞上，标记的微生物特异多克隆抗体可以获得高信号强度。以前，频繁采用的是选择大量存在于每个靶细胞中的种类特异结合位点的方法。该方法的实例包括采用用于核糖体RNA的核酸探针(根据目标生物体和细胞类型，可以存在于每个细胞上千个拷贝中)。同样，某些抗原靶分子存在于目标生物体每个细胞的数百或数千个拷贝中。本发明可以利用这两种方法。另一个实例是，当采用核酸结合荧光染料Syber Green I作为种类结合分子/发信号部分时，大量存在于细菌中的种类特异结合位点便可以产生高的信号强度。
使大量信号部分与靶细胞结合不仅可以提高信号强度，还使本发明具有可靠性，因为在靶细胞不存在的情况下下，观测到具有预期复合信号标记的许多簇大量发信号部分的机会是很少的。
使发信号部分与种类结合分子结合
本发明可以采用本领域技术人员已知的多种方法(见例如Hermanson，G.，Bioconjugate Techniques(Academic Press，1996)以及下述特定实例)将可直接与种类结合分子结合的多种类型发信号部分整合。例如，抗体或寡核苷酸种类结合分子可直接与荧光团或量子点发信号部分结合。可选地，可以采用抗体或寡核苷酸种类结合分子包被荧光微粒基底，或光散射纳米颗粒基底的发信号部分。发信号部分可以间接地与种类结合分子结合。例如，抗生物素蛋白可直接与多个信号元结合，构成一个发信号部分。继而该标记的抗生物素分子可与生物素化的种类特异抗体结合。在该结合步骤之前、期间或之后，发信号部分均可以被结合到该种类结合分子上。例如，本发明的一种实施方案中，可采用异羟基洋地黄毒甙元标记的核酸探针作为种类结合分子。种类结合分子与样本靶细胞中的种类特异结合位点结合之后，将未结合的探针洗涤除去。继而使抗异羟基洋地黄毒甙元抗体：碱性磷酸酶结合物(发信号部分)与已结合的异羟基洋地黄毒甙元标记的探针结合。继而将碱性磷酸酶底物(如化学发光底物CDP-Star；NEN)添加到已结合的碱性磷酸酶中以产生信号。
步骤2：使细胞目标物沉积在检测范围内
在基于本发明的应用中，第二步通常是使样本中的靶细胞沉积在检测范围内。通常采用基本上平的检测区，因为在某种程度上，光学成像系统可以有效地收集来自薄检测区的光(即具有小深度视野的光学系统)，例如当微集落生长在营养琼脂表面，或者生长在覆于营养琼脂平板表面的膜上时。这些情况中，与检测区的侧向尺寸相比，检测区的深度可以被忽略不计。该步骤也可被用于选择性地沉积某种靶细胞，除去可能抑制细胞生长的物质，或者使靶细胞与标记试剂接触。
利用膜过滤使细胞沉积在基本上平的膜检测表面具有若干优势。利用膜过滤的一个重要优势是其可以从大样本体积收集少量靶细胞的能力。例如，1升水中的单个细菌细胞可以迅速且有效地沉积在标准过滤膜的表面上。水可以自由通过膜，而细胞则因为膜孔尺寸不能通过。将水样倒入一种底部已形成膜的容器内，继而使膜底部表面真空。水流经膜的同时，细胞仍停留在膜表面上。采用液体任选地洗涤该膜，以有效地除去诸如生长抑制物的物质，或者使细胞暴露于标记试剂。继而可以将该膜置于生长培养基上。
使靶细胞沉积于表面的其它方法包括离心、重力沉降、磁选择或者与表面已结合的种类结合分子结合(如捕获抗体)。某些情况(如磁分离)中，采用的是独特部分，即选择部分。包被有种类特异抗体的磁性微粒是该选择部分的一个实例。靶细胞与抗体包被的磁性颗粒结合之后，利用磁场使磁标记细胞沉积在检测表面上。同样，可以采用包被有目标特异抗体的致密微粒作为选择部分。该情况中，是通过重力对该致密颗粒的作用使标记细胞沉积在检测表面上。
步骤3：使细胞复制以形成微集落
该步骤中，通过在检测区适当位置上进行分裂，靶细胞形成了微集落。微集落的生长是通过将细胞暴露于含营养物的生长培养基，并在可以促进细胞生长和分裂的条件下进行培养而得以实现的(上文步骤1中选定了这些参数)。一种典型实施方案中，细胞沉积在多孔膜滤器上。将该滤膜置于培养皿内凝固的营养琼脂生长培养基表面上，继而盖上培养皿，并将其放在处于适当温度的培养箱中。目前，该方法被广泛地用于支持利用传统微生物培养方法进行的集落生长，因为营养物质可以通过膜自由扩散，而不会使祖细胞来源的子细胞移动。可选地，微集落可以直接生长在营养琼脂培养基或等效物的表面上。
也可以在微集落生长步骤中对靶细胞特异生长进行选择。例如，可能将一个实验设计用于检测样本中的厌氧细菌(例如，对可注射药物成品的检验而言，这种实验通常是必需的)。该情况中，生长步骤可以在钟形罐内的厌氧环境下进行。该步骤中也可采用选择性生长培养基以实现选择性微生物生长。为检测细菌对抗生素的抗性，例如，通常在不同浓度的多种抗生素存在条件下培育细胞。如果在某一浓度的抗生素存在和缺乏条件下，细菌菌株的生长是可比较的，便可推断该细菌菌株对这一浓度抗生素的抗性。
本发明可以检测多种集落形态。多种类型的生长细胞在相同底物(营养琼脂培养基和膜)上形成单个分散的丘状集落。其它类型的细胞则形成不规则形状集落或丝状集落。此外，集落形态依赖于生长条件(如营养、温度和底物)。某些类型细胞是游离的，根本不能形成分散集落。如果检测这种生物的生长是重要的，可以在培养基中添加运动抑制物。因此，应选定生长条件，并进行对照实验以确保靶细胞形成可检测的微集落。如果需要，可以改变生长条件，或者可以在平行实验中应用多种条件。
步骤4：微集落的任选标记
该任选步骤是在有利于特异结合的条件下使种类结合分子及相联的发信号部分(也称为探针、标记或染色剂)与靶细胞接触。例如，该步骤中使一个种类特异核酸序列集合杂交到样本中的互补目标序列。同样，使样本中的种类特异抗原与相应的种类特异抗体结合。
就结合步骤，以及可于实验过程中的多个时间点进行的结合而言，存在若干可能的物理配置方法。例如，在使靶细胞沉积在检测区之前，可以在液体样本中标记靶细胞。继而在沉积步骤期间或者通过洗涤，可以有效地除去未结合的探针。该方法的一个缺点是信号通常不随着微生物生长而增加。较强的信号通常是通过在微生物生长期间或之后标记微集落而获得的。可以在营养培养基中添加标记试剂，以使微生物可以在生长期间连续地暴露于该试剂。可选地，可以在生长之后使微集落暴露于探针。例如，通常可以通过干燥、加热和/或暴露于化学试剂(如NaOH或氯仿蒸气)，固定膜上的微集落，并且暴露相应的种类特异结合位点。继而可以通过采用标记试剂覆盖微集落，或者通过将膜置于含有该标记试剂的垫上，从而实现标记。通常，需采用洗涤步骤以除去未结合的试剂。为实现快速结合动力学，需要最优化种类结合分子的浓度。针对特异结合所选择的选定条件取决于种类结合分子的特征，以及其与目标分子的相互作用。下述实例描述了特定条件和操作。
步骤5：计数微集落
检验基于本发明的应用的最后一步是计数样本中的靶细胞。该计数步骤本身包括成像、图象分析和产生报告的步骤。
本发明可以无需放大地检测微观集落。低放大倍数成像有利于大范围成像，反过来也有利于观测大样本。本发明的某些实施方案在某种程度上是通过利用高效光学元件，引导微集落发射的光子投射进光电检测器阵列的少量像素中，从而无需放大地检测微观集落。
采用的成像方法取决于步骤1所选定的信号产生类型。例如，根据光学特性或者用于产生信号的发信号特征，成像方法是不同的。对某些信号特征(如反射率、荧光性、光散射、吸光度)而言，必须通过光源照亮检测区中的复合物。就其它信号特征(如化学发光、热辐射)而言，则无需照明。可以利用多种检测器，包括电子光电检测器、底片及直接目测。
个体微集落的检测本身是定量且超灵敏的。通过在照相或数码图象中计数个体细胞，或者利用自动图象分析数字化图象，可以人工实现定量化。累计整个样本的信号强度也可以量化靶细胞。对含有高浓度靶细胞的样本而言，信号集成尤其有用。这些情况中，分辨重合信号往往是不可能的。
对标记探针家族信号的解码实现了对诸多种类靶细胞的鉴定。该步骤的一个重要目标是通过确定附着样本的标记种类结合分子的信号，从而鉴定样本中靶细胞的种类。
当以荧光为信号特征时，大范围成像所采用的可用装置是图3所示以CCD照像机为基础的成像仪。该装置被用于收集下述若干实例中的数据。通过将来自高强度白光源(1000W氙弧灯，Model A-6000，Photon Technology Incorporated，Monmouth Junction，NJ)的光导入液体光导(5mm内径，Model 380，Photon Technology Incorporated，Monmouth Junction，NJ)，便可提供激发光。该液体光导将光传导进激发滤光轮(BioPoint FW，Ludl Electronics，Hawthorne，NY)，并引导过滤的光束(如9mm或更大直径)投射在含有微集落的检测表面上。该设备可以检测位于多种配置条件中的微集落(如在营养琼脂、显微镜载玻片、盖玻片、或具有光学透明平底的管或孔的表面上；或者固定在营养琼脂或其它物质中)。入射光投射在检测表面，引发靶细胞中的荧光。通过高效收集透镜系统收集一部分发射的荧光，并经过发射滤光轮(BioPoint FW，Ludl Electronics)将其引导至CCD照像机(Orca II，Hamamatsu，Bridgewater，NJ)。该光学联动装置的设计及构造是基于本领域技术人员已知的原理和实践经验。
本发明也可以整合其它类型的光电检测器和其它配置。可以通过选择更为灵敏的照像机(如被冷却至低温的照像机，或者采用薄型背照式芯片的照像机)提高成像系统的灵敏度。可选地，可以通过利用行扫描系统(如BT Image Array；Hamamatsu)提高检测灵敏度和分辨率。对行扫描而言，采用了线性CCD或光电二极管阵列(如1×500或1×1000个像素)以捕捉图象。一维中的分辨率对应的是阵列元素数量，而二维图象的捕捉通常是通过垂直移动线性阵列下的样本载玻片而实现的。由于元件较少，类似灵敏度的线性阵列典型地没有区域形式的CCD照像机昂贵。
图3图解的设备通过利用X-Y定位镜台(BioPoint XY，LudlElectronics)，在激发和收集光学元件上移动样本容器(如微量滴定板)，方便了对多个样本的信号检测。Image-Pro和Image-Pro add-ins控制了所有设备组成及图象获得。滤光轮由ScopePro add-in(MediaCybernetics，Baltimore MD)控制，StagePro add-in(Media Cybernetics，Baltimore MD)操纵了镜台定位，而照像机控制是通过Hamamatsu OrcaII driver(Hamamatsu，Bridgewater，NJ)。也采用了Image-Pro Pluse加工图象并如下述进行分析。
本发明采用白光照明的实施方案利用了滤谱器以提供针对每个荧光团的最佳激发峰。白光的光谱宽，使得可以选择多种荧光团以消除发射光谱重叠现象。采用白光照明器可获得的典型斑点尺寸，如2mm～5mm，对大范围成像而言均是合适的。由于滤波改变相对简单，可以自动化，并且白光系统非常适用，因此可以采用相同设备检验采用特定组荧光团的情况。
图3所示系统的收集效率的最大化是通过采用一个定制设计的由两个部分：收集物镜和调焦元件组成的收集光学装置而得以实现。该收集物镜具有高的收集效率(≥f#/1.2)并且可以输出相对准直射的光束。调焦透镜捕捉由该收集物镜输出的光，并将其聚焦在CCD的检测表面上。该光学装置被设计为两部分，以便在收集透镜的光程内插入一个滤光轮。就本发明某些实施方案而言，例如某些无需滤波变化的实施方案，包括一个锥形光导纤维束以获得高收集效率可能是理想的。光导纤维束所包含的光纤可以收集最接近样本的光，并将光直接引导至CCD芯片。可选地，本发明可以利用直接接近检测法非常灵敏地检测信号，其中样本被直接叠置在CCD芯片或邻近位置上(以实现对薄型背照式CCD芯片的最高灵敏度)。
除了上述的白光、多重光谱系统以外，我们也发展了简易的单色荧光成像系统用于非放大性大范围成像。图4所示系统中，激发光是由532nm双频二极管激光器(50mW，Model#BWT-50E，B&W Tek，Newark，DE)提供的。由于该检测采用单色，因此滤光轮并非必需。单个激发滤光器(Model HQ532/10x，Chroma Technology，Brattleboro，VT)除去来自激光输出的谐波，单个发射滤光器(Model HQ620/60m，Chroma Technology，Brattleboro，VT)则使只有特定荧光信号才可以通过并到达CCD照像机。该系统也采用了没有前述CCD照像机昂贵的一种CCD照像机(Model KX-2E，Apogee CCD，Auburn，CA)以捕捉图象。通过合并多重激光发射器和滤光器装置，可以容易地使该设备适于进行多色分析。
本发明所合并的CCD照像机通常被冷却至-5℃～-50℃，该温度对10秒到大约2分钟(取决于照像机灵敏度)的集成时间而言已经足够，并具有最小的内成像杂波。通过持续收集荧光团所发射的光子一个较长的时间段，使得集成时间越长，通常所获的灵敏度越高。长的集成时间对行扫描而言是不合适的；不过，可以利用具有非常高量子效率的薄型背照式线性阵列，以提高灵敏度。
本发明也可以采用基于干涉仪的光谱成像，以检测并解码信号(Schrock，E.，1997，同上)。利用该技术，由发信号部分发射或散射的光被分为两路，通过棱镜(以使不同波长传播不同距离)，并使其重组以创建一个干扰图形。经过对该干扰图形的傅里叶分析，便产生一个对应该图象中每一点的光谱。
可选地，可以采用照相底片经济地记录样本中的靶细胞图象。当发信号特征为化学发光时，该方法最容易实施。可以在商用扫描仪中使底片上收集的图象数字化，以存储数据和分析数字图象。
对本发明产生数字图象的实施方案而言，是采用计算机软件鉴定并量化目标微集落。对采用不同种类荧光发信号部分的典型实验而言，软件将合适的荧光团特异图象叠加，通过确定每个目标微集落发射的信号或组合信号以鉴定靶细胞，并计数样本中存在的每种目标微集落。该软件也可以：(1)纠正照明不均匀；(2)通过反卷积矩阵纠正荧光交叉；(3)用印在底片上的记录标记排列图像)(4)比较不同时间点的图象；(5)应用算法以辨别生长中的微集落与非生长中的微集落；(6)基于与查询表的比较，为样本中每个成像微集落分配ID编码；(7)记录成像样本条形码用于鉴定样本；以及(8)自动将输出数据、图象及条形码保存在可以借助，例如网络浏览器接口查询的数据库内。商业可提供的图象分析包可以提供这些功能。也可以采用多色图象分析所用的软件包(如Image-Pro，Media Cybemetics；MetaMorph，Universal Imaging；MatLab；The Math Works)。
在此处略述该软件包以及分析下述多个实例中所收集的荧光数据的方法是有用的。使检测表面成像，以确定荧光目标的数量和/或总荧光信号。通过CCD照像机从膜上捕捉荧光，并将其保存为TIFF(Tagged Image File Format)图象文件，该文件包含像素位点及强度的记录。采用三种方法量化分析结果。通过合计所有像素的荧光信号可以确定成像检测区的总集成信号。比较样本来源的集成信号和阴性对照来源的集成信号。对含有大量靶细胞的样本而言，测定其总集成信号是尤其有用的。第二种方法是计数检测区内的荧光目标。第三种方法是累计荧光目标所包含所有像素的强度(与总计图象中所有像素强度相反)。所有图象分析均是采用Image-Pro v4.0(Media Cybernetics，Silver Springs，MD)进行的。
通过最初定义膜上的区域(感兴趣的区域)可以实现总集成信号的获得。Image-Pro可以将感兴趣的区域转换为单个目标，其它Image-Pro工具则可以总计该目标中所显示的像素总信号。继而以相同方式分析来源自未添加靶细胞的膜的类似图象，以其作为阴性对照。从含有样本的目标的值减去将该阴性对照的值。该扣除同时除去了分析和电子仪器带来的杂波。
第二种和第三种定量方法采用了Image-Pro的目标搜寻程序。该程序汇集了值(信号)大于自动或用户定义的阈值的相邻像素。建立了目标的周边轮廓线。周边像素及其内部的像素被定义为目标，总计这些像素值，便获得目标的集成值。继而利用该分析软件计数感兴趣范围内的所有目标，其中该感兴趣范围表现为样本容器的底部，另外，该分析软件也可用于推算已发现的所有目标的集成信号强度。
利用IPP Image-Pro宏语言，上述程序可以自动地同时对若干图象进行批处理。另外，采用用户定义的其它IPP scripts也可以处理数据。例如，将某一尺寸(面积)或强度之下或之上的目标包括在内或排除在外，对排除灰尘而言，将是一种有效的工具。对用于确定目标定义的图象分析而言，其它重要参数是根据应用的不同而变化的，并且应该进行相应的最优化。
本发明的多个方面均可以自动化，包括将上文略述的步骤串联。假设一个应用是分析液体样本，如注射用药水或临床尿样。该自动系统，是从收集烧杯内的样本开始，可以通过过滤使靶细胞沉积于膜上，并将其置于生长培养基上，于生长条件下培育靶细胞，有规律地定期使膜成像，并报告结果。可选地，本发明的单项功能也可自动化。例如，用于将培养皿(或其它用于微生物生长的一次性耗材)自动加载进或卸载出成像设备的模块，以及用于自动调焦的模块均可以被合并入体系内。
实施例.下述实施例并不对本发明构成限制，它们提供了实施与一系列应用相关的本发明不同实施方案的技术细节。
实施例1.利用非放大性大范围成像进行细菌微集落的检测与鉴定
背景与目标：临床微生物学(如细菌鉴定与抗菌敏感度检验)和工业微生物学(如要求的无菌度检验)的核心均是微生物生长的检测，但常用方法慢。在分析上必然存在延迟，在临床情况中会引起无谓的死亡和痛苦，在工业中则需要大笔费用。
利用非放大性大范围成像检测个体微集落，在利用微生物培养的优势的同时，避免了传统及新出现方法的重大缺陷。利用本发明原位复制分析的优势是：速度；易多元化(观测超过一个的微生物)；无需牺牲微集落活力检测和鉴定的能力(对有效抗菌敏感度检验而言是必需的)。
实验目标：该实施例证明了本发明检测细菌微集落原位复制的能力。该方法的原理见图7所示。使细菌沉积在滤膜上，并使其进行原位复制。以两种方式标记所获的微集落：采用核酸染色剂SyberGreen I，和通过结合由FITC标记的群体特异抗体。继而采用以基于CCD的非放大性大范围成像检测标记微集落。
实验方法：在LB培养基中培养大肠杆菌MG1655细胞过夜，使其密度达到大约109个细胞/ml。通过对血球计数器中的过夜培养物的稀释液进行计数，以确定细胞的大概数量。继而稀释该过夜培养物，获得大约103个细胞/ml密度。利用真空过滤装置和塑料漏斗杯(Millipore Microfil V User Guide，PF07114，Rev A 3/00)，使1毫升稀释液沉积在黑色聚碳酸酯滤膜(Osmonics；cat.num.K02BP04700)上。以该方式制备16个单独的滤膜，每个滤膜含有～1000个细胞，其中四个滤膜用于四个时间点(0、1.5、3和24小时)。过滤后，将每个滤膜置于含有LB生长培养基、独立的并已预热至37℃的琼脂平板上，将其置于37℃培养箱中。定时(0、1.5、3、24小时)将四个滤膜取出培养箱。通过在一条已布点有甲醛的ParafilmTM的500μl点上放入滤器，沉积有细菌的一侧朝上，将其中两个滤器固定在3.0％甲醛中，保持10分钟。固定后，将滤膜置于吸水垫上，以吸收多余的甲醛。继而将Syber Green I(200μl，Molecular Probes)的10X溶液添加在滤膜顶部。染色细胞10分钟。采用PBS-B将另外两个未用于核酸染色的滤膜封闭15分钟后，向该滤膜上添加FITC标记的抗大肠杆菌抗体(Fitzgerald)。培育30分钟后，将滤膜置于吸水垫上，以吸收残余液体。继而通过将滤膜置于以CCD为基础的成像仪(详述部分的步骤5中有所描述，并如图3所示)上，并使细菌面对光源和CCD芯片，以使所有膜成像。
结果：该实施例中，为形成微集落，需使细胞经过复制若干代。采用Syber Green I或FITC标记抗体标记微集落。图6中的上排图片显示的是0小时的单细胞。下排图片显示的是培育3小时后的微集落。由于在集落形成细胞最初所附着位点上的细胞数量的增加，从而通过CCD成像随时间检测到的目标尺寸和信号存在实质性的增加。对医学和工业微生物实践而言，生长检测是重要的。该实施例显示本发明可以显著缩短检测微生物生长所需的时间。
实施例2.利用非放大性大范围成像对细菌微集落进行的基于自身荧光的检测
背景与目标：在背景部分论述了检测微生物生长的方法的重要性，以及现有方法的局限性。该实施例证实基于本发明快速检测细菌微集落生长的方法是非常简单且有效的方法。该方法依赖于靶细胞的固有荧光性(自身荧光性)以产生可检测的信号。因此，该方法不利用种类结合分子或外源发信号部分，便可以实现微观靶细胞的非放大性大范围成像。无试剂非破坏性计数的优势包括可获得纯培养物(对微生物鉴定和抗生素敏感度检验而言)、提高方法有效性、以及随时间跟踪微生物生长的能力(目标分辨力和生长动力学而言))。
实验方法：如实施例1培育大肠杆菌MG1655细胞。采用无菌PBS系列稀释(10倍稀释)细菌细胞。利用真空过滤装置和塑料漏斗杯(Millipore Microfil V User Guide，PF07114，Rev A 3/00)，使细菌细胞(50ml体积，10-7稀释液)沉积在黑色聚碳酸酯滤器(Osmonics；cat.num.K02BP04700)上。以过滤无菌PBS的滤器作为阴性对照。过滤后，将每个滤器置于含有LB生长培养基、独立的并已预热至37℃的琼脂平板上，将其置于37℃培养箱中。通过过滤重复样本，并在LB琼脂上培育滤器，以确定10-7稀释液中的活细胞数量。该过程显示10-7稀释液中每50ml约含1000个细胞。5.25小时，通过将保持在玻璃显微镜载玻片上的滤器置于以CCD为基础的成像仪(详述部分的步骤5中有所描述，并如图3所示)中，并使细菌面对光源和CCD照像机，以使膜成像。采用FITC光学滤光器装置(Chroma；激发470/40nm，发射522/40nm)并利用软件控制(Image Pro Plus，version4：1；Media cybernetics)捕获1秒曝光。
结果：图7显示了5.25小时生长后对细菌微集落进行的以自身荧光为基础的检测结果。1秒曝光后，含有微集落的滤器产生了强信号(图7，左图)，而不含微集落的滤器，虽然经过相同处理并成像，仍未显示这种信号(图7，右图)。
该实施例证明对微生物生长的检测而言，本发明这一非常简单的实施方案是有效的方法。可以利用该技术更为有效地制定多种重要微生物的诊断应用，包括无菌度检验、环境和水检验、微生物鉴定及微生物敏感度。
实施例3.一种利用与传统培养方法的内部比较验证快速无试剂微生物计数实验的简单方法
背景与目标：对新方法的开发者及其用户而言，验证新的微生物学实验与“金标准”方法等效是基本任务。定型的验证要求条件通常被编纂在政府规定中，以指导新的微生物学方法在工业和保健行业中的推广。在制药工业中，微生物学实验所用的新方法有时实施困难，是由于证明其与已接受方法等效存在难度。该实施例的目标是验证一种可证明基于本发明的实验与传统微生物培养实验等效的简单方法。
实验方法：如实施例2培育并分析大肠杆菌MG1655细胞。微集落成像后，于37℃再次培育滤器大约15小时。采用由斜角照射平板的显微镜白炽灯所提供的反射白光对所获大集落成像。另外，与检测微集落自身荧光性所用系统相同，也采用相同成像系统收集该反射光。
结果：通过比较图8中的左图和右图，证实本发明的该实施方案明显地未伤害微生物。通过内部比较“祖代”微集落(左图)与其“子代”大集落(右图)之间的准确相符程度，有利地证实该方法与传统微生物培养计数实验等效。
实施例4.利用非放大性大范围成像检测自身荧光微集落的检测准确度及限度
背景与目标：在保健和工业微生物学两方面，少量微生物的准确检测都是重要的。例如，携带潜在致命血液感染物的患者的10ml血液样本中可能仅存在1个细菌细胞。同样，在药物生产中，可注射药物的无菌度测试必须检测到样本中可能含有的单个活的微生物细胞。两种情况中，假阴性结果与假阳性结果均会造成严重后果。实验结果为假阳性和假阴性的部分便定义了实验方法的准确度。
该实施例的目标是显示本发明检测最低水平靶细胞时的准确度。
实验方法：如实施例3培育并分析大肠杆菌MG1655细胞。不过，对该实施例而言，是采用多级滤器(n＝101)过滤细胞的稀释液，从而预期平均五个滤器中大约有一个滤器上的检测区内含有一个单个靶细胞。5小时培育完成后，使每个滤器成像，并记录微集落的存在。继而再次培育滤器过夜，再记录大集落的存在。继而比较利用本发明所获的结果与利用传统目测法所获的结果。
结果：图9图示了当样本含有极低水平靶细胞时，该实施例所采用的测定本发明准确度的方法。对101个滤器中的每一个而言，通过计数微集落所获的结果与通过传统方法所获的结果相同。如通过微集落或大集落存在所判断的那样，大多数滤器(n＝80)无沉积的靶细胞。此外，含有沉积的靶细胞(n＝21)的滤器，微集落出现的数量(若干滤器含多个靶细胞，如统计学所预期一样)以及在滤器上的位置均与观察大集落的结果相同，都为结果增加了进一步的可信度。本发明与“金标准”方法有100％的一致性，并且无假阳性或假阴性检测结果。因此，结果表明本发明在检测非常低水平靶细胞时是准确的。
实施例5.确定在利用无试剂非放大成像快速检测的自身荧光细菌微集落中微生物细胞的数量
背景与目标：该实施例的目标是证实利用大范围成像无试剂检测微集落自身荧光性的灵敏度及速度。之所以可以快速检测微生物生长，是由于本发明具有在细胞量少时也可检测早期微集落的能力。该实施例中的实验通过非放大CCD成像确定了所检测微集落中的细菌细胞数量。
实验方法：将新鲜培养的大肠杆菌(ATCC，Cat.No8739)单集落接种至含有生长培养基(TSB；10ml)的锥底管(50ml)内，并进行培育(16小时，37℃，150rpm)。含有稳定期细胞的培养物(2.4×109/ml)用于接种含预热TSB(37℃，100ml)的锥形烧瓶(500ml)，以产生对检测而言时间最佳的对数期培养物。将稳定期培养物(100μl)接种至含有预热TSB的烧瓶中，并进行培育(2小时、37℃、150rpm)。通过倒平板滴定法发现，以该方式获得的培养物含有～5×107个细菌/ml。将对数期培养物稀释在PBS中(10-6)。利用过滤装置(Millipore Inc.，1225 Sampling Manifold，Cat.No.XX2702550)，通过架在一个吸水垫(Whatman Inc.，Cat.No.1441325)上的膜(Chemunex Inc.，Chemfilter CB0.4，Black，PET-23，25mm)过滤一体积(10ml)的稀释液。将细菌收集在膜上后，将该膜置于预热(32.5℃)过的TSA平板上。通过采用FITC光学滤光器装置(Chroma；激发470/40nm，发射522/40nm)以及软件控制(Image Pro Plus，MediaCybernetics)的非放大性大范围成像捕捉(30秒曝光)平板图像。捕捉到初始图象后，将该平板置于培养箱(32.5℃)内进行培育。2.5小时的生长后，从培养箱取出平板，并利用之前应用的图象捕捉装置使相同区域再次成像。捕捉图象之后，立即固定膜(于含有1.5％甲醛经过过滤的1型水中5分钟)，之后将膜洗涤两次(PBS，每次5分钟)，再将膜置于含有上述固定或洗涤溶液的3M Whatman纸上。将膜放在取样支管上，该支管只有一个位置未用塞子密封。进行真空过滤15秒。为计数单个微集落中的细菌，需将膜染色，将碘化丙啶(1ml，5μg/ml)添加至杯壁内，同时加以真空压力，继而添加1型水(1ml)。继续保持真空压力15秒后，将膜移开并置于玻璃载玻片上，采用Pro Long Antifade Reagent(Molecular Probes，Eugene，OR，Cat.No.P-4781)干燥，并盖上盖玻片。利用配备有SPOT RT照像机(Diagnostic Instruments，Sterling Heights，MI，Model No.2.3.1，2秒，仅选择红色光谱)的荧光显微镜(Axioplan II荧光显微镜，Carl，ZeissInc.，Thornwood，NY；Cy3.5 filter set，Chroma Id.No.SP-103，激发581/10nm，发射617/40nm，400x)使着色微集落成像，空间配准之后，利用大范围成像鉴定相应的未着色微集落。
结果：图10显示了该实施例所获的结果。对采用本发明32.5℃下生长2.5小时后所检测到的三个微集落进行染色，并利用高倍数显微镜分析。三个微集落分别含有45、48和50个细胞。在微集落附近未观测到单个细菌细胞，证明经过染色操作的微集落仍然完整。应当指出，大肠杆菌的可见集落(～1mm直径)所含细胞数量约为上述数量的1百万倍。因此，利用非放大无试剂检测，本发明可以在细胞分裂仅几代后便检测到微集落。
实施例6.对环境水样中的细菌微集落进行的基于CCD、非放大性、大范围成像检测与鉴定
背景与目标：该实施例旨在显示当将本发明应用于检测多种可能被营养抑制的环境微生物时，本发明快速检测微生物生长的能力。
水是许多药物的生产、加工和配方中的常用配料。在生产过程中，检测药用水中的细菌是基本步骤，因为细菌本身或其代谢产物如果存在于最终产品中的话，都将引起不利后果。细菌的增殖可能出现在产品的生产、保存和分装过程中。饮用水是提供药用水的来源，也是微生物污染的主要外源。粪便大肠杆菌和广泛多种微生物、大量革兰氏阴性细菌均可能存在于饮用水中。检测水中细菌的常用方法慢，不利于及时的系统控制。
采用非放大性大范围成像检测个体细菌微集落显示出体外复制分析的优势，同时避免了传统方法与新出现方法的重要缺点。采用本发明的原位复制分析的优势是：速度以及无需牺牲微集落活力进行检测并鉴定的能力(有利于鉴定产品和加工过程中的微生物污染源，或确定特定微生物是否对应用水的产品或加工过程有害)。
实验概述：本实施例证实了本发明在集落生长成为大集落之前检测细菌微集落原位复制的能力。使细菌沉积在滤器上，并使其进行原位复制。采用基于CCD、非放大、大范围成像方法，利用自身荧光性(FITC激发和放射滤光器)和白光反射性检测所获的微集落和大集落。
实验方法：无菌条件下从查尔斯河中采集水样，并在采集后的1小时之内应用在实验中。在设置14,000rpm的Eppendorf Centrifuge5415C中离心查尔斯河水样1～2秒。采用无菌I型水以1∶10的比例稀释离心后的查尔斯河水样，并利用真空过滤装置和无菌塑料漏斗(Millipore100ml Funnel，cat.num.MIHABG072)将1.0ml稀释液沉积在黑色、混合纤维素酯滤器(Millipore；cat.num.HABP04700)上。将每个过滤后的滤器置于含有R2A生长培养基(Becton Dickinson/Difco；cat.num.218263)的单个琼脂平板上。制备10个单独的滤器，并于32.5℃培育该琼脂平板74小时。定时(17、24、42、50、68和74小时)将琼脂平板从培养箱中取出，并通过把平板置于以CCD为基础的成像仪上，使细菌集落面对发光源和CCD芯片，从而使滤器成像。用于反射的照明光源是由
Figure C0282209700602
Model190 Convection Cooled 30 Watt Quartz Halogen Illuminator(Dolan-Jenner Industries，Inc.，Lawrence，MA)提供的，照明是以斜角照射在滤器上。肉眼可观测到0.5mm或更大直径的细菌集落，因此可以利用该尺寸标准作为细菌集落的辨别特征。鉴别0.55mm或更大直径的集落，并于反射图象中进行计数。也可以确定将发育成为大集落的自身荧光微集落何时可以被检测到。分析自身荧光图象以确定74小时的大集落的祖代细胞出现时间。于不同时间点标绘出74小时的大集落在还是自身荧光微集落时便被检测到的百分比。
结果：该实施例中，为形成微集落和大集落，需使来自水样的细菌细胞进行复制。通过利用本发明检测两种类型的集落，并通过自身荧光性和反射率进行鉴定。图11所示数据表明可目测的集落数量从17小时的11％(6个集落)增加至74小时的100％(53个集落)。74小时大集落中的94％(50个集落)在24小时还是自身荧光微集落时便可被检测到。该实施例显示本发明可以显著缩短检测细菌生长所需的时间，进而缩短检验水样中的细菌所需的时间。
实施例7.细菌微集落的基于CCD、非放大、大范围成像检测与计数细菌的传统方法之间的相关性
背景与目标：本实施例的目标是确定采用本发明快速检测微集落所获的结果与采用较慢的传统微生物培养所获的结果之间数字的相关性。
实验目标：本实施例比较了分别通过本发明和传统“倒平板”培养方法的微集落计数。使细菌沉积在滤器上，并使其进行原位复制。采用基于CCD、非放大、大范围成像并利用自身荧光性(FITC激发和发射滤光器)检测所获的微集落。继而比较采用本发明所获的微集落数量与采用倒平板方法所获的大集落数量。
实验方法：在TSB中培育大肠杆菌8739细胞过夜，使其密度约为109个细胞/ml。在PBS中对过夜培养物进行稀释，获得从大约107个细胞/ml到大约102个细胞/ml的10倍系列稀释液。采用PBS进一步稀释从每个系列稀释液取出的等份试样，使1.0ml含有大约50个细菌。将1毫升稀释液连同35ml融化的(47℃)胰酶豆琼脂(TSA)(Becton Dickinson/Difco；cat.num.236950)置于培养皿中。于室温冷却该琼脂平板，继而于32.5℃培育平板过夜。制备10个琼脂平板用于每个系列稀释液。通过目测平板计数琼脂平板中的大集落。利用真空过滤装置和无菌塑料漏斗(Millipore
Figure C0282209700611
100ml Funnel，cat.num.MIHABG072)将细菌稀释液(11.3ml)沉积在黑色混合纤维素酯滤器(Millipore；cat.num.HABP04700)上。将每个滤器置于含有TSA的单个琼脂平板上。制备10个滤器对应每个系列稀释液，并于32.5□培育该琼脂平板7小时。继而从培养箱中取出平板，并通过将平板置于以CCD为基础的成像仪上，使细菌集落面对照明光源和CCD芯片，以使滤器成像。利用FITC激发和发射滤光器检测来自每个微集落的自身荧光。过滤时采用多于11倍的体积是因为每个图象构成整个滤器表面的大约1/11th。因此，每个图象应含有的细菌数量与进入每个倒平板中的细菌数量相同。通过目测检查图象以确定每个图象中的微集落数量。通过使微集落或大集落的数量乘以一个稀释系数，计算每个系列稀释液中的细菌数量。
结果：该实施例中，使细菌细胞进行复制，并于滤器上形成微集落或者在琼脂平板中形成大集落。微集落是利用本发明检测，大集落是利用传统培养方法和目测检查琼脂平板而得以检测。相对于每个系列稀释液，标绘出通过每种方法所测定的细菌浓度，结果如图12所示。每个点代表10次单独测定结果的平均值。在采用本发明所获的结果与采用传统倒平板方法所获的结果之间获得一个正相关性。0.9996的相关系数表明在采用本发明的微集落计数和采用传统培养方法的大集落计数之间存在很好的线性关系。
实施例8.无试剂计数实验的动态范围及线性
背景与目标：新微生物学检验方法的两个验证标准为该方法的范围及线性。该范围是已被证实可采用新检验方法精确、准确、线性测定的微生物的最高和最低水平之间的区间。微生物学检验方法的线性是其获得特定结果的能力，其中该结果在给定范围内与存在于样本中的微生物浓度成比例。
该实施例证明本发明在一定细菌水平范围上的线性。本发明检测了滤器表面上的微集落的存在，并通过利用基于CCD、非放大、大范围成像量化微集落的自身荧光信号。
实验方法：在TSB中培育大肠杆菌8739细胞过夜，使其密度约为109个细胞/ml。在PBS中对过夜培养物进行稀释，获得10-4～10-9的10倍系列稀释液。利用真空过滤装置和无菌塑料漏斗(Millipore
Figure C0282209700621
100ml Funnel，cat.num.MIHABG072)将5ml的每个系列稀释液沉积在黑色混合纤维素酯滤器(Pall Gelman Laboratory；cat.num.66585)上。将完成过滤的每个滤器置于含有胰酶解酪蛋白豆琼脂、卵磷脂和聚山梨醇酯80(Becton Dickinson BBL，cat.num.211764)的单个琼脂平板上。对应每个系列的稀释液制备1个滤器，并于32.5℃培育该琼脂平板6.5小时，继而于32.5℃培育过夜。于6.5小时的时间点，从培养箱中取出琼脂平板，并通过将平板置于基于CCD的成像仪上，使细菌集落面对照明光源和CCD芯片，以使滤器成像。利用GFP激发和GFP-LP发射滤光器检测来自每个微集落的自身荧光。利用ImagePro软件(Media Cybernetics，Inc.，Version 4.5.0.19)量化每个图象中来自微集落的自身荧光信号。继而过夜培育，目测检查琼脂平板，对采用10-8和10-9稀释液制备的滤器上所存在的大集落数量进行计数。利用这两个滤器上的大集落数量以推算被添加至每个膜上的细菌数量，以及最初过夜培养物中的细菌浓度。
结果：该实施例中，使细菌细胞进行复制并在琼脂平板中的滤器上形成微集落。微集落是通过利用本发明检测，并通过GFP-LP自身荧光性得以鉴定。利用ImagePro软件量化每个图象中来自微集落的自身荧光信号。与添加至每个滤器中的细菌数量相对应，标绘出每个图象中的自身荧光信号，结果如图13所示。数据在细菌水平的5个对数范围上是线性的。该范围是非常显著的，因为某些传统培养方法，即倒平板的范围仅为2个对数。结果也显示出非常好的线性，其R2值为0.9929。对新的微生物学检验方法(Evaluation，Validation，andImplementation of New Microbiological Testing Methods.2000；PDAJournal of Pharmaceutical Science & Technology 54(Supplement TR33)，1-41)而言，该值在可接受的R2值范围(0.8～1.2)内。
实施例9.无需稀释样本的快速抗微生物防腐剂效果检验
背景与目标：将抗菌防腐剂添加至被包装在多剂量容器内的物品中，以避免可能由生产环节或者在消费者取出单剂量时引入的微生物的生长。对含有固有抗菌活性的药品或含有抗菌防腐剂的产品而言，均必须证实其的抗菌效果。该实验非常昂贵且难以进行，因为必须分析大量样本稀释液。典型的抗菌防腐剂效果检验需要分析数百个微生物培养平板。该实施例的一个重要目标是证实本发明可以通过避免稀释样本的需要而节省大部分实验人力。
实验方法：在TSB中培养大肠杆菌8739细胞过夜，使其密度达到大约109个细胞/ml。将细菌(共计8.48×106或2.12×105个细胞/ml)添加至40ml无菌PBS或40ml的Osco Brand无菌保存盐溶液(由American Procurement and Logistics Company分装，Lot num.1T016，Exp.Jun 03)。室温培育这两种溶液168小时。分别于0、24、96和168小时后，取出5ml含细菌PBS和5ml含细菌Osco Saline，并将其添加至含有45ml无菌D/E Neutralizing Broth(BectonDickinson/Difco，cat num.281910)的单独试管中。利用真空过滤装置和无菌塑料漏斗(Millipore
Figure C0282209700631
100ml Funnel，cat.num.MIHABG072)将稀释的样本沉积在黑色混合纤维素酯滤器(PallGelman Laboratory；cat.num.66585)上。将每个滤器置于含有胰酶解酪蛋白豆琼脂、卵磷脂和聚山梨醇酯80(Becton Dickinson BBL，cat.num.211764)的单个琼脂平板上。于每个时间点对应每个稀释液制备1个滤器。于32.5℃培育琼脂平板6.5小时。从培养箱中取出琼脂平板，并通过将平板置于以CCD为基础的成像仪上，使细菌集落面对照明光源和CCD芯片，以使滤器成像。利用GFP激发和GFP-LP发射滤光器检测自身荧光。利用ImagePro软件(Media Cybernetics，Inc.，Version 4.5.0.19)量化每个图象中的微集落来源的自身荧光信号。采用实施例8中所示的标准曲线，将通过ImagePro分析所获的自身荧光信号转换成每个膜所加入的细菌数量，并继而转换成针对每个时间点的每ml溶液(PBS或Osco Saline)的细菌浓度。给定0小时培养时细菌的起始浓度，计算24、96和168小时时间点的细菌浓度减量的对数值。0、24、96和168小时后，从含细菌的PBS和Osco盐溶液中取出100μl，将其添加至900μl的D/E Neutralizing Broth(1∶10稀释)中。继而在1.0ml无菌PBS中以1∶10稀释率制备10-1～10-6的系列10倍稀释液。将总体积的10-1～10-6稀释液分别添加至含有卵磷脂和聚山梨醇酯80的30ml融化(45℃)的胰酶解酪蛋白豆琼脂中。室温冷却这些琼脂平板，并于32.5℃培育过夜。目测计数两个最低稀释度的平板，每个平板所含集落不超过300个。利用这些数字(乘以合适的稀释系数)计算PBS和Osco盐溶液中的细菌浓度。给定0小时培养时细菌的起始浓度，计算24、96和168小时时间点的细菌浓度减量的对数值。标绘出通过本发明所测定细菌浓度减量的对数值，并与通过倒平板方法(一种传统的、以生长为基础的微生物学计数方法)所测定细菌浓度减量的对数值进行比较。结果如图14的图表所示。
结果：图14中的结果显示在Osco盐溶液(0.1％山梨酸)中的抗菌防腐剂在减少细菌浓度方面是有效的。在PBS中则未观察到细菌浓度的降低。数据表明即使本发明不需要稀释，两种计数方法仍然线性相关(R2＝0.9633)。结果显示本发明可以通过避免传统方法麻烦的样本稀释步骤，从而节省了大部分劳力和物料。
实施例10.利用非放大性大范围成像对热应力生物学指示剂进行的基于自身荧光的检测
背景与目标：该实施例的目标是显示本发明在采用耐热孢子作为生物学指示剂方面的潜在应用。在药物和医学器械生产，以及临床实验室中，为确保无菌操作的效果，一个重要的应用就是灭菌器定量方法。
进一步的目标是显示本发明可以通过减少所需样本的数量从而简化生物学指示剂的计数。在传统倒平板方法中，覆盖整个可能范围的系列10倍稀释液对准确定量样本而言是必要的。该实施例中，利用生物学指示剂脂肪嗜热杆菌自身荧光的非放大性大范围成像，以定量有活力的孢子浓度。该定量化是线性的，具有大约3个数量级，并减少了准确测定热应力处理之后残留活力孢子数量所必需的稀释液数量。在短期生长之后捕捉自身荧光图象，继而分析图象以估计获得有活力的热应力脂肪嗜热杆菌孢子的起始浓度。
实验方法：在无菌水中稀释脂肪嗜热杆菌ATCC7953(RavenBiological Laboratories，Inc.)的孢子，获得～2×105个孢子/ml的浓度，并进行多种热应力实验，范围从110℃持续5分钟到121℃持续15分钟。在水中以10倍稀释度系列稀释该热处理后的孢子和未处理的对照，直到1/1000稀释度。为了做比较，除了非放大性大范围成像自身荧光以外，每个样本是通过传统倒平板方法分析的。通过将每个样本的每个稀释液1ml置于培养皿中，并添加20ml融化的胰酶解酪蛋白豆琼脂(TSA，BD catalogue no.236950)，制备倒平板。凝固后，于55℃培育平板48小时，并人工计数。选择含30～300个集落的平板计算孢子滴度，如果没有一个平板所含集落超过30个，该情况中，便采用含有未稀释的样本1ml的平板。
为制备用于大范围成像的微集落，采用15ml无菌水分别混合1ml未稀释样本和1ml的1/100稀释液，并利用真空过滤和塑料漏斗杯(Millipore Microfil V User Guide，PF07114，Rev A 3/00)使其滤过黑色HABP滤器(Millipore catalogue no.HABP04700)。过滤后，将每个滤器置于TSA的单个平板上。利用非放大性基于CCD的成像仪(于详述部分的步骤5中所描述，如图3所示)捕捉t＝0小时的图象。利用FITC光学滤光器装置(Chroma；激发470/40nm，发射522/40nm)通过5秒曝光捕捉自身荧光。于55℃培育平板，并于8和20小时捕捉图象。利用Image Pro Pluse软件(version 4.1；Media cybernetics)分析图象。采用t＝0曝光可以发现可能在细菌生长前便存在于平板上的灰尘和其它荧光杂质。对每个图象而言，除去t＝0时的杂质来源的信号，将所有目标(在特定实施例中该研究对象被定义为具有3200～65301个强度单位的像素强度)的像素强度总和与采用未经热应力处理的孢子所获的标准曲线相比较，并由该标准曲线计算孢子滴度。对由未稀释样本所获的值与由1/100稀释液所获的值而言，根据在标准曲线的线性范围内哪一个值下降，便选用该值。将通过非放大性成像所获自身荧光计算的孢子/ml值与通过倒平板方法计算的值相比较。
结果：通过倒平板方法计算的热应力孢子滴度与通过自身荧光大范围成像计算的孢子滴度对比图可见于图15。两种方法所获的值之间存在好的相关性，不过每两个自身荧光图象需要四个平板。另外，倒平板需要48～72小时才可以读数，而自身荧光图象则在生长8～20小时便可以被捕捉到并分析。
变动：也可以利用自身荧光的非放大性大范围成像以定量其它生物学指示剂生物，如枯草芽孢杆菌和产芽胞梭状芽胞杆菌的活细胞浓度。
可以采用自身荧光图象的多种分析方法定量细胞浓度。例如，可以采用微集落的目标数量代替目标像素强度总和。由于目标(微集落)远比充分生长后的大集落小(可肉眼计数)，相同面积中适合更多微集落进入，同时不牺牲由于研究对象重叠而损失的准确度。另外，可以将更复杂的目标搜寻算法应用到图象中，以处理局部荧光背景，邻接目标，和杂质荧光颗粒的存在。
实施例11.对绞细牛肉中细菌微集落进行的基于自身荧光的检测
背景与目标：该实施例说明与药典方法相比，本发明能够缩短检测绞细牛肉中细菌微集落所需的时间。对预防早期食品腐败而言，测定生肉中的活细菌总量是重要的。现有方法需花费两天，并且通常需要生产者在获得实验结果之前就开始运输检验用肉。缩短检测微生物所需的时间可以预防食品引起的疾病事故、无效生产和昂贵的召回成本。
实验方法：于225ml 0.1％蛋白胨水中稀释瘦绞细牛肉(25g)，并于细菌分离器中加工以使样本匀质化。继而在0.1％蛋白胨水中系列稀释该样本。将合适体积的10-2、10-3、10-4和10-5稀释液添加至PBS中，并利用真空过滤装置将其倾倒在两种类型的滤器膜上(MilliporeHABP Cat.No.HABP047000.45μm和Chemunex CB0.40.4μm Ref.no.200-C20010-01)。对应每个稀释液和滤器类型制备复制样本，于35℃培育TSA平板48小时。利用基于CCD的成像仪捕捉0、6、16、24和48小时的图象。利用FITC光学滤光器装置(Chroma；激发470/40nm，发射522/40nm)，并利用软件控制(Image Pro Plus.)于HDyn分辨率下捕捉曝光10秒的图象。也可采用白光反射曝光10秒捕捉图象。
结果：数据收集自两种类型膜滤器上的10-4和10-5稀释液。通过在反射图象中计数48小时0.5mm或更大直径的大集落，以分析该数据。继而在反射和自身荧光图象中将这些大集落回溯至24、16和6小时的时间点。图16分别显示了自身荧光微集落和大集落的检测时间。跟踪可于48小时形成大集落的微集落随着时间的出现，发现100％的大集落可以通过本发明于16小时便检测到。这些结果显示与传统方法相比，本发明可以显著缩短获得结果所需的时间。
变动：可以将该实施例中的实验延伸至检验多种食品，包括其它肉类、蔬菜、饮料和奶制品。
实施例12.采用非特异磁选择继而通过利用非放大性大范围成像的微集落检测对复杂样本中的细菌进行检测
目标：本实施例说明了一种非特异性地从复杂样本中选择个体细菌细胞，继而通过利用非放大性大面积成像快速检测微集落生长的免疫测定方法。更具体而言，本实施例证实了从血液中有效选择一定范围的细菌，并继而利用直接生长方法检测细菌生长的能力。本实施例显示借助包被有结合试剂混合物的磁珠，可以从复杂样本中选择不同种类的细菌。
实验方法：图17显示了本实施例检测复杂样本中细菌的过程。首先，将细菌细胞和磁珠添加至样本中，并进行培养。使磁珠与细菌细胞结合；继而利用磁力沉淀复合物。重新悬浮(PBS)磁珠，过滤，并平板接种于生长培养基上。也将所获的磁选择上清液制成平板。培养结束后，利用非放大性大范围成像于不同时间点使滤器成像，以检测微集落。
通过使具有活性甲苯磺酰基团的磁性颗粒(Dynal，Oslo，Norway，cat.no.140.03)与若干非特异和特异的接合剂偶联，获得一个磁性颗粒阵列。该接合剂包括多粘菌素B硫酸盐(Sigma；cat.no.P1004)、多粘菌素B纳米蛋白(Sigma；cat.no.P2076)、内毒素中和蛋白(Seikagaku America：自然来源和重组型，cat.no.910140-1，910130-1和910120-1)、内毒素抑制蛋白(Bachem；cat.no.H-1382)、内毒素底物(Bachem；cat.no.L-1195)、抗脂磷壁酸质抗体(QED；cat.no.15711)、抗内毒素抗体(QED cat.no.15306和15301)。超声处理(1分钟；设置8；Fisher Scientific 550 Sonic Dismembrator)包被的磁性颗粒(每10μl含1×108个)。继而将混合的包被磁珠添加至内含血液(1ml，Biochemed；黄种人血液，以柠檬酸钠为抗凝血剂，cat.no.10762WB)的1.5ml试管中，其中该血液混有大约1、10或100个金黄色葡萄球菌(ATCC#27694)。培育(室温下1小时)血液、细菌和磁体。培育结束后，利用磁分离装置(Polysciences，Inc.，Warrington，PA，Cat.No.8MB4111S)以捕获并保护磁性颗粒，从而磁选择出珠体。继而澄清血液后，置于TSA(Difco，cat.no.236950)平板上，同样制成初始金黄葡萄球菌接种量为1、10和100个细胞的平板(作为对照)。重新悬浮(1ml PBS)磁性颗粒，并将所获的含有磁性颗粒-细菌复合体的液体过滤通过膜(Osmonics，poretics 47mm，0.22μm孔，聚碳酸酯黑色滤器，cat.no.1213889)，将膜置于TSA平板上。利用非放大性大范围成像于0时间点和短暂培养期之后使滤器成像，以检测自身荧光微集落。回收百分率是通过比较采用磁性的捕获量和采用公式：(平均磁捕获/平均接种量)×100所获数值而确定的。
结果：图18显示的实验结果说明了磁分离之后的微集落检测。该图显示的两个图象，取自0点和生长6小时。6小时图象含有认定的微集落-为亮点，而0点图象中则无法看见。为证实这些微集落确实是生长中的微生物微集落，将滤器培育过夜并再次成像。于认定的微集落位点检测到大集落，证实了快速检测结果。1个细胞样本便实现了超过90％的金黄色葡萄球菌回收率。10和100个细胞样本则获得超过50％的回收率。
变动(广泛接合剂)：可以采用多种广泛反应性接合剂，包括细菌凝集素、抗肠细菌常用抗原、抗蛋白质A、抗蛋白质G、LPS结合蛋白、粘蛋白(细菌接合剂)、CD 14(结合LPS和LPS细菌复合体)、胶凝素(于噬菌作用或补体串联期间结合细菌)、其补体的亚单位，如C3b和C4b、人类清除细胞受体(与细菌组成结合的细胞受体)和tectonics(结合蛋白质的碳水化合物)。
变动(特异接合剂)：可以采用多种类型的种类结合分子，包括抗体、适体和配体以从复杂样本中特异地选择一定范围的细菌类型。该变动实施例中，大肠杆菌O157:H7的选择是通过利用大肠杆菌O 157:H7特异抗体实现的。
实验方法的变动：该变动中，复杂样本中的细菌检测是采用分析物特异性磁选择实现的。该选择之后，利用非放大性大范围成像检测微集落。图17显示了该实施例所用的方法。将含有大肠杆菌O157:H7的样本与磁性颗粒混合。继而对样本进行磁选择，过滤并利用非放大性大范围成像于一系列时间点成像。通过使甲苯磺酰基修饰的磁性颗粒(Dynal，Oslo，Norway，cat.No.140.03；根据生产商推荐方法进行偶联)与由大肠杆菌O157:H7引发的多克隆抗体(BioTrace亲和纯化的；Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，MD，Cat.No.01-95-90)偶联，获得抗大肠杆菌O157:H7磁性颗粒。超声处理(1分钟；设置8；Fisher Scientific 550 Sonic Dimembrator)抗大肠杆菌O157:H7磁性颗粒(1×108/10μl)。继而将该磁珠添加至混有大肠杆菌O 157:H7(Strain DEC 3B，Dr.Tom Whittam，Pennsyl-vania StateUniversity)的血液中(1ml；Biochemed；黄种人血液，以柠檬酸钠为抗凝血剂，cat.no.10762WB)。大肠杆菌O157:H7微集落的生长和检测是遵循本实施例中上述的相同步骤实现的。
实施例13利用原位复制和非放大性大范围成像的抗微生物敏感度检验
背景与目标：背景部分论述了抗微生物敏感度检验对确定合适疗法的意义。监测固体培养基上的微生物生长是常用的方法，并且与液体培养中的生长相比具有若干显著优势。不利用设备(如采用平板扩散实验)、经济、并同时定量地确定细菌菌株对若干抗生素的敏感度是可能的，但是目前的方法需要纯化的集落，因此在处理患者样本后的1～2天通常不能进行。这种延迟可能给患者带来生命危险。此外，通常还需要另外的1～2天以检测并分析抗菌敏感度实验的结果。
目标：本实施例证实了本发明快速确定细菌菌株抗菌敏感度的用途。该方法的原理如图19所示。下述实验中，抗性和敏感性菌株生长在含有和不含有抗生素的培养基上，并且微集落的检测方法与上述实施例相同。该方法显示了显著缩短被拖延的生长步骤(在抗生素中的集落纯化与生长)的能力，而该被拖延的生长步骤在目前可能会拖延合适的抗菌疗法的实施。
方法：与上述实施例(实施例1)相同，使细菌的敏感性(大肠杆菌MG1655)和抗性(大肠杆菌MG1655/pLafr I)菌株沉积在滤器上。将含有大约1000个抗性细菌的滤器置于含抗生素(四环素；64μg/ml)或不含抗生素的LB平板(LB琼脂；Difco)上。于37℃培育(3小时)后，如上述实施例(实施例1)对滤器进行染色并成像。
结果：图21显示了利用基于CCD的非放大性大范围成像对抗菌敏感度的检验结果。CCD成像在含有抗性细菌的膜上检测到微集落，而在含有敏感性细菌的膜上则未检测到(于最左端标记：3小时+tet，CCD的图象部分中比较标有“resistant strain(抗性菌株)”和“sensitivestrain(敏感菌株)”的图象)。从图象分析获得的强度数据量化了该观测结果(条形图)。高倍数荧光显微镜证实培养3小时后抗性菌株形成微集落，而敏感菌株则未形成微集落。(显微镜分析表明在抗生素存在条件下，敏感细菌的培育将导致异常的细菌形态[比较下排标有“sensitive strain(敏感菌株)”的两幅显微镜图象])。
该实验结果显示，对抗菌敏感度检验而言，利用非放大性大范围成像检测微集落是一种快速且灵敏的方法。
变动：抗菌敏感度检验中的某些变动包括采用不同信号部分。该实验中，活性染色剂，如Syto 9和其它Syto家族成员(MolecularProbes)，酯酶底物如荧光素二乙酸酯或ChemChrome V6(Chemunex)，标记抗体，或产生荧光产物的代谢物均可以作为核酸染色剂的替代品。也可以利用靶细胞的天然自身荧光性检测微集落。也可以利用微集落生长，与采用抗菌敏感度检验的平板扩散或E检验方法(AB biodisk NA Inc.；E-test条带)相同，监测几何生长抑制。该抗菌敏感度检验也可以被延伸为包括采用不同荧光标记的抗体同时鉴定多种微生物。
实施例14利用圆片扩散方法和非放大性大范围成像的快速抗菌敏感度检验
目标：本实施例证实了本发明利用圆片扩散方法快速确定细菌菌株抗菌敏感度的用途。将含有已知浓度抗生素的圆片置于含有大量来自微生物纯培养物的细胞的平板上。抗生素由圆片扩散而出，以圆片为中心形成抗生素浓度的一个放射状梯度(即越接近圆片，抗生素浓度越高)。高抗性菌株可以在圆片存在下生长，即使是在抗生素浓度最高的圆片边缘也不例外。较小抗性的菌株则生长在环绕圆片的一个抑制区之外。抑制区的宽度与对菌株的抗生素抗性水平相关。
抑制区传统地是通过培养过夜后利用肉眼进行测定。本实施例证实了通过利用非放大性大范围成像检测微集落生长，可以在几小时内便确定所形成的抑制区的能力。
实验方法：将实施例13中采用并描述的菌株稀释至106CFU/ml后，平板接种于TSA培养基上。继而将一个四环素扩散圆片(HardyDiagnostics；30μg四环素，cat.no.Z9121)置于该平板上。于37℃培育平板5小时。与上述实施例相同，利用微集落自身荧光性和非放大性大范围成像使微集落成像。
结果：图21显示了利用非放大性大范围成像快速检验抗菌敏感度的结果。以CCD为基础的成像仅于5小时后便可在抗生素扩散圆片附近检测到生长的自身荧光抗性集落。该抑制区与通过培养过夜目测检查所获的结果是可以比较的。该实验结果显示基于微集落生长检测抑制区比传统圆片扩散方法更为快速，并且可以获得可比较的结果。
变化：本技术可以采用大部分抗生素扩散圆片和大部分微生物。
实施例15利用E-testTM和非放大性大范围成像的快速抗微生物敏感度检验
目标：本实施例证实本发明利用E-testTM抗生素实验条带快速确定细菌菌株的抗生素敏感度的用途。该E-testTM条带含有一定范围浓度的四环素，使用户可以利用一个条带便确定抑制实验细菌生长所需的最低抗生素浓度。该最小抑制浓度是基于对无生长发生区域的目测，该区域被称为抑制区。抑制区传统地是通过培养过夜后利用肉眼测定。该实施例证实了通过利用非放大性大范围成像检测微集落生长，可以在几小时内便确定抑制区的能力。
实验方法：将实施例13中采用并描述的菌株稀释至106CFU/ml后，平板接种于TSA培养基上。继而将E-testTM条带(Hardy Diagnostics：0.016～256μg四环素，cat.no.51002258)置于该平板上，并于37℃培育平板5小时。与上述实施例相同，利用微集落自身荧光性和非放大性大范围成像使生长在实验条带上或相邻位置的微集落成像。
结果：图22显示了利用非放大性大范围成像快速检验抗菌敏感度E-testTM的结果。非放大、大范围成像检测到在E-testTM抗生素实验条带附近生长的自身荧光抗性微集落。生长5小时后便可以测定抑制区，且该抑制区与培养过夜后所观测到的抑制区是可比较的。本实验结果显示利用非放大性大范围成像检测微集落是一种快速、灵敏的方法，并且大大缩短了E-testTM实验获得结果所需的时间。
变动：含有多种抗生素的E-testTM条带均可应用本技术。
其它实施方案
本申请中参考的所有专利、专利应用和出版物均引入在此，作为参考。从于此公开的本发明的说明书和实践的考虑出发，对本领域技术人员而言，本发明的其它实施方案将是显而易懂的。说明书与实施例应当被认为仅是示范性的，下述权利要求指明了本发明的实际范畴与精神。可以被本文所描述方法采用的其它实施方案的实施例见提交于2002年9月6日，标题为“RAPID AND SENSITIVE DETECTION OFCELLS AND VIRUSES”的美国申请No.___________，和提交于2002年9月6日，标题为“RAPID AND SENSITIVE DETECTION OFMOLECULES”的美国申请No.___________，两篇专利均被引入在此作为参考。
其它实施方案在权利要求中。
权利要求为：

Claims (108)

1.一种检测样本中活的靶细胞的方法，该方法包括如下步骤：
(a)将该样本中存在的活的靶细胞以每平方毫米检测面积不超过100个靶细胞的密度提供在包括检测面积在内的检测区中，其中在该检测区内，所述细胞是随机分散且固定的；
(b)所述靶细胞通过原位复制形成一个或多个微集落；和
(c)检测所述一个或多个微集落；
其中所述检测面积的最长线性维度大于1mm；所述一个或多个微集落在至少两个正交维度上具有不超过50微米的平均量度；所述一个或多个微集落中的细胞在检测之后保留了复制能力。
2.权利要求1的方法，其中所述靶细胞是以每平方毫米检测面积不超过10个靶细胞的密度随机分散在检测区内。
3.权利要求1的方法，其中所述靶细胞是以每平方毫米检测面积不超过1个靶细胞的密度随机分散在检测区内。
4.权利要求1的方法，其中所述检测方法检测了检测面积中的单个微集落。
5.权利要求1的方法，其中所述检测方法检测了重叠或相邻的微集落。
6.权利要求1的方法，其中所述检测不要求超过5x的放大倍数。
7.权利要求1的方法，其中所述检测不要求超过2x的放大倍数。
8.权利要求1的方法，其中所述检测不要求超过1x的放大倍数。
9.权利要求1的方法，其中所述检测不要求超过0.2x的放大倍数。
10.权利要求1的方法，其中所述一个或多个微集落中的平均细胞数量不超过50,000。
11.权利要求10的方法，其中所述一个或多个微集落所含细胞不超过10,000。
12.权利要求10的方法，其中所述一个或多个微集落中的平均细胞数量不超过1000。
13.权利要求10的方法，其中所述一个或多个微集落中的平均细胞数量不超过100。
14.权利要求10的方法，其中所述一个或多个微集落中的平均细胞数量不超过10。
15.权利要求10的方法，其中所述一个或多个微集落具有最长线性尺寸不超过25微米的平均量度。
16.权利要求10的方法，其中所述一个或多个微集落具有最长线性尺寸不超过10微米的平均量度。
17.权利要求1的方法，其中所述靶细胞为细菌。
18.权利要求1的方法，其中所述靶细胞为真核细胞。
19.权利要求18方法，其中所述靶细胞为霉菌或真菌细胞。
20.权利要求18方法，其中所述靶细胞为人类、动物或植物细胞。
21.权利要求1的方法，其中所述靶细胞为人类、动物或植物的寄生物。
22.权利要求1的方法，其中所述检测方法检测并鉴定了来源自超过一种非重叠种类细胞的微集落。
23.权利要求1的方法，其中所述样本含有由多细胞生物体获得的流体或组织。
24.权利要求1的方法，其中所述样本含有动物的体液或组织。
25.权利要求1的方法，其中所述样本来源自人类。
26.权利要求1的方法，其中所述样本来源自非人类的脊椎动物。
27.权利要求1的方法，其中所述样本选自：呼吸道、泌尿生殖道、生殖道、中枢神经系统、尿、血液、皮肤、血浆、血清、唾液、创伤组织、创伤渗出物、活组织检查物、粪便、生殖道和致密组织样本。
28.权利要求1的方法，其中所述样本为血液或尿样本。
29.权利要求1的方法，其中所述样本来源自植物。
30.权利要求1的方法，其中所述样本是通过取样环境空气或水，或暴露于环境的表面、物体或生物体而获得的。
31.权利要求1的方法，其中所述样本是从选自：在人类或动物局部或内部使用的药物、化妆品、血液或其它产品生产中的原料、已完成或加工中的物料；在食品或饮料生产中的原料、加工中或已完成的物料；在医学或体外诊断装置、化学产品的生产中的原料、加工中或已完成的物料；工业表面；设备；和机械装置的材料中获得。
32.权利要求1的方法，其中所述检测区是与含有一种或多种有利于靶细胞复制的物质的液体培养基相接触的。
33.权利要求1的方法，其中所述细胞直接沉积于固体或半固体生长培养基上。
34.权利要求1的方法，其中在步骤(a)之前，利用选择方法将一个或多个所述靶细胞与选择部分的复合体沉积在所述检测区中，其中所述选择方法选自磁选择、离心、沉淀和过滤。
35.权利要求34的方法，其中在步骤(a)之前，使所述靶细胞与靶细胞特异的磁性选择部分接触，继而利用磁力将一个或多个所述靶细胞与所述选择部分的复合体沉积在所述检测表面上。
36.权利要求35的方法，其中所述靶细胞特异的磁性选择部分含有可与种类结合分子结合的磁性颗粒。
37.权利要求34的方法，其中所述靶细胞是在液体中与平均密度大于所述液体平均密度的靶细胞特异的选择部分接触，其中一个或多个所述靶细胞与所述选择部分的复合体随后通过重力、离心或向心力被沉积在所述检测表面上。
38.权利要求1的方法，其中所述靶细胞是利用选自磁选择、离心、沉淀和过滤的选择方法被沉积在所述检测区中，其中未应用选择部分。
39.权利要求1的方法，其中在步骤(a)之前，所述样本经过处理，以使所述样本液化和/或均质化。
40.权利要求1的方法，其中在步骤(a)之前，所述样本经过处理，以除去除了所述靶细胞以外的物质或物体。
41.权利要求1的方法，进一步包括确定一种或多种物质或处理对所述靶细胞的一种或多种属性的影响。
42.权利要求41的方法，其中所述属性为进行细胞复制的能力。
43.权利要求41的方法，其中所述一种或多种物质存在于用于支持所述靶细胞复制的培养基中。
44.权利要求41的方法，其中所述属性为所述靶细胞在无菌处理后进行复制的能力。
45.权利要求41的方法，其中所述属性为所述靶细胞在一种或多种潜在的复制抑制物的存在下复制的能力。
46.权利要求41的方法，其中所述靶细胞为细菌、真菌、寄生物或培养的细胞，所述物质为抗菌剂、抗真菌剂或抗寄生物剂。
47.权利要求45的方法，其中所述一种或多种抑制物为抗微生物化合物。
48.权利要求45的方法，其中所述一种或多种抑制物为抗肿瘤化合物。
49.权利要求41的方法，其中所述属性为所述靶细胞的生活力、光学特性变化、代谢或酶活力，或生物化学组成。
50.权利要求35的方法，进一步包括如下步骤：
(d)使所述靶细胞与一种或多种物质接触，或者利用一种或多种处理方法处理所述细胞；以及
(e)确定所述一种或多种物质或所述一种或多种处理方法对所述靶细胞的一种或多种属性的影响。
51.权利要求1的方法，其中所述检测区包括选自玻璃、塑料、微量滴定板孔表面、吸水膜、塑料条带、毛细管表面、显微射流室表面和显微射流通道表面的材料。
52.权利要求1的方法，其中所述微集落中所述细胞的复制在所述检测之后是持续的。
53.权利要求1的方法，其中步骤(c)包括至少两个循环，每个循环包括一个时间段，所述时间段内细胞进行了复制，并继而进行检测步骤。
54.权利要求1的方法，进一步包括采用一种或多种其它样本重复步骤(a)～(c)的步骤，其中所述重复是自动进行的。
55.权利要求54的方法，其中所述样本是被自动加载进包括检测器在内的设备中。
56.权利要求54的方法，其中所述样本被自动沉积在一系列检测区内，所述一系列检测区是物理相连的，并且被自动且相继地加载进包括检测器在内的设备中。
57.权利要求1的方法，其中所述检测包括照射一个或多个微集落以产生可检测信号。
58.权利要求57的方法，其中所述检测方法检测了因所述一个或多个微集落的照射所引起的光发射、散射、反射或吸收。
59.权利要求1的方法，其中所述检测方法检测了荧光。
60.权利要求59的方法，其中所述荧光是由所述微集落所发射的自身荧光。
61.权利要求57的方法，其中所述照射应用了一个或多个激光器。
62.权利要求57的方法，其中所述照射应用了一个或多个发光二极管。
63.权利要求57的方法，其中所述照射应用了白光源。
64.权利要求57的方法，其中所述照明是经过一个或多个仅可透过选定波长的光的光学滤光器。
65.权利要求1的方法，其中所述检测方法检测了所述一个或多个微集落不依赖于添加发信号部分或种类结合分子的特性。
66.权利要求1的方法，进一步包括在步骤(c)之前或期间，采用发信号部分标记所述一个或多个微集落的步骤，其中步骤(c)中的检测方法检测了由发信号部分产生的信号。
67.权利要求1的方法，进一步包括在步骤(c)之前或期间，使所述样本与发信号部分接触的步骤，所述发信号部分与所述靶细胞直接或间接相连。
68.权利要求67的方法，其中所述发信号部分是与种类结合分子相连的。
69.权利要求1的方法，进一步包括在步骤(c)之前或期间，在允许所述种类结合分子与位于一个或多个所述靶细胞之上的一个或多个种类特异结合位点之间形成一个或多个复合体的条件下，使所述样本与种类结合分子接触的步骤。
70.权利要求69的方法，其中所述种类结合分子包括抗体、适体或配体。
71.权利要求69的方法，其中所述检测应用到可以区分不同家族的标记种类结合分子的信号标记的光学滤光器。
72.权利要求69的方法，其中所述种类结合分子直接或间接标记有一个或多个发信号部分。
73.权利要求72的方法，进一步包括在步骤(c)之前，将任何未结合的种类结合分子从所述一个或多个复合体移除的步骤。
74.权利要求69的方法，其中所述种类结合分子是种类结合分子集合的一个成员，其中所述集合包括一个特异于每个非重叠种类待检测靶细胞的种类结合分子家族。
75.权利要求74的方法，其中所述种类结合分子家族中的每一个均标记有可以发射具有独特信号种类或信号标记的信号的发信号部分。
76.权利要求75的方法，其中步骤(c)中，所述检测通过检测所述发信号部分的独特信号标记之间的差异，从而检测所述非重叠种类的靶细胞。
77.权利要求68的方法，其中所述发信号部分为颗粒或者是与颗粒物理相连。
78.权利要求67的方法，其中所述发信号部分具有荧光信号特征。
79.权利要求78的方法，其中所述发信号部分选自有机荧光团、正调节磷光体、镧系元素、量子点、从非荧光底物生成荧光产物的酶和荧光染色的颗粒。
80.权利要求78的方法，其中所述发信号部分为用于细胞的荧光染色剂。
81.权利要求67的方法，其中所述发信号部分具有生色发信号特征。
82.权利要求78的方法，其中所述发信号部分具有化学荧光发信号特征。
83.权利要求67的方法，其中所述发信号部分具有光散射发信号特征。
84.权利要求83的方法，其中所述发信号部分为共振光散射颗粒或等离子共振颗粒。
85.权利要求67的方法，其中所述发信号部分为用于染色活细胞的活性染色剂。
86.权利要求74的方法，其中所述种类结合分子集合具有的家族复杂度为1。
87.权利要求74的方法，其中所述种类结合分子集合具有的家族复杂度大于1。
88.权利要求87的方法，其中所述集合具有的家族复杂度≥5。
89.权利要求67的方法，其中所述发信号部分包含一种或多种化合物，所述化合物只有与所述靶细胞相连才是可检测的，所述靶细胞组成或所述靶细胞生理学、物理学或微环境状态对所述发信号部分起作用。
90.权利要求1的方法，其中所述复制与所述检测发生在特定器皿内，所述器皿被构建为可以避免其它细胞进入或者样本中的细胞逸出。
91.权利要求1的方法，其中所述复制与所述检测发生在特定器皿内，所述器皿具有用于自动跟踪样本的条形码或等效标记。
92.权利要求1的方法，其中所述复制与所述检测发生在具有记录标记的表面上，所述记录标记有利于相同表面的多个图象的排列定位。
93.权利要求1的方法，其中所述检测方法检测了检测区特定范围内的对照标记或对照细胞。
94.权利要求1的方法，其中所述检测应用了适于检测照射所述靶细胞产生的信号的光学滤光器。
95.权利要求1的方法，其中所述检测应用了光电检测器。
96.权利要求1的方法，其中所述检测应用了光电阵列检测器。
97.权利要求96的方法，其中所述光电检测器包括CCD检测器。
98.权利要求1的方法，其中所述检测未应用图象增强器。
99.权利要求1的方法，其中所述检测应用了光电倍增管检测器。
100.权利要求1的方法，其中所述检测应用了光电二极管检测器。
101.权利要求1的方法，其中所述检测应用了感光底片。
102.权利要求1的方法，进一步包括在步骤(c)期间或之后，确定微集落数量的步骤。
103.权利要求1的方法，进一步包括在步骤(c)期间或之后，通过利用图象分析软件分析所述检测面积的图象，确定所述靶细胞种类的步骤。
104.权利要求1的方法，进一步包括在步骤(c)期间或之后，通过利用图象分析软件分析所述检测面积的图象，确定所述一个或多个微集落在检测区中的定位。
105.权利要求104的方法，进一步包括在步骤(c)期间或之后，比较单个微集落在检测区中的定位与之前确定的相同微集落的定位的步骤。
106.权利要求105的方法，其中所述图象分析软件包括从不随时间改变尺寸的目标中辨别出可以随时间改变尺寸的目标所用的算法。
107.权利要求102的方法，其中所述测定包括分析所述检测面积的图象。
108.权利要求44的方法，其中所述无菌处理选自热灭菌、辐射、暴露于毒气、消毒剂处理。
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