CN104471382B - 热对比测定和读取器 - Google Patents

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Abstract

公开了一种结合热对比读取器使用的测定。在所述测定中，测试试条包括如果样品中存在目标分析物则可以发生热响应的材料。所述热对比读取器包括壳体，具有用于在测试位置处接收测试试条的开口；能量源，针对测试位置；以及热传感器，针对测试位置。热传感器配置为：如果目标分析物存在于样品中，则当在测试位置处激发热源时，感测测试试条的发热。热传感器可以使用与传感器输出相耦接并被配置为提供诊断输出的诊断电路，提供传感器输出。诊断输出可以根据传感器输出，指示患者的诊断状况。本公开还包括检测目标分析物的方法以及包括侧向流测定和热对比读取器的试剂盒。

Description

热对比测定和读取器
技术领域
本发明涉及用于在样品中检测分析物的测定和读取器。更具体地，本发明涉及基于热对比进行操作的测定和读取器。
背景技术
LFA(侧向流测定或侧向流免疫测定，也称作快速诊断测试——RDT或生物测定)技术在实验室环境内外都得到了广泛的应用。在典型的测定中，向测试试条施加来自患者的流体样品。样品与测试试条上的化学物质进行反应，导致试条光学上改变特性。人们可以观察到视觉指示，例如，使用家庭妊娠测试。然而，可以使用测定读取器来获得更准确的读数。例如，这种读取器可以包括光学敏感传感器，相较于人类观察者，能够以更可重复的方式更准确地感测光学变化。在于2007年11月20日授权的Polito等人的美国专利No.7,297,529中示出了典型的测定读取器的一个示例。
快速识别疾病的能力支持及时治疗，并改善结果。这种可能性增加了对快速医疗点诊断设备或系统的开发和使用，所述快速医疗点诊断设备或系统能够在来源丰富环境和资源有限环境中进行生物分子检测。LFA便宜、简单、便携和鲁棒，因此令LFA在医疗、农业和非处方个人使用中很常见，例如，用于妊娠测试。LFA还被广泛地用于大量传染病，例如，疟疾、AIDS相关的隐球菌脑膜炎、肺炎球菌性肺炎以及最近的结核病。
尽管一些LFA的分析性能可与基于实验室的方法相媲美，然而大多数LFA的分析灵敏度(备选地，称作检测极限)在mM到μM的范围，该灵敏度明显低于其它分子技术(例如，酶联免疫测定(ELISA))。因此，当抗原水平较低时，LFA并非特别有助于病理过程的早期检测。由于基于微流体、生物条形码和酶的测定技术可能可以在nM到pM的范围内进行检测，所以研究关注于开发这些测定技术，以便在抗原检测中获得更高的灵敏度。然而，所有这些方法仍处于开发阶段，没有证实能够以可靠、经济有效的方式执行所述方法以由终端用户在医疗站点中使用。
众所周知，材料的光、热和电特性在纳米尺度上大幅改变。具体地，可以将金属纳米颗粒的增强的光热特性用于：恶性肿瘤的热切割、检测循环肿瘤细胞、光热基因转染、增强化学疗法的治疗效率以及用于跟踪纳米颗粒在细胞内的转移。
发明内容
在一个方面，本发明涉及一种热对比测定读取器。所述热对比测定读取器包括：能量源；传感器；I/O电路；以及开口，用于接收测定试条。读取器被配置为当在测定试条的测试区域上激活能量源时将传感器结果转换为输出信号。
在另一方面，本发明涉及一种包括测定系统的测定试剂盒(kit)。所述测定试剂盒包括：样品垫；测试试条；纳米颗粒，与分析物结合分子缀合；测试区域；对照区域；以及吸收垫，配置为当施加样品时进行流体连通。所述试剂盒还包括热对比测定读取器。
在另一方面，本发明涉及一种检测样品中的分析物的方法，所述方法包括：在将测定系统的测试试条与样品接触之后，向能量源暴露测定系统中的测试试条的测试区域。样品由于毛细管作用而移动通过所述测试试条，所述测定系统包括：纳米颗粒，与在样品中结合分析物的分析物结合分子缀合；以及测试区域，包括捕获分子。所述方法还包括通过传感器测量在测试区域中产生的热，以检测测试区域中存在或不存在所述分析物。
附图说明
图1是示出了侧向流测定测试试条和读取系统的简化图。
图2A是便携式测定读取器的简化框图。
图2B是台式测定读取器的简化框图。
图3是图2A的测定读取器的简化框图。
图4A和4B是示出了LFA相对于时间的热量响应的图。
图5是示出了在热对比测定中使用金纳米颗粒(GNP)的图。
图6是示出了热对比如何增强现有免疫色谱侧向流测定对隐球菌抗原(CrAg)的检测的图。高浓度下信号的稳定阶段是由于LFA的高剂量钩状效应。虚线示出了来自对照样品的背景。
图7A是针对不同纳米颗粒形状的纳米颗粒浓度相对于温度变化的图。
图7B是针对不同材料的温度变化的图。
图8A是hCG(人体绒毛膜促性腺激素)的热对比测定的结果的图片示意表示。
图8B是hCG的热对比测定的结果的图。
图9是疟疾抗原的热对比测定的结果的图。
图10A和图10B是示出了使用SAR的图。
图11是使用SAR的hCG的热对比测定的结果的图。
图12A、12B和12C是分别示出了在CrAg量杆、hCG量杆和合成GNP内的GNP的多分散性的图。
图13是示出了均匀尺寸的合成GNP的图。
具体实施方式
本发明涉及结合热对比读取器使用的测定系统。本发明还涉及用于使用热对比测定和读取系统来检测样品中的分析物的方法。本发明包括测定测试试条，所述测定测试试条展示出响应于暴露给样品中可能存在的特定目标化合物而改变的热特性。本发明包括用于读取这种测试试条的热特性的读取器。下文更详细地讨论了本发明的多个方面。
热对比测定系统是配置为结合热对比读取器运作的测定。有利地，可以将热对比测定系统用于检测样品中的分析物，与使用视觉读取器的测定相比，所述热对比测定的分析物可以具有更低的浓度。热对比测定系统可以是对多种样品中的分析物的高灵敏度检测系统。有利地，与使用视觉检测方法的相似LFA相比，能够实现在更早阶段检测疾病或状况。此外，所述方法的简单性支持终端用户方便并准确地使用该系统。所述系统非常适合医疗点设施和资源有限环境。这里所述的实施例涉及可以用于扩展临床使用的LFA的灵敏度、动态范围和量化的热对比测定系统。
本发明还包括试剂盒，其中所述试剂盒包括这里所述的热对比读取器和测定系统。可以通过终端用户使用所述试剂盒以使用测定系统处理所需样品，然后使用热对比读取器检测目标分析物和/或目标分析物的量。试剂盒可以包括与使用所述试剂盒相关的指令。
本发明总体上涉及纳米颗粒的激光激发，然而应认识到电磁激发的其它实施例也在本发明的范围内。这里所指的纳米颗粒的激光(或光)激发是指激发纳米颗粒以产生能够由红外或其它热传感器读取的热，应理解其它实施例也是有可能的并仍在本发明的范围内。将与传感器输出相耦接的诊断电路配置为根据传感器输出提供对患者的诊断状况的诊断输出指示。
可以将这里所述的测定系统用于使用与分析物结合分子缀合的纳米颗粒，检测样品中的目标分析物。具体地，可以有效地使用测定中的纳米颗粒，将输入光转换为热。在测定中，将膜与可能包含分析物的样品相接触。当样品移动通过所述膜时(通常由于毛细管作用)，与分析物结合分子缀合的纳米颗粒结合目标分析物以形成纳米颗粒/分析物络合物。这里所用的“纳米颗粒/分析物络合物”是指与分析物结合分子缀合的纳米颗粒，所述分析物结合分子已经结合了来自样品的分析物。纳米颗粒/分析物络合物继续移动通过所述膜，移向包含结合所需分析物的捕获分子的测试区域。通过捕获分子结合纳米颗粒/分析物络合物，并将其保留在测试区域。然后可以将这里所述的热对比读取器用于检测存在或不存在所述分析物。此外，热对比读取器还可以量化在测试区域中存在的分析物(即，样品)的量。热对比读取器通常包括热源和如下文所述配置的热传感器。
测定系统(即，LFA)通常包括：样品垫；膜；纳米颗粒，与分析物结合分子缀合；以及针对分析物的捕获分子。LFA系统还可以包括：缀合垫；吸收垫；背衬垫；测试区域；对照区域；和/或所有这些组件的组合。测试区域通常包括分析物捕获分子。对照区域可以包括例如对照抗体等对照分子。缀合垫通常包括与分析物结合分子缀合的纳米颗粒。
这里所用的“膜”是指使用膜和一个或多个试剂检测样品中的目标分析物的测试设备或试条。可以可替换地使用“膜”和“测试试条”。
可以结合热对比读取器使用的测定包括侧向流测定。用于执行侧向流测定的多种配置在本领域是公知的，例如在Kaylor等人的美国专利公开US 2003/0119202和Mehra等人的美国专利公开No.US 2010/0136566中描述了所述配置，通过引用将所述专利合并于此。图1示出了一个示例实施例，用于执行侧向流测定的其它配置是本领域所公知的，并也在本发明的范围内。
图1是示出了根据本发明的侧向流测定测试和读取系统98的示例实施例的简化图。测试试条100包括样品垫102，配置为接收来自患者的样品104。毛细管作用导致样品104从样品垫102沿箭头所示方向向吸收垫108流动。样品104流经缀合垫110并流经膜112，直到到达测试区域114。还提供了分离的对照区域116。测试试条100、样品垫102、吸收垫108、缀合垫110、测试区域114和对照区域116都是流体连通的。这里所述的“流体连通”是指液体在所述材料或表面之间流动或行进的能力。
如图1的插图所示，测试区域的示例实施例可以包括与在测试区域114处和抗原相结合的单克隆抗体关联的金纳米颗粒。可以通过施加能量120引起测试区域114发热，来确定结合在测试区域114内的结合金纳米颗粒的量。针对测试区域114的热传感器122测量测试区域114的发热，所述发热与纳米颗粒的量相关，从而与测试区域114中存在的抗原的量相关。如下文详细所述，可以将这种方法用于诊断患者的状况。能量120可以是引起测试区域114发热的任何形式的能量。可以将能量源120和传感器122容纳在一个单元中。备选地，可以分离地容纳能量源120和传感器122。
在如图1插图所述的实施例中，将分析物结合分子和捕获分子示出为单克隆抗体。分析物结合分子和捕获分子可以是相同类型的分子，即，抗体。在这种情况下，优选地，它们在不同部位结合分析物，换言之，分析物结合分子和捕获分子优选地不结合分析物的相同部位或表位。备选地，分析物结合分子和捕获分子可以是两种不同分子，但是二者能够在不同部位结合分析物。
在上述示例实施例中，在将试条浸入临床标本或与临床标本相接触之后，涂覆抗体的GNP由于毛细管作用在硝化纤维素试条内移动。当存在目标抗原时，目标抗原与涂覆单克隆抗体的GNP相结合。当通过膜上识别抗原-抗体-GNP络合物的抗体将这种结合络合物捕获时，结合络合物停止通过毛细作用在“量杆”上移动。这导致在LFA测试区域114处累积GNP，产生阳性测试结果。由于GNP的尺寸可以设计为迁移通过膜112的孔，可以方便地向GNP涂覆抗体，以及GNP与可见光具有强烈地反应，从而产生便于可视化的深色，因此将GNP用于LFA。可以将与其它光波长的光具有强烈反应的GNP用于热对比检测，例如，在近红外下具有最大光吸收的金纳米棒。
图2A是根据本发明的一个示例实施例的便携式测定读取器200的简化框图。读取器200包括在其中具有开口204的壳体202，配置为在狭槽或支架206中接收LFA 100。在图2A中，激光220产生导向LFA 100的测试区域中的能量120。在图2A中，能量可以是例如可见光或近红外光，使用备选的透镜222将光聚焦于测试区域。如上所述，导向纳米颗粒的可见光或近红外光可以引起纳米颗粒发热。使用例如红外传感器的传感器122对其进行检测。可以将测试结果显示在显示器230上，显示器230可以包括例如LCD显示器。显示器可以提供定量输出或定性输出，例如，简单的通过/失败指示。提供了备选的用户输入232。例如，所述输入可以是允许操作员发起测试的单个按钮，或可以是更复杂的输入，例如数字键盘或具有数字键盘，所述数字键盘允许操作员更新参数，例如，由设备200使用的阈值。所述输入232可以是显示器230上的覆层，以提供触摸屏。
如下文所详述，通过电子电路240控制设备200的操作。例如，所述设备可以包括微处理器、模数转换器、I/O电路等。提供了电源242。优选地，电源242是便携式电源，例如，电池等。备选地，可以通过与其它电源的连接或使用太阳能电池等，来对所述电源进行再充电。
附加地，设备200包括如下文所详述的输入/输出(I/O)电路310。I/O电路310允许将设备200收集的数据传输或提供给其它设备。例如，可以收集并向中心位置或云服务器发送测试结果，以便进行后续评估。
图2B是以“台式”结构配置的测定读取器200的简化框图。在图2B的配置中，标识为PC的计算机用于执行测试。PC 260通过I/O电路262耦接到激光器220和红外传感器122。例如，I/O电路262可以包括数模转换器、模数转换器、可切换输出等。典型地，图2B所示的PC260的计算能力比便携式设备中可用的计算能力强。这样可以允许执行附加测试或更高级的测试。
尽管可以采用任何合适的组件，然而在一个优选实施例中，所述源220包括激光器，例如，532nm绿色激光器(即，LRS-0532-PFM_00200-03，LaserGlow Technologies Inc)。聚焦光学器件222可以包括例如平凸式聚焦透镜。适合的红外传感器包括红外摄像机(A20或E30，FLIR Inc)或红外传感器(MLX90614，Melexis)。然而，本发明不限于这种配置。
图3是设备200的简化框图，包括根据存储在存储器302中的指令进行操作的微处理器300。微处理器300通过激活能量源电源302来控制能量源220。通过向模数转换器304提供输出的热传感器122检测LFA(图3未示出)的发热。提供了可选的试条传感器306。可以将试条传感器306配置为检测狭槽206中是否存在LFA 100，从而允许微控制器300激活能量源220并开始测试。
图3示出了与电源242相连的可选的再充电电路308。这可以允许例如使用外部电源、太阳能电池、机械曲柄等，对电源242进行再充电。
输入/输出电路310还示出为与微处理器300相耦接。这可以包括任何类型的输入或输出设备，包括显示器、键盘或手动输入、音频输出、数字输出，例如USB或Ethernet连接、RF(射频)或IR(红外)输入和/或输出、蜂窝数据连接、Ethernet连接等。示例RF连接包括但不限于连接，或其它短距离通信技术、WIFI连接等。蜂窝电话连接允许设备使用蜂窝电话网络进行通信，以传输数据和/或提供可选语音通信。所述数据可以包括测试结果和地理信息(GPS位置)，以收集关于传染病的时空信息。
使用I/O 310允许将通过设备200收集的数据发送到其它位置。例如，当在现场使用时，设备200可以将测试结果回传到中心数据库。可以通过任何适合的技术来进行这种传输。例如，可以通过Internet连接、经由蜂窝网络等来发送所述数据。所述连接可以需要物理的有线连接或可以使用WIFI、Bluetooth等进行无线连接。此外，I/O可以用于更新存储在存储器302中的信息。例如，可以更新编程指令、校准信息或其它数据。I/O 310还可以用于使用显示器230和/或输入232与远程的操作员进行通信。
在操作期间，将LFA 100(图3未示出)置于壳体202中，例如，通过狭槽204(如图2所示)。由微处理器300响应于来自试条传感器306的信号或一些其它触发(例如，使用输入/输出电路310的手动输入)，发起测试过程。在一个配置中，提供并通过微控制器300控制可选步进电机307。步进电机307可以用于令LFA 100在设备200中的移动自动化。如果需要监控LFA 100在设备200中的位置，则可以使用多个试条传感器306或其它配置。微处理器300向能量源200施加电力，从而加热LFA 100。通过传感器122感测发热响应，并使用模数信号转换器304将发热响应转换为数字信号。基于这种数字化的信号，微处理器300使用输入/输出电路310提供指示测试结果的输出。
此外，图3示出了反馈传感器303，布置在源220的路径中以便感测所施加的能量的强度。通过模数转换器305将来自反馈传感器303的输出提供给处理器300。例如，传感器303可以是用于感测来自激光器220的输出的强度的光传感器。可以将该信息用于校准所述设备的操作并校准感测的热量。此外，可以将反馈用于诊断目的，以便检测输出微弱信号或完全失灵的源220
由微处理器使用存储器302，以短期或长期存储信息。例如，可以将设备200的寻址信息320存储在存储器302中。所述地址可以是例如唯一识别或半唯一识别设备200的地址，可以包括但不限于互联网协议(IP)地址、Mac地址或其它地址格式。还可以将存储器302用于存储校准信息，所述校准信息可以用于校准从传感器122接收到的数据。可以以多种方式确定校准信息，例如包括：在制造设备期间使用电路310的输入，或基于使用LFA 100(例如，使用图1所示的校准区域116)执行的校准。这种校准信息可以向由传感器122提供的读数提供基线或其他类型的偏移。存储器302还包括用于控制微处理器300的操作的操作指令324。
图4A和4B是示出了当施加能量120时LFA 100的发热响应TS的图。发热量到达由RM指示的最大值。此外，如图4A和4B所示，所述响应的斜率开始成最陡上升，缓慢地平稳到最大等级RM。微处理器300通过分析对所施加能量信号的发热响应而操作为诊断电路。例如，可以使用简单的阈值等级，其中将最大响应与阈值等级进行比较。可以将其提供为输出，例如，基于比较的“通过/失败”输出。此外，可以基于最大响应等级来提供定量输出。这种定量输出可以示出在测试位置114(图1所示)处捕获到的金纳米颗粒的量。这可以与抗原的量相关，从而与患者内疾病的进度相关。
在本发明的一个方面，诊断是基于响应的轮廓的。例如，如图4A和4B所示，示出了响应的初始斜率。基于所述初始斜率，有可能外推RM的值，而不必允许加热到所述最大值。可以将这种技术用于加快测试过程的速度。此外，还可以将所述信息用于验证传感器122检测到的RM值。例如，如果外推出的RM值明显不同于测量的RM值，则可能指示了组件故障、测试试条受损或测量中的一些其它误差。此外，如上所述，校准信息可以用于改善测量的准确度。例如，校准信息可以提供基线响应，基线响应与所述响应信号比较。因此，可以基于校准信息调整响应阈值等级。
能量源220可以是任何适合的能量源。在一个优选实施例中，能量源220包括激光器。在本领域中公知的多种激光器用作热源，所述多种激光器可以是例如连续波激光器、脉冲波激光器或尺寸缩小的激光器。可以通过使用更高功率的激光器和/或针对不同浓度的GNP调谐激光功率以便扩展动态范围，来增加热对比灵敏度。激光器可以发射可见范围中的光。还可以使用发射近红外区域的光的激光器。通常，选择并调谐激光器，以最大化纳米颗粒中的吸收，同时最小化来自背景材料的干涉。可以改变在LFA系统中使用的激光功率的量，所述激光功率的量取决于测定的成分。在示例实施例中，激光功率在大约5W和50W之间(连续波激光器)。然而可以在其它实施例中使用更高或更低的能量等级。例如，脉冲激光器内可以施加更低的总能量但是更高的能量密度。由于下文所述背景吸收的降低，可以使用更高的激光功率，以进一步改善灵敏度和信号强度。
通常，膜和背衬包括具有最小光吸收的材料。背景发热限制了使用更高能量来获得更高信号强度的能力。通过选择具有最小光吸收的材料，可以降低背景热读数，以确保热检测来自于测试区域中的纳米颗粒，而不是来自测定系统的材料。LFA系统中的膜通常是包含多个空隙或孔的多孔材料。通常，液体可以由于毛细管作用流经这些空隙或孔。多孔材料可以由自然物质或合成物质构成。在LFA系统中使用的适合多孔材料可以包括例如硝化纤维素、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚乙烯、尼龙、醋酸纤维素、聚酯、聚醚砜(PES)、聚砜等。优选实施例使用具有最小光吸收的膜。还可以使用本领域公知的其它多孔材料。多种背衬在本领域是公知的，主要提供对LFA的结构支撑。为了热对比检测，具有最小光吸收的材料优选为这里所述LFA的背衬。在一个优选实施例中，背衬可以由玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯)构成。样品垫可以由多种材料制成，例如包括聚酯、聚丙烯酸、其他聚合材料或玻璃纤维。缀合垫和吸收垫可以由例如纤维素材料等构成。
金属纳米颗粒在受到光学激发时产生热。该产生热是由于在从激发态到基态的跃迁期间金属介质界面处的表面等离子体导致的。可以通过下式描述由GNP产生的热量：
Q＝NQnano＝NCabsI 式(1)
其中总发热(Q，W/m3)是单个GNP(Qnano)(写为GNP浓度(N，#/m3，其中#表示颗粒的数量)、GNP吸收截面面积(m2)和激光强度(W/m2)的乘积)的组合贡献。
纳米颗粒可以包括多种材料、形状和尺寸。纳米颗粒可以是金纳米颗粒、银纳米颗粒、铜纳米颗粒、铂纳米颗粒、铝纳米颗粒、镉纳米颗粒、合成颗粒(即，银和金)、石墨烯纳米颗粒等。在优选实施例中，LFA测定系统包括金纳米颗粒。还可以采用其他类型的纳米颗粒，且仍在本说明的范围内。在备选实施例中，可以使用两个或多个类型的纳米颗粒的组合。纳米颗粒的组合可以用于识别多种分析物，或放大或增强信号。
纳米颗粒可以包括多种尺寸，通常纳米颗粒必须能够通过膜。优选地，纳米颗粒的直径的范围可以从10nm到200nm。对纳米颗粒尺寸的选择和优化部分地取决于能量吸收。对于将激光器作为能量源并具有金纳米颗粒的一个优选实施例，所谓的等离子体共振的物理现象增强了光学吸收效率，因此增强了热产生。可以使用直径高达约100nm的金纳米颗粒。更大尺寸是可用的，并且在本发明的范围内也可以使用并包括更大尺寸。在一些实施例中，尺寸大约为40-80nm的GNP具有较高的吸收效率(定义为Qabs＝Cabs/A，其中Cabs是吸收横截面面积，A是颗粒的投影横截面面积)，因此，从产生热的角度，所述尺寸的GNP是优选的。
可以在这里所述的LFA系统中使用多种形状的纳米颗粒，都在本发明的范围内。纳米颗粒可以是例如纳米球、纳米棒、纳米壳、纳米立方体、纳米胆体、纳米棱锥体、纳米星形体等。在优选实施例中，纳米颗粒是纳米球、纳米棒和/或纳米壳。可以使用这些形状的纳米颗粒中的任何纳米颗粒。具有最高光学吸收效率的纳米颗粒是优选的，所述最高光学吸收效率相对其他特性在测定中发挥作用。对于具有非球形的颗粒，可以使用有效半径(具有等同体积的球体)来计算吸收效率。
如针对CrAg和hCG量杆的图12A-C和13所示，不好控制在现有LFA中使用的GNP的多分散性。对多分散性的更好控制导致更均匀的纳米颗粒尺寸分布。这可以导致热对比检测的更小标准偏差，因此，改善了信号稳定性和一致性。更均匀的纳米颗粒还可以给予更高的光学吸收并热产生。例如，具有不同尺寸的GNP在不同波长处具有峰值吸收。对于多分散的GNP群体，较少的GNP将在峰值吸收波长处产生热，因此，降低了所产生的热的量。在纳米颗粒的样品中，与纳米颗粒簇相比，良好分散的均匀尺寸的纳米颗粒是优选的。纳米颗粒的簇集会导致纳米颗粒的更不均匀的吸收。可选地，可以对纳米颗粒进行涂覆以便降低簇集，从而增加吸收的均匀性。如果存在涂层，则优选地，所述涂层不降低纳米颗粒内的吸收能力。
纳米颗粒的尺寸分布可以改变。在一些实施例中，至少大约60％的纳米颗粒在纳米颗粒的平均直径的+/-10nm的范围内。优选地，至少大约70％的纳米颗粒在纳米颗粒的平均直径的+/-5nm的范围内。更优选地，至少大约70％的纳米颗粒在纳米颗粒的平均直径的+/-3nm的范围内。再优选地，至少大约75％的纳米颗粒在纳米颗粒的平均直径的+/-3nm的范围内。这些范围外的纳米颗粒也在本发明的范围内。
可以根据具体测定、具体纳米颗粒、分析物结合分子等，改变LFA系统中使用的纳米颗粒的量或浓度。通常，纳米颗粒的量可以大约在1-100μg的量级上。还可以使用该范围外的纳米颗粒，并仍在本发明的范围内。对于一个实施例，CrAg测定使用每LFA大约4μgGNP。根据结合分子的结合亲和性、患者样品中目标分析物的浓度范围以及其它因素，所用的纳米颗粒的量可以高于或低于指定范围。
可以确定多种样品中的分析物，通常可以是任何类型的液体样品。样品可以是生物样品、化学样品、环境样品、食物样品等。生物样品可以包括例如血液、血浆、血清、尿液、汗液、胆汁、脑脊液、粪便、阴道分泌物、唾液等。还可以分析其它生物样品，并都在本发明的范围内。可以直接使用具有分析物的样品，或使用稀释剂稀释具有分析物的样品。稀释剂可以是多种溶液，通常是本领域所公知的。在示例实施例中，稀释剂是盐水溶液。
可以使用本说明书的方法和设备检测多种分析物。目标分析物可以是蛋白质、多肽、核酸、半抗原、化学物等。分析物还可以包括：治疗性药物，滥用药物，激素，维生素，葡萄糖蛋白质，抗体，类固醇，细菌或细菌感染，真菌，病毒，寄生虫，细菌的成分和产物、过敏原、抗原等。分析物还可以包括感兴趣化合物的衍生物或代谢物。
在一些实施例中，分析物可以与疾病相关联，例如，疟疾、TB等。在其它实施例中，分析物可以与生理或病理状况相关联，例如，妊娠。分析物的示例包括：隐球菌抗原(CrAg)、疟疾抗原、结核抗原、人体绒毛膜促性腺激素(hCG)、人类促黄体激素(hLH)、人促卵泡激素(hFSF)、前列腺特异抗原(PSA)、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎抗体、HIV抗原、A族链球菌、葡萄球细菌属、STD、恶性疟原虫(P.Falciparum)、发热板等。
分析物结合分子和捕获分子可以是能够结合目标分析物的任何分子。在一些实施例中，分析物结合分子和捕获分子是生物宏分子，例如，抗体或抗体的一部分。这些分子还可以是受体、配体、多核苷酸、多肽、糖肽、脂蛋白质、核蛋白质、核苷酸、适体等。在一个示例实施例中，所述分析物结合分子和捕获分子是抗体。在一些实施例中，分析物结合分子与捕获分子相同。在其它实施例中，分析物结合分子与捕获分子不同。
用于将纳米颗粒与分析物结合分子缀合或耦合的多种方法在本领域是公知技术，所述多种方法在本发明的范围内。通常，允许在高温、高湿度或低湿度和/或辐射条件下改善稳定性的缀合化学是优选的。化学结合是指使用将颗粒与分析物结合分子相链接的化学官能团和/或分子。一个示例是在颗粒表面上放置羧酸，以允许通过碳化二亚胺介导分子与抗体上的胺基官能团相链接。缀合可以包括被动吸收。被动吸收在本领域是公知的，例如在US 2010/0136566中对其进行了公开，所述文献通过引用合并与此。
在本领域中公知多种液体调剂和喷洒技术，将捕获分子沉积到膜。可以使用这些技术中的任何技术，优选的是引起捕获分子更好吸收性和稳定性的喷洒技术。还可以将与分析物结合分子缀合的纳米颗粒喷洒到缀合垫上。在示例实施例中，来自BioDotTM的多种液体调剂仪器可以用于这些目的。
本说明书还包括检测样品中的分析物的方法。通过使用这里所述的热对比技术，可以明显改善LFA分析灵敏度，可能大于视觉检测方法的灵敏度的10,000倍。
所述方法包括：将样品与样品垫相接触，允许液体由于毛细管作用流经所述膜。与分析物结合分子缀合的纳米颗粒响应于样品应用而通过毛细管作用在所述膜内移动。当存在目标分析物时，目标分析物与缀合的纳米颗粒相结合。当测试区域中的捕获分子识别并结合纳米颗粒/分析物络合物时，纳米颗粒/分析物络合物停止穿过所述膜。这导致在LFA的测试区或区域处积累纳米颗粒/分析物络合物。所述方法还包括通过首先向例如激光器的能量源暴露测试区域，然后通过传感器测量从测试试条产生的热量，来使用热对比读取器检测并量化测试区域中分析物的量。传感器产生的输出指示了是否存在目标分析物和/或目标分析物的量。
所述方法还可以包括检测多种分析物。可以通过具有多个测试区域来检测多种分析物，其中每个测试区域具有不同的捕获分子。因此，第一纳米颗粒/分析物络合物结合到具有结合第一分析物的第一捕获分子的测试区域1，其中第二纳米颗粒/分析物络合物结合到具有结合第二分析物而不是第一分析物的第二捕获分子的测试区域2。这样，可以通过配置为包括多个测试区域，来将LFA系统扩展为识别多种分析物。还可以使用具有不同开始位置的多种纳米颗粒，检测多种分析物。纳米颗粒可以具有不同缀合以及不同的分析物结合分子。这些纳米颗粒可以调谐为不同地流经所述膜。多种分析物可以在相同样品或不同样品中。在一些实施例中，可以在相同测试区域中测试多种分析物。对多种分析物的检测导致识别对应测试区域中的每种分析物，优选地，分析物的定量数量。在一些实施例中，还可以在一个测试区域中检测和/或积累量化多种分析物。例如，使用在不同激光波长处进行吸收的不同颗粒，这允许使用具有对应波长的激光激发进行多路复用。
所述方法还可以包括通过使用对不同纳米颗粒的次级受控流动，放大所述信号。在一个示例实施例中，可以通过使用银染色法或次级结合纳米颗粒，放大来自具有主要金纳米颗粒的LFA的信号。在银染色法的过程中，金纳米颗粒可以作为成核点，以在表面上生长银壳。在次级纳米颗粒结合的过程中，次级纳米颗粒结合到捕获目标分析物的第一颗粒，以便放大信号。
本方法还包括量化测试区域中存在的分析物的量。对膜的热变化的测量可以与测试区域中存在的分析物的量相关。有利地，LFA系统可以不仅提供存在或不存在分析物，而且还提供在膜(因此，样品)中存在的分析物的等级。这特别有利于确定患者的疾病、传染病或状况的程度。
在向能量源暴露测试区域之后，可以通过测量所述膜的测试区域内的热变化或温度，来检测分析物的存在和分析物的量。备选地，还可以测量温度变化的初始速率，以确定吸收率(SAR)。SAR可以用于确定测试区域中存在的分析物的量。SAR实际上是上式1中的Q。它涉及当通过例如激光器的能量源对纳米颗粒进行激发时纳米颗粒发出的热能的量(W/m3)。如式1所示，它与激光能量密度和纳米颗粒的数目成正比，所述纳米颗粒的数目直接涉及分析物中抗原的量。
除了改善分析灵敏度之外，还可以对LFA进行存档以便将来分析。不同于其他检测方法，使用热对比系统不存在信号损失。在荧光测量中，有机荧光团经历光漂白。一些色度测量中，染料可能由于光化裂解而随着时间失去它们的信号。在执行测定的两个星期之后进行的热对比读数可能几乎相同。有利地，这允许在现场处理医疗点LFA，并安排到中心实验室，针对热对比读数来处理相同LFA系统。换言之，不必在样品运行之后立即测量分析物信号。可以多次测量信号，例如，在完成测定之后立即测量并且在随后的时间测量。所述方法还可以包括向能量源暴露测试区域，在将测定试条与样品接触后12小时、24小时或更长时间之后，测量测试区域中的分析物。
隐球菌病是所有AIDS相关机会性传染中死亡的主要原因之一，并且是在非洲成年人患脑膜炎的最常见原因，每年在世界范围内导致多于500,000人死亡。通常通过培养液、墨汁或CrAg测试的组合(连续两倍稀释)(即，CrAg滴定度，定义为当执行两倍连续稀释时最末的阳性测试)半定量地诊断隐球菌性脑膜炎。
本说明书包括用于检测和量化CrAg抗原的方法。所述方法包括：将样品与样品垫相接触，允许液体由于毛细管作用流经膜。与CrAg结合分子缀合的纳米颗粒响应于施加样品，通过毛细管作用在所述膜内移动。当存在CrAg时，CrAg与缀合的纳米颗粒相结合。当测试区域中的捕获分子识别并结合纳米颗粒/CrAg络合物时，纳米颗粒/CrAg络合物停止穿过所述膜。这样导致在LFA的测试区域处积累纳米颗粒/CrAg络合物。可以通过首先向例如激光器的能量源暴露测试区域，然后通过热传感器测量从测试试条产生的热，来将所述热对比系统用于检测并量化测试区域中CrAg的量。
图6示出了与色度检测相比，热对比产生32倍的分析灵敏度提高，其中对数线性斜率高达通过乳胶凝集(R2＝0.98)产生的等同浓度为1∶1024的CrAg滴定度。在所述1∶1024滴定度以上，存在大剂量“钩状”效应，降低了视觉强度以及热强度到达平稳状态。可以通过改变对测定的稀释或改变测定的工程，来克服这个问题。此外，可以通过标准化这些纳米颗粒的尺寸以便降低方差系数，来改善测定的测定间精度。为了进行比较，在具有隐球菌脑膜炎的患者中观察到的中值CrAg滴定度通常为1∶1024到1∶2048。然而，尽管有HIV治疗，对于CrAg滴定度＞1∶8，在具有亚临床疾病(以100％灵敏度和96％特异性，预示后来发展为隐球菌脑膜炎)的无体征患者中，存在大约几个星期到几个月的亚急性潜伏期。在具有晚期AIDS的人群中进行血清CrAg筛查和预防性的抗真菌治疗防止朝着症状性脑膜炎的临床进展。由于在尿液中可检测CrAg，因此有可能进行非侵入性筛查，然而尿液比血液中CrAg的浓度低22倍。因此，通过热对比改善LFA灵敏度，这可以实现对AIDS的无体征患者的非侵入性筛查，量化CrAg负担以便进行危险分层的能力。
本说明书包括用于检测和量化hCG抗原的方法。所述方法包括：将样品与样品垫相接触，允许液体由于毛细管作用流经膜。与hCG结合分子缀合的纳米颗粒响应于施加样品，通过毛细管作用在所述膜内移动。当存在hCG时，hCG与缀合的纳米颗粒相结合。当测试区域中的捕获分子识别并结合纳米颗粒/hCG络合物时，纳米颗粒/hCG络合物停止穿过所述膜。这样导致在LFA的测试区域处积累纳米颗粒/hCG络合物。可以通过首先向例如激光器的能量源暴露测试区域，然后通过热传感器测量从测试试条产生的热，来将所述热对比系统用于检测并量化测试区域中hCG的量。
本说明书包括用于检测和量化疟疾抗原的方法。所述方法包括：将样品与样品垫相接触，允许液体由于毛细管作用流经膜。与疟疾抗原结合分子缀合的纳米颗粒响应于施加样品，通过毛细管作用在所述膜内移动。当存在疟疾抗原时，疟疾抗原与缀合的纳米颗粒相结合。当测试区域中的捕获分子识别并结合纳米颗粒/疟疾抗原络合物时，纳米颗粒/疟疾抗原络合物停止穿过所述膜。这样导致在LFA的测试区域处积累纳米颗粒/疟疾抗原络合物。可以通过首先向例如激光器的能量源暴露测试区域，然后通过热传感器测量从测试试条产生的热，来将所述热对比系统用于检测并量化测试区域中疟疾抗原的量。
本说明书包括用于检测和量化TB抗原的方法。所述方法包括：将样品与样品垫相接触，允许液体由于毛细管作用流经膜。与TB抗原结合分子缀合的纳米颗粒响应于施加样品，通过毛细管作用在所述膜内移动。当存在TB抗原时，TB抗原与缀合的纳米颗粒相结合。当测试区域中的捕获分子识别并结合纳米颗粒/TB抗原络合物时，纳米颗粒/TB抗原络合物停止穿过所述膜。这样导致在LFA的测试区域处积累纳米颗粒/TB抗原络合物。可以通过首先向例如激光器的能量源暴露测试区域，然后通过热传感器测量从测试试条产生的热，来将所述热对比系统用于检测并量化测试区域中TB抗原的量。
示例
示例1-GNP的合成与分析
金纳米颗粒(GNP)合成：如Perault等和Neha等在Frens G.中所述(参照FrensG.Nat.Phys.Sci.1973；Perrault，Steven D.等Nano Letters 20099(5)1909-1915；NehaB.Shah等Molecular Pharmaceutics 2012 9(8)2146-2155)，通过氯金酸的还原法合成30nm GNP，接着涂覆聚乙二醇(PEG)以保持水溶液中的稳定性。通过紫外可见光分光光度计、原子发光光谱、动态光散射和TEM来执行GNP的特征化，以确保成功合成并量化浓度和尺寸。准备滴定浓度的GNP水溶液，将每个溶液的10μL作为液滴转移到载玻片。然后，用来自CW激光器(532nm，Millennia Vs，二极管泵浦)的激光束照射液滴1分钟，从而诱发GNP发热。在激光照射期间，安装在样品上方一定角度的红外摄像机(FLIR ThermoVisionTM A20)远程测量温度改变。根据热图像确定并绘制每个样品的最大温度改变。
将溶液中GNP的热对比与视觉对比进行比较。准备一系列不同浓度的GNP。将10μL的GNP溶液置于显微镜载片上。为了进行视觉分析，通过数字摄像机拍摄照片，随后用ImageJ对所述图像进行分析。为了进行热量分析，用激光(0.5W，532nm)照射GNP溶液，通过红外摄像机记录温度变化。
结果示出：相较于通过视觉对比的2.5x1011纳米颗粒/mL，使用热对比能够检测低至2.5x109纳米颗粒/mL的GNP。这清楚地示出了热对比检测可以将整体分析灵敏度改善100倍(图5)。还将GNP的热对比与使用标准微型酶标仪的标准光密度测量(其原理广泛地用于微流体ELlSA)进行比较。在相同样品容量(10μL)的情况下，与光密度测量相比，热对比显示出50倍的改善。通过使用较高功率的激光器和/或针对不同浓度的GNP调谐激光功率以便扩展热对比的动态范围，有可能进一步改善热对比灵敏度。重要的是，还可以通过调谐激光波长以便更好地令纳米颗粒(金纳米棒)进行吸收，增加灵敏度。
示例2-检测隐球菌抗原(CrAg)
使用从Immy，Inc获得的用于检测隐球菌抗原(CrAg)的经FDA批准的LFA，检测热对比相对于色度检测(即，视觉对比)的分析性能，这在Qin等Angewandte Chemie 2012中描述了。LFA的热对比成像：隐球菌抗原LFA(Immy，Inc.Norman，OK)，于2011年7月经FDA批准，检测血清和脑脊液(CSF)中隐球菌物种络合物(Cryptococcus neoformans和Cryptococcusgatlii)的荚膜多糖抗原。对来自具有隐球菌脑膜炎患者的血清样品进行2倍连续稀释，以便评估检测极限，作为CrAg滴定度。根据制造商的指示执行所述测试。通过用激光照射所述测试线1分钟，来执行热对比。红外摄像机记录温度变化。照射每个水平测试带上的三个点，测量平均最大温度变化。在每个浓度下，操作三个单独的LFA量杆。图6示出了所述结果。
视觉对比量化：对于GNP小滴，通过数字摄像机拍摄图像。通过平板扫描仪(型号：Visioneer Onetouch 7400)扫描所述量杆。分析感兴趣区域(ROI)(即，小滴和量杆测试带)的平均灰度。还通过在530nm处由分光光度计连同Take3微型酶标仪和Synergy HT多模式微型酶标仪(BioTek，Winooski，VT)，测量相同容量的GNP溶液(10μL)。
将血清样品LFA连续2倍稀释的(通过乳胶凝集(Immy，Inc.)在1∶32768滴定度处为阳性)进行比较。结果示出了热对比确实比色度视觉检测对LFA更敏感。图6示出了与色度检测相比，热对比产生改善了32倍的分析灵敏度，其中对数线性斜率高达等同浓度为1∶1024的CrAg滴定度。在所述1∶1024滴定度以上，存在大剂量“钩状”效应，其中降低视觉强度，热量强度到达平稳状态。
使用经FDA批准的隐球菌抗原(CrAg)LFA，看到通过热对比将分析灵敏度改善了32倍(图6)，与此同时量化抗原浓度。在“具有读取器的一次性RDT”模型中该增强的灵敏度可以支持在资源有限的区域针对症状性和无体征CrAg+进行CrAg筛查和量化，允许在先前通过定性LFA未检测到的患者中进行有目标的预防性抗真菌治疗。
示例3-改善LFA的分析灵敏度
基于多种金纳米颗粒(例如，棒、壳和球)的实验性测量的吸收横截面面积，进行建模，以开发对LFA的分析灵敏度的进一步改善。评估了包括金纳米棒、纳米壳和金纳米球的金纳米颗粒。如图7A所示，在等同激光功率和纳米颗粒浓度的情况下，典型的纳米棒和纳米壳相比于金纳米球分别产生4.6倍和36倍的热。为了消除颗粒尺寸影响，通过颗粒体积标准化吸收横截面面积(Cabs)，以对热产生能力进行更好的估计。用于进行这种比较的GNP的尺寸为：球D＝30nm；纳米棒D＝12.7nm，L＝49.5nm；纳米壳Dcore＝120nm(二氧化硅)，Dshell＝150nm(金)。标准化热对比(ΔTsignal)和纳米颗粒浓度。使用所述标准化，在产生热方面，金纳米棒比金纳米球和金纳米壳的效率大约高一个量级(图7A插图)。此外，目前的LFA(即，具有厚背衬材料的薄硝化纤维素膜)吸收大量激光能量(532nm)，产生背景加热或噪声。因此，使用低吸收(即，高透射或反射)的背衬材料(例如，塑料或玻璃)，允许使用更高的激光强度(I)。基底吸收：用532nm激光照射空白的量杆以及塑料和玻璃盖玻片各1分钟。通过红外摄像机测量在激光照射期间的温度变化并确定最大温度改变(参照图7B)。将较高吸收的纳米颗粒和较低吸收的LFA背衬材料组合，这可以增加灵敏度。应注意，金纳米棒与金纳米球可以在不同的波长下进行有效吸收。
可以通过将功率密度增加100倍(即，将激光功率从0.01增加到1W)和使用吸收率增加10倍(Cabs)的纳米颗粒，来产生1000倍的热对比增加。如上所述，可以通过降低背景吸收来使用较高的激光功率。
考虑到使用这里所述的改良示出的比视觉测试方法提高约10倍的改善，以及预计相对视觉检测方法的1000倍改善，可以将测定的分析灵敏度改善大约10,000倍。
示例4-检测hCG
使用具有GNP的LFA来测试在样品中hCG的存在(妊娠测试)。从Fisher Scientific(Sure-Vue血清/尿液hCG测试试剂盒)购买hCG LFA。
如图8A和8B所示，与视觉检测相比，热对比示出了对于hCG的存在的增强灵敏度。使用热对比示出了检测极限的20倍提高。
示例5-检测疟疾
还使用具有GNP的LFA来测试疟疾抗原的存在。从Alere Inc(BinaxNOWTM疟疾测试)购买疟疾LFA。
如图9所示，与视觉检测相比，热对比示出了对于疟疾抗原的存在的增强灵敏度。使用热对比示出了检测极限的8倍提高。
示例6-检测TB
使用具有GNP的LFA来测试TB的存在。Alere Inc(DetermineTM TB LAM快速测试)制造TB LFA。结果示出在表格1中。热对比度基于痰培养的参考标准，检测大多数的视觉阴性的TB LFA(即，假阴性)。
表格1
方法 检测比率 检测百分比
TB-LAM LFA-视觉 0/39 0
TB-LAM LFA-热量 22/39 56
痰培养 39/39 100
由于热对比降低了假阴性测试结果，这样直接说明测试灵敏度的增加。
示例7-针对hCG使用吸收率
进行该实验以查看是否可以使用吸收率(SAR)执行热对比。基于ΔT执行示例1-7中的热对比。SAR基于温度变化的初始斜率。
图10A示出了在延长时间段上的温度变化。图10B示出了第一个20秒内的温度变化。如图10A和10B所示，可以通过计算SAR来执行热对比。这样实现在早期进行测量，以便最小化干扰。具体地，随着时间的热量增加导致在材料中扩散。如果非常快速地增加热量使得最小化所述扩散，则温度变化的速率完全与SAR(或式1中的Q)相关，因此在测试中可以更直接地捕获GNP的存在，从而捕获抗原的存在。这可以允许使用脉冲激光器。图11示出了与如上述示例4所述的使用hCG的实验相同的结果，除了确定SAR而不是温度变化。可以看出，SAR可以用于检测分析物，而不损失灵敏度或准确性。
示例8-使用单分散颗粒
如示例1所述使用Frens的方法制备纳米颗粒，并针对分散性进行分析。
如图12A、图12B和12C所示，合成GNP比量杆中的GNP更均匀地分散。
图13是在图12的TEM图像中看到的结果的量化。具体地，增加不同尺寸的GNP的计数，附图示出了与用Frens的方法合成的颗粒相比，在当前量杆中具有更宽的分布。
尽管参考优选实施例描述了本发明，然而本领域技术人员应认识到可以在不脱离本发明的精神和范围的前提下，进行形式和细节上的多种变化。

Claims (7)

1.一种热对比测定读取器，包括：能量源；传感器；I/O电路；以及开口，用于接收测定试条；所述读取器被配置为当在测定试条的测试区域上激活能量源时将传感器结果转换为输出信号，其中所述传感器是红外摄像机，配置为测量测定试条的测试区域中的热对比。
2.根据权利要求1所述的读取器，其中所述能量源是激光器。
3.根据权利要求1所述的读取器，其中所述测定试条的测试区域包括纳米颗粒。
4.根据权利要求1所述的读取器，其中所述读取器是台式设备，将输出信号显示在台式设备的显示器上。
5.根据权利要求1所述的读取器，其中所述读取器是手持设备，将输出信号显示在手持设备的显示器上。
6.根据权利要求1所述的读取器，其中通过有线连接将所述输出信号传送到其它设备。
7.根据权利要求1所述的读取器，其中通过无线连接将所述输出信号传送到其它设备。
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