KR20140127275A

KR20140127275A - 열대비 분석법 및 판독기

Info

Publication number: KR20140127275A
Application number: KR1020147023705A
Authority: KR
Inventors: 죤 씨. 비숍; 젠 팽 신; 워렌 챤; 타너 아킨
Original assignee: 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 미네소타
Priority date: 2012-01-31
Filing date: 2013-01-30
Publication date: 2014-11-03
Also published as: CN104471382B; CN107505465A; CN107505465B; EP3321666B1; BR112014018563A2; US20140377770A1; WO2013116333A3; CN104471382A; IN2014MN01698A; ES2661870T3; ES2816061T3; PL2810052T3; US9651508B2; EP3321666A1; AP2014007834A0; EP2810052B1; EP2810052A2; WO2013116333A2; JP2015509201A

Abstract

본 발명은 열대비 판독기와 결합하여 사용되는 분석법에 대한 것이다. 본 발명의 분석법에서, 검사 스트립은 타겟 분석물이 샘플에 존재할 경우 열적 반응을 발생시킬 수 있는 물질을 포함한다. 열대비 판독기는 검사 영역에 있는 검사 스트립을 수용하기 위한 개구, 검사 위치를 향하는 에너지원 및 검사 위치를 향하는 열센서를 포함한다. 열센서는 타겟 분석물이 샘플 내에 존재하는 경우, 검사 위치에 있는 열원(heat source)의 활성화에 따라 검사 스트립의 열을 감지하도록 형성되어 있다. 열센서는 센서 출력에 연결되고 진단 출력(diagnostic output)을 제공하도록 형성된 진단 회로소자(circuitry)를 사용하여 센서 출력을 제공할 수 있다. 진단 출력은 센서 출력의 함수로서 환자의 진단 상태를 표시할 수 있다. 본 발명은 또한 타겟 분석물을 탐지하는 방법과, 측면 유동 분석법 및 열대비 판독기를 포함하는 키트에 관한 것이다.

Description

열대비 분석법 및 판독기{THERMAL CONTRAST ASSAY AND READER}

본 발명은 샘플에 있는 분석물(analytes)을 탐지하는 분석법 및 판독기에 대한 것이다. 보다 자세하게는, 열대비(theremal contrast)를 바탕으로 작동되는 분석법 및 판독기에 대한 것이다.

측면 유동 분석(lateral flow assay; LFA)이나 측면 유동 면역분석(lateral flow immunoassay) 또는 신속 진단 검사(rapid diagnostic test; RDT, 또는 생물학적 분석(bioassays)이라 불리는 기술은 실험실 안팎에서 광범위하게 사용되고 있음이 밝혀졌다. 통상적 분석에서, 환자로부터 얻는 유체 샘플(fluid sample)은 검사 스트립(test strip)에 인가된다. 상기 샘플은 검사 스트립에 있는 화학성분(chemicals)과 반응하여 스트립이 최적의 특성 변화를 일으키게 한다. 시각 표시기(visual indicator) 예를 들어 가정용 임신 검사기 등을 사용하여 각 개인이 관찰할 수도 있으나, 분석 판독기를 사용하여 더욱 정확한 판독을 얻을 수 있다. 상기와 같은 판독기로는, 예를 들어, 광학적 변화를 좀 더 정확하게 감지할 수 있는 감응성 광학 센서(sensitive optical sensor)를 들 수 있으며, 육안 관찰에 비해 훨씬 반복적으로 수행할 수 있다. 통상적 분석 판독기의 한 예는 2007.11.20에 발행된 폴리토(Polito) 등의 미국특허번호 7,297,529에 기재되어 있다.

질병의 신속한 진단은 해당 질병의 신속한 치료를 가능하게 하고 치료 결과를 개선할 수 있다. 이에 따라, 고소득 환경 및 제한된 자원 환경 모두에서 생체분자를 탐지할 수 있는 신속한 현장진단(point-of-care)용 진단 장치 또는 시스템의 개발 및 사용이 증가하였다. LFAs는 비싸지 않고, 간단하고, 휴대가능하며, 견고하므로 의학, 농업 및 임신 검사와 같이 처방 없이 사용할 수 있는(over-the-counter) 개인적 사용이 가능한 용도로 일상화 되었다. 또한 LFAs는 말라리아, AIDS-관련 크립토코쿠스성 뇌수막염(cryptococcal meningitis), 폐렴구균 폐렴(pneumococcal pneumonia) 및 최근에는 결핵(tuberculosis)을 포함한 수많은 감염성 질병(infectious diseases)에 널리 사용되고 있다.

일부 LFAs의 분석 성능은 실험실-기준 방법에 비길만하지만, 대부분의 LFA의 분석 감도(또는 탐지 한계)는 mM 내지 μM의 범위를 갖고 있으며, 이는 효소결합 면역학적 검정(enzyme-linked immunoassays; ELISA)과 같은 다른 분자생물학적 기술에 비해 그 감도가 훨씬 낮다. 따라서, LFAs는 항원(antigen)의 농도가 낮은 경우에는 질병 단계의 초기의 탐지에는 아주 유용하다고 볼 수는 없다. 이들 기술은 nM 내지 pM 범위 내에서만 탐지가 가능하므로, 항원 탐지에 있어 보다 높은 감도를 얻기 위하여 미세 유체 공학(microfluidics), 바이오-바코드(biobarcodes) 및 효소기반 분석 기술에 대한 연구에 초점이 맞추어졌다. 그러나, 상기 모든 방법은 아직 개발 단계에 있으며, 최종 사용자가 현장진단 시 사용가능할 수 있는 신뢰성 있고, 비용 효과적 방법은 아직 개발되지 않은 상태다.

이미 알려진 바와 같이, 물질의 광학적, 열적 및 전기적 물성은 나노스케일 단위로 급격한 변화를 하게 된다. 특히, 금속 나노입자(metal nanoparticles)의 향상된 광열(photothermal) 신호는 하기 목적에 이용되어 왔다: 악성 종양의 열적 제거(thermal ablation), 순환 종양세포의 탐지, 광열적 유전자 형질전환(photothermal gene transfection), 화학요법(chemotherapeutics)의 치료 효율 개선 및 세포 내 나노입자의 이동 추적.

본 발명의 한 관점에 있어서, 본 발명은 열대비 분석 판독기에 관한 것이다. 열대비 분석 판독기는 에너지원(enregy source), 센서, I/O 회로소자(circuitry) 및 분석 스트립(assay strip)을 수용하는 개구(opening)를 포함한다. 상기 판독기는 에너지원을 분석 스트립의 검사 영역(test region)으로 활성화함에 따라 센서 결과를 출력 신호로 전환하도록 구성되어 있다.

본 발명의 다른 관점에 있어서, 본 발명은 분석 시스템을 포함하는 분석 키트에 관한 것이다. 상기 분석 키트는 샘플 패드(pad), 검사 스트립, 분석물 결합 분자(analytes binding molecule)에 접합된(conjugated) 나노입자, 검사 영역, 제어 영역(control region) 및 샘플의 인가 시 유체 통신(fluid communication)을 하도록 형성된 흡수(absorbent) 패드를 포함한다. 상기 키트는 또한 열대비 분석 판독기를 포함한다.

본 발명의 또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 분석 시스템의 검사 스트립을 샘플과 접촉한 후, 상기 분석 시스템 내의 검사 스트립의 검사 영역을 에너지원에 노출시키는 단계를 포함하는 샘플 내의 분석물을 탐지하는 방법에 관한 것이다. 상기 샘플은 모세관 현상에 의해 검사 스트립을 통해 이동하며, 분석 시스템은 샘플 내의 분석물에 결합하는 분석물 결합 분자에 접합한 나노입자와 포획분자(capture molecules)를 포함하는 검사 영역을 포함한다. 상기 방법은 또한 검사 영역에서 분석물의 유무를 탐지하기 위하여 센서를 이용하여 검사 영역에서 발생하는 열을 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명은 열대비 판독기와 함께 사용되는 분석 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 또한 열대비 분석법 및 판독기 시스템을 이용하여 샘플에 있는 분석물을 탐지하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 샘플에 존재하는 특정 타겟(target) 화합물에 대한 노출에 반응하여 변화하는 열적 특성을 나타내는 분석 검사 스트립을 포함한다. 본 발명은 상기 검사 스트립의 열적 특성을 판독하는 판독기를 포함한다. 본 발명의 여러 관점을 이하 더 자세히 설명된다.

열대비 분석 시스템은 열대비 판독기와 같이 작동하도록 구성되어 있는 분석법이다. 열대비 분석 시스템은 시각 판독기(visual readers)를 이용하는 분석법보다 훨씬 낮은 농도의 샘플에 존재하는 분석물을 탐지하는데 유용하게 사용될 수 있다. 열대비 분석 시스템은 다양한 샘플에 존재하는 분석물을 위한 고감도 탐지 시스템이다. 상기 시스템은 시각 탐지 방법을 이용하는 비교되는 LFAs에 비하여 훨씬 조기에 질병 또는 상태를 탐지할 수 있다. 또한, 상기 방법은 그 방법이 단순하여 최종 사용자가 그 시스템을 용이하고 정확하게 사용할 수 있다. 상기 시스템은 현장진단용 시설 및 제한된 자원 환경에 아주 적합할 수 있다. 이하 기재된 실시예는 감도(sensitivity), 작동 범위(dynamic range) 및 임상적으로 사용되는 LFAs 정량화를 확대하는데 사용될 수 있는 열대비 분석 시스템에 관한 것이다

본 발명에서는 또한 키트에 관해 설명하고 있고, 상기 키트는 이하 기재된 열대비 판독기 및 분석 시스템을 포함한다. 상기 키트는 최종 사용자가 분석 시스템을 이용하여 원하는 샘플을 처리하는 데 사용할 수 있으며, 이후 열대비 판독기를 사용하여 타겟 분석물 및/또는 타겟 분석물의 양을 탐지하는 데 사용할 수 있다. 상기 키트는 키트 사용과 관련한 지침을 포함할 수 있다.

전자기 여기(electromagnetic excitation)에 대한 실시예도 본 발명의 범위에 속하는 것이지만, 본 발명에서는 일반적으로 나노입자의 레이저 여기에 대하여 설명한다. 여기서, 나노입자를 여기하여 적외선 또는 다른 열센서로 판독할 수 있는 열을 생산하는 것을 의미하는 것으로 언급된, 나노입자의 레이저(또는 광) 여기는 또한 가능하고 본 발명의 범위에 속한다. 센서 출력에 연결된 진단 회로(Diagnostic circuitry)는 센서 출력의 함수로서 환자의 진단 상태의 진단 출력 표시(diagnostic output indication)를 제공하도록 구성된다.

본 발명에 기재된 분석 시스템은 분석물 결합 분자와 접합된 나노입자를 사용하여 샘플 내에 존재하는 타겟 분석물을 탐지하는 데 사용된다. 상세하게는, 분석 시스템에 있어서 나노입자는 입사광을 열로 효율적으로 전환시키는 데 사용할 수 있다. 분석 시스템에 있어서 멤브레인은 잠재적으로 분석물을 포함하는 샘플과 접촉하게 된다. 샘플이 주로 모세관 현상에 의해서 멤브레인을 통해 이동하면, 분석물 결합 분자와 접합된 나노입자는 타겟 분석물에 결합하여 나노입자/분석물 복합체를 형성한다. 본 발명에서 "나노입자/분석물 복합체"란 샘플의 분석물에 결합된 분석물 결합 분자에 접합된 나노입자를 의미한다. 상기 나노입자/분석물 복합체는 원하는 분석물에 결합하는 포획 분자를 포함하는 검사 영역을 향하여 지속적으로 멤브레인을 통해 이동한다. 상기 나노입자/분석물 복합체는 포획 분자에 결합되고 검사 영역에 유지된다. 열대비 판독기는 분석물의 존재 유무를 탐지하는 데 사용할 수 있다. 또한, 상기 열대비 판독기는 검사 영역에 존재하는 분석물의 양, 즉, 샘플의 양을 정량할 수 있다. 상기 열대비 판독기는 이하 기재된 바와 같이 일반적으로 열원(heat source)과 열센서를 포함한다.

분석 시스템, 즉 LFA는 일반적으로 샘플 패드, 멤브레인, 분석물 결합 분자에 접합된 나노입자 및 분석물 포획 분자를 포함한다. LFA 시스템은 또한 접합(conjugate) 패드, 흡수 패드, 백킹(backing), 검사 영역, 제어(control) 영역 및/또는 이들 모든 성분의 조합을 포함할 수 있다. 검사 영역은 일반적으로 분석물 포획 분자를 포함한다. 제어 영역은 제어 항체(control antibody)와 같은 제어 분자(control molecule)를 포함한다. 상기 접합(conjugate) 패드는 일반적으로 분석물 결합 분자에 접합된 나노입자를 포함한다.

본 발명에서 "멤브레인"은 샘플에 존재하는 타겟 분석물을 탐지하기 위하여 멤브레인과 하나 이상의 시약(reagents)을 사용하는 검사 장치 또는 검사 스트립을 의미한다. "멤브레인"과 "검사 스트립"은 상호 호환하여 사용할 수 있다.

상기 열대비 판독기와 같이 사용할 수 있는 분석법은 측면 흐름 분석(lateral flow assays; LFA)을 포함한다. 측면 흐름 분석을 수행할 수 있는 다양한 구성이 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국특허공개 US 2003/0119202 (Kaylor et al.) 및 미국특허공개 US 2010/0136566 (Mehra et al.)을 참조 목적으로 이하 기재하였다. 도 1은 당업계에 공지된 측면 흐름 분석을 수행하기 위한 일 구현예 및 다른 구성(configurations)을 나타내며, 이들 또한 본 발명의 범위에 속한다.

도 1은 본 발명에 따른 측면 흐름 분석 검사 및 판독기 시스템 (98)의 일 구현예를 보여 주는 간단한 다이아그램이다. 검사 스트립 (100)은 환자로부터 샘플 (104)을 받게 구성되어 있는 샘플 패드 (102)를 포함한다. 샘플 (104)은 모세관 현상에 의하여 샘플 패드 (102)로부터 화살표 (106)으로 표시된 바와 같이 흡수 패드 (108)의 방향으로 이동하게 된다. 샘플 (104)은 접합(conjugate) 패드 (110)을 통과하고 또한 멤브레인 (112)를 통과하여 검사 영역 (114)에 도달할 때까지 흐르게 된다. 또한, 분리된 제어 영역 (116)이 제공된다. 검사 스트립 (100), 샘플 패드 (102), 흡수 패드 (108), 접합 패드 (110), 검사 영역 (114) 및 제어 영역 (116)은 모두 유체 통신 내에 있다. 본 발명에서 "유체 통신(Fluid communication)"이란 유체가 상기 언급한 물질 또는 표면 사이를 흐르거나 이동하는 능력을 의미한다.

도 1에 도시된 바와 같이, 상기 검사 영역의 일 구현예는 검사 영역 (114)에서 항원과 결합한 단일 클론 항체와 관련된 금 나노입자를 포함할 수 있다. 검사 영역 (114)에서 결합된 결합 금 나노입자의 양은 에너지 (120)를 가하여 검사 영역 (114)을 가열함으로써 결정될 수 있다. 상기 검사 영역 (114)을 향하는 열센서 (122)는 나노입자의 양과 관련된 검사 영역 (114)의 가열을 측정하며, 따라서 검사 영역 (114)에 존재하는 항원의 양을 측정한다. 이하 더욱 상세하게 기재된 바와 같이, 본 발명의 시스템은 환자의 상태를 진단하는 데 사용될 수 있다. 상기 에너지 (120)는 검사 영역 (114)에 열을 가할 수 있는 여하한 형태의 에너지를 사용할 수 있다. 에너지원 (120) 및 열센서 (122)는 하나의 유니트에 수용되거나, 또는 별도로 수용할 수 있다.

도 1에 도시된 구현예에 있어서, 분석물 결합 분자 및 포획 분자는 단일 클론 항체로 나타내었다. 분석물 결합 분자 및 포획 분자는 동일 형태의 분자, 즉 항체일 수도 있다. 이와 같은 경우, 이들은 바람직하기에는 서로 다른 위치에서 분석물에 결합한다. 다시 말하면, 분석물 결합 분자 및 포획 분자는 분석물의 동일 위치 또는 항원결정인자(epitope)에 결합하지 않는다. 상재적으로, 분석물 결합 분자 및 포획 분자는 서로 다른 두 개의 분자일 수 있으나, 이들 모두는 분석물을 서로 다른 위치에 결합할 수 있다.

상기에 기재한 구현예에 있어서, 항체-피복(antibody-coated) 금 나노입자( GNPs)는 스트립이 임상 시료에 침지되거나 접촉한 후 모세관 현상을 통해 니트로셀룰로오스 스트립 내에서 이동한다. 존재할 경우, 타겟 항원은 단일 클론 항체-피복 GNPs에 결합한다. 이 결합된 복합체는 항원-항체-금 나노입자 복합체를 인식하는 멤브레인 위에 있는 항체에 의해 포획된 경우 "딥스틱(dipstick)"을 빨아들이는 것을 중지한다. 따라서, LFA의 검사 영역 (114)에 금 나노입자가 축적하게 되며, 양성 검사 결과를 가져온다. 금 나노입자는 이의 크기가 멤브레인 (112)의 기공을 통해 이동할 수 있도록 고안되어 있기 때문에 LFA에 사용되어 왔고; 금 나노입자는 항체로 쉽게 피복될 수 있고; 금 나노입자는 가시 광선과 강한 상호작용을 갖으므로 쉽게 시각화되는 짙은 색(deep color)을 만들 수 있다. 다른 빛 파장을 갖는 빛과 강한 상호작용을 하는 금 나노입자는 열대비 탐지, 예를 들어 근적외선에서 최대 빛 흡수를 하는 금 나노 로드(nanorod)에 사용될 수 있다.

도 2a는 본 발명의 일 구현에에 따른 휴대용 분석 판독기 (200)의 간략한 블록 다이아그램이다. 판독기 (200)는 슬롯(slot) 또는 홀더(holder) (206)에서 LFA (100)를 접수할 수 있도록 형성된, 개구 (204)를 갖는 하우징 (202)를 포함한다. 도 2a에서, 레이저 (220)는 LFA (100)의 검사 영역을 향하는 에너지 (120)를 발생시킨다. 도 2a에서, 상기 에너지는 예를 들어 선택적 렌즈 (222)를 사용하여 검사 영역에 포커스되는 가시광선 또는 근적외선일 수 있다. 이하 기재한 바와 같이, 나노입자를 향한 가시광선이나 근적외선은 나노입자의 가열을 초래할 수 있다. 이는 적외선 센서와 같은 센서 (122)에 의해 탐지된다. 상기 검사의 결과는 예를 들어 LCD 디스플레이를 포함할 수 있는 디스플레이 (230)에 표시될 수 있다. 상기 디스플레이는 정량적 출력(quantitative output)이나 단순한 합격/불합격(pass/fail) 표시와 같은 정성적 출력(qualitative output)을 제공할 수 있다. 선택적 사용자 입력장치 (232)가 제공된다. 상기 입력장치는 예를 들어 작동자가 검사를 개시하게 하는 단일 버튼이거나, 또는 숫자판(numerical keypad) 또는 장치 (200)에 사용되는 임계값과 같은 매개변수를 작동자가 업데이트 하기 위한 숫자판과 같은 보다 복잡한 입력장치일 수 있다. 상기 입력장치 (232)는 터치스크린을 제공하기 위하여 디스플레이 (230)에 로드되는 오버레이(overlay)일 수 있다.

장치 (200)의 작동은 이하 자세히 설명된 바와 같이 전기 회로소자에 의해 제어된다. 상기 장치는, 예를 들어 마이크로 프로세서, 아날로그-디지털(analog-to-digital) 변환기, I/O 회로소자 등을 포함할 수 있다. 전력원 (242)이 제공된다. 상기 전력원 (242)은 바람직하기로는 배터리 등과 같은 휴대용 전력원이다. 상기 전력원은 다른 전기원(electrical source) 또는 태양전지(solar cell) 등에 연결하여 선택적으로 재충전할 수 있다.

또한, 상기 장치 (200)는 이하 상세히 기재한 입력/출력(I/O) 회로소자 (310)을 포함한다. I/O 회로소자 (310)는 장치 (200)에 의해 수집된 데이터를 전송하거나 다른 장치에 제공할 수 있다. 예를 들어, 검사 결과는 수집 후 향후 평가를 위하여 중앙 위치(central location) 또는 클라우드 서버(cloud server)로 전송될 수 있다.

도 2b는 "벤치탑(bench top)" 배열로 구성된 분석 판독기 (200)의 간략한 블록 다이아그램이다. 도 2b의 배열에 있어서, PC로 나타낸 컴퓨터는 검사를 위하여 사용된다. PC (260)은 I/O 회로소자 (262)를 통해 레이저 (220) 및 적외선 센서 (122)에 연결된다. I/O 회로소자 (262)는, 예를 들어 디지털-아날로그(digital-to-analog) 변환기, 아날로그-디지털 변환기, 전환가능한(switchable) 출력 등을 포함할 수 있다. 통상적으로, 도 2b에 도시된 PC (260)는 휴대용 장치에 허용되는 것보다 더 강력한 연산 능력을 가질 수 있다. 상기 PC는 추가 검사 또는 더 진보된 검사 수행도 가능하다.

비록 어떠한 적절한 요소가 사용될 수 있지만, 바람직한 구현예에서, 소스(source) (220)은 레이저, 예를 들어 532 nm 녹색 레이저(즉, LRS-0532-PFM_00200-03, LaserGlow Technologies Inc)를 포함한다. 초점 광학장치(Focusing optics) (222)는 예를 들어, 평-볼록(plano-convex) 초점 렌즈를 포함한다. 적절한 적외선 센서는 적외선 카메라 (A20 또는 E30, FLIR Inc) 또는 적외선 센서(MLX90614, Melexis)를 포함하나 본 발명은 상기 구성에 한정되지는 않는다.

도 3은 장치 (200)의 간략한 블록 다이아그램이고, 메모리 (302)에 저장된 지시사항에 따라 작동되는 마이크로프로세서 (300)를 포함한다. 마이크로프로세서 (300)는 에너지원 전력원 (302)을 활성화함으로써 에너지원 (220)을 제어한다. LFA(도 3에 미도시)의 가열은 아날로그-디지털 변환기 (304)에 출력을 제공하는 열센서 (122)에 의해 탐지된다. 선택적 스트립 센서 (306)가 제공되고, 스트립 센서 (306)는 슬롯 (206)에서 LFA (100)의 존재를 탐지하도록 구성되어 있고, 따라서 마이크로프로세서 (300)가 에너지원 (220)을 활성화시켜서 검사를 시작하게 할 수 있다.

도 3은 전력원 (242)에 연결된 선택적 재충전 회로 (308)를 보여준다. 상기 회로는, 예를 들어 외부 전원, 태양 전지, 기계적 크랭크 등을 사용하여 전원 장치 (242)를 재충전한다.

입력/출력 회로소자 (310)는 마이크로프로세서 (300)과 연결하여 도시되어있다. 이는 디스플레이, 키보드 또는 수동 입력, 음성 출력(audible output), 유에스비(USB) 또는 이더넷 연결(Ethernet connection)과 같은 디지털 출력, 라디오 주파수(RF) 또는 적외선(IR) 입력 및/또는 출력, 무선 데이터 연결(cellular data connection), 이더넷 연결 등을 포함하는 여하한 형태의 입력 또는 출력 장치를 포함할 수 있다. 라디오 주파수 연결의 예로서 블루투스 연결(BLUETOOTH® connections)이나 기타 단거리 통신 기술, 와이파이 연결(WIFI connections) 등을 포함할 수 있지만 이에 국한되지 않는다. 무선 전화 연결(Cellular phone connections)은 데이타 통신 및/또는 선택적 음성 통신 제공을 위하여 장치가 무선(cellular) 전화 네트워크를 사용하여 통신할 수 있게 한다. 상기 데이터는 감염성 질병에 대한 검사 결과 및 시공간(spatiotemporal) 정보를 입수하기 위한 지리적 정보(GPS 위치)를 포함할 수 있다.

상기 I/O (310)는 장치 (200)으로 수집한 데이터를 다른 장소로 전송할 수 있다. 예를 들어, 야외에서 사용 시 장치 (200)은 검사 결과를 중앙 데이터 베이스에 재송부할 수 있다. 이러한 전송은 여하한 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 데이터를 무선 네트워크 등을 통해 인터넷 연결을 통해 전송하는 것이다. 상기 연결은 물리적 와이어 연결을 필요로 할 수도 있고 와이파이, 블루투스 등을 사용하여 무선으로 수행할 수도 있다. 또한, 상기 I/O는 메모리 (302)에 저장된 정보를 업데이트하는 데 사용할 수도 있다. 예를 들어, 프로그래밍 지시, 교정 정보 또는 기타 데이터를 업데이트할 수 있다. 상기 I/O (310)는 디스플레이 (230) 및/또는 입력장치 (232)를 사용하여 원격 장소에서 조작자와 통신하는데에 사용할 수도 있다.

작동 중, LFA (100)(도 3에 미도시)은 하우징 (202)에, 예를 들어 슬롯 206(도 2에 도시)을 통하여 설치된다. 검사 과정은 스트립 센서 (306) 또는 입력/출력 회로소자 (310)을 사용하여 수동 입력과 같은 다른 트리거(trigger)로부터의 신호에 대응하여 마이크로프로세서 (300)에 의해 개시된다. 구성의 한 예로서, 선택적 스텝퍼 모터(stepper motor) (307)을 제공할 수 있고, 마이크로프로세서 (300)에 의해 제어된다. 상기 스텝퍼 모터 (307)는 장치 (200) 내에서 LFA (100)의 이동을 자동화하는 데 사용할 수 있다. 상기 장치 (200) 내에서 LFA (100)의 위치를 모니터링하는 것이 필요할 경우, 다중(multiple) 스트립 센서 (306) 또는 다른 구성을 사용할 수도 있다. 상기의 경우, 마이크로프로세서 (300)는 전력을 에너지원 (220)에 인가하여 LFA (100)를 가열한다. 이러한 가열 반응은 센서 (122)에 의해 감지되고 아날로그-디지털 신호 변환기 (304)를 사용하여 디지털 신호로 변환된다. 상기 디지털화된 신호를 바탕으로, 마이크로프로세서 (300)는 입력/출력 회로소자 (310)을 사용하여 검사 결과를 나타내는 출력을 제공한다.

또한, 도 3은 인가된 에너지의 강도를 감지하기 위하여 에너지원 (220)의 경로에 배열되는 피드백 센서 (303)를 도시하고 있다. 상기 피드백 센서 (303)로부터의 출력은 아날로그-디지털 변환기 (305)를 통하여 프로세서 (300)에 전달된다. 예를 들어, 센서 (303)는 레이저 (220)로부터의 출력 강도를 감지하는 광센서(light sensor) 일 수도 있다. 상기 정보는 장치 및 감지된 가열을 교정하는 데 사용할 수 있다. 또한, 상기 피드백은 약한 신호를 나타내거나 완전히 소멸된(failed) 에너지원 (220)을 탐지하기 위한 진단용 목적으로 사용될 수도 있다.

메모리 (302)는 마이크로프로세서에 의한 단기 및 장기 정보 저장에 사용된다. 예를 들어, 상기 장치 (200)의 주소 정보(addressing information) (320)는 메모리 (302)에 저장할 수 있다. 상기 주소는, 예를 들어, 유일하거나 또는 거의 유일하게 장치 (200)를 인식할 수 있는 주소일 수 있고, 인터넷 프로토콜 (IP) 주소, 맥 주소(Mac address), 또는 다른 주소 형태(format)를 포함할 수도 있으나 이에 한정되지는 않는다. 상기 메모리 (302)는 센서 (122)로부터 받은 데이터를 교정하는데 사용할 수 있는 교정 정보를 저장하는 데 사용될 수 있다. 상기 교정 정보는, 예를 들어 장치의 제조 공정 과정이나, 회로소자 (310)의 입력 과정, 또는 LFA (100)을 사용하여 수행한 교정, 예를 들어 도 1에 도시된 교정 영역 (116)을 기초로 하는 여러 방법을 통하여 결정될 수 있다. 상기 교정 정보는 센서 (122)가 제공하는 판독(readings)에 대한 기준선(baseline) 또는 이를 상쇄할 수 있는 다른 형태를 제공할 수 있다. 메모리 (302)는 또한 마이크로프로세서 (300)의 작동을 제어하는데 사용되는 작동 지시 (324)를 포함한다.

도 4a 및 도 4b는 에너지 (120)가 인가될 때 Ts, LFA (100)의 가열 반응을 나타내는 그래프이다. 가열량은 R_M으로 표시되는 최대치에 도달한다. 또한, 도 4a 및 도 4b에 도시된 바와 같이, 상기 반응은 초기에 가장 가파른 상승 곡선을 보이다가 천천히 최대 수준으로 감소되는 기울기를 갖는다. 마이크로프로세서 (300)는 인가된 에너지 신호에 대한 가열 반응(heating response)을 분석하는 진단용 회로소자로서 작동된다. 예를 들어, 최대 반응이 임계 수준(threshold level)에 비교되는 단순한 임계점을 사용할 수 있다. 상기 비교를 토대로 예를 들어 "합격/불합격(pass/fail)" 출력을 출력으로서 제공할 수 있다. 또한, 상기 최대 반응 수준을 토대로 정량적 출력을 제공할 수 있다. 이 정량적 출력은 검사 위치 (114)(도 1 참조)에서 포획된 금 나노입자의 양을 나타낼 수 있다. 이는 예를 들어, 항원의 양과 관련될 수 있으며, 따라서 환자의 질병의 진행상태와 관련될 수 있다.

본 발명의 한 관점에 있어서, 진단은 반응의 프로파일을 기초로 한다. 예를 들어, 도 4a 및 도 4b에는 반응 초기의 기울기를 보여주고 있다. 상기 초기 기울기를 바탕으로, 최대치까지 가열할 필요 없이, 최대치인 R_M 값을 추정하는 것이 가능하다. 상기 방법은 검사 과정의 속도를 증대하는 데 사용될 수 있다. 또한, 상기 정보는 센서 (122)에 의해 탐지되는 최대치 R_M을 입증하는 데 사용할 수도 있다. 예를 들어, 상기 추정된 R_M 값이 실측 R_M 값과 상당한 차이가 있을 경우, 상기 결과는 잘못된 성분(failing component), 검사 스트립의 손상, 또는 측정상의 기타 다른 오류를 나타낼 수 있다. 또한 상기에서 언급한 바와 같이, 교정 정보는 측정의 정확도를 개선하는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 교정 정보는 반응 신호가 비교되는 반응의 기준선을 제공할 수 있다. 따라서, 상기 교정 정보에 따라 반응 임계 수준(response threshold levels)을 조정할 수 있다.

상기 에너지원 (220)은 여하한 적절한 에너지원일 수 있다. 하나의 바람직한 구현예로 에너지원 (220)은 레이저를 포함할 수 있다. 당해 기술분야에는 열원으로 사용되는 다양한 레이저가 공지되어 있고, 예를 들어, 연속파 레이저(continuous wave laser), 펄스파 레이저(pulsed wave laser), 또는 감쇄 레이저(reduced size laser)가 될 수 있다. 열대비 감도는 작동 범위를 확대하기 위하여 보다 높은 출력의 레이저(higher powered lasers)의 사용 및/또는 다른 농도의 금 나노입자용 레이저 강도를 조정함으로써 증가될 수 있다. 상기 레이저는 가시 범위에서 빛을 낼 수 있다. 근적외선 영역에서 빛을 내는 레이저 또한 사용될 수도 있다. 일반적으로, 레이저는 배경 물질(background materials)로부터의 간섭을 최소화하면서 나노입자 내에서 흡수를 극대화하기 위하여 선택 및 조정된다. 상기 LFA 시스템에서 사용되는 레이저 파워의 양은 변화될 수 있고, 분석법의 성분에 따라 달라진다. 일 구현예로서, 레이저 파워는 약 5 와트(W)와 50 와트(연속파 레이저) 사이이다. 그러나, 다른 구현예로서 더 높거나 더 낮은 에너지 레벨이 사용될 수도 있다. 예를 들어, 총 에너지는 더 낮으나 에너지 밀도는 더 높은 것을 펄스파 레이저에 사용할 수도 있다. 이하 설명되는 배경 흡수를 감소시킴으로써, 더 높은 레이저 파워가 감도와 신호 세기를 증가시키기 위하여 사용될 수도 있다.

일반적으로, 멤브레인 및 백킹은 최소한의 빛을 흡수하는 물질을 포함한다. 배경 가열(background heating)은 더 높은 신호 세기를 얻을 수 있는 더 높은 에너지를 사용할 수 있는 능력을 제한한다. 빛 흡수를 최소로 하는 물질을 선택함으로써, 배경 열 판독(thermal reading)은 열 탐지가 분석 시스템의 물질로부터가 아니라 검사 영역 내에 있는 나노입자로부터임을 보장하기 위하여 감소될 수 있다. LFA 시스템에 있는 멤브레인은 일반적으로 다수의 간극(interstices)이나 기공(pores)을 포함하는 다공성(porous) 물질이다. 액체는 모세관 현상에 의하여 이들 간극이나 기공을 통해 흐르게 된다. 상기 다공성 물질은 천연 또는 합성 물질로 제조할 수 있다. LFA 시스템에 사용할 수 있는 적절한 다공성 물질로는, 예를 들어 니트로셀룰로오스, 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF), 폴리에틸렌, 나일론 셀룰로오스 아세테이트, 폴리에스테르, 폴리에테르설폰(PES), 폴리설폰(polysulfone) 등을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예로서, 최소한의 빛 흡수를 하는 멤브레인을 사용할 수 있다. 다공성 물질은 기타 당업계에서 공지된 것을 사용할 수도 있다. 당업계에는 다양한 백킹(backing)이 공지되어 있고 주로 LFA를 구조적으로 지지한다. 여기에 기재한 바와 같이 열대비 탐지를 위하여 최소한의 빛을 흡수하는 물질이 LFAs에서 백킹 물질로서 바람직하다. 한 바람직한 구현예로서, 백킹은 유리 또는 플라스틱(예를 들어 폴리스티렌)으로 제조할 수 있다. 샘플 패드는 예를 들어, 폴리에스테르, 폴리아크릴(polyacrylic), 기타 중합성 물질(polymeric materials) 또는 유리 섬유(glass fiber)로 제조할 수 있다. 접합 패드(conjugate pad) 및 흡수 패드(absorbent pad)는 예를 들어 셀룰로스(cellulosic) 물질 등을 사용하여 제조할 수 있다.

금속 나노입자는 광 자극을 받는 즉시 열을 발생한다. 이 열 발생은 금속-유전체 계면(metal-dielectric interface)에 있는 표면 플라즈몬(surface plasmons)이 여기(excited)상태에서 기저상태(ground state)로 전환하는 동안 발생한다. 금속 나노입자에 의하여 발생하는 열량은, 예를 들어, 하기 식으로 기재할 수 있다:

Q=NQnano=NCabsI 식(1)

상기 식에서, 총 발생열(Q, W/㎥)은 금 나노입자 농도의 생성물로 기재된 (N, #/㎥) 단일 금 나노입자(Qnano), 금 나노입자 흡수 단면(㎡) 및 레이저 강도(W/㎡)의 조합된 결과이다.

상기 나노입자는 다양한 물질, 형상 및 크기를 가질 수 있다. 상기 나노입자는 금 나노입자, 은 나노입자, 구리 나노입자, 플라티늄 나노입자, 알루미늄 나노입자, 카드뮴 나노입자, 복합체 입자(composite particles), 즉 은 및 금, 그래핀(graphene) 나노입자 등을 포함할 수 있다. 한 바람직한 구현예로서, LFA 분석 시스템은 금 나노입자를 포함할 수 있다. 본 명세서의 범위 안에서 다른 형태의 나노입자가 사용될 수도 있다. 또 다른 구현예로서, 둘 또는 그 이상의 나노입자의 조합이 사용될 수도 있다. 이들 나노입자는 복수 개의 분석물을 확인하거나 신호를 증폭하거나 개선할 목적으로 사용할 수 있다.

상기 나노입자는 일련의 크기 범위를 포함할 수 있고, 일반적으로 멤브레인을 통하여 이동할 수 있어야 한다. 바람직하기로는, 상기 나노입자의 직경은 lO nm 에서 200 nm 사이이다. 나노입자 크기의 선택 및 최적화는 부분적으로는 에너지 흡수에 달려 있다. 레이저를 에너지원으로 하고 금 나노입자를 사용하는 한 바람직한 구현예에 있어서, 플라즈몬 공명(plasmon resonance)이라 불리는 물리적 현상은 광 흡수 효율을 개선시키므로 열 발생을 개선한다. 금 나노입자는 직경이 약 lOO nm 까지 사용할 수 있다. 더 큰 크기도 사용 가능하고 본 발명의 범위에 포함된다. 일부 구현예에 있어서, 약 40-80 nm의 크기를 갖는 금 나노입자는 더 높은 흡수 효율(Qabs = Cabs/A로 정의되며, 상기에서 Cabs는 흡수 단면, A는 입자의 돌출 단면을 나타냄)을 가지며, 따라서 열 발생의 관점에서 바람직하다.

이하 기재된 바와 같이, 상기 LFA 시스템에서는 본 발명의 범위 내에서 다양한 형태의 나노입자를 사용할 수 있다. 상기 나노입자는, 예를 들어, 나노스피어(nanospheres), 나노로드(nanorods), 나노쉘(nanoshells), 나노 큐브(nanocubes), 나노어친(nanourchins), 나노 피라미드(nanopyramids), 나노스타(nanostars) 등을 포함한다. 바람직한 구현예로서, 상기 나노입자는 나노스피어, 나노로드 및/또는 나노쉘이다. 상기 여하한 형태의 나노입자를 사용할 수 있다. 최고의 광 흡수 효율(optical absorption efficiency)을 가진 나노입자 및 다른 물성과 관련하여 분석에서 기능적인 나노입자가 바람직하다. 나노스피어 형태의 입자는 흡수 효율을 산정하기 위하여 유효 반경(동등한 부피를 갖는 스피어(sphere))을 사용할 수도 있다.

종래의 LFAs에서 사용되는 금 나노입자의 다분산성(polydispersity)은 도 12a-c 및 도 13에서 뇌수막염 항원 및 hCG 딥스틱에서 보여주고 있듯이 잘 제어되지 않는다. 다분산성의 보다 나은 제어는 더욱 균일한 나노입자 분포를 이룰 수 있다. 보다 나은 제어는 열대비 탐지에 대한 표준 편차를 더 작게 하고 따라서 신호 안정성 및 일관성(consistency)을 개선하게 된다. 보다 균일한 나노입자는 광 흡수 및 열발생을 증가시킨다. 예를 들어, 크기가 서로 다른 금 나노입자는 서로 다른 파장에서 흡수 피크(peak absorption)를 갖는다. 다분산성 금 나노입자 군(GNP population)과 관련하여, 금 나노입자가 더 적으면 흡수 피크 파장에서 열을 발생하게 되므로 따라서 발생하는 열의 양이 감소하게 된다. 나노입자 샘플에 있어서, 균일한 크기를 가진 잘 분산된 나노입자는 나노입자 클러스터(clusters)보다 더 바람직하다. 나노입자의 군락화(clustering)는 나노입자에 의해 균일한 흡수가 감소하게 된다. 군락화를 감소시켜 흡수의 균일성을 증가시키기 위하여 나노입자를 선택적으로 코팅할 수 있다. 상기 코팅은, 존재한다 하더라도, 바람직하게는 나노입자 내에서 흡수를 감소시키지 않는다.

나노입자의 크기 분포는 변할 수 있다. 일부 구현예에서, 최소한 약 60%의 나노입자는 나노입자의 평균 직경의 +/-10 nm 범위 내에 존재한다. 바람직하기로는, 최소한 약 70%의 나노입자는 나노입자의 평균 직경의 약 +/-5 nm 이내에 존재한다. 더욱 바람직하기로는, 최소한 약 70%의 나노입자는 나노입자의 평균 직경의 약 +/-3 nm 이내에 존재한다. 가장 바람직하기로는, 최소한 약 75%의 나노입자는 나노입자의 평균 직경의 약 +/-3 nm 이내에 존재한다. 상기 범위를 벗어나는 나노입자도 역시 본 발명의 범위 내에 속한다.

상기 LFA 시스템에서 사용되는 나노입자의 양 또는 농도는 각 분석법, 각 나노입자, 분석물 결합 분자 등에 따라 서로 다를 수 있다. 일반적으로, 나노입자의 양은 대략 l-100μg이다. 이 범위를 벗어나는 나노입자의 양도 사용될 수 있으며 본 발명의 범위에 속한다. 일 구현예로서, 뇌수막염 항원 분석에는 LFA당 약 4μg의 금 나노입자를 사용한다. 나노입자의 사용량은, 기타 다른 요소 중에서 결합 분자의 결합 친화력, 환자의 샘플에 존재하는 타겟 분석물의 농도 범위에 따라 특정 범위보다 더 높거나 낮을 수 있다.

다양한 샘플에 존재하는 분석물은 측정될 수도 있고 일반적으로 여하한 형태의 액체 샘플일 수도 있다. 상기 샘플은 생물학적 샘플, 화학적 샘플, 환경적 샘플, 음식 샘플 등일 수 있다. 생물학적 샘플은, 예를 들어, 혈액, 혈장(plasma), 혈청(serum), 뇨(urine), 땀(sweat), 담즙(bile), 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 대변(fecal material), 질액(vaginal fluids), 타액(saliva) 등을 포함한다. 다른 생물학적 샘플도 분석될 수 있고 본 발명의 범위에 속한다. 분석물을 포함하는 샘플은 직접 사용되거나 또는 희석제로 희석하여 사용할 수 있다. 희석제로는 다양한 용액이 사용될 수 있고 당업계에서 일반적으로 공지된 것이다. 일 구현예로서, 상기 희석제는 생리 식염수(saline solution)일 수 있다.

본 명세서의 방법 및 장치를 사용하여 다양한 분석물을 탐지할 수 있다. 타겟 분석물은 단백질, 펩타이드, 핵산, 합텐(hapten), 화학물질 등이 될 수 있다. 분석물은 또한 치료약, 약물 남용(drugs of abuse), 호르몬, 비타민, 글루코스 단백질, 항체, 스테로이드, 박테리아 또는 박테리아 감염, 곰팡이(fungi), 바이러스, 기생충, 박테리아 성분 및 생성물, 알레르기 항원(allergens), 항원 등을 포함할 수 있다. 분석물은 또한 관심 화합물의 유도체 또는 대사물(metabolites)을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 상기 분석물은 질병, 예를 들어, 말라리아, 결핵(TB) 등과 관련될 수 있다. 또한 일부 구현예에서, 상기 분석물은 생리학적 또는 병리학적 상태, 예를 들어, 임신과 관련될 수 있다. 분석물의 예로서는 뇌수막염 항원(CrAg), 말라리아 항원, 결핵 항원, hCG, 인간 황체 형성 호르몬(human luteinizing hormone; hLH), 인간 여포 자극 호르몬(human follicle stimulating hormone; hFSF), 전립선 특이 항원(prostate speific antigen; PSA), B형 간염 표면 항원(hepatitis B surface antigen), B형 간염 항체(hepatitis B antibodies), HIV 항원, 연쇄상구균(Streptococcus A), 포도상구균(Staphylococcus bacteria), 성병(STDs), 열대열 말라리아(P. Falciparum), 발열 패널(Fever panel) 등을 포함한다.

상기 분석물 결합 분자와 포획 분자는 타겟 분석물에 결합할 수 있는 여하한 분자가 될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 상기 분석물 결합 분자 및 포획 분자는 생물학적 고분자(macromolecules), 예를 들어 항체 또는 항체의 일부이다. 이들 분자는 또한 수용체(receptors), 리간드(ligands), 폴리뉴클레오티드, 폴리펩타이드, 글리코펩타이드, 지질단백질(lipoproteins), 핵단백질(nucleoproteins), 핵산, 압타머(aptamer) 등일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 분석물 결합 분자와 포획 분자는 항체이다. 일 구현예에서, 상기 분석물 결합 분자는 포획 분자와 동일한 것이다. 또 다른 구현예에서, 상기 분석물 결합 분자는 포획 분자와 다른 것일 수 있다.

상기 나노입자를 분석물 결합 분자에 접합(conjugate) 또는 결합(couple)하는 방법에는 여러 가지가 당업계에 공지되어 있으며, 이들 모두는 본 발명의 범위에 속한다. 일반적으로, 고온, 고습도 또는 저습도 및/또는 방사성 조건(radiative conditions)에서 개선된 안정성을 나타내는 접합 화학(conjugation chemistry)이 바람직하다. 화학 결합이란 입자를 분석물 결합 분자에 연결하는 화학적 기능기 및/또는 분자를 사용하는 것을 의미한다. 일례로서, 카르복실산을 입자의 표면에 위치시킴으로써 카르보디이미드 매개 분자(carbodiimide mediated molecule)를 통해 항체에 있는 아민 기능기에 연결하게 하는 것을 들 수 있다. 접합(Conjugation)은 수동적 흡수를 포함할 수 있다. 수동적 흡수는 당업계에 이미 공지된 것으로서, 예를 들어, 이하 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 US 2010/0136566에 개시되어 있다.

상기 포획 분자를 멤브레인에 증착(deposition)하는 방법으로 다양한 액체 분배(dispensing) 및 스프레이 방법이 당업계에 알려져 있다. 이들 중 여하한 방법이 사용될 수 있고, 포획 분자의 흡수 및 안정을 증진할 수 있는 스프레이 방법이 바람직하다. 분석물 결합 분자에 접합된 나노입자는 접합 패드에 스프레이할 수도 있다. 일 구현예로서, 바이오도트(BioDot™)의 다양한 액체 분배 기구를 이들 목적에 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 샘플에 있는 분석물을 탐지하는 방법을 포함한다. 상기 LFA 분석 감도는 이하 기재된 열대비 기술을 사용함으로써 육안 탐지 방법에 비해 상당히, 대략 10,000배 이상 개선될 수 있다.

상기 방법은 샘플을 샘플 패드와 접촉하여 액체가 모세관 현상에 의하여 멤브레인을 통하여 흐르는 것을 포함한다. 분석물 결합 분자와 접합된(conjugated) 나노입자는 샘플 인가에 반응하여 모세관 현상에 의하여 멤브레인 내에서 이동한다. 존재하는 경우, 타겟 분석물은 접합된 나노입자에 결합한다. 상기 나노입자/분석물 복합체는 검사 영역에 있는 포획 분자가 나노입자/분석물 복합체를 인식하고 결합하면 멤브레인을 통한 이동을 중지한다. 이로 인해 LFA의 검사 구역(zone)이나 영역(region)에 나노입자/분석물이 축적되게 된다. 상기 방법은 또한 열대비 판독기를 사용하여 우선 검사 영역을 레이저와 같은 에너지원에 노출시키고, 이어서 센서를 통해 검사 스트립에서 발생되는 열을 측정함으로써, 검사 영역에 존재하는 분석물의 양을 탐지 및 정량하는 것을 포함한다. 상기 센서에 의해 발생되는 출력은 타겟 분석물의 존재 여부 및/또는 양을 나타낸다.

상기 방법은 또한 복수 개의 분석물을 탐지하는 것을 포함할 수 있다. 복수 개의 분석물은 복수 개의 검사 영역을 가짐으로써 탐지될 수 있고, 각 검사 영역은 서로 다른 포획 분자를 가진다. 따라서, 제1 나노입자/분석물 복합체는 제1 분석물에 결합하는 제1 포획분자를 갖는 검사 영역 1에 결합하며, 제2 나노입자/분석물 복합체는 제1 분석물이 아니라 제2 분석물에 결합하는 제2 포획 분자를 갖는 검사 영역 2에 결합한다. 이런 방식으로, 상기 LFA 시스템은 복수 개의 검사 영역을 포함하도록 배열함으로써 복수 개의 분석물을 확인할 수 있도록 확대될 수 있다. 복수 개의 분석물은 또한 서로 다른 개시 위치(starting positions)를 가진 복수 개의 나노입자를 사용하여 탐지될 수 있다. 상기 나노입자는 서로 다른 접합체(conjugates) 및 분석물 결합 분자를 가질 수도 있다. 이는 멤브레인을 통하여 서로 다른 흐름을 갖도록 조절될 수 있다. 상기 복수 개의 분석물은 동일 샘플 내에 또는 서로 다른 샘플에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 복수 개의 분석물은 동일 검사 영역에서 검사될 수도 있다. 상기 복수 개의 분석물의 탐지는 대응 검사 영역에서 각 분석물, 바람직하기로는 분석물의 정량을 확인한다. 일부 구현예에서, 상기 복수 개의 분석물은 단일 검사 영역에서 탐지 및/또는 점증적으로 정량될 수도 있다. 예를 들어, 서로 다른 레이저 파장에서 흡수하는 서로 다른 입자를 이용하여 대응 파장을 갖는 레이저 여기를 이용하여 다중화(multiplexing)를 허용할 수 있다.

상기 방법은 또한 서로 다른 나노입자의 2차적으로 제어된 흐름의 사용을 통하여 신호를 증폭하는 것을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 1차 금 나노입자를 갖는 LFA로부터의 신호는 은 염색(silver staining) 또는 2차 결합 나노입자를 사용하여 증폭할 수 있다. 은 염색의 과정에 있어서, 상기 금 나노입자는 표면에 있는 은 쉘(silver shell)의 성장을 위한 핵생성 자리(nucleation site)의 역할을 할 수 있다. 2차 나노입자 결합 과정에서, 상기 2차 나노입자는 신호를 증폭하기 위하여 타겟 분석물을 포획하는 제1 입자에 결합한다.

본 발명의 방법은 또한 검사 영역에 존재하는 분석물의 양을 정량하는 것을 포함한다. 멤브레인의 열적 변화 측정은 검사 영역에 존재하는 분석물의 양과 관련이 될 수 있다. 상기 LFA 시스템은 분석물의 존재 유무를 제공하는 이점이 있을 뿐 아니라 또한 멤브레인 및 궁극적으로 샘플에 존재하는 분석물의 수준도 제공할 수 있다. 이는 특히 환자의 질병, 감염, 또는 상태의 정도를 결정하는 데 도움이 된다.

상기 검사 영역을 에너지원에 노출 후, 분석물의 존재 여부 및 양은 멤브레인의 검사 영역에서 열적 변화 또는 온도를 측정함으로써 탐지할 수 있다. 대안으로서, 초기 온도 변화율은 전자파 인체 흡수율(specific absorption rate; SAR)을 결정하는 데 사용될 수 있다. 전자파 인체 흡수율은 검사 영역에 존재하는 분석물의 양을 결정하는 데 사용될 수 있다. 전자파 인체 흡수율은 사실상 상기 식 (1)에서 Q에 해당한다. 이는 일단 나노입자가 레이저와 같은 에너지원에 의해 활성화되면, 상기 나노입자에 의해 W/㎥에서 방출된 열 에너지의 양과 관련된다. 상기 식(1)에 표시된 바와 같이, 전자파 인체 흡수율은 레이저 강도(laser fluence)및 나노입자 수와 직접적으로 비례하며, 이는 분석물에 있는 항원의 양과 직접 관련이 있다.

분석 감도의 개선과는 별도로, 상기 LFAs는 향후 분석을 위하여 보관할 수 있다. 다른 탐지 방법과는 달리, 열대비 시스템을 사용하면 신호의 손실이 없다. 형광(fluorescence) 측정에 있어서, 유기 형광단(organic fluorophores)은 광표백(photobleaching)을 겪게 된다. 몇몇 비색(colorimetric) 측정에 있어서, 염료(dyes)는 시간이 경과되면서 광분해(photodestruction)을 통해 신호를 잃을 수도 있다. 분석 수행 2주 후 열대비 판독한 결과는 거의 동일할 수 있다. 이로 인해 해당 분야에서 LFA를 현장진단(point-of-care)할 수 있고, 열대비 판독을 위하여 동일한 LFA 시스템을 중앙 실험실(central lab)에 처리하도록 의뢰하는 이점이 있다. 다시 말하면, 분석물 신호는 샘플을 가동 후 즉시 측정할 필요는 없다. 상기 신호는 복수 회, 예를 들어 분석이 완료된 즉시 및 이후의 시간에 측정될 수도 있다. 상기 방법은 검사 영역을 에너지원에 노출하고, 검사 영역에 있는 분석물을 분석 스트립이 샘플에 접촉 후 12 시간 후, 24 시간 또는 그 이상 후에 측정하는 단계를 포함할 수 있다.

효모균증(Cryptococcosis)은 모든 AIDS 관련 기회 감염(opportunistic infection) 중에서 가장 주요한 사망 원인 중 하나이기도 하고, 아프리카 성인의 뇌수막염(meningitis)의 가장 흔한 발병 원인으로서 매년 전세계적으로 500,000 만명 이상이 이로 인해 사망하고 있다. 크립토코쿠스성 뇌수막염(Cryptococcal meningitis)은 관행적으로 문화, 인디아 잉크, 또는 2배의 단계 희석(serial two-fold dilutions)에 의한 반-정량(semi-quantification)에 의한 뇌수막염 항원(CrAg) 검사의 조합을 통해 진단한다(즉, 뇌수막염 항원 역가(titer), 2배의 단계 희석을 수행 시 마지막 양성 검사로 정의됨).

본 명세서는 뇌수막염 항원의 탐지 및 정량에 대한 방법을 포함한다. 상기 방법은 샘플이 샘플 패드와 접촉하고, 액체가 모세관 현상에 의해 멤브레인으로 흘러들어가게 하는 단계를 포함한다. 뇌수막염 항원 결합 분자에 접합된 나노입자는 샘플 인가에 대한 반응으로서 모세관 현상에 의해 멤브레인 내에서 이동하게 된다. 존재하는 경우, 뇌수막염 항원은 접합된 나노입자에 결합한다. 상기 나노입자/뇌수막염 항원 복합체는 검사 영역에 있는 포획 분자가 나노입자/뇌수막염 항원 복합체를 인식하고 결합하면, 멤브레인 내에서의 이동을 중지한다. 이로 인해 LFA의 검사 영역에 나노입자/뇌수막염 항원 복합체가 축적되게 된다. 열대비 시스템은 우선 검사 영역을 레이저와 같은 에너지원에 노출시키고, 검사 스트립에서 발생되는 열을 열센서를 통해 측정함으로써, 검사 영역에 존재하는 뇌수막염 항원의 양을 탐지 및 정량하는 데 사용할 수 있다.

도 6은 라텍스 응집반응(latex agglutination)(R² =0.98)에 의해 1: 1024의 뇌수막염 항원 역가와 동일한 농도에 이르기까지 로그-선형 기울기(log-linear slope)를 갖는 열대비가 비색 탐지보다 32배 크게 개선된 분석 감도를 가짐을 보여준다. 1: 1024의 역가 이상에서는, 시각 강도의 감소와 열적 강도의 안정기(plateau)를 갖는 고농도 "후크(hook)" 효과를 보였다. 이것은 분석의 희석 또는 분석의 기술을 변경함으로써 해결할 수 있다. 또한, 상기 분석의 분석간 정밀도(inter-assay precision)는 이들 나노입자의 크기를 표준화하여 변동 계수(coefficient of variance)를 감소시킴으로써 개선할 수 있다. 비교를 위하여, 크립토코쿠스성 뇌수막염 환자에서 평균 뇌수막염 항원의 역가는 보통 1: 1024 내지 1:2048이다. 그러나, HIV 치료법에도 불구하고 100% 감도 및 96%의 특이성을 갖는 향후 크립토코쿠스성 뇌수막염 발병이 예상되는 준임상형 질병(subclinical disease)을 가진 무증상(asymptoomatic) 사람에서도 수 주일에서 수 개월에 걸쳐 뇌수막염 항원의 역가가 >1:8인 아급성 발병(sub-acute onset)이 있다. 진전된 AIDS를 갖고 사는 사람에게 혈청 뇌수막염 항원 스크리닝 및 예방 차원에서의 항진균 치료를 하면, 증후성(symptomatic) 뇌수막염으로의 임상적 진행을 방지한다. 뇌수막염 항원이 뇨에서 탐지가능하므로 비침입성 스크리닝(Non-invasive screening)이 가능하지만, 뇨는 혈액보다 뇌수막염 항원의 농도가 22배나 더 낮다. 따라서, 열대비에 의한 LFA 감도의 개선은 AIDS를 갖는 무증상 사람에게 비침입적 스크리닝이 가능하게 하고, 뇌수막염 항원의 성층화 부담을 정량화할 수 있다.

본 발명은 hCG 항원을 탐지 및 정량화하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 샘플을 샘플 패드와 접촉하고 액체가 모세관 현상에 의해 멤브레인으로 흘러들어가게 하는 단계를 포함한다. 상기 hCG 결합 분자에 접합된 나노입자는 샘플 인가에 대한 반응으로서 모세관 현상에 의해 멤브레인 내에서 이동하게 된다. 존재하는 경우, 상기 hCG는 접합된 나노입자에 결합한다. 상기 나노입자/hCG 복합체는 검사 영역에 있는 포획 분자가 나노입자/hCG 복합체를 인식하고 결합하면 멤브레인 내에서의 이동을 중지한다. 이로 인해 상기 LFA의 검사 영역에 나노입자/hCG 복합체가 축적되게 된다. 열대비 시스템은 우선 검사 영역을 레이저와 같은 에너지원에 노출시키고, 검사 스트립에서 발생되는 열을 열센서를 통해 측정함으로써 검사 영역에 존재하는 hCG의 양을 탐지 및 정량하는 데 사용할 수 있다.

본 발명은 말라리아 항원을 탐지 및 정량화하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 샘플이 샘플 패드와 접촉하고 액체가 모세관 현상에 의해 멤브레인으로 흘러들어가게 하는 단계를 포함한다. 상기 말라리아 항원 결합 분자에 접합된 나노입자는 샘플 인가에 대한 반응으로서 모세관 현상에 의해 멤브레인 내에서 이동하게 된다. 존재하는 경우, 상기 말라리아 항원은 접합된 나노입자에 결합한다. 상기 나노입자/말라리아 항원 복합체는 검사 영역에 있는 포획 분자가 나노입자/말라리아 항원 복합체를 인식하고 결합하면 멤브레인 내에서의 이동을 중지한다. 이로 인해 상기 LFA의 검사 영역에 나노입자/말라리아 항원 복합체가 축적되게 된다. 열대비 시스템은 우선 검사 영역을 레이저와 같은 에너지원에 노출시키고, 검사 스트립에서 발생되는 열을 열센서를 통해 측정함으로써 검사 영역에 존재하는 말라리아 항원의 양을 탐지 및 정량하는 데 사용할 수 있다.

본 발명은 결핵(TB) 항원을 탐지 및 정량화하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 샘플이 샘플 패드와 접촉하고 액체가 모세관 현상에 의해 멤브레인으로 흘러들어가게 하는 단계를 포함한다. 상기 결핵 항원 결합 분자에 접합된 나노입자는 샘플 인가에 대한 반응으로서 모세관 현상에 의해 멤브레인 내에서 이동하게 된다. 존재하는 경우, 상기 결핵 항원은 접합된 나노입자에 결합한다. 상기 나노입자/결핵 항원 복합체는 검사 영역에 있는 포획 분자가 나노입자/결핵 항원 복합체를 인식하고 결합하면 멤브레인 내에서의 이동을 중지한다. 이로 인해 상기 LFA의 검사 영역에 나노입자/결핵 항원 복합체가 축적되게 된다. 열대비 시스템은 우선 검사 영역을 레이저와 같은 에너지원에 노출시키고, 검사 스트립에서 발생되는 열을 열센서를 통해 측정함으로써 검사 영역에 존재하는 결핵 항원의 양을 탐지 및 정량하는 데 사용할 수 있다.

본 발명의 열대비 분석 시스템은 시각 판독기(visual readers)를 이용하는 분석법보다 훨씬 낮은 농도의 샘플에 존재하는 분석물을 탐지하는데 유용하게 사용될 수 있고, 다양한 샘플에 존재하는 분석물을 위한 고감도 탐지 시스템이다.

또한 상기 시스템은 시각 탐지 방법을 이용하는 비교되는 LFAs에 비하여 훨씬 조기에 질병 또는 상태를 탐지할 수 있고, 그 방법이 단순하여 최종 사용자가 그 시스템을 용이하고 정확하게 사용할 수 있다.

본 발명의 분석 키트는 최종 사용자가 분석 시스템을 이용하여 원하는 샘플을 처리하는 데 사용할 수 있으며, 이후 열대비 판독기를 사용하여 타겟 분석물 및/또는 타겟 분석물의 양을 탐지하는 데 사용할 수 있다.

도 1은 측면 유동 분석 검사 스트립 및 판독기 시스템을 간략히 나타낸 다이아그램이다.
도 2a는 휴대용 분석 판독기를 간략히 나타낸 블록 다이아그램이다.
도 2b는 벤치탑(bench top) 분석 판독기를 간략히 나타낸 블록 다이아그램이다.
도 3은 도 2a의 분석 판독기를 간략히 나타낸 블록 다이아그램이다.
도 4a 및 도 4b는 LFA 대 시간의 열적 반응(thermal response)을 나타낸 그래프이다.
도 5는 열대비 분석에 있어서 금 나노입자(gold nanoparticles; GNPs)의 사용을 나타낸 그래프이다.
도 6은 열대비가 어떻게 뇌수막염 항원(cryptococcal antigen; CrAg)을 위한 존재하는 면역크로마토그라피 측면 유동 분석법의 감지를 어떻게 개선하는지를 보여주는 그래프이다. 고농도에서 신호가 안정된 양상을 보이는 것은 LFA의 고용량 후크 효과(high dose hook effect)에 기인한 것이며, 파선은 대조군 샘플의 배경(background)을 나타낸다.
도 7a는 서로 다른 나노입자 모양에 대하여 나노입자 농도와 온도 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7b는 서로 다른 물질에 대한 온도 변화를 나타낸 그래프이다.
도 8a는 인간 융모성 생식선 자극 호르몬(Human chorionic gonadotropin; hCG)의 열대비 분석 결과 사진을 간략히 도식화한 것이다.
도 8b는 hCG의 열대비 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 말라리아 항원의 열대비 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10a 및 도 10b는 전자파 인체 흡수율(specific absorption rate; SAR)의 사용을 나타내는 그래프들이다.
도 11은 SAR을 사용하여 hCG의 열대비 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12a, 도 12b 및 도 12c는 각각 뇌수막염 항원(CrAg) 딥스틱(dipstick), hCG 딥스틱 및 합성된 금 나노입자(GNPs)에서 금 나노입자의 다분산성(polydispersity)을 나타내는 사진이다.
도 13은 합성된 금 나노입자(GNPs)의 균일한 크기를 나타내는 배치도(plot)이다.

실시예

실시예 1 - 금 나노입자(GNPs)의 합성 및 분석

금 나노입자의 합성: 프렌스 지, 페라울트 및 네하 등(Frens G., Perault et al. and Neha et al.)에 기재된 바와 같이, 클로로어릭 애시드(chloroauric acid)를 사이트레이트 환원(citrate reduction)하여 30 nm의 금 나노입자를 합성하고, 수용액에서 안정성을 유지하기 위하여 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 코팅하였다(참조, Frens G. Nat. Phys. Sci. 1973; Perrault, Steven D. et al. Nano Letters 2009 9 (5) 1909-1915; Neha B. Shah et al. Molecular Pharmaceutics 2012 9 (8) 2146-2155). 합성과 농도 정량 및 크기를 성공적으로 수행하기 위하여, UV-Vis 분광광도계(spectrophotometer), 원자방출분광(atomic emission spectroscopy), 동적 광산란(dynamic light scattering) 및 투과전자현미경(TEM)을 이용하여 금 나노입자의 특성을 파악하였다. 금 나노입자 수용액을 적정 농도(titrated concentrations)로 준비 후, 각 용액의 l0 μL를 유리 슬라이드에 방울로 옮겼다. CW Laser(532 nm, Millennia Vs, Diode pumped)로부터 레이저 빔을 1분간 방울에 조사하여 금 나노입자 열발생을 유도하였다. 샘플 위에 일정 각도로 설치한 적외선 카메라(FLIR Thermovision™ A20)를 사용하여 레이저 조사 동안에 원격으로 온도 변화를 측정하였다. 각 샘플에 대한 최대 온도 변화는 열적 이미지를 토대로 결정하고 표시하였다.

용액의 금 나노입자의 열대비와 시각 대비를 비교하였다. 금 나노입자를 일련의 서로 다른 농도로 준비하였다. 금 나노입자 용액의 l0 μL 를 현미경 슬라이드 위에 올려놓았다. 시각 분석을 위하여, 디지털 카메라로 사진을 찍은 후, J 이미지(Image J)로 분석하였다. 열적 분석을 위하여, 금 나노입자 용액을 레이저(0.5W, 532 nm)로 조사한 후 온도 변화를 적외선 카메라로 기록하였다.

상기 결과에 따르면, 금 나노입자는 시각 대비에 의한 2.5 x 10¹¹ 나노입자/mL 에 비하여, 열대비를 사용시에는 2.5 x 10⁹ 나노입자/mL 와 같이 낮게 탐지할 수 있었다. 상기 결과는 열대비를 통한 탐지가 전체 분석 감도를 약 100배 정도 개선할 수 있음을 입증한다(도 5). 금 나노입자의 열대비를 또한 미세유체(microfluidic) ELISA에서 광범위하게 사용되는 표준 마이크로-볼륨 플레이트 판독기(micro-volume plate reader)를 사용하여 표준 광학밀도 측정과 비교하였다. 동일한 샘플 부피(10μL)에 대하여, 열대비는 광학밀도 측정에 비해 50배 개선을 나타내었다. 열대비의 작동범위를 확장하기 위하여, 더욱 고파워의 레이저를 사용하거나 금 나노입자의 서로 다른 농도에 대한 레이저 파워를 조정함으로써 열대비 감도를 더욱 개선할 수 있다. 중요한 것은, 레이저 파장을 더 높은 흡수력의 나노입자(금 나노로드)로 조정함으로써 감도를 높일 수 있다.

실시예 2 - 뇌수막염 항원(CrAg)의 탐지

열대비와 비색 탐지(즉, 시각 대비)의 분석 수행을, 이미 인코포레이티드(Immy, Inc.)에서 구입하고 신 등(Qin et al. Angewandte Chemie 2012)에 기재되어 있는, 뇌수막염 항원(CrAg) 탐지용 FDA-승인 LFAs를 사용하여 검사하였다.

LFAs의 열대비 이미징: 2011년 7월 FDA-승인 뇌수막염 항원 LFA(Immy, Inc. Norman, OK)는 혈청(serum) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid; CSF)에 있는 크립토코쿠스 속(Cryptococcus species) 복합체(크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans) 및 크립토코쿠스 가트리(Cryptococcus gatlii))의 캡슐 폴리사카라이드 항원을 탐지한다. 크립토코쿠스형 뇌수막염 환자에서 얻은 혈청 샘플은 뇌수막염 항원으로서 탐지 한계를 평가하기 위하여 2배 단계 희석을 수행하였다. 상기 검사는 제조업자의 지침에 따라 수행하였다. 열대비는 레이저로 검사 라인을 1분간 조사함으로써 수행하였다. 적외선 카메라를 사용하여 온도 변화를 기록하였다. 각 수평 검사 밴드의 3 스폿(spots)을 조사한 후 평균 최대 온도 변화를 측정하였다. 각 농도에서, 세 개의 별개의 LFA 딥스틱(dipsticks)을 가동하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

시각 대비 정량화: 상기 금 나노입자 방울을 디지털 카메라를 사용하여 이미지를 촬영하였다. 상기 딥스틱은 평판 스캐너(flatbed scanner)(Model: Visioneer Onetouch 7400)를 사용하여 스캔하였다. 관심 영역(regions of interest; ROI)의 평균 회색 강도, 즉, 방울과 딥스틱 용 검사 밴드를 분석하였다. 동일한 부피의 금속 나노입자 용액(l0 μL)을 테이크3 마이크로-볼륨 플레이트(Take3 micro-volume plate) 및 시너지 HT 멀티-모드 마이크로플레이트 리더(Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader)(BioTek, Winooski, VT)가 구비된 분광 광도계를 사용하여 530 nm에서 측정하였다.

1:32768 역가에서 라텍스 응집 반응이 양성인 혈청 샘플(Immy, Inc.)의 LFA 2배 단계 희석물을 비교하였다. 그 결과, LFA에 대한 민감도는 열대비가 비색 시각 탐지에 비하여 실제로 더 높은 민감도를 보였다. 도 6은 1 : 1024의 뇌수막염 항원 역가와 동일한 농도에 이르기까지 로그-선형 기울기룰 갖는, 열대비가 비색 탐지에 비해 32배 더 개선된 분석 감도를 가짐을 보여주고 있다. 1: 1024의 역가 이상에서는, 시각 강도의 감소와 열적 강도의 안정기(plateau)를 갖는 고농도 후크 효과를 보였다.

FDA-승인 뇌수막염 항원 LFAs를 사용하여, 항원 농도를 정량함과 동시에 열대비의 분석 감도가 32배 증가됨이 확인되었다(도 6). "판독기가 구비된 일회용 신속 진단 검사(RDT)" 모델에서 상기 감도의 증가는, 증후성 및 무증상 뇌수막염 항원(CrAg⁺) 모두를 위하여 제한된 자원 영역에서 뇌수막염 항원의 스크리닝 및 정량을 가능하게 함으로써, 이전에 정성 LFA로 탐지되지 않은 환자에서 예방적 항진균 치료(preemptive antifungal therapy)를 가능하게 한다.

실시예 3 - LFAs의 분석 감도 개선

LFAs의 분석 감도를 더욱 개선하기 위하여 로드, 쉘 및 스피어와 같은 다양한 금 나노입자의 실험적으로 측정된 흡수 단면(absorption cross section)을 토대로 모델링을 수행하였다. 금 나노로드, 금 나노쉘, 금 나노스피어를 포함하는 금 나노입자를 평가하였다. 도 7a에 도시된 바와 같이, 동등한 레이저 파워 및 나노입자 농도에서, 전형적인 나노로드 및 나노쉘은 금 나노스피어보다 열 발생이 각각 4,6배 및 36배 더 많다. 입자 크기 효과를 제거하기 위하여, 상기 흡수 단면(Cabs)을 입자 부피(V)로 표준화(normalize)함으로써 열발생 능력 평가를 개선하였다. 상기 비교를 위하여 사용된 금 나노입자의 크기는 다음과 같았다: 스피어 D=30 nm, 나노로드 D=12.7 nm by L=49.5 nm, 나노쉘 Dcore=(120) nm (실리카), Dshell=150 nm (금). 열대비(ΔΤsignal) 및 나노입자 농도는 표준화된다. 상기 표준화를 사용하여, 금 나노로드는 금 나노스피어 및 금 나노쉘에 비해 열 발생에 있어서 약 10배 더 효율적이었다(도 7a, 삽입). 또한, 현재 LFAs(즉, 두꺼운 백킹 물질을 갖는 얇은 니트로셀룰로오스 멤브레인)은 배경 열 또는 소음을 발생하는 레이저 에너지(532 nm 에서)의 상당량을 흡수한다. 따라서, 플라스틱이나 유리 같은 낮은 흡수(즉, 고투과 또는 고반사) 백킹 물질의 사용은 더 높은 레이저 강도를 사용하게 한다(I).

기질 흡수(substrate absorption): 블랭크(blank) 딥스틱 및 플라스틱 및 유리 커버글래스를 532 nm에서 레이저로 1분간 각각 조사하였다. 레이저 조사 동안의 온도 변화는 적외선 카메라를 통해 측정하였고, 최대 온도 변화를 결정하였다(도 7b 참조). 높은 흡수 나노입자와 낮은 흡수 LFA 백킹 물질의 조합은 감도를 높일 수 있다. 금 나노로드는 금 나노스피어에 비해 다른 파장에서 더 효과적으로 흡수할 수 있다.

출력 밀도(power density)(532 nm)를 100배 증가(즉, 레이저 파워를 0.01에서 1 W로 증가)시키고 흡수(Cabs)를 10배 증가한 나노입자를 사용함으로써 열대비를 1000배 추가 향상시킬 수 있다. 상기에서 배경 흡수를 감소시킴으로써 더 높은 레이저 파워를 사용할 수 있다.

시각 탐지에 비해 분석 감도가 10배 이상이 개선됨이 밝혀졌고 또한 여기에 기재된 변경을 통해 1000배의 개선이 예측되는 것을 고려하면, 분석법의 분석 감도를 약 10,000배 향상시킬 수 있다.

실시예 4 - hCG의 탐지

샘플 내 인간 융모성 생식선 자극 호르몬(임신 검사)의 존재 여부를 금 나노입자를 갖는 LFA를 사용하여 검사하였다. 상기 hCG LFA는 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)(Sure-Vue 혈청/뇨 hCG 검사 키트)에서 구입하였다.

도 8a 및 도 8b에 도시된 바와 같이, 열대비는 시각 탐지에 비해 hCG의 존재 여부에 대한 감도가 향상되었다. 열대비를 사용 시 탐지 한계가 20배 향상되었다.

실시예 5 - 말라리아 탐지

말라리아 항원의 존재 여부를 금 나노입자를 갖는 LFA를 사용하여 검사하였다. 말라리아 LFA는 알러 인코포레이티드(Alere Inc) (BinaxNOW™ 말라리아 검사)에서 구입하였다.

도 9에 도시된 바와 같이, 열대비는 시각 탐지에 비해 말라리아 항원의 존재 여부에 대한 감도가 더 우수하였다. 열대비를 사용 시 탐지 한계가 8배 향상되었다.

실시예 6 - 결핵(TB) 탐지

결핵의 존재 여부를 금 나노입자를 갖는 LFA를 사용하여 검사하였다. 결핵 LFA는 알러 인코포레이티드(Determine™ TB LAM 신속 검사)에서 구입하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다. 열대비는 담배양(sputum culture)의 참조 표준을 바탕으로 대부분의 시각적 음성 결핵 LFAs(즉, 가음성(false negatives))를 탐지한다.

방법	탐지된 비율	탐지된 %

결핵-LAM LFA - 시각적	0/39	0
결핵-LAM LFA - 열적	22/39	56
담배양	39/39	(100)

열대비는 가음성 검사 결과를 감소시키므로 상기 결과는 검사 감도의 증가를 의미한다.

실시예 7 - hCG를 위한 전자파 인체 흡수율(SAR) 사용

이 실험은 열대비를 전자파 인체 흡수율(SAR)을 사용하여 수행할 수 있는지 여부를 알기 위하여 실시하였다. 실시예 1-7의 열대비는 ΔΤ를 바탕으로 실시하였다. 전자파 인체 흡수율은 온도변화의 초기 기울기를 바탕으로 한다.

도 10a는 연장된 기간 동안의 온도 변화를 나타내고 있다. 도 10b는 처음 20초 동안의 온도 변화를 나타낸다. 도 10a 및 도 10b에 도시된 바와 같이, 열대비는 전자파 인체 흡수율을 계산함으로써 수행할 수 있다. 이와 같이 함으로써, 더 조기에 측정을 함으로써 간섭(interference)을 최소화할 수 있다. 특히, 시간 경과에 따른 열 부가(heat addition)는 물질의 확산을 유도한다. 만일 열이 아주 빨리 추가되어 확산이 최소화되면, 온도 변화율은 완전히 전자파 인체 흡수율(또는 식(1)의 Q)에 관련되므로, 보다 직접적으로 금 나노입자의 존재 여부, 따라서 검사에서의 항원을 포획할 수 있다. 이는 펄스 레이저를 사용할 수도 있다. 도 11은, 온도 변화 대신에 전자파 인체 흡수율을 결정하는 것을 제외하고, 상기 실시예 4에서 기재된 바와 같이 hCG를 사용한 실험에서 얻은 결과를 보여주고 있다. 도시된 바와 같이, 전자파 인체 흡수율은 감도나 정확성의 손실 없이 분석물을 탐지하는 데 사용할 수 있다.

실시예 8 - 단분산 입자(monodisperse particles)의 사용

나노입자는 실시예 1에 기재된 바와 같이 프렌즈(Frens) 방법을 사용하여 제조하였고 이의 분산성을 분석하였다.

도 12a, 도 12b 및 도 12c에 도시된 바와 같이, 합성된 금 나노입자는 딥스틱에서 금 나노입자보다 휠씬 균일하게 분산된다.

도 13은 도 12의 투과 전자현미경 이미지에 나타난 결과를 정량화한 것이다. 특히, 서로 다른 크기의 금 나노입자의 수를 더하고, 그래프는 프렌즈(Frens) 방법을 사용하여 합성한 딥스틱보다 기존의 딥스틱 내에서 훨씬 더 넓은 분포를 갖고 있음을 보여준다.

비록 본 발명이 특정 실시예에 의하여 기재하고 있지만, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명이 개량 및 변화될 수 있다는 것은 당업자에게 있어서 자명할 것이다.

Claims

에너지원(energy source), 센서, I/O 회로소자(circuitry) 및 분석 스트립(assay strip)을 수용하는 개구(opening)를 포함하고, 상기 에너지원을 분석 스트립의 검사 영역 쪽으로 활성화함에 따라 센서 결과를 출력 신호로 전환하도록 구성된 열대비(thermal contrast) 분석 판독기.
청구항 1에 있어서, 상기 에너지원이 레이저인 것을 특징으로 하는 열대비 분석 판독기.
청구항 1에 있어서, 상기 센서가 적외선 카메라인 것을 특징으로 하는 열대비 분석 판독기.
청구항 1에 있어서, 상기 분석 스트립의 검사 영역이 나노입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 열대비 분석 판독기.
청구항 1에 있어서, 상기 판독기는 벤치탑(bench-top) 장치이고, 상기 출력 신호가 벤치탑 장치의 디스플레이에 표시되는 것을 특징으로 하는 열대비 분석 판독기.
청구항 1에 있어서, 상기 판독기는 휴대용(handheld) 장치이고, 상기 출력 신호가 휴대용 장치의 디스플레이에 표시되는 것을 특징으로 하는 열대비 분석 판독기.
청구항 1에 있어서, 상기 출력 신호가 유선 연결을 통해 다른 장치에 전달되는 것을 특징으로 하는 열대비 분석 판독기.
청구항 1에 있어서, 상기 출력 신호가 무선 연결을 통해 다른 장치에 전달되는 것을 특징으로 하는 판독기.
샘플 패드, 검사 스트립, 분석물 결합 분자에 접합된(conjugated) 나노입자, 검사 영역, 제어(control) 영역 및 샘플이 인가 시 유체 통신(fluid communication)을 하도록 구성된 흡수 패드를 포함하는 분석 시스템(assay system); 및
열대비 분석 판독기
를 포함하는 분석 키트(assay kit).
청구항 9에 있어서, 상기 나노입자는 은, 그래핀(graphene), 금 및 이의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 키트.
청구항 9에 있어서, 상기 나노입자는 나노스피어(nanospheres), 나노로드(nanorods) 및 나노쉘(nanoshells) 및 이의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 키트.
청구항 9에 있어서, 상기 검사 스트립은 니트로셀룰로오스 멤브레인을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
청구항 9에 있어서, 상기 열대비 분석 판독기는 에너지원 및 센서를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
청구항 9에 있어서, 상기 분석물은 뇌수막염 항원(CrAg), 결핵(Tb) 항원, 인간 융모성 생식선 자극 호르몬(hCG), 말라리아(malaria) 항원, 연쇄상구균(Strep A), 포도상구균(Staph), 성병(STDs), 열대열 말라리아(P. Falciparum), 발열 패널(Fever panel) 또는 이의 조합인 것을 특징으로 하는 분석 키트.
청구항 9에 있어서, 상기 샘플은 혈액, 혈장, 뇨, 타액 또는 이의 조합인 것을 특징으로 하는 분석 키트.
청구항 9에 있어서, 상기 검사 영역은 포획분자(capture molecules)를 포함하고, 검사 영역의 포획분자는 분석물 결합 분자와 동일한 것을 특징으로 하는 분석 키트.
청구항 9에 있어서, 상기 검사 영역은 포획분자(capture molecules)를 포함하며, 검사 영역의 포획분자는 나노입자에 접합된 분석물 결합 분자와 다른 것을 특징으로 하는 분석 키트.
청구항 9에 있어서, 하나의 분석 시스템에서 복수 개의 다른 분석물이 탐지되는 것을 특징으로 하는 분석 키트.
청구항 9에 있어서, 상기 열대비 분석 판독기는 샘플에 존재하는 분석물의 정량적 양을 제공하는 것을 특징으로 하는 분석 키트.
청구항 9에 있어서, 상기 분석물 신호는 샘플이 인가된 후 적어도 24시간 후에 측정되는 것을 특징으로 하는 분석 키트.
분석 시스템의 검사 스트립을 샘플과 접촉한 후, 분석 시스템의 검사 스트립의 검사 영역을 에너지원에 노출하는 단계; 및
검사 영역에서 분석물의 유무를 탐지하기 위하여 검사 영역에서 발생하는 열을 센서를 이용하여 측정하는 단계를 포함하고;
상기 샘플은 모세관 현상에 의해 검사 스트립을 통해 이동하고, 분석 시스템은 샘플에 존재하는 분석물에 결합하는 분석물 결합 분자에 접합되는 나노입자와 포획분자를 포함하는 검사 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는,
샘플에 존재하는 분석물을 탐지하는 방법.
청구항 21에 있어서, 상기 탐지된 분석물은 뇌수막염 항원(CrAg), 결핵(Tb) 항원, 인간 융모성 생식선 자극 호르몬(hCG), 말라리아(malaria) 항원 또는 이의 조합인 것을 특징으로 하는, 샘플에 존재하는 분석물을 탐지하는 방법.
청구항 21에 있어서, 상기 샘플은 혈액, 뇨, 타액, 혈장 또는 이의 조합인 것을 특징으로 하는, 샘플에 존재하는 분석물을 탐지하는 방법.
청구항 21에 있어서, 하나의 분석 시스템에서 복수 개의 다른 분석물이 탐지되는 것을 특징으로 하는, 샘플에 존재하는 분석물을 탐지하는 방법.
청구항 21에 있어서, 상기 센서는 샘플에 존재하는 분석물의 정량적 출력(quantitative output)을 제공하는 것을 특징으로 하는, 샘플에 존재하는 분석물을 탐지하는 방법.
청구항 21에 있어서, 상기 분석물 신호는 즉시 측정되지 않는 것을 특징으로 하는, 샘플에 존재하는 분석물을 탐지하는 방법.
청구항 21에 있어서, 상기 분석물 신호는 은 증폭(silver amplification)을 이용하여 증강되는 것을 특징으로 하는, 샘플에 존재하는 분석물을 탐지하는 방법.