ES2635912T3 - Detección rápida de células en replicación - Google Patents

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ES2635912T3 ES09166028.2T ES09166028T ES2635912T3 ES 2635912 T3 ES2635912 T3 ES 2635912T3 ES 09166028 T ES09166028 T ES 09166028T ES 2635912 T3 ES2635912 T3 ES 2635912T3
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Abstract

Instrumento para detectar microcolonias de células diana en una muestra, comprendiendo dicho instrumento: (a) un detector de matriz fotoeléctrico que tiene óptica de recogida para detectar un área de detección que tiene al menos una dimensión que es >=1 mm sin aumentar dicha área de detección más de 5 veces; (b) una fuente de iluminación que ilumina dicha área de detección; y (c) un ordenador programado para recibir los datos recogidos por dicho detector de matriz fotoeléctrico, y programado para el análisis de imágenes que comprende analizar dichos datos para detectar una o más microcolonias que tienen una medición de menos de 50 micrómetros en al menos dos dimensiones ortogonales, y programado para cuantificar el número de microcolonias detectadas en dicha área de detección, en el que dicho instrumento detecta una propiedad óptica intrínseca de las microcolonias y en el que dichas células en dichas una o más microcolonias siguen siendo competentes para replicarse tras la detección.

Description

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DESCRIPCION
Deteccion rapida de celulas en replicacion Antecedentes de la invencion
La invencion se refiere a la deteccion, enumeracion e identificacion de celulas en replicacion, especialmente celulas microbianas (por ejemplo, bacterias, levaduras y mohos), en muestras medicas, industriales y medioambientales. El cultivo microbiano es la metodologfa predominante en estos mercados, debido a sus muchas caractensticas atractivas. La invencion aborda la desventaja principal del cultivo microbiano (el periodo de tiempo necesario para lograr resultados) mientras que conserva los atributos beneficiosos del metodo.
Cultivo microbiano para detectar y enumerar microbios
Durante los siglos XIX y XX, surgio una comprension referente al papel de las bacterias, levaduras y mohos en la produccion de enfermedades infecciosas y en la determinacion de la calidad de alimentos y bebidas. Al principio, se desarrollo un metodo potente, el cultivo microbiano, para detectar pequenos numeros de microbios. El cultivo microbiano permite una deteccion visual sencilla de microbios aprovechandose de su propension a reproducirse en grandes numeros rapidamente. Por ejemplo, una unica celula bacteriana, que es demasiado pequena para verse a simple vista (aproximadamente una millonesima de un metro), cuando se coloca en caldo nutritivo, puede hacer que el caldo se vuelva visiblemente turbio en menos de 24 horas.
Una tecnica de cultivo microbiano relacionada, denominada enumeracion microbiana o recuento de colonias, cuantifica el numero de celulas microbianas en una muestra. El metodo de enumeracion microbiana, que se basa en la replicacion microbiana in situ, proporciona generalmente una “colonia” detectable visualmente para cada celula microbiana en la muestra. Por tanto, el recuento de colonias visibles permite a los microbiologos determinar el numero de celulas microbianas en una muestra de manera precisa. Para realizar la enumeracion microbiana, las celulas bacterianas pueden dispersarse sobre la superficie de agar nutritivo en placas de Petri (“placas de agar”) e incubarse en condiciones que permiten la replicacion bacteriana in situ. Los microbios individuales, visualmente indetectables, se replican repetidamente para crear un gran numero de microbios hijos identicos en el sitio ffsico en el que se deposito la celula microbiana progenitora. Las celulas hijas permanecen colocalizadas (esencialmente contiguas) con la celula original, de modo que la cohorte de celulas hijas (que puede crecer hasta decenas o centenas de millones de celulas) forma finalmente una colonia visible sobre la placa.
Se han desarrollado metodos electronicos para enumerar colonias microbianas. La mayona de tales metodos automatizan el recuento de colonias pero no aumentan sustancialmente la sensibilidad ni disminuyen el tiempo hasta conseguir resultados en comparacion con la enumeracion tradicional a simple vista. Los contadores de colonias usan una variedad de metodos opticos para detectar colonias incluyendo la deteccion de propiedades opticas intrmsecas de las microcolonias (por ejemplo, patente estadounidense n°: 3.493.772; patente estadounidense n°: 3.811.036; patente estadounidense n°: 5.290.701; Arkin, A. P., et al. (1990); Biotechnology (N Y) 8: 746-9) y cambios de color de moleculas indicadoras del pH en la matriz que rodea a las colonias (patente estadounidense n° 5.510.246). Tambien se han desarrollado metodos que usan tinciones o sondas para marcar las colonias y se trataran mas adelante.
El cultivo microbiano es un metodo extraordinariamente satisfactorio, tal como se evidencia por el hecho de que incluso tras mas de un siglo, el metodo predomina todavfa en microbiologfa medica y en las pruebas de control de calidad en microbiologfa industrial (por ejemplo, fabricacion de productos farmaceuticos, alimentos y bebidas). El metodo es economico, relativamente sencillo y ultrasensible. La sensibilidad del cultivo microbiano puede observarse en la prueba comun para patogenos transmitidos por alimentos en carne picada. Puede detectarse una unica celula patogena bacteriana microscopica en 25 gramos de carne picada usando el cultivo microbiano. Otra ventaja del cultivo microbiano es su capacidad para detectar una gran variedad de microbios de importancia medica e industrial.
Una ventaja de la replicacion bacteriana in situ es la capacidad para generar una poblacion de celulas pura, o clonal (denominada cultivos puros, clones o colonias). Un cultivo puro es una gran coleccion de celulas vivas identicas que desciende de la misma celula progenitora. Se requieren cultivos puros para metodos que identifican microbios y para determinar la resistencia a antibioticos. La microbiologfa medica se basa en gran medida en cultivos puros, dado que los patogenos bacterianos se afslan frecuentemente de muestras clmicas no esteriles (por ejemplo, heces o heridas) junto con bacterias no patogenas que probablemente son incluso mas numerosas que la celula patogena. El aislamiento de cultivos microbianos puros es tambien importante en microbiologfa industrial. Por ejemplo, los fabricantes de productos farmaceuticos y cosmeticos deben someter a prueba sus productos para detectar la presencia de contaminantes microbianos. Se usan cultivos puros de los microbios contaminantes para la identificacion microbiana, lo que determina si un lote de produccion debe desecharse y ayuda en la investigacion de la fuente de la contaminacion en el proceso industrial.
Enumeracion microbiana usando cultivo microbiano
5
10
15
20
25
30
35
Ventajas
•
ultrasensible
•
cuantitativa
•
genera cultivos puros
•
puede detectar y enumerar muchos tipos de microbios en una unica prueba
•
puede hacer crecer microbios selectivamente
•
solo detecta celulas en replicacion
•
economica
•
sencilla y facil de realizar
Desventajas
•
lenta
•
analisis y procedimientos manuales
•
no todos los microbios pueden cultivarse
Tabla 1.
La capacidad para cultivar microbios selectivamente es una herramienta esencial para la identificacion microbiana y para determinar la resistencia y la sensibilidad a agentes antimicrobianos tales como antibioticos. El cultivo selectivo se aprovecha del hecho de que diferentes microbios requieren diferentes condiciones de crecimiento. Estas diferencias surgen del hecho de que las cepas de microbios difieren en su composicion bioqmmica debido a diferencias geneticas inherentes. Por ejemplo, un tipo de microbio podna ser capaz de crecer en medio nutritivo que contiene el azucar sorbitol como unica fuente de atomos de carbono para impulsar su crecimiento, mientras que otro tipo de microbio no puede hacerlo. El crecimiento selectivo es importante en la industria alimentaria. Por ejemplo, puede explorarse una muestra de alimento para detectar un patogeno alimentario particular, Salmonella, sembrando en placa la muestra sobre medios que permiten que crezca Salmonella pero no otros microbios alimentarios.
De manera similar, se usa el cultivo selectivo para determinar que antibiotico es el mas eficaz para destruir una cepa bacteriana aislada del lfquido cefalorraqrndeo de un nino con meningitis bacteriana. Se usa un cultivo bacteriano puro (derivado de una colonia clonal de una placa de agar nutritivo) para inocular medio de crecimiento que contiene diversos antibioticos a diversas concentraciones. Se determina la terapia con antibiotico optima monitorizando la capacidad del microbio para crecer en presencia de los diversos antibioticos. La determinacion de la sensibilidad y la resistencia a antibioticos mediante crecimiento selectivo sobre la superficie de medio de agar nutritivo solido es otro enfoque comun. Por ejemplo, en el metodo de Kirby-Bauer, se colocan pequenos discos de papel de filtro impregnados con diferentes antibioticos sobre la superficie de placas de agar nutritivo recubiertas con un cultivo puro de bacterias de una muestra clmica. Un gradiente de antibiotico difunde radialmente hacia fuera desde el filtro. Las bacterias que son resistentes a altos niveles del antibiotico crecen hasta el borde del filtro. Sin embargo, las bacterias que son muy sensibles al antibiotico no pueden crecer a menos que esten lejos del borde del filtro. Tras incubar las placas (habitualmente durante uno o dos dfas), un microbiologo determina el nivel de resistencia a un antibiotico midiendo el grosor del anillo libre de crecimiento o la zona alrededor del filtro. Un metodo relacionado, la prueba “E” (diagnostico de Hardy), usa una tira rectangular que esta impregnada con un gradiente de antibiotico. Se determina el nivel de resistencia bacteriana midiendo el punto en la tira con la mayor concentracion de antibiotico cerca del cual las bacterias continuan replicandose.
La desventaja mas seria del cultivo microbiano es que es lento-lleva tiempo generar el numero de celulas requerido para la deteccion visual. El largo periodo de crecimiento requerido para el cultivo microbiano es un problema significativo tanto en la asistencia sanitaria como en la industria. Por ejemplo, debido a que se requieren dfas para cultivar e identificar el microbio que produce una infeccion sangumea en un paciente, un paciente con una infeccion sangumea fungica podna morir antes incluso de que se inicie la terapia antifungica. Algunos agentes infecciosos, tales como la bacteria que produce la tuberculosis, requieren generalmente semanas para crecer en cultivo. El largo tiempo requerido para detectar M. tuberculosis puede dar como resultado que un paciente con tuberculosis infecte a muchos otros de la enfermedad sumamente contagiosa o la cuarentena costosa de pacientes que no tienen tuberculosis.
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En la fabricacion de alimentos, los ciclos de pruebas largos pueden aumentar el deterioro de los alimentos o dar como resultado que material sometido a prueba de manera inadecuada avance hacia etapas de procesamiento posteriores. El cultivo microbiano lento tambien afecta de manera adversa a la produccion de productos biofarmaceuticos y vacunas. En estas aplicaciones, el proceso de fabricacion requiere a menudo la agrupacion de lotes. Debido a los largos ciclos de pruebas del cultivo microbiano y a la necesidad de hacer avanzar el material a traves del proceso de fabricacion, algunas veces no se detectan lotes contaminados hasta despues de una etapa de agrupamiento de lotes. Si se encuentra posteriormente que un lote contaminado se combino con lotes no contaminados, todo el conjunto de lotes combinados debe desecharse.
Otras desventajas del cultivo microbiano, tales como los procedimientos manuales tediosos y la incapacidad para cultivar algunos microbios, se consideran menos problematicas que el largo tiempo requerido. Por ejemplo, predominan metodos manuales para la enumeracion microbiana, aun cuando se han introducido instrumentos para la siembra en placa y el analisis automatizados. La mayona de los tipos de microbios encontrados en el medioambiente no pueden crecer en el laboratorio. Sin embargo, tales microbios a menudo no son perjudiciales para los seres humanos o son destruidos en procesos de fabricacion industrial y por tanto se ignoran para la mayona de las aplicaciones. Sin embargo, varias excepciones importantes de importancia medica cntica incluyen bacterias diffciles o imposibles de cultivar tales como Chlamydia, cuyas cepas pueden producir una enfermedad de transmision sexual y neumoma. Afortunadamente, estan disponibles en estos casos metodos alternativos independientes de cultivo (vease mas adelante).
Metodos de enumeracion rapida con cultivo bacteriano
Se han desarrollado varios metodos de cultivo microbiano para una enumeracion microbiana mas rapida (por ejemplo, patente estadounidense n°: 4.587.213). Un metodo de cultivo microbiano rapido deposita celulas bacterianas sobre portaobjetos de microscopio recubiertos con medio nutritivo. Usando examen microscopico, puede detectarse el crecimiento microbiano mucho mas pronto que a simple vista, dado que los microscopios pueden detectar microcolonias que resultan de un pequeno numero de divisiones celulares. Sin embargo, este metodo no es eficaz para someter a prueba muestras grandes que contienen numeros bajos de celulas microbianas, porque solo puede observarse un volumen muy pequeno de la muestra en un campo de vision microscopico. La baja sensibilidad de los metodos microscopicos limita generalmente su utilidad a muestras que contienen mas de diez mil celulas bacterianas por mililitro (estos metodos son mucho menos sensibles que el cultivo microbiano tradicional).
El advenimiento de sistemas electronicos de obtencion de imagenes ha conducido al desarrollo de numerosos “contadores de colonias” automaticos. Aunque la mayona de estos contadores estan disenados para ayudar al usuario automatizando el proceso de recuento de colonias y no disminuyen el tiempo hasta conseguir resultados, algunos sistemas han demostrado la capacidad para detectar colonias antes de que sean suficientemente grandes como para observarse facilmente a simple vista. Por ejemplo, el contador de microcolonias rapido Colifast (Colifast) puede detectar colonias pequenas marcadas de manera fluorescente de bacterias coliformes horas antes de que puedan observarse a simple vista. El sistema Colifast logra una deteccion potenciada usando un compuesto fluorogenico (una sustancia que no es fluorescente hasta que se metaboliza por bacterias coliformes) incluido en los medios de agar nutritivo.
Se ha comercializado recientemente un sistema para la enumeracion rapida de colonias microbianas usando marcaje bioluminiscente. El sistema MicroStar (Millipore) usa el ATP celular en microcolonias para generar luz a traves de la accion de sustratos y enzima luciferasa aplicados. El metodo reduce el tiempo hasta la deteccion sustancialmente. El sistema de obtencion de imagenes MicroStar tambien se ha usado junto con sondas marcadas para identificar bacterias espedficas (Stender, H., et al. J Microbiol Methods 46: 69-75 (2001)). Una desventaja del sistema es que el metodo de deteccion destruye los microbios, impidiendo el aislamiento de cultivos puros a partir de las colonias. El sistema tambien requiere un modulo intensificador de imagenes caro.
Un metodo basado en pelfcula instantanea para detectar microcolonias que contienen bacterias espedficas se ha desarrollado por Boston Probes (Perry-O-Keefe, H., et al. Journal of Applied Microbiology 90: 180-9 (2001)). Se marcan microcolonias microbianas sobre membranas usando sondas de ANP espedficas de microbios marcadas con una enzima que puede generar una senal quimioluminiscente. Las membranas se colocan entonces sobre una pelfcula instantanea o de rayos X para la obtencion de imagenes. El metodo se limita a la exploracion para detectar un microbio particular en un experimento. Un metodo similar usa sondas de ANP marcadas de manera fluorescente y un escaner en red (Stender, H., et al. Journal of Microbiological Methods 45: 31-9 (2001)). Estos enfoques requieren sustancialmente mas pericia que los metodos de cultivo tradicionales.
Enumeracion microbiana rapida sin cultivo microbiano
Los metodos mas rapidos para la enumeracion microbiana renuncian al cultivo microbiano. Los microbiologos industriales y medicos generalmente estan interesados solo en enumerar microbios viables -solo los microbios vivos pueden replicarse durante el cultivo microbiano. Por tanto, para que sean mas eficaces, los metodos que detectan celulas individuales sin dependencia de la replicacion celular deben distinguir los microbios vivos de los muertos usando sustitutos fisiologicos para la replicacion celular (por ejemplo, Nebe-von-Caron, G., et al., J Microbiol Methods 42: 97-114., 2000; Mignon-Godefroy, K., et al., Cytometry 27: 336-44, 1997). Las celulas se tinen con
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colorantes que miden una propiedad bioqmmica que esta correlacionada generalmente con la capacidad para replicarse (por ejemplo, actividad esterasa o respiracion bioqmmica). La validacion y el establecimiento de metodos sustitutos ha sido problematica ya que las muestras que se sabe que cumplen las normas reguladoras y que se puntuan como esteriles usando metodos de cultivo en placa tradicionales a menudo tienen miles de celulas que puntuan positivo para la actividad bioqmmica sustituta.
Un ejemplo de un sistema que detecta directamente celulas viables es el sistema ScanRDI (Chemunex). ScanRDI enumera celulas microbianas que estan tenidas con un sustrato de esterasa fluorogenico usando tecnologfa de barrido laser (patente estadounidense n°: 5.663.057; Mignon-Godefroy, K., et al., Cytometry 27: 336-44, 1997). Un sistema de barrido laser (que incluye un sistema de recogida optica que usa tubos fotomultiplicadores (PMTs)) captura una imagen del filtro y puede detectar celulas marcadas individuales. El sistema ilumina y consulta un area microscopica (generalmente de 4-14 |im) pero barre el haz progresivamente de modo que cubre un area macroscopica (por ejemplo, un drculo de 25 mm de diametro). El sistema esta disenado para detectar celulas con membranas intactas y enzima esterasa activa. Hay una correlacion entre los numeros de tales celulas y el numero de celulas que pueden formar colonias en medio de crecimiento. Sin embargo, este enfoque da como resultado a menudo un “recuento excesivo” sustancial, es decir, un numero de celulas superior al detectado mediante el cultivo tradicional (Costanzo, S., et al. (2002). PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 56: 206-219). Otra desventaja del sistema ScanRDI es que destruye los microbios durante el proceso de tincion impidiendo la generacion de cultivos puros a partir de los microbios detectados. Finalmente, los sistemas de barrido laser para la enumeracion celular son complejos y caros (cientos de miles de dolares), lo que hace diffcil justificarlos para aplicaciones microbiologicas de rutina. Se han comercializado tambien otros sistemas de barrido laser (Miraglia, S., et al., J Biomol Screen 4: 193-204, 1999; Tibbe, A. G., et al., Nat Biotechnol 17: 1210-3, 1999; Kamentsky, L., 2001, Laser Scanning Cytometry. En Cytometry, Z. Darzynkiewicz, H. Crissman y J. Robinsnon, eds. Methods in Cell Biology Vol. 63, parte A, 3a ed, Series Eds. L. Wilson y P. Matsudaira. (San Diego: Academic Press)).
La citometna de flujo es otro metodo potente que puede enumerar rapidamente microbios sin basarse en la replicacion celular (Alvarez-Barrientos, A., et al., Clin Microbiol Rev 13: 167-195, 2000). Partfculas u organismos individuales se fuerzan para que fluyan a traves de un canal estrecho, uno cada vez, por delante de un haz de laser. Ademas de la enumeracion, se recoge informacion sobre el tamano/la forma y la composicion analizando la emision de fluorescencia y la dispersion de luz producida por los organismos. Pueden analizarse miles de partfculas o celulas individuales por minuto. Pueden identificarse patogenos usando citometna de flujo mediante la union a organismos fijados de sondas de acido nucleico o anticuerpos espedficos de especie marcados de manera fluorescente (Alvarez-Barrientos, 2000, supra).
Pueden identificarse patogenos usando citometna de flujo mediante la union a organismos fijados de sondas de acido nucleico o anticuerpos espedficos de especie marcados de manera fluorescente (Alvarez-Barrientos, 2000, supra). Habitualmente, las dianas son celulas individuales de un tipo particular. Se han usado mas extensamente metodos de citometna de flujo para detectar cuantitativamente tipos celulares particulares basandose en la capacidad para unirse a sondas marcadas, habitualmente o bien anticuerpos o bien acidos nucleicos. Por ejemplo, se usa citometna de flujo para cuantificar los tamanos de poblaciones de clases de linfocitos en pacientes con SIDA. La citometna de flujo es un metodo mas complejo y caro que el cultivo tradicional. Aunque mas rapido que el cultivo tradicional, la citometna de flujo no tiene un lfmite de deteccion comparable al metodo tradicional. El cultivo microbiano tradicional puede detectar una celula bacteriana en 0,1 litros de agua, mientras que la citometna de flujo es lo mas eficaz cuando esta a niveles que son muchos miles de veces superiores a eso. Ademas, las dianas microbianas se destruyen a menudo por los metodos de tincion usados para la deteccion, eliminando la capacidad para producir cultivos puros.
El uso de la obtencion de imagenes microscopicas para visualizar y enumerar microorganismos directamente puede ser rapido y relativamente sencillo de realizar (Amann, R. I., et al., Microbiological Reviews 59: 143-69, 1995). Los ensayos de fluorescencia directa (DFA) en los que un anticuerpo marcado de manera fluorescente reacciona con una muestra fijada son un metodo comun en laboratorios de diagnostico clmico. Por ejemplo, muestras que se sospecha que contienen agentes bacterianos se tinen rutinariamente con tincion de Gram. De manera similar, para someter a prueba para detectar M. tuberculosis, las muestras se someten a tincion acidorresistente. La desventaja de esta tecnica es que es muchos miles de veces menos sensible que el cultivo microbiano. La baja sensibilidad se debe a los pequenos campos visualizados a un aumento alto. Solo a altas concentraciones de celulas diana es probable que los pequenos campos contengan una celula diana. Por tanto, por ejemplo, la identificacion fiable de patogenos bacterianos en esputos usando hibridacion in situ fluorescente requiere tftulos de aproximadamente 4 x 105 celulas/ml o mas. Las muestras clmicas obtenidas en infecciones comunes medicamente significativas pueden contener menos de 100 celulas/ml, una concentracion que no es ni con mucho lo suficientemente alta como para esperar encontrar una celula en un campo microscopico de alta potencia.
Se ha desarrollado un sistema que tiene la sensibilidad para detectar celulas bacterianas unicas usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas por investigadores de Hamamatsu Corporation (Masuko, M., et al., FEMS Microbiol Lett 67: 231-8, 1991; Masuko, M., et al., FEMS Microbiol Lett 65: 287-90, 1991; Yasui, T., et al., Appl Environ Microbiol 63: 4528-33, 1997). La obtencion de imagenes de grandes areas de celulas diana microscopicas individuales se logra usando una camara de CCD de recuento de fotones ultrasensible acoplada a un sistema de fibra optica, un intensificador de imagenes y un procesador de imagenes. Una desventaja de este sistema es el gran
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gasto en que se incurre debido a la incorporacion del intensificador de imagenes y la optica asociada. Ademas, a diferencia de los metodos de cultivo microbiano, el sistema no puede detectar ningun microbio, distinguir entre microbios vivos y muertos ni generar cultivos puros.
El documento US5.828.716 describe un enfoque que es radicalmente opuesto a esta tendencia que consiste en la mejora de las tecnicas para el recuento individual de acontecimientos, proponiendo la adquisicion de una imagen de microorganismos y celulas marcados ubicados sobre un sustrato con pocos aumentos, haciendo eso por medio de un dispositivo que genera imagenes acumulando y contando fotones, denominado en la memoria descriptiva camara acumuladora de fotones.
Enumeracion microbiana rapida cuantificando constituyentes moleculares de celulas.
En el ultimo medio siglo se han desarrollado numerosos metodos para detectar e identificar microbios basados en sus constituyentes moleculares. Aunque algunos de estos metodos son sustancialmente mas rapidos que el cultivo microbiano, ninguno ofrece todas las caractensticas del cultivo que son cnticas para los microbiologos. Por ejemplo, aunque se han comercializado numerosos inmunoensayos para microbios, esta tecnica no es inherentemente cuantitativa, es mucho menos sensible que el cultivo microbiano y no es tan potente como el cultivo para detectar muchos tipos de microbios en una unica prueba. O, como otro ejemplo, los metodos de amplificacion de acido nucleico pueden ser tan sensibles como el cultivo microbiano, pero no distinguen entre celulas vivas y no vivas y no pueden suministrar cultivos puros para pruebas de sensibilidad a antibioticos. Los metodos para analisis bioqmmico (por ejemplo, de acidos grasos, acidos nucleicos o protemas) usando electroforesis, espectrometna de masas y cromatograffa pueden ser potentes para la identificacion microbiana, pero habitualmente tales metodos son inapropiados para la enumeracion microbiana y generalmente son demasiado caros y complejos para el diagnostico microbiano de rutina.
Necesidades no cumplidas para la enumeracion microbiana
En resumen, las pruebas de enumeracion microbiana actuales estan dominadas por el cultivo microbiano. El cultivo microbiano tiene las importantes ventajas de ser sencillo, ultrasensible, economico y cuantitativo pero tiene la desventaja significativa de ser lento. El largo tiempo requerido para obtener resultados tiene costes importantes en la asistencia sanitaria y la fabricacion. Se han desarrollado metodos mas rapidos, pero aunque mejoran el tiempo hasta conseguir resultados, han sacrificado una o mas de las ventajas cnticas del cultivo microbiano.
Por tanto, hay una necesidad de una prueba que sea mas rapida que el cultivo microbiano tradicional pero que conserve los beneficios clave del metodo tradicional.
Sumario de la invencion
La presente invencion se define en las reivindicaciones adjuntas. La presente divulgacion permite la enumeracion eficaz, rapida y sensible de celulas vivas mediante la deteccion de colonias microscopicas que provienen de la division celular in situ usando obtencion de imagenes de grandes areas. Las pruebas de enumeracion microbiana basadas en la invencion abordan un problema importante en la microbiologfa clmica e industrial (el largo tiempo necesario para la deteccion de las pruebas tradicionales) mientras que conservan ventajas clave de los metodos tradicionales basados en cultivo microbiano. Las realizaciones de la invencion incluyen metodos asepticos no destructivos para detectar microcolonias celulares sin reactivos de marcaje. Estos metodos permiten la generacion de cultivos puros que pueden usarse para la identificacion microbiana y la determinacion de la resistencia antimicrobiana.
Se da a conocer un metodo para detectar celulas diana vivas en una muestra, comprendiendo dicho metodo las etapas de:
(a) proporcionar celulas diana vivas presentes en dicha muestra en una zona de deteccion que comprende un area de deteccion a una densidad inferior a 100 celulas diana por mm2 del area de deteccion, en el que dentro de dicha zona de deteccion dichas celulas estan dispersadas e inmovilizadas al azar;
(b) permitir la formacion de una o mas microcolonias de dichas celulas diana mediante replicacion in situ; y
(c) detectar dichas una o mas microcolonias;
en el que la dimension lineal mas larga de dicha area de deteccion es mayor de 1 mm; dichas una o mas microcolonias tienen una medida media inferior a 50 micras en al menos dos dimensiones ortogonales; dicha deteccion no supone un aumento superior a 5x; dicha deteccion detecta una propiedad de dichas una o mas microcolonias que no depende de la adicion de un resto de senalizacion o una molecula de union a una categona; y dichas celulas en dichas una o mas microcolonias siguen siendo competentes para replicarse tras dicha deteccion.
Ventajas
En la tabla 2 se enumeran algunas ventajas de diversas realizaciones de la presente divulgacion.
Realizacion
Ventajas
• Enumeracion y deteccion fluorescente sin reactivos de microcolonias
- Cambios mmimos con respecto a practicas aceptadas - Trayectoria reguladora mas rapida y con menos riesgos - Bajo coste de los artfculos - Simplicidad del sistema - Permite pruebas no destructivas (mas adelante)
• Optica de recogida optimizada para detectar microcolonias vivas
- Corto tiempo hasta la deteccion
• Obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas de microcolonias vivas individuales sobre membranas
- Permite una deteccion ultrasensible - Permite un amplio intervalo dinamico - Permite amplio intervalo de volumenes de muestra - Razon senal:fondo alta a bajos tttulos
• Enumeracion no destructiva (es decir, los microbios no se destruyen)
- Permite la generacion de cultivos puros - Permite la identificacion microbiana - Permite la deteccion de resistencia antimicrobiana - Permite la validacion interna (a continuacion)
• Comparacion interna con colonias visibles tradicionales
- Racionaliza la demostracion de equivalencia con respecto a metodos validados
• Obtencion de imagenes de microcolonias vivas en elementos desechables esteriles (cerrados)
- Permite multiples lecturas - Minimiza los falsos positivos
• Metodos y software que diferencian unicamente microbios en crecimiento de artefactos
- Robustez de deteccion anadida, especificidad - Permite la deteccion en muestras complejas
Tabla 2
El corto periodo de tiempo necesario para lograr resultados proviene de la capacidad para detectar microcolonias que contienen solo una pequena fraccion de las celulas que se requieren por los metodos tradicionales. Dado que la replicacion celular requiere tiempo, la deteccion de microcolonias pequenas usando la invencion proporciona 5 resultados mas rapidos que la deteccion de colonias visibles mas grandes usando metodos de enumeracion tradicionales. Para detectar microcolonias pequenas, la invencion usa una combinacion de metodos de generacion de senales y deteccion de senales eficaces.
La ultrasensibilidad (su capacidad para detectar pequenos numeros de celulas microscopicas en grandes muestras) proviene, en parte, del uso de obtencion de imagenes de grandes areas. Por ejemplo, el metodo dado a conocer 10 puede detectar colonias microscopicas sin aumento. Esta caractenstica permite que se inspeccione una gran area para detectar microcolonias en una unica imagen. La obtencion de imagenes de una gran area es una clave de la capacidad de la invencion para analizar eficazmente grandes volumenes de muestra. Por ejemplo, pueden depositarse los contaminantes microbianos en un gran volumen de una muestra sobre una membrana usando filtracion por membrana. El metodo, usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas de 15 microcolonias, puede analizar toda la membrana eficazmente. En cambio, el uso de un microscopio de alto aumento para evaluar las microcolonias en el mismo filtro podna requerir miles de imagenes.
La potencia para enumerar pequenos numeros de microcolonias en una gran area eficazmente tambien procede de la capacidad de la invencion para usar enfoques de obtencion de imagenes que comparan senales de objetos con
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fondos locales. Esta capacidad mejora la razon de senal con respecto al fondo para muestras que contienen pocas celulas con respecto a metodos que integran el fondo y la senal totales en una gran area.
La robustez del ensayo para muestras con pocas celulas se proporciona mediante la capacidad inherente del metodo para enumerar microcolonias en crecimiento. Por tanto, el metodo dado a conocer puede disminuir los falsos positivos con respecto a metodos que detectan una unica senal integrada, tales como metodos que cuantifican la presencia de biomoleculas (por ejemplo, ATP, antfgenos o acidos nucleicos). Cualquier artefacto que produzca una senal puede generar un falso positivo cuando se usan metodos que dependen unicamente de una senal integrada. Considerese una muestra que contiene 482 celulas microbianas cada una de las cuales genera 100 unidades de fluorescencia. El resultado de un metodo de integracion es un unico numero (48.200 unidades de fluorescencia). Artefactos que generan un numero similar de unidades de fluorescencia, por ejemplo, una gran partfcula de polvo fluorescente, pueden ser indistinguibles. Sin embargo, la invencion puede distinguir facilmente entre una unica partfcula de polvo fluorescente de polvo grande y 482 microcolonias en crecimiento individuales.
La deteccion de microcolonias en crecimiento es un metodo potente para diferenciar senales falsas positivas de objetos inanimados y celulas que no pueden crecer en las condiciones de prueba. Por ejemplo, considerese una prueba para detectar microcolonias microbianas en una membrana que se encuentra sobre medios de crecimiento solidos en una placa de Petri. En una realizacion de la invencion, se toman imagenes del area de deteccion antes de permitir que los microbios en el area de deteccion crezcan para dar microcolonias. Si estan presentes algunas partfculas de polvo fluorescentes o celulas de mamffero autofluorescentes en el area de deteccion, seran evidentes algunas senales positivas en esta imagen a “tiempo cero”. Tras incubar la placa de Petri para permitir la replicacion microbiana, se toma otra imagen. Cuando se alinean las dos imagenes en el registro, las senales positivas que corresponden a las microcolonias pueden distinguirse de los falsos positivos dado que los falsos positivos estan presentes (habitualmente sin cambios) en la imagen a “tiempo cero” y en la imagen tras la incubacion. Solo las microcolonias en crecimiento deben aparecer a lo largo del tiempo. Para confirmar las senales de microcolonias, pueden obtenerse las imagenes y compararse a multiples puntos de tiempo durante la incubacion. Solo las microcolonias en crecimiento deben aumentar en tamano y en intensidad de la senal a lo largo del tiempo.
Las pruebas construidas usando el metodo dado a conocer pueden tener un gran intervalo dinamico en comparacion con pruebas construidas usando metodos de la tecnica anterior. Por tanto, por ejemplo, una prueba basada en la invencion disenada puede detectar desde una hasta 106 microcolonias en una unica imagen. En cambio, los metodos de enumeracion microbiana tradicionales funcionan mejor cuando se depositan de aproximadamente 30 a 150 colonias sobre un filtro (de 47 mm de diametro). Los nuevos metodos de enumeracion (por ejemplo, ScanRDI de Chemunex y MicroStar de Millipore) tienen tambien intervalos dinamicos limitados.
Para lograr una generacion de senales eficaz, el metodo dado a conocer puede aprovecharse o bien de las propiedades opticas intrmsecas de las microcolonias (por ejemplo, autofluorescencia, reflectancia o dispersion de luz) o bien de diversos reactivos de marcaje aplicados de manera externa. La capacidad para aprovecharse de una variedad de propiedades opticas y metodos de marcaje permite la creacion de pruebas microbiologicas importantes. Por ejemplo, el uso de un metodo que detecta una propiedad ubicua de las microcolonias (por ejemplo, autofluorescencia o absorcion de infrarrojos) es util para pruebas que enumeran el contenido microbiano total de una muestra. Tales pruebas son cnticas en el procesamiento de alimentos para determinar la posibilidad de deterioro y para pruebas de liberacion de productos terminados en la fabricacion farmaceutica. Una realizacion importante de la invencion usa un sistema sin reactivos basado en la deteccion de autofluorescencia celular para detectar microcolonias microbianas pequenas. Esta realizacion proporciona un enfoque sencillo, no destructivo, aseptico para la enumeracion microbiana. Para detectar tipos de celulas espedficos, pueden usarse reactivos de marcaje espedficos de categona. Por ejemplo, puede usarse un anticuerpo marcado de manera fluorescente que se une espedficamente a Listeria monocytogenes para detectar microcolonias que provienen de celulas de este importante patogeno alimentario.
Como el cultivo microbiano tradicional, el metodo y el instrumento dados a conocer pueden aprovecharse de la potencia diagnostica de medir el crecimiento microbiano en condiciones selectivas. Por ejemplo, para determinar la resistencia bacteriana a antibioticos, pueden hacerse crecer bacterias en medio de crecimiento sobre el que se han colocado discos con antibioticos. El tamano de la zona sin crecimiento cerca de los discos determina la resistencia a antibioticos. El metodo y el instrumento dados a conocer pueden usarse para detectar el tamano de esta zona mas rapidamente. De manera similar, el metodo y el instrumento dados a conocer pueden usarse para detectar el crecimiento de microbios espedficos en medio selectivo rapidamente.
La simplificacion del ciclo de validacion de la prueba obligatorio en el que se muestra que un metodo nuevo es equivalente al “metodo de referenda” es otra ventaja de la invencion que proviene de la enumeracion no destructiva. La divulgacion facilita la equivalencia con respecto a las pruebas de cultivo como “metodo de referenda” permitiendo una comparacion interna de los metodos nuevo y antiguo. En resumen, tras obtener imagenes de las microcolonias que provienen de microbios en una muestra en un punto de tiempo temprano, pueden volver a incubarse las muestras durante la cantidad de tiempo requerida cuando se usa deteccion visual tradicional de colonias. De esta forma, puede realizarse una comparacion interna entre la enumeracion de las microcolonias de la divulgacion y la enumeracion de las mismas colonias en un tiempo posterior mediante el metodo tradicional.
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Otras caractensticas y ventajas resultaran evidentes a partir de la siguiente descripcion y las reivindicaciones.
Por celula diana se quiere decir una celula que esta potencialmente presente en una muestra y cuya presencia se somete a ensayo mediante la invencion.
Por categona de celulas diana se quiere decir multiples celulas diana que se consideran identicas para los fines de una prueba construida usando la invencion.
Considerese una prueba disenada para detectar cualquier cepa de bacterias E. coli. Para los fines de la prueba, la categona “E. coli” incluina por tanto cualquier bacteria de la especie E. coli. Una prueba de este tipo podna disenarse para detectar, sin diferenciacion, cualquier bacteria de la especie E. coli. Las bacterias y otras celulas diana que no son E. coli o bien no se detectanan en esta prueba o bien se detectanan e identificanan como que no son miembros del grupo E. coli. En cambio, considerese una prueba disenada para detectar el patogeno E. coli O157:H7, un subgrupo de la especie E. coli. El este caso, el subgrupo E. coli O157:H7 es una categona de celulas diana. Las bacterias del subgrupo, es decir, de la categona “E. coli Ol57:H7”, se detectan sin diferenciacion. Las E. coli que no estan en el subgrupo E. coli O157:H7 no se detectan mediante la prueba y por tanto no estan en la categona E. coli O157:H7.
No es necesario que las categonas esten relacionadas taxonomicamente como en el parrafo anterior. Por ejemplo, podna disenarse una prueba para detectar la categona de bacterias que produce una protema que se requiere para conferir resistencia al antibiotico vancomicina. Esta protema podna producirse por cepas bacterianas que no estan relacionadas estrechamente, es decir, que son miembros de especies dispares. Sin embargo, una cepa resistente a vancomicina de una especie es probable que este relacionada muy estrechamente con cepas sensibles a vancomicina de la misma especie. La categona de bacterias que producen la protema vanA (importante para lograr resistencia a vancomicina), por ejemplo, incluye bacterias resistentes a vancomicina del genero Enterococcus y del genero Staphylococcus, mientras que la mayona de los enterococos y estafilococos no estan incluidos en la categona. Por tanto, en este caso, puede observarse que la categona abarca celulas diana que se considera, para los fines de la prueba, que son identicas debido a una caractenstica comun, en este caso un componente molecular (un sitio de union espedfico de categona) en vez de una relacion filogenetica comun (genealogica).
Por categonas no solapantes de celulas diana se quiere decir grupos de celulas diana cuya union es el conjunto nulo. Es decir, la categona de todas las bacterias E. coli, la categona de todas las bacterias del genero Pseudomonas y la categona de todos los hongos son categonas no solapantes. Es decir, ningun miembro de ninguna de las categonas es un miembro de ninguno de los otros grupos.
Por complejidad categorica de una prueba se quiere decir el numero de categonas no solapantes que se detectan en la prueba.
Por sitio de union espedfico de categona se quiere decir un sitio en una celula diana que se une espedficamente a una molecula de union a una categona en condiciones de union espedficas y que distingue celulas diana que son miembros de una categona particular que va a identificarse en una prueba de celulas diana que no son miembros de esa categona pero que podnan estar presentes tambien en la muestra de prueba. Es decir, el sitio esta presente normalmente en todos los miembros de una categona, y normalmente no esta en ningun miembro de categonas no solapantes. Los sitios de union espedficos de categona se unen espedficamente a moleculas de union espedficas de categona.
Si una prueba explora una muestra para detectar una categona de celulas diana que constituye un grupo taxonomico, un sitio de union espedfico de categona es uno que esta presente en esencialmente todos los miembros de ese grupo taxonomico, pero que no esta presente en esencialmente todos los miembros de otros grupos taxonomicos que podnan estar presentes en la muestra de prueba.
Alternativamente, una prueba podna explorar una muestra para detectar sitios de union espedficos de categona que son compartidos por miembros de diferentes grupos taxonomicos. Ejemplos de este tipo de sitio de union espedfico de categona incluyen diversas macromoleculas (por ejemplo, ADN) y genes, ARNm y protemas que confieren resistencia a antibioticos, confieren virulencia o indican viabilidad. Un sitio de union espedfico de categona es a menudo una parte de un complejo o molecula mas grande. Por ejemplo, puede usarse una secuencia genomica espedfica de categona como sitio de union espedfico de categona en una prueba. Un sitio de union espedfico de categona de este tipo es parte de un genoma mucho mas grande que contiene (1) secciones que no son espedficas de categona; (2) secciones que son sitios de union espedficos de categona pero que la prueba no explora; y (3) otras secciones que son secuencias espedficas de categona distintas que la prueba explora.
Los sitios de union que estan presentes, por ejemplo en el 80%, 90%, 95%, o mas del 99% de las celulas diana que son miembros de una categona pero que estan ausentes, por ejemplo, en el 80%, 90%, 95%, o mas del 99% de las celulas diana que son miembros de todas las otras categonas de la misma clase, se consideran sitios de union espedficos de categona. Observese que un sitio de union espedfico de categona puede estar ausente trivial o excepcionalmente de una celula diana que es un miembro de la categona. De manera similar, un sitio de union espedfico de categona puede estar presente trivial o excepcionalmente en una celula diana que no es un miembro de una categona. Por ejemplo, considerese un sitio proteico que se produce esencialmente en todas las bacterias E.
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coli pero en ninguna otra especie bacteriana. Si, como podna ser el caso en menos de una celula entre millones de bacterias, una mutacion hace que no se produzca la protema, el marcador no estara presente en esa cepa de E. coli. Sin embargo, este sitio proteico se considera todavfa un sitio de union espedfico de categona. Alternativamente, el gen para la misma protema se transfiere a una cepa de una especie diferente de bacterias mediante tecnologfa de ADN recombinante o por medios naturales (por ejemplo, mediante transduccion viral). En este caso, una cepa bacteriana que no es un miembro de la categona E. coli expresana lo que se considerana todavfa un sitio de union espedfico de E. coli.
Por molecula de union a una categona se quiere decir una molecula o complejo molecular que se une espedficamente a un sitio de union espedfico de categona. Ejemplos de moleculas de union a una categona son sondas de acido nucleico que hibridan con ADN genomico; aptameros de acido nucleico que se han seleccionado o “evolucionado” in vitro para unirse espedficamente a sitios en protemas; anticuerpos que se unen a antfgenos celulares o protemas sericas; y ligandos tales como factor de crecimiento epidermico o biotina que se unen espedficamente a receptores de hormonas o a moleculas de union, tales como avidina. Se dice que dos moleculas de union a una categona son distintas si se unen a sitios de union espedficos de categona distintos y no solapantes. Puede hacerse referencia a moleculas de union a una categona segun su composicion molecular, por ejemplo, un ligando, anticuerpo, sonda, oligonucleotido, etc. de union a una categona.
Por una molecula de union a una categona que se une espedficamente a una categona de celulas diana se quiere decir una molecula de union a una categona que se une en condiciones de union definidas a esencialmente todas las celulas diana que son miembros de una categona explorada por una prueba, pero a esencialmente ninguna celula diana que no es miembro de la categona pero que es probable que este presente en la muestra. El numero de moleculas de union a una categona que se unen a celulas diana en una categona explorada en comparacion con el numero unido a celulas diana que no estan en una categona de ese tipo, es normalmente de dos veces, cinco veces, diez veces o mayor de cincuenta veces mayor.
Por condiciones de union se quiere decir las condiciones usadas en una prueba para lograr una union espedfica de moleculas de union a una categona a sitios de union espedficos de categona. Por ejemplo, cuando las moleculas de union a una categona son sondas de ADN espedficas de categona, las condiciones de union para una prueba particular podnan ser condiciones de hibridacion de ADN rigurosas. Las condiciones de hibridacion de ADN rigurosas apropiadas dependen de la naturaleza de las sondas, tal como conocen bien los expertos en la tecnica. Por ejemplo, para sondas de ADN tfpicas de longitud mayor de 500 bases, una condicion de union apropiada (denominada habitualmente “condicion de lavado” en la hibridacion nativa) es de 65°C a 0,2X SSC. Para unir un anticuerpo a un antfgeno, condiciones de union tfpicas son temperatura ambiente en PBS-TB.
Por una familia de moleculas de union a una categona se quiere decir un grupo de moleculas de union a una categona que se unen espedficamente a una categona particular de celulas diana.
Los anticuerpos policlonales constituyen generalmente familias de moleculas de union a una categona dado que generalmente comprenden multiples moleculas de union a una categona distintas que se unen a la misma categona de la celula diana. Observese que, a menos que se use purificacion por afinidad, las preparaciones de anticuerpos policlonales contienen tambien normalmente anticuerpos que no se unen a la categona elegida de celula diana y que pueden contener anticuerpos que se unen a otras categonas. Estan presentes anticuerpos adicionales porque el repertorio de anticuerpos de un animal esta determinado por la historia de infecciones del animal. Por tanto, los anticuerpos policlonales se purifican preferiblemente mediante metodos de afinidad. Las moleculas de union a una categona en una familia podnan unirse a algunas celulas diana en la categona pero no a otras.
Otro ejemplo de una familia de moleculas de union a una categona es un grupo de 80 secuencias de ADN genomico espedficas de categona que se producen en todas las cepas de E. coli Ol57:H7 pero que no se producen en miembros de otros grupos de bacterias. Esta familia de moleculas de union a una categona pueden hibridar como un grupo con celulas E. coli O157:H7 adecuadamente preparadas, pero no hibridan con otras categonas de celulas. Las familias pueden incluir diferentes tipos de moleculas de union a una categona. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal que se une espedficamente al antfgeno O157 y uno que se une a la protema intimina (un factor de virulencia) podnan incluirse tambien en la familia anterior de moleculas de union a una categona. Una familia de moleculas de union a una categona puede comprender cualquier numero de moleculas de union a una categona (es decir, una o mas).
Por familias no solapantes de moleculas de union a una categona se quiere decir familias de moleculas de union a una categona en las que cada familia se une espedficamente a una, y solo una, categona en un grupo de categonas no solapantes. Es decir, un grupo de familias no solapantes de moleculas de union a una categona delimita un grupo congruente de categonas no solapantes. Por ejemplo, en una prueba que explora los 4 organismos objetables para la USP, E. coli, Salmonella, Pseudomonas spp. y Staphylococcus aureus, hay cuatro categonas no solapantes. Una prueba de este tipo podna incorporar cuatro anticuerpos policlonales que no reaccionan de manera cruzada diferentes, cada uno espedfico para una de las categonas de prueba. Por tanto, la prueba comprende cuatro familias no solapantes de moleculas de union a una categona. Las familias no solapantes de moleculas de union a una categona en una prueba se denominan un conjunto de moleculas de union a una categona.
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Por un conjunto de moleculas de union a una categona se quiere decir un grupo de una o mas familias no solapantes de moleculas de union a una categona que se combinan en una mezcla para una prueba particular. Las pruebas que exploran para detectar multiples categonas no solapantes de celulas diana comprenden una familia de moleculas de union a una categona por categona. Todo el grupo de moleculas de union a una categona, que comprenden estas familias, se denomina conjunto.
Por la complejidad de molecula de union a una categona de un conjunto se quiere decir el numero de restos o moleculas de union a una categona distintos en un conjunto. Por ejemplo, si un conjunto de moleculas de union a una categona consiste en 234 sondas oligonucleotfdicas, la complejidad de molecula de union a una categona del conjunto sena de 234.
Por la complejidad de familia de un conjunto se quiere decir el numero de familias no solapantes de moleculas de union a una categona en un conjunto. La complejidad de familia es la misma que el numero mmimo de celulas diana requerido para unirse a una molecula de union a una categona de cada una de las familias de un conjunto. La complejidad de familia de una prueba corresponde a la complejidad categorica de una prueba, es decir, el numero de categonas distintas para las que se explora la muestra. En general, la complejidad de familia corresponde tambien al numero de firmas de senal distintas usadas en una prueba.
Por elemento de senal se quiere decir una molecula o partmula que genera directamente una senal detectable. La frase “genera directamente” se refiere al hecho de que los elementos de senal son la fuente inmediata o el modulador cntico de la senal detectable. Por tanto, si la senal son fotones que surgen de un fluoroforo, el fluoroforo es la fuente inmediata de los fotones y, por tanto, es un elemento de senal. Si la senal son fotones dispersados por una partmula de RLS, la partfcula de RlS es un elemento de senal. Alternativamente, si la senal es la luz transmitida o dispersada a partir de un producto precipitado cromogenico de la enzima peroxidasa del rabano, el producto cromogenico es el elemento de senal.
Una caractenstica de un elemento de senal es que un elemento de este tipo no puede dividirse en partes de manera que cada parte genere una senal que es comparable (en caracter, no necesariamente en intensidad) a la totalidad. Por tanto, un punto cuantico de 2 nM de diametro es un elemento de senal, ya que al dividirlo cambia el caracter (espectro de emision) de los nanocristales resultantes. Una partmula de 5 |im impregnada con un colorante fluorescente tal como fluorescema no es un elemento de senalizacion, dado que podna dividirse en partes de manera que cada parte tenga caractensticas de senalizacion comparables a la partmula intacta. La molecula fluorescema, en cambio, es un elemento de senalizacion. Los productos detectables de enzimas que generan senales (por ejemplo, luciferasa, fosfatasa alcalina, peroxidasa del rabano) se consideran tambien elementos de senal. Tales elementos de senal (o sus precursores cuando hay una conversion qmmica de un precursor en un elemento de senal) pueden ser sustancias difusibles, productos insolubles y/o intermedios inestables. Por ejemplo, la enzima fosfatasa alcalina convierte el sustrato quimioluminiscente CDP-Star (NEN; numero de catalogo nEL-601) en un producto activado, que es un elemento de senal emisor de fotones.
Por resto de senalizacion se quiere decir una molecula, partmula o sustancia que comprende o produce (en el caso de enzimas) uno o mas elementos de senal y que esta o puede estar conjugado con una molecula de union a una categona. El resto de senalizacion puede unirse a la molecula de union a una categona o bien covalentemente o bien no covalentemente y o bien directa o bien indirectamente (por ejemplo, mediante uno o mas restos “conectores qmmicos” o adaptadores). Ejemplos de restos de senalizacion incluyen puntos cuanticos carboxilados; un fluoroforo tal como Rojo Texas que se modifica para unirse a una sonda de acido nucleico o a una sonda de anticuerpos; partmulas de poliestireno fluorescentes recubiertas con estreptavidina (que pueden conjugarse con protemas de union espedficas de categona biotiniladas); un producto de replicacion en drculo rodante que contiene secuencias de acido nucleico repetidas cada una de las cuales puede hibridar con varios oligonucleotidos con colas de nucleotidos modificados de manera fluorescente y que contiene un oligonucleotido de union espedfico de categona en el extremo 5'. Un resto de senalizacion puede comprender elementos ffsicamente distintos. Por ejemplo, en algunos casos el resto de senalizacion es una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina) que esta conjugada a una molecula de union a una categona (un anticuerpo, por ejemplo). La senal se genera cuando un sustrato de fosfatasa alcalina (por ejemplo, CDP-Star, o BM purpura de NEN y Roche, respectivamente) se convierte en productos que son elementos de senal (por ejemplo, un intermedio inestable que emite un foton, o un producto cromogenico precipitable). No es inusual que las moleculas de union a una categona, los restos de senalizacion enzimaticos y el sustrato se apliquen a la reaccion en momentos distintos.
Por complejo de restos de senalizacion se quiere decir una celula ffsica que comprende mas de un resto de senalizacion y mas de una molecula de union a una categona. La asociacion ffsica de los restos de senalizacion y las moleculas de union a una categona en un complejo de restos de senalizacion debe ser estable (por ejemplo, los restos de senalizacion y las moleculas de union a una categona deben tener semividas medias de asociacion con el complejo de al menos un dfa en PBS a 4°C). Como ejemplo de un complejo de restos de senalizacion, se considera una micropartmula de poliestireno que esta recubierta por miles de moleculas de dos tipos: un anticuerpo espedfico de celula diana y fosfatasa alcalina. Un complejo de restos de senalizacion de este tipo se une a la celula diana mediante la molecula de union a una categona de anticuerpo conjugado. Cuando se incuba con un sustrato de fosfatasa alcalina cromogenico (el elemento de senal; por ejemplo, Bm purpura, Roche), puede generarse un punto coloreado que puede detectarse a simple vista. Alternativamente, el mismo complejo de restos de senalizacion,
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cuando se incuba con un sustrato de fosfatasa alcalina o bien quimioluminiscente o bien fluorescente, genera una senal o bien quimioluminiscente o bien fluorescente. Ejemplos adicionales de complejos de restos de senalizacion incluyen: partmulas de nano-oro conjugadas con anticuerpos marcados con fluorescema, y partmulas de latex conjugadas tanto con moleculas de union a una categona de oligonucleotidos como con esteres de acridinio que emiten quimioluminiscencia tras la adicion de peroxido de hidrogeno.
Por caracter de la senal de un elemento de senal o resto de senal se quiere decir el aspecto o aspectos de una senal generada por el resto de senalizacion del elemento de senal que es util para distinguirlo de otros elementos de senal o restos de senalizacion. Por ejemplo, el caracter de la senal de un resto de senalizacion marcado con fluorescema y rodamina es la fluorescencia. El caracter de un transpondedor de radio es la radiofrecuencia. Ejemplos del caracter de la senalizacion fotonica son la fluorescencia, dispersion de luz, fosforescencia, reflectancia, absorbancia, quimioluminiscencia y bioluminiscencia. Todos menos los dos ultimos ejemplos del caracter de la senalizacion fotonica dependen de la iluminacion externa (por ejemplo, una fuente de luz blanca, una fuente de luz laser o luz diurna). En cambio, la quimioluminiscencia y la bioluminiscencia son caracteres de la senalizacion que son independientes de las fuentes de luz externas.
Por la clase de un elemento de senal o resto de senalizacion se quiere decir la cualidad diferente de la senal que es util para distinguirla de otros elementos de senal o restos de senalizacion. Por ejemplo, un liposoma que esta marcado con colorante rojo se distingue de liposomas coloreados de manera diferente. El color rojo es su clase. Para un microtransmisor que transmite una senal de radiofrecuencia particular, la cualidad de la senal de radiofrecuencia que diferencia el microtransmisor de otros microtransmisores constituye la clase del elemento de senal.
Por firma de senal se quiere decir la cualidad de senalizacion distintiva de la combinacion de restos de senalizacion que se unen a una categona de celulas diana en una prueba. Una celula diana que se une a cuatro tipos de anticuerpos, uno de los cuales esta conjugado a una molecula de fluorescema y tres de los cuales estan conjugados con moleculas de rodamina, tiene una firma de senal que se describe mediante los espectros de emision y absorbancia ponderados combinados de la fluorescema y la rodamina.
Por complejidad de senal de una prueba o un conjunto de moleculas de union a una categona marcadas se quiere decir el numero de categonas de celulas diana que pueden marcarse claramente en la prueba o mediante la union al conjunto. Alternativamente, la complejidad de senal se define como el numero de firmas de senal distintas que se esperana que se produjesen si estuviese presente un miembro de cada categona de celula diana. Para algunas pruebas, la complejidad de senal de un conjunto de moleculas de union a una categona es la misma que el numero de categonas que explora la prueba. Otras pruebas, que exploran muchas categonas, pueden tener solo una complejidad de senal de uno.
Por fuerza de seleccion se quiere decir una fuerza que se usa para capturar, aislar, mover o secuestrar celulas diana. Los ejemplos de fuerzas de seleccion incluyen la gravedad, el magnetismo, el potencial electrico, la fuerza centnfuga, la fuerza centnpeta, la densidad de flotacion y la presion. Las celulas diana pueden movilizarse mediante una fuerza de seleccion que actua sobre la celula diana sola. Alternativamente, las fuerzas de seleccion pueden actuar espedficamente sobre celulas diana que estan asociadas con restos de seleccion (vease la definicion a continuacion).
Los ejemplos de la aplicacion de fuerzas de seleccion para movilizar celulas diana incluyen: centrifugacion de celulas diana; seleccion magnetica de celulas diana unidas a partmulas magneticas; sedimentacion gravitacional de celulas diana marcadas con partmulas metalicas; y deposicion de celulas diana sobre una membrana porosa mediante filtracion a vado.
Por resto de seleccion se quiere decir un atomo, molecula, partmula o celula que pueden conjugarse con una molecula de union a una categona y que confiere a la molecula de union a una categona la capacidad de capturarse, aislarse, moverse o secuestrarse selectivamente mediante una fuerza de seleccion. Cuando un complejo de molecula de union a una categona:resto selectivo se une espedficamente a una celula diana, generalmente la celula diana tambien puede capturarse, aislarse, moverse o secuestrarse selectivamente mediante la fuerza de seleccion. Selectivo se refiere a la concesion preferente de sensibilidad a la movilizacion mediante la fuerza de seleccion sobre restos de seleccion y celulas asociadas con respecto a celulas no asociadas con restos de seleccion.
Partmulas paramagneticas y ferritina son ejemplos de restos de seleccion. Una partmula de sflice densa que se hunde en disolucion es otro tipo de resto de seleccion. Tales partmulas, cuando se recubren con moleculas de union a una categona y se unen a una celula diana microbiana, produciran que la celula diana se hunda en disolucion acuosa, permitiendo asf la separacion de la celula diana unida de otros constituyentes no unidos de la muestra.
Por caracter selectivo se quiere decir el aspecto o aspectos de un resto de seleccion que es util para capturar, seleccionar o mover el resto de seleccion. Por ejemplo, el caracter selectivo de una partmula paramagnetica es el magnetismo. El caracter selectivo de una partmula de sflice que se hunde rapidamente en disolucion acuosa es la masa.
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Por un sustrato o una superficie aproximadamente plana se quiere decir una superficie que puede alinearse en paralelo con un plano imaginario de manera que cuando la distancia se mide desde puntos en cualquier cuadrado de 1 mm x 1 mm en la superficie hasta los puntos mas cercanos en el plano imaginario, el valor absoluto de la distancia media es inferior a 50 micrometros.
Por superficie de deteccion se quiere decir la superficie de un sustrato aproximadamente plano sobre el que se depositan celulas diana. En realizaciones que usan un caracter de senalizacion fotonico, si la superficie de deteccion es opticamente transparente, la deteccion puede efectuarse a traves de cualquier cara de la superficie de deteccion. Si la superficie de deteccion es opaca, la deteccion se efectua a traves de la cara de la superficie de deteccion sobre la que se depositan las celulas diana.
Por area de deteccion se quiere decir el area de la superficie de deteccion que se muestrea simultaneamente mediante un dispositivo de deteccion. Por ejemplo, la seccion de un portaobjetos de vidrio del que se obtienen imagenes simultaneamente mediante un dispositivo optico que incluye una lente de recogida y un chip de CCD podna medir 0,8 cm x 0,5 cm. El area de deteccion es entonces de 0,4 cm2.
Por zona de deteccion se quiere decir el volumen en el que pueden detectarse celulas diana en replicacion mediante el dispositivo de deteccion. La zona de deteccion tiene las mismas dimensiones que el area de deteccion pero tiene una profundidad correspondiente a la profundidad en la que la senal de las celulas diana en replicacion puede detectarse e identificarse. La profundidad de la zona de deteccion es dependiente por tanto de los criterios umbral usados para puntuar una senal positiva. Cuando se usa deteccion optica, la profundidad de la zona de deteccion depende de la profundidad optica del campo.
Por la dimension mas larga de un area de deteccion se quiere decir la lmea de longitud maxima que puede trazarse entre dos puntos en el penmetro del area de deteccion. Por ejemplo, si el area de deteccion es un rectangulo que mide 0,3 cm x 0,4 cm, la dimension mas larga del area de deteccion es la diagonal, 0,5 cm. Si el area de deteccion es una elipse con un semieje mayor de una longitud de 7 mm y un semieje menor de una longitud de 2,5 mm, la dimension mas larga del area de deteccion es de 14 mm.
Por deteccion de grandes areas u obtencion de imagenes de grandes areas se quiere decir un metodo para detectar celulas diana microscopicas en el que el area de deteccion (el area que se analiza simultaneamente mediante el dispositivo de deteccion) es mucho mas grande que las dimensiones de las celulas diana o microcolonias. El area de deteccion para la deteccion de grandes areas tiene al menos una dimension lineal que es > 1 mm. En cambio, las colonias microscopicas son sustancialmente mas pequenas, midiendo normalmente menos de 50 |im en al menos dos dimensiones ortogonales. Ejemplos de deteccion de grandes areas incluyen la obtencion de imagenes de un area de deteccion de 9 mm de diametro con una camara de CCD; la obtencion de imagenes de un rectangulo de 2 cm x 1 cm explorando con un detector de matriz lineal que tiene una dimension larga de 1 cm; y la obtencion de imagenes de un filtro de 4 cm x 4 cm usando exposicion directa sobre pelmula fotografica.
Algunas tecnologfas exploran muestras para detectar microcolonias pero no se aprovechan de la deteccion de grandes areas. Los ejemplos incluyen citometna de barrido por microhaz de laser en fase solida y examen microscopico de multiples campos microscopicos de alta potencia sobre un portaobjetos.
Por asociado de manera estable o conjugado se quiere decir una asociacion ffsica entre dos entidades en las que la semivida media de asociacion es al menos de un dfa en PBS a 4°C. Considerese, por ejemplo, el caso complejo de la adsorcion pasiva de protemas a partmulas de poliestireno. Hay varias clases diferentes de protemas adsorbidas. Algunas protemas estan asociadas de manera estable a la superficie con semividas de muchos meses. Otras protemas, tales como aquellas que estan unidas de manera suelta en la capa externa de protema adsorbida, pueden no estar asociadas de manera estable con las partmulas y pueden lixiviarse en el plazo de horas.
Por partmula se quiere decir una matriz ngida (es decir, con al menos algunas caractensticas de un solido), que mide menos de un milfmetro a lo largo de cualquier eje. Las partmulas pueden doparse o conjugarse con elementos de senal. Las partmulas se denominan a menudo partmulas o con terminos que reflejan sus dimensiones o geometnas. Por ejemplo, los terminos nanoesfera, nanopartmula o nanoperla se usan para referirse a partmulas que miden menos de 1 micra a lo largo de cualquier eje dado. De manera similar, los terminos microesfera, micropartmula o microperla se usan para referirse a partmulas que miden menos de un milfmetro a lo largo de cualquier eje dado. Los ejemplos de partmulas incluyen partmulas de latex, partmulas de poliacrilamida, micropartmulas de magnetita, ferrofluidos (nanopartmulas magneticas), puntos cuanticos, etc.
Por intensificador de imagen o tubo de imagen se quiere decir un dispositivo que amplifica una senal fotonica, tal como se define en el glosario de Inoue, Shinya, et al., Video microscopy: the fundamentals (Plenum Press, Nueva York, 1997; pag. 665): “Un dispositivo acoplado (mediante fibras opticas o lentes) a un tubo de camara de video para aumentar la sensibilidad. El intensificador es un tubo de vacfo con un fotocatodo en el extremo frontal que emite electrones segun la imagen enfocada tras el, una lente de electrones y/o placa(s) de microcanales que enfocan los electrones sobre un fosforo en el extremo trasero, y un acelerador de alto voltaje que aumenta la energfa de los electrones. Puede ser de una unica o multiples fases”. Se describe una variedad de tales intensificadores de imagenes en detalle en el Capftulo 8 de la misma referencia.
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Por deteccion simultanea en una seccion del area de deteccion se quiere decir la deteccion de la senal a partir de una seccion de una superficie de deteccion aproximadamente plana en una etapa. La obtencion de imagenes de grandes areas de dianas en un area de deteccion usando un chip de CCD, deteccion visual o integracion de senales a base de fotodiodos son ejemplos de deteccion simultanea.
Por identificacion se quiere decir determinar la categona o categonas de las que una celula diana es un miembro.
Por muestra se quiere decir material que se explora mediante la invencion para detectar la presencia de celulas diana.
Por deteccion visual directa se quiere decir deteccion visual sin la ayuda de instrumentacion aparte de lentes correctoras que pueden llevarse puestas.
Por detector fotoelectrico se quiere decir un dispositivo o instrumento artificial que transduce senales fotonicas a senales electricas. Ejemplos de detectores fotoelectricos incluyen detectores de CCD, detectores de tubos fotomultiplicadores y detectores de fotodiodos, por ejemplo, fotodiodos de avalancha.
Por energfa circunscrita o energfa encuadrada se quiere decir el porcentaje de fotones de una fuente de luz infinitamente pequena que son capturados en un pixel de una matriz fotodetectora.
Por radiacion termica se quiere decir la radiacion del cuerpo negro.
Por autofluorescencia celular o autofluorescencia se quiere decir la fluorescencia mostrada por celulas debido a la fluorescencia de constituyentes celulares intrmsecos naturales, tales como NADH y flavoprotemas oxidadas. Las celulas que expresan fluorescencia debido a protemas fluorescentes recombinantes tales como la protema fluorescente verde no se considera que son autofluorescentes.
Por replicacion in situ se quiere decir la replicacion de una celula diana en su sitio, de modo que las celulas hijas permanecen esencialmente colocalizadas con la celula diana progenitora. Por ejemplo, en el cultivo biologico in vitro de bacterias sobre placas de agar nutritivo, se depositan bacterias dispersadas individuales sobre una placa y se incuban en condiciones que permiten la replicacion bacteriana. Una bacteria en una determinada ubicacion se replica dando lugar a celulas de progenie que tambien se replican. Todas las celulas permanecen colocalizadas (esencialmente contiguas) con la celula original, dando lugar finalmente a una colonia visible sobre la placa. Donde hubo anteriormente una unica celula, hay ahora una colonia de mas de 107 celulas.
Por una microcolonia de celulas diana se quiere decir un grupo de celulas diana que se encuentran en proximidad ffsica estrecha entre sf, que se encuentran sobre (o ancladas a) una superficie y que son los descendientes clonales mediante amplificacion basada en replicacion in vitro e in situ de una unica celula diana ancestral. Una microcolonia generalmente es demasiado pequena para ser visible a simple vista (por ejemplo, menos de 50 micras de diametro).
Cualquier tipo de celula diana en division puede dar lugar a microcolonias en situaciones que conducen a una colocalizacion ffsica de los descendientes clonales de las celulas diana. Por ejemplo, las microcolonias podnan contener celulas animales o vegetales, hongos o bacterias.
Por iluminacion se quiere decir irradiar con radiacion electromagnetica. Puede usarse para iluminar radiacion electromagnetica de diversas longitudes de onda. Incluye, por ejemplo, radiacion con longitudes de onda en las regiones de rayos X, UV, visible e infrarroja del espectro. Observese que la radiacion de iluminacion no esta necesariamente en el intervalo visible.
Por elementos de senal o restos de senalizacion con caracter de senalizacion fotonico se quiere decir elementos de senal o restos de senalizacion que pueden detectarse a traves de la emision, reflexion, dispersion, refraccion, absorcion, captura o redireccion de fotones, o cualquier otra modulacion o combinacion del comportamiento de fotones. Algunos ejemplos de elementos de senal o restos de senalizacion que tienen caracter de senalizacion fotonico incluyen: el fluoroforo Rojo Texas (caracter de senalizacion fluorescente); CDP-Star (caracter de senalizacion quimioluminiscente); luciferasa (caracter de senalizacion bioluminiscente); parffculas de dispersion resonante de luz (caracter de senalizacion de dispersion de luz); BM purpura (caracter de senalizacion cromogenico o de absorcion de luz); y fosforos de conversion ascendente (absorcion de dos fotones de longitud de onda larga y emision de un foton de longitud de onda mas corta).
Por “numero” X “nombre de la disolucion” se quiere decir una disolucion acuosa que comprende los constituyentes del nombre de la disolucion a un numero de veces la concentracion de la disolucion (excepto para el agua). Por ejemplo, 10X EE contiene EDTA 10 mM/EPPS 100 mM (EE, o 1X EE, contiene EDTA 1 mM/EPPS 10 mM).
EE es una disolucion que es EDTA 1 mM/EPPS 10 mM. Antes de mezclarlos entre sf, los acidos conjugados de ambos componentes se llevan hasta pH 8,0 con NaOH
PB es tampon fosfato de sodio 0,1 M pH 7,4.
PBS es una solucion salina tamponada con fosfato que contiene: NaCl 120 mM, KCl 2,7 mM y tampon fosfato 10
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mM (sal de sodio) pH 7,4.
PBS-B es BSA al 0,1% (sin IgG; numero de catalogo de Sigma A-7638) en PBS.
PBS-T es Triton X-100 al 0,05% (numero de catalogo de Sigma X-100) en PBS PBS-TB es PBS/BSA al 0,1%/Triton X-100 al 0,05%
PBT es PBS/BSA al 0,1% (sin IgG; numero de catalogo de Sigma A-7638)/Tween-20 al ,05% (numero de catalogo de Sigma X-100)
LB es caldo Luria para el crecimiento de bacterias y se prepara tal como se describio anteriormente (Ausubel 1987, supra).
SSC es NaCl 150 mM/citrato de Na315 mM ajustado a pH 7,0 con HCl.
EDAC es (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil))carbodiimida.
TSA es agar de tripticasa soja (Becton Dickinson/Difco; numero de catalogo 236950).
TSB es caldo de tripticasa soja Bacto™ (numero de catalogo de Becton Dickinson 211822).
AP es fosfatasa alcalina.
BSA es albumina serica bovina.
CCD es un dispositivo de carga acoplada.
Ufc es la unidad formadora de colonias (una medicion de la concentracion bacteriana que corresponde al numero de celulas bacterianas viables).
FITC es isotiocianato de fluorescema.
ANP es acido nucleico peptidico.
A menos que se indique lo contrario, las cepas microbiologicas descritas en la memoria descriptiva se obtienen de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Manassas, VA.
Breve descripcion de los dibujos
Figura 1. El cultivo microbiano tradicional requiere muchas generaciones de division celular.
El largo de tiempo hasta conseguir resultados del cultivo microbiano tradicional resulta del tiempo requerido para generar suficientes celulas diana microscopicas para que sean visibles a simple vista.
Figura 2. El concepto de deteccion rapida del crecimiento microbiano detectando microcolonias
La invencion logra una rapida enumeracion de celulas en crecimiento obteniendo imagenes de microcolonias que contienen menos celulas de las que contienen las macrocolonias que se detectan a simple vista usando el metodo tradicional. La invencion es mas rapida porque se requieren menos generaciones que para el metodo tradicional.
Figura 3. Un dispositivo de obtencion de imagenes CCD para la obtencion de imagenes de grandes areas
El dispositivo de obtencion de imagenes basado en CCD representado en la figura se uso para recoger muchos de los datos descritos en los ejemplos (vease tambien la etapa 5 de la seccion de Descripcion detallada). En un ejemplo, se proporciona luz de excitacion introduciendo luz de una fuente de luz blanca de alta intensidad (lampara de arco de xenon de 1000 vatios, modelo A-6000, Photon Technology Incorporated, Monmouth Junction, NJ) en una grna de luz lfquida (diametro de nucleo de 5 mm, modelo 380, Photon Technology Incorporated, Monmouth Junction, NJ). La grna de luz lfquida porta la luz hasta una rueda de filtros de excitacion (BioPoint FW, Ludl Electronics, Hawthorne, NY) y dirige el rayo filtrado (normalmente de 9 mm de diametro) sobre la superficie de deteccion que contiene las celulas diana marcadas. La superficie de deteccion es el fondo opticamente transparente de un pocillo de una placa de microtitulacion. Sin embargo, el mismo aparato puede detectar celulas diana marcadas en varias superficies de deteccion (por ejemplo, portaobjetos de microscopio, cubreobjetos y tubos con fondos planos, opticamente transparentes). La luz incidente choca contra la superficie de deteccion induciendo fluorescencia en los restos de senalizacion que estan unidos a celulas diana a traves de moleculas de union a una categona y que estan depositadas en la superficie opticamente transparente. Una parte de la luz fluorescente emitida se recoge mediante un sistema de lentes de alta eficiencia de recogida y se transmite a traves de una rueda de filtros de emision (BioPoint FW, Ludl Electronics) hasta una camara de CCD (Orca II, Hamamatsu, Bridgewater, NJ).
Figura 4. Un sistema de obtencion de imagenes de CCD para la obtencion de imagenes de grandes areas no
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aumentadas
La figura muestra un dispositivo de obtencion de imagenes de CCD con una configuracion de iluminacion angular en el que se introduce luz sobre la superficie de deteccion (mostrada en este caso como el fondo de un pocillo de una placa de microtitulacion) en un angulo desde el lado de la optica de recogida. El angulo se elige para optimizar la eficiencia de recogida y para evitar la obstruccion del rayo incidente por la lente de recogida. La ventaja de esta configuracion es que las reflexiones de la superficie del fondo del soporte de la muestra no se recogen por la lente de recogida y por tanto no contribuyen al ruido de fondo de la fluorescencia.
Figura 5. Deteccion sin reactivos de microcolonias usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas
La figura representa un metodo rapido para enumerar el crecimiento bacteriano sin usar un reactivo de marcaje. La autofluorescencia intrmseca de las celulas diana en microcolonias se detecta usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas basada en CCD. Las ventajas de este enfoque sin reactivos incluye su simplicidad, que no es destructivo y su amplia aplicabilidad. Alternativamente, pueden usarse reactivos de marcaje que se unen a sitios de union espedficos de celula diana (por ejemplo, anticuerpos fluorescentes o sondas de acido nucleico) para detectar microcolonias que contienen celulas diana.
Figura 6. Deteccion e identificacion de microcolonias bacterianas usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas (Ejemplo 1)
La figura muestra un metodo rapido, sencillo y sensible para detectar microcolonias mediante obtencion de imagenes de microcolonias marcadas usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas basada en CCD. En este ejemplo, se dejo que celulas individuales experimentaran varias generaciones de replicacion con el fin de formar microcolonias. Las microcolonias se marcaron o bien con Syber Green I o bien con un anticuerpo marcado con FITC. En la Figura 7, la fila superior de los paneles muestra el punto de tiempo de hora 0 que contiene celulas individuales. La fila inferior de paneles muestra las microcolonias tras 3 horas de incubacion. Hay un aumento sustancial en el tamano y la senal de los objetos detectados mediante la obtencion de imagenes de CCD a lo largo del tiempo debido al aumento en el numero de celulas en los sitios en los que se depositaron originalmente las celulas formadoras de colonias.
Figura 7. Deteccion basada en autofluorescencia de microcolonias bacterianas usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas (Ejemplo 2)
La figura representa un metodo rapido, sencillo y sensible para detectar microcolonias mediante obtencion de imagenes de senales autofluorescentes celulares usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas basada en CCD. Se depositaron celulas dispersadas individuales sobre un filtro, que se incubo en medio de crecimiento durante 5,25 horas a 37°C. Las microcolonias (que resultaban del crecimiento clonal de las celulas dispersadas individuales) generaron una senal autofluorescente sustancial (panel izquierdo) en comparacion con un filtro sobre el que no se depositaron bacterias (panel derecho) sino que se preparo de otra manera y se obtuvieron imagenes de manera identica.
Figura 8. Un metodo sencillo para validar una prueba de enumeracion microbiana rapida sin reactivos usando una comparacion interna con el metodo de cultivo tradicional (Ejemplo 3)
La figura muestra un metodo sencillo para demostrar la equivalencia de la enumeracion de microcolonias con el metodo tradicional. El uso de deteccion no destructiva de autofluorescencia de microcolonias permite que las microcolonias detectadas mediante la invencion vuelvan a incubarse hasta que maduren para dar las macrocolonias que se detectan usando el recuento de colonias visibles tradicional. Observese que el patron de puntos formado por las microcolonias (panel izquierdo) corresponde al patron formado por las colonias visibles (panel derecho), indicando la equivalencia de los dos metodos.
Figura 9. Exactitud y lfmite de deteccion de la deteccion de microcolonias autofluorescentes usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas (Ejemplo 4)
La figura muestra el metodo usado para medir la exactitud de la invencion cuando las muestras contienen niveles extremadamente bajos de celulas diana. Para cada uno de los 101 filtros, el resultado obtenido puntuando las microcolonias autofluorescentes fue igual que el resultado obtenido mediante el metodo tradicional.
Figura 10. Determinacion del numero de celulas microbianas en microcolonias bacterianas autofluorescentes detectadas rapidamente usando obtencion de imagenes no aumentadas sin reactivos (Ejemplo 5)
La figura muestra la senal generada a partir de microcolonias de E. coli usando obtencion de imagenes de grandes areas de microcolonias de Escherichia coli (panel superior). Las tres microcolonias de las que se obtuvieron imagenes con microscopfa de alta potencia en los paneles inferiores corresponden a las tres microcolonias de las que se obtuvieron imagenes usando la invencion en el panel superior. El numero de bacterias en cada microcolonia se indica debajo de cada imagen (45, 48 y 50 celulas). La figura demuestra que las microcolonias que contienen bajos numeros de celulas E. coli pueden detectarse usando obtencion de imagenes de grandes areas no
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aumentadas sin reactivos.
Figura 11. Deteccion e identificacion mediante obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas, basada en CCD de microcolonias bacterianas en una muestra de agua medioambiental (Ejemplo 6)
La figura muestra el analisis del crecimiento bacteriano usando la invencion para detectar colonias bacterianas en agua del no Charles. Se recogieron celulas bacterianas sobre filtros de ester mixto de celulosa. Se colocaron los filtros sobre una placa de agar R2A, y se incubaron durante 74 horas a 32,5°C. A diversos puntos de tiempo, se obtuvieron imagenes de los filtros usando reflectancia de luz blanca y autofluorescencia. Se identificaron macrocolonias que teman 0,55 mm o mas de diametro y se contaron en las imagenes de reflectancia. Se determinaron tambien los puntos de tiempo a los cuales podfan detectarse las microcolonias autofluorescentes que dieron lugar a macrocolonias. A diversos puntos de tiempo, se represento graficamente el porcentaje de las macrocolonias a las 74 h que podfan detectarse como microcolonias autofluorescentes.
Figura 12. Correlacion entre deteccion mediante obtencion de imagenes de grandes areas, no aumentadas, basada en CCD de microcolonias bacterianas y un metodo clasico de cultivo de vertido en placa para enumerar bacterias en una muestra (Ejemplo 7)
La figura compara la enumeracion de microcolonias autofluorescentes obtenidas usando la invencion y el metodo tradicional de vertido en placa de cultivo microbiano.
Figura 13. Linealidad e intervalo dinamico de una prueba de enumeracion sin reactivos (Ejemplo 8)
La figura muestra el analisis de intervalo dinamico y linealidad usando la invencion para detectar microcolonias autofluorescentes.
Figura 14. Pruebas de eficacia del conservante antimicrobiano sin diluciones de la muestra (Ejemplo 9)
La figura muestra que se obtienen resultados de eficacia del conservante antimicrobiano comparables usando metodos tradicionales y de la invencion. La comparacion muestra el potencial de la invencion para eliminar la mayona del trabajo y el gasto de esta prueba obviando la necesidad de analizar cientos de diluciones de la muestra.
Figura 15. Deteccion basada en autofluorescencia de un biologico con estres termico usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas (Ejemplo 10)
La figura muestra la correlacion entre la enumeracion de celulas indicadoras biologicas con estres termico usando la invencion y el metodo de vertido en placa tradicional. Se sometio el indicador biologico G. stearothermophilus a una variedad de regfmenes de estres termico. Se midio la autofluorescencia de las microcolonias usando obtencion de imagenes de grandes areas basada en CCD y se contaron visualmente las macrocolonias visibles. Los resultados de los dos metodos se representan graficamente unos frente a otros y muestran buena correlacion. Sin embargo, la invencion requena sustancialmente menos diluciones que el metodo tradicional.
Figura 16. Deteccion basada en autofluorescencia de microcolonias bacterianas en carne picada (Ejemplo 11)
La figura muestra los tiempos de deteccion de microcolonias autofluorescentes y macrocolonias que provienen de microbios en carne picada. El seguimiento del aspecto a lo largo del tiempo de microcolonias que dieron lugar a las macrocolonias a las 48 h mostro que el 100% de las macrocolonias se detectaron mediante la invencion a las 16 h. Esto muestra el potencial de la invencion para reducir el tiempo requerido para lograr resultados de manera significativa en comparacion con los metodos tradicionales.
Figura 17. Seleccion magnetica seguida por deteccion de microcolonias (ejemplo 12)
Se muestra un esquema para la seleccion magnetica de celulas diana seguida por crecimiento in situ y deteccion de autofluorescencia de las microcolonias usando la invencion.
Figura 18. Deteccion de bacterias en una muestra compleja con seleccion magnetica no espedfica seguida por deteccion de microcolonias usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas (Ejemplo 12)
La figura muestra los resultados de un experimento en el que se capturaron magneticamente bacterias S. aureus a partir de sangre completa. Las bacterias se seleccionaron a partir de una muestra de sangre usando partfculas magneticas recubiertas con una mezcla de agentes ampliamente reactivos que se unen a bacterias. Tras la filtracion, la siembra en placa y la incubacion (6 h), se detectaron las microcolonias autofluorescentes usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas. Se dejaron incubar los filtros durante la noche. Despues de eso, se obtuvieron de nuevo imagenes de los filtros (imagenes no mostradas) y se verifico la posicion de microcolonias de seis horas que han crecido para dar macrocolonias, eliminando la posibilidad de que se hubiesen confundido microcolonias con polvo u otros materiales particulados.
Figura 19. Esquema para las pruebas de sensibilidad antimicrobiana rapidas (Ejemplo 13)
La figura representa un metodo rapido para someter a prueba la sensibilidad de una cepa bacteriana a un antibiotico detectando el aspecto de microcolonias usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas basada en CCD. Para la cepa de bacterias mostrada, no pueden formarse microcolonias cuando las bacterias se hacen crecer en presencia del antibiotico (columna derecha) indicando sensibilidad al antibiotico. Las bacterias tampoco crecen 5 sin incubacion en condiciones de crecimiento (columna izquierda). Tal como se esperaba, se detecta crecimiento cuando la cepa se incuba en condiciones de crecimiento en ausencia del antibiotico (columna central).
Figura 20. Pruebas de sensibilidad antimicrobiana rapidas (Ejemplo 13)
La figura muestra los resultados de una prueba de sensibilidad antimicrobiana que compara el crecimiento de cepas bacterianas (una sensible a y una resistente al antibiotico tetraciclina) como microcolonias sobre placas de agar que 10 contienen el antibiotico. Se filtraron celulas bacterianas de cada cepa sobre una membrana de policarbonato, se colocaron sobre placas de agar LB que conteman tetraciclina y luego se incubaron durante tres horas a 37°C (columnas marcadas “hora 3”). Se colocaron otros filtros preparados de manera similar sobre placas de agar LB que conteman tetraciclina durante menos de 5 minutos a temperatura ambiente (columnas del panel marcado “hora 0”). Se fijaron los filtros y se tineron con una tincion de acido nucleico. La obtencion de imagenes de CCD de las 15 membranas que conteman bacterias que se incubaron durante tres horas (columna marcada: “CCD hora 3”) detecto el crecimiento de microcolonias sobre las membranas que conteman la cepa resistente pero no la cepa sensible. Se confirmo el crecimiento de microcolonias sobre los filtros que conteman la cepa resistente pero no la sensible mediante microscopfa de fluorescencia de alta potencia (columna marcada: “microscopio hora 3”). Tal como se esperaba, no se detectaron microcolonias en la imagen de CCD de los filtros que no se incubaron en condiciones de 20 crecimiento (columna marcada: “CCD hora 0”) y solo se detectaron celulas dispersadas individuales mediante microscopfa de fluorescencia de alta potencia. Se uso el analisis de imagenes por ordenador para cuantificar los resultados de la obtencion de imagenes de CCD de las membranas (grafico de barras). La membrana que contema microcolonias formadas por la cepa resistente genero aproximadamente 25 veces mas intensidad de lo que lo hizo la membrana que contema la cepa sensible. Los resultados de este experimento muestran que la deteccion de 25 microcolonias usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas es un metodo rapido y sensible para
las pruebas de sensibilidad antimicrobiana.
Figura 21. Pruebas de sensibilidad antimicrobiana rapidas usando el metodo de difusion de disco y obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas (Ejemplo 14)
La figura muestra los resultados de una prueba de difusion de disco para la sensibilidad antimicrobiana que compara 30 el crecimiento de cepas bacterianas (una sensible y una resistente). Pudieron detectarse microcolonias autofluorescentes, que crecfan sobre o cerca del disco de difusion, tras 5 horas de crecimiento, reduciendo en gran medida el tiempo hasta la deteccion de un crecimiento durante la noche convencional. El panel izquierdo muestra la cepa resistente a Tet que crece cerca del disco de difusion, mientras que el panel de la derecha muestra la falta de crecimiento de la cepa sensible a Tet. Se dejaron incubar las placas de difusion de disco durante la noche. Se 35 compararon las zonas de inhibicion a las 24 horas con las zonas a las 5 horas. La zona de inhibicion a las 24 horas
era igual que el resultado de microcolonias a las 5 horas, indicando que la invencion puede proporcionar resultados mas rapidos pero comparables en comparacion con el metodo tradicional.
Figura 22. Pruebas de sensibilidad antimicrobiana rapidas usando el E-test™ y obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas (Ejemplo 15)
40 La figura muestra los resultados de una prueba de sensibilidad antimicrobiana que compara el crecimiento de cepas bacterianas (una sensible y una resistente) usando tiras Etest™ que contienen el antibiotico tetraciclina. Se extendieron celulas bacterianas sobre placas de TSA. Se anadio directamente una tira E-test™ a las placas, que se incubaron a 37°C. Pudieron detectarse microcolonias autofluorescentes que crecfan sobre o cerca de la tira E-test™ tras 5 horas de crecimiento. El panel izquierdo muestra la cepa resistente a las 5 horas creciendo cerca del 45 segmento de 256 |ig/ml de la tira. El panel de la derecha muestra la cepa sensible a las 5 horas con una zona de inhibicion cerca del segmento de 2 |ig/ml de la tira. Las placas E-Test™ se dejaron incubar durante la noche. Las zonas de inhibicion a las 24 horas eran comparables a las zonas a las 5 horas, indicando que los resultados mas rapidos obtenidos con la invencion son comparables al metodo tradicional mas lento.
Descripcion detallada
50 Vision general de la invencion
La invencion analiza de manera rapida y economica una muestra mmimamente procesada para detectar celulas en crecimiento. Tanto el metodo de la invencion como el de cultivo bacteriano tradicional miden el crecimiento celular detectando la formacion de “colonias” bacterianas (agrupaciones de celulas asociadas que surgen a partir de celulas individuales mediante divisiones celulares sucesivas (Figura 1). Sin embargo, la invencion detecta el crecimiento 55 celular mas rapidamente que el cultivo microbiano tradicional, porque detecta microcolonias que aparecen en una fase mas temprana que las macrocolonias observadas visualmente mediante el cultivo microbiano tradicional (Figura 2, Figura 8). Usando los mismos principios del metodo que el cultivo microbiano, la invencion puede conservar las ventajas del metodo tradicional mientras que mejora todavfa el tiempo hasta conseguir resultados de manera
significativa.
Para entender como la invencion detecta microcolonias es util examinar una aplicacion y realizacion espedficas. Por ejemplo, considerese una prueba para enumerar los microbios en el agua usada para fabricar un producto farmaceutico inyectable. Los microbios en una muestra del agua (100 ml) se concentran e inmovilizan haciendo 5 pasar el Kquido a traves de una membrana porosa. La membrana que contiene los microbios se coloca en medio de
crecimiento nutritivo en una placa de Petri desechable. Los microbios se incuban a 32°C para dejar que se repliquen y formen microcolonias. Se dirige luz a la superficie de la membrana haciendo que las celulas en las microcolonias emitan autofluorescencia. Esta senal de autofluorescencia proviene de biomoleculas que estan presentes en las celulas (por ejemplo, NADH y flavoprotemas oxidadas). Se obtienen entonces imagenes de microcolonias 10 autofluorescentes de manera electronica. La luz que se origina a partir de una microcolonia individual choca contra un pixel o pequeno agrupamiento de pfxeles adyacentes sobre un fotodetector de matriz de CCD. El numero de microcolonias autofluorescentes se calcula inmediatamente mediante software de procesamiento de imagenes y se notifica al usuario. Observese que el proceso es identico al cultivo microbiano tradicional, excepto que la invencion detecta los resultados mas rapido y de manera automatica.
15 Debido a que esta realizacion de la invencion no es destructiva (es decir, no destruye ni dana los microbios), las microcolonias detectadas pueden hacerse crecer para dar cultivos puros. Estos cultivos puros pueden usarse para la identificacion microbiana y, para muestras clmicas, para determinar la sensibilidad y la resistencia antimicrobianas. La deteccion no destructiva tambien simplifica la validacion de la equivalencia del metodo con la enumeracion microbiana tradicional. Tras detectar las microcolonias usando la invencion, la placa de Petri puede volver a 20 incubarse de manera sencilla para dejar que las microcolonias crezcan durante el periodo de tiempo requerido para generar las macrocolonias visibles detectadas mediante la deteccion con cultivo microbiano tradicional. La comparacion del numero y la ubicacion de las microcolonias detectadas mediante la invencion con las colonias visibles que provienen del crecimiento adicional de las microcolonias facilita la determinacion de la equivalencia del metodo de la invencion y el tradicional.
25 La invencion puede usarse para construir pruebas usando varios formatos, metodos de marcaje, moleculas de union a una categona y metodos de deteccion. Sin embargo, las pruebas tienen varias caractensticas clave en comun. Las etapas y procedimientos que son comunes a muchas realizaciones de la invencion se describen a continuacion.
La configuracion general de las aplicaciones del metodo dado a conocer incluye las siguientes etapas:
Etapa 1: Formulacion de la cuestion de prueba, eleccion de la muestra, categonas de celulas que van a detectarse, 30 las condiciones de crecimiento y caracter de senalizacion
Etapa 2: Deposicion de las dianas celulares en el area de deteccion
Etapa 3: Dejar que se produzca la replicacion celular para formar microcolonias
Etapa 4: Marcaje opcional de las microcolonias
Etapa 5: Enumeracion de las microcolonias
35 La formulacion de la cuestion que va a responderse mediante la prueba es la primera etapa en la creacion de una nueva aplicacion basada en la invencion. Algunos ejemplos de cuestiones importantes que los microbiologos industriales y clmicos deben abordar se enumeran en la tabla 3. La expresion de la cuestion de prueba define generalmente el tipo de muestra que debe someterse a prueba (por ejemplo, carne picada, muestra de orina clmica o un producto farmaceutico terminado). El tipo y volumen de muestra son parametros importantes en la eleccion de 40 los metodos para depositar las celulas diana en el area de deteccion (vease la etapa 2). La expresion de la cuestion de prueba tambien define los tipos, o categonas, de celulas que deben detectarse en la aplicacion (por ejemplo, bacterias aerobias, levaduras o mohos, pseudomonas, E. coli O157:H7 o un aislado de lfquido cefalorraqrndeo anonimo).
Ejemplos de cuestiones respondidas mediante pruebas basadas en la invencion
• ^Indica el numero de bacterias en una muestra de orina una infeccion del tracto urinario?
• ^Contiene una muestra de sangre de un paciente microbios infecciosos viables?
• ^Que antibiotico es el mejor para tratar a un paciente particular con meningitis bacteriana?
• ^Cuantas bacterias aerobias estan presentes en 25 g de carne?
• ^Hay celulas del patogeno transmitido por los alimentos E. coli 017:H7 en una muestra de carne picada?
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• ^Cuantas celulas de mohos y levaduras estan presentes en una muestra de aire medioambiental?
• ^Cuantas celulas de Pseudomonas estan presentes en 10 g de un comprimido farmaceutico sin receta medica?
• ^Es esteril el lote de producto terminado de un farmaco inyectable?
• ^Cuantas celulas de levaduras estan presentes en una muestra de produccion de cerveza?
Tabla 3
Tras definir el tipo de celulas que van a detectarse o enumerarse, se eligen las condiciones para promover el crecimiento de las celulas en el area de deteccion. Los parametros importantes para permitir la replicacion celular incluyen: la composicion del medio de crecimiento, la presencia de reactivos selectivos tales como antibioticos, la temperatura y el nivel de oxfgeno y otros gases. Si es posible, se eligen condiciones de crecimiento que promueven el crecimiento de las celulas que van a detectarse pero que son resistentes al crecimiento de otros tipos de celulas. Por ejemplo, los medios para detectar levaduras y mohos contienen a menudo componentes que inhiben el crecimiento de microbios bacterianos que crecen por lo demas mas rapidamente.
Tambien debe elegirse un metodo para generar una senal detectable a partir de las celulas que van a detectarse. La eleccion de la senal depende del tipo de celulas en las microcolonias que van a detectarse, de los tipos de otras celulas que podnan formar microcolonias y del tipo de fondo esperado en la muestra. Considerese una prueba para determinar el numero total de bacterias aerobias en un producto terminado en la fabricacion farmaceutica; una disolucion de lavado para lentes de contacto, por ejemplo. Debido a que un amplio espectro de miles de microbios medioambientales podna estar presente en una muestra de este tipo, el metodo de generacion de la senal debe ser muy general. Algunos de tales metodos se basan en las propiedades opticas intnnsecas de las microcolonias, tales como autofluorescencia, reflectancia o absorbancia de infrarrojos de las microcolonias. Tales metodos permiten una deteccion de microcolonias rapida sin usar un reactivo, una ventaja importante de la invencion. La generacion de la senal sin reactivos usando, por ejemplo, la autofluorescencia de las microcolonias, simplifica sustancialmente los metodos de prueba, permite un procesamiento aseptico de la muestra y facilita pruebas rapidas que usan los mismos medios y productos desechables usados en los “metodos de referenda”. Alternativamente, las microcolonias generadas mediante las celulas diana pueden marcarse usando tinciones.
Uso de sondas espedficas y tinciones para enumerar categonas espedficas de celulas diana
El uso de tinciones o sondas que se unen a constituyentes moleculares de celulas diana puede usarse en aplicaciones que formulan una variedad de cuestiones de diagnostico. Los ejemplos de tinciones que pueden usarse para detectar una amplia variedad de celulas diana (por ejemplo, todas las bacterias aerobias) incluyen tinciones de acido nucleico (por ejemplo, yoduro de propidio o Syber Green (Molecular Probes)), y tinciones para detectar actividad enzimatica (por ejemplo, tinciones de esterasas fluorogenicas). Para marcar categonas mas estrechas de celulas diana, pueden usarse sondas marcadas que se unen a constituyentes moleculares espedficos de diana. Por ejemplo, puede usarse un anticuerpo marcado de manera fluorescente que se une espedficamente a una molecula que solo se produce en la superficie del patogeno alimentario E. coli O157:H7 para detectar microcolonias patogenas en una muestra de alimentos.
Por tanto, para detectar la presencia de una categona de celulas diana, el metodo y el instrumento dados a conocer pueden usar moleculas que se unen espedficamente a constituyentes moleculares espedficos de categona. Los constituyentes moleculares espedficos de categona que se producen en celulas diana se denominan sitios de union espedficos de categona y las moleculas que se unen espedficamente a ellos se denominan moleculas de union a una categona. Para detectar la union de moleculas de union a una categona, se une generalmente un marcador detectable, o resto de senalizacion, a las moleculas de union a una categona. Observese que los sitios de union espedficos de categona son una propiedad de celulas diana que estan potencialmente presentes en la muestra que va a someterse a prueba. En cambio, las moleculas de union a una categona son un reactivo proporcionado en un kit de prueba de diagnostico.
Una ventaja de la divulgacion es que puede usarse un amplio espectro de moleculas de union a una categona. Esta caractenstica es importante dado que se usan diferentes tipos de moleculas de union a una categona para formular diferentes tipos de cuestiones de diagnostico (por ejemplo, investigacion amplia a nivel de reino frente a identificacion estrecha a nivel de subespecie). Las clases de moleculas de union a una categona (tambien denominadas algunas veces sondas) comprenden: acidos nucleicos (oligonucleotidos, aptameros, secuencias clonadas, ADN genomico, ARN, etc.); variantes qmmicas relacionadas con acidos nucleicos, tales como acidos nucleicos peptfdicos (ANP); anticuerpos; enzimas (que pueden unirse a sustratos diana); protemas no enzimaticas tales como avidina (que se une a la molecula diana biotina), moleculas que se unen a constituyentes celulares espedficamente (por ejemplo, faloidina que se une a actina o biotina que se une a avidina); colorantes y tinciones, (por ejemplo, yoduro de propidio, auramina-rodamina, o SYTO 17); ligandos (por ejemplo, factor de crecimiento
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epidermico, que se une espedficamente al receptor del factor de crecimiento epidermico); y reactivos de union a polipeptidos o acidos nucleicos que se han seleccionado usando tecnicas de evolucion in vitro (por ejemplo, Zhang et al., Nat. Biotech. 18: 71-74, 2000).
Las moleculas de union a una categona pueden incorporar otras modificaciones o dominios funcionales. Por ejemplo, las moleculas de union a una categona estan a menudo asociadas covalente o no covalentemente con restos de senalizacion (es decir, dominios de marcaje tales como un fluoroforo o una micropartfcula tenida) o restos de seleccion (por ejemplo, partmulas magneticas o superficies solidas). Alternativamente, una molecula de union a una categona puede estar unida a un resto adaptador que, a su vez, facilita la union a otro resto funcional. Algunas veces la molecula de union a una categona tiene funciones no separables dobles. Por ejemplo, puede usarse yoduro de propidio, una tincion de acido nucleico, como molecula de union a una categona (por ejemplo, el sitio de union espedfico de categona puede ser el acido nucleico celular en una levadura) mientras que, al mismo tiempo, el colorante unido funciona como resto de senalizacion (es decir, puede fluorescer cuando se une al sitio de union espedfico de categona). Las pruebas basadas en la divulgacion pueden incorporar mas de una clase de molecula de union a una categona (por ejemplo, anticuerpos y tincion de acido nucleico, o anticuerpos y oligonucleotidos).
Las pruebas mas sencillas incorporan un unico tipo de molecula de union a una categona para explorar para detectar una unica categona de celula diana. Por ejemplo, una prueba para detectar M. tuberculosis puede usar un anticuerpo monoclonal que se une espedficamente a un sitio de union espedfico de categona en la superficie de M. tuberculosis. En otro ejemplo, cuando se explora para detectar infecciones del tracto urinario, la unica categona es “todas las celulas” (o, si se lisan celulas humanas, “todas las celulas no humanas”) y el unico tipo de molecula de union a una categona puede ser una tincion de acido nucleico (por ejemplo, yoduro de propidio).
Una familia de moleculas de union a una categona es un grupo de moleculas de union a una categona distintas que se unen a miembros de la misma categona de celulas diana. Por ejemplo, un anticuerpo policlonal producido frente al virus de la hepatitis C es una familia de anticuerpos dado que comprende multiples moleculas de union a una categona que se unen espedficamente a la misma categona de celulas diana, en este caso VHC. Otro ejemplo de una familia de moleculas de union a una categona es un grupo de 80 secuencias de ADN genomico espedficas de categona que se producen en todas las cepas de E. coli O157:H7 pero que no se producen en miembros de otros grupos de bacterias. Esta familia de moleculas de union a una categona pueden hibridarse como grupo a celulas E. coli O157:H7 preparadas adecuadamente pero no se hibridan a otros tipos de celulas.
Para detectar multiples categonas de celulas diana, una prueba incluye una familia de moleculas de union a una categona para cada categona. Un grupo de familias de moleculas de union a una categona se denomina conjunto de moleculas de union a una categona. Por ejemplo, las pruebas de neumoma o las pruebas de consumo de drogas deben distinguir numerosas categonas de celulas diana entre sf. Se usa una familia de moleculas de union a una categona para cada categona de celulas diana. Para una prueba de neumoma, puede usarse un conjunto de anticuerpos que reaccionan frente a antfgenos espedficos de categona en la superficie de microbios que provocan neumoma. Una familia de este conjunto de moleculas de union a una categona puede comprender anticuerpos policlonales procedentes de la fraccion de inmunoglobulinas de antisuero producido en un huesped conejo y dirigidos contra Streptococcus pneumoniae. Otra familia puede comprender un anticuerpo recombinante o un anticuerpo monoclonal dirigido contra una protema de recubrimiento de adenovirus.
El numero de grupos o categonas distintas de celulas diana sometidas a prueba mediante un conjunto, es decir, la complejidad categorica, esta reflejada por el numero de familias de moleculas de union a una categona en el conjunto. A su vez, el numero de familias en un conjunto puede definirse con exactitud mediante una cantidad denominada la “derivacion categorica minima” de un conjunto. La complejidad de familia es el numero mmimo de celulas diana distintas que se requiere que se una a miembros de cada una de las familias de moleculas de union a una categona en el conjunto de prueba. Por ejemplo, considerese un conjunto de anticuerpos espedficos de categona usados para someter a prueba simultaneamente una muestra de esputos para detectar la presencia de Mycobacterium tuberculosis, Legionella spp y Coccidoides immitus. La complejidad de familia del conjunto sena de tres, dado que se requerina que un mmimo de tres celulas diana, una de cada categona de patogeno, se unan a miembros de cada familia de moleculas de union a una categona en el conjunto. La capacidad del metodo y el instrumento dados a conocer para identificar un amplio espectro de categonas de celulas diana en una unica prueba es una consecuencia de su capacidad para explorar una muestra usando un conjunto de moleculas de union a una categona que tiene una gran complejidad de familia.
Las moleculas de union a una categona usadas junto con la divulgacion deben ser espedficas porque deben unirse en condiciones de ensayo a la celula diana deseada pero no a otros tipos de celulas diana que se pretende distinguir mediante el ensayo o a otros posibles constituyentes de la muestra o prueba. Por tanto, en una prueba para infeccion bacteriana de las vfas respiratorias superiores, se exploran potenciales moleculas de union a una categona para eliminar aquellas que reaccionan de manera cruzada con constituyentes microbianos normales (comensales) de las vfas respiratorias superiores.
Se incluyen en los ejemplos a continuacion metodos representativos para obtener y caracterizar moleculas de union a una categona.
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La capacidad de la invencion para analizar una muestra para detectar numerosas categonas dispares de celulas diana simultaneamente proviene de la capacidad para diferenciar las senales que provienen de las diferentes categonas de celulas diana. La invencion distingue entre categonas marcando cada familia espedfica de categona de moleculas de union a una categona con restos de senalizacion de manera que tiene una firma de senal unica. La capacidad para generar y detectar grandes numeros de firmas de senal distintas (es decir, altas complejidades de senal) permite la construccion de pruebas que analizan para detectar numerosas categonas de celulas diana (es decir, pruebas sumamente multiplexadas).
La invencion puede aprovecharse de diversos tipos de caracter de senal incluyendo: fluorescencia, luz dispersada, polarizacion de luz, quimioluminiscencia y radiactividad. Aparecen a continuacion ejemplos de restos de senalizacion y esquemas de deteccion usando diversos caracteres de senal. Puede haber multiples clases de senal dentro de un caracter de senal. Por ejemplo, si el caracter de senal es la fluorescencia, se incluyen diversos espectros de emision caractensticos en las clases de senal (por ejemplo, fluorescencia roja, fluorescencia verde y fluorescencia azul). En otro ejemplo, considerense micropartfculas fluorescentes rojas que se tinen con diferentes concentraciones del mismo fluoroforo. En este caso, la fluorescencia es el caracter de senal, pero las diferentes intensidades de las partfculas constituyen las clases del caracter de senal, es decir, la intensidad de fluorescencia es la cualidad del caracter de senal que diferencia un grupo de partfculas de otro.
Puede usarse una gran variedad de restos de senalizacion junto con la divulgacion tal como se demuestra en los ejemplos a continuacion. Los restos de senalizacion pueden incluir fluoroforos sencillos, fosforos regulados por incremento, protemas fluorescentes de manera natural (tales como protema fluorescente verde y sus relacionadas), colorantes, sistemas de enzima:sustrato (que generan cambios de color o quimioluminiscencia), micropartfculas fluorescentes, partfculas de dispersion de luz, partfculas magneticas o microdispositivos radiotransmisores.
Conseguir una alta complejidad de senal es clave para desarrollar ciertas pruebas que exploran numerosos tipos de celulas diana (es decir, pruebas con alta complejidad categorica).
Logro de una alta complejidad de senal
El numero de marcas distinguibles (o restos de senalizacion) en una mezcla se denomina complejidad de senal. Para pruebas sumamente multiplexadas, algunas veces es ventajoso usar restos de senalizacion con alta complejidad de senal. Tres enfoques generales que pueden usarse con esta divulgacion para generar alta complejidad de senal son: (1) marcaje de distincion, (2) marcaje combinatorio y (3) marcaje en razon.
1. Para un marcaje de distincion, se etiquetan sondas de diferentes familias de sondas con un unico resto de senalizacion que puede detectarse facilmente en presencia de todos los demas restos de senalizacion en el experimento. Hasta el momento, ha sido diffcil lograr un marcaje de distincion a altas complejidades de senal. Esta dificultad esta presente debido a que la mayona de los metodos de marcaje usan senales opticas (por ejemplo, cromogenicas, fluorescentes, quimioluminiscentes) o marcaje radiactivo, y debido al ancho de banda espectral de senales opticas y el intervalo limitado de senales detectables mediante los instrumentos actuales, la complejidad de senal resoluble usando senales opticas es bastante pequena. Por ejemplo, la resolucion de docenas de fluoroforos con espectros de emision distintos es actualmente imposible debido al solapamiento espectral.
2. Otra forma de lograr la alta complejidad de senal usada en la divulgacion es aplicar un enfoque de marcaje combinatorio. El marcaje combinatorio es una tecnica para lograr una alta complejidad de senal usando un numero relativamente pequeno de restos de senalizacion distintos. Con este enfoque, se unen diferentes combinaciones de restos de senalizacion a diferentes dianas. Actualmente, los fluoroforos son una clase favorecida de restos de senal para diagnosticos moleculares. Sin embargo, dadas las complicaciones implicadas al analizar multiples fluoroforos distintos (que surgen en gran parte del solapamiento de los espectros de excitacion y emision), actualmente solo es practico incorporar aproximadamente siete o menos fluoroforos convencionales. Sin embargo, usados en combinacion, pueden usarse siete fluoroforos para generar 127 senales distintas (N fluoroforos generan 2N-1 combinaciones). Tambien puede lograrse una alta complejidad de senal mediante marcaje combinatorio usando otros tipos de restos de senalizacion. Por ejemplo, pueden usarse con este enfoque partfculas impregnadas con diferentes colorantes, partfculas que se encuentran dentro de diferentes clases de tamano diferenciado o transpondedores que emiten senales de radio distintas. El marcaje combinatorio usando fluoroforos se ha aplicado recientemente con exito para el cariotipado de seres humanos (Speicher et al 1996, supra; Schrock et al 1996, supra). La instrumentacion y el software para el analisis de experimentos de marcaje combinatorio estan comercialmente disponibles.
3. Tambien puede obtenerse una alta complejidad de senal usando el enfoque de marcaje en razon (Fulton, et al 1997, supra). En el marcaje en razon, como en el marcaje combinatorio, se generan muchos tipos distintos de restos de senalizacion usando un numero relativamente pequeno de elementos de senalizacion distintos. Sin embargo, en contraposicion al marcaje combinatorio, los restos de senalizacion en el marcaje en razon se distinguen mediante la razon de los elementos de senalizacion. Por ejemplo, pueden usarse dos fluoroforos, X e Y, con diferentes caractensticas de excitacion/emision para tenir partfculas de poliestireno. Se aplican diferentes concentraciones relativas de los fluoroforos ([X], [Y]) a diferentes grupos de partfculas. Por ejemplo, pueden usarse ocho concentraciones diferentes de X y ocho concentraciones diferentes de Y para tenir partfculas en todas las
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combinaciones (X1Y1, X1Y2, X8Y7, XbY8) dando como resultado 64 clases de pardculas distinguibles. El marcaje en razon simplifica la instrumentacion, ya que solo necesita usarse un pequeno numero de tipos de senal. Tambien pueden usarse elementos de senal, diferentes de fluoroforos y que incluyen elementos de senal no opticos, para generar altas complejidades de senal usando un enfoque de marcaje en razon.
Generacion de senales intensas para facilitar la deteccion de microcolonias
El nivel de intensidad de senal necesario depende, por supuesto, del tipo de caracter de senal y de la instrumentacion/el metodo de deteccion (vease a continuacion).
Pueden usarse diversos enfoques para marcar moleculas de union a una categona para lograr la sensibilidad requerida. Un metodo para optimizar la intensidad de senal es marcar moleculas diana con restos de senalizacion sumamente fluorescentes. Por ejemplo, puntos cuanticos, nanoesferas tenidas de manera fluorescente y moleculas de fluoroforo polimerizadas generan senales fluorescentes intensas. La incorporacion de numerosos elementos de senal puede aumentar la intensidad de la fluorescencia de un resto de senalizacion. Por ejemplo, las nanoesferas fluorescentes (de ~20 nm de diametro; Molecular Probes) pueden generar una senal equivalente a aproximadamente 180 moleculas de fluorescema. Las micropartfculas de poliestireno tenidas de manera fluorescente (por ejemplo, de 1 |im de diametro) pueden incorporar millones de elementos de senalizacion de fluoroforo. Un metodo para incorporar multiples fluoroforos en un resto de senal que se asocia con una molecula de union a una categona de acido nucleico es incorporar conjugados de fluoroforo-dNTP durante la amplificacion por PCR de una secuencia clonada espedfica de categona. Los metodos alternativos para incorporar multiples fluoroforos en moleculas de union a una categona de acido nucleico incluyen enfoques que usan: dendnmeros, ADN ramificado o moldes de drculo rodante unidos a multiples restos de senal, o la adicion de una cola con numerosos nucleotidos marcados con fluoroforos polimerizados. La conjugacion de moleculas de union a una categona con multiples restos de senalizacion tambien aumenta la intensidad de senal. Por ejemplo, tambien puede lograrse la amplificacion de la senal conjugando grandes numeros de enzimas de senalizacion (por ejemplo, fosfatasa alcalina o peroxidasa del rabano) a una nanopartfcula.
Otro enfoque para obtener senales intensas es unir numerosas moleculas de union a una categona marcadas a cada celula. Esta union puede lograrse mediante diversos medios incluyendo: el uso de multiples moleculas de union a una categona (que reconocen multiples sitios de union espedficos de categona en la misma celula diana) o mediante la eleccion de moleculas de union a una categona que se unen a moleculas diana que estan sumamente representadas en una celula diana. Por ejemplo, un anticuerpo policlonal espedfico de microbio marcado puede lograr altas intensidades de senal uniendose a numerosos epttopos distintos en una celula diana microbiana. La estrategia de elegir sitios de union espedficos de categona que estan presentes en grandes numeros en cada celula diana se ha usado de manera frecuente anteriormente. Los ejemplos de esta estrategia incluyen el uso de sondas de acido nucleico para ARN ribosomico (que dependiendo del organismo diana y del tipo celular puede estar presente en miles de copias por celula). De manera similar, algunas moleculas diana antigenicas estan presentes en cientos o miles de copias en cada celula de un organismo diana. La divulgacion puede aprovecharse de ambas de estas estrategias. Como otro ejemplo, el gran numero de sitios de union espedficos de categona presentes en una bacteria proporcionan una gran intensidad de senal cuando se usa el colorante fluorescente de union a acido nucleico Syber Green I como resto de senalizacion/molecula de union a una categona.
La union de numerosos restos de senal a una celula diana no solo aumenta la intensidad de senal, sino que tambien dota al metodo dado a conocer de robustez dado que las posibilidades de observar numerosos agrupamientos de un gran numero de restos de senalizacion con la firma de senal compuesta esperada en ausencia de la celula diana son pequenas.
Conjugacion de restos de senalizacion a moleculas de union a una categona
La divulgacion puede incorporar numerosos tipos de restos de senalizacion que pueden conjugarse directamente con moleculas de union a una categona usando diversos metodos que conocen los expertos en la tecnica (vease, por ejemplo, Hermanson, G., Bioconjugate Techniques (Academic Press, 1996) y ejemplos espedficos a continuacion). Por ejemplo, pueden conjugarse directamente moleculas de union a una categona de anticuerpo u oligonucleotido con un resto de senalizacion de fluoroforo o punto cuantico. Alternativamente, pueden usarse moleculas de union a una categona de oligonucleotido o anticuerpos para recubrir restos de senalizacion a base de nanopartfculas de dispersion de luz o a base de micropartfculas fluorescentes. Pueden conjugarse indirectamente restos de senalizacion con moleculas de union a una categona. Por ejemplo, puede conjugarse directamente avidina con multiples elementos de senal para constituir un resto de senalizacion. La molecula de avidina marcada puede unirse entonces a un anticuerpo espedfico de categona biotinilado. Pueden conjugarse restos de senalizacion con las moleculas de union a una categona antes, durante o tras las etapas de union. Por ejemplo, en una realizacion de la divulgacion, se usan sondas de acido nucleico marcadas con digoxigenina como moleculas de union a una categona. Tras unir las moleculas de union a una categona a los sitios de union espedficos de categona en las celulas diana en la muestra, las sondas no unidas se eliminan por lavado. Se conjugan entonces conjugados de anticuerpo antidigoxigenina:fosfatasa alcalina (los restos de senalizacion) con las sondas marcadas con digoxigenina unidas. Se anade entonces un sustrato de fosfatasa alcalina (por ejemplo, el sustrato quimioluminiscente CDP-Star; NEN) a la fosfatasa alcalina unida para generar la senal.
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Etapa 2: Deposicion de las dianas celulares en el area de deteccion
La deposicion de las celulas diana de la muestra en la zona de deteccion es generalmente la siguiente etapa en aplicaciones basadas en la invencion. Se usan a menudo zonas de deteccion esencialmente planas, en parte, debido a que los sistemas opticos de obtencion de imagenes pueden recoger eficazmente la luz de zonas de deteccion delgadas (es decir, sistemas opticos con una pequena profundidad de campo), por ejemplo, cuando se hacen crecer microcolonias en la superficie del agar nutritivo o sobre membranas que se encuentran en la superficie de placas de agar nutritivo. En estos casos, la profundidad de la zona de deteccion puede ser insignificante en comparacion con las dimensiones laterales de la zona de deteccion. Esta etapa tambien puede usarse para depositar ciertas celulas diana selectivamente, para eliminar sustancias que podnan inhibir el crecimiento celular o para poner en contacto celulas diana con reactivos de marcaje.
El uso de la filtracion por membrana para depositar celulas sobre una superficie de deteccion de membrana aproximadamente plana tiene varias ventajas. La capacidad para recoger pequenos numeros de celulas diana a partir de grandes volumenes de muestra es una ventaja importante del uso de la filtracion por membrana. Por ejemplo, puede depositarse rapida y eficazmente una unica celula bacteriana en 1 litro de agua en la superficie de membranas de filtracion estandar. El agua puede pasar libremente a traves de las membranas pero las celulas no pueden, debido al tamano de los poros de la membrana. La muestra de agua se vierte en un recipiente cuya base forma una membrana y entonces se aplica vado a la superficie del fondo de la membrana. Se extrae el agua a traves de la membrana mientras que las celulas se retienen en la superficie de la membrana. La membrana puede lavarse opcionalmente con lfquido para eliminar eficazmente sustancias tales como inhibidores del crecimiento o para exponer celulas a reactivos de marcaje. La membrana puede colocarse entonces en medios de crecimiento.
Otros metodos para depositar las celulas diana en una superficie incluyen centrifugacion, sedimentacion gravitacional, seleccion magnetica o union a moleculas de union a una categona unidas a superficie (por ejemplo, anticuerpos de captura). En algunos casos (por ejemplo, separacion magnetica) se usa un resto distinto, el resto de seleccion. Micropartfculas magneticas recubiertas con anticuerpos espedficos de categona son un ejemplo de un resto de seleccion. Tras dejar que las celulas diana se unan a las partfculas magneticas recubiertas con anticuerpos, se aplica un campo magnetico para depositar las celulas marcadas de manera magnetica en la superficie de deteccion. De manera similar, pueden usarse micropartfculas densas recubiertas con anticuerpos espedficos de diana como restos de seleccion. En este caso, las celulas marcadas se llevan a la superficie de deteccion mediante la accion de la gravedad sobre las partfculas densas.
Etapa 3: Permitir la replicacion celular para formar microcolonias
En esta etapa, las celulas diana forman microcolonias mediante division en su sitio en la zona de deteccion. El crecimiento de las microcolonias esta ayudado por la exposicion de celulas a medio de crecimiento que contiene nutrientes y la incubacion de las mismas en condiciones que promueven el crecimiento y la division celulares (estos parametros se seleccionan en la etapa 1 anterior). En una realizacion tfpica, las celulas se depositan sobre un filtro de membrana porosa. El filtro se coloca sobre la superficie de medio de crecimiento de agar nutritivo solidificado en una placa de Petri, que entonces se cubre y se coloca en un incubador fijado a la temperatura apropiada. Este metodo se usa en la actualidad ampliamente para ayudar al crecimiento de colonias usando cultivo microbiano tradicional porque los nutrientes pueden difundir libremente a traves de la membrana sin producir movimiento de celulas hijas procedentes de la celula progenitora. Alternativamente, pueden hacerse crecer microcolonias directamente en la superficie de medio de agar nutritivo o el equivalente.
La seleccion para el crecimiento espedfico de las celulas diana puede producirse en la etapa de crecimiento de microcolonias. Por ejemplo, puede disenarse una prueba para detectar bacterias anaerobias en una muestra (se requiere generalmente una prueba de este tipo para productos terminados farmaceuticos inyectables, por ejemplo). En este caso, la etapa de crecimiento puede llevarse a cabo en una atmosfera anaerobia en una campana. Tambien pueden usarse medios de crecimiento selectivo para lograr un crecimiento microbiano selectivo en esta etapa. Para detectar resistencia bacteriana a antibioticos, por ejemplo, se incuban las celulas generalmente en presencia de diversos antibioticos a varias concentraciones. La resistencia a una cierta concentracion de antibiotico se deduce si una cepa bacteriana crece de manera comparable en presencia y ausencia de antibiotico a esa concentracion.
La invencion puede detectar diversas morfologfas de colonias. Muchos tipos de celulas en crecimiento forman colonias con forma de cupula diferenciadas sencillas sobre sustratos comunes (medios de agar nutritivo y membranas). Otras forman colonias con forma irregular o colonias filamentosas. Ademas, la morfologfa de las colonias puede depender de las condiciones de crecimiento (por ejemplo, nutrientes, temperatura y sustrato). Algunos tipos de celulas son moviles y no forman colonias diferenciadas en absoluto. Si es importante detectar el crecimiento de tales organismos, pueden anadirse inhibidores de la motilidad al medio. Por tanto, deben elegirse las condiciones de crecimiento y llevarse a cabo experimentos de control para garantizar que las celulas diana forman microcolonias detectables. Si es necesario, pueden modificarse las condiciones de crecimiento o pueden usarse multiples condiciones en pruebas en paralelo.
Etapa 4: Marcaje opcional de microcolonias
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En esta etapa opcional, se ponen en contacto moleculas de union a una categona y restos de senalizacion asociados (tambien denominados las sondas, los marcadores o las tinciones) con celulas diana en la muestra bajo condiciones que facilitan la union espedfica. Por ejemplo, un conjunto de secuencias de acido nucleico espedficas de categona se hibrida con secuencias diana complementarias en la muestra en esta etapa. De manera similar, se deja que se unan antfgenos espedficos de categona en la muestra a los anticuerpos espedficos de categona correspondientes.
Hay varias configuraciones ffsicas posibles para la etapa de union y la union puede llevarse a cabo en diversos puntos en el procedimiento de prueba. Por ejemplo, pueden marcarse celulas diana en una muestra lfquida antes de depositar las celulas diana en la zona de deteccion. Entonces pueden eliminarse eficazmente las sondas no unidas durante la etapa de deposicion o mediante lavado. Una desventaja de este enfoque es que generalmente la senal no aumenta con el crecimiento microbiano. Se obtienen generalmente senales mas intensas marcando las microcolonias durante o tras el crecimiento microbiano. El reactivo de marcaje puede anadirse a los medios nutritivos de modo que los microbios se exponen de manera continua al reactivo durante el crecimiento. Alternativamente, las microcolonias pueden exponerse a las sondas tras el crecimiento. Por ejemplo, pueden fijarse generalmente las microcolonias sobre una membrana y exponerse los sitios de union espedficos de categona relevantes mediante secado, calentamiento y/o exposicion a compuestos qmmicos (por ejemplo, NaOH o vapor de cloroformo). Entonces puede efectuarse el marcaje solapando las microcolonias con el reactivo de marcaje o colocando la membrana sobre una almohadilla que se ha saturado con el reactivo. Generalmente, se usa una etapa de lavado para eliminar el reactivo no unido. La concentracion de las moleculas de union a una categona se optimiza para lograr una cinetica de union rapida. Las condiciones elegidas para la seleccion para detectar una union espedfica dependen de las caractensticas de las moleculas de union a una categona y sus interacciones con moleculas diana. En los ejemplos a continuacion se describen procedimientos y condiciones espedficas.
Etapa 5: Enumeracion de las microcolonias
La enumeracion de las celulas diana en la muestra se produce en la etapa final de aplicaciones de pruebas basadas en la invencion. La etapa de enumeracion comprende por sf misma las etapas de obtencion de imagenes, analisis de imagenes y generacion de informe.
La invencion puede detectar colonias microscopicas sin aumento. La obtencion de imagenes con poco aumento facilita la obtencion de imagenes de una gran area que, a su vez, facilita la exploracion de grandes muestras. Algunas realizaciones de la invencion detectan colonias microscopicas sin aumento, en parte, usando una optica de alta eficacia para dirigir fotones emitidos por la microcolonia hacia un pequeno numero de pfxeles de matrices fotodetectoras.
El metodo de obtencion de imagenes usado depende del tipo de generacion de la senal elegido en la etapa 1. Por ejemplo, el procedimiento de obtencion de imagenes es diferente dependiendo de la propiedad optica o el caracter de senalizacion que se usa para la generacion de la senal. Para algunos caracteres de senal (por ejemplo, reflectancia, fluorescencia, dispersion de luz, absorbancia), los complejos en la zona de deteccion deben iluminarse mediante una fuente de luz. Para otros (por ejemplo, quimioluminiscencia, radiacion termica), no se requiere iluminacion. Pueden usarse diversos detectores incluyendo fotodetectores electronicos, pelfcula y visualizacion directa.
La deteccion de microcolonias individuales es, naturalmente, cuantitativa y ultrasensible. La cuantificacion puede llevarse a cabo manualmente contando celulas individuales en una imagen fotografica o digital o usando analisis de imagenes automatizado de imagenes digitalizadas. Tambien puede usarse la integracion de la intensidad de senal con respecto a la muestra para cuantificar las celulas diana. La integracion de la senal es particularmente util con muestras que contienen altas concentraciones de celulas diana. En estos casos, la resolucion de senales coincidentes puede no ser siempre posible.
La descodificacion de las firmas de familias de sondas marcadas permite la identificacion de numerosas categonas de celulas diana. Un objetivo importante de esta etapa es identificar la categona de celulas diana en la muestra determinando la firma de moleculas de union a una categona marcadas que se han adherido a la muestra.
El dispositivo de obtencion de imagenes basado en una camara de CCD, mostrado en la figura 3, es un dispositivo util para la obtencion de imagenes de grandes areas que se usa cuando se usa la fluorescencia como caracter de senal. Este dispositivo se uso para recoger los datos para muchos de los ejemplos a continuacion. La luz de excitacion puede proporcionarse mediante la introduccion de luz de una fuente de luz blanca de alta intensidad (lampara de arco de xenon de 1000 vatios, modelo A-6000, Photon Technology Incorporated, Monmouth Junction, NJ) en una grna de luz lfquida (diametro de nucleo de 5 mm, modelo 380, Photon Technology Incorporated, Monmouth Junction, NJ). La grna de luz lfquida lleva la luz hasta una rueda de filtros de excitacion (BioPoint FW, Ludl Electronics, Hawthorne, NY) y dirige el rayo filtrado (por ejemplo, de 9 mm o mas de diametro) sobre la superficie de deteccion que contiene las microcolonias. El aparato puede detectar microcolonias en diversas configuraciones (por ejemplo, en las superficies de agar nutritivo, portaobjetos de microscopios, cubreobjetos o tubos o pocillos con fondos planos, opticamente transparentes; o inmovilizadas en agar nutritivo u otras sustancias). La luz incidente golpea la superficie de deteccion induciendo fluorescencia en las celulas diana. Una parte de la luz
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fluorescente emitida se recoge mediante un sistema de lentes de alta eficacia de recogida y se transmite a traves de una rueda de filtros de emision (BioPoint FW, Ludl Electronics) hasta una camara de cCd (Orca II, Hamamatsu, Bridgewater, NJ). El diseno y la construccion del tren optico se basan en principios y practicas conocidas por los expertos en la tecnica.
La invencion tambien puede incorporar otros tipos de fotodetectores y otras configuraciones. La sensibilidad del sistema de obtencion de imagenes puede aumentarse eligiendo una camara mas sensible (por ejemplo, una camara refrigerada hasta una temperatura inferior, o una camara que usa un chip con parte posterior mas delgada). Alternativamente, la sensibilidad y resolucion de la deteccion puede aumentarse implementando un sistema de barrido en lmea (por ejemplo, BT Image Array; Hamamatsu). Para el barrido en lmea, se usa una CCD lineal o matriz de fotodiodos (por ejemplo, 1 x 500 o 1 x 1000 pfxeles) para capturar la imagen. La resolucion en una dimension corresponde al numero de elementos de la matriz, mientras que la segunda dimension se captura generalmente moviendo el portaobjetos de la muestra perpendicularmente bajo la matriz lineal. Dado que hay menos elementos, las matrices lineales de sensibilidad similar son normalmente menos caras que las camaras de CCD de formato de area.
El instrumento representado en la figura 3 facilita la medicion de senales a partir de multiples muestras usando una platina de posicionamiento X-Y (BioPoint XY, Ludl Electronics) para mover el recipiente de la muestra (por ejemplo, placa de microtitulacion) a lo largo de la optica de excitacion y de recogida. Image-Pro y los complementos de Image-Pro controlan todos los componentes de instrumento y la adquisicion de imagenes. Las ruedas de filtros se manejan con el complemento de ScopePro (Media Cybernetics, Baltimore MD), y el complemento de StagePro (Media Cybernetics, Baltimore MD) maneja el posicionamiento de la platina, mientras que el control de la camara es a traves del controlador Hamamatsu Orca II (Hamamatsu, Bridgewater, NJ). Tambien se usa Image-Pro Plus para el analisis y el procesamiento de imagenes tal como se describe a continuacion.
Las realizaciones de la invencion que usan iluminacion con luz blanca utilizan filtros espectrales para proporcionar un pico de excitacion optimo para cada uno de los fluoroforos. El espectro de luz blanca es grande, permitiendo que se seleccione una amplia variedad de fluoroforos para eliminar solapamiento del espectro de emision. Normalmente, los tamanos de puntos que pueden lograrse con iluminadores de luz blanca, por ejemplo, de 2 mm a 5 mm, son apropiados para la obtencion de imagenes de grandes areas. Dado que los cambios de filtro son relativamente sencillos, y pueden automatizarse, los sistemas de luz blanca son muy adaptables, permitiendo que el mismo aparato se use para pruebas que usan distintos grupos de fluoroforos.
La eficacia de recogida del sistema mostrado en la figura 3 se maximiza incorporando una optica de recogida disenada a medida que consiste en dos componentes: un objetivo de recogida y un elemento de enfoque. El objetivo de recogida tiene una alta eficacia de recogida (> f#/1,2) y produce un rayo relativamente colimado. La lente de enfoque captura la salida de luz del objetivo de recogida y la enfoca sobre la superficie de deteccion de la CCD. La optica esta disenada en dos partes para permitir que se inserte una rueda de filtros en la trayectoria de la lente de recogida. Para ciertas realizaciones de la invencion, por ejemplo para algunas realizaciones que no requieren cambios de filtro, puede ser deseable incluir un haz de fibras opticas de seccion decreciente para lograr una alta eficacia de recogida. El haz de fibras opticas contiene fibras que recogen luz de manera proximal a la muestra y canalizan la luz directamente hasta un chip de CCD. Alternativamente, la invencion puede detectar senales de manera muy sensible usando una deteccion proximal directa en la que la muestra se aplica directamente en o en proximidad estrecha al chip de CCD (para la mayor sensibilidad a la parte posterior de un chip de CCD con parte posterior mas delgada).
Ademas del sistema multiespectral, de luz blanca, descrito anteriormente, tambien se ha desarrollado un sistema de obtencion de imagenes de fluorescencia de un unico color mas sencillo para la obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas. En el sistema mostrado en la figura 4, la luz de excitacion se proporciona mediante un laser de diodo de doble frecuencia de 532 nm (50 mW, modelo numero BWT-50E, B&W Tek, Newark, DE). Dado que esta deteccion usa un unico color, no son necesarias ruedas de filtros. Un unico filtro de excitacion elimina los harmonicos de la salida de laser (modelo HQ532/10x, Chroma Technology, Brattleboro, VT) y un unico filtro de emision (modelo HQ620/60m, Chroma Technology, Brattleboro, VT) permite que solo las senales fluorescentes espedficas pasen hasta la camara de CCD. El sistema tambien usa una camara de CCD menos cara (modelo KX- 2E, Apogee CCD, Auburn, CA) que la descrita anteriormente, para capturar imagenes. El instrumento puede adaptarse facilmente al analisis multicolor incorporando multiples laseres y grupos de filtros.
Las camaras de CCD incorporadas en la invencion se refrigeran generalmente hasta una temperatura de entre -5°C y -50°C, suficiente para tiempos de integracion de desde diez segundos hasta aproximadamente dos minutos (dependiendo de la sensibilidad de la camara) con una acumulacion de ruido de la camara minima. Tiempos de integracion mas largos proporcionan generalmente una sensibilidad superior permitiendo la recogida de los fotones emitidos desde los fluoroforos durante un periodo prolongado. Los tiempos de integracion largos son inapropiados para el barrido en lmea; sin embargo, estan disponibles matrices lineales con la parte posterior mas delgada que tienen eficacias cuanticas muy altas, lo que aumenta la sensibilidad.
La invencion tambien puede usar la obtencion de imagenes espectrales basada en interferometro para la deteccion y descodificacion de senales (Schrock, E., 1997, supra). Al usar esta tecnica, la luz emitida o dispersada por restos de
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senalizacion se divide en dos trayectorias, pasa a traves de prismas (de modo que las diferentes longitudes de onda recorren diferentes distancias) y se deja que se recombine para crear un patron de interferencia. El analisis de Fourier del patron de interferencia genera un espectrografo para cada punto en la imagen.
Alternativamente, puede usarse una pehcula fotografica para registrar imagenes de las celulas diana de manera barata en una muestra. Cuando el caracter de senalizacion es la quimioluminiscencia, este enfoque es el mas facilmente implementado. Las imagenes recogidas en la pelfcula pueden digitalizarse en escaneres comerciales para el almacenamiento de datos y para el analisis de imagenes digitales.
Para realizaciones de la invencion que generan imagenes digitales, el software informatico identifica y cuantifica las microcolonias diana. Para un ensayo tfpico en el que se usan diferentes clases de restos de senalizacion fluorescentes, el software superpone las imagenes espedficas de fluoroforo apropiadas, identifica las celulas diana determinando que firma o combinacion de senales se emite por cada microcolonia diana y enumera cada categona de microcolonia diana que esta presente en la muestra. El software tambien puede: (1) corregir una iluminacion no uniforme; (2) corregir una diafoma de fluorescencia a traves de una matriz de desconvolucion; (3) alinear imagenes usando marcas de registro impresas sobre el sustrato; (4) comparar imagenes de diferentes puntos de tiempo; (5) aplicar algoritmos para distinguir microcolonias en crecimiento de objetos que no estan en crecimiento; (6) asignar un codigo de ID a cada microcolonia de la que se obtuvieron imagenes en la muestra basandose en la comparacion con una tabla de consulta; (7) registrar el codigo de barras de la muestra de la que se obtuvieron imagenes para la identificacion de la muestra; y (8) guardar automaticamente los datos de entrada, las imagenes y el codigo de barras en una base de datos que puede consultarse, por ejemplo, a traves de una interfaz de navegador web. Pueden usarse paquetes de analisis de imagenes comercialmente disponibles para proporcionar estas funciones. Pueden usarse paquetes de software para el analisis de imagenes multicolores (por ejemplo, Image-Pro, Media Cybernetics; MetaMorph, Universal Imaging; MatLab; The MathWorks).
Es util explicar resumidamente aqrn los paquetes de software y los metodos que se usaron para analizar los datos de fluorescencia recogidos en muchos de los ejemplos que siguen. Se obtuvieron imagenes de la superficie de deteccion para determinar el numero de objetos fluorescentes y/o la senal fluorescente total. La fluorescencia se capturo a partir de la membrana mediante una camara de CCD y se almaceno como un archivo de imagen TIFF (“Tagged Image File Format’’, formato de archivo de imagen etiquetada) que contema registros de intensidades y ubicaciones de pfxeles. Se usaron tres enfoques para cuantificar los resultados del ensayo. La senal integrada total de la zona de deteccion de la que se obtuvieron imagenes se determino sumando la senal fluorescente de todos los pfxeles. La senal integrada de la muestra se comparo con la de controles negativos. La medicion de la senal integrada total es especialmente util para muestras que contienen numerosas celulas diana. Un segundo enfoque era contar los objetos fluorescentes en la zona de deteccion. Un tercer enfoque era integrar la intensidad de todos los pfxeles contenidos dentro de los objetos fluorescentes (en oposicion a sumar la intensidad de todos los pfxeles de la imagen). Todos los analisis de imagenes se realizaron usando Image-Pro v 4.0 (Media Cybernetics, Silver Springs, MD).
Se logro la obtencion de la senal integrada total definiendo inicialmente un area sobre la membrana (el area de interes). Image-Pro permite que el area de interes se convierta en un unico objeto y otras herramientas de Image- Pro permiten que se sume la senal total de los pfxeles representados en este objeto. Se analizo entonces de la misma forma una imagen similar a partir de una membrana sobre la que no se anadieron celulas diana y se uso como control negativo. Los valores del control negativo se restaron de los valores de las muestras que conteman la diana. Esta resta elimino tanto el ruido electronico como el del ensayo.
El segundo y tercer metodos de cuantificacion usaron la utilidad de hallazgo de objetos de Image-Pro. Esta utilidad une pfxeles contiguos que tienen un valor (senal) por encima de un umbral automatico o definido por el usuario. Esto establece una lmea de contorno alrededor del penmetro del objeto. Los pfxeles del penmetro y los de dentro se definen como el objeto, y la suma de estos valores de pfxeles da como resultado el valor de integracion del objeto. Entonces se uso el software de analisis para contar todos los objetos en un area de interes que representa el fondo del recipiente de la muestra y, ademas, puede usarse para calcular la intensidad de senal integrada de todos los objetos encontrados.
Usando el lenguaje macro de Image-Pro IPP, las utilidades anteriores pueden automatizarse para permitir el procesamiento discontinuo de varias imagenes de una vez. Ademas, los datos pueden manipularse con otros programas instructores de IPP definidos por el usuario. Por ejemplo, pueden incluirse o excluirse objetos por encima o por debajo de un cierto tamano (area) o intensidad, lo que puede ser una herramienta util para la exclusion del polvo. Otros parametros importantes para el analisis de imagenes que determinan la definicion de objetos (por ejemplo, los criterios de aceptacion y rechazo) vanan segun la aplicacion y deben optimizarse en consecuencia.
Diversos aspectos de la invencion pueden automatizarse incluyendo la conexion de las etapas explicadas anteriormente de manera resumida. Considerese una aplicacion para analizar muestras lfquidas tales como agua farmaceutica para inyeccion o una muestra de orina lfquida. El sistema automatizado, partiendo de la muestra en un vaso de precipitados de recogida, puede recoger las celulas diana sobre una membrana mediante filtracion, colocarla sobre medios de crecimiento, incubar las celulas diana en condiciones de crecimiento, obtener imagenes de la membrana a intervalos regulares y notificar los resultados. Alternativamente, pueden automatizarse funciones
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individuals de la invencion. Por ejemplo, pueden incorporarse en el sistema modulos para cargar y descargar automaticamente placas de Petri (o dispositivos desechables alternativos usados para hacer crecer microbios) en el instrumento de obtencion de imagenes y para enfocar automaticamente.
Ejemplos. Los ejemplos a continuacion proporcionan detalles tecnicos para implementar diversas realizaciones de la presente divulgacion para su uso junto con una variedad de aplicaciones que no se pretende que sean limitativos.
Ejemplo 1. Deteccion e identificacion de microcolonias bacterianas usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas.
Antecedentes y objetivos: La deteccion del crecimiento microbiano esta en la base tanto de la microbiologfa clmica (por ejemplo, pruebas de sensibilidad antimicrobiana e identificacion bacteriana) como de la microbiologfa industrial (por ejemplo, pruebas de esterilidad exigidas), pero los metodos comunmente usados son lentos. Los retrasos consecuentes en el analisis producen muertes y padecimiento de situaciones clmicas innecesarios y demandan un gran coste financiero en la industria.
El uso de obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas para detectar microcolonias individuales se aprovecha de las ventajas del cultivo microbiano mientras que evita las desventajas sustanciales de los metodos tradicionales y emergentes. Las ventajas del analisis de replicacion in situ usando la invencion son: velocidad, facilidad de multiplexacion (exploracion para mas de un microbio); y la capacidad para detectar e identificar sin sacrificar la viabilidad de las microcolonias (esencial para las pruebas de sensibilidad antimicrobiana eficaces).
Objetivo experimental. El ejemplo demuestra la capacidad de la invencion para detectar la replicacion in situ de microcolonias bacterianas. El principio del metodo se representa en la figura 7. Las bacterias se depositan sobre un filtro y se deja que se repliquen in situ. Las microcolonias resultantes se marcaron de dos formas: con la tincion de acido nucleico Syber Green I y mediante la union a anticuerpos espedficos de grupo marcados con FITC. Se detectaron entonces las microcolonias marcadas usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas basada en CCD.
Metodos experimentales. Se hicieron crecer celulas E. coli MG1655 durante la noche en medio LB hasta una densidad de aproximadamente 109 celulas/ml. Se determino el numero aproximado de celulas contando diluciones del cultivo de durante la noche en un hemocitometro. Entonces se diluyo el cultivo de durante la noche para lograr aproximadamente 103 celulas/ml. Se deposito un mililitro de la dilucion sobre un filtro de policarbonato negro (Osmonics; numero de catalogo K02BP04700) usando un dispositivo de filtracion a vado y una copa de embudo de plastico (grna de usuario de Millipore Microfil V, PF07114, Rev A 3/00). Se prepararon de esta manera dieciseis filtros separados con ~1000 celulas, cuatro filtros para cada uno de los cuatro puntos de tiempo (0, 1,5, 3 y 24 horas). Tras la filtracion, se puso cada filtro sobre una placa de agar separada que contema medio de crecimiento LB, que se precalento hasta 37°C, y se puso en un incubador a 37°C. Periodicamente, (0, 1,5, 3, 24 horas) se sacaron cuatro filtros del incubador. Dos de estos filtros se fijaron en formaldehudo al 3,0% durante 10 minutos, anadiendo el filtro con las bacterias hacia arriba sobre un punto de 500 |il de formaldehudo que se coloco sobre un trozo de Parafilm™. Tras la fijacion, los filtros se pusieron sobre una almohadilla absorbente para absorber el formaldehudo en exceso. A continuacion, se anadio sobre el filtro una disolucion 10X de Syber Green I (200 □!, Molecular Probes). Se dejo que se tineran las celulas durante 10 minutos. Los otros dos filtros que no se usaron en la tincion de acido nucleico se bloquearon con PBS-B durante 15 min. y entonces se anadieron a los filtros anticuerpos anti-E. coli marcados con FITC (Fitzgerald). Tras 30 minutos de incubacion, se pusieron los filtros sobre una almohadilla absorbente para absorber cualquier lfquido residual. Entonces se obtuvieron imagenes de todas las membranas poniendo el filtro sobre un instrumento de obtencion de imagenes basado en CCD (descrito en la etapa 5 de la seccion de descripcion detallada y mostrado en la figura 3) de modo que las bacterias estaban orientadas hacia la fuente de iluminacion y el chip de CCD.
Resultados. En este ejemplo, se dejo que celulas individuales experimentasen varias generaciones de replicacion con el fin de formar microcolonias. Se marcaron las microcolonias o bien con Syber Green I o bien con un anticuerpo marcado con FITC. En la figura 6, la fila superior de paneles muestra el punto de tiempo de hora 0 que contiene celulas individuales. La fila inferior de paneles muestra microcolonias tras 3 horas de incubacion. Hubo un aumento sustancial en tamano y senal de los objetos detectados mediante la obtencion de imagenes de CCD a lo largo del tiempo debido al aumento en el numero de celulas en los sitios en los que se depositaron originalmente las celulas formadoras de colonias. La deteccion del crecimiento es fundamental para la practica microbiologica medica e industrial.
Este ejemplo muestra que la invencion puede disminuir drasticamente el tiempo requerido para la deteccion del crecimiento microbiano.
Ejemplo 2. Deteccion basada en autofluorescencia de microcolonias bacterianas usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas.
Antecedentes y objetivos: La importancia de los metodos que detectan el crecimiento microbiano y las limitaciones de los metodos actuales se tratan en la seccion de antecedentes. Este ejemplo muestra un metodo muy sencillo
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aunque potente basado en la presente invencion que detecta rapidamente el crecimiento de microcolonias bacterianas. El metodo se basa en la fluorescencia intrmseca (autofluorescencia) de las celulas diana para generar una senal detectable. Por tanto, este metodo no usa moleculas de union a una categona o restos de senalizacion exogenos para lograr la obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas de celulas diana microscopicas. Las ventajas de la enumeracion no destructiva sin reactivos incluyen la generacion de cultivos purificados (para pruebas de sensibilidad a antibioticos e identificacion microbiana), un metodo de validacion mejorado y la capacidad para realizar un seguimiento del crecimiento microbiano a lo largo del tiempo (para la diferenciacion de objetos y la cinetica de crecimiento)).
Metodos experimentales. Se hicieron crecer celulas E. coli MG1655 como en el ejemplo 1. Se diluyeron en serie celulas bacterianas (diluciones de diez veces) con PBS esteril. Se depositaron celulas bacterianas (volumen de 50 ml de la dilucion 10-7) sobre un filtro de policarbonato negro (Osmonics; numero de catalogo K02BP04700) usando un dispositivo de filtracion a vado y una copa de embudo de plastico (grna de usuario de Millipore Microfil V, PF07114, Rev A 3/00). Se preparo un control negativo filtrando PBS esteril. Tras la filtracion, se puso cada filtro sobre una placa de agar separada que contema medio de crecimiento LB, que se precalento hasta 37°C, y se puso en un incubador a 37°C. Se determino el recuento de celulas viables de la dilucion 10-7 filtrando muestras por duplicado e incubando el filtro sobre agar LB. Este procedimiento indico que la dilucion 10-7 contema aproximadamente 1000 celulas por 50 ml. A las 5,25 horas, se obtuvieron imagenes de las membranas poniendo los filtros soportados sobre portaobjetos de microscopio de vidrio en un instrumento de obtencion de imagenes basado en CCD (descrito en la etapa 5 de la seccion de descripcion detallada y mostrado en la figura 3) de modo que las bacterias estaban orientadas hacia la fuente de iluminacion y la camara de CCD. Se uso un grupo de filtros opticos de FITC (Chroma; excitacion 470/40 nm, emision 522/40 nm) y se capturo una exposicion de un segundo usando el control de software (Image Pro Plus, version 4.1; Media cybernetics).
Resultados. La figura 7 muestra la deteccion basada en autofluorescencia de microcolonias bacterianas tras 5,25 horas de crecimiento. Un filtro que contema microcolonias proporciono intensas senales tras una exposicion de un segundo (figura 7, panel izquierdo), mientras que un filtro que careda de microcolonias, pero que por lo demas se proceso y se obtuvieron imagenes del mismo de manera identica, no presento tales senales (figura 7, panel derecho).
El ejemplo demuestra que esta realizacion muy sencilla de la invencion es un enfoque potente para la deteccion del crecimiento microbiano. La tecnica puede usarse para hacer que muchas aplicaciones de diagnostico microbiano importantes sean mas eficaces incluyendo pruebas de esterilidad, pruebas medioambientales y de agua, identificacion microbiana y sensibilidad microbiana.
Ejemplo 3. Un metodo sencillo para validar una prueba de enumeracion microbiana sin reactivos rapida usando una comparacion interna con el metodo de cultivo tradicional.
Antecedentes y objetivos: Demostrar la equivalencia de una nueva prueba microbiologica con el metodo de referencia es una tarea esencial tanto para los desarrolladores de nuevos metodos como para sus clientes. Los requisitos de validacion formalizados estan codificados generalmente en reglamentos gubernamentales que grnan la introduccion de nuevos metodos microbiologicos en la industria y la asistencia sanitaria. Algunas veces, nuevos metodos para pruebas microbiologicas en la industria farmaceutica han fallado debido a la dificultad de demostrar la equivalencia con los metodos aceptados. El objetivo de este ejemplo es mostrar un metodo sencillo para demostrar la equivalencia de una prueba basada en la invencion con la prueba de cultivo microbiano tradicional.
Metodos experimentales. Se hicieron crecer celulas E. coli MG1655 y se analizaron como en el ejemplo 2. Tras obtener imagenes de las microcolonias, volvio a incubarse el filtro a 37°C durante aproximadamente 15 horas. Se obtuvieron imagenes de las macrocolonias resultantes usando luz blanca reflejada suministrada por una lampara incandescente de microscopio que iluminaba de manera oblicua a la placa. Por lo demas, se uso el mismo sistema de obtencion de imagenes para recoger la luz reflejada que se uso para detectar la autofluorescencia de las microcolonias.
Resultados. Que esta realizacion de la invencion no dana a los microbios es evidente comparando los paneles izquierdo y derecho de la figura 8. La correspondencia exacta entre las microcolonias “ancestrales” (panel izquierdo) y sus macrocolonias “descendientes” (el panel derecho) mediante esta comparacion interna debe facilitar la demostracion de la equivalencia con la prueba de enumeracion mediante cultivo microbiano tradicional.
Ejemplo 4. Exactitud y lfmite de deteccion de la deteccion de microcolonias autofluorescentes usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas
Antecedentes y objetivos: La deteccion exacta de pequenos numeros de microbios es cntica tanto en la microbiologfa industrial como en la asistencia sanitaria. Por ejemplo, puede estar presente solo una celula bacteriana en una muestra de sangre de 10 ml en un paciente con una infeccion sangumea potencialmente mortal. De manera similar, las pruebas de esterilidad de un farmaco inyectable en la fabricacion farmaceutica deben detectar una unica celula microbiana viva en una muestra. En ambos casos, los resultados falsos negativos y los resultados falsos positivos pueden tener consecuencias graves. La fraccion de resultados de la prueba que son
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falsos positivos y falsos negativos define la exactitud de un metodo de prueba.
El objetivo de este ejemplo es mostrar la exactitud de la invencion al nivel mas bajo de las celulas diana.
Metodos experimentales. Se hicieron crecer celulas E. coli MG1655 y se analizaron como en el ejemplo 3. Sin embargo, para este ejemplo se aplico una dilucion de celulas a multiples filtros (n = 101) de modo que se esperaba que en promedio la zona de deteccion en aproximadamente uno de cinco filtros contuviese una unica celula diana. Tras 5 h de incubacion, se obtuvieron imagenes de cada filtro y se puntuaron para la presencia de microcolonias. Entonces volvieron a incubarse los filtros durante la noche y se puntuaron para la presencia de macrocolonias. Entonces se compararon los resultados obtenidos usando la invencion se con los resultados obtenidos usando el metodo visual tradicional.
Resultados. La figura 9 muestra el metodo usado en este ejemplo para medir la exactitud de la invencion cuando las muestras contienen los niveles extremadamente bajos de celulas diana. Para cada uno de los 101 filtros, el resultado obtenido puntuando las microcolonias fue el mismo que el resultado obtenido mediante el metodo tradicional. Tal como se evalua mediante la presencia de o bien microcolonias o bien macrocolonias, la mayona de los filtros (n = 80) no teman celulas diana depositadas. Ademas, en los filtros que conteman celulas diana depositadas (n = 21), las microcolonias se produjeron en los mismos numeros (varios filtros teman multiples celulas diana, tal como se esperana estadfsticamente) y con la colocacion identica sobre los filtros que las macrocolonias, anadiendo robustez adicional a los resultados. La invencion y el metodo de referencia concordaban en un 100%, sin falsos positivos o falsos negativos detectados. Por tanto, los resultados indican que la invencion es exacta a niveles de celulas diana muy bajos.
Ejemplo 5. Determinacion del numero de celulas microbianas en microcolonias bacterianas autofluorescentes detectadas rapidamente usando obtencion de imagenes no aumentadas sin reactivos.
Antecedentes y objetivos: El objetivo de este ejemplo es demostrar la sensibilidad y la velocidad de la deteccion sin reactivos de la autofluorescencia de las microcolonias usando obtencion de imagenes de grandes areas. La deteccion rapida del crecimiento microbiano es el resultado de la capacidad de la invencion para detectar microcolonias en estadios tempranos cuando el numero de celulas es pequeno. Los experimentos en el ejemplo determinan el numero de celulas bacterianas en microcolonias detectadas mediante obtencion de imagenes de CCD no aumentadas.
Metodos experimentales: Se inoculo una unica colonia de Escherichia coli (ATCC, numero de catalogo 8739) hecha crecer recientemente en un tubo conico (50 ml) que contema medio de crecimiento (TSB; 10 ml) y se incubo (16 horas, 37°C, 150 rpm). Se uso este cultivo que contema celulas en fase estacionaria (2,4 x 109/ml) para inocular un matraz Erlenmeyer (500 ml) que contema TSB precalentado (37°C, 100 ml) para producir un cultivo en fase logantmica durante un tiempo optimo hasta la deteccion. Este matraz, que contema TSB precalentado, se inoculo con el cultivo en fase estacionaria (100 |il) y se incubo 2 horas, 37°C, 150 rpm. Se encontro que un cultivo establecido de esta forma contema ~5 x 107 bacterias/ml mediante titulacion por vertido en placa. Se diluyo el cultivo en fase logantmica en PBS (10-6). Se filtro un volumen (10 ml) de esta dilucion a traves de una membrana (Chemunex Inc., Chemfilter CB0.4, negra, PET-23, 25 mm) soportada sobre una almohadilla absorbente (Whatman Inc., numero de catalogo 1441325) usando un dispositivo de filtracion (Millipore Inc., 1225 Sampling Manifold, numero de catalogo XX27 025 50). Tras recoger las bacterias sobre la membrana, se puso la membrana sobre una placa de TSA precalentada (32,5°C). Se capturo una imagen de la placa (exposicion de 30 s) usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas con un grupo de filtros opticos de FITC (Chroma; excitacion 470/40 nm, emision 522/40 nm) usando control de software (Image Pro Plus, Media Cybernetics). Tras esta captura de imagen inicial, se puso la placa en un incubador (32,5°C) para el crecimiento. Se retiro la placa del incubador tras 2,5 horas de crecimiento y se tomaron imagenes del mismo campo de nuevo usando los ajustes de captura de imagenes aplicados anteriormente. Tras capturar las imagenes, se fijo inmediatamente la membrana (formaldelmdo al 1,5% en agua filtrada de tipo 1 durante 5 minutos) seguido por dos lavados (PBS, 5 min. cada uno) poniendo la membrana sobre papel Whatman 3M impregnado con disoluciones o bien de fijacion o bien de lavado tal como se indica. Se puso la membrana sobre el colector de muestreo bloqueando todas menos una de las ubicaciones con un tapon. Se aplico filtracion a vado durante 15 segundos. Para tenir la membrana con el fin de enumerar las bacterias en una microcolonia individual, se anadio yoduro de propidio (1 ml, 5 |ig/ml) a la pared de la copa mientras que se aplicaba presion de vado, seguido por agua de tipo 1 (1 ml). Se aplico presion de vado durante otros 15 segundos tras lo cual se retiro la membrana y se puso sobre un portaobjetos de vidrio, se seco y se monto con un cubreobjetos usando el reactivo antidesvanecimiento Pro Long (Molecular Probes, Eugene, OR, numero de catalogo P-4781). Se obtuvieron imagenes de las microcolonias tenidas usando microscopfa de fluorescencia (microscopio de fluorescencia Axioplan II, Carl, Zeiss Inc., Thornwood, NY; grupo de filtros Cy3.5, numero de id. de Chroma SP-103, excitacion 581/10 nm, emision 617/40 nm, 400x) equipada con la camara SPOT RT (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI, modelo numero 2.3.1,2 segundos, seleccionados solo espectros rojos) tras el registro espacial de estas con sus microcolonias no tenidas correspondientes identificadas usando obtencion de imagenes de grandes areas.
Resultados: La figura 10 muestra los resultados obtenidos en este ejemplo. Se tineron tres microcolonias detectadas tras 2,5 h de crecimiento a 32,5°C usando la invencion y se analizaron usando microscopfa de alta potencia. Las tres microcolonias conteman 45, 48 y 50 celulas, respectivamente. No se observaron celulas bacterianas individuales
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cerca de las microcolonias, demostrando que las microcolonias permanedan intactas durante todo el procedimiento de tincion. Observese que las colonias visibles de E. coli (~1 mm de diametro) contienen aproximadamente un millon de veces este numero de celulas. Por tanto, usando deteccion sin reactivos no aumentada, la invencion puede detectar microcolonias tras solo unas pocas generaciones de division celular.
Ejemplo 6. Deteccion e identificacion mediante obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas, basada en CCD de microcolonias bacterianas en una muestra de agua medioambiental
Antecedentes y objetivos: Este ejemplo pretende mostrar el poder de la invencion para la deteccion rapida del crecimiento microbiano cuando se aplica a una variedad de microbios medioambientales anonimos que es probable que experimenten estres nutricional.
En agua es un componente comun en la produccion, el procesamiento y la formulacion de muchos productos farmaceuticos. La deteccion de bacterias en el agua farmaceutica es una etapa fundamental en el proceso de fabricacion porque las propias bacterias o sus productos metabolicos podnan producir consecuencias adversas si estan presentes en el producto final. La proliferacion de bacterias puede producirse en la produccion, el almacenamiento y la distribucion de esta sustancia. El agua potable es el agua de alimentacion fuente para el agua farmaceutica y es la fuente exogena principal de contaminacion microbiana. Los coliformes fecales y una amplia variedad de microorganismos, en buena parte bacterias Gram negativas, pueden estar presentes en el agua potable. Los metodos usados comunmente para detectar bacterias en el agua son lentos y, por tanto, dificultan el control del sistema oportuno.
El uso de la obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas para detectar microcolonias bacterianas individuales se aprovecha de las ventajas del analisis de replicacion in vitro mientras que evita las desventajas sustanciales de los metodos tradicionales y emergentes. Las ventajas del analisis de replicacion in situ usando la invencion son: velocidad y la capacidad para detectar e identificar sin sacrificar la viabilidad de las microcolonias (util para identificar la fuente de contaminacion microbiana en un producto o un proceso o para determinar si un microorganismo particular es perjudicial para los productos o los procesos en los que se usa el agua.)
Vision general experimental. El ejemplo demuestra la capacidad de la invencion para detectar la replicacion in situ de microcolonias bacterianas antes de que estas colonias crezcan para dar macrocolonias. Las bacterias se depositan sobre un filtro y se deja que se repliquen in situ. Las microcolonias y macrocolonias resultantes de detectaron usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas, basada en CCD usando autofluorescencia (filtros de emision y excitacion de FITC) y reflectancia de luz blanca.
Metodos experimentales. Se recogio agua de manera aseptica del no Charles (Cambridge, MA) y se uso en el experimento en el plazo de una hora desde la recogida. Se centrifugo el agua del no Charles a un parametro de 14.000 rpm en una centnfuga Eppendorf 5415C durante 1-2 segundos. El agua del no Charles centrifugada se diluyo 1:10 con agua esteril tipo I y se depositaron 1,0 ml de esta sobre un filtro negro de ester mixto de celulosa (Millipore; numero de catalogo HABP04700) usando un dispositivo de filtracion a vacfo y un embudo de plastico esteril (embudo de 100 ml de Microfil® de Millipore, numero de catalogo MIHABG072). Cada filtro se coloco tras la filtracion sobre una placa de agar separada que contema medio de crecimiento R2A (Becton Dickinson/Difco; numero de catalogo 218263). Se prepararon diez filtros separados y se incubaron las placas de agar a 32,5°C durante hasta 74 horas. Periodicamente (tras 17, 24, 42, 50, 68 y 74 horas) se retiraron las placas de agar del incubador y se obtuvieron imagenes de los filtros colocando las placas sobre un dispositivo de obtencion de imagenes basado en CCD de modo que las colonias bacterianas estuvieran orientadas hacia la fuente de iluminacion y el chip de CCD. La fuente de iluminacion para la reflectancia se proporciono mediante un dispositivo de iluminacion halogeno de cuarzo de 30 vatios enfriado por conveccion Fiber-Lite® Modelo 190 (Dolan-Jenner Industries, Inc., Lawrence, MA), y la iluminacion se dirigio en un angulo oblicuo sobre el filtro. A simple vista pueden verse colonias bacterianas que tienen un diametro de 0,5 mm o superior, por lo que se uso este criterio de tamano como una caractenstica de discriminacion de una colonia bacteriana. Las colonias que teman un diametro de 0,55 mm o superior se identificaron y se contaron en las imagenes de reflectancia. Tambien de determino cuando podfan detectarse microcolonias autofluorescentes que daban lugar a una macrocolonia. Se analizaron las imagenes autofluorescentes para determinar cuando aparedan los progenitores de las macrocolonias de 74 h. Se represento graficamente en diversos puntos de tiempo el porcentaje de macrocolonias de 74 h que podfan detectarse como microcolonias autofluorescentes.
Resultados. En este ejemplo se dejo que se replicaran las celulas bacterianas de una muestra de agua con el fin de formar microcolonias y macrocolonias. Se detectaron ambos tipos de colonias mediante el uso de la invencion y se identificaron mediante autofluorescencia y reflectancia. Los datos mostrados en la figura 11 indican que el numero de colonias que pueden observarse visualmente aumento desde el 11% (6 colonias) a las 17 h hasta el 100% (53 colonias) a las 74 h. El noventa y cuatro por ciento (50 colonias) de las macrocolonias detectadas a las 74 horas se detectaron como microcolonias autofluorescentes a las 24 horas. Este ejemplo muestra que la invencion puede disminuir drasticamente el tiempo requerido para la deteccion del crecimiento bacteriano y, por tanto, disminuir la cantidad de tiempo necesaria para realizar una prueba bacteriana para el agua.
Ejemplo 7. Correlacion entre deteccion mediante obtencion de imagenes de grandes areas, no aumentadas, basada
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en CCD de microcolonias bacterianas y un metodo tradicional para enumerar bacterias
Antecedentes y objetivos: El objetivo de este ejemplo es determinar la correlacion numerica de los resultados obtenidos usando la presente invencion para detectar microcolonias rapidamente y los obtenidos usando un cultivo microbiano tradicional mas lento.
Objetivo experimental: El ejemplo compara la enumeracion de las microcolonias mediante la invencion y el metodo de cultivo clasico de “vertido en placa”. Se depositaron las bacterias sobre un filtro y se dejo que se replicaran in situ. Se detectaron las microcolonias resultantes usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas, basada en CCD usando autofluorescencia (filtros de emision y excitacion de FITC). Entonces se comparo el numero de microcolonias obtenidas con la invencion con el numero de macrocolonias que se obtuvieron con el metodo de vertido en placa.
Metodos experimentales: Se hicieron crecer celulas E. coli 8739 durante la noche en TSB hasta una densidad de aproximadamente 109 celulas/ml. Se realizaron diluciones en serie de diez veces comenzando con aproximadamente 107 celulas/ml y terminando con aproximadamente 102 celulas/ml del cultivo de durante la noche en PBS. Se diluyo adicionalmente una alfcuota de cada dilucion en serie con PBS de manera que 1,0 ml contendnan aproximadamente 50 bacterias. Se puso un mililitro en una placa de Petri junto con 35 ml de agar de tripticasa y soja (TSA) (47°C) fundido (Becton Dickinson/Difco; numero de catalogo 236950). Se dejaron enfriar las placas de agar a temperatura ambiente y entonces se incubaron las placas durante la noche a 32,5°C. Se prepararon diez placas de agar para cada dilucion en serie. Se contaron las macrocolonias en las placas de agar mediante la inspeccion visual de las placas. Se depositaron diluciones de bacterias (11,3 ml) sobre un filtro negro de ester mixto de celulosa (Millipore; numero de catalogo HABP04700) usando un dispositivo de filtracion a vacfo y un embudo de plastico esteril (embudo de 100 ml Microfil® de Millipore, numero de catalogo MIHABG072). Se coloco cada filtro sobre una placa de agar separada que contema TSA. Se prepararon diez filtros separados para cada dilucion en serie y se incubaron las placas de agar a 32,5°C durante 7 horas. Entonces se retiraron las placas del incubador y se obtuvieron imagenes de los filtros colocando las placas sobre un dispositivo de obtencion de imagenes basado en CCD de modo que las colonias bacterianas estuvieran orientadas hacia la fuente de iluminacion y el chip de CCD. Se detecto la autofluorescencia de cada microcolonia usando filtros de emision y excitacion de FITC. Se uso once veces mas volumen con el filtro porque cada imagen constituye aproximadamente 1/11° de toda la superficie del filtro. Por tanto, cada imagen debe contener aproximadamente el mismo numero de bacterias que se puso en cada vertido en placa. Se determino el numero de microcolonias en cada imagen mediante la inspeccion visual de la imagen. Se calculo el numero de bacterias en cada dilucion en serie multiplicando el numero de microcolonias o macrocolonias por un factor de dilucion.
Resultados: En este ejemplo se dejo que se replicaran las celulas bacterianas y que formaran microcolonias sobre un filtro o macrocolonias en placas de agar. Se detectaron las microcolonias usando la invencion y se detectaron las macrocolonias usando un metodo de cultivo clasico e inspeccionando visualmente las placas de agar. Se represento graficamente la concentracion de bacterias tal como se determino mediante cada uno de los metodos para cada dilucion en serie y los resultados se muestran en la figura 12. Cada punto representa el promedio de diez determinaciones separadas. Se obtuvo una correlacion positiva entre los resultados obtenidos con la invencion y los resultados obtenidos con el metodo clasico de vertido en placa. El coeficiente de correlacion de 0,9996 indica una fuerte relacion linear entre el recuento de microcolonias con la invencion y macrocolonias con un metodo de cultivo clasico.
Ejemplo 8. Linealidad e intervalo dinamico de una prueba de enumeracion sin reactivos
Antecedentes y objetivos: Dos de los criterios de validacion para un nuevo metodo de pruebas microbiologicas son la linealidad y el intervalo del nuevo metodo. El intervalo dinamico es el espacio entre los niveles superior e inferior de microorganismos que se ha demostrado que se determinan con precision, exactitud y linealidad usando el nuevo metodo de pruebas. La linealidad de un metodo de prueba microbiologico es su capacidad para obtener resultados que son proporcionales a la concentracion de microorganismos presentes en la muestra dentro de un intervalo dado.
El ejemplo demuestra la linealidad de la invencion a lo largo de un intervalo de niveles bacterianos. La invencion detecta la presencia de microcolonias en la superficie de un filtro y cuantifica la senal autofluorescente de las microcolonias usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas, basada en CCD.
Metodos experimentales. Se hicieron crecer celulas E. coli 8739 durante la noche en TSB hasta una densidad de aproximadamente 109 celulas/ml. Se realizaron diluciones en serie de diez veces comenzando con una dilucion de 10-4 del cultivo de durante la noche y terminando con una dilucion de 10-9 en PBS. Se depositaron cinco ml de cada dilucion en serie sobre un filtro negro de ester mixto de celulosa (Pall Gelman Laboratory; numero de catalogo 66585) usando un dispositivo de filtracion a vacfo y un embudo de plastico esteril (embudo de 100 ml Microfil® de Millipore, numero de catalogo MIHABG072). Se coloco cada filtro tras la filtracion sobre una placa de agar separada que contema agar de tripticasa y soja con lecitina y Polisorbato 80 (Becton Dickinson BBL, numero de catalogo 211764). Se preparo un filtro para cada dilucion en serie y entonces se incubaron las placas a 32,5°C durante 6,5 horas seguido por incubacion durante la noche a 32,5°C. En el punto de tiempo de 6,5 horas, se retiraron las placas de agar del incubador y se obtuvieron imagenes de los filtros colocando las placas sobre un dispositivo de obtencion
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de imagenes basado en CCD de modo que las colonias bacterianas estuvieran orientadas hacia la fuente de iluminacion y el chip de CCD. Se detecto la autofluorescencia de cada microcolonia usando filtros de emision de GFP-LP y de excitacion de GFP. Se cuantifico la senal autofluorescente de las microcolonias en cada imagen usando el software ImagePro (Media Cybernetics, Inc., version 4.5.0.19). Tras la incubacion durante la noche, se inspeccionaron visualmente las placas de agar y se conto el numero de macrocolonias presentes en los filtros preparados con las diluciones de 10"8 y 10"9. Se uso el numero de macrocolonias en estos dos filtros para calcular el numero de bacterias anadidas a cada membrana y la concentracion de bacterias en el cultivo inicial nocturno.
Resultados. En este ejemplo se dejo que se replicaran las celulas bacterianas y que formaran microcolonias sobre un filtro en placas de agar. Se detectaron las microcolonias mediante el uso de la invencion y se identificaron mediante autofluorescencia de GFP-LP. Se cuantifico la senal autofluorescente de las microcolonias en cada imagen usando el software ImagePro. Se represento graficamente la senal autofluorescente en cada imagen frente al numero de bacterias anadidas a cada filtro y los resultados se muestran en la figura 13. Los datos son lineales a lo largo de un intervalo de 5 log de niveles bacterianos. Este intervalo es significativo porque el intervalo de algunos metodos de cultivo clasicos, es decir, de vertido en placas es de solo 2 log. Los resultados tambien muestran una linealidad muy fuerte con un valor de R2 de 0,9929. Este valor esta dentro de los valores aceptables de R2 (d 0,8 a 1,2) para un nuevo metodo de pruebas microbiologico (Evaluation, Validation, and Implementation of New Microbiological Testing Methods. 2000; PDA Journal de Pharmaceutical Science & Technology 54 (Suplemento TR33), 1-41).
Ejemplo 9. Pruebas de eficacia del conservante antimicrobiano rapidas sin diluciones de la muestra
Antecedentes y objetivos: Se anaden conservantes antimicrobianos a artfculos envasados en envases de multiples dosis para protegerlos contra el crecimiento de microorganismos que pueden introducirse por el proceso de fabricacion o por los clientes durante la retirada de las dosis individuales. Debe demostrarse la eficacia antimicrobiana para productos farmaceuticos que contienen actividad antimicrobiana intnnseca o para productos que contienen un conservante antimicrobiano. Las pruebas son muy laboriosas y caras de realizar debido al gran numero de diluciones de la muestra que deben analizarse. Normalmente, una prueba de eficacia de conservante antimicrobiano requiere el analisis de cientos de placas de cultivo microbiano. Un objetivo importante de este ejemplo es demostrar el potencial de la invencion para eliminar la mayor parte del trabajo de la prueba obviando la necesidad de diluciones de la muestra.
Metodos experimentales. Se hicieron crecer durante la noche celulas E. coli 8739 en TSB hasta una densidad de aproximadamente 109 celulas/ml. Se anadieron las bacterias (8,48 x 106 totales o 2,12 x 105 celulas/ml)) a 40 ml de PBS esteril o a 40 ml de solucion salina conservada esteril marca Osco (distribuida por American Procurement and Logistics Company, numero de lote 1T016, fecha de caducidad junio de 03). Se incubaron estas dos disoluciones a temperatura ambiente durante 168 horas. Tras 0, 24, 96 y 168 horas, se extrajeron 5 ml de PBS que contema las bacterias y 5 ml de la solucion salina Osco que contema las bacterias y se anadieron a tubos separados que conteman 45 ml de caldo de neutralizacion D/E esteril (Becton Dickinson/Difco, numero de catalogo 281910). Entonces se deposito la muestra diluida sobre un filtro negro de ester mixto de celulosa (Pall Gelman Laboratory; numero de catalogo 66585) usando un dispositivo de filtracion a vacfo y un embudo de plastico esteril (embudo de 100 ml Microfil®, de Millipore numero de catalogo MIHABG072). Se coloco cada filtro sobre una placa de agar separada que contema agar de tripticasa y soja con lecitina y Polisorbato 80 (Becton Dickinson BBL, numero de catalogo 211764). Se preparo un filtro para cada disolucion en cada punto de tiempo. Se incubaron las placas de agar a 32,5°C durante 6,5 horas. Se retiraron las placas de agar del incubador y se obtuvieron imagenes de los filtros colocando las placas sobre un dispositivo de obtencion de imagenes basado en CCD de modo que las colonias bacterianas estuvieran orientadas hacia la fuente de iluminacion y el chip de CCD. Se detecto la autofluorescencia usando filtros de emision de GFP-LP y de excitacion de GFP. Se cuantifico la senal autofluorescente de las microcolonias en cada imagen usando el software ImagePro (Media Cybernetics, Inc., version 4.5.0.19). Usando la curva patron mostrada en el ejemplo 8, se convirtio la senal autofluorescente obtenida mediante el analisis de ImagePro en el numero de bacterias anadido por membrana y luego en la concentracion de bacterias por ml de disolucion (PBS o solucion salina Osco) para cada punto de tiempo. Dada la concentracion de partida de las bacterias tras 0 horas de incubacion, se calculo la disminucion logantmica en la concentracion bacteriana para los puntos de tiempo de 24, 96 y 168 horas. Tras 0, 24, 96 y 168 horas, se extrajeron 100 |il de las disoluciones de PBS y solucion salina Osco que conteman las bacterias y se anadieron a 900 |il de caldo de neutralizacion D/E (dilucion 1:10). Entonces se realizaron diluciones en serie de 10 veces en 1,0 ml de PBS esteril de la dilucion 1:10 comenzando en 10"1 y terminando en 10"6. Se anadio todo el volumen de las diluciones de 10"1 a 10"6 a 30 ml de agar de tripticasa y soja fundido (45°C) con lecitina y Polisorbato 80. Se dejaron enfriar las placas de agar a temperatura ambiente y luego se incubaron las placas durante la noche a 32,5°C. Se contaron visualmente las colonias bacterianas en las placas de las dos diluciones mas bajas que conteman menos de 300 colonias por placa. Se usaron estos numeros (multiplicados por el factor de dilucion apropiado) para calcular la concentracion de bacterias en las disoluciones de PBS y solucion salina Osco. Dada la concentracion de bacterias de partida tras 0 horas de incubacion, se calculo la disminucion logantmica en la concentracion bacteriana para los puntos de tiempo de 24, 96 y 168 horas. Se represento graficamente la disminucion logantmica en la concentracion bacteriana tal como se determino mediante la invencion frente a la disminucion logantmica en la concentracion bacteriana tal como se determino mediante el metodo de vertido en placa (un metodo clasico, basado en el crecimiento, de enumeracion
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microbiologica). Los resultados se muestran graficamente en la figura 14.
Resultados. Los resultados en la figura 14 muestran que el conservante antimicrobiano en la solucion salina Osco (acido sorbico al 0,1%) es eficaz para disminuir la concentracion de bacterias. No se observo disminucion en la concentracion bacteriana en el PBS. Los datos indican una correlacion lineal (R2 = 0,9633) entre los dos metodos de enumeracion aun cuando la invencion no requena diluciones. Los resultados muestran el potencial de la invencion para ahorrar la mayor parte del trabajo y los materiales mediante la eliminacion de las onerosas diluciones de la muestra del metodo tradicional.
Ejemplo 10. Deteccion basada en autofluorescencia de un indicador biologico con estres termico usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas
Antecedentes y objetivos: Los objetivos de este ejemplo son mostrar la aplicacion potencial de la invencion para aplicaciones que usan esporas termorresistentes como indicadores biologicos. Una aplicacion importante son los metodos de cuantificacion con esterilizador para asegurar la eficacia de los procedimientos de esterilizacion en la fabricacion de dispositivos medicos y farmaceuticos y en laboratorios clrnicos.
Un objetivo adicional es mostrar el potencial de la invencion para simplificar la enumeracion del indicador biologico reduciendo el numero de muestras requeridas. En el metodo tradicional de vertido en placa, son necesarias diluciones en serie de diez veces que cubren todo el intervalo posible para cuantificar las muestras de manera precisa. En este ejemplo, se usa la obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas de la autofluorescencia del indicador biologico Geobacillus stearothermophilus para cuantificar la concentracion de esporas viables. La cuantificacion es lineal durante aproximadamente 3 ordenes de magnitud, disminuyendo el numero de diluciones necesarias para determinar con precision el numero de esporas viables que quedan tras el estres termico. Se toma una imagen autofluorescente tras un corto periodo de crecimiento, que luego se analiza para dar una estimacion de la concentracion inicial de esporas viables de G. stearothermophilus con estres termico.
Metodos experimentales: Se diluyeron esporas de G. stearothermophilus ATCC 7953 (Raven Biological Laboratories, Inc.) hasta una concentracion de ~2 x 105 esporas/ml en agua esteril y se sometieron a una variedad de condiciones de estres termico que oscilaban desde 5 minutos a 110°C hasta 15 minutos a 121°C. Las esporas tratadas con calor y un control no tratado se diluyeron en serie 10 veces en agua hasta una dilucion 1/1000. Para la comparacion, se analizo cada muestra mediante el metodo tradicional de vertido en placa ademas de la obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas de autofluorescencia. Se prepararon vertidos en placa poniendo 1 ml de cada dilucion (incluyendo la disolucion de reserva no diluida) de cada muestra en una placa de Petri seguido por la adicion de 20 ml de agar de tripticasa y soja fundido (TSA, numero de catalogo de BD 236950). Tras la solidificacion, se incubaron las placas a 55°C durante 48 horas y se contaron manualmente. Se usaron las placas que teman entre 30 y 300 colonias para calcular el tftulo de esporas, a menos que ninguna placa tuviera mas de 30 colonias, en cuyo caso se uso la placa que contema 1 ml de disolucion de reserva no diluida.
Para preparar las microcolonias para la obtencion de imagenes de grandes areas, se mezclaron 1 ml de la disolucion de reserva no diluida y 1 ml de la dilucion 1/100 con 15 ml de agua esteril y se filtraron a traves de un filtro negro de HABP (numero de catalogo de Millipore HABP04700) usando filtracion a vacfo y una copa embudo de plastico (grna de usuario de Millipore Microfil V, PF07114, Rev A 3/00). Tras la filtracion, se coloco cada filtro sobre una placa de TSA separada. Se tomaron imagenes a t=0 horas usando el dispositivo de obtencion de imagenes no aumentadas basado en CCD (descrito en la etapa 5 de la seccion de Descripcion detallada y mostrado en la figura 3). Se capturo la autofluorescencia usando el grupo de filtros opticos de FITC (Chroma; excitacion 470/40 nm, emision 522/40 nm) con exposiciones de 5 segundos. Se incubaron las placas a 55°C y se tomaron imagenes a las 8 y las 20 horas. Se analizaron las imagenes usando el software Image Pro Plus (version 4,1; Media cybernetics). Se usaron las exposiciones a t=0 para encontrar polvo y otros contaminantes fluorescentes que podna haber habido en las placas antes del crecimiento. Para cada imagen, se comparo la suma de las intensidades de pfxeles de todos los objetos (en el que los objetos se definen en este ejemplo particular como que contienen intensidades de pixel de desde 3200 hasta 65301 unidades de intensidad) menos la senal de los contaminantes a t=0 con una curva patron generada usando esporas sin estres, y se calculo el tftulo de esporas a partir de la curva patron. Se uso el valor de o bien la muestra no diluida o bien la dilucion 1/100 segun el cual uno cafa dentro del intervalo lineal de la curva patron. Se compararon los valores calculados de esporas/ml de la autofluorescencia a partir de la obtencion de imagenes no aumentadas con los valores calculados a partir del metodo del vertido en placa.
Resultados: En la figura 15 puede observarse una representacion grafica del tftulo de esporas con estres termico calculado a partir de vertidos en placa frente al tftulo de esporas usando obtencion de imagenes de grandes areas autofluorescentes. Existe una buena correlacion entre los valores de ambos metodos, pero eran necesarios cuatro vertidos en placa para cada dos imagenes autofluorescentes. Ademas, el vertido en placas tarda 48-72 horas en leerse, mientras que las imagenes autofluorescentes pueden tomarse y analizarse a las 8-20 horas de crecimiento.
Variaciones. La obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas de autofluorescencia tambien podna usarse para cuantificar las concentraciones de celulas viables de otros microorganismos indicadores biologicos, tales como Bacillus subtilis y Clostridium sporogenes.
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Puede usarse una variedad de analisis de imagenes autofluorescentes para cuantificar concentraciones de celulas. Por ejemplo, pueden usarse recuentos de microcolonias objeto en lugar de la suma de intensidades de p^xeles de los objetos. Dado que los objetos (microcolonias) son mucho mas pequenos que las macrocolonias de crecimiento completo (que pueden contarse a simple vista), pueden ajustarse mas dentro de la misma area sin sacrificar la precision que puede perderse debido a un solapamiento de objetos. Ademas, pueden aplicarse algoritmos de hallazgo de objetos mas sofisticados a las imagenes para tratar el fondo fluorescente local, los objetos en contacto y la presencia de partfculas fluorescentes contaminantes.
Ejemplo 11. Deteccion basada en autofluorescencia de microcolonias bacterianas en carne picada
Antecedentes y objetivos: Este ejemplo ilustra la capacidad de la invencion para reducir el tiempo para la deteccion de microcolonias bacterianas en carne picada en comparacion con los metodos compendiados. La determinacion del recuento de bacterias viables totales en la carne cruda es esencial para prevenir el deterioro temprano de los alimentos. Los metodos actuales tardan dos dfas, requiriendo a menudo que los productores transporten la carne antes de obtener los resultados de la prueba. Reducir el tiempo para la deteccion de microbios podna prevenir incidentes de enfermedades transmitidas por los alimentos, ineficacias en la fabricacion y retiradas costosas.
Metodos experimentales: Se diluyo carne picada magra (25 g) en 225 ml de agua de peptona al 0,1% y se proceso en un dispositivo Stomacher para homogeneizar la muestra. Entonces se diluyo esta muestra en serie en agua de peptona al 0,1%. Se anadieron volumenes apropiados de las diluciones 10, 10-3, 10-4 y 10-5 a PBS y luego se vertieron en dos tipos de membrana de filtracion (Millipore HABP numero de catalogo HABP04700 de 0,45 |im y Chemunex CB0.4 de 0,4 |im numero de referencia 200-C20010-01) usando dispositivos de filtracion a vado. Se obtuvieron muestras por duplicado para cada dilucion y tipo de filtro y se incubaron en placas de TSA a 35°C durante 48 h. Se capturaron las imagenes usando un dispositivo de obtencion de imagenes basado en CCD a las 0, 6, 16, 24 y 48 h. Se uso un grupo de filtros opticos de FITC (Chroma; excitacion 470/40 nm, emision 522/40 nm) y se capturo una imagen de 10 segundos bajo resolucion de HDyn usando un control de software (Image Pro Plus). Tambien se capturaron imagenes con reflectancia de luz blanca durante 10 segundos.
Resultados: Se recogieron datos de las diluciones 10-4 y 10-5 en ambos tipos de filtro de membrana. Se analizaron los datos contando las macrocolonias a las 48 horas que teman 0,5 mm de diametro o mayor en las imagenes de reflectancia. Entonces volvieron a rastrearse estas macrocolonias (> 0,5 mm) en los puntos de tiempo de 24, 16 y 6 h, en imagenes autofluorescentes y de reflectancia. La figura 16 muestra los tiempos de deteccion de las macrocolonias y microcolonias autofluorescentes. Al realizar un seguimiento del aspecto a lo largo del tiempo de las microcolonias que dieron lugar a las macrocolonias de 48 horas, se mostro que el 100% de las macrocolonias se detectaba mediante la invencion hacia las 16 h. Estos resultados muestran el potencial de la invencion para reducir significativamente el tiempo requerido para lograr los resultados en comparacion con los metodos tradicionales.
Variaciones. La prueba de este ejemplo puede ampliarse para someter a prueba una variedad de alimentos, incluyendo otras carnes, verduras, bebidas y productos lacteos.
Ejemplo 12. Deteccion de bacterias en una muestra compleja con seleccion magnetica no espedfica seguida por deteccion de microcolonias usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas
Objetivo: Este ejemplo demuestra un metodo de inmunoensayo para seleccionar celulas bacterianas individuales, de manera no espedfica, de una muestra complicada seguido por deteccion rapida de microcolonias en crecimiento usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas. Mas espedficamente, este ejemplo demuestra la capacidad para seleccionar una variedad de bacterias de manera eficaz de la sangre y luego detectar el crecimiento de las bacterias usando el metodo directo de crecimiento. Este ejemplo muestra que perlas magneticas recubiertas con una mezcla de agentes de union pueden seleccionar especies divergentes de bacterias de una muestra compleja.
Metodos experimentales: La figura 17 muestra el proceso que sigue este ejemplo para detectar bacterias en una muestra compleja. En primer lugar, se anaden celulas bacterianas y perlas magneticas a la muestra y se incuban. Las perlas magneticas se unen a las celulas bacterianas; luego se secuestran los complejos usando fuerza magnetica. Las perlas magneticas se resuspenden (PBS), se filtran y se siembran en placa sobre medios de crecimiento. Tambien se siembra en placa el sobrenadante de la seleccion magnetica resultante. Tras un periodo de incubacion, se obtienen imagenes del filtro a diversos puntos de tiempo usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas para detectar microcolonias.
Se obtuvo una matriz de partmulas magneticas mediante el acoplamiento de las partmulas magneticas con grupos tosilo activos (Dynal, Oslo, Noruega, numero de catalogo 140.03) a varios agentes de union espedficos asf como no espedficos. Los agentes incluyen sulfato de polimixina B (Sigma; numero de catalogo P1004), nanoprotema de polimixina B (Sigma; numero de catalogo P2076), protema neutralizante de endotoxina (Seikagaku America: versiones derivadas de manera natural y recombinantes, numero de catalogo 910140-1, 910130-1 y 910120-1), protema inhibidora de endotoxina (Bachem; numero de catalogo H-1382), sustrato de endotoxina (Bachem; numero de catalogo L-1195), anticuerpo anti-acido lipoteicoico (QED; numero de catalogo 15711), anticuerpo anti-endotoxina (QED; numero de catalogo 15306 y 15301). Se sonicaron las partmulas magneticas recubiertas (1x108 por 10 |il) (1
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min.; parametro 8; desmembrador sonico Fisher Scientific 550). Entonces se anadieron combinaciones de las perlas magneticas recubiertas a tubos de sangre de 1,5 ml (1 ml, Biochemed; sangre humana, citrato de sodio como anticoagulante, numero de catalogo 10762WB) con adiciones conocidas de aproximadamente 1, 10 o 100 celulas de Staphylococcus aureus (ATCC n.° 27694). Se dejaron incubar la sangre, las bacterias y los imanes (1 hora a temperatura ambiente). Tras la incubacion, se seleccionaron magneticamente las perlas usando un dispositivo de separacion magnetica (Polysciences, Inc., Warrington, PA, numero de catalogo 8MB4111S) para capturar y sujetar las partfculas magneticas. Entonces se decanto la sangre y se sembro en placa sobre TSA (Difco, numero de catalogo 236950) como se habfa hecho con los inoculos iniciales de Staphylococcus aureus de 1, 10 y 100 celulas (usados como controles). Se resuspendieron las partfculas magneticas (1 ml de PBS) y se filtro el lfquido resultante que contema partfculas magneticas-complejos bacterianos sobre una membrana (Osmonics, poretics 47 mm, poro de 0,22 |im, filtro negro de policarbonato, numero de catalogo 1213889), y entonces se coloco la membrana sobre una placa de TSA. Tanto en el punto de tiempo cero como tras un corto periodo de incubacion, se obtuvieron imagenes de los filtros usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas para detectar las microcolonias autofluorescentes. Se determino la recuperacion en porcentaje comparando el recuento de inoculos con el recuento de captura magnetica y usando la formula: (captura magnetica promedio/recuento de inoculos promedio) X 100.
Resultados: La figura 18 muestra los resultados experimentales que demuestran la deteccion de microcolonias tras la separacion magnetica. Esta figura muestra dos imagenes, tomadas tras cero y seis horas de crecimiento. La imagen a las seis horas tiene supuestas microcolonias (estas son puntos brillantes que no se observan en la imagen a tiempo cero). Para confirmar que estas son de hecho microcolonias microbianas en crecimiento, se dejaron incubar los filtros durante la noche y volvieron a obtenerse imagenes. Se detectaron macrocolonias en las posiciones de las supuestas microcolonias confirmando el resultado rapido. Se logro una recuperacion mayor del 90 por ciento de Staphylococcus aureus para las muestras de 1 celula. Las muestras de 10 y 100 celulas tuvieron una recuperacion mayor del 50 por ciento.
Variaciones (agentes de union amplios): Podnan usarse numerosos agentes de union ampliamente reactivos incluyendo aglutinina de germen de trigo, antfgeno comun anti-enterobacteriano, anti-protema A, anti-protema G, protema de union a LPS, mucina (agente de union bacteriano), CD14 (se une tanto a LPS como a complejos bacterianos con LPS), colectinas (estas se unen a las bacterias durante la fagocitosis o durante la cascada del complemento), subunidades del propio complemento tales como C3b y C4b, receptores endocfticos (“scavenger’) humanos (receptores celulares que se unen a componentes bacterianos) y moleculas tectonicas (protemas de union a hidratos de carbono).
Variaciones (agentes de union espedficos): Puede usarse una variedad de tipos de moleculas de union a una categona, incluyendo anticuerpos, aptameros y ligandos, para seleccionar espedficamente un intervalo de tipos de celulas de las muestras complejas. En esta variacion de ejemplo, se logra la seleccion de una E. coli 0157.H7 usando un anticuerpo espedfico frente a E. coli 0157.H7.
Variacion del metodo experimental: En esta variacion, se logra la deteccion de bacterias en una muestra compleja con seleccion magnetica espedfica de analito. La seleccion va seguida por la deteccion de microcolonias usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas. La figura 17 muestra el metodo de uso para este ejemplo. Se mezcla una muestra que contiene E. coli O157:H7 con partmulas magneticas. Entonces la muestra se selecciona magneticamente, se filtra y se obtienen imagenes de la misma en una serie de puntos de tiempo usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas. Se obtienen partmulas magneticas anti-E. coli 0157.H7 mediante el acoplamiento de partmulas magneticas modificadas con tosilo (Dynal, Oslo, Noruega, numero de catalogo 140.03; acoplamiento realizado segun las recomendaciones del fabricante) a anticuerpos policlonales producidos contra E. coli 0157.H7 (BioTrace purificado por afinidad; Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, numero de catalogo 01-95-90). Se sonicaron las partmulas magneticas anti-E. coli 0157.H7 (1x108/10 ml) (1 min.; parametro 8; desmembrador sonico Fisher Scientific 550). Entonces se anadieron las perlas magneticas a la sangre (1 ml; Biochemed; sangre humana, citrato de sodio como anticoagulante, numero de catalogo 10762WB) con adiciones conocidas de E. coli 0157.H7 (cepa DEC 3B, Dr. Tom Whittam, Pennsylvania State University). Se logran el crecimiento y la deteccion de microcolonias de E. coli 0157.H7 siguiendo las mismas etapas usadas anteriormente en este ejemplo.
Ejemplo 13. Pruebas de sensibilidad antimicrobiana usando replicacion in situ y obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas
Antecedentes y objetivos: La importancia de las pruebas de sensibilidad antimicrobiana para determinar la terapia apropiada se trata en la seccion de antecedentes. La monitorizacion del crecimiento microbiano sobre un medio solido es comun y tiene ventajas algo significativas con respecto al crecimiento en un cultivo lfquido. Es posible determinar de manera economica, simultanea y cuantitativa la sensibilidad de una cepa de bacterias a varios antibioticos sin el uso de instrumentacion (por ejemplo, usando ensayos de difusion de disco), pero los metodos actuales requieren una colonia purificada y, por tanto, habitualmente no pueden realizarse hasta 1-2 dfas despues de haber procesado la muestra del paciente. Tales retrasos pueden ser potencialmente mortales. Ademas, generalmente se requieren otros 1-2 dfas para detectar y analizar el resultado de una prueba de sensibilidad antimicrobiana.
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Objetivo. El ejemplo demuestra el uso de la invencion para determinar la sensibilidad a antibioticos de cepas bacterianas rapidamente. El principio del metodo se representa esquematicamente en la figura 19. En el experimento descrito mas adelante, se hicieron crecer cepas resistentes y sensibles sobre medios con y sin antibiotico y se detectaron microcolonias como en el ejemplo anterior. El enfoque ofrece el potencial de acortar significativamente las etapas de crecimiento prolongadas (purificacion de colonias y crecimiento en antibiotico) que actualmente pueden retrasar la puesta en practica de una terapia antimicrobiana apropiada.
Metodos. Se deposito una cepa de bacterias sensible (E. coli MG1655) y una resistente (E. coli MG1655/ pLafr I) sobre filtros como en el ejemplo anterior (ejemplo 1). Se colocaron filtros que conteman aproximadamente 1000 bacterias resistentes sobre placas de LB (agar LB; Difco) que o bien conteman antibiotico (tetraciclina; 64 |ig/ml) o bien no conteman antibiotico. Tras la incubacion a 37°C (3 h), se tineron y se obtuvieron imagenes de los filtros como en el (ejemplo 1).
Resultados. La figura 21 muestra los resultados de las pruebas de sensibilidad antimicrobiana usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas basada en CCD. La obtencion de imagenes de CCD detecto microcolonias en la membrana que contema bacterias resistentes pero no en la membrana que contema bacterias sensibles (comparense las filas marcadas “cepa resistente” y “cepa sensible” en la columna mas a la izquierda marcada: 3 horas + tet, CCD). Los datos de intensidad obtenidos a partir del analisis de imagenes cuantificaron esta observacion (grafico de barras). La microscopfa de fluorescencia de alta potencia confirmo que la cepa resistente formaba microcolonias tras 3 horas de incubacion, mientras que la cepa sensible no. (El analisis microscopico indico que la incubacion de la cepa sensible en presencia de antibiotico conduce a morfologfas bacterianas aberrantes [comparense las dos imagenes microscopicas en la fila inferior marcada “cepa sensible”].).
Los resultados de este experimento muestran que la deteccion de microcolonias usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas es un metodo rapido y sensible para las pruebas de sensibilidad antimicrobiana.
Variaciones: Algunas variaciones en la prueba de sensibilidad antimicrobiana incluyen usar diferentes restos de senal. En este ensayo podna sustituirse la tincion del acido nucleico por colorantes de viabilidad, tales como Syto 9 y otros miembros de la familia Syto (Molecular Probes), sustratos de esterasa tales como diacetato de fluorescema o chemchrome V6 (Chemunex), anticuerpos marcados o metabolitos que producen productos fluorescentes. Tambien podna usarse la autofluorescencia natural de las celulas diana celulares para detectar las microcolonias. Tambien podna usarse el crecimiento de microcolonias para monitorizar las limitaciones de crecimiento geometricas como con la difusion de disco de las pruebas de sensibilidad antimicrobiana o los metodos de prueba E (AB biodisk NA Inc.; tiras de prueba E). El ensayo de sensibilidad antimicrobiana tambien puede ampliarse para incluir la identificacion simultanea de diversos microbios con diferentes anticuerpos marcados de manera fluorescente.
Ejemplo 14. Pruebas de sensibilidad antimicrobiana rapidas usando el metodo de difusion de disco y obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas
Objetivo: Este ejemplo demuestra el uso de la invencion para determinar la sensibilidad a antibioticos de cepas bacterianas rapidamente usando el metodo de difusion de disco. Se colocan discos que se han impregnado con una concentracion conocida de un antibiotico sobre placas que contienen un gran numero de celulas de un cultivo microbiano purificado. El antibiotico difunde desde el disco creando un gradiente radial de concentracion de antibiotico centrado en el disco (es decir, cuanto mas cerca del disco, mayor es la concentracion de antibiotico). Las cepas altamente resistentes pueden crecer en presencia de los discos incluso cerca del borde en el que la concentracion de antibiotico es la mas alta. Las cepas menos resistentes crecen fuera de una zona de inhibicion que rodea al disco. La anchura de la zona de inhibicion esta correlacionada con el nivel de resistencia al antibiotico para la cepa.
La zona de inhibicion se mide tradicionalmente a simple vista tras un crecimiento durante la noche. Este ejemplo demuestra la capacidad para determinar la zona de inhibicion en horas mediante la deteccion del crecimiento de microcolonias usando obtencion de imagenes de grandes areas no ampliadas.
Metodos experimentales: Las cepas, usadas en el ejemplo y descritas en el ejemplo 13, se diluyeron hasta 106 UFC/ml y se sembraron en placa sobre medios TSA. Entonces se coloco un disco de difusion de tetraciclina (Hardy Diagnostics; 30 |ig de tetraciclina, numero de catalogo Z9121) sobre las placas. Se dejaron incubar las placas a 37°C durante 5 horas. Se obtuvieron imagenes de las microcolonias usando autofluorescencia de microcolonias y obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas como en los ejemplos anteriores.
Resultados: La figura 21 muestra los resultados de una prueba de sensibilidad antimicrobiana rapida usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas. La obtencion de imagenes basada en CCD detecto colonias resistentes autofluorescentes que crecfan cerca de un disco de difusion de antibiotico tras solo 5 horas. La zona de inhibicion era comparable a la obtenida mediante inspeccion visual tras el crecimiento durante la noche. Los resultados de este experimento muestran que la deteccion de las zonas de inhibicion basandose en el crecimiento de microcolonias es mas rapido que el metodo de difusion de disco tradicional, pero puede proporcionar resultados comparables.
Variaciones: Esta tecnica puede usarse con la mayona de los discos de difusion de antibioticos y la mayona de los
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microbios.
Ejemplo 15. Pruebas de sensibilidad antimicrobiana rapidas usando el E-test™ y obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas
Objetivo: Este ejemplo demuestra el uso de la invencion para determinar rapidamente la sensibilidad a antibioticos de cepas bacterianas usando una tira de prueba de antibioticos E-test™. La tira E-test™ esta impregnada con un intervalo de concentraciones de tetraciclina que permiten que el usuario use una tira para determinar la menor concentracion de antibiotico necesaria para inhibir el crecimiento de las bacterias sometidas a prueba. Esta concentracion inhibitoria minima se basa en la visualizacion de zonas sin crecimiento, denominadas zona de inhibicion. La zona de inhibicion se mide tradicionalmente a simple vista tras un crecimiento durante la noche. Este ejemplo demuestra la capacidad para determinar la zona de inhibicion en horas mediante la deteccion del crecimiento de microcolonias usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas.
Metodos experimentales: Las cepas, usadas en el ejemplo y descritas en el ejemplo 13, se diluyeron hasta 106 UFC/ml y se sembraron en placa sobre medios TSA. Entonces se coloco la tira E-test™ (Hardy diagnostics: 0,016256 |ig de tetraciclina, numero de catalogo 51002258) sobre las placas que se dejaron incubar a 37°C durante cinco horas. Se obtuvieron imagenes de las microcolonias que credan en o cerca de la tira de prueba usando autofluorescencia de microcolonias y obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas como en los ejemplos anteriores. Tras la obtencion de imagenes, se dejaron incubar las placas durante la noche.
Resultados:
La figura 22 muestra los resultados de una prueba E-test™ de sensibilidad antimicrobiana rapida usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas. La obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas detecto microcolonias resistentes autofluorescentes que credan cerca de la tira de prueba de antibioticos E-test™. Pudo determinarse una zona de inhibicion comparable a la observada tras el crecimiento durante la noche tras cinco horas de crecimiento. Los resultados de este experimento muestran que la deteccion de microcolonias usando obtencion de imagenes de grandes areas no aumentadas es un metodo rapido y sensible que reduce enormemente el tiempo hasta obtener los resultados para un E-test™.
Variaciones: Esta tecnica es aplicable a las tiras E-test™ impregnadas con una variedad de antibioticos.

Claims (17)

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REIVINDICACIONES
Instrumento para detectar microcolonias de celulas diana en una muestra, comprendiendo dicho instrumento:
(a) un detector de matriz fotoelectrico que tiene optica de recogida para detectar un area de deteccion que tiene al menos una dimension que es > 1 mm sin aumentar dicha area de deteccion mas de 5 veces;
(b) una fuente de iluminacion que ilumina dicha area de deteccion; y
(c) un ordenador programado para recibir los datos recogidos por dicho detector de matriz fotoelectrico, y programado para el analisis de imagenes que comprende analizar dichos datos para detectar una o mas microcolonias que tienen una medicion de menos de 50 micrometros en al menos dos dimensiones ortogonales, y programado para cuantificar el numero de microcolonias detectadas en dicha area de deteccion, en el que dicho instrumento detecta una propiedad optica intrmseca de las microcolonias y en el que dichas celulas en dichas una o mas microcolonias siguen siendo competentes para replicarse tras la deteccion.
Instrumento de la reivindicacion 1, que comprende ademas un incubador para la replicacion microbiana.
Instrumento de la reivindicacion 2, en el que dicho instrumento puede detectar dicha area de deteccion en multiples puntos de tiempo durante la incubacion.
Instrumento de la reivindicacion 1, que comprende ademas un foco automatico para enfocar sobre dicha area de deteccion.
Instrumento de la reivindicacion 1, en el que dicha optica de recogida no produce aumento.
Instrumento de la reivindicacion 1, en el que dicho analisis de imagenes comprende ademas detectar microcolonias en crecimiento.
Instrumento de la reivindicacion 1, en el que dicho instrumento puede cargar automaticamente dicha muestra.
Instrumento de la reivindicacion 1, en el que dicha deteccion detecta luz emitida, dispersada, reflejada o absorbida como resultado de la iluminacion de dichas una o mas microcolonias.
Instrumento de la reivindicacion 1, en el que dicha deteccion detecta la autofluorescencia emitida por dichas microcolonias.
Instrumento de la reivindicacion 1, en el que dicha fuente de iluminacion emplea uno o mas laseres.
Instrumento de la reivindicacion 1, que comprende ademas uno o mas filtros opticos que solo dejan pasar longitudes de onda seleccionadas de luz.
Instrumento de la reivindicacion 1, en el que dicho instrumento puede alinear multiples imagenes del area de deteccion por medio de marcas de registro.
Instrumento de la reivindicacion 1, en el que dicho detector de matriz fotoelectrico comprende un detector de CCD, detector de tubos fotomultiplicadores o un detector de fotodiodos, en particular un detector de CCD enfriado.
Instrumento de la reivindicacion 1, en el que dicha deteccion comprende determinar las ubicaciones en el area de deteccion de dichas una o mas microcolonias.
Instrumento de la reivindicacion 1, en el que dicho analisis de imagenes distingue objetos que cambian de tamano a lo largo del tiempo de objetos que no cambian de tamano a lo largo del tiempo.
Instrumento de la reivindicacion 1, que comprende ademas una platina X-Y automatizada para situar dicha muestra en relacion con dicha fuente de iluminacion y detector.
Instrumento de la reivindicacion 1, en el que dicho ordenador puede guardar automaticamente datos de salida para consulta.
Instrumento de la reivindicacion 1, en el que el ordenador esta programado para detectar dichas microcolonias mediante una utilidad de hallazgo de objetos que une pfxeles contiguos que tienen un valor por encima de un umbral automatico o definido por el usuario para establecer una lmea de contorno alrededor del penmetro del objeto, en el que los pfxeles del penmetro y los de dentro se definen como el objeto.
19. Instrumento de la reivindicacion 1, en el que la optica de recogida comprende una lente de recogida y una lente de enfoque.
20. Instrumento de la reivindicacion 1, en el que dicho instrumento sigue automaticamente a dicha muestra mediante un codigo de barras o una etiqueta equivalente.
5 21. Instrumento de la reivindicacion 1, en el que el instrumento ilumina el area de deteccion con luz visible.
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