CN115980011A - 一种基于荧光标记的生殖道致病微生物的检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种基于荧光标记的生殖道致病微生物的检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于致病微生物快速检测技术领域，涉及一种基于荧光标记的生殖道致病微生物的检测试剂盒及检测方法。本发明提供了一种基于荧光标记的生殖道致病微生物的检测试剂盒，所述试剂盒包括：无菌稀释液、甲醇、能够与致病微生物特异性结合的荧光抗体溶液和清洗剂。本发明所述试剂盒灵敏度高、特异性性好、操作简便，适合大批量检测，能够实现生殖道致病微生物的快速检测。

Description

一种基于荧光标记的生殖道致病微生物的检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于致病微生物快速检测技术领域，具体涉及一种基于荧光标记的生殖道致病微生物的检测试剂盒及检测方法。
背景技术
生殖道传染病是全球卫生公共问题，尤其是女性生殖道健康。女性生殖道病原微生物感染是临床妇科常见的疾病，具有易复发、混合感染等特点，影响患者生活质量。研究表明支原体、衣原体是非淋球菌性尿道炎最常见的病原体。加德纳菌、毛滴虫、白色念珠菌等是阴道炎最常见的病原微生物。致病微生物的预防和治疗一直是备受关注的热点。因此，致病微生物的快速、高灵敏度检测是生殖道健康的重要保证。
目前，传统的生殖道病原微生物的检验方法主要有分离培养生化鉴定，要经过选择性培养及扩增后进行生化鉴定或者PCR法，完成这些过程时间久，操作繁杂。因此，亟需建立一种生殖道致病微生物的快速检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于荧光标记的生殖道致病微生物的检测试剂盒及检测方法。本发明所述试剂盒灵敏度高、特异性性好、操作简便，适合大批量检测，能够实现生殖道致病微生物的快速检测。
本发明提供了一种基于荧光标记的生殖道致病微生物的检测试剂盒，所述试剂盒包括：无菌稀释液、甲醇、能够与致病微生物特异性结合的荧光抗体溶液和清洗剂。
优选的是，所述生殖道致病微生物包括细菌、真菌、毛滴虫、支原体和衣原体中的一种或两种以上。
优选的是，所述无菌稀释液包括含质量百分含量为0.5％的曲拉通的PBS缓冲液。
优选的是，所述荧光抗体包括FITC标记的致病微生物的单克隆抗体。
优选的是，所述荧光抗体的制备方法包括以下步骤：使用荧光染料标记试剂盒对致病微生物的单克隆抗体进行荧光标记；所述荧光染料标记试剂盒包括上海生工生物工程有限公司生产的HOOKDyeLabelingKit。
优选的是，所述清洗剂包括碧云天生产的免疫荧光洗涤液。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述试剂盒的非疾病诊断或治疗目的的生殖道致病微生物的检测方法，包括以下步骤：
1)将待测生殖道样本与无菌稀释液混合，得到稀释后的样本；
2)将稀释后的样本涂布于载玻片上，加入甲醇对样本进行固定，得到固定后的样本；
3)将固定后的样本与荧光抗体溶液混合，37℃反应20min，使用清洗剂进行清洗、晾干，得到晾干后的样本；
4)将晾干后的样本在荧光显微镜下进行观察。
优选的是，步骤1)所述混合时，无菌稀释液的添加量为200～300μL。
优选的是，步骤2)所述固定时，甲醇的添加量为10～30μL；所述固定的时间为5～10min。
优选的是，步骤3)所述混合时，荧光抗体溶液的添加量为10～15μL。
本发明提供了一种基于荧光标记的生殖道致病微生物的检测试剂盒。本发明所述试剂盒利用荧光抗体特异性结合目标微生物，在荧光显微镜下能够直接观察是否有目标致病微生物。利用本发明所述试剂盒进行检测，具有以下有益效果：(1)检测操作简便，样本处理简单；(2)检测快速，易于观察，对仪器设备要求低；(3)操作人员无需特别培训，按说明书操作也可以完成检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的生殖支原体检测结果图；
图2为本发明提供的沙眼衣原体检测结果图；
图3为本发明提供的阴道加德纳菌检测结果图；
图4为本发明提供的毛滴虫检测结果图；
图5为本发明提供的白色念珠菌检测结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种基于荧光标记的生殖道致病微生物的检测试剂盒，所述试剂盒包括：无菌稀释液、甲醇、能够与致病微生物特异性结合的荧光抗体溶液和清洗剂。
在本发明中，所述生殖道致病微生物优选包括细菌、真菌、毛滴虫、支原体和衣原体中的一种或两种以上。本发明对所述细菌、真菌、毛滴虫、支原体和衣原体的具体种类没有特殊限定，是常规感染生殖道疾病的微生物即可。在本发明中，所述细菌优选包括加德纳菌；所述真菌优选包括白色念珠菌；所述衣原体优选包括沙眼衣原体。
在本发明中，所述无菌稀释液优选包括含质量百分含量为0.5％的曲拉通的PBS缓冲液。在本发明中，所述荧光抗体优选包括FITC标记的致病微生物的单克隆抗体。在本发明中，所述荧光抗体的制备方法优选包括以下步骤：使用荧光染料标记试剂盒对致病微生物的单克隆抗体进行荧光标记；所述荧光染料标记试剂盒优选包括上海生工生物工程有限公司生产的HOOKDyeLabelingKit。本发明对所述致病微生物的单克隆抗体的来源没有特殊限定，每种致病微生物的单克隆抗体优选采用常规市售单克隆抗体即可，如购自美国ViroStat。如当检测毛滴虫时，本发明优选使用够自美国ViroStat的毛滴虫的单克隆抗体进行荧光标记，获得毛滴虫的荧光抗体，然后利用毛滴虫的荧光抗体与毛滴虫的结合作用实现对毛滴虫的荧光检测。
在本发明中，所述清洗剂优选包括碧云天生产的免疫荧光洗涤液。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述试剂盒的非疾病诊断或治疗目的的生殖道致病微生物的检测方法，包括以下步骤：
1)将待测生殖道样本与无菌稀释液混合，得到稀释后的样本；
2)将稀释后的样本涂布于载玻片上，加入甲醇对样本进行固定，得到固定后的样本；
3)将固定后的样本与荧光抗体溶液混合，37℃反应20min，使用清洗剂进行清洗、晾干，得到晾干后的样本；
4)将晾干后的样本在荧光显微镜下进行观察。
本发明将待测生殖道样本与无菌稀释液混合，得到稀释后的样本。在本发明中，所述无菌稀释液优选包括PBS缓冲液，所述PBS缓冲液中含有曲拉通，PBS缓冲液中曲拉通的质量百分含量为0.5％。在本发明中，所述混合时，无菌稀释液的添加量优选为200～300μL。
得到稀释后的样本后，本发明将稀释后的样本涂布于载玻片上，加入甲醇对样本进行固定，得到固定后的样本。在本发明中，所述固定时，甲醇的添加量优选为10～30μL；所述固定的时间优选为5～10min。
得到固定后的样本后，本发明将固定后的样本与荧光抗体溶液混合，37℃反应20min，使用清洗剂进行清洗、晾干，得到晾干后的样本。在本发明中，所述荧光抗体优选包括FITC标记的致病微生物的单克隆抗体。在本发明中，所述荧光抗体的制备方法优选包括以下步骤：使用荧光染料标记试剂盒对致病微生物的单克隆抗体进行荧光标记；所述荧光染料标记试剂盒优选包括上海生工生物工程有限公司生产的HOOKDyeLabelingKit。本发明对所述致病微生物的单克隆抗体的来源没有特殊限定，采用常规市售单克隆抗体即可，如购自美国ViroStat。在本发明中，所述混合时，荧光抗体溶液的添加量优选为10～15μL。在本发明中，所述清洗剂优选包括碧云天生产的免疫荧光洗涤液。
得到晾干后的样本后，本发明将晾干后的样本在荧光显微镜下进行观察。
本发明所述检测方法能够有效降低背景，增加特异性结合，识别更加精准。
本发明所述检测方法通过荧光染料标记抗体，使抗体具有荧光特性，再与目标抗原结合后在荧光显微镜下呈现特定的颜色，肉眼可快速识别目标致病微生物。本发明利用荧光抗体特异性结合目标微生物，在荧光显微镜下直接观察是否有目标致病微生物。本发明的方法可准确快速、高通量地的检测生殖道致病微生物，具有易操作、特异性强、灵敏度高等优点，其应用前景广泛。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种基于荧光标记的生殖道致病微生物的检测试剂盒及检测方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
检测病人样本中是否含有致病微生物—生殖支原体
1.1荧光抗体制备
用荧光染料标记试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司，HOOKDyeLabelingKit)对生殖支原体的单克隆抗体(购自美国ViroStat)进行荧光标记。标记步骤如下：(1)染料配置：取1管染料加入DMSO100μL充分溶解后备用。(2)抗体浓缩至浓度为2～3mg/ml，取0.5ml按照试剂盒中要求加入步骤(1)中配置好的荧光染料5μL，室温标记1h。(3)脱盐柱的处理：取一支脱盐柱1000g离心2min，去除存储液，然后加入缓冲液2ml，1000g离心2min，重复5次。(4)去除未结合的染料：将步骤(2)中标记好的溶液加入步骤(3)中处理好的柱子中1000g，离心5min收集过柱后的液体，即得到了荧光抗体。
1.2样本检测
(1)样本处理：将医院的样本(棉签取样)加入无菌稀释液200μL漩涡混合备用。
(2)样本固定：取5μL步骤1)中的样本涂布在载玻片上，加入10μL甲醇固定5min。
(3)在固定好的样本上加入10μL荧光抗体溶液，孵育20min后，用清洗剂洗去多余的抗体，然后在荧光显微镜下观察结果。
(4)若能看到绿色荧光球状、杆状或椭球状形态的微生物，见图1(生殖支原体检测结果图)。则说明含有目标致病微生物。
(5)对20个阳性样本进行检测，结果显示19个样本能看到生殖支原体，1个未检出，检出率较高。
实施例2
检测病人样本中是否含有致病微生物—沙眼衣原体
用荧光染料标记试剂盒对沙眼原体的单克隆抗体(购自美国ViroStat)进行荧光标记。标记步骤如下：(1)染料配置：取1管染料加入DMSO100μL充分溶解后备用。(2)抗体浓缩至浓度为2～3mg/ml，取0.5ml按照试剂盒中要求加入步骤(1)中配置好的荧光染料5μL，室温标记1h。(3)脱盐柱的处理：取一支脱盐柱1000g离心2min，去除存储液，然后加入缓冲液2ml，1000g离心2min，重复5次。(4)去除未结合的染料：将步骤(2)中标记好的溶液加入步骤(3)中处理好的柱子中1000g，离心5min收集过柱后的液体，即得到了荧光抗体。
1.2样本检测
(1)样本处理：将医院的样本(棉签取样)加入无菌稀释液200μL漩涡混合备用。
(2)样本固定：取5μL步骤1)中的样本涂布在载玻片上，加入10μL甲醇固定5min。
(3)在固定好的样本上加入10μL荧光抗体溶液，孵育20min后，用清洗剂洗去多余的抗体，然后在荧光显微镜下观察结果。
(4)若能看到绿色荧光针尖大小形态的微生物，见图2(沙眼衣原体检测结果图)。则说明含有目标致病微生物。
(5)对10个阳性样本和5个阴性样本进行检测，结果显示阳性样本能看到沙眼衣原体，阴性样本未看到，准确性很高。
实施例3
检验病人样本中是否含有致病微生物—阴道加德纳菌
用荧光染料标记试剂盒对阴道加德纳菌的单克隆抗体(购自美国ViroStat)进行荧光标记。标记步骤如下：(1)染料配置：取1管染料加入DMSO 100μL充分溶解后备用。(2)抗体浓缩至浓度为2～3mg/ml，取0.5ml按照试剂盒中要求加入步骤(1)中配置好的荧光染料5μL，室温标记1h。(3)脱盐柱的处理：取一支脱盐柱1000g离心2min，去除存储液，然后加入缓冲液2ml，1000g离心2min，重复5次。(4)去除未结合的染料：将步骤(2)中标记好的溶液加入步骤(3)中处理好的柱子中1000g，离心5min收集过柱后的液体，即得到了荧光抗体。
1.2样本检测
(1)样本处理：将医院的样本(棉签取样)加入无菌稀释液200μL漩涡混合备用。
(2)样本固定：取5μL步骤1)中的样本涂布在载玻片上，加入10μL甲醇固定5min。
(3)在固定好的样本上加入10μL荧光抗体溶液，孵育20min后，用清洗剂洗去多余的抗体，然后在荧光显微镜下观察结果。
(4)若能看到绿色荧光杆状形态的微生物，见图3(阴道加德纳菌检测结果图)。则说明含有目标致病微生物。
(5)对30个阳性样本和10个阴性样本进行检测，结果显示阳性样本28个能看到阴道加德纳菌，2个阳性样本未看到，阴性样本均未看到，检出率很高。
实施例4
检验病人样本中是否含有致病微生物—毛滴虫
用荧光染料标记试剂盒对毛滴虫的单克隆抗体(购自美国ViroStat)进行荧光标记。标记步骤如下：(1)染料配置：取1管染料加入DMSO 100μL充分溶解后备用。(2)抗体浓缩至浓度为2～3mg/ml，取0.5ml按照试剂盒中要求加入步骤(1)中配置好的荧光染料5μL，室温标记1h。(3)脱盐柱的处理：取一支脱盐柱1000g离心2min，去除存储液，然后加入缓冲液2ml，1000g离心2min，重复5次。(4)去除未结合的染料：将步骤(2)中标记好的溶液加入步骤(3)中处理好的柱子中1000g，离心5min收集过柱后的液体，即得到了荧光抗体。
1.2样本检测
(1)样本处理：将医院的样本(棉签取样)加入无菌稀释液200μL漩涡混合备用。
(2)样本固定：取5μL步骤1)中的样本涂布在载玻片上，加入10μL甲醇固定5min。
(3)在固定好的样本上加入10μL荧光抗体溶液，孵育20min后，用清洗剂洗去多余的抗体，然后在荧光显微镜下观察结果。
(4)若能看到绿色荧光团聚态的微生物，见图4(毛滴虫检测结果图)。则说明含有目标致病微生物。
(5)对10个阳性样本进行检测，结果显示阳性样本均能看到毛滴虫。
实施例5
检验病人样本中是否含有致病微生物—白色念珠菌
用荧光染料标记试剂盒对白色念球菌的单克隆抗体(购自美国ViroStat)进行荧光标记。标记步骤如下：(1)染料配置：取1管染料加入DMSO100μL充分溶解后备用。(2)抗体浓缩至浓度为2～3mg/ml，取0.5ml按照试剂盒中要求加入步骤(1)中配置好的荧光染料5μL，室温标记1h。(3)脱盐柱的处理：取一支脱盐柱1000g离心2min，去除存储液，然后加入缓冲液2ml，1000g离心2min，重复5次。(4)去除未结合的染料：将步骤(2)中标记好的溶液加入步骤(3)中处理好的柱子中1000g，离心5min收集过柱后的液体，即得到了荧光抗体。
(1)样本处理：将医院的样本(棉签取样)加入无菌稀释液200μL漩涡混合备用。
(2)样本固定：取5μL步骤1)中的样本涂布在载玻片上，加入10μL甲醇固定5min。
(3)在固定好的样本上加入10μL荧光抗体溶液，孵育20min后，用清洗剂洗去多余的抗体，然后在荧光显微镜下观察结果。
(4)若能看到绿色荧光圆形孢子和菌丝体形态的微生物，见图5(白色念珠菌检测结果图)。则说明含有目标致病微生物。
(5)对20个阳性样本进行检测，结果显示阳性样本均能看到白色念珠菌及其菌丝。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种基于荧光标记的生殖道致病微生物的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：无菌稀释液、甲醇、能够与致病微生物特异性结合的荧光抗体溶液和清洗剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生殖道致病微生物包括细菌、真菌、毛滴虫、支原体和衣原体中的一种或两种以上。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述无菌稀释液包括含质量百分含量为0.5％的曲拉通的PBS缓冲液。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光抗体包括FITC标记的致病微生物的单克隆抗体。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光抗体的制备方法包括以下步骤：使用荧光染料标记试剂盒对致病微生物的单克隆抗体进行荧光标记；所述荧光染料标记试剂盒包括上海生工生物工程有限公司生产的HOOK DyeLabelingKit。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述清洗剂包括碧云天生产的免疫荧光洗涤液。
7.一种基于权利要求1～6任一项所述试剂盒的非疾病诊断或治疗目的的生殖道致病微生物的检测方法，包括以下步骤：
1)将待测生殖道样本与无菌稀释液混合，得到稀释后的样本；
2)将稀释后的样本涂布于载玻片上，加入甲醇对样本进行固定，得到固定后的样本；
3)将固定后的样本与荧光抗体溶液混合，37℃反应20min，使用清洗剂进行清洗、晾干，得到晾干后的样本；
4)将晾干后的样本在荧光显微镜下进行观察。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤1)所述混合时，无菌稀释液的添加量为200～300μL。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤2)所述固定时，甲醇的添加量为10～30μL；所述固定的时间为5～10min。
10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤3)所述混合时，荧光抗体溶液的添加量为10～15μL。
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