CN104975065A - 一种基于生化初筛及荧光纳米生物探针检测沙门菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明一种基于生化初筛及荧光纳米生物探针检测沙门菌的方法，用含培养基的拭子采样并培养，通过观测其是否产生硫化亚铁形成的黑斑而筛选出硫化氢反应阳性的拭子，然后将其与特异性抗体偶联的量子点纳米探针溶液孵育，实现探针对靶向菌的特异性结合。通过观测拭子上的量子点偶合物荧光信号达到检测靶向菌的目的。本发明配合设计的带截止滤光片及荧光激发光源的体视镜制成的人工荧光观测仪或激光共聚焦显微镜，实现可视化判断结果，可操作性强，适合广泛应用于大批量样品的实际检测工作。本发明的操作简单、特异性强、准确度高、效率高，可以在一天内完成初筛，两天完成靶向菌的分离。所需的拭子、培养基、生物探针均易于制备，适合产业化生产。

Description

一种基于生化初筛及荧光纳米生物探针检测沙门菌的方法

技术领域

本发明涉及病原菌检测技术领域，特别是涉及到一种基于生化初筛及荧光纳米生物探针检测沙门菌的方法。

背景技术

食源性致病菌一直是一个严重的全球健康威胁。在过去十年的中国，微生物导致食物中毒爆发的比例最大(60.4％)。在美国，每年发生约42000宗严重的沙门菌病。由于很多致病菌的感染剂量非常低，所以简单、快速、灵敏、可靠的检测技术对人类生命健康至关重要。然而，基于传统培养的检测方法的灵敏度和分离技术的不足，轻微感染沙门菌的情况下，通常没有被诊断出来，因此实际感染数目是非常大的。开发能大幅提高检测和分离率的新技术成为迫切需求。沙门菌的传统基于培养的检测方法及酶联免疫吸附试验(ELISA)灵敏度低，程序复杂并且工作量大，需要专业人员进行仪器操作，检测所需的人力、物力多。现有技术不能满足日常检测需要，也给实验人员带来了极大的检测困难。

很多由半导体量子结构所构成现代发光材料和器件不断出现，制造形成的量子点尺寸都与过去常用的染料分子的尺寸接近，其和传统荧光染料一样对生物医学的研究有很大用途。从生物体系的发光标记物的差异上分析，量子点由于量子力学的奇妙规则而具有显著的尺寸效应，基本上高于特定域值的光都可吸收，而一个有机染料分子只有在吸收合适能量的光子后才能从基态升到较高的激发态，所用的激发光必须是精确的波长。量子点材料要吸收所有高于其带隙能量的光子，但所发射光的波长(具有相应的颜色)又非常具有尺寸依赖性，故单一种类的纳米半导体材料就能够按尺寸变化产生一个发光波长不同的、颜色分明的标记物家族，这是染料分子根本无法实现的。

荧光分析法由于灵敏度高、选择性好、仪器结构相对简单、价格便宜等特点，已成为化学分析中的常用方法之一。由于能发射出荧光的物质数量不多，那些不能发射荧光的物质常需要与一些荧光配合物或荧光探针等结合才能进行分析测定，从而限制了荧光分析法的直接应用。量子点由于其具有的独特荧光性质，成为科研工作者采用荧光标记法进行生物测定的新型探针材料。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种快速、灵敏、简便的检测沙门菌的方法。

本发明用含有培养基的拭子直接采样并培养，通过观测是否产生硫化亚铁形成的黑斑而判断硫化氢反应是否阳性，作出阳性初筛，然后将特异性靶向抗体偶联的量子点纳米颗粒溶液与初筛阳性的拭子孵育，从而实现对靶向菌的特异性结合及荧光观测，通过观测拭子上的量子点偶合物的荧光信号检测靶向菌。

具体的技术方案是：一种基于生化初筛及荧光纳米生物探针检测沙门菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

A)含培养基拭子的制作：将适于沙门菌生长的培养基加入用吸水材料所制作的拭子中，晾干备用，其拭子分为棉签状、纸片状两种；

B)取样培养：使用步骤A处理后的拭子加入定量样本，37℃培养18～48小时；

C)可疑样品的筛选：肉眼观察拭子生长情况，筛选产生黑色斑点的拭子；然后其放入含沙门菌特异性抗体偶联的水溶性量子点生物探针溶液中，37℃孵育15分钟或者4～8℃低温冷孵育过夜，然后将拭子放于设计的人工荧光观测仪(带特制截止滤光片及荧光激发光源的体视镜)或者激光共聚焦显微镜下观察，或者激光共聚焦显微镜下观察，并提供与量子点相应波长的激发光源，有荧光斑或丝出现者为阳性，且可以判定为标本携带沙门菌；

D)可直接挑取黑斑、荧光斑的部分培养物，转至鉴别平板培养基上划线分离，获取沙门菌的纯分离株，以供作其它试验用。

所述拭子为棉签状拭子或者纸片状拭子，所述棉签状拭子，由长25～30mm，宽9～10mm，重0.1～0.2g的100％医疗级脱脂棉纤维和一个14.5cm长的柄构成，将棉签状拭子置于和棉签状拭子相适应的长筒状容器内，添加1.0～2.0ml培养基后于35℃～45℃无菌环境干燥48小时，置于4℃备用；所述纸片状拭子，由长10～15cm，宽2.2～2.8cm的3号层析滤纸片构成，将纸片状拭子折叠后放于密封袋内，添加1.0～2.0ml培养基后于35℃～45℃无菌环境干燥48小时，置于4℃备用。

所述培养基含有40毫克的多价蛋白胨，5毫克氯化钠，10毫克普通蛋白胨，0.6毫克柠檬酸铁胺，12毫克硫代硫酸钠，0.6毫克亮氨酸，8微克胆盐，补加蒸馏水至1毫升。PH值调至7.4。

所述方法中步骤C)可以采用人工荧光观测仪进行观测，所述带人工荧光观测仪是在普通体视镜的物镜外层安装一个环形蓝色发光二极管，在二极管外层盖装一个环形光学截止滤光片；光学截止滤光片能够完全遮盖住蓝色发光二极管。

所述环形蓝色发光二极管的激发光波长为365～405nm；所述光学截止滤光器截止的发射光波长为400～680nm。

本发明的有益效果是：本发明将生化反应的初筛作用与荧光纳米生物探针结合起来检测沙门菌，建立了快速检测的方法，配合设计的带截止滤光片及荧光激发光源的体视镜制成的人工荧光观测仪或激光共聚焦显微镜，实现可视化判断结果，可操作性强，适合大批量样品的检测，操作简单、特异性强、准确度高、效率高，可以在一天内完成初筛，两天完成靶向菌的分离。本发明大大减少了人力、物力的消耗，检测效率大大提高，可广泛应用于实际检测工作；所需的拭子、培养基、生物探针均易于制备，适合产业化生产。

附图说明

图1为单克隆抗体共轭的量子点探针的表征:量子点偶合抗体后(A-a)及偶合前(A-b)凝胶电泳图、水溶性CdSe/ZnS量子点在标准抗体前后的荧光吸收及发射光谱图(B)、单克隆抗体标记的CdSe/ZnS量子点与沙门菌特异性孵育结合的透射电子显微镜观测图(C)；

图2为人工荧光观测仪的设计图；

图3为检测沙门菌的方法流程图；

图4为拭子的生化反应初筛效果图(A)、特制的分离可疑菌株用的弯钩(B)、初筛阳性拭子孵育量子点探针溶液后的肉眼荧光效果图(C-G)；

图5为拭子孵育量子点探针溶液后的激光共聚焦显微镜观测图；

图6为拭子孵育量子点探针后的扫描电子显微镜检测图：

图7为模拟样本检测的特异性、灵敏性和检出率(A)、肛拭样本加标检测应用(B-C)。

具体实施方式

为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合实施例详细描述本发明提供的技术方案。以下实施例仅用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。

实施例1应用水溶性氨基化CdSe/ZnS量子点及含培养基的棉签状拭子对曼哈顿沙门菌Salmonella manhattan的检测。

下面以水溶性氨基化CdSe/ZnS量子点及含培养基的棉签状拭子对曼哈顿沙门菌Salmonella manhattan检测为例，对本发明方法进行详细的说明。

1、拭子的制备方法

棉签状拭子：长25～30mm，宽9～10mm，重0.11g的100％医疗级脱脂棉纤维和一个14.5cm长的竹柄的棉签状拭子，能够吸收1000微升培养基或样品溶液。所有定制拭子不含有任何添加剂(如甲醛，消色剂或荧光剂等)。将1000微升配置好的培养基加入到一个和棉签状拭子相适应的长筒状容器内，将所述拭子插入到该容器内，在室温下吸收30分钟，然后将充分吸收了培养基的拭子置于35℃～45℃无菌环境干燥48小时，再置于4℃备用。

2、培养基的制备

每毫升培养基中含有40毫克的多价蛋白胨，5毫克氯化钠，10毫克普通蛋白胨，0.6毫克柠檬酸铁胺，12毫克硫代硫酸钠，0.6毫克亮氨酸，8微克胆盐，补加蒸馏水至1毫升。PH值调至7.4。

3、单克隆沙门菌抗体偶联CdSe/ZnS量子点探针的表征检测

制备或市售的抗体偶联水溶性量子点的表征检测是正确应用前的检测基础。取5μL单克隆抗体共轭CdSe/ZnS量子点(98.6×10^-2μg/μL)或CdSe/ZnS量子点(98.6×10^-2μg/μL)分别加样于凝胶电泳的a、b轨道起始孔，应用考马斯亮蓝染色，加电压80mv，电泳30分钟后即可在观测显色带。

应用荧光分光光度计(UV-2550,Shimadzu,Japan)检测量子点前后的吸收波长和发射波长。光度计的扫描范围为400～700nm，扫描带宽为0.5nm，激发波长为405nm，参比溶液为10mM PBS(pH7.4)。

应用透射电子显微镜(Hitachi 7000FA)检测沙门菌与相应量子点探针孵育后发生的特异性表面构象变化。取50uL的曼哈顿沙门菌(105CFU mL^-1)与10μL的单克隆标记CdSe/ZnS量子点溶液(98.6×10^-2μg/μL)共同孵育于1.0ml TBS溶液(0.01M,pH 7.4)约30分钟，然后取20μL孵育后的偶合溶液沉积于专用的铜片载体上约24小时，干燥后被放置于透射电镜下观测(×20000、75kV)。

4、人工LED荧光观测仪的设计

应用InGaN材料制作的156个蓝色发光二极管(激发波长为405nm)制成环形激发光源(内径为44mm，外径为98mm)。如图6所示，此激发光源配有功率为10瓦的调谐器(输入电压90V～264V,输出电压12V)。另有定制的滤光片(国标规格编号：zwb2，内径为46mm，外径为100mm，厚度1mm)为紫外线石英玻璃，其可以紧扣在环形激发光源的正上方，使波长400～680nm之间的激发光和其它干涉光得到截止。因为靶向量子点的发射光波长在525nm，从而可以得到更窄更纯的发射光(525nm)以供观测。将滤光片与激发光源的整合体加装在体视显微镜的目镜上，手持或固定样本拭子于目镜下方，打开激发光源，即可肉眼观测靶向拭子上放大的荧光影像。

5、曼哈顿沙门菌Salmonella manhattan的检测

应用制备好的拭子加入含10CFU ml^-1曼哈顿沙门菌(中国医学微生物菌种保藏管理中心批号：CMCC 50152)的1mL定量样本中，经37℃培养18～48小时。隔3小时观察拭子生长情况，筛选出有黑色斑点的拭子。这些拭子判定为硫化氢反应阳性的菌(包含沙门菌等生化反应特性达标的菌)，再用特制的钩子勾取黑斑部位并划线转至平板培养基以获取相关可疑菌的纯分离株。然后将产黑斑拭子放入含沙门菌特异性抗体偶联的氨基修饰的水溶性CdSe/ZnS量子点溶液(1μg/μL)中，孵育15分钟或者4～8℃低温冷孵育过夜。然后将拭子放于本发明研制的人工荧光观测仪(带特制截止滤光片及荧光激发光源的体视镜)或者激光共聚焦显微镜下观察，并提供与量子点相应激发波长的光源，观测荧光产生情况。尤其在肉眼荧光不易分辨时，可调节体视显微镜的放大倍数，或者挑选可疑纤维压片置于激光共聚焦显微镜下观测最后再用特制的钩子勾取荧光斑或丝的纤维部分转至相应的用于沙门菌鉴别及分离的琼脂平板培养基，以进一步获取相关可疑菌的纯分离株。

6、拭子纤维孵育量子点探针溶液后的激光共聚焦显微镜检测分析

应用研制的人工荧光检测仪仍然不易肉眼分辨拭子的荧光斑或丝时，可挑取可疑纤维丝置于玻片上，滴加一滴20％甘油(10μL)，盖上盖玻片后，置于荧光共聚焦显微镜下观测。凡样本拭子纤维丝的荧光强度强于阴性拭子(接种非沙门菌)荧光强度的三倍标准差(应用image J软件计算荧光强度)，即可判定为沙门菌阳性的标本。随即将阳性纤维丝直接转至靶向菌的分离平板培养基中培养，以得到纯的分离株。

7、拭子纤维孵育量子点探针后的扫描电子显微镜检测分析

阳性拭子孵育量子点探针前后、接种奇异变形杆菌的拭子及空白拭子孵育量子点探针后，取相关纤维固定于2.5％戊二醛溶液中，随后用乙醇溶液作梯度脱水处理，然后将样品纤维真空干燥并涂覆金铂颗粒。

应用扫描电镜(Hitachi S-4800)观测证实纤维上的阳性菌在孵育量子点探针前后的表面构象变化，以及阴性拭子和空白纤维是否存在与量子点探针的非特异性结合。

8、应用本发明方法检测模拟样本的特异性、检出率及应用效果

制备各40份混合菌液的模拟样本做测试验证最低检出限，其含有10¹CFU ml^-1曼哈顿沙门菌与10⁵CFU ml^-1、10⁶CFU ml^-1或10⁷CFUml^-1的三种非沙门菌(大肠杆菌、变形杆菌或枸橼酸杆菌)，以纯净水为空白管。制备各40份混合菌液的模拟样本做测试验证特异性和检出率，其含有10¹CFU ml^-1曼哈顿沙门菌与10⁵CFU ml^-1的三种非沙门菌(大肠杆菌、变形杆菌或枸橼酸杆菌)，以纯净水为空白管。此外，经疾控中心采集120份不含沙门菌的肛拭样本(混合于4ML纯净水中)以验证真实样本的应用效果，120份样本均一分为四，其中两份为一组加入10¹CFU ml^-1的曼哈顿沙门菌，而另两份样本为一组不添加沙门菌，各组均作新方法和传统基于培养方法的比对。通过本方法应用检测后，依据国际检测标准方法(国际食品微生物标准委员会标准：ICMSF-2006))验证分析证实相关所得分离株，统计相关检测参数。

二、结果

1、单克隆沙门菌抗体偶联CdSe/ZnS量子点探针的表征

图1A所示，单克隆抗体共轭CdSe/ZnS量子点和CdSe/ZnS量子点的凝胶电泳运动轨道分别为a、b轨道，单克隆抗体共轭CdSe/ZnS量子点(Aa)比标记前的CdSe/ZnS量子点(Ab)跑的慢。量子点探针己成功标记上相应抗体。

图1B所示，CdSe/ZnS量子点标记前的发射波长为525nm，标记后的发射波长仍为525nm，证实量子点标记前后的荧光激发特性稳定。

图1C所示，曼哈顿沙门菌与相应抗体偶合量子点探针溶液孵育后发生了特异性结合。菌体表面的抗原抗体结合点的直径为16nm,超过90％的单克隆抗体共轭的量子点探针连接到沙门菌的菌体表面。

2、人工LED荧光观测仪的结构

体视显微镜(SZM-45T1 Cnina)的物镜加装人工荧光激发光源及相应滤光片的成品图(图2A)及暗室中开机的效果图(图2B)、功率10瓦的环形LED激发光源(图2C)、截止滤光片(ZWB2)的实物图(图2D)、截止滤光片的荧光光谱图(图2E)、人工荧光观测仪的光路图(图2F)。

3、曼哈顿沙门菌Salmonella manhattan的检测

经37℃培养18～48小时后，筛选出有黑色斑点(产硫化亚铁沉淀物)的疑似含沙门菌拭子(图4A)。经过量子点探针的孵育后，在特制的人工荧光观测仪或激光共聚焦显微镜下观测拭子，发现荧光斑或丝出现者即为沙门菌阳性(图4(C-G))。最后可直接挑取黑斑、荧光斑的部分培养物，转至鉴别平板培养基上划线分离，获取沙门菌的纯分离株，以供作其它试验分析用。

4、拭子纤维孵育量子点探针溶液后的激光共聚焦显微镜观测分析

含曼哈顿沙门菌的阳性样本(图5(A-C))、含变形杆菌的阴性样本(图5(D-F))、空白纤维样本(图5(G-I))，依次为暗场、明场和叠加。应用image J软件计算暗场下的样本荧光强度：A＝164.729,D＝0.382,G＝0.341。阳性标本的荧光强度大于与阴性对照观测值的三倍标准差，相应标本可以判定为阳性。

5、拭子纤维孵育量子点探针后的扫描电子显微镜检测分析

如图6所示，在阳性纤维上的沙门菌体表面在孵育特异性量子点抗体前(图6(A-B))非常平整光滑，但孵育后(图6(C-D))则出现无数直径约0.2-0.5μm的结节偶合物。阴性拭子上的变形杆菌(图6(E-F))及空白纤维(图6(G-H))表面也是呈现光滑平整。相关分析证实了量子点探针对阳性拭子上沙门菌的特异性吸附反应。

6、检测模拟样本的特异性、灵敏度、检出率及肛拭样本加标检测的应用效果

在含有10¹CFU ml^-1曼哈顿沙门菌与10⁵CFU ml^-1、10⁶CFU ml^-1或10⁷CFU ml^-1的三种非沙门菌(大肠杆菌、变形杆菌或枸橼酸杆菌)的各40份模拟样本中，仅有10¹CFU ml^-1曼哈顿沙门菌与10⁵CFUml^-1三种非沙门菌(大肠杆菌、变形杆菌或枸橼酸杆菌)的样本都可以在24小时内100％检出曼哈顿沙门菌，其它浓度配比的样本都只能获不到60％的阳性检出率，故最低检出限为10¹CFU ml^-1曼哈顿沙门菌，且混合10⁵CFU ml^-1的三种非沙门菌不干扰检测。

图7A所示，大肠杆菌、变形杆菌或枸橼酸杆菌为干扰菌的新方法检出率(应用人工荧光观测仪作终极判定标准)分别达97.50％(图7A-a3)、97.50％(图7A-b3)、100％(图7A-c3)。其中肉眼荧光分辨率可以分别达52.50％(图7A-a2)、57.5％(图7A-b2)、62.5％(图7A-c2)。新方法的检测含沙门菌拭子的产黑斑率达100％(图7A-a1、b1、c1)，含阴性菌样本拭子的肉眼荧光假阳性检出率为0.0％(图7A-d2、e2、f2)，且含阴性菌样本拭子的应用激光共聚焦显微镜检测的假阳性率为0.0％(图7A-d3、e3、f3)。阴性菌的硫化氢反应都正常，其中含大肠杆菌拭子的硫化氢反应全呈阴性(图7A-d1)、含变形杆菌或枸橼酸杆菌拭子的硫化氢反应全呈阳性(图7A-e1、f1)。

图7B、图7C所示，加标阳性标本在应用激光共聚焦显微镜检测的新方法后获得阳性检出率为96.67％(图7BA-g3)，产肉眼可视荧光率为68.33％(图7BA-g2)，产黑斑率为100％(图7BA-g1)，必须按国标方法完成每一步鉴定步骤的比率(即完整工作量)为100％(图7BA-g4)；而传统方法的检出率为91.67％(图7BA-i1)及完整工作量为100％(图7BA-i2)。未加标阴性标本在应用激光共聚焦显微镜检测的新方法后的阳性检出率为1.67％(图7B-h3)，产肉眼可视荧光率为1.67％(图7BA-h2)，产黑斑率为25.00％(图7BA-h1)，完整工作量为25.00％(图7BA-h4)，而传统方法的检出率为0.00％(图7BA-j1)及相应的完整工作量为100％(图7BA-j2)。在上述1.67％的假阳性样本中分离出枸橼酸杆菌，其与沙门菌抗体可以非特异性结合，证实其具有与沙门菌相交叉的遗传背景或免疫原性，所以此类非特异性检出可以接受。

本发明用含有培养基的拭子直接采样并培养，通过观测是否产生硫化亚铁形成的黑斑而判断硫化氢反应是否阳性，作出阳性初筛，然后将特异性靶向抗体偶联的量子点纳米颗粒溶液与初筛阳性的拭子孵育，从而实现对靶向菌的特异性结合及荧光观测，通过观测拭子上的量子点偶合物的荧光信号检测靶向菌。

本发明的有益效果是：本发明将生化反应的初筛作用与荧光纳米生物探针结合起来进行检测沙门菌，建立了快速检测的方法，配合设计的人工荧光观测仪或激光共聚焦显微镜，实现可视化判断结果，可操作性强，适合大批量样品的检测。本发明操作简单、特异性强、准确度高、检测周期短、效率高，可以在一天内完成初筛，两天完成靶向菌的分离。本发明大大减少了人力、物力的消耗，检测效率大大提高，可广泛应用于实际检测工作；所需的拭子、培养基、生物探针均易于制备，适合产业化生产。

Claims (5)

1.一种基于生化初筛及荧光纳米生物探针检测沙门菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

A)含培养基拭子的制作：将适于沙门菌生长的培养基加入用吸水材料所制作的拭子中，晾干备用，其拭子分为棉签状、纸片状两种；

B)取样培养：使用步骤A处理后的拭子加入定量样本，37℃培养18～48小时；

C)可疑样品的筛选：肉眼观察拭子生长情况，筛选产生黑色斑点的拭子；然后其放入含沙门菌特异性抗体偶联的水溶性量子点生物探针溶液中，37℃孵育15分钟或者4～8℃低温冷孵育过夜，然后将拭子放于设计的人工荧光观测仪或者激光共聚焦显微镜下观察，并提供与量子点相应波长的激发光源，有荧光斑或丝出现者为阳性，且可以判定为标本携带沙门菌；

D)可直接挑取黑斑、荧光斑的部分培养物，转至鉴别平板培养基上划线分离，获取沙门菌的纯分离株，以供作其它试验用。

2.根据权利要求1所述的一种基于生化初筛及荧光纳米生物探针检测沙门菌的方法，其特征在于：所述拭子为棉签状拭子或者纸片状拭子，所述棉签状拭子，由长25～30mm，宽9～10mm，重0.1～0.2g的100％医疗级脱脂棉纤维和一个14.5cm长的柄构成，将棉签状拭子置于和棉签状拭子相适应的长筒状容器内，添加1.0～2.0ml培养基后于35℃～45℃无菌环境干燥48小时，置于4℃备用；所述纸片状拭子，由长10～15cm，宽2.2～2.8cm的3号层析滤纸片构成，将纸片状拭子折叠后放于密封袋内，添加1.0～2.0ml培养基后于35℃～45℃无菌环境干燥48小时，置于4℃备用。

3.根据权利要求2所述的一种基于生化初筛及荧光纳米生物探针检测沙门菌的方法，其特征在于：所述培养基每毫升中含有40毫克的多价蛋白胨，5毫克氯化钠，10毫克普通蛋白胨，0.6毫克柠檬酸铁胺，12毫克硫代硫酸钠，0.6毫克亮氨酸，8微克胆盐，补加蒸馏水至1毫升。PH值调至7.4。

4.根据权利要求1所述的一种基于生化初筛及荧光纳米生物探针检测沙门菌的方法，其特征在于：所述方法中步骤C)可以采用人工荧光观测仪进行观测，所述人工荧光观测仪是在普通体视镜的物镜外层安装一个环形蓝色发光二极管作为激发光源，在二极管外层再盖装一个环形光学截止滤光片；光学截止滤光片能够完全遮盖住蓝色发光二极管。

5.根据权利要求4所述的一种基于生化初筛及荧光纳米生物探针检测沙门菌的方法，其特征是：所述环形蓝色发光二极管的激发光波长为365～405nm；所述光学截止滤光片截止的发射光波长为400～680nm。