ES2624685T3 - Detección microbiana rápida y prueba de susceptibilidad antimicrobiana - Google Patents

Abstract

Un método de detección del crecimiento de células de microorganismos individuales en una muestra, que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un biosensor que comprende al menos una superficie de detección y un módulo de detección; (b) concentrar las células de microorganismos individuales sobre la al menos una superficie de detección de forma que cada célula individual esté en un sitio discreto que está espacialmente separado; (c) someter las células de microorganismos individuales a condiciones de crecimiento durante un primer periodo de tiempo en presencia o en ausencia de uno o más agentes antimicrobianos; y (d) detectar el crecimiento de la célula o las células de microorganismo individual sobre la al menos una superficie de detección como una indicación de su viabilidad.

Description

Detección microbiana rápida y prueba de susceptibilidad antimicrobiana

5 Antecedentes de la invención

Los resultados médicos para tratar infecciones humanas (por ejemplo, neumonía adquirida por respirador, meningitis infecciosa, bacteremia, y similares) pueden verse significativamente afectados por la duración de tiempo requerida para realizar los análisis de la cantidad e identidad de las bacterias y la susceptibilidad de las bacterias a diversos antibióticos. Convencionalmente, el tiempo para el análisis puede ser 24 a 48 horas o más, tiempo durante el cual la afección del paciente puede deteriorarse a medida que las bacterias se multiplican (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 4.778.758 de Ericsson et al., la patente de EE.UU. 3.935.073 de Waters, la patente de EE.UU. 6.043.048 de Johnston et al. y la patente de EE.UU. 4.259.442 de Gayral). El análisis microbiano contemporáneo empieza con el crecimiento de bacterias a partir de un espécimen clínico, tal como esputo, sangre, y similares, a alta

15 concentración en medio de cultivo, normalmente del orden de 100 millones de organismos por mililitro. Los especímenes clínicos pueden contener solo algunos organismos individuales (por ejemplo, en la prueba de sangre para bacteremia), y umbrales de diagnóstico incluso para especímenes de alta concentración normalmente son varios miles de veces más bajos que los límites de detección de cultivo cuantitativo.

Después de lograr el crecimiento en masa inicial hasta una concentración de trabajo adecuada, el operario realiza entonces una o más pruebas bioquímicas o crecimiento en medios selectivos que incorporan reactivos bioquímicos selectivos. Así, los actuales procedimientos normalizados requieren al menos dos ciclos de crecimiento secuenciales, requiriendo cada uno normalmente muchas horas hasta completarse.

25 Adicionalmente, la prueba de susceptibilidad a fármacos requiere la determinación del fallo al crecimiento en medios selectivos. La comprobación de la ausencia de crecimiento requiere tiempo adicional en cultivo con respecto al que podría requerirse de un indicador directo de muerte celular. Es muy reconocido en la clase médica que en ciertas circunstancias tales métodos, que intentan demostrar la ausencia de crecimiento, producen resultados que no se correlacionan adecuadamente con los resultados reales del tratamiento.

Como resultado de estas y otras graves deficiencias, la práctica contemporánea deja de proporcionar al médico adjunto la información de diagnóstico específica que el médico necesita con el fin de seleccionar un fármaco eficaz para tratar la infección dentro de la ventana de tiempo deseada. Por ejemplo, en neumonía adquirida por el respirador, la investigación clínica ha demostrado que la razón de posibilidades para la elevada morbilidad y

35 mortalidad después de 24 horas de tratamiento ineficaz sigue siendo 7:1 a pesar de un cambio a tratamiento eficaz. Es decir, a menos que el médico inicie el tratamiento eficaz, es decir, fármacos antimicrobianos de un tipo y concentración adecuados para destruir rápidamente el organismo infeccioso en el plazo de sustancialmente menos de 24 horas desde la aparición de los síntomas, un cambio de terapia ineficaz a eficaz no mejorará significativamente los resultados para aproximadamente el 87 % de los pacientes así tratados.

Los médicos son muy conscientes del riesgo del retraso, y así prescriben el tratamiento normalmente usando una combinación de fármacos de amplio espectro seleccionados empíricamente, basándose en una historia de hospital o de comunidad particular de resistencia o susceptibilidad al fármaco microbiano. La investigación clínica ha demostrado que tal tratamiento con fármaco empírico es ineficaz en aproximadamente del 25 % al 50 % de los

45 casos. Adicionalmente, la exposición de un paciente a terapia inadecuada no solo aumenta los costes individuales del paciente y los riesgos médicos, sino que también aumenta la probabilidad de promover la emergencia de organismos resistentes. El último problema aumenta el riesgo médico no solo para el paciente individual, sino para todos los otros individuos en el hospital y comunidad que pueden después llegar a infectarse con organismos resistentes.

Está muy reconocido en la bibliografía de investigación clínica que la exposición anterior de un paciente a antibióticos ineficaces constituye un factor de riesgo significativo en la posterior emergencia de organismos resistentes en ese paciente. Por estos y otros motivos, se desea dentro de la clase médica idear métodos de diagnóstico que no sufran las deficiencias de retraso e inexactitud que caracterizan a las prácticas actuales.

55 En teoría, alternativas al cultivo de crecimiento microbiano incluyen métodos analíticos microbianos directos tales como inmunoensayos de diversos tipos. Están comercialmente disponibles anticuerpos contra diversos microbios o pueden ser fácilmente desarrollados. En realidad, ahora se usan rutinariamente muchos tipos diferentes de inmunoensayos en ciertos aspectos del diagnóstico para infección microbiana. Sin embargo, todavía no existe ninguna identificación bacteriana rutinaria, cuantificación y prueba de susceptibilidad a fármaco para muchas enfermedades infecciosas graves.

De manera similar, también es deseable la rápida detección de diversos microbios tales como bacterias, virus, mohos, y similares, para probar contaminación en alimentos y agua, y en la detección de la presencia de posibles 65 agentes de guerra biológica. En la industria alimentaria están comercialmente disponibles muchos productos para detectar contaminantes microbianos. En ciertas circunstancias, algunos de éstos proporcionan resultados en

aproximadamente 24 horas para un conjunto limitado de organismos particulares. Sin embargo, todos los productos comerciales todavía requieren el enriquecimiento de muestras por medio de cultivo bacteriano antes de aplicar las pruebas.

5 En la bibliografía de investigación referente a defensa para guerra biológica, también se han descrito muchos dispositivos de detección rápida, que incluyen algunos que proporcionan resultados en una hora o incluso menos. Además, algunos de tales dispositivos no requieren cultivos de crecimiento antes de ser usados.

Sin embargo, la sensibilidad de los dispositivos hasta la fecha descrita en la bibliografía para la prueba de alimentos

10 o biodefensa dista mucho de los requisitos para los diagnósticos médicos. Además, estas aplicaciones no de diagnóstico no requieren pruebas de susceptibilidad a fármacos y así los dispositivos anteriormente dichos ni proporcionan ni aparentemente se prestan a adaptación para un fin tal.

Una limitación clave con estos dispositivos y con métodos de laboratorio tales como ELISA es su dependencia de la

15 concentración de analito diana. Se basan en la difusión pasiva de la diana a una superficie de inmuno-captura u otra de detección. La velocidad de aparición de eventos de proximidad sonda a diana íntimos, y de ahí la velocidad de la reacción de detección, depende de la concentración de analito en la solución o suspensión de muestra. Este problema se agrava por las velocidades de difusión muy bajas de las bacterias.

20 Con el fin de aumentar la sensibilidad con estos dispositivos, es necesario aumentar sustancialmente la concentración de analito. Los investigadores han descrito varias estrategias para aumentar la concentración de analito diana y también para acelerar el tiempo de respuesta para el análisis de diversas dianas biomoleculares y microbianas. Por ejemplo, anteriormente se ha descrito la electroforesis de diana a la sonda en Nanogen, Inc. de San Diego, CA (por ejemplo, en la patente de EE.U.U. N.º 5.849.486 de Heller, en la patente de EE.UU. N.º

25 6.017.696 de Heller, en la patente de EE.UU. N.º 6.051.380 de Sosnowski et al., en la patente de EE.UU. N.º

6.099.803 de Ackley et al., en la patente de EE.UU. N.º 6.245.508 de Heller et al. y en la patente de EE.UU. N.º

6.379.897 de Weidenhammer et al.). Estos sistemas y métodos describen una matriz direccionable de electrodos a la que están unidas sondas individuales en cada electrodo individual, y que entonces se hacen reaccionar secuencialmente y muy rápidamente con sondas. Los aumentos informados en la velocidad de reacción entre la 30 diana y las sondas son cientos o miles de veces. Estos sistemas, sin embargo, sufren varias limitaciones, que incluyen la necesidad de inmovilizar secuencialmente sondas sobre los electrodos direccionables, la necesidad de realizar reacciones secuenciales y limitaciones sobre los métodos de detección que pueden emplearse debido a las tensiones más altas que se requieren para la electroforesis, excluyendo el uso de electrodos transparentes (por ejemplo, mediante el uso de óxido de indio y estaño), que no pueden operar a las tensiones usadas por el sistema 35 Nanogen. Además, las tensiones más altas a las que el sistema Nanogen opera generan productos de oxidación que son posiblemente peligrosos para las sondas o dianas, y que, por tanto, requiere el uso de superficies de pasivación complejas para proteger las sondas y dianas. Sistemas que podrían hacer uso de la impresión de micromatrices de alta velocidad, que no requirieron superficies de pasivación complejas, y que no requirieron la electrónica y otro control necesario para electrodos direccionables, reducirían enormemente el coste y la

40 complejidad de tales sistemas.

Con respecto al uso de sondas inmovilizadas para la detección de bacterias u otros microorganismos, también es útil determinar la actividad antimicrobiana de diferentes agentes terapéuticos, tales como antibióticos. Ha habido una abundancia de sistemas que usan sondas de ácido nucleico o de anticuerpo para determinar la identidad de

45 bacterias en una muestra (por ejemplo, en la patente de EE.UU. N.º 5.656.432 de Claverys et al. y en patente de EE.UU. N.º 6.403.367 de Cheng et al.). Con estos sistemas, es dificil determinar la susceptibilidad a agentes antimicrobianos, dada la dificultad de encontrar marcadores de ácido nucleico o de anticuerpo que se correlacionen de forma fiable con la resistencia o con el comportamiento antimicrobiano. Es a la solución de estos y otros problemas a lo que se refiere la presente invención.

50 El documento GB 1.520.733 enseña la detección de la presencia de microorganismos en una muestra de fluido cultivando los microorganismos en un medio de crecimiento que pone en contacto un electrodo de medición y uno de referencia y que mide el posible cambio entre los electrodos con un potenciómetro de alta impedancia.

55 El documento WO 95/08640 A1 describe la clasificación de poblaciones de microorganismos a partir de una mezcla que contiene más de una población de microorganismos. Se sabe que los microorganismos de diferentes tipos varían en tamaño, forma y características de carga superficial. Se sugiere que estas características contribuyen a la velocidad de migración para microorganismos bajo la influencia de un campo eléctrico, y que los microorganismos de la misma población (género y especie) migrarán de manera similar.

60 El documento EP 0498920 A2 desvela un método de ensayo para detectar la presencia de organismos capaces de ser cultivados, tales como bacterias, caracterizado por captura por anticuerpo del organismo de interés, incubación de las células capturadas para formar colonias; eliminación de material de las colonias con una membrana de levantamiento de colonias; y detección del material de colonia sobre la hoja de membrana por el

65 uso de anticuerpos marcados.

El documento WO 89/01162 A1 se refiere a métodos para la detección de bajos números de un microorganismo particular o microorganismos de una población mixta, comprendiendo el método exponer la muestra a un soporte sólido al que anticuerpos específicos para el (los) organismo(s) se adsorben y o bien crecer el (los) organismo(s) unido(s) a un nivel detectable seguido de inmunoensayo o bien liberar los organismos del soporte, seguido de

5 crecimiento sobre un medio no selectivo y observación de las colonias resultantes. El documento WO 89/01162 también se refiere a kits de prueba para realizar estos métodos.

Breve descripción de los dibujos

10 Las Figuras 1A-1L representan varias configuraciones electroforéticas con primer y segundo electrodos de electroforesis 500 y 510, superficies de detección 520, primer y segundo sustratos 530 y 535 que forman una o más cámaras de detección (no mostradas).

Las Figuras 2A -2J representan varios esquemas de posibles cartuchos de biosensor. La Fig. 2A es un diagrama

15 esquemático desde arriba de una celda de detección bacteriana 804, y la Fig. 2B es un diagrama esquemático en vista lateral de la celda de detección bacteriana de la Fig. 32A a través de la sección transversal X. La celda 804 comprende dos cámaras 805 (también representadas en el presente documento como microcanales 700), de los que puede haber solo uno o decenas o incluso cientos. Cada cámara se usará tanto para manipular una muestra bacteriana diferente, como para manipular una al lado de la otra una única muestra, en la que las

20 bacterias se tratarán con diferentes medios de crecimiento, antibióticos u otros agentes antiorganismo, perfiles de concentración de antibiótico, temperaturas, u otras condiciones físicas, químicas o biológicas a las que se someterán las bacterias. Las cámaras 805 se muestran como rodeadas en todos los lados, pero la cámara como se describe en el presente documento puede estar abierta, tal como en un formato de un pocillo de placa de microtitulación. Si la cámara 805 es cerrada, se proporcionan un puerto de entrada 803 y un puerto de salida 802

25 para cambiar la solución dentro de la cámara 805. La Fig. 2C es un diagrama esquemático en vista lateral de la celda de detección bacteriana de la Fig. 2B con el uso de electrodos direccionables. Las Figuras 2A, 2B y 2C representan todas un área de "preconcentración" 810 opcional, que pueden tener su propio electrodo 819A o no (figura 2B). También se representan puertos de entrada y/o salida 802. La Figura 2D también representa otra configuración como se describe en el presente documento, que utiliza un único electrodo de referencia y varios

30 electrodos de trabajo, uno 500 que está debajo de la superficie de captura de preconcentración 810 y uno 501 que está debajo de una pluralidad de superficies de detección 520, aunque también puede usarse una superficie de detección. En general, no se muestran interconexiones.

Las Figuras 3A -3F representan de manera similar las vistas de varios posibles cartuchos de biosensor

35 adicionales; la Figura 3A utiliza un primer sustrato con una depresión de forma que las cámaras se forman cuando el segundo sustrato se añade a la parte superior; las Figuras 3B y 3C utilizan una junta 540 entre los dos sustratos. La Figura 3D, 3E y 3F representan varias configuraciones de configuraciones de electroforesis, además de interconexiones eléctricas 550, tanto sobre la superficie del primer sustrato (Figura 3D, solo se muestra el primer sustrato "inferior") como a través del primer sustrato (Figura 3E). No se representan puertos de

40 entrada y/o salida.

Las Figuras 4A, 4B, 4C, 4D y 4E representan varios esquemas de diferentes posibles configuraciones de cartuchos de biosensor. La Figura 4A representa un biosensor que contiene un único microcanal de flujo 700 con módulos de almacenamiento opcionales 600, 601, 602 y 603 (por ejemplo para guardar muestras, agentes 45 antimicrobianos, medios de crecimiento adicionales, reactivos, marcas, ligandos de unión, cámaras de residuos, etc.), válvulas opcionales 610 y una única superficie de detección 520. Las Figuras 4B, 4C, 4D y 4E representan cartuchos de biosensor multicanal. Obsérvese que los diferentes módulos de muestra (600 y siguientes) pueden conectarse individualmente a los microcanales, por ejemplo cuando un primer microcanal es para evaluar un primer agente antimicrobiano y un segundo microcanal es para evaluar un segundo agente, o cuando van a 50 probarse diferentes muestras en diferentes microcanales. Además, o alternativamente, algunos módulos de muestra pueden conectarse a todos los canales, por ejemplo cuando una única muestra va a evaluarse en todos los canales o para reactivos comunes. Las Figuras 4D y 4E representan el dispositivo de 8 canales usado en los ejemplos. En este caso hay canales fluídicos para mover el fluido (705) distintos de los canales fluídicos 700 que contienen la superficie de detección 520. Obsérvese que los electrodos de electroforesis y sus interconexiones

55 no se muestran, ni las entradas de muestra y de reactivos.

Las Figuras 5A -5D representan algunos resultados del Ejemplo 4.

Las Figura 6 representa algunos resultados del Ejemplo 4.

60 Las Figuras 7a y 7b representan algunos resultados del Ejemplo 5.

Las Figuras 8a y 8b representan algunos resultados del Ejemplo 6.

65 Las Figuras 9a, 9b, 9c y 9d representan algunos resultados del Ejemplo 7.

Las Figura 10 representa algunos resultados del Ejemplo 7. Las Figura 11a, 11b y 11c representan algunos resultados del Ejemplo 8.

Las Figura 12 representa algunos resultados del Ejemplo 8. 5 Las Figura 13a, 13b, 13c, 13d, 13e y 13f representan algunos resultados del Ejemplo 9.

Las Figura 14 representa la curva de crecimiento de S. aureus como se explica resumidamente en el Ejemplo 10.

10 Además, todas las figuras del documento USSN 10/888.828, que se publicó como US 2005-048599, y las leyendas adjuntas y texto se incorporan por este documento expresamente por referencia.

Sumario de la invención

15 La presente invención se refiere a métodos de detección del crecimiento de células de microorganismos individuales en una muestra y la identificación y caracterización de microorganismos. En el presente documento también se describen varias composiciones para la detección, identificación y caracterización de microorganismos.

Un primer aspecto de la invención se describe a continuación. 20

(1) Un método de detección del crecimiento de células de microorganismos individuales en una muestra que comprende:

(a) poner en contacto la muestra con un biosensor que comprende al menos una superficie de detección y un 25 módulo de detección;

(b)

concentrar las células de microorganismos individuales sobre la al menos una superficie de detección de forma que cada célula individual esté en un sitio discreto que está espacialmente separado;

(c)

someter las células de microorganismos individuales a condiciones de crecimiento durante un primer periodo de tiempo en presencia o ausencia de uno o más agentes antimicrobianos; y

30 (d) detectar el crecimiento de la célula de microorganismo individual o células sobre la al menos una superficie de detección como una indicación de su viabilidad.

También se proporcionan las siguientes realizaciones.

35 (2) El método según (1), que adicionalmente comprende añadir al menos un agente bioactivo durante las condiciones de crecimiento. Opcionalmente se toman varias lecturas o evaluaciones del crecimiento. Opcionalmente se añaden una pluralidad de agentes, tanto secuencialmente como simultáneamente, o a alícuotas de la muestra.

40 (3) El método según (2), que adicionalmente comprende medir el crecimiento de las células de microorganismos individuales antes de la adición del uno o más agentes antimicrobianos; y medir el crecimiento de las células de microorganismos individuales después de un segundo periodo de crecimiento en presencia del uno o más agentes antimicrobianos.

45 (4) El método según (1), en el que se establece la identidad de al menos un microorganismo.

(5) El método según (1), en el que la detección comprende monitorizar alteraciones en el área física sobre la superficie asociada a una célula de microorganismo individual a medida que crece.

50 (6) El método según (1), en el que la detección comprende detectar la presencia de células hija en sustancialmente la misma localización sobre la al menos una superficie de detección que las células de microorganismos individuales de las que se derivan. Algunas realizaciones incluyen el uso de marcas.

(7) El método según (1), en el que el biosensor comprende una pluralidad de canales, comprendiendo cada uno 55 una superficie de detección.

(8) El método según (1), en el que el biosensor comprende además una pluralidad de módulos de almacenamiento, conteniendo cada módulo un agente antimicrobiano diferente.

60 (9) El método según (1), en el que la al menos una superficie de detección comprende una pluralidad de sitios de detección individuales. La al menos una superficie de detección puede comprender opcionalmente ligandos de captura selectivos, o una superficie no específica.

(10) El método según (1), que adicionalmente comprende identificar al menos una de las células de 65 microorganismos individuales concentrada sobre la al menos una superficie de detección

(11) El método según (1), en el que, la concentración de las células de microorganismos individuales sobre la al menos una superficie de detección se logra por un método seleccionado del grupo que consiste en electroforesis, dielectroforesis, centrifugación, captura por afinidad, reparto de fases, captura por campo magnético, filtración, gravedad, recirculación, difusión, o una combinación de estos métodos.

5 El método de la invención puede usarse para diagnosticar una infección microbiana en un paciente que comprende proporcionar una matriz curvas de tiempo frente a de aniquilación para un panel de agentes antimicrobianos contra un panel de microorganismos, y poner en contacto una muestra del paciente con un biosensor. Los microorganismos del paciente se monitorizan para el crecimiento en presencia del panel de agentes antimicrobianos y al menos uno de los microorganismos del paciente se identifica comparando su crecimiento con la matriz.

El método de la invención puede usarse para cribar un agente antimicrobiano de al menos un microorganismo que comprende poner en contacto el microorganismo con un biosensor como se ha explicado resumidamente en el presente documento, concentrar los microorganismos, añadir al menos un agente antimicrobiano candidato y

15 detectar alteraciones en el crecimiento de microorganismos distintos en comparación con la ausencia del agente candidato.

El método de la invención puede usarse para determinar la dependencia de la concentración de un agente inhibidor del crecimiento sobre una muestra de microorganismos. El método comprende inmovilizar microorganismos individuales en distintas localizaciones sobre un sustrato e incubar los microorganismos y descendientes lineales en presencia del agente. La cantidad de microorganismos se determina a intervalos, y la cinética de inhibición del crecimiento está relacionada con la dependencia de concentración del agente.

El método de la invención puede usarse para determinar la resistencia a un agente inhibidor del crecimiento sobre

25 una muestra de microorganismos. El método comprende inmovilizar una multiplicidad de microorganismos individuales en distintas localizaciones sobre un sustrato e incubar. La cantidad de microorganismos se analiza a intervalos en cada localización, indicando así el efecto del agente sobre cada microorganismo y sus descendientes, y se suman los efectos individuales.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en el uso de una nueva forma de análisis de detección microbiana, llamada en el presente documento "microbiología cuántica" (algunas veces denominada el presente documento "QM"). Los análisis microbiológicos cuantitativos estándar se basan en "unidades formadoras de colonias", o "UFC", un término 35 que se refiere a cualquier cosa que produzca una colonia microbiana visualmente detectable sobre una placa de agar nutriente. Es decir, el "cuanto" tradicional es una colonia visible de microorganismos sobre una placa de agar. QM, sin embargo, permite la cuantificación y/o cualificación de microorganismos basándose en una única célula (por ejemplo, el "cuanto" en este caso es una única célula, o una población clónica de una única célula). Esto tiene varias ventajas profundas, que incluyen el hecho de que el tiempo de duplicación individual de una única célula del tipo de interés en diagnóstico es generalmente 20-60 minutos, en vez de las 12 a 48 horas generalmente requeridas usando las actuales técnicas para visualizar cambios en UFC, haciendo que los métodos basados en las presentes técnicas sean mucho más rápidos, una ventaja significativa en infecciones microbianas potencialmente mortales. Así, las técnicas de la invención se denominan algunas veces en el presente documento técnicas cinéticas, permitiendo el análisis de velocidades usando mediciones repetidas de las mismas células con el tiempo. Adicionalmente, los

45 presentes métodos permiten alta redundancia de la célula de diagnóstico, y así de cada una de las células dentro de los clones formados a partir de las células individuales proporciona información cuantitativa y/o cualitativa. Por ejemplo, a cada célula hija y nieta puede asignársele una identidad y vinculación basada en los factores resumidamente explicados en el presente documento, y así pueden obtenerse datos estadísticamente significativos incluso para células muy raras, debido a la verificación de la presencia y/o identidad de su progenie dentro de una muestra, que incluye su relación clónica.

La presente invención también proporciona métodos para la cuantificación y/o cualificación de susceptibilidad y resistencia antimicrobiana (por ejemplo en el caso de infecciones bacterianas, resistencia a antibióticos y susceptibilidad), que conduce no solo a decisiones terapéuticas, sino también a la capacidad de tanto identificar

55 microorganismos basándose en una "huella dactilar" o "perfil" de susceptibilidad antimicrobiana, pero también para generar decisiones terapéuticas incluso en ausencia de tal identificación; en esta realización, la eficacia del agente es la medición. En este caso, los resultados pueden correlacionarse con la "concentración mínima inhibitoria", o "CMI", de un antibiótico para un microorganismo.

La presente invención también proporciona la rápida cuantificación y/o cualificación de microorganismos dentro de una muestra de paciente usando sistemas que permiten la concentración de los microorganismos sobre una superficie de detección. Por ejemplo, un problema significativo en la biodetección es el hecho de que muchas muestras clínicas puedan estar tanto bastante diluidas (por ejemplo, sangre), como el recuento microbiano por unidad muestra pueda ser bajo. Como se ha explicado resumidamente, la presente invención proporciona métodos 65 de concentración de los microorganismos para permitir tanto detección más rápida como más precisa dentro de un biosensor. Además, los métodos de detección preferidos no son dependientes de la concentración de analito por sí

misma, que es el caso con la mayoría de los métodos convencionales. En su lugar, los métodos de la invención cuentan el número absoluto de organismos individuales independientemente de su concentración en el espécimen o soporte de muestra. Este método de recuento distinto proporciona ventajas sustanciales con respecto a la detección basada en la concentración en reducir los niveles de ruido y aumentar la sensibilidad. Aunque en el presente 5 documento están incluidas una amplia variedad de técnicas de concentración y recogida útiles como se describe más adelante, el transporte electroforético de los microorganismos a la superficie de detección es de particular interés. El sistema puede adoptar varias configuraciones, como se ha explicado resumidamente en el presente documento. En general, se usan dos configuraciones principales diferentes, aunque configuraciones adicionales son tanto tratadas en el presente documento como contempladas. En un sistema, se usan un primer electrodo y un segundo electrodo para generar un campo eléctrico para efectuar el transporte electroforético y la(s) superficie(s) de detección están entre estos electrodos (véanse, por ejemplo, las Figuras 1A, 1E, 1F). Esto puede ser en la dirección horizontal (Figura 1C) o en la dirección vertical (véanse, por ejemplo, la Figura 1B y 1F). Además, pueden usarse diferentes canales que comprenden la(s) superficie(s) de detección con un único conjunto de electrodos (véase, por ejemplo, la Figura 1E). Alternativamente, se usan conjuntos de electrodos. En una configuración, cada superficie de 15 detección en una matriz puede tener un electrodo asociado (por ejemplo, como se ha explicado resumidamente en el presente documento, tanto en estrecha proximidad espacial como el propio electrodo se usa como la superficie de detección) con uno o más contra-electrodos (véanse las Figuras 1G, 1H, 1I y 1J); otra vez, en tanto la orientación horizontal (Figura 1J) como la vertical (Figura 1K). En algunos casos, se aplica un campo eléctrico entre los conjuntos, o alternativamente secuencialmente a diferentes electrodos para mover la muestra de una superficie de detección (asociada a un electrodo) a otra (véase, por ejemplo, Nanogen, las patentes de EE.UU. N.º 5.849.486 y 6.017.696, entre otros). En las figuras 1H y 1G, se muestra otro uso de conjuntos de electrodos, donde conjuntos de primero y segundo electrodos se usan para establecer campos eléctricos. Como preciarán los expertos en la materia, los módulos de concentración representados en la Figura 1 pueden tener componentes adicionales, tales como componentes microfluídicos como se explica resumidamente más adelante, además de ser parte de sistemas

25 más grandes.

Usando estas configuraciones, y otras explicadas resumidamente en el presente documento, la velocidad de unión de microorganismos a la superficie de detección aumenta significativamente. Es decir, el aumentar la concentración de los microorganismos en la proximidad de la superficie de detección, por ejemplo por electroforesis, produce cinética más rápida. De manera similar, en el caso en el que se usen ligandos de captura, la velocidad aumenta tanto aumentando la concentración del microorganismo en la proximidad del ligando de captura como reduciendo la distancia que un microorganismo dado debe desplazarse para encontrar un ligando de unión.

En algunas realizaciones, el uso secuencial o simultáneo de una pluralidad de electrodos de electroforesis permite

35 electroforesis multidimensional, es decir, la solución puede ser elegida como diana, "mezclada" o "agitada" en la proximidad de la superficie de detección, para aumentar adicionalmente la cinética de unión. Por ejemplo, las polaridades pueden ser invertidas para permitir que microorganismos que pueden no haberse unido a la superficie de detección se desplacen de nuevo "sobre" la superficie, produciendo aumento de la unión. Por tanto, pueden localizarse los electrodos y cambiarse la polaridad del campo según una secuencia programada de manera que se proporcione agitación en dos dimensiones de un plano, o en tres dimensiones.

Además, debido al hecho de que la presente invención se basa en la captura secuencial de los microorganismos seguido de crecimiento de los microorganismos (tanto en presencia como ausencia o ambos de los agentes antimicrobianos), seguido de detección, la toxicidad de los tampones electroforéticos es importante. Muchos 45 mediadores redox electroforéticos tradicionales pueden ser tóxicos para las células (por ejemplo, benzoquinona), tanto mediante la activación de oxígeno como mediante la alquilación de macromoléculas esenciales. Por consiguiente, se describen varios tampones electroforéticos en el presente documento que utilizan pares especiales de mediadores redox con varias ventajas. Primera de todas, estos mediadores redox permiten electroforesis de baja tensión para preservar la viabilidad de los microorganismos, además del uso de materiales de electrodo particulares que tienen utilidad limitada en la electroforesis de alta tensión (por ejemplo, electrodos de óxido de indio y estaño, "ITO"). Además, estos mediadores redox encuentran uso en "sistemas cerrados", por ejemplo sistemas no abiertos a la atmósfera. Éstos son importantes por varios motivos: formación de burbujas u otras especies reactivas no se generan durante la etapa de electroforesis, que puede producir varios problemas, y en segundo lugar, se prefieren sistemas cerrados para prevenir la exposición del técnico a las muestras posiblemente infecciosas, además de

55 reducir los problemas asociados a desechar muestras biológicas.

En general, la invención proporciona métodos para la identificación (incluyendo diagnóstico) de microorganismos e infecciones microbianas (incluyendo infecciones polimicrobianas) en pacientes. Para la identificación de diferentes microorganismos dentro de las muestras, por ejemplo, que proporcionan especificidad, se usa varios métodos aunque otros se explican resumidamente y se contemplan en el presente documento. En una realización, se usa una pluralidad de superficies de detección. En una realización, cada superficie de detección tiene un ligando de captura específico diferente. Es decir, una superficie de detección puede incluir ligandos de captura que comprenden anticuerpos para especies o géneros microbianos específicos, y otro ligando de captura diferente a una especie específica diferente. En algunas realizaciones, se usa una pluralidad de superficies de detección que están 65 fluídicamente separadas entre sí; por ejemplo, como se explica resumidamente más adelante, un cartucho de biosensor como se describe en el presente documento pueden tener una pluralidad de módulos de detección, por

ejemplo canales de detección, donde una muestra puede dividirse en los módulos de detección y puede entonces someterse a diferentes condiciones, por ejemplo diferentes agentes antimicrobianos, para la evaluación. Como se explica resumidamente en el presente documento, toda la pluralidad de diferentes superficies de detección sobre un único cartucho de biosensor puede no tener captura específica, o ligandos de captura específicos.

5 En algunas realizaciones, la(s) superficie(s) de detección se basan en la captura no específica de los microorganismos, pero el método de detección se basa en ligandos de unión específica; por ejemplo, pueden usarse anticuerpos para una especie específica de microorganismo con una marca fluorescente. En esta realización, la detección simultánea normalmente se basa en diferentes ligandos de unión que contienen diferentes marcas, mientras que la detección secuencial puede hacerse usando una o más etapas de lavado, seguido de un ligando de unión diferente con la misma marca. Otra realización de la invención evita el uso de tanto captura específica como marcado específico. En esta realización, la invención proporciona identificación específica de un microorganismo usando separación espacial de los microorganismos sobre la superficie de detección basada en cambios detectables

o conocidos. Por ejemplo, la capacidad para detectar la división de microorganismos individuales permite la

15 identificación basándose en cualquier número de parámetros, particularmente parámetros cinéticos, que incluyen, pero no se limitan a, velocidades de crecimiento, evaluación de la actividad metabólica, velocidad de destrucción de células con diferentes antibióticos, además de morfología de microorganismos, que pueden incluir tamaño, forma y relaciones con organismos hermanos (por ejemplo, crecimiento en agrupaciones o cadenas, crecimiento bidimensional sobre la superficie o crecimiento tridimensional lejos de la superficie). Además de la evaluación de las velocidades, también pueden hacerse análisis puntuales de datos individuales (por ejemplo, área elevada asociada a un microorganismo individual sobre la superficie (por ejemplo, crecimiento positivo), área estancada (sin crecimiento positivo) o pérdida de área (por ejemplo, crecimiento negativo, apoptosis y/o muerte). Muchos de estos parámetros pueden ser construidos en matrices o "huellas dactilares", que permiten o mejoran la identificación de un microorganismo basándose en un análisis multiparamétrico de sus velocidades de destrucción con, por ejemplo,

25 diferentes antibióticos y combinaciones de antibióticos.

En el presente documento también se describen varios dispositivos que encuentran uso en los presentes métodos. En general, los dispositivos de biosensor se diseñan para integrarse en una unidad de detección, y generalmente utilizan varios componentes, que pueden tanto estar "sobre el chip" (por ejemplo, parte de un cartucho de biosensor) como "fuera del chip" (donde algunos de los componentes son parte del dispositivo o dispositivos separados en los que se integra el cartucho de biosensor). Estos componentes incluyen, pero no se limitan a, una o una pluralidad (por ejemplo, una matriz) de superficie(s) de detección, módulos de concentración (que como se ha explicado resumidamente en el presente documento frecuentemente están configurados con la(s) superficie(s) de detección), módulos de detección (otra vez, frecuentemente configurados con la(s) superficie(s) de detección), puertos de

35 entrada y salida, canales, bombas, mezcladoras, válvulas, calentadores, depósitos de fluido (que incluyen depósitos de muestra, depósitos de reactivo y depósitos de tampón), controladores de concentración (por ejemplo, en el caso de electroforesis, controladores eléctricos) y componentes de recogida y análisis de datos (por ejemplo, ordenador).

Debe observarse que la discusión de a continuación se basa en el uso de microorganismos como analitos diana, pero la detección de otros analitos diana, tales como ácidos nucleicos, proteínas, mohos, células eucariotas tales como células cancerosas, etc., se explica resumidamente en U.S.S.N. 10/888.828, que se publicó como US 2005048599.

Por ejemplo, debe mencionarse que ciertos organismos que se detectarían en los métodos descritos en el presente

45 documento pueden no ser viables por sí mismos, sino que pueden requerir un huésped (por ejemplo, para la detección de un virus, prión, marcadores moleculares o bacterias intracelulares). En ese caso, la superficie de detección puede comprender células huésped que soportan el crecimiento del virus u otro organismo. En ese caso, la detección de la célula huésped diana infectada avanza en cierto modo a los métodos explicados resumidamente en el presente documento, y se hace generalmente según las características del virus y el huésped, y puede incluir la presencia de marcadores superficiales de células indicativos de infección (por ejemplo, usando anticuerpos marcados), por cambios en la fisiología del huésped que resulta de infección, o mediante lisis o muerte del huésped. Debe mencionarse que las células asociadas también pueden comprender células colaboradoras, que ayudan en el crecimiento de los organismos que se prueban mediante su proximidad a las células probadas.

55 Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos para la detección del crecimiento de células de microorganismos individuales en una muestra y para la cuantificación, cualificación y/o identificación de microorganismos en muestras. En el presente documento también se describen dispositivos para la detección, cuantificación, cualificación y/o identificación de microorganismos en muestras.

Detección de microorganismos

Por "microorganismo" se indica en el presente documento un miembro de una de las siguientes clases: bacterias, hongos, algas y protozoos. En el presente documento también se describen virus, priones u otros patógenos. En una realización se evalúan bacterias, y patógenos humanos y animales particulares. Microorganismos adecuados 65 incluyen cualquiera de aquellos bien establecidos en las ciencias médicas y aquellos patógenos novedosos y variantes que surgen de vez en cuando. Ejemplos de patógenos bacterianos actualmente conocidos, por ejemplo,

incluyen, pero no se limitan a géneros tales como Bacillus, Vibrio, Escherichia, Shigella, Salmonella, Mycobacterium, Clostridium, Corynebacterium, Streptococcus, Staphylococcus, Haemophilus, Neisseria, Yersinia, Pseudomonas, Chlamydia, Bordetella, Treponema, Stenotrophomonas, Acinetobacter, Enterobacter, Klebsiella, Proteus, Serratia, Citrobacter, Enterococcus, Legionella, Mycoplasma, Chlamydophila, Moraxella, Morganella, y otros patógenos 5 humanos encontrados en la práctica médica. De manera similar, los microorganismos pueden comprender hongos seleccionados de un conjunto de géneros tales como Candida, Aspergillus, y otros patógenos humanos encontrados en la práctica médica. Todavía otros microorganismos como se describen en el presente documento pueden comprender patógenos de virus (algunas veces patógenos humanos) encontrados en la práctica médica, que incluyen, pero no se limitan a, ortomixovirus (por ejemplo, virus de la gripe), paramixovirus (por ejemplo, virus respiratorio sincitial, virus de las paperas, virus del sarampión), adenovirus, rinovirus, coronavirus, reovirus, togavirus (por ejemplo, virus de la rubeola), parvovirus, poxvirus (por ejemplo, virus de la viruela, virus de la variolovacuna), enterovirus (por ejemplo, virus de la polio, virus de Coxsackie), virus de la hepatitis (incluyendo A, B y C), virus del herpes (por ejemplo, virus del herpes simple, virus varicela-zóster, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr), rotavirus, virus de Norwalk, hantavirus, arenavirus, rabdovirus (por ejemplo, virus de la rabia), retrovirus (incluyendo VIH,

15 HTLVI y II), papovavirus (por ejemplo, virus del papiloma), virus del polioma y picornavirus, y similares. Con respecto a los virus, en general, los métodos y composiciones como se describen en el presente documento pueden usarse para identificar células huésped que alojan virus.

Muestras

La invención proporciona un método de detección del crecimiento de células de microorganismos individuales en una muestra. Como será apreciado por aquellos expertos en la materia, la solución de muestra puede comprender cualquier número de fuentes, que incluyen, pero no se limitan a, fluidos corporales (que incluyen, pero no se limitan a, sangre, orina, suero, linfa, saliva, secreciones anales y vaginales, sudoración, líquido peritoneal, líquido pleural,

25 derrames, ascitis y secreciones purulentas, líquidos de lavado, líquidos drenados, especímenes de citología con cepillo, tejido de biopsia, dispositivos médicos explantados, catéteres infectados, pus, biopelículas y semen) de prácticamente cualquier organismo, encontrando las muestras de mamífero, particularmente muestras humanas, y muestras medioambientales (que incluyen, pero no se limitan a, muestras de aire, agrícolas, de agua y tierra) uso en la invención. Además, pueden tomarse muestras del procesamiento de alimentos, que pueden incluir muestras tanto de entrada (por ejemplo, granos, leche o cadáveres de animales), como en etapas intermedias de procesamiento, además de alimento terminado listo para el consumidor. El valor de la presente invención para aplicaciones veterinarias debe apreciarse también, y son dignos de mencionar su uso para el análisis de leche en el diagnóstico y el tratamiento de mastitis, y el análisis de muestras respiratorias para el diagnóstico de enfermedad respiratoria bovina.

35 Las muestras pueden oscilar de menos de un mililitro hasta un litro para ciertos líquidos de lavado respiratorio, y pueden oscilar además en concentración bacteriana de menos de una bacteria a más de 109 bacterias por mililitro. Además, la muestra puede estar presente en sangre, orina, esputo, líquido de lavado u otro medio. La concentración de muestra tanto concentra la muestra de manera que las bacterias que están presentes en pequeños números pueden todas ser eficazmente introducidas en el sistema, así como el medio líquido basal pueda normalizarse, o en algunos casos eliminarse o reducirse, para tener propiedades coherentes tras la introducción al sistema. Debe observarse, sin embargo, que ciertas muestras, sin embargo, pueden usarse sin concentración u otra modificación dentro de la presente invención.

45 Detección del crecimiento

"Crecimiento", como se usa en el presente documento, incluye crecimiento positivo, neutro y negativo. "Crecimiento positivo" en el caso de microorganismos que son células (por ejemplo, bacterias, protozoos y hongos) se refiere al aumento en el tamaño y/o sucesión de división celular, e incluye particularmente la producción de células hijas. Así, "detectar el crecimiento positivo" de un microorganismo distinto se refiere a detectar tanto un aumento en el tamaño del microorganismo y/o detectar la presencia de división celular, que puede o puede no aumentar el área total ocupada por el microorganismo. Debe observarse que en algunos casos, como se explica resumidamente en el presente documento, el crecimiento positivo puede detectarse como un aumento en el área sobre la superficie de detección que ocupan la célula parental o células hija. Otros microorganismos pueden crecer "fuera" de la superficie

55 y así no pueden aumentar su "huella dactilar" sobre la superficie de detección mientras que aumentan el volumen.

En el caso de virus, "crecimiento positivo" se refiere a la reproducción de virus, generalmente dentro de una célula huésped, y puede incluir lisis de células huésped, en el caso de virus líticos. Así, el "crecimiento positivo" de un virus puede algunas veces detectarse como una pérdida de la célula huésped distinta.

"Detectar el crecimiento" también puede referirse a detectar una falta de crecimiento, por ejemplo tanto crecimiento neutro como negativo. Es decir, algunos agentes antimicrobianos actúan retardando el crecimiento positivo pero no destruyen las células; esto se denomina generalmente un "crecimiento neutro". Así, detectar poco o ningún cambio en el tamaño, forma, volumen y/o área de una célula (sobre una superficie) se incluye dentro de la evaluación del

65 "crecimiento", por ejemplo, en ausencia de un agente, un microorganismo presentará crecimiento positivo, pero en presencia del agente, una falta de crecimiento es significativa, aunque el microorganismo no muera. Debe

observarse que en algunos casos habrá pequeños cambios en el tamaño, forma, volumen y/o área de una célula sobre la superficie de detección, pero esto puede distinguirse del crecimiento positivo.

"Detectar el crecimiento" también puede referirse a detectar crecimiento negativo, por ejemplo necrosis. Además, ha

5 habido algunas discusiones limitadas de muerte celular programada bacteriana (por ejemplo, apoptosis y/o muerte celular autofágica), que también considerarían el crecimiento negativo. En general, el detectar el crecimiento negativo se basa en cambios, normalmente pero no siempre disminuciones, en el tamaño, forma, área o volumen del microorganismo que pueden detectarse por los métodos de la invención.

10 Así, "detectar el crecimiento" pueden referirse a detectar crecimiento positivo, una falta de crecimiento, por ejemplo detectar células que no están dividiéndose activamente, pero que no están creciendo positivamente, y crecimiento negativo, por ejemplo muerte.

En general, la invención es única porque la detección del crecimiento se hace al nivel del microorganismo individual

15 o distinto, en vez de al nivel de colonia. Así, "detectar el crecimiento de un microorganismo distinto" se hace como una evaluación del crecimiento de una célula individual en un periodo de tiempo de forma que pueda formarse una pequeña población de células hija, pero antes de la capacidad de ver visualmente una colonia a simple vista. Así, el componente de "microbiología cuántica" de la invención permite la detección en el plazo de solo algunos tiempos de duplicación de un microorganismo, en vez de decenas o cientos de tiempos de duplicación. Además, como se ha

20 explicado resumidamente en el presente documento, los métodos de la invención no requieren un crecimiento inicial de microorganismos (tanto líquidos como sólidos) antes del ensayo; la presente invención es lo suficiente sensible como para empezar con muestras biológicas sin crecimiento antes del ensayo. En general, los métodos de la invención utilizan de 1 a aproximadamente 10 tiempos de duplicación totales, siendo particularmente útiles aproximadamente 1 a aproximadamente 4, y siendo 1 a 2 ideales en situaciones donde el "tiempo hasta la

25 respuesta" esté siendo minimizado.

A continuación se explica resumidamente varios métodos de detección de crecimiento.

Agentes antimicrobianos

30 Como se describe más completamente a continuación, los métodos incluyen opcionalmente la determinación del nivel de susceptibilidad, resistencia o tolerancia de microorganismos a agentes antimicrobianos. Los "agentes antimicrobianos" son un tipo de agentes bioactivos, explicados resumidamente más adelante, y son agentes que modulan el crecimiento de los microorganismos, como se ha definido anteriormente.

35 Como se conoce en la técnica, y dependiendo del microorganismo, se prueba varios agentes antimicrobianos, frecuentemente en un ámbito de matriz de diferentes agentes y diferentes concentraciones de agentes. Agentes antimicrobianos adecuados incluyen, pero no se limitan a, familias de antibióticos tales como cefalosporinas, penicilinas, carbapenémicos, monobactámicos, otros antibióticos beta-lactámicos novedosos, inhibidores de beta

40 lactamasa, quinolonas, fluoroquinolonas, macrólidos, cetólidos, glucopéptidos, aminoglucósidos, fluoroquinolonas, ansamicinas, azalidas, lincosamidas, lipopéptidos, glicolipopéptidos, estreptograminas, polimixinas, tetraciclinas, fenicoles, oxazolidinonas, nitroamidazoles, inhibidores de la vía de folato y otras familias, además de bacteriófagos, que incluyen agentes novedosos, usados como antibióticos en la práctica clínica o en investigación. Dentro de la definición de agentes antimicrobianos también están incluidos los agentes antivirales e incluyen tanto agentes

45 antivirales autorizados conocidos como experimentales. Además, pueden probarse las combinaciones de estos agentes, particularmente en vista de la evolución de cepas resistentes. Por tanto, como se describe en el presente documento, puede cambiarse la concentración del agente antimicroorganismo con el tiempo para reflejar la farmacocinética del agente antimicroorganismo en tejido animal. Además, pueden usarse los ensayos en el presente documento para probar agentes antimicrobianos candidatos y su eficacia, que incluye medición de CMI, CMB,

50 cinética de letalidad, supresión de la división celular, inducción y selección de resistencia, y parámetros farmacodinámicos.

En general, los métodos como se describen en el presente documento, utilizan varias etapas como se explica resumidamente más adelante, que generalmente comprenden una etapa de preparación de muestras opcional,

55 dependiendo de la naturaleza y de la concentración y volumen de la muestra; una etapa de concentración, que opcionalmente incluye una etapa de preconcentración; asociar los microorganismos sobre la(s) superficie(s) de detección en sitios predominantemente independientes, que puede ser parte de la etapa de concentración; someter los microorganismos a condiciones de crecimiento, en presencia o ausencia (o ambos) de agentes antimicrobianos; y detectar la presencia o ausencia (o ambos, en el caso de poblaciones mixtas) de los microorganismos. Métodos

60 adicionales participan en la evaluación de la susceptibilidad a agentes antimicrobianos.

En el presente documento también se describe uno o más dispositivos para realizar estos métodos.

Preparación de muestras

En una realización, la muestra se prepara antes de la introducción a la etapa de concentración (por ejemplo, etapa electroforética) o superficie(s) de detección. El método de preparación depende del tipo de material que se ensaya, y 5 puede incluir la maceración de tejido sólido, centrifugación, perlas o columnas de intercambio iónico, cromatografía, filtración, electroforesis de apilamiento, o formas de separación bioquímica. En una realización, se hace intercambio de tampón, y pueden añadirse agentes de preparación de muestras. Por ejemplo, puede hacerse una etapa de concentración (como se explica resumidamente más adelante) y preparación de muestras simultánea, por ejemplo, centrifugando la muestra y resuspendiendo los microorganismos en tampones adecuados. Por ejemplo, cuando los microorganismos son el analito diana, pueden usarse saponinas, generalmente en un intervalo de aproximadamente el 0,01 % -1 % como se conoce en la técnica, para romper las células animales y residuos celulares. De manera similar, pueden usarse agentes reductores tales como DTT para romper el moco en muestras, y en algunos casos esto también puede hacerse enzimáticamente. Adicionalmente, pueden incluirse inhibidores de la proteasa (por ejemplo, mezcla de inhibidores de la proteasa de Roche, Complete de Boeringer, leupeptina, PMSF) -estos se usan

15 para prevenir la acción de proteasas sobre superficies celulares, que tienden a reducir su carga. En general, la preparación puede incluir cualquier técnica como ya es muy conocida para aquellos expertos en la materia y técnicas y mejoras novedosas como pueden ser ideadas por profesionales e investigadores de vez en cuando.

Debe observarse que muchas técnicas del estado de la técnica se basan en un crecimiento en líquido inicial de los microorganismos dentro de una muestra antes del análisis (siembra en placa, etc.). En una realización, no se hace fase de crecimiento inicial (por ejemplo, aplicación previa al biosensor).

Concentración de microorganismos

25 Como se ha explicado resumidamente en el presente documento, generalmente, pero no siempre, se requiere concentrar los microorganismos dentro de la muestra tanto antes de, durante, como después de la aplicación al biosensor y la(s) superficie(s) de detección. Métodos de concentración adecuados incluyen, pero no se limitan a, electroforesis, dielectroforesis, centrifugación, captura por afinidad, reparto de fases, captura por campo magnético, filtración, gravedad, recirculación o difusión, o combinaciones de estos. También es conveniente como parte de o antes de la etapa de concentración realizar un filtrado previo con el fin de eliminar tanto contaminantes más grandes como más pequeños (o ambos), mientras que se permite el paso de las bacterias que van a monitorizarse. Tales filtros pueden comprender nitrocelulosa, nailon, celulosa, u otras membranas, filtros de perlas (que incluyen filtros de tamaño), u otros filtros como puedan ser convenientes.

35 Preconcentración

En una realización, los microorganismos se "preconcentran". "Preconcentrado" en este contexto significa que los microorganismos se concentran parcialmente antes del crecimiento sobre la(s) superficie(s) de detección. La preconcentración realiza dos funciones. En primer lugar, aumenta la relación del número de microorganismos con respecto al volumen de la muestra, de manera que puede usarse la mayor fracción posible de la muestra en el sistema. Un segundo motivo es que los microorganismos pueden estar en un líquido cuyas propiedades eléctricas u otras son incompatibles o no óptimas para el sistema de detección. Por ejemplo, si posteriormente van a usarse métodos electroforéticos, la eficacia de tales métodos mejora generalmente usando tampones de electrolito bajo. En tal caso, el líquido de muestra de microorganismo se sustituirá por un líquido que es más compatible con el sistema.

45 Hay dos métodos de preconcentración principales; uno hecho antes de la introducción de los microorganismos al cartucho de biosensor, y uno hecho en el cartucho.

Pre-cartucho: Captura por afinidad

En algunos casos, se desea preconcentrar los microorganismos antes de la introducción al cartucho. Esto puede hacerse en algunos casos usando un colector eluible. En un sistema tal, la muestra se filtra a través de una matriz (generalmente denominada una "columna") que está densamente rellena con un material que se une reversiblemente a los microorganismos. Una vez la muestra ha pasado a través de la columna, los microorganismos

55 se eluyen, generalmente mediante cambios químicos, enzimáticos o físicos tales como concentración de sales, pH, etc. Un colector tal puede usarse para concentrar los microorganismos en un volumen de tampón más pequeño, para poner los microorganismos en un medio uniforme que es muy apto para etapas adicionales en el método, además de para eliminar material contaminante que tiene diferencias de tamaño o de carga de los microorganismos que se desean monitorizar. (Así, debe observarse que en algunos casos puede ser solo un intercambio de tampón y ninguna concentración real, aunque esto no es generalmente el caso).

Una realización preferida de esta preparación de muestras es la de un cartucho con volumen de 50-1000 microlitros, y preferentemente inferior a 250 microlitros, en el que está cargada una resina de intercambio iónico, generalmente perlas. En esta realización, la muestra puede comprimirse a través del cartucho tanto sin modificación, como con la 65 adición de un tampón para regular el pH, y/o también en presencia de un detergente preferentemente no iónico, con el fin de reducir la unión no específica de los microorganismos a los componentes del sistema o entre sí. Es

preferible que el pH sea relativamente neutro (en el intervalo de pH 6 a 8), y en cualquier caso suficiente para que los microorganismos sigan siendo viables y mantengan una carga negativa, y que la resina mantenga una carga positiva. Esta carga negativa es típica para la mayoría de los microorganismos, pero debe observarse que para cualquier organismo que normalmente está positivamente cargado, la resina aniónica puede sustituirse por una

5 resina catiónica, y el control de pH será el opuesto al que se describe anteriormente y más adelante de organismos negativamente cargados.

Los microorganismos pueden en general eluirse de la resina en un volumen no significativamente diferente de aquél del cartucho, y teniendo cuidado de no mezclar la solución de elución, incluso más pequeño de aquél del cartucho. En general, después de la elución del cartucho, la solución se neutralizará, preferentemente con un tampón de ión bipolar de manera que no se aumente demasiado la conductancia del tampón. Otras propiedades del medio resultante pueden ajustarse según se necesite, que incluyen fuerza iónica, conductancia, la presencia de tensioactivos, la presencia de nutrientes o factores de crecimiento para los microorganismos, y el pH. En general, como se tratará a continuación, es preferible que los microorganismos estén en solución de conductancia

15 relativamente baja. Dado que la elución se realizará a pH tanto por encima de 3 como por debajo de 11, es probable que la solución neutralizada resultante tenga una fuerza iónica inferior a sal 10 mM, que es preferible para las etapas posteriores. Esta captura por afinidad puede usarse alternativamente como un método de preparación de muestras, pero también produce una pre-concentración de microorganismos, y puede ser demandada para ese fin como se describe más adelante.

Preconcentración en el cartucho

Como será apreciado por aquellos expertos en la materia, hay una amplia variedad de métodos para preconcentrar los microorganismos, varios de los cuales se representan en las figuras. Cualquiera de las técnicas explicadas

25 resumidamente más adelante puede usarse para preconcentrar los microorganismos sobre una superficie de preconcentración tal como se representa en la Figura 2. Por ejemplo, como se representa en las Figuras 2, y se describe en más detalle más adelante, la electroforesis se usa para recoger los microorganismos sobre una superficie no específica, y entonces las dianas se alejan de la superficie de preconcentración sobre la(s) superficie(s) de detección. Alternativamente, otra vez como se describe más adelante, pueden usarse membranas o filtros, con presión o centrifugación positiva, por ejemplo, para preconcentrar los analitos antes de la aplicación a la(s) superficie(s) de detección.

Sistemas electroforéticos y geometrías

35 Después de la etapa de preconcentración opcional, un método útil de la presente invención es concentrar electroforéticamente los microorganismos sobre una superficie de detección sobre la que monitorizar el crecimiento de los microorganismos y evaluar su susceptibilidad a agentes antiorganismo (AOA). El método usa múltiples electrodos dispuestos a diferentes potenciales, entre los que los microorganismos se introducen en un electrolito. Cuando los constituyentes en el electrolito experimentan reacciones de oxidación y reducción (redox) en los electrodos, hay un campo eléctrico que se genera dentro del electrolito tal que los microorganismos, que están generalmente cargados (y cuya carga puede ser algo manipulada variando la composición y pH del electrolito, y/o alternativamente usando marcas electroforéticas que añaden carga), migrarán a uno o el otro electrodo bajo la influencia del campo eléctrico.

45 Por consiguiente, en un aspecto, los microorganismos dentro de la muestra se concentran sobre la(s) superficie(s) de detección. Como se ha explicado resumidamente en el presente documento, hay varias configuraciones generales que se usan. Generalmente, en un aspecto, hay una etapa electroforética "a granel", que usa un primer electrodo y un segundo electrodo para generar un campo eléctrico, y la(s) superficie(s) de detección están entre estos electrodos, tanto en una dirección horizontal como vertical. Varias de estas configuraciones se muestran en la Figura 1. En otra realización, se usan conjuntos de electrodos para tanto generar un único campo eléctrico (Figura 1D), múltiples campos eléctricos (Figura 1G, 1I, 1J y 1K), como campos eléctricos secuenciales (Figuras 1I, 1J y 1K). Adicionalmente, una forma alternativa de clasificar estos sistemas es aquella en que la(s) superficie(s) de detección tienen electrodo(s) subyacente(s) (algunas veces denominados en el presente documento "electrodos estrechamente asociados", por ejemplo, Figuras 1F, 1I, 1J, 1K y 1L) y aquellos que no (por ejemplo, Figuras 1A, 1B,

55 1C, ID, 1E, 1G). Como se describe en el presente documento, la(s) superficie(s) de detección pueden colocarse dirigidas sobre electrodos para considerarse "electrodos subyacentes".

Para todas las realizaciones tratadas en el presente documento, el número, tamaños, formas y posiciones de los electrodos de electroforesis pueden modificarse para generar campos eléctricos tanto sustancialmente uniformes, variables como asimétricos. Como tal, el tamaño y la forma de los electrodos representados en las figuras es representativo solo. En la mayoría de los casos, las figuras no representan las interconexiones eléctricas usadas para conectar los electrodos con la fuente de alimentación apropiada y controlador, descritos más adelante.

Por consiguiente, en una configuración descrita en el presente documento, se usa un único conjunto de electrodos,

65 con la(s) superficie(s) de detección entre estos electrodos dentro del campo eléctrico. En una configuración descrita en el presente documento, los electrodos y las superficies de detección están sobre un único sustrato; por ejemplo,

como se muestra en la Figura 1A, el primer electrodo 500 y el segundo electrodo 510 están sobre un primer sustrato 530 con superficies de detección 520. Obsérvese que las interconexiones electrónicas 550 no se representan en estas figuras, pero pueden estar tanto sobre la superficie del sustrato (véase, por ejemplo, la Figura 3D) como a través del sustrato (véase, por ejemplo, Figura 3E) para la interconexión con fuentes de alimentación, generalmente 5 fuera del chip. Estos sistemas con los componentes funcionales sobre un único sustrato (incluyendo las Figuras 1A, 1D, 1E, 1H, 1I y 1J) pueden ser sistemas abiertos, por ejemplo, podrían estar en el fondo de un pocillo de microtitulación u otro pocillo sobre una superficie plana, o pueden ser parte de un sistema cerrado. Sistemas cerrados adecuados incluyen el uso de un segundo sustrato con un espaciador para definir una cavidad, o estando formulado el cartucho entero de un único material (o hecho en capas que son posteriormente ensambladas). Así, la 10 Figura 1A representa un sistema de dos electrodos con una pluralidad de superficies de detección dentro del campo eléctrico. La Figura 1E representa un sistema de dos electrodos con canales que comprenden una o más superficies de detección (la figura representa múltiples superficies de detección (que en algunas configuraciones tendrán diferentes ligandos de unión de captura) dentro de cada canal, pero también se contempla una única superficie de detección, particularmente en el caso de captura no específica). La Figura 1D representa múltiples canales en el 15 sustrato (otra vez, la figura representa múltiples superficies de detección (que en algunas configuraciones tendrán diferentes ligandos de unión de captura) dentro de cada canal, pero también se contempla una única superficie de detección, particularmente en el caso de captura no específica), cada una con un conjunto de electrodos de electroforesis. La Figura 1F representa una celda de biodetección en la que un único electrodo de sonda 510 está debajo de múltiples superficies de detección 520 que se colocan en una forma de matriz. Las paredes de la celda no 20 están colocadas en el diagrama, pero pueden ser, por ejemplo, un material de junta para formar una junta impermeable al agua. Un electrodo de referencia 500 está físicamente colocado, preferentemente por encima del electrodo de sonda 510, y puede opcionalmente ser de tamaño aproximadamente similar al electrodo de sonda, de manera que el campo eléctrico entre los dos electrodos sea sustancialmente uniforme. En general, como es cierto para muchas de las configuraciones descritas en el presente documento, los electrodos son opcionalmente

25 aproximadamente paralelos entre sí, de manera que los campos electroforéticos que se generen sean aproximadamente perpendiculares a la superficie del electrodo de sonda, y den lugar a deposición uniforme de las dianas sobre las superficies de detección.

En algunas realizaciones, se usan conjuntos de electrodos para generar los campos eléctricos. Por ejemplo, se

30 muestran disposiciones alternativas en las Figuras 1G, 1I, 1J y 1K. En la Figura 1G, los electrodos no están debajo de las superficies de detección. En este caso, las superficies de detección están dispuestas en un formato de matriz. Dos electrodos 510 están laterales a la matriz, y se encentran debajo de una matriz de electrodos de referencia parciales 500, marcados en esta figura P, Q y R. El número y tipo de electrodos de referencia parciales pueden variarse, y el objetivo de la colocación de los dos electrodos 510 y los electrodos de referencia parciales 500 es

35 gestionar la intensidad y topología de los campos eléctricos ajustando las tensiones relativas de los electrodos. Por ejemplo, el colocar el segundo electrodo y los electrodos de referencia parciales P, Q y R a una polarización negativa, y el primer electrodo a una polarización relativamente positiva, producirá un campo eléctrico en gran medida horizontal a través de la superficie de la matriz. Pueden usarse múltiples electrodos de referencia parciales para prevenir el "corto" del campo eléctrico que podría producirse con un gran electrodo continuo. La Figura 1H es

40 similar, y muestra las intensidades de campo eléctrico de los conjuntos de electrodos, para proporcionar un componente vertical del campo eléctrico en la localización de la matriz que es relativamente constante con una componente hacia abajo. Ajustando las intensidades relativas de la polarización de la tensión en los diferentes electrodos, puede disponerse de varias topologías de campo eléctrico diferentes para los fines que se describirán a continuación.

45 En algunas configuraciones descritas en el presente documento, los componentes pueden estar sobre dos sustratos; por ejemplo, en las Figuras 1B, 1C, 1F, 1G y 1K, uno de los electrodos está "encima" del sustrato (debe observarse que "encima" y "debajo" como se usan en el presente documento no pretenden ser limitantes). Otra vez, no se muestran las paredes laterales de la cámara.

50 En una configuración adicional descrita en el presente documento, los conjuntos de electrodos pueden usarse para crear campos eléctricos secuenciales para permitir el movimiento de microorganismos analito entre electrodos. Esto implica generalmente aplicar un potencial entre dos electrodos, y entonces invertir la polaridad del segundo electrodo para que funcione como el "primer" electrodo en la segunda etapa electroforética. En esta configuración,

55 puede haber un electrodo de referencia (por ejemplo, Figura 1I o varias (por ejemplo, Figura 1J), y una o más superficies de detección asociadas al electrodo de trabajo (véanse, por ejemplo, las Figuras 1I, 1J y 1K, todas las cuales representan múltiples superficies de detección, aunque también se contempla una única superficie de detección). Además, la Figura 2 representa el uso de varios electrodos de preconcentración 810 y superficies de detección asociadas 820 y electrodos de trabajo 816 y 819. En el dispositivo de la Figura 2J, puede aplicarse un

60 potencial entre el electrodo 510 y el electrodo 500, y entonces entre 500 y 501. Alternativamente, dentro de este mismo dispositivo, el potencial puede aplicarse entre el electrodo 510 y simultáneamente los electrodos 500 y 501. En otro ejemplo, en el dispositivo de la Figura 2C, que opcionalmente incluye los electrodos 817B, 817C, etc., puede aplicarse un potencial como entre el electrodo 817A y el electrodo de preconcentración 819A, seguido de potenciales secuenciales entre 819A y 819B, 819B y 819C, etc. También se hace referencia a la Figura 10 y al texto

65 adjunto del documento U.S.S.N,10/084.632, que se publicó como US 2003-153023.

En una etapa opcional, puede eliminarse material no específicamente unido débilmente adherido de la matriz aplicando una pequeña polarización positiva neta a los electrodos P, Q, y R, que extrae el material lejos de la matriz.

En una realización adicional, la electroforesis utiliza una marca electroforética como se ha explicado resumidamente

5 en el presente documento; véase también el documento U.S.S.N. 10/888.828, que se publicó como US 2005048599. Generalmente, la marca se añade a una concentración que permite la rápida asociación de la marca con el microorganismo. Esta etapa puede hacerse en cualquier momento en el ensayo, siendo una realización poner en contacto la marca con la muestra antes de la carga. En algunos casos, el usar marcas electrostáticas valorables permite el ajuste de pH y otras condiciones durante la electroforesis. Se describen varias marcas electroforéticas en

10 el documento U.S.S.N. 10/888.828, que se publicó como US 2005-048599, específicamente en las Figuras 6 y 7. En general, las marcas electroforéticas tienen altas cargas electrostáticas, y pueden usarse una o más marcas por microorganismo. Las marcas electroforéticas se utilizan generalmente en configuración "sándwich", y como se describe en el documento U.S.S.N. 10/888.828, que se publicó como US 2005-048599, pueden comprender múltiples componentes funcionales, que incluyen, pero no se limitan a, componentes indicadores, conectores,

15 componentes electrostáticos, etc.

Si la superficie de electrodo a la que los microorganismos son atraídos tiene un agente de captura, al que se unen los microorganismos, los electrodos pueden desconectarse después de que los microorganismos se hayan concentrado sobre la superficie, y los microorganismos seguirán en su sitio. El agente de captura (algunas veces 20 denominado en el presente documento el "ligando de captura", la "sonda de captura" o el "agente de captura"), como se describirá después en más detalle, puede ser tanto generalmente "pegajoso" a un amplio intervalo de microorganismos (por, por ejemplo, interacciones electrostáticas o hidrófobas generales), como alternativamente, puede ser específico para un estrecho intervalo de especificidades de microorganismos, tales como por el uso de anticuerpos que son específicos de cepa. El agente de captura también se denomina en esta memoria descriptiva la

25 "sonda". Debe observarse, sin embargo, que ocasionalmente, los electrodos pueden asociarse a una superficie no de unión a la que no se unen los microorganismos, para la concentración de los microorganismos temporalmente, y tales electrodos a los que los microorganismos son atraídos también pueden denominarse electrodos de sonda.

La Fig. 4A es un diagrama en perspectiva de una celda de biodetección en la que un único electrodo de sonda 200

30 se encuentra debajo de múltiples localizaciones de sonda 170 que se colocan en una matriz 180. Las paredes de la celda no están puestas en el diagrama, y generalmente comprenderán material de junta para formar una junta impermeable al agua. Un electrodo de referencia 190 está físicamente colocado preferentemente por encima del electrodo de sonda 200 y de tamaño aproximadamente similar al electrodo de sonda 200, de manera que el campo eléctrico entre los dos electrodos sea sustancialmente uniforme. Sin embargo, el electrodo de referencia 200 como

35 se describe en el presente documento puede tener diversas formas y posiciones que permiten uniformidad similar o incluso menor. En general, los electrodos son aproximadamente paralelos el uno al otro, de manera que los campos electroforéticos que se generan son aproximadamente perpendiculares a la superficie del electrodo de sonda 200, y dan lugar a deposición uniforme de los microorganismos sobre las localizaciones de sonda 170.

40 Esta disposición del electrodo de sonda 200 y las localizaciones de sonda 170 permiten métodos convencionales de colocación de sondas sobre la superficie de electrodo usando técnicas conocidas, que incluyen, pero no se limitan a, deposición, impresión, etc. Además, la asociación del microorganismo con la sonda puede realizarse en paralelo con todas las localizaciones de sonda diferentes, en vez de en serie como se realiza con el estado de la técnica.

45 Una disposición alternativa se muestra en la Fig. 4B, un diagrama en perspectiva de una celda de biodetección en la que los electrodos no se encuentran debajo de las localizaciones de sonda 170. En este caso, las sondas se colocan en localizaciones de sonda 170 dispuestas en una matriz 180. Un primer electrodo 210 y un segundo electrodo 220 son laterales a la matriz 180, y se encuentran debajo de una matriz de electrodos de referencia parciales 195, marcada en esta figura P, Q y R. El número y tipo de electrodos de referencia parciales 195 puede variarse, y el

50 objetivo de la colocación del primer electrodo 210, el segundo electrodo 220 y los electrodos de referencia parciales 195 es gestionar la intensidad y topología de los campos eléctricos ajustando las tensiones relativas de los electrodos. Por ejemplo, el colocar el segundo electrodo 220 y los electrodos de referencia parciales 195 P, Q y R a una polarización negativa, y el primer electrodo 210 a una polarización relativamente positiva, producirá un campo eléctrico en gran medida horizontal a través de la superficie de la matriz 180. La necesidad de los múltiples

55 electrodos de referencia parciales 195 es debida al "corto" del campo eléctrico que se produciría con un gran electrodo continuo, dificultando mantener un campo eléctrico a través de un electrodo más grande.

La Fig. 5 es un diagrama de intensidades de campo eléctrico de un primer electrodo 210, un segundo electrodo 220 y un conjunto de electrodos de referencia parciales 195. El segundo electrodo 220 y los electrodos parciales 195

60 tienen una polarización negativa, y el primer electrodo 210 tiene una polarización relativamente positiva. Como puede apreciarse, el componente vertical del campo eléctrico en la localización de la matriz 180 es relativamente constante con una componente hacia abajo. Ajustando las intensidades relativas de la polarización de la tensión en los diferentes electrodos, puede disponerse de varias topologías de campo eléctrico diferentes para los fines que se describirán a continuación.

Tampones y mediadores electroforéticos

En una realización, los métodos de la invención utilizan electroforesis de baja tensión y específicamente mediadores redox seleccionados. El uso de mediadores redox tiene varias ventajas, que incluyen, pero no se limitan a, la

5 generación de campos eléctricos significativos y corrientes inferiores a 1 voltio de potencial aplicado, el uso de materiales de electrodo que tienen utilidad limitada en muchas aplicaciones de alta tensión, la capacidad de usar un "sistema cerrado" debido a la recirculación general del sistema redox que evita el agotamiento, la capacidad para usar una variedad más amplia de químicas superficiales para las superficies de detección, y requisitos de potencia más baja. En un aspecto, los mediadores redox son moléculas neutras netas para limitar el efecto electroforético sobre los analitos cargados (por ejemplo, microorganismos).

El transporte electroforético de baja tensión permite el uso de materiales que están limitados por sus propias propiedades electroquímicos u otras propiedades físicas. Por ejemplo, el óxido de indio y estaño (ITO) es un material comercial muy utilizado, ya que es uno de los pocos materiales conocidos por ser altamente conductor y altamente

15 transparente. El uso de óxido de indio y estaño en aplicaciones electroforéticas ha estado limitado por el hecho de que el material experimenta una transición electroquímica en un material no transparente negro a potenciales superiores a 1 voltio con respecto a un electrodo de hidrógeno estándar. Como resultado, la aplicación de ITO en sistemas que se basan en la hidrólisis del agua no es generalmente factible. Sin embargo, pueden generarse corriente y campos eléctricos significativos con electrodos de ITO empleando mediadores redox y potenciales aplicados inferiores al potencial de ruptura crítico.

Además, los subproductos del proceso redox estándar pueden conducir a condiciones muy agresivas cerca de la proximidad de los electrodos que incluyen la formación de agentes tóxicos tales como el anión hipoclorito reactivo (blanqueador) cuando se hidroliza agua en presencia de aniones cloro. A diferencia, los mediadores redox

25 consumidos se regeneran con formación de productos secundarios tales como gases u otras especies reactivas. Como resultado, el sistema está más estrictamente controlado y es útil siempre que los propios mediadores sean no reactivos hacia el analito de interés.

En algunos casos, los agentes redox pueden ser tóxicos para las células y organismos celulares. Por ejemplo, se ha mostrado que las benzoquinonas son tóxicas mediante dos mecanismos principales: activación de oxígeno por ciclado redox y alquilación de macromoléculas esenciales. La toxicidad del mediador puede ser mitigada limitando la exposición de células y organismos celulares, desarrollando derivados de mediador impermeables, utilizando mediadores redox con bajos potenciales redox estándar y/o reactividad.

35 En el caso de células y organismos celulares, el potencial rédox estándar de agentes de oxidación se correlaciona libremente con la toxicidad. La modificación de los potenciales redox estándar en el caso de benzoquinonas puede llevarse a cabo con la adición de grupos donantes de electrones tales como alquilo (por ejemplo, metilo o terc-butilo)

o grupos hidroxilo a la estructura de anillo central.

Agentes de oxidación tóxicos tales como benzoquinona también puede estar sustituidos con agentes redox no tóxicos en sistemas de mediador asimétrico. Por ejemplo, el potencial de la celda para la oxidación de agua acoplado con la reducción de hidroquinona es significativamente inferior a un voltio y útil en electroforesis de baja tensión. Métodos de mediador asimétrico proporcionan otra vía en torno a los problemas de toxicidad asociados a la benzoquinona. Pueden usarse agentes reductores tales como ditiotreitol (DTT) u otro agente de extinción adecuado

45 para extinguir y oxidar químicamente la benzoquinona en su forma de hidroquinona no tóxica como se forma a partir de la oxidación de hidroquinona, y la forma oxidada de DTT puede servir de agente oxidante en lugar del agua. En general, el uso de agentes reductores tales como DTT en la solución mantiene un entorno reductor que protege a los microorganismos de los efectos dañinos de los agentes de oxidación fuertes, y están preferentemente presentes en exceso con respecto a los constituyentes del sistema redox, y más preferentemente en dos veces o más de exceso con respecto a los constituyentes del sistema redox. Por ejemplo, si el sistema redox comprende hidroquinona 10 mM como agente reductor y agua como agente oxidante, es preferible que el DTT esté presente en cantidades de 20 mM o mayores. Sistemas de mediador redox asimétrico también pueden incluir múltiples agentes redox como en el caso de un agente oxidante de quinoxalina usado conjuntamente con un agente reductor de catecol.

55 También puede mitigarse la toxicidad del mediador minimizando la cantidad de tiempo de electroforesis o tiempo en la solución del mediador, seguido del rápido intercambio de solución de redox por medio no tóxico. La exposición de células u organismos celulares a mediadores también puede limitarse con el uso de flujo de fluidos. Por ejemplo, los entornos de flujo laminar proporcionan la oportunidad de confinar los agentes de oxidación tóxicos como la benzoquinona (BQ) al cátodo lejos de células u organismos celulares confinados dentro del agente reductor de hidroquinona (HQ) no tóxico como se ilustra a continuación:

A medida que las células negativamente cargadas pasan a través de la cámara (de derecha a izquierda), la HQ y la BQ se reducen y se oxidan en los electrodos respectivos, generando un campo eléctrico mientras que las células son conducidas hacia el ánodo lejos de la solución de cargar de benzoquinona. La solución de HQ + células también

65 puede contener un agente reductor (es decir, DTT) u otro reactivo diseñado para extinguir la BQ formada en el ánodo resultante de la reducción electroquímica de HQ.

Hay varios métodos que pueden usarse para generar mediadores redox que no son permeables a microorganismos basándose en el tamaño físico del mediador, además de otras propiedades físicas. Estas estrategias son relevantes en casos en los que la toxicidad resulte del paso de mediador a través de membranas celulares y la interferencia intracelular con organismo o respiración celular y/o reacción con otras moléculas importantes. Oligómeros cortos de

5 benzoquinonas sobre el esqueleto molecular tales como polietilenglicol o incluso formas poliméricas de mediadores prevendrán el daño intracelular. Además, grupos estéricos grandes tales como terc-butilo u otros grupos alcano pueden también proporcionar impedimento estérico para prevenir el daño oxidativo/reactivo o la permeación intracelular. También pueden utilizarse versiones de ión bipolar o cargadas de mediadores redox para prevenir la migración intracelular. Otras estrategias incluyen diseñar un mediador de agente reductor en el que la versión oxidada es insoluble y forma un precipitante.

Por consiguiente, la presente invención proporciona conjuntos de mediadores redox para su uso en el transporte electroforético de células viables. Un ejemplo de tales reactivos es el sistema de benzoquinona/hidroquinona. En este caso, la hidroquinona se oxida en el ánodo a benzoquinona y la benzoquinona se reduce en el cátodo a

15 hidroquinona. Debido a que las reacciones son complementarias en los electrodos (es decir, tienen potenciales invertidos), el único potencial celular es debido a diferencias en la concentración en vez de diferencias en el potencial estándar en los electrodos, y así la reacción redox de electroforesis se produce a potenciales relativamente bajos entre los dos electrodos. Además, debido a que las dos especies no están cargadas, los agentes redox no aumentan significativamente la conductividad de la solución y así no compiten con las moléculas cargadas (por ejemplo, ADN) o material (por ejemplo, bacterias) por el transporte mediante electroforesis.

El esquema redox como se ha descrito anteriormente puede operar tanto con respecto a un sistema cerrado como a uno abierto. Se hace referencia a la Figura 14 del documento U.S.S.N. 10/888.828, que se publicó como US 2005048599, y al texto correspondiente. Un sistema cerrado está cerrado del entorno, y la electroforesis puede continuar

25 indefinidamente sin reponer los reactivos redox. Esto es beneficioso por varios motivos, que incluyen la contención de muestras biológicas. Un sistema abierto puede ser ejecutado tanto con los reactivos redox reversibles, como con reposición. Es decir, puede haber dos pares de reactivos que no se regeneran entre sí (tanto directamente como en benzoquinona y hidroquinona, o por extinción mutua de productos redox, como se describe a continuación). Así, en este sistema abierto, con el fin de mantener la electroforesis, los reactantes deben ser continuamente repuestos, que se lleva a cabo generalmente manteniendo un flujo de nuevos reactantes en el tampón de electroforesis en el espacio entre los electrodos.

Dependiendo de la cantidad de disponibilidad de portadores de carga (que puede ser electrolito no relacionado, los mediadores redox, o moléculas cargadas o materiales que van a transportarse), la fuerza electroforética, y por tanto

35 la velocidad a la que las moléculas o materiales pueden transportarse, puede limitarse a la velocidad de difusión de los mediadores redox. Esta velocidad de difusión puede mejorarse significativamente haciendo la distancia entre el cátodo y el ánodo pequeña -es preferible que esta distancia sea inferior o igual a 500 micrómetros, incluso más preferible que esta distancia sea inferior o igual a 250 micrómetros, e incluso más preferible que esta distancia sea inferior o igual a 100 micrómetros.

Hay numerosos pares redox que pueden operar dentro de la presente invención. Como se ha descrito anteriormente, la benzoquinona y la hidroquinona son muy adecuados para esto, y se usan preferentemente en concentraciones superiores a 1 mM, más preferentemente se usan en concentraciones superiores a 10 mM, y lo más convenientemente se usan en concentraciones superiores a 30 mM. Debe observarse que el uso de

45 benzoquinona e hidroquinona está limitado a un grado por su solubilidad limitada, y así pueden usarse convenientemente derivados más polares o cargados para aumentar su solubilidad, incluyendo tales derivados la sustitución de los carbonos de anillo no unidos a carbono con halógenos, nitratos, hidroxilos, tioles, carboxilatos y aminas, y otros restos tales. Debe observarse que es óptimo que el sistema para los agentes redox resultantes esté sin cargar (excepto como se mostrará más adelante), de manera que su distribución no esté afectada por la electroforesis del sistema, y así se equilibre la sustitución con un grupo positivamente cargado (por ejemplo, una amina) por una segunda sustitución con un grupo negativamente cargado (por ejemplo, un carboxilato), tal como en 2-amino, 5-carboxiparabenzoquinona. En tales casos de benzoquinonas e hidroquinonas derivatizadas, las concentraciones de los reactivos redox pueden aumentarse convenientemente.

55 Otros pares redox similares incluyen pares cetona/alcohol y aldehído/alcohol, cuyo grupo carbonilo de la cetona puede flanquearse por grupos alquilo o arilo, grupos que también pueden derivatizarse con halógeno, nitrato, hidroxilo, tiol, carboxilato; grupos amino y otros grupos para modificar la carga sobre la molécula o para aumentar su solubilidad. Otro sistema conveniente es aquel de ditiotreitol/ditioeritritol y sus formas oxidadas (que pueden formarse por la oxidación parcial de soluciones de las formas reducidas, por ejemplo, por peróxido de hidrógeno), o alternativamente por alcanos con grupos tiol terminales (por ejemplo, 1,5-ditiobutano). En general, es preferible que los dos grupos tioles estén en la misma molécula (como en ditiotreitol), a diferencia de en moléculas separadas (por ejemplo, como en beta-mercaptoetanol), de manera que la reacción de oxidación sea una reacción unimolecular que es relativamente menos sensible a la concentración (aunque los tioles individuales, tales como el betamercaptoetanol, son agentes reductores aceptables para muchas aplicaciones).

65 Debe observarse que los pares redox anteriores se oxidan y reducen en pares de electrones de tal manera que la

carga en ambos pares redox sea la misma, y sea preferentemente neutra. El requisito de que los pares de electrones se transfieran puede, sin embargo, reducir la velocidad de la reacción, y así también puede ser conveniente usar pares en los que un electrón se transfiere en la reacción redox. Ejemplos de tales pares incluyen ferroceno/ferrocinio y sus derivados, y ferrocianuro/ferricianuro. En tales casos, es preferible usar pares en los que el producto reducido esté neutramente cargado, y el producto oxidado esté positivamente cargado en aquellos casos en los que se transportarán moléculas o materiales negativamente cargados. El motivo para esto es que el producto oxidado suministra contra-carga al transporte de las moléculas transportadas negativamente cargadas, y el producto reducido está sin carga, y así no compite por el transporte con las moléculas transportadas negativamente cargadas.

Otra configuración del sistema es aquella donde los productos de las reacciones redox se extinguen los unos a los otros, tal como en lo siguiente:

Ánodo: 2I -→ 2e -+I2 Cátodo: S4O62-+ 2e-→ 2S2O3-2

Los productos de esta reacción reaccionan espontáneamente entre sí según 2S2O3-2 + I2 → S4O6-2 + 2I, regenerando el estado de partida. El uso de yoduro u otro haluro es conveniente, ya que el yoduro se mueve mediante electroforesis hacia el ánodo, y el yodo resultante está neutramente cargado y pueden moverse mediante osmosis hacia el otro electrodo, donde se encontrará con el tiosulfato para la regeneración del sistema inicial.

En sistemas de bucle abierto sin recirculación, donde los pares redox no se regeneran el uno al otro durante sus reacciones respectivas, el intervalo de agentes redox es más ancho, e incluye convenientemente compuestos que incluyen glutatión, ascorbato, metil-viológeno, metosulfato de fenazina, trolox, y otros, que incluyen sus pares redox (tales como GSSG para glutatión y deshidroascorbato para ascorbato, metil-viológeno oxidado para metil-viológeno). En este caso, es algunas veces conveniente que la carga de la molécula sea tal que el reactante sea atraído hacia el electrodo en el que participará en reacciones rédox (es decir, los reactantes que van a oxidarse en el ánodo deben estar negativamente cargados y los reactantes que van a reducirse en el cátodo deben estar positivamente cargados). Esto puede llevarse a cabo generalmente derivatizando la molécula con uno o más restos apropiadamente cargados. La principal desventaja de esto es que un agente redox negativamente cargado, aunque aumenta la velocidad de reacción, también puede competir con las moléculas de transporte negativamente cargadas, de forma que el aumentar la cantidad de reactante redox pueden incluso reducir el transporte global de las moléculas de transporte. Así, se necesita tener cuidado durante la experimentación para garantizar que los reactivos redox negativamente cargados no tengan un efecto perjudicial global.

Debe observarse, sin embargo, que moléculas pequeñas de un par redox, debido a sus altas velocidades de difusión, están solo moderadamente afectadas por la electroforesis, y durante las cortas distancias que generalmente existen entre el cátodo y el ánodo, muestran un gradiente modesto con respecto a los electrodos (frecuentemente solo 2-3 veces, y generalmente menos de 10 veces). En este caso, puede ser útil que uno o ambos reactivos redox sea neutro o esté positivamente cargado. En el caso en el que ambos agentes estén positivamente cargados, es preferible que el agente que reacciona en el ánodo positivamente cargado esté en concentraciones molares globales más grandes para compensar las concentraciones locales más bajas en el ánodo. En aquellos casos en los que los microorganismos están siendo transportados en presencia de agentes redox, es importante observar que algunos de los agentes redox mencionados anteriormente pueden tener toxicidad para los microorganismos. En casos en los que se desea el posterior crecimiento o monitorización de organismos vivos, esto puede ser un problema significativo. Por ese motivo, es útil tanto usar bajas concentraciones del reactivo redox tóxico (generalmente el agente oxidante), para limitar la duración a la que el microorganismo se expone al agente, como usar un agente con toxicidad más baja, incluso ese agente debe tener propiedades redox menos deseables. Además, bacterias que han sido expuestas a un agente redox tóxico pueden tratarse después de la exposición a un agente para contrarrestar. Por ejemplo, si el agente redox tóxico debe ser un agente oxidante, la adición de un agente reductor tal como beta-mercaptoetanol o ditiotreitol puede reducir los efectos del agente oxidante. Debe observarse que uno de los objetivos del uso de los agentes redox es permitir que la electroforesis se produzca a un potencial más bajo, tanto para minimizar la producción de productos redox perjudiciales (por ejemplo, productos de cloro a partir de cloruro), como también de manera que pueda producirse detección óptica usando electrodos de ITO, que pueden ser dañados por potenciales altos. Así, el potencial de la celda de los pares rédox elegidos para la aplicación es preferentemente inferior a 2 V (el potencial al que ITO empieza a afectarse), e incluso más preferentemente inferior a 1 V y lo más preferentemente inferior a 500 mV, ya que el intervalo de potenciales entre el potencial más bajo al que la electroforesis se produce (es decir, 500 mV) y el punto final (es decir, 2 V) dará alguna medida de control con respecto a las velocidades de electroforesis. Incluso en aquellos casos en los que los potenciales de la celda estándar de los agentes redox puedan estar fuera de estos intervalos, el uso de concentraciones diferentes de agente oxidante y agente reductor puede proporcionar un potencial de la celda que permite operación útil.

Las preferencias generales de los mediadores redox es que 1) sean solubles en agua, y generalmente a una concentración superior a 1 mM y más preferentemente a una concentración superior a 10 mM, 2) que estén aproximadamente sin cargar a algún pH entre pH 5 y pH 9, 3) que tengan toxicidad relativamente baja para los microorganismos. Algunos mediadores redox que cumplen algunas o todas de las preferencias a cierto grado

incluyen:

Agente oxidante

Agente reductor

1,4-Benzoquinona

1,4-Hidroquinona

Agua

1,4-Hidroquinona

2,3-Dihidroxi-1,4-ditiobutano

Ditiotreitol

Menadiona

Menadiol

Adrenocromo

Adrenocromo reducido

1,2-Benzoquinona

Catecol

Quinoxalina

Quinoxalina reducida

Cloranilo

Tetracloro-hidroquinona

Antraquinona

Antraquinona reducida

Manipulación de la carga de microorganismos

5 También puede manipularse la carga eficaz del microorganismo. Se ha caracterizado el punto isoeléctrico para un gran número de bacterias y se ha informado en la bibliografía científica que generalmente oscila de pH 3 a pH 8, y la mayoría de los microorganismos de interés médico están negativamente cargados (es decir, con un potencial zeta negativo). En general, la movilidad de los microorganismos puede aumentarse aumentando el pH del tampón de

10 electroforesis, que tiende a desprotonar grupos ácidos, dejando los microorganismos más negativamente cargados. Adicionalmente, el número de grupos cargados en las células u organismos celulares puede alterarse con la unión química de reactivos aniónicos o catiónicos (es decir, ésteres de NHS que contienen carboxilo). Reactivos poliméricos catiónicos o aniónicos (es decir, polietilenimina o poli-L-lisina) también puede ser físicamente absorbidos sobre células u organismos celulares. El uso de quelantes de metal también puede emplearse para embeber iones

15 polivalentes que competirán por la capa de contraiones estrechamente unida a las células u organismos celulares disminuyendo su movilidad eficaz. Debe observarse que el uso de unión física o química de agentes aniónicos o catiónicos a la superficie de microorganismos debe realizarse con cuidado, para garantizar que los agentes de identificación o agentes de captura (por ejemplo, anticuerpos) retengan su afinidad y especificidad por el microorganismo.

Dielectroforesis

En una realización, el método de concentración es la dielectroforesis. La dielectroforesis se basa en la polarización del analito y la creación de campos eléctricos asimétricos. Estos métodos generalmente requieren el uso de

25 electrodos que están moldeados tanto en dos como tres dimensiones para crear campos eléctricos o electroforéticos que no son uniformes. Una descripción del uso de estos electrodos dielectroforéticos se presenta en G. H. Markx y

R. Pethig, Dielectrophoretic Separation of Cells: Continuous Separation. Biotechnol. Bioeng. 45, 337-343 (1995) y G.

H. Markx, Y. Huang, X.-F. Zhou and R. Pethig, Dielectrophoretic characterization and separation of microorganisms,

Microbiology, 140, 585-591 (1994). 30

Centrifugación y filtración

En una realización, el método de concentración es tanto centrifugación como filtración, generalmente seguido de resuspensión del microorganismo en una pequeña cantidad de fluido. Debe también observarse que la

35 centrifugación puede ir acompañada de floculación, precipitación o adición de un co-precipitado, y tales métodos se fomentan por que permiten la manipulación de números muy pequeños de microorganismos, y previenen la agregación de los microorganismos. En cualquiera de estos casos, sin embargo, es algunas veces preferible que no se añada material que quede en una partícula, especialmente con propiedades (tamaño o densidad) similares a las del microorganismo (por ejemplo, el uso de perlas de polímero).

40 Pueden hacerse tanto centrifugación y/o filtración bien antes de la introducción de la muestra al biosensor o bien como parte de la etapa de introducción. Por ejemplo, pueden centrifugarse o filtrarse, resuspenderse y añadirse, muestras al biosensor. Alternativamente, el biosensor puede configurarse de forma que la muestra se añada a un recipiente dentro del cartucho de biosensor, el dispositivo completo se centrifugue para hacer bajar los

45 microorganismos a una superficie del biosensor (por ejemplo, tanto una preconcentración como superficie de detección). Se hace referencia particular a los dispositivos de las Figuras 39 y 40 del documento U.S.S.N. 10/888.828, que se publicó como US 2005-048599, y al texto adjunto que explica resumidamente los métodos y estructuras.

50 Apilamiento electroforético y electrodos de recogida

Otro método según la presente invención es el uso de concentración electrocinética. En un enfoque tal, la concentración se produce en el límite entre dos columnas de líquido en contacto entre sí en las que un líquido tiene una fuerza iónica mucho más baja que el otro. Un apilamiento tal o sistema de tampón discontinuo es muy conocido

55 en la técnica de laboratorio de la electroforesis, que incluye electroforesis capilar. La presente invención tiene una

gran disposición para aplicar tanto formas débiles como fuertes de concentración de tampón discontinuo.

En otro enfoque tal, un electrodo conductor se coloca debajo de una zona no de unión en, por ejemplo, una antecámara a una región de biosensor analítico. En el momento de la concentración de analito, este electrodo de

5 colector recibe una tensión eléctrica programada que atrae a los analitos que tienen la polaridad opuesta. La superficie que se encuentra debajo del electrodo está recubierta con un material no adsorbente no de unión, tal como OptiChem(r) desactivado producido por Accelr8 Technology Corporation. Este campo eléctrico sirve para concentrar los analitos sobre el área distinta del material de electrodo. Tras completarse, la terminación o inversión del potencial eléctrico libera los organismos para el procesamiento adicional.

Concentración magnética de microorganismos

En una realización, el método de concentración es captura por campo magnético. En esta realización, similar a las marcas electroforéticas, se utiliza una marca magnética. Ejemplos de tales partículas incluyen partículas Estapor de 15 Bangs Laboratories (Fishers, IN), y Dynabeads de Dynal, Inc. (Noruega). Como se describe en el documento

U.S.S.N. 10/888.828, que se publicó como US 2005-048599, estas partículas paramagnéticas son preferentemente inferiores a 1 micrómetro de diámetro, y más preferentemente inferiores a 250 nm de diámetro, y lo más preferentemente inferiores a 100 nm de diámetro; en general, cuanto más pequeña sea la partícula, menos interfiere con la difusión del microorganismo a la(s) superficie(s) de detección. En lugar de electrodos, la colocación de imanes permanentes o electroimanes tanto por encima como por debajo de la superficie de detección permite la concentración. Estos imanes pueden estar tanto "sobre el chip" como "fuera del chip"; es decir, pueden ser parte del cartucho de biosensor, por ejemplo, colocados sobre la superficie opuesta de la superficie de detección, o como parte del dispositivo en el que el biosensor se coloca para la manipulación o detección. Partículas magnéticas que incluyen, pero no se limitan a, ferrofluidos y suspensiones de partículas magnéticas pequeñas de un tamaño

25 comparable al tamaño de un único dominio magnético, pueden unirse a la diana con el fin de aumentar la magnetización neta de la diana y acelerar la concentración. Además, en los casos de organismos diana de naturaleza celular, las partículas magnéticas pueden diseñarse para tener una velocidad más rápida de permeación en el organismo, a diferencia de la velocidad de permeación fuera del organismo. Además, las partículas magnéticas pueden diseñarse para estar irreversiblemente contenidas dentro del organismo diana. Lo más preferentemente, las partículas magnéticas son superparamagnéticas y de tamaño comparable a un único dominio magnético.

Recirculación

En una realización, el método de concentración es la recirculación. Es decir, dentro de un sistema cerrado,

35 generalmente uno o más canales que contienen una o más superficies de detección, que recirculan la muestra a granel a través de los canales y pasan la(s) superficie(s) de detección, producirán un porcentaje más alto de microorganismos que se concentran en la(s) superficie(s) de detección. En general, estas técnicas utilizan métodos de flujo a granel que se basan en el uso de bombas (tanto sobre el chip como fuera del chip) o mezcladoras y opcionalmente válvulas, tales como válvulas pico de pato o válvulas fluídicas diferenciales, para tener el flujo de fluidos a granel en una dirección. Esto permite generalmente que los microorganismos se distribuyan a lo largo de la superficie, y puedan permitir además que una fracción más grande de los microorganismos sea una donde hay múltiples regiones de posible unión. Si estas regiones tienen especificidad diferente por diferentes especies de microorganismos dentro de la muestra, entonces esto permite que los microorganismos se muevan de región a región hasta que se pongan en contacto con la región con la especificidad correspondiente.

Separación en alícuotas de muestras e intervalo dinámico

Debe observarse que el número de microorganismos en la muestra puede oscilar a lo largo de muchos órdenes de magnitud, pero el intervalo dinámico de los métodos y dispositivo para la captura, crecimiento e identificación de los microorganismos puede tener un intervalo dinámico mucho más pequeño. Si la muestra está diluida, entonces la muestra entera se usará preferentemente en el análisis posterior. Sin embargo, si la muestra se concentra de manera que la aplicación directa sature el intervalo dinámico del dispositivo o método, entonces la muestra necesitará diluirse antes de la aplicación.

55 Con el fin de determinar la concentración de los microorganismos en la muestra, están disponibles varios métodos diferentes. Por ejemplo, la absorción de luz es indicativa de la concentración de microorganismos en solución. Alternativamente, tras la concentración de organismos sobre una superficie según los métodos anteriores, pueden obtenerse imágenes de la superficie con un sistema óptico y cámara, y analizarse el campo de vista para la presencia de microorganismos (por ejemplo, por el juego de herramientas de análisis de imágenes ImageJ de los Institutos Nacionales de Salud, por el juego de herramientas de análisis de imágenes IMAQ, u otras herramientas comerciales o patentadas, según sea necesario). Por tanto, los microorganismos sobre una superficie pueden barrerse con un sistema de láser de barrido, y la dispersión de la luz puede usarse para indicar la presencia de un microorganismo. Además, el microorganismo puede tratarse con un colorante absorbente o fluorescente, y la cantidad total de absorción o fluorescencia puede usarse para proporcionar una estimación aproximada del número

65 de microorganismos sobre la superficie. Debe observarse que el número de microorganismos no necesita en esta etapa cuantificarse con mucha exactitud, y obtener números de microorganismos dentro de un factor de 2-3 veces

es generalmente adecuado con el fin de enviar al sistema el número correcto de microorganismos. La selección de una fracción específica de microorganismos puede realizarse en varias formas diferentes. En su forma más simple, la muestra puede extraerse manualmente y posiblemente diluirse, y puede ponerse una alícuota en la siguiente parte del sistema manualmente. Preferentemente, la selección de muestras se produce mediante medios

5 automáticos. Por ejemplo, en un dispositivo basado en microfluídica, puede usarse una medida de la cantidad de la muestra, posiblemente con dilución con tampón limpio.

Fuerzas y flujos horizontales

Además de los métodos de concentración explicados resumidamente en el presente documento, hay varias fuerzas y flujos horizontales diferentes que pueden usarse para aumentar la cinética o unión total de los microorganismos a la superficie de detección. Los métodos de proporcionar mezcla, tales como fuerzas horizontales, pueden incluir mezcla física del medio en la celda (por ejemplo, mediante el uso de un mecanismo de agitación físico, bombas, flujo electroosmótico, acústica de ondas superficiales, y otros medios), el uso de fuerzas electroforéticas horizontales

15 sobre los microorganismos, el uso de fuerzas magnéticas sobre los microorganismos, y otros medios convenientes. Configuraciones específicamente para mezclar se explican resumidamente en el documento U.S.S.N. 10/888.828, que se publicó como US 2005-048599, particularmente las Figuras 18 y 19. Aquellas fuerzas que comprenden flujo a granel de la solución (por ejemplo, electroosmosis, agitación, bombas y acústica de ondas superficiales) son particularmente fáciles de implementar. Las fuerzas verticales pueden comprender electroforesis, dielectroforesis, filtración, atracción de campo magnético y otras fuerzas tales que acercarán los microorganismos a la superficie de detección.

Debe observarse que el uso de "vertical" y "horizontal" se usa en relación con la superficie de los electrodos, y no está relacionado con la gravedad, arriba/abajo u otros esquemas de coordenadas. Dada la orientación de los

25 diagramas, horizontal puede entenderse en este contexto por ser paralelo al electrodo (o más generalmente, la superficie sobre la que reside la sonda), mientras que vertical puede entenderse en este contexto por ser perpendicular al electrodo. Entre éstos se incluyen fuerzas electroforéticas, electroosmosis, ondas acústicas, agitación mecánica y bombeo de fluidos. Por ejemplo, en la Fig. *4B, los electrodos laterales 210 y 220 pueden usarse para aplicar fuerzas horizontales a los microorganismos. En tal caso, la magnitud del campo eléctrico vertical puede ajustarse por el potencial sobre los electrodos de referencia 195, en relación con la magnitud del campo eléctrico horizontal de los electrodos 210 y 220.

También se describe en el presente documento para las fuerzas horizontales cambiar la dirección, de manera que el microorganismo se mueva hacia atrás y hacia adelante sobre la superficie de detección. En tal caso, el

35 microorganismo tendrá múltiples posibilidades de interaccionar con la superficie, y así aumentará su unión. Por tanto, con el fin de aumentar la cantidad de unión, puede disminuirse la velocidad de movimiento horizontal, o aumentar la velocidad de movimiento vertical.

Con respecto a las ondas acústicas, pueden colocarse actuadores piezoeléctricos tanto sobre el sustrato 120 como sobre la tapa 111 en una disposición topológica de forma que bajo una señal de control de alta frecuencia, las ondas acústicas superficiales en el vidrio produzcan el transporte de masa en el fluido en el que los microorganismos están suspensos. En tal caso, se crea una corriente de convección dentro de la célula que mantiene un flujo laminar constante a través de la superficie del sustrato 120. Alternando el control de las señales piezoeléctricas, pueden alternarse periodos de mezcla turbulenta con periodos de flujo laminar.

45 También puede usarse bombeo mecánico o electroosmótico para crear flujo laminar a través de la superficie 120. Mientras que el bombeo mecánico es conveniente para grandes volúmenes, el bombeo electroosmótico puede usarse para ayudar incluso en el caso de volúmenes extremadamente pequeños. En tal caso, las superficies electroosmóticas pueden incorporarse tanto en el sustrato 120, como más convenientemente en la tapa 111, ya que el sustrato 120 está frecuentemente cubierto por una superficie a medida usada principalmente para unir la sonda 116 y para reducir la cantidad de unión no específica, y que puede ser una superficie menos eficaz para crear fuerzas electroosmóticas.

Captura de los microorganismos

55 Como se trata en el presente documento, hay varios métodos para la captura de microorganismos sobre superficies en el método de la invención. En general, éstos se clasifican en dos categorías: captura específica y no específica. "Captura" en este contexto significa que los microorganismos están asociados con la(s) superficie(s) de detección de forma que no se mueven o desprenden significativamente en las condiciones del ensayo. Por ejemplo, esta asociación es generalmente lo suficientemente fuerte como para permitir etapas de lavado sin eliminar los microorganismos de la superficie. En general, la captura se basa en fuerzas no covalentes tales como interacciones electrostáticas, enlace de hidrógeno, hidrofobia, etc., aunque en algunos casos puede hacerse unión covalente (incluyendo, por ejemplo, reticulación). Puede lograrse reticulación activada mediante medios térmicos inducidos por luz.

65 El lavado depende de la diferencia en las energías de unión entre los materiales deseados y no deseados. Un

profesional experto habitual en la materia puede medir fácilmente las diferencias de energía de unión usando flujo hidrodinámico y electrocinesis, como ejemplos. Construyendo tales curvas de energía de unión para cada tipo de sustancia, es posible optimizar tanto los modos de lavado diferenciales individuales como las combinaciones de tales modos.

Captura no específica de microorganismos

En general, hay varias técnicas, que incluyen técnicas conocidas, que pueden usarse para capturar no específicamente microorganismos sobre la(s) superficie(s) de detección (o sobre la superficie de preconcentración). Como antes, estas técnicas generalmente se basan en enlace de hidrógeno, interacciones electrostáticas e hidrófobas, que pueden usarse tanto individualmente como en combinación.

Se conocen varios materiales que son "pegajosos" a cualquiera o ambos de los microorganismos y/o moléculas biológicas. Estos incluyen cualquier número de moléculas biológicas y polímeros, que incluyen, pero no se limitan a,

15 superficies poli-iónicas, particularmente superficies poli-catiónicas cuando los microorganismos tienen una carga negativa global, que incluye poliaminoácidos (por ejemplo, polilisina) y fibronectina. Además, es muy conocido en la técnica que especies de bacterias se unen selectivamente a ciertas moléculas. Por ejemplo, es muy conocido que Escherichia coli se une a superficies de manosa selectivamente. Organismos de Streptococcus y Staphylococcus se unen a la porción Fc de anticuerpos mediante el mecanismo de proteína A. Estos ligandos de receptor pueden utilizarse para inmovilizar bacterias sobre superficies. Superficies altamente hidrófobas, tales como poliestireno, son generalmente "pegajosas" a microorganismo y también pueden usarse.

Una superficie polimérica de interés es OptiChemTM, como se describe en el documento U.S.S.N. 2003/0022216, que es un miembro de una clase de superficies de "hidrogel" (incluyendo también CodeLink por Amersham) que son

25 altamente porosas y que generalmente soportan, debido a esta porosidad, la difusión de mediadores redox e interacciones con los electrodos necesarios para la electroforesis de microorganismos. Esto puede modificarse con grupos particulares para potenciar la adhesión no específica, que incluye dietilentriamina (útil para potenciar interacciones electrostáticas), y Tris y etanolamina (útiles para potenciar el enlace de hidrógeno). También puede modificarse con restos hidrófobos, que pueden incluir bencenos, naftalenos y compuestos que contienen tales restos, que están preferentemente sustituidos con aminas o sulfhidrilos de manera que puedan unirse convenientemente a OptiChem u otros hidrogeles similares.

Una de las propiedades importantes de estas superficies de hidrogel es su falta de "adhesividad" en su estado sin sustituir para los microorganismos. Esto hace que estas superficies sean de valor particular en el recubrimiento de

35 superficies de los dispositivos como se describe en el presente documento en áreas donde no se desea que los microorganismos se unan, que incluyen, por ejemplo, pocillos de introducción de muestras, vías y canales, e incluso electrodos a los que no se desea que los microorganismos se unan, tales como electrodos de concentración.

Captura específica

En general, una realización de la invención proporciona ligandos de unión de captura específica unidos a la(s) superficie(s) de detección. La "especificidad" en este caso variará con la aplicación, ensayo y muestra. En algunas realizaciones, puede desearse tener un ensayo para un panel de diferentes tipos de microorganismos, o para un panel de diferentes especies dentro de un género particular, o combinaciones. Así, mientras que captura no

45 específica se refiere a la mayoría o a todos los microorganismos dentro de una muestra, captura específica se refiere a microorganismos específicos. Por ejemplo, puede desearse tener ligandos de captura específicos para diferentes especies de E. coli que no reaccionarán de forma cruzada entre sí. En otros casos, puede ser adecuado tener un ligando de captura que se une a muchas o todas las cepas de E. coli, y otro que se une a muchas o todas las especies o cepas del género Streptococcus. También son apropiadas combinaciones de estos.

Por "ligando de unión" o "especies de unión" en el presente documento se indica un compuesto que se usa para sondar la presencia del microorganismo diana, que se unirá al microorganismo diana. En una realización, cuando se usan marcas, puede haber dos ligandos de unión usados por microorganismo diana; un ligando de unión de "captura" o de "anclaje" que está unido a la superficie de detección como se describe en el presente documento, y

55 un ligando de unión soluble, que se une independientemente al microorganismo diana y contiene una marca, como se describe más adelante.

Generalmente, el ligando de unión de captura permite la unión de microorganismos a la(s) superficie(s) de detección, para los fines de detección. En una realización preferida, la unión es específica, y el ligando de unión es parte de un par de unión. Por "unir específicamente" en el presente documento se indica que el ligando se une al analito, con especificidad suficiente para diferenciar entre el microorganismo específico y otros microorganismos, componentes o contaminantes de la muestra de prueba. Sin embargo, como será apreciado por aquellos expertos en la materia, será posible detectar analitos usando unión que no es altamente específica; por ejemplo, los sistemas pueden usar ligandos de unión diferentes, por ejemplo, una matriz de diferentes ligandos, y la detección del analito 65 particular es mediante su "distintivo" de unión a un panel de ligandos de unión, similar al modo en que funcionan las "narices electrónicas". La unión debe ser suficiente para permitir que el analito siga unido en las condiciones del

ensayo, que incluye etapas de lavado para eliminar la unión no específica. En algunas realizaciones, por ejemplo, en la detección de ciertas biomoléculas, las constantes de unión del analito al ligando de unión serán al menos aproximadamente 10-4 a 10-6 M-1, prefiriéndose al menos aproximadamente 10-5 a 109 y siendo particularmente preferido al menos aproximadamente 10-7 a 10-9 M-1. Debe observarse que en la presente realización pueden

5 utilizarse ligandos de unión más baja, debido al gran número de interacciones entre un analito, el tamaño de un microorganismo y el ligando.

Como será apreciado por aquellos expertos en la materia, la composición del ligando de unión puede variar. Se conocen ligandos de unión para una amplia variedad de analitos, o pueden ser fácilmente encontrados usando técnicas conocidas. Anticuerpos para proteínas de la superficie celular, lípidos o hidratos de carbono son útiles en una realización. El término "anticuerpo" incluye fragmentos de anticuerpos, como se conoce en la técnica, que incluyen Fab, Fab2, anticuerpos monocatenarios (por ejemplo Fv), anticuerpos quiméricos, etc., tanto producidos por la modificación de anticuerpos completos como aquellos sintetizados de novo usando tecnologías de ADN recombinante. El término "anticuerpo" comprende además anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales, que

15 pueden ser anticuerpos agonistas o antagonistas, anticuerpos de variante y anticuerpos derivatizados por cualquier número de restos químicos, tales como PEGilación. Hay varios anticuerpos comercialmente disponibles para microorganismos infecciosos, véase generalmente los anticuerpos comercializados por Accurate Chemical, Biodesign, Fitzgerald, KPL, US Biological, Virostat, QED, Novus Biologicals, Cortex y Abcam, entre otros.

Alternativamente, como se describe generalmente en las patentes de EE.UU. 5.270.163, 5.475.096, 5.567.588, 5.595.877, 5.637.459, 5.683.867, 5.705.337, y patentes relacionadas, pueden desarrollarse "aptámeros" de ácido nucleico para unirse a prácticamente cualquier analito diana, que incluyen restos superficiales sobre los microorganismos.

25 En una realización adicional, las proteínas de ligando de unión incluyen péptidos. Por ejemplo, cuando la diana sobre el microorganismo es una enzima, ligandos de unión adecuados incluyen sustratos, inhibidores y otras proteínas que se unen a la enzima, es decir, componentes de un complejo multi-enzimático (o proteína). Como será apreciado por los expertos en la materia, pueden usarse dos moléculas cualquiera que se asociarán, preferentemente específicamente, tanto como el analito como el ligando de unión. Pares de analito/ligando de unión adecuados incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos/antígenos, receptores/ligando, proteínas/ácidos nucleicos; ácidos nucleicos/ácidos nucleicos, enzimas/sustratos y/o inhibidores, hidratos de carbono (incluyendo glucoproteínas y glicolípidos)/lectinas, hidratos de carbono y otros componentes de unión, proteínas/proteínas; y proteína/moléculas pequeñas. Éstos pueden ser secuencias no mutantes o derivadas. En una realización preferida, los ligandos de unión son porciones (particularmente las porciones extracelulares) de receptores de la superficie celular que son

35 conocidas por multimerizarse. De manera similar, hay un amplio conjunto de bibliografía referente al desarrollo de componentes de unión basados en métodos de química combinatoria.

El ligando de captura se une generalmente a la superficie de detección mediante un conector de unión, que puede ser un material polimérico como se ha explicado resumidamente en el presente documento, que incluye tanto polímeros lineales como ramificados, o conectores más lineales tales como cadenas de alquilo. El método de unión de los ligandos de unión de captura al conector de unión generalmente se hará como se conoce en la técnica, y dependerá de tanto la composición del conector de unión como del ligando de unión de captura. En general, los ligandos de unión de captura se unen al conector de unión mediante el uso de grupos funcionales sobre cada uno que pueden entonces usarse para la unión. Grupos funcionales preferidos para la unión son grupos amino, grupos 45 carboxi, grupos oxo, tioles, arilazidas, alcoholes, aminas, epoxis, n-hidroxi-succinimida, biotina, avidina y grupos tiol. Estos grupos funcionales pueden entonces unirse, tanto directamente como indirectamente, mediante el uso de un conector. Los conectores son muy conocidos en la técnica; por ejemplo, conectores homo-o heterobifuncionales como son muy conocidos (véase el catálogo de Pierce Chemical Company de 1994, sección técnica sobre conectores cruzados, páginas 1550200). Debe también observarse que estos mismos métodos pueden usarse para añadir marcas a ligandos de unión solubles para la detección, como se explica resumidamente más adelante. Además, es muy conocido en la técnica que especies de bacterias se unen selectivamente a ciertas moléculas. Por ejemplo, es muy conocido que Escherichia coli se une a superficies de manosa selectivamente. Organismos de Streptococcus y Staphylococcus se unen a la porción Fc de anticuerpos mediante mecanismo de proteína G o proteína A, respectivamente. Además, otros tipos de bacterias pueden tener sitios de unión, tales como adhesinas

55 en fimbrias, que tienen sustratos de unión preferidos, tales como polisacáridos o proteínas específicos. En tales casos, la captura puede tener lugar proporcionando tales zonas de sustrato de unión naturalmente preferidas.

Separación

En el método de la invención, la separación de los microorganismos sobre la superficie está controlada. Las bacterias electroforéticamente transportadas de la solución a granel a una superficie tienden a formar agrupaciones semiorganizadas sobre las superficies, debido al flujo electrohidrodinámico. Para fines de QM, una mayoría de las células deben asociarse a la superficie en sitios distintos individuales, es decir, la agrupación está limitada. Hay varias formas para realizar esto. En una realización, la viscosidad de la solución electroforética se aumenta 65 añadiendo un agente de viscosidad. Agentes de viscosidad adecuados incluyen glicerol, sacáridos y polisacáridos tales como dextranos, y polímeros tales como polietilenglicol. Estos agentes pueden añadirse a diferentes

concentraciones, dependiendo de su viscosidad; por ejemplo, es útil 10-25 % de glicerol, siendo el 20 % una realización particular. En algunos casos, pueden añadirse otros reactivos para reducir este efecto de "agrupación", opcionalmente conjuntamente con agentes de viscosidad y las técnicas como se explican resumidamente más adelante. Por ejemplo, pueden añadirse tensioactivos, proteínas tales como albúminas, caseínas, etc., inhibidores

5 específicos de la adhesión celular, materiales poliméricos tales como polietilenglicol, y dextrano para reducir la agrupación.

En otra realización, puede emplearse ventajosamente diseño fluídico y geometría de electrodo electrocinético para proporcionar o aumentar la separación de los microorganismos sobre la superficie.

En otra realización más, la separación de los microorganismos sobre la superficie se hace controlando la densidad de cualquiera de los ligandos de captura específicos o los componentes que contribuyen a la unión no específica sobre la(s) superficie(s) de detección. Por ejemplo, cuando se usan ligandos de captura específicos, la concentración del ligando sobre la superficie se controla para permitir una densidad espacial que permite la unión de 15 microorganismos individuales en sitios distintos que están espacialmente separados. En una realización, la distancia de separación es mayor que el diámetro de varios microorganismos, de forma que un único microorganismo unido en un sitio discrito puede experimentar varios ciclos de división celular y todavía ser detectablemente distinto de otros microorganismos unidos en regiones vecinas. La densidad de los ligandos de captura dependerá en parte del tamaño del microorganismo que va a evaluarse, además de la concentración del microorganismo en la muestra. Como se ha indicado anteriormente en esta memoria descriptiva, puede regularse el número de microorganismos añadidos al sistema para unirse a la superficie de captura. En general, el número de microorganismos debe equilibrarse con el tamaño de la superficie de captura de forma que la distancia centro a centro entre los microorganismos tenga una mediana de al menos 10 micrómetros, y más preferentemente 20 micrómetros, e incluso más preferentemente 40 micrómetros. Esta distancia garantizará que incluso después de varias divisiones, en las

25 que los microorganismos hermanos de un único fundador se numerarán 16 o 32, la mayoría de las minicolonias (llamadas aquí "clones", como se trata más abajo en más detalle) seguirán siendo distintas y no se solaparán.

En algunos casos, la electroforesis bajo ciertas de las condiciones explicadas resumidamente en el presente documento produce una falta de homogeneidad de la dispersión de los microorganismos sobre la superficie de detección, como se demuestra por áreas de concentración y rarefacción de células. Esto se ha observado en condiciones de benzoquinona 10 mM e hidroquinona 10 mM, una separación de electrodos de óxido de indio y estaño (ITO) de 300 micrómetros y un potencial superior a 1,5 voltios e inferior a la tensión de ruptura de ITO. Hay varios métodos que pueden utilizarse para controlar este fenómeno. En una realización, la intensidad de la fuerza electroforética puede reducirse, tanto disminuyendo la tensión como aumentando la conductividad de la solución. 35 Por ejemplo, en una solución de benzoquinona 10 mM e hidroquinona 10 mM y conductividad muy baja (por ejemplo, < 100 mS/cm), las células no aparecen muy fuertemente por debajo de 1,4 voltios. En un aspecto adicional, pueden intercalarse periodos de fuerza electroforética fuerte con periodos de menor fuerza electroforética o ninguna, en los que la cantidad de menor fuerza electroforética es preferentemente inferior al 50 % de la fuerza máxima, y más preferentemente inferior al 25 % de la fuerza máxima, y es lo más preferentemente inferior al 10 % de la fuerza máxima. En general, el periodo de fuerza electroforética fuerte debe ser inferior a aquél en el que las células se forman primero, y tales periodos son preferentemente no superiores a 5 segundos, y más preferentemente no superiores a 2 segundos, y lo más preferentemente no superiores a 1 segundo. Los periodos sin fuerza electroforética son convenientemente sustancialmente suficientes para permitir la difusión de iones a distancias largas en comparación con el tamaño vertical de las células (es decir, la distancia entre los electrodos), y son

45 preferentemente superiores a 100 milisegundos, y más preferentemente superiores a 300 milisegundos, y lo más preferentemente superiores a 1 segundo. En otra realización, es conveniente permitir que el flujo de líquido rompa las células, tales como mediante el uso de convección por temperatura ayudada por calentamiento desigual de las paredes de la cámara, o mediante el movimiento de fluido a través de la cámara, por ejemplo, mezcla o lavado.

También puede ser beneficioso en ciertas circunstancias tener las bacterias distribuidas de una forma no uniforme sobre la superficie de detección. Por ejemplo, en el caso en el que el número de bacterias pueda oscilar durante números más grandes del intervalo nominal del sistema con distribución uniforme de bacterias, teniendo una distribución no uniforme sobre la superficie de detección, pueden usarse áreas de escasez relativa de bacterias cuando el número de bacterias en la muestra sea alto, mientras que pueden usarse áreas de concentración relativa

55 cuando el número de bacterias en la muestra sea bajo.

En una realización, varias de estas técnicas se combinan juntas. Por ejemplo, la densidad del ligando de captura puede controlarse y puede usarse un agente de viscosidad. De manera similar, puede usarse electroforesis intermitente en presencia de un agente de viscosidad.

Lavado

Como será apreciado por aquellos en la materia, puede usarse cualquier número de etapas de lavado opcionales durante los métodos de la invención.

65 En una realización, la(s) etapa(s) de lavado se hacen para eliminar materiales exógenos libremente unidos, y

pueden incluir, pero no se limitan a, diferentes concentraciones de sales a diferentes condiciones de pH, u otros tratamientos químicos o físicos, que incluyen el uso de lavados de alta fuerza/presión. Esta etapa (o etapas) de lavado también pueden hacerse para intercambiar tampones para aumentar las afinidades de unión.

5 En una realización, se usan etapas de lavado para discriminar afinidades de unión de las dianas por la(s) superficie(s) de detección, tanto unión no específica además de unión específica. Es decir, pueden asociarse diferentes microorganismos (además de contaminantes) con la(s) superficie(s) de detección con diferentes afinidades de unión. En algunos casos, pueden usarse etapas de lavado para discriminar entre diferentes entidades, por ejemplo, pueden usarse lavados correspondientes a varias energías de unión (se hace referencia a la Figura 9 del documento U.S.S.N. 10/888.828, que se publicó como US 2005-048599, y la leyenda y discusión correspondientes). Debe observarse que puede usarse el uso de fuerzas electroforéticas en tanto acelerar la reacción, además de en proporcionar discriminación entre material específica y no específicamente unido. Debe entenderse, sin embargo, que en una aplicación dada, pueden usarse ambos usos de las fuerzas electroforéticas que actúan sobre complejos de diana-sonda, o alternativamente, solo uno o los otros de estos usos de fuerzas

15 electroforéticas para el efecto beneficioso.

En una realización, se usan etapas de lavado para proporcionar nuevos nutrientes para condiciones de crecimiento. Es decir, puede haber un sistema de tampón para su uso en la etapa de concentración electroforética que se intercambia después de que se haya producido la unión a la(s) superficie(s) de detección. Alternativamente, el sistema de tampón electroforético es constante, debido al pulso esporádico de la fuerza electroforética durante el crecimiento para mantener las células hija en la proximidad de la célula fundadora, pero los nutrientes para el crecimiento son consumidos, requiriendo intercambio de tampón.

Debe observarse que en la discusión precedente puede usarse el uso de cada anticuerpo u otros marcadores para

25 la identificación en ambas maneras como se ha descrito en cualquier parte en esta memoria descriptiva. Es decir, los microorganismos pueden identificarse con los anticuerpos tanto mediante procesos de tinción, como alternativamente, mediante el uso de diferentes regiones sobre la superficie de captura a la que los anticuerpos específicos están adheridos, y a las que entonces se unirán los microorganismos específicos.

Crecimiento de los microorganismos

Una vez los microorganismos se han asociado a la(s) superficie(s) de detección, ahora crecen con el fin de determinar su viabilidad, características de crecimiento y susceptibilidad a diversos agentes (tales como antibióticos). El crecimiento se produce por la incubación del microorganismo en presencia de un medio adecuado a

35 temperaturas y saturación o agotamiento de oxígeno apropiados (por ejemplo, para bacterias anaerobias o aerobias, dependiendo generalmente de la fuente de la muestra). El medio de incubación se corresponderá en general con las bacterias que se monitorizan -por ejemplo, aspirados de pulmón, muestras de orina y muestras de sangre se incubarían todas con medios que son muy aptos para microorganismos de los orígenes respectivos, como es muy conocido en la técnica. Además, los agentes antimicrobianos que van a probarse para los efectos también son muy conocidos en la técnica, y cambiarán con el descubrimiento de nuevos agentes y a medida que la mezcla de los actuales agentes en uso cambie con la aparición de resistencia.

Como se ha explicado resumidamente en el presente documento, durante el crecimiento de las bacterias, puede ser opcionalmente conveniente aplicar una fuerza electroforética continua o frecuente, con el fin de que el

45 microorganismo hijo o el nuevo microorganismo estén en aproximadamente la misma localización que el microorganismo original del que se derivan. Esto permite la determinación de que los microorganismos originales están creciendo, y permite en segundo lugar la determinación del tipo de microorganismo sin tener que hacer pruebas adicionales (por ejemplo, tinción de anticuerpos).

Debe observarse que la fuerza electroforética experimentada por las bacterias está relacionada inversamente con la conductancia del medio, y por tanto es conveniente tener un medio de crecimiento de baja conductancia. La mayoría de los medios usados para el crecimiento de bacterias, levadura, y otros organismos, sin embargo, generalmente tienen Na+, K+, Mg+2, Cl-, SO4-2, NO3-y otros iones como tanto nutrientes, además de para mantener una fuerza iónica del medio. Es preferible que el medio de crecimiento tenga una conductividad inferior a 5 mS/cm, y más 55 preferible que el medio de crecimiento tenga una conductividad inferior a 2 mS/cm, e incluso más preferible que el medio de crecimiento tenga una conductividad de menos de 1 mS/cm. Debe observarse que estas conductividades son generalmente superiores a las usadas en el movimiento de bacterias y otras moléculas para la concentración de éstas en el electrodo, como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, debido a que los microorganismos hija se crean en o próximos a los electrodos, el movimiento requerido es pequeño en distancia, y se requieren cantidades más bajas de fuerza electroforética. Además, la aplicación de la fuerza electroforética no necesita ser constante, y puede aplicarse intermitentemente, especialmente en aquellos casos en los que el medio de crecimiento no esté bajo movimiento de volumen constante. Debido a la lenta difusión de microorganismos, es preferible aplicar fuerza electroforética cuando el medio no esté en movimiento de volumen no más frecuentemente de cada 10 segundos, e incluso más preferible no más frecuentemente de cada 60 segundos. En general, muchos medios de crecimiento 65 contienen grandes cantidades de sal (por ejemplo, 0,5% de NaCl en caldo L), y se prefiere que esta sal se sustituya por una especie de ión bipolar, tal como alanina o cisteína, que contribuye muy poco a la conductancia. También es

preferible que la intensidad osmótica del medio sea suficientemente alta de manera que las bacterias no experimenten choque osmótico. Pueden usarse para este fin componentes osmóticos no iónicos, tales como glicerol

o sacarosa.

5 El crecimiento positivo indica por sí mismo principalmente la viabilidad del organismo, y posiblemente las velocidades relativas de crecimiento del microorganismo. Sin embargo, también puede usarse para estudiar la susceptibilidad del organismo a diversos agentes antiorganismo como se ha explicado resumidamente en el presente documento, y combinaciones de los mismos. Además, la vinculación clónica de organismos individuales que crecen durante la prueba mejora sustancialmente la sensibilidad y especificidad de ciertas pruebas. Pruebas estadísticas basadas en relaciones clónicas añaden así potencia a las pruebas como se describe en el presente documento.

Detección e identificación de los microorganismos

15 La monitorización de la unión y/o crecimiento del microorganismo puede realizarse para un promedio de todo el material que se une -por ejemplo, midiendo la salida total de luz que es dispersada de una marca que tiene un indicador de dispersión de la luz. Sin embargo, en una realización, si el detector es un detector óptico, y el detector es un detector de obtención de imágenes tal como una cámara o un escáner láser acoplado a un tubo fotomultiplicador, la unión se determina para microorganismos individuales. En este caso, el detector necesitará guardar las localizaciones de cada microorganismo entre detecciones secuenciales y determinar el crecimiento. Se describe varios métodos en el presente documento.

Además, una realización útil de la invención utiliza tanto imágenes de campo brillante como de campo oscuro, ya que la combinación de estas técnicas permite la discriminación de microorganismos de residuos contaminantes. Los

25 residuos frecuentemente parecen similares a las bacterias en el campo oscuro debido a eficiencias de dispersión similares (por ejemplo, el cambio en el índice de refracción multiplicado por el área de dispersión de la sección transversal) a las bacterias, pero en el campo brillante las propiedades de absorción entre bacterias y residuos pueden ser espectacularmente diferentes. Por ejemplo, en muchos casos los residuos son visibles en obtención de imágenes de campo brillante y las bacterias no.

Hay una amplia variedad de métodos adecuados para detectar e identificar microorganismos, que incluyen métodos que incluyen marcas y métodos que no.

Uso de marcas en detección y/o identificación

35 En una realización, la detección de los microorganismos se hace usando marcas detectables que pueden ser tanto específicas como no específicas. Es decir, de la misma manera que para la captura de microorganismos sobre superficie(s) de detección, el marcado de los microorganismos para la detección puede ser específico para el tipo (por ejemplo, especie o género) de microorganismo, o puede ser no específico, por ejemplo, se unirá a varios microorganismos diferentes. Así, el resto de detección tiene dos componentes: un componente de unión y un componente de marca. Los componentes de marca pueden seleccionarse independientemente de los restos explicados resumidamente anteriormente para los ligandos de captura.

Como será apreciado por aquellos en la materia, hay una amplia variedad de marcas disponibles que se adaptarán

45 al tipo de detección usado. Marcas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, indicadores de enzima; marcas ópticas que incluyen, pero no se limitan a, colorantes ópticos, colorantes fluorescentes, fósforos sobreconversores, puntos cuánticos, partículas de dispersión de la luz, partículas absorbentes de luz (por ejemplo, partículas coloreadas), o partículas de contraste de fases (es decir, para conferir diferencias del índice de refracción que pueden visualizarse en un microscopio de contraste de fases o por resonancia de plasmones superficiales), indicadores quimioluminiscentes; indicadores electroquímicos (por ejemplo, redox); indicadores radiactivos, etc. Los fósforos sobreconversores son partículas que convierten luz de frecuencia más baja en de frecuencia más alta (véase Orasure Technologies, Inc. de Bethlehem, PA), y es conveniente usarlos debido a los pocos compuestos naturales que tienen esta propiedad, que conducen generalmente a fondos bajos en ensayos de detección. Los puntos cuánticos funcionan precisamente de la misma forma que los colorantes fluorescentes, pero con un desplazamiento

55 considerablemente más grande entre las frecuencias de excitación y de admisión. Este gran desplazamiento permite el uso de filtros ópticos de eficiencia más alta que reducen la cantidad de ruido de fondo en un ensayo de detección. Un ejemplo de puntos cuánticos es los nanocristales producidos por Quantum Dot Corp. (Hayward, California). Las partículas de visualización directa pueden ser metálicas (por ejemplo, oro), cerámica, vidrio coloreado u otro material opaco o en gran medida opaco y es convenientemente al menos 250 nanómetros, y más preferentemente al menos 500 nanómetros, de manera que es visible mediante microscopía óptica. Un ejemplo de una partícula de dispersión de la luz 294 tal es partículas de dispersión de la luz por resonancia por Genicon (San Diego, California).

Muchos de estos indicadores pueden usarse con sistemas de detección óptica que se corresponden con aquellos del indicador. Así, por ejemplo, fluoróforos, puntos cuánticos y fósforos sobreconversores, iluminación de excitación 65 emparejada (por ejemplo, iluminadores de excitación láser o de amplio espectro con filtros paso bajo) y detectores específicos de emisión (por ejemplo, de filtros paso bajo) se utilizan junto con sistemas de obtención de imágenes

apropiados (por ejemplo, cámaras con o sin ópticas de aumento). Las partículas de dispersión de la luz usarán frecuentemente iluminación incidente oblicua (incluyendo condensadores de campo oscuro estándar) o iluminación evanescente, o pueden alternativamente usar óptica de contraste de fases, ya que las partículas con diferencia suficiente en el índice de refracción que dan lugar a efectos ópticos de fases también darán lugar a dispersión de la 5 luz. Además, las partículas de contraste de fases también serán generalmente visibles en resonancia de plasmones superficiales. Puede usarse microscopía de fases para partículas de contraste de fases, y pueden usarse partículas de absorción de luz y reacciones enzimáticas en tanto microscopía de contraste de fases como obtención de imágenes de campo brillante (por ejemplo, con obtención de imágenes microscópica u otras formas de aumentos). La quimioluminiscencia puede detectarse con aumentos y detectores apropiados dispuestos para tener la

10 receptividad apropiada para la señal quimioluminiscente. Las descripciones anteriores no son exhaustivas, y se desvela en el presente documento que hay otras combinaciones de indicador y detector.

QM puede usar técnicas tales como unión por afinidad para identificar organismos individuales por especies. En una realización, el propio agente de captura superficial es un agente de afinidad específico (tal como un anticuerpo)

15 inmovilizado en una zona distinta mapeada sobre una superficie de observación. Una pluralidad de tales zonas de captura distinta proporciona entonces una matriz de diferentes agentes de afinidad dirigidos a diferentes especies o grupos microbianos. Después de la captura y lavado riguroso para eliminar materiales no específicamente adsorbidos, los organismos que quedan sobre cada zona son aquellos contra los que se dirige el agente de captura específico de zona. El mapa de la zona revela la identidad.

20 Por ejemplo, un "panel" o conjunto específico de especies bacterianas para un presunto tipo de infección podría incluir Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, etc. Una matriz de QM consistiría entonces en anticuerpos de alta afinidad, aptámeros, u otros agentes de unión de afinidad desarrollados contra estas especies particulares e inmovilizados sobre la superficie analítica, cada uno en

25 una zona distinta, según un esquema de mapeo, tal como una disposición lineal en la secuencia precisamente descrita.

Como se describe además más adelante, con el fin de detectar los organismos capturados, un detector de QM usa un dispositivo tal como un microscopio digital que proporciona imágenes electrónicas adecuadas para el análisis por 30 un ordenador. El programa de análisis de imágenes analiza entonces cada imagen según algoritmos desarrollados con el fin de identificar organismos individuales. A medida que el ordenador analiza las imágenes para cada zona mapeada, puntúa los eventos de reconocimiento de organismos, registra su identidad en virtud de la identidad de zona que se analiza, y registra sus coordenadas espaciales. El sistema QM crea así un mapa espacial de cada organismo identificable, enlazando implícitamente cada localización de organismo con su identidad de grupo, tal

35 como la especie.

Esta forma de mapeo se produce muy rápidamente durante o inmediatamente después de la captura usando computación de alta velocidad. Por tanto, añade tiempo insignificativo al análisis.

40 En una realización adicional, como se describe en el presente documento, el agente de captura no es específico, pero captura todos los organismos en una única zona distinta de agente de unión inmovilizado. En este modo, un agente de captura tal no permite la identificación directa, como lo hace la forma de matriz mapeada.

En su lugar, en un aspecto, este modo de QM se aplica a agentes específicos, tales como aquellos descritos para la

45 captura mapeada, pero en solución o suspensión libre y conjugados con un resto medible tal como un colorante fluorescente, partícula dispersora de la luz, etc. Después de la exposición a los organismos capturados, incubación breve y lavado, las marcas de afinidad siguen unidas a sus ligandos relacionados o dianas. El detector de QM se diseña para identificar tales marcas a la escala de organismos individuales, operando en cierto modo como aquel descrito para el modo de análisis de imágenes de captura específica, que incluye mapear la localización de cada

50 organismo y su identidad de grupo.

Esta etapa de marcado y análisis normalmente requiere considerablemente menos de treinta minutos para completarse.

55 Además, el crecimiento negativo (por ejemplo, necrosis) puede determinarse usando tinciones mortales como se ha explicado resumidamente en el presente documento.

Métodos que no se basan en marcas

60 Para la detección de microorganismos que no se basan en el uso de marcas (tanto ligandos de captura como ligandos de marca), en general se usan técnicas ópticas, como se ha explicado resumidamente en el presente documento, para monitorizar el crecimiento, que incluye crecimiento positivo, neutro y negativo.

Ensayos antimicrobianos y QM

Aproximadamente la mitad de los antibióticos requieren bacterias que estén activamente en el ciclo (crecimiento positivo) con el fin de ejercer su efecto antimicrobiano. Por tanto, antes de la aplicación de AOA como se describe en

5 lo sucesivo, es generalmente preferible, al menos para aquellos AOA para los que se necesita el crecimiento positivo, que los microorganismos se cultiven durante al menos una, y preferentemente dos o más divisiones celulares, antes de la administración de AOA. Estas divisiones celulares pueden monitorizarse directamente por análisis de la imagen como se describe en cualquier parte en esta memoria descriptiva.

10 En el caso más simple, esto implica la incubación del organismo en una concentración constante de agente antiorganismo (AOA), y determinar la velocidad de crecimiento y/o la velocidad de muerte del organismo. La Fig. 33E muestra cómo se realizaría esto como se describe en el presente documento. En la Fig. 33D, las bacterias 830, 835 y 840 han sido específicamente unidas a superficies de captura 820. Después de un periodo de incubación en una concentración de un AOA en un medio de crecimiento (indicado por punteado por luz), las bacterias 840 han

15 aumentado en número, y las bacterias 830 y 835 no, que indica que las bacterias 840 no son susceptibles a AOA a la concentración usada, y que las bacterias 830 y 835 son susceptibles a las concentraciones de AOA usadas. Debe observarse que las bacterias 835 son del mismo tipo que las bacterias 830, excepto que están muertas. Dada una tinción mortal o vital, por tanto, puede determinarse que las bacterias 830 no han sido aniquiladas por la concentración de AOA, que indica o bien que el AOA previene el crecimiento positivo pero no aniquila las bacterias

20 830, o que a las concentraciones usadas AOA solo actúa deteniendo el crecimiento positivo (crecimiento neutro).

En la Fig. 33F, la concentración de AOA aumenta, y el número de bacterias 840 sigue aumentando, que indica que las bacterias 840 no son susceptibles a las bacterias incluso a esta concentración. Sin embargo, ahora las bacterias 830 han sido aniquiladas (indicado por las bacterias muertas 835), que indica que a esta concentración AOA es letal.

25 Así, como se indica en las Fig. 33E-F, usando concentraciones crecientes de AOA en el medio de crecimiento, puede determinarse la respuesta de concentración de las bacterias a AOA. Claramente, aumentando la cantidad de AOA en las etapas durante un periodo de tiempo, puede determinarse una concentración mínima inhibitoria (CMI). Además, debido a que la viabilidad de las bacterias también puede determinarse a cada concentración, también puede determinarse una concentración mínima bactericida (CMB).

30 Debe observarse que organizaciones tales como el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) han normalizado procedimientos rigurosos para determinar la CMI usando métodos estándar de oro y han hecho circular un borrador de propuesta para normalizar procedimientos para determinar la CMB.

35 Debe observarse que la detección del crecimiento (incluyendo la viabilidad) a diferentes concentraciones de AOA puede realizarse tanto usando una serie de cámaras 805 en la célula 804, cada una de las cuales expone las bacterias a una concentración específica de AOA, como alternativamente, aumentando la concentración dentro de una cámara 805 dada. En el primer caso, el tiempo de respuesta de las bacterias puede ser fácilmente establecido, además de la respuesta persistente de las bacterias una vez se ha eliminado el AOA (por ejemplo, un efecto post

40 antibiótico). Es decir, las bacterias también pueden exponerse a una concentración dada de AOA durante un breve periodo, y entonces sustituirse el medio con un medio que carece de AOA, y el crecimiento de las bacterias puede monitorizarse con el tiempo.

Como se ha descrito anteriormente, de manera que no se usen cámaras 805 separadas para cada concentración

45 diferente de AOA, la concentración de AOA dentro de una cámara 805 puede aumentarse con el tiempo. Las Fig. 38A-B son gráficos de la respuesta de las bacterias a un cambio de las concentraciones de AOA. En la Fig. 38A, la concentración de AOA aumenta con el tiempo, generalmente según un aumento exponencial con el tiempo, aunque también es conveniente que la concentración aumente linealmente o según otras relaciones de concentración/tiempo, que incluyen funciones de etapa que aumentan la concentración; estas funciones de etapa

50 pueden ponerse a intervalos de concentración regulares, o alternativamente a concentraciones estándar como se indica o sugiere por las normas de los laboratorios clínicos como podrían ser establecidas por organizaciones tales como el National Committee for Clinical Laboratory Standards. El sistema se usa entonces para determinar el número total de bacterias, el número de bacterias muertas y el número de bacterias vivas (como se ha descrito anteriormente, dos cualesquiera de estos números da lugar al tercer número).

55 La relación del efecto de AOA con el crecimiento de microorganismos tiene muchos significados diferentes en el uso convencional. Por ejemplo, el LLOD visual para el método de microdilución del manual ASM podría requerir que el inóculo de 5x104 UFC por pocillo (concentración de aproximadamente 5x105 UFC/ml) creciera a aproximadamente 1x106 UFC (1x107 UFC/ml, citado por M. Mueller et al., Antimicrob. Agents Chemother., 48:369-377, 2004). Esta

60 cantidad de aumento representa el crecimiento positivo neto de aproximadamente un factor de veinte veces dentro del periodo de observación. Hallazgos negativos incluirían cualquier cantidad inferior a esta. En este contexto, sería preferible declarar que se produjo inhibición del crecimiento positivo si el cambio de la población total neto, durante un periodo homólogo, fuera inferior al factor de veinte veces la población inicial. Velocidades de crecimiento positivo inferiores a la puntuación umbral como "inhibición del crecimiento" y velocidades más altas puntúan como fallo del

65 fármaco.

El momento en el que el número total de bacterias no continúa aumentando, indicado en la Figura a la concentración A, se considera que es una concentración mínima que inhibe el crecimiento positivo bacteriano (CMI). El momento donde el número de bacterias vivas empieza a disminuir (a la concentración B) se considera que es una concentración mínima que es bactericida (CMB). Debe observarse que las CMI y CMB reales pueden ser más bajas

5 que las concentraciones A y B, respectivamente, y solo serán las CMI y CMB en aquellos casos en los que la velocidad de aumento en la concentración sea muy baja con respecto al crecimiento positivo de las bacterias. Así, dado que se desea que CMI y CMB de AOA se determinen dentro de un factor de X, es preferible que la concentración de AOA aumente un factor de X no más rápido que la mitad del tiempo de duplicación de las bacterias en las condiciones de incubación que carecen de AOA, y es más preferible que la concentración de AOA aumente un factor de X no más rápido que el tiempo de duplicación de las bacterias, y es lo más preferible que la concentración de AOA aumente un factor de X no más rápido de dos veces el tiempo de duplicación de las bacterias. Debe observarse que las CMI y CMB generadas usando estos métodos pueden no correlacionarse exactamente con las CMI y CMB estándar definidas por organizaciones tales como el NCCLS.

15 El menos crecimiento positivo de las bacterias requerido con el fin de de que haya alta confianza de que el crecimiento positivo se ha producido reducirá el tiempo necesario para realizar una prueba. Monitorizando bacterias individuales, puede observarse crecimiento positivo con la duplicación de solo un pequeño número de bacterias. Es decir, si se considera el volumen como en los ensayos de turbidez convencionales, por ejemplo, el límite de sensibilidad de detectar crecimiento positivo bacteriano está limitado por la relación señal con respecto a ruido en la medición de turbidez. Sin embargo, la fisión de una bacteria es un evento distinto que puede detectarse, aunque esa bacteria sea una de los muchos miles de bacterias. Así, la presente invención pueden tener una sensibilidad muy alta, con el sistema preferentemente capaz de detectar la duplicación de menos del 25 % de las bacterias, más preferentemente capaz de detectar la duplicación del 10 % de las bacterias, y lo más preferentemente capaz de detectar la duplicación del 5 % de las bacteria. Obsérvese que el tiempo de duplicación para una fracción de las

25 bacterias puede estar tanto predeterminado (por ejemplo, por calibración en un laboratorio con especímenes experimentales), como más preferentemente, comparando las bacterias en ausencia de AOA con aquellas en presencia de AOA – esto hace que los resultados se controlen internamente.

Los puntos de corte de medición para determinar la susceptibilidad a antibióticos pueden expresarse, como se trata anteriormente, en términos absolutos, tales como la duplicación de un porcentaje dado de las bacterias. Sin embargo, el número de bacterias requeridas para hacer un criterio estadísticamente válido puede ser dependiente del número de bacterias presentes en la muestra. Por ejemplo, si hay solo 10 bacterias presentes en cada cámara, que demuestra que una duplicación de una única bacteria representa el 10 % de la muestra. Alternativamente, con números muy grandes de bacterias sobre la superficie (por ejemplo, superiores a 100.000), la duplicación de incluso

35 1.000 bacterias (es decir, el 1 %) es normalmente estadísticamente significativa. Así, es en muchos casos preferible analizar el número de bacterias requeridas para mostrar que la duplicación en la condición de control (es decir, medio de crecimiento ausente el AOA) con respecto al número de bacterias que muestran duplicación en la condición experimental (es decir, medio de crecimiento con el AOA) es estadísticamente relevante. Por ejemplo, un método convencional sería aplicar una prueba de la chi al cuadrado a estos dos números, y decidir si los resultados cumplen una probabilidad particular de significancia. En general, es preferible que esta probabilidad sea inferior a 0,05, e incluso más preferible que esta probabilidad sea inferior a 0,025 y lo más preferible que esta probabilidad sea inferior a 0,01. Debido a que números pequeños de bacterias no permitirán probabilidades de la chi al cuadrado muy pequeñas, los niveles de probabilidad pueden ser convenientemente reducidos para casos de números muy pequeños de bacterias (por ejemplo, inferiores a 20 bacterias viables en el control de medio de crecimiento).

45 Debe entenderse que el tiempo de duplicación de las bacterias es un fenómeno de la población, y que dentro de una población de bacterias, algunas bacterias se dividirán más rápidamente que otras. Esto podría ser debido tanto a ligeras diferencias genéticas en una población como a efectos puramente estadísticos. Sin embargo, también puede ser debido a la etapa en la que cada bacteria está creciendo durante su recogida o preparación, ya que las bacterias presentarán tiempos de latencia sustancialmente diferentes en su crecimiento positivo cuando se pongan en medio nuevo dependiendo de esa etapa. Mientras que un periodo de tiempo más largo va generalmente a proporcionar más información sobre las características del crecimiento y la susceptibilidad a AOA de las bacterias, hay una necesidad de suministrar al personal médico información sobre las bacterias y su susceptibilidad a AOA. Dado que los tiempos de latencia para la mayoría de las bacterias de interés son del orden de 2-6 horas, y el tiempo de

55 duplicación de las bacterias es generalmente 1-2 horas, es preferible para las mediciones de crecimiento bacteriano y susceptibilidad a AOA usar detección de las bacterias a no más de 8 horas, y más preferentemente menos de 6 horas. Aunque no todas las bacterias en una muestra tienen una oportunidad de demostrar duplicación, la tendrá una fracción suficientemente grande de aquellas bacterias, de manera que serán capaces de indicar susceptibilidad.

En este caso, es útil tener toda la información disponible para las bacterias individuales con respeto a la tinción vital y/o mortal (que indica bacterias vivas frente a muertas), además de crecimiento en presencia de medio de crecimiento con y sin la presencia de AOA. Cualquier observación en la que la fracción de bacterias vivas disminuye por una primera fracción predeterminada en presencia de AOA, o en la que el crecimiento positivo de bacterias (demostrado tanto por las duplicaciones como por los aumentos en el tamaño de las bacterias) disminuye por una 65 segunda fracción predeterminada en presencia de AOA, se demuestra por la acción de AOA. En general, la primera fracción determinada, debido a su evidencia de mayor muerte, generalmente será más pequeña que la segunda

fracción predeterminada. Un valor preferible de la primera fracción predeterminada es el 20 %, y un valor más preferible es del 33 %, y el valor más preferible es del 50 %. Un valor preferible para la segunda fracción predeterminada es el 50 %, y un valor más preferido es el 66 %, y un valor más preferido es el 80 %.

5 Como se indica anteriormente, la mayoría de los estudios sobre la susceptibilidad de AOA se refieren a la concentración a la que se encuentra un efecto particular, en vez de la cinética específica y efectos que se observan. Es decir, en pruebas convencionales, las bacterias se exponen normalmente a varias concentraciones diferentes (o incluso concentraciones cambiantes) de AOA para determinar la concentración a la que las bacterias presentan muerte o velocidades reducidas de crecimiento positivo, a partir de las que se determinan CMI o CMB según normas establecidas de organizaciones como el NCCLS. Considerar, por ejemplo, una prueba de antibiótico convencional empleando una placa de agar con un disco de antibiótico. Alrededor del disco están colonias de diversos tamaños, que representan no simplemente muerte, sino crecimiento más lento en presencia de concentraciones diferentes de antibiótico. Por esta medida, la CMI no es fácil de definir, ya que incubar las placas durante un periodo de tiempo prolongado permitiría que las colonias se parecieran a concentraciones que se consideran inhibitorias.

15 Sin embargo, tanto desde un punto de vista del tiempo como del coste, puede ser conveniente en algunos casos exponer en su lugar las bacterias a dosis constantes únicas de AOA, y entonces observar el efecto específico y la velocidad de efecto del fármaco, con el fin de determinar la susceptibilidad. En la presente invención, puede proporcionarse una dosis constante de AOA, y la velocidad a la que las bacterias se aniquilan, o el grado al que se reduce su crecimiento positivo, puede usarse para calibrar los probables efectos a una multiplicidad de dosis terapéuticas. Estas respuestas pueden describirse con nuevas medidas del efecto de AOA, tales como el tiempo de duplicación bacteriano en presencia de un AOA dividido entre el tiempo de duplicación bacteriano en ausencia de AOA. En este caso, para bacterias que son resistentes a un AOA, pero cuyo tiempo de duplicación se triplica en presencia de AOA, el tratamiento con el AOA puede todavía ser significativo. Estos valores pueden proporcionarse

25 tanto a una dosis única, como a múltiples dosis. Hasta el punto que pueden aislarse y estudiarse bacterias de diferentes niveles de susceptibilidad, la información a una o más concentraciones de AOA puede ser entonces útil en predecir la respuesta a otras concentraciones.

En un homólogo directo a la prueba susceptible a antibiótico convencional, una realización usa exposición a fármaco en dos puntos de ruptura para cada par de especie/fármaco como se especifica por la publicación M100-S15 del Clinical and Laboratory Standards Institute (www.clsi.org). Esta versión no proporciona CMI, sino que proporciona categorización de SIR (susceptible, intermedio, resistente). El homólogo de CMI usa análisis paralelos a diluciones de duplicación, en el mismo intervalo y modo que el ensayo de microdilución convencional. Sin embargo, la realización puede usar la respuesta a la velocidad de crecimiento de organismos individuales como en la variación

35 de SIR.

Además de los homólogos de AST convencional, los métodos de la presente invención también pueden usar una alta concentración de fármaco (muy por encima del punto de ruptura de CLIS superior) para revelar clones resistentes más pequeños. La concentración exacta para cada par de especie/fármaco se determina basándose en el modo de acción del fármaco. Por ejemplo, la prueba de provocación de resistencia para antibióticos betalactámicos usa concentraciones por encima del punto de ruptura superior, pero por debajo de la concentración a la que se produce el llamado "efecto paradójico" o "efecto de Eagle".

En la prueba de provocación, la concentración de fármaco debe detener rápidamente el crecimiento positivo en

45 todos los fundadores y clones. Sin embargo, si células individuales continúan dividiéndose repetidamente dentro de clones individuales, el análisis detecta rápidamente el fallo del fármaco e informa del número y la proporción de clones minoritarios que presentan resistencia.

La presente invención incluye al menos dos formas que proporcionan sensibilidad sustancialmente más alta para la detección de resistencia que es ahora posible usando otros métodos. Primero, los métodos analizan sustancialmente todos los organismos o un número muy grande (al menos 1.000, y preferencialmente superior a 10.000) de organismos a partir del espécimen original. Métodos de cultivo estándar normalmente usan solo aproximadamente 3 a 20 organismos originales, que se seleccionan después de enriquecimiento y aislamiento. Por tanto, QM elimina el error de muestreo inherente a los métodos de cultivo estándar.

55 Adicionalmente, en algunas realizaciones, los métodos de QM de la presente invención usan la prueba de provocación con estadística de clones individuales para identificar incluso un único clon resistente. QM usa la vinculación de células individuales, en virtud de su derivación clónica, para aumentar estadísticamente la sensibilidad analítica.

Por ejemplo, los métodos de QM puede detectar un único clon resistente contra un fondo de 10.000 clones (0,01 %

o 100 partes por millón) o más que son susceptibles. Métodos convencionales que usan, por ejemplo, cepas clínicas de colonias que representan 10 UFC de fundadores pueden en promedio detectar solo un fundador resistente en 10,

o 10 % de sensibilidad de detección. Entre otros motivos, este error de muestreo ayuda a explicar el mal registro

65 clínico de métodos de cultivo estándar para detectar el "crecimiento críptico" (cepas minoritarias resistentes invisibles) o "persistidoras" como es muy conocido en la bibliografía de investigación clínica.

QM usa los recuentos de mortalidad periódica para calcular una llamada "curva de tiempo-aniquilación" (TK) con gran precisión y diferenciada según respuestas del clon componente. La respuesta del clon para resistencia se basa en la probabilidad de divisiones celulares individuales en una agrupación celular contigua en comparación con la población promedio o agrupación estadística más susceptible independiente de la probabilidad de aniquilación de

5 células. Cuando la velocidad de crecimiento positivo dentro de una agrupación de células contiguas supera estadísticamente la de la velocidad de referencia de alrededor, QM puntúa el clon como resistente.

QM analiza agrupaciones estadísticas de velocidades de aniquilación (por clon) y suma los datos para determinar la velocidad de aniquilación total. Las curvas de tiempo-aniquilación (TK) para cada par de especie/fármaco tienen formas estadísticamente estereotípicas. Por tanto, los métodos de QM usan los primeros puntos de datos de tiempoaniquilación estadísticamente significativos para seleccionar la curva de referencia correspondiente, y entonces la velocidad de aniquilación máxima para esa curva patrón. QM informa esta velocidad de aniquilación máxima (logaritmo del número máximo de células aniquiladas por hora).

15 Además, las curvas patrón de TK se correlacionan con la CMI como se determina usando métodos de AST de cultivo estándar. Habiendo seleccionado la curva patrón de TK de ajuste óptimo, el método QM busca entonces la CMI correspondiente y la informa.

Los métodos de QM requieren solo algunas horas para completarse debido a su capacidad para predecir puntos finales basados en las respuestas de células y clones individuales. Además, los métodos de QM informan datos que tienen capacidad mucho más predictiva que el valor de CMI estándar solo. Por ejemplo, el fármaco clínicamente óptimo para usar en el tratamiento de una infección es aquél que aniquila patógenos más rápidamente y con las menores divisiones celulares intermedias antes de la erradicación.

25 La CMI sola no proporciona esta información. Dados dos o más fármacos que tienen CMI perfectamente dentro del intervalo de susceptibilidad, el médico debe determinar cuál de ellos es más probable que erradique la infección y aniquile los patógenos más rápidamente. La CMI no contiene esta información. QM, a diferencia, proporciona datos de comparación directa para todos los parámetros clínicamente útiles.

Debe observarse que los efectos de AOA sobre el crecimiento positivo (por ejemplo, tiempo de duplicación), además de información referente a la velocidad de muerte de microorganismos, proporcionan información suficiente para predecir resultados en el formato de prueba de NCCLS normalizada. Por ejemplo, la determinación de CMI de la microdilución de caldo de NCCLS implica la exposición de un inóculo normalizado a una concentración de AOA durante un periodo de tiempo definido bajo entorno rigurosamente controlado. La susceptibilidad de un organismo se

35 define como la concentración mínima a la que el crecimiento positivo del microorganismo se impide por debajo del límite de detección umbral. Así, dado un AOA, que afecta la velocidad de crecimiento positivo de microorganismos, solo tiene una velocidad de crecimiento crítica a la que por encima de esta concentración el organismo superará el umbral para el crecimiento positivo detectable. Adicionalmente, y AOA que afecta la viabilidad de organismos y no la velocidad de crecimiento de organismos, tendrá un umbral de viabilidad crítico al que un organismo no superará el umbral para el crecimiento positivo detectable. Además, es probable que el AOA afecte tanto la velocidad de crecimiento positivo como la viabilidad de una población de organismos. Por tanto, la correlación de antes mencionó mediciones cinéticas de velocidades de crecimiento positivo y la viabilidad con métodos de CMI y CMB de NCCLS normalizado puede ser predicha a partir del modelado del crecimiento positivo de bacterias y el modelado de la viabilidad.

45 Debe observarse que la concentración de AOA en un ser humano o animal se determina por la cantidad y frecuencia de tratamiento (por ejemplo, inyección), además de la farmacocinética de AOA. En muchos casos, las farmacocinéticas son muy conocidas para seres humanos libres de enfermedad, y pueden modelarse basándose en el estado médico conocido (por ejemplo, insuficiencia hepática) de la persona que se monitoriza. Usando esta información, puede estimarse la concentración de AOA con el tiempo en el órgano diana (por ejemplo, sangre, vías urinarias, pulmones). Esta concentración de AOA puede aproximarse en la cámara mezclando medio con AOA en partes relativas con medio que carece de AOA, para producir el perfil estimado de AOA tal como que se muestra en la Fig. 38B. En general, la concentración de AOA aumentará, llegará al máximo, y entonces disminuirá exponencialmente. Como antes, el número total de bacterias, las bacterias muertas y las bacterias vivas pueden

55 monitorizarse con el tiempo. En este caso, los parámetros farmacodinámicos CMI y CMB no están muy definidos, ya que se está considerando la respuesta a las bacterias que incluyen la farmacocinética de AOA, y se considera, por tanto, a la dosis mínima inhibitoria y la dosis mínima bactericida realizando duplicados del sistema a diferentes dosis, y entonces monitorizando si el perfil de concentración de AOA global produce el cese del crecimiento positivo o la muerte de las bacterias. Debe observarse que mientras que el análisis de la Fig. 38B solo se ocupa de una dosis única de AOA (es decir, aumento, pico, disminución), también es posible continuar el análisis con la dosis secuencial de AOA como se usaría frecuentemente en el tratamiento (por ejemplo, inyección 4 veces al día).

Debe observarse que los métodos de la presente invención pueden aplicarse no solo a la respuesta de organismos a AOA, sino también a la respuesta a otras condiciones, tales como otros agentes bioactivos, que incluyen 65 hormonas, fármacos (por ejemplo, para la prueba de sensibilidad a fármaco), agentes medioambientales u otros. Estos agentes pueden así analizarse, en tanto que la respuesta sea detectable por el detector empleado. En muchos

casos, puede requerirse una tinción de algún tipo con el fin de hacer visible la respuesta a la condición.

En la discusión anterior, el momento preciso de la aplicación de AOA puede estar relacionado tanto con el momento en el que las bacterias se ponen primero en medio de crecimiento, como alternativamente con el momento en el que 5 se detecta por primera vez el crecimiento positivo bacteriano (por ejemplo, mediante cambios en el tamaño de las bacterias, o la presencia de células hijas). En el último caso, el crecimiento positivo puede monitorizarse continuamente, y añadirse AOA a la incubación en un momento tal en el que se determina que se ha completado el tiempo de latencia. La finalización del tiempo de latencia generalmente será aquél momento en el que alguna fracción predeterminada de células haya mostrado signos de crecimiento positivo, que es preferentemente inferior al

10 50 % de las células, y más preferentemente inferior al 30 % de las células, y lo más preferentemente inferior al 20 % de las células.

Como se ha descrito anteriormente, una característica de la microbiología cuántica (QM) es el uso de microorganismos individuales como una unidad importante de análisis. Haciendo el análisis en el microorganismo 15 individual, surgen varias ventajas. Por ejemplo, el tiempo necesario para cultivar los microorganismos en grandes números (por ejemplo, para el recuento sobre una placa de agar) requiere tiempo considerable, que puede no estar disponible para la ventana de tratamiento para ciertas afecciones médicas. Además, el análisis de grandes números de organismos hace más problemática la detección y el análisis de pequeños números de microorganismos resistentes en la población. Además, con ciertos tipos de análisis (por ejemplo, la aparición de colonias sobre una

20 placa de agar), es difícil distinguir a veces la mortalidad de microorganismos de efectos que aumentan el tiempo de duplicación para el crecimiento de microorganismos, o que actúan deteniendo el crecimiento positivo, pero no aniquilando los microorganismos (por ejemplo, crecimiento neutro).

En QM pueden hacerse observaciones en cuatro entidades diferentes, algunas veces simultáneamente. Estas 25 entidades son:

microorganismos individuales, tanto aislados como presentes como una parte de una entidad más grande (por ejemplo, un clon o una población, como se describe a continuación),

30 clones, que representan la progenie de un microorganismo individual, o de una UFC, que pueden comprender una agrupación de microorganismos físicamente asociados.

cepas, que representan todos los microorganismos que reaccionan con el mismo anticuerpo específico de cepa u otro método de identificación de cepas. La designación de cepas puede comprender serotipos de especies

35 individuales, serotipos de todas las especies, serotipos de todos los géneros, Gram-positivas o negativas, o cualquier subconjunto similar de microorganismos que pueda distinguirse como se describe en los métodos anteriores.

poblaciones, que comprenden la totalidad o un subconjunto de microorganismos individuales y clones, todos los 40 cuales se derivan de la misma muestra médica (por ejemplo, una muestra de lavado):

Debe observarse que un microorganismo individual, cuando se divide en dos durante la división celular, crea dos microorganismos en los que, debido a que la división es en gran medida en dos partes aproximadamente iguales, es frecuentemente difícil marcar al padre y al "hijo". Más bien, los dos microorganismos son 45 "hermanos". Lo más conveniente en general con respecto a QM para seguir un microorganismo individual particular es solo formar división a división, y los microorganismos hermanos resultantes pueden considerarse nuevos individuos. Así, en una base de datos de microorganismos que se cultivan y miden por la presente invención, un microorganismo dado no es de existencia continua, sino que se origina en la división de su progenitor, y cuya existencia se considera al fin en su división. Alternativamente, en una división celular,

50 puede considerarse que uno de los microorganismos es la existencia continuada del progenitor (por ejemplo, el más grande de los microorganismos, o el microorganismo que más se solapa en posición con la posición del progenitor), y considerarse que el otro microorganismo resultante de la división es el microorganismo "hijo".

55 Aunque pueden distinguirse microorganismos individuales por su tamaño, forma y otras características a partir de una imagen microscópica, las relaciones clónicas son más difíciles de establecer. Por ejemplo, mientras que dos microorganismos que son físicamente contiguos pueden representar miembros de un único clon, pueden representar alternativamente dos microorganismos que están accidentalmente físicamente adyacentes. Así, para establecer relaciones clónicas verdaderas, es preferible tener una serie de imágenes microscópicas con el tiempo, en las que la

60 aparición de dos microorganismos en la localización donde había sido visto solo un microorganismo es indicativa de una relación de hermanos. Esta relación puede establecerse más fuertemente incluso, en la medida en la que el volumen del microorganismo "padre" puede aumentar con el tiempo, con una disminución brusca en el volumen que coincide con la aparición de un nuevo microorganismo hermano. Debe observarse que el volumen del microorganismo no se medirá en general directamente, sino en términos del área aparente en una imagen

65 bidimensional.

Debe observarse que algunas especies tienen morfología de agrupación multicelular estereotípica, tal como agrupaciones tipo uva para Staphylococcus aureus o cadenas tipo perla de diplococos de Streptococcus pneumoniae. Por tanto, es conveniente convertir recuentos viables individuales en equivalentes de UFC, ya que éstos son más parecidos a las mediciones convencionalmente determinadas, suponiendo que cualquier agrupación

5 contigua que incluye uno o más individuos viables cuenta como una UFC.

Cuando se hacen observaciones de microorganismos individuales, se establece la posición del microorganismo. Es importante para esta y otras mediciones descritas más adelante que se mantenga la posición absoluta del campo de microorganismos, incluso debe si el espécimen de prueba en el que se hacen las mediciones se mueve de vez en cuando con respecto al sistema óptico y de obtención de imágenes. Esta posición absoluta puede mantenerse mediante, por ejemplo, el uso de marcas de calibración ópticas en el espécimen de prueba. Además de la posición de un microorganismo, puede observarse la identidad de la cepa (como se establece, por ejemplo, por la identificación del microorganismo por una preparación de anticuerpo marcado, como se ha descrito anteriormente). Además, puede establecerse el tiempo de duplicación del microorganismo en ausencia de un AOA, por ejemplo,

15 buscando la aparición de hermanos clónicos (especialmente cuyo aspecto coincide por una disminución en el volumen aparente del microorganismo). Mientras que este tiempo de duplicación puede mantenerse para cada generación individualmente, esta información se mantiene preferentemente como una media o intervalo medio de tiempo entre duplicaciones. Dado que puede haber un tiempo de latencia en el crecimiento positivo inicial del microorganismo, que sería demostrado como un tiempo de duplicación inicialmente largo, el promedio estadístico (por ejemplo, media, mediana) puede mantenerse para solo las N últimas duplicaciones (por ejemplo, manteniendo un promedio o mediana de ejecución), donde N es preferentemente inferior a 5, y más preferentemente inferior a 3.

El tiempo de duplicación normalmente se mide con respecto a la población de microorganismos, en el que el número de microorganismos se mide en momentos diferentes (generalmente a intervalos fijos). Con respecto a medir el 25 tiempo de duplicación de un microorganismo individual particular, pueden emplearse diferentes métodos. En un primer método, la observación repetida del microorganismo individual permite determinar la diferencia en el tiempo entre la división celular previa que da lugar al microorganismo individual como la división celular resultante del microorganismo individual. Esto dará una medición del tiempo de duplicación del microorganismo a dentro de aproximadamente el intervalo de tiempo de observación (es decir, más o menos la mitad del intervalo en cada tiempo límite entre divisiones). Si las observaciones se hacen cada minuto o dos, esto proporcionará una estimación precisa del tiempo de duplicación. Sin embargo, si las observaciones se hacen menos frecuentemente (por ejemplo, cada 15 minutos), entonces la incertidumbre del tiempo de duplicación individual puede ser una fracción grande del tiempo de duplicación actual. Sin embargo, estos números, cuando se suman para varios microorganismos – tanto en un clon, una cepa, como una población total, darán como promedio una medición altamente precisa del tiempo de 35 duplicación de la entidad que se mide, incluso con relativamente pocos microorganismos individuales (como en un clon). Esta afortunada característica significa que los tiempos de duplicación de microorganismos individuales pueden monitorizarse y guardarse, antes de la asignación del microorganismo a una entidad más grande particular. Por ejemplo, considerar dos sub-cepas de un microorganismo que están inicialmente marcadas como que son la misma entidad (por ejemplo, mediante la tinción de anticuerpo). Sin embargo, algún momento después, podría determinarse que hay en realidad dos subcepas diferentes dentro de la cepa, que se distinguen, por ejemplo, por su susceptibilidad a AOA. En este caso, habiendo guardado los tiempos de duplicación de los microorganismos individuales, ya que pueden ser asignados retrospectivamente a las sub-cepas, los tiempos de duplicación de estas sub-cepas pueden reconstruirse desde el principio de las observaciones. Debe observarse que esta discusión con respecto a los tiempos de duplicación también se refiere a otras mediciones de crecimiento y muerte cinética, tales

45 como las curvas de tiempo-aniquilación.

Es de particular interés monitorizar el comportamiento del microorganismo en presencia de un AOA. Después de la adición del AOA al caldo de crecimiento, observaciones que pueden hacerse incluyen el nuevo tiempo de duplicación del microorganismo, y la viabilidad o mortalidad del microorganismo (donde la viabilidad y/o la mortalidad se monitorizan como se ha descrito anteriormente). Esta información se mantendrá en general como un tiempo absoluto o tiempo con respecto a la introducción del AOA. El tiempo de duplicación, debe mencionarse, generalmente no cambiará súbitamente a un estado final, pero puede cambiar durante un periodo de tiempo. En general, esto puede modelarse como un aumento en el tiempo de duplicación que se aproxima al tiempo de duplicación "final" asintóticamente (y que frecuentemente puede modelarse como un enfoque exponencial), que

55 permite que el tiempo de duplicación final sea aproximado con solo algunos puntos de datos.

Otro parámetro de uso considerable que está disponible a partir de las observaciones anteriores es el momento en el que el AOA aniquila al microorganismo, que puede medirse tanto por la pérdida de viabilidad como la aparición de mortalidad, generalmente observada mediante el uso de tinciones como se ha descrito anteriormente. Este número puede ser de interés considerable médicamente, ya que la aniquilación elimina la posibilidad tanto de la aparición de resistencia como de crecimiento positivo debido a periodos en la concentración farmacodinámica dependiente del tiempo del AOA que se encuentra por debajo de algún umbral de forma que se deje crecer el AOA.

Con respecto a los clones de microorganismos, pueden hacerse observaciones similares. Por ejemplo, la posición

65 del clon puede observarse, además de la identidad de la cepa de los microorganismos que comprenden el clon. Esta posición puede incluir varios parámetros relacionados diferentes, que pueden incluir las posiciones del perímetro del

clon, el centro de masa (en términos X-Y) del clon y el diámetro aproximado del clon. Pueden monitorizarse observaciones sobre el número de células, el tiempo de duplicación del microorganismo (antes y después de la administración de AOA), la fracción de microorganismos vivos y muertos, y otra información. Debe observarse que con respecto a, por ejemplo, el tiempo de duplicación del clon, esto puede expresarse tanto como el tiempo de

5 duplicación más rápido de un microorganismo dentro del clon, o algún número de población (por ejemplo, el tiempo para que se duplique el número de microorganismos dentro del clon), como un promedio o mediana del tiempo de duplicación de los microorganismos individuales dentro del clon.

Debe observarse que con el fin de mantener observaciones de clones, un método preferido es mantener observaciones sobre cada microorganismo individual, además de información de miembros sobre de qué clon es miembro cada microorganismo, y entonces las observaciones clónicas pueden comprender la información apropiada de cada microorganismo individual de un clon reunido con la información apropiada. Además, con la generación de nuevos microorganismos mediante la división de microorganismos existentes, debe permitirse que crezca el almacenamiento de información con el fin de acomodar todos los nuevos microorganismos.

15 Una de las ventajas de considerar un clon de microorganismos a diferencia de un microorganismo individual es que los efectos de la administración de AOA pueden ser más inequívocos y cuantitativos. Por ejemplo, si un microorganismo individual muere tras la administración de AOA, puede ser debido a un sinfín de factores no relacionados con el AOA. Sin embargo, si algunos, la mayoría o todos los microorganismos que comprenden un clon dado están afectados, entonces puede estarse seguro del efecto del AOA sobre los microorganismos de ese tipo. Asimismo, si el tiempo de duplicación de un microorganismo individual aumenta por un factor de dos tras la administración de un AOA, la fiabilidad estadística del tiempo de duplicación puede ser baja, especialmente dado que la mayoría de las muestras no se monitorizarán continuamente, sino que solo se monitorizan a intervalos predeterminados, donde los intervalos generalmente serán al menos 15 minutos. Sin embargo, con un clon de 32

25 microorganismos, por ejemplo, 15-30 observaciones individuales de microorganismos que están duplicándose cada 30-60 minutos generalmente darán tiempos de duplicación fiables incluso con solo dos o tres observaciones.

Las observaciones de cepas y poblaciones se obtendrán en general mediante observaciones de clones y microorganismos individuales, seguido de manipulación algorítmica de los datos. La información que se mantendrá puede incluir la identidad de cepa/serotipo, el número de células que comparten la misma identificación, y el tiempo de duplicación en ausencia de AOA (que puede incluir tanto tiempo de duplicación mínimo, además de promedios estadísticos tales como medias, medianas, medias ponderadas y similares). Además, es de particular interés obtener medidas de susceptibilidad de AOA, que incluyen el tiempo promedio/medio para aniquilar los microorganismos, la fracción de microorganismos vivos y muertos en función del tiempo después de la

35 administración de AOA, la fracción de microorganismos que están creciendo positivamente a diferencia de la fracción que están en estasis aparente (determinada con respecto a un tiempo de duplicación umbral predeterminado), los tiempos de duplicación de los microorganismos más rápidos dentro de la cepa o población particular, y la fracción de clones que son afectados (es decir, con un cambio en la viabilidad o aumento fraccionario en el tiempo de duplicación superior a un factor predeterminado).

En general, dos de las ventajas de la presente invención pueden ser ampliamente establecidas. La monitorización de los microorganismos individuales y su respuesta a AOA proporciona bajos límites de detección, buena estadística para el análisis y resultados más fiables. La monitorización cuantitativa del crecimiento en más de un intervalo permite a los presentes inventores medir cambios en velocidades de crecimiento y tiempos de duplicación, además

45 de medir la cinética de la aniquilación y cambios en las velocidades de crecimiento, que les permite a los presentes inventores hacer predicciones cuantitativas del crecimiento de los microorganismos en el paciente, predicciones que pueden indicar parámetros clínicamente relevantes (carga de microorganismos, la aparición de cepas resistentes) en función del tiempo.

Las observaciones de microorganismos individuales, clones, cepas y poblaciones generalmente se mantendrán en un ordenador, que puede guardar la información tanto en una base de datos (tal como una base de datos SQL), como que puede almacenarse alternativamente en memoria y archivos binarios específicos para tales datos. Se requiere acceso rápido a la información con el fin de mantener y actualizar los datos.

55 Otros métodos estadísticos de microbiología cuántica

Como se ha mencionado anteriormente, los métodos como se describen en el presente documento operan a muchos niveles diferentes, pero son de beneficio particular la aplicación de QM a células de microorganismos individuales y clones de microorganismos fundadores individuales en el método de la presente invención. Este tipo de análisis, que puede realizarse en tamaños de muestras pequeños (a límites de sensibilidad de los métodos, decenas o incluso menos microorganismos o clones en un canal particular), requiere diferentes análisis estadísticos de métodos convencionales, que pueden expresarse como las probabilidades de eventos.

Por ejemplo, puede determinarse P(+) como la fracción de todas las células vivas en la población de muestra que se

65 divide durante un intervalo de tiempo normalizado en presencia de una concentración antimicrobiana fija. Esto es la probabilidad de que cualquier célula individual particular que se observe durante un periodo de tiempo tal se divida

en realidad.

De manera similar, P(-) es la fracción de células aniquiladas en el mismo intervalo de observación normalizado, y la probabilidad de que cualquier célula individual particular que se observe durante un periodo de tiempo tal muera en

5 realidad. La erradicación es posible en tanto que P(-) sea mayor que P(+). Generalmente, AST convencional revela resultados para poblaciones en las que P(-) es muy superior a P(+). Dentro de cualquier clon susceptible, las observaciones siguen siendo las mismas. Observación con respecto a intervalos de tiempo en serie se aproximarán a las distribuciones de frecuencia de la población susceptible agregada.

Sin embargo, P(-) para células resistentes es mucho más lenta que para células susceptibles. Por definición, P(-) es muy inferior a P(+) para células resistentes. En una población microbiana en la que células susceptibles sobrepasan en número sustancialmente a las células resistentes, las estadísticas de poblaciones agregadas requieren una prolongada observación con el fin de que la población resistente llegue a ser lo suficientemente grande para ser detectable. Sin embargo, la capacidad para identificar miembros de un clon aumenta sustancialmente la velocidad

15 de detección.

Un AOA aniquila grandes números de células susceptibles en una población mixta tal, y continúa creciendo un subconjunto pequeño de células resistentes. Examinando células individuales de relación clónica conocida es posible calcular la velocidad de aniquilación dentro de un clon promedio. Por tanto, cualquier clon que muestre desviación estadísticamente significativa de la velocidad de muerte intra-clónica indica resistencia.

Por ejemplo, pueden seleccionarse condiciones en las que el intervalo de observación es lo suficientemente largo para producir un promedio de una aniquilación por intervalo en clones susceptibles y se producen divisiones celulares aleatorias (de células susceptibles) a frecuencia sustancialmente más baja, o no se producen en absoluto.

25 Entonces, cuando se observa cada clon durante la exposición a AOA, cualquier clon que empiece a superar estadísticamente la velocidad de nacimiento de la mayoría de los clones representa entonces resistencia. Así, la sensibilidad de la estadística clónica QM supera la de la estadística global. Dada una concentración de fármaco y un intervalo de tiempo de observación fijo, es útil en QM contar los nacimientos y muertes en cada clon identificado durante el primer intervalo de observación. El sistema clasifica los clones en los que los nacimientos superaron a las muertes como posiblemente resistentes, y aquellos en los que las muertes superaron a los nacimientos como posiblemente susceptibles. El método de QM puede repetir el recuento en el segundo intervalo de tiempo, mientras que retiene los recuentos de recuentos anteriores en cajas separadas. El tiempo de acción del AOA puede determinarse por la duración que los nacimientos continúan superando a las muertes, con respecto a los clones en los que las muertes superaron a los nacimientos.

Presentación de información de microbiología cuántica

Los datos sobre microorganismos individuales, clones, cepas y poblaciones que se observan y se mantienen como se ha descrito anteriormente tienen, como datos sin procesar, utilidad limitada para el personal médico dependiente de los datos. Los datos deben convertirse en un formato que sea fácil de interpretar para el personal médico, y que apoye las decisiones de tratamiento.

En general, el personal médico no necesita tener información sobre microorganismos individuales o clones, sino sobre los datos generales que se disponen tanto por cepa como por población. La información, además, debe

45 proporcionarse preferentemente con información que incluye:

separación de aniquilación de la estasia o prolongación del tiempo de duplicación, ya que la aniquilación de microorganismos tiene, como se ha descrito anteriormente, beneficios de tratamiento.

El momento preciso de la aniquilación, ya que cuanto más un AOA aniquila los microorganismos, más rápidamente mejorará la afección del paciente, más baja será la probabilidad de que surja resistencia, y menos daño surgirá de la eventual eliminación de la resistencia a AOA.

Información del tiempo de duplicación, ya que esto puede distinguir de forma aproximada la estasia de

55 infecciones que aparecerán pronto (es decir, un microorganismo que no aparece en una placa de agar de infusión de AOA podría no estar en estasia o muerto, sino más bien solo algunas pocas horas desde la aparición).

El número de clones de resistencia -es decir, los clones de microorganismos resistentes serán inequívocos, y su presencia indicará las posibilidades de que aparezcan infecciones después incluso en presencia de AOA para el que la mayoría de la población es susceptible.

Esta información es voluminosa, y puede proporcionarse al personal médico en varios formatos diferentes. Por ejemplo, en un formato similar al de un antibiograma convencional, las columnas pueden representan cepas 65 individuales, mientras que las filas pueden representar parámetros individuales de lo anterior (aniquilación, tiempo de aniquilación, estasia, tiempo de duplicación, resistencia), que pueden proporcionarse tanto en valores numéricos

(es decir, números específicos, porcentajes, veces) como en números relativos (por ejemplo, números de signos más o signos menos).

El antibiograma es particularmente útil para organizar la información por cepa u organismo. Una disposición

5 alternativa es el uso de un predictograma. En un "predictograma", la información sobre todos los microorganismos diferentes y su susceptibilidad y respuestas específicas a AOA pueden incorporarse en un formato integrado, con proyecciones cuantitativas hechas del futuro crecimiento basándose en los números de poblaciones de microorganismos actuales medidos, tasas de aniquilación de la cinética de tiempo-aniquilación a diferentes concentraciones de AOA y crecimiento de microorganismos a partir de las mediciones del tiempo de duplicación a diferentes concentraciones de AOA. Considerar primero que todos los microorganismos en una muestra son de la misma cepa, que se caracteriza por una curva de tiempo/aniquilación, un tiempo de duplicación después de la exposición a AOA y otros parámetros. En este caso, el predictograma sería un gráfico, con el tiempo en la abscisa (generalmente en horas, y extendiéndose durante preferentemente al menos 48 horas, y más preferentemente durante más de 96 horas) y el número de microorganismos vivos en la ordenada (que puede formatearse con una

15 escala logarítmica), en el que se da el número de microorganismos vivos en función del tiempo. Este gráfico se da para una concentración constante de AOA, o alternativamente, una concentración de AOA que se deriva de la farmacocinética conocida de AOA, suponiendo que los microorganismos han sido expuestos en el aparato de prueba a concentraciones para imitar el perfil de concentración de AOA. Los números de microorganismos con el tiempo pueden estimarse a partir de curvas de tiempo/aniquilación combinadas con tiempos de duplicación, en los que el número de microorganismos en un momento dado puede aproximarse como la suma de la curva de tiempo/aniquilación y la curva de crecimiento exponencial para cada entidad individual en la muestra, donde la entidad puede ser microorganismos individuales, clones o cepas. Convenientemente, el sistema también puede modelarse como una serie de etapas de tiempo, en el que en cada etapa de tiempo, los microorganismos son aniquilados según la curva tiempo-aniquilación, y los microorganismos se reproducen según el tiempo de

25 duplicación.

El predictograma puede presentarse tanto para la población en conjunto, como pueden presentarse predictogramas separados para cada cepa. Los predictogramas pueden incluir los resultados de una serie de AOA, o pueden presentarse a diferentes concentraciones del mismo AOA. Los predictogramas pueden presentarse con múltiples gráficos que solapan los mismos ejes, y mostrarían convenientemente las respuestas de las sub-poblaciones totales

o seleccionadas con diferentes AOA o concentración del mismo AOA de manera que pudieran compararse directamente los diferentes tratamientos.

Alternativamente, a lo largo del eje de tiempo del predictograma pueden anotarse los microorganismos más

35 prevalentes predichos (por ejemplo, cualquier microorganismo predicho que constituya al menos una fracción predeterminada, tal como el 10 %, de la población total) en cada intervalo de tiempo.

Debe observarse que el predictograma informa intrínsecamente de las curvas de tiempo-aniquilación de cada AOA. La cinética de aniquilación es importante para la eficacia de AOA, ya que la generación de microorganismos resistentes es proporcional al número total de divisiones de microorganismos. Si un AOA hace muchas divisiones celulares para aniquilar un microorganismo, esto aumentará las probabilidades de que surja una cepa resistente.

Debe observarse que los resultados de la mayoría de los métodos convencionales no proporcionan buena información sobre el tiempo de duplicación para los microorganismos, que no permite hacer predicciones de

45 crecimiento de microorganismos con el tiempo. Así, el estándar de oro actual es la concentración mínima inhibitoria, que representa un corte aproximadamente arbitrario en términos del tiempo que los cultivos de microorganismo se dejan crecer (por ejemplo, si los microorganismos sobre placas de agar con AOA se dejan crecer indefinidamente, el crecimiento bacteriano apareceré en toda la placa, tanto debido a que la concentración de AOA puede extenderse en toda la placa como disminuir en concentración local, pero además el tiempo de duplicación de microorganismos se prolonga, pero no se elimina el crecimiento). Así, el proporcionar a los doctores médicos con información sobre la aniquilación de microorganismos en función del tiempo, además del crecimiento de microorganismos en función del tiempo, proporciona información nueva e importante en el tratamiento médico.

Como se trata anteriormente, la definición de CMI varía según el método de la prueba de susceptibilidad, pero

55 generalmente se refiere a la concentración mínima de AOA que afecta fuertemente el crecimiento del microorganismo. En la presente invención, los microorganismos pueden exponerse a un intervalo de concentraciones de AOA, y la CMI puede entonces determinarse de varias formas diferentes. Por ejemplo, la CMI puede determinarse como la concentración a la que el tiempo de duplicación del microorganismo aumenta un factor predeterminado, factor que es preferentemente dos o más, y más preferentemente 4 veces o más. Alternativamente, puede determinarse el crecimiento global de los microorganismos con el tiempo, y esa concentración que no produce crecimiento adicional neto (a partir de una combinación de aniquilación, estasia y aumento en el tiempo de duplicación) puede definirse como la CMI. Otra definición de CMI puede ser la concentración a la que el número total de microorganismos durante un periodo de tiempo predeterminado (que es preferentemente un día, y más preferentemente dos días o más) es algún factor predeterminado con respecto al número de microorganismos real,

65 en el que el factor predeterminado puede ser tanto superior, igual como inferior a uno (1), y que es preferentemente inferior a 10, y más preferentemente uno o menos. Debe observarse que un factor predeterminado de uno es

equivalente a estasia.

Mientras que algunas medidas de CMI hacen uso de una medida continua (por ejemplo, el radio de la zona despejada alrededor de un disco que contiene una cantidad específica de antibiótico que se pone sobre una placa

5 de agar), los análisis de la presente invención se hacen generalmente basándose en distintas concentraciones de AOA. Con el fin de estimar CMI específicas con más precisión que pudieran encontrarse entre las distintas concentraciones probadas, es conveniente realizar interpolaciones y extrapolaciones basándose en los distintos datos obtenidos. Las interpolaciones y extrapolaciones pueden ser lineales, cuadráticas o exponenciales, determinándose el tipo de interpolación o extrapolación por investigaciones de laboratorio con muestras de microorganismos conocidas. Además, es preferible que las interpolaciones y extrapolaciones se hagan independientemente con respecto a la aniquilación y cambios en el tiempo de duplicación, ya que los efectos de los AOA con respecto a la aniquilación y el tiempo de duplicación pueden ser diferentes, después de lo cual pueden sintetizarse independientemente velocidades globales del crecimiento o declive de microorganismos a partir de los números independientes.

15 Un objetivo secundario importante de la selección de fármacos en el tratamiento médico es minimizar la probabilidad de inducir o seleccionar cepas resistentes. Como ha sido muy conocido desde el influyente artículo de Luria y Delbruck en 1943 (Genetics 28:491-511), las bacterias mutan a una velocidad relativamente rápida (en el intervalo de aproximadamente 10,6 a 10-9 por división celular) en un entorno selectivo. Como el número total de divisiones de células bacterianas en una población infecciosa supera los 109 órdenes de magnitud, puede esperarse que surja resistencia espontáneamente durante el tratamiento. El efecto clínico puede aumentarse por la presencia de numerosos tipos de elementos genéticos móviles, tales como plásmidos y similares, en infecciones bacterianas, causando la rápida diseminación de la resistencia emergente o inducida.

25 Por tanto, la rápida finalización de la terapia es casi tan importante como seleccionar un fármaco eficaz. El método de QM puede incluir el cálculo del tiempo de erradicación terapéutico y, por tanto, la duración óptima del tratamiento. Además, el método de QM puede calcular el número más probable de divisiones celulares durante todo el transcurso del tratamiento, basándose en los recuentos de muestras, velocidades de aniquilación y velocidades de crecimiento tras el comienzo de la exposición al fármaco. El método puede entonces informar de un listado jerárquico de cada rendimiento del fármaco, que incluye CMI, CMB, velocidad máxima de aniquilación, divisiones celulares del tratamiento totales y duración del tratamiento total estimada. Este informe presenta un antibiograma clínicamente relevante detallado para cada caso.

Los antibiogramas convencionales tienen al menos dos formas. La primera presenta una lista de categorías de CMI

35 y/o SIR para un organismo particular como se somete a AST. La segunda presenta una matriz de especies y fármacos, estableciendo la intersección el porcentaje de cepas clínicas susceptibles (o resistentes) durante el periodo de tiempo y la localización de las fuentes de datos (normalmente un año o más para una comunidad, un hospital entero o un departamento del hospital).

Los métodos de QM pueden proporcionar además la cinética de aniquilación (velocidad máxima de aniquilación) de curvas TK. Las categorías de SIR tienen alta granularidad y baja precisión. Las CMI podrían ser más precisas, pero es muy sabido por aquellos expertos habituales en la materia que incorporan capacidad predictiva limitada. Por tanto, el método de QM puede incluir la producción de antibiogramas basados en la cinética de aniquilación.

45 Para estadística de supervivencia, cada intersección de especie/fármaco en el antibiograma de QM presenta un sublistado de la prevalencia de cepas por agrupación de velocidades de aniquilación. Esto ofrece al agente de control de la infección un cuadro mucho más completo de tendencias y orientación de los medicamentos disponibles que el antibiograma convencional.

La velocidad inherentemente alta del análisis de QM permite nuevas estrategias de diagnóstico y optimización del tratamiento que no son posibles usando métodos más lentos. Entre otras capacidades, QM proporciona curvas TK in vivo factuales que atribuyen a los individuos variaciones farmacocinéticas y farmacodinámicas únicas. Además, la respuesta TK in vivo atribuye los efectos a otros factores del huésped no cuantificables tales como la activación de macrófagos y otros fenómenos.

55 Esto permite que los métodos de cálculo de QM ajusten el modelo in vitro del paciente individual para incluir tales efectos en el ajuste de sus proyecciones para la pauta de tratamiento total. De manera similar, la base de datos QM acumula estos resultados basados en el tiempo para mejorar continuamente sus modelos estadísticos.

Debe también observarse que una gran fracción de los microorganismos que producen infección humana no consigue ser identificada por los anticuerpos utilizados en la identificación clínica. Un motivo de esto es que es prácticamente posible usar solo un número limitado de anticuerpos u otros identificadores, y hay una gran cantidad de cepas productoras de infecciones. Para aquellos microorganismos que no son identificados, es conveniente proporcionar al usuario información útil que podría ayudar a los especialistas médicos a determinar el probable

65 agente etiológico. Esta información puede incluir información de imagen derivada del programa de análisis de imágenes, que incluye el tamaño del microorganismo en micrómetros, la relación de aspecto aproximada del

microorganismo (es decir, redondo o alargado), la topología de crecimiento del microorganismo (en agrupaciones o cadenas, en dos o tres dimensiones), la velocidad de duplicación del microorganismo, la susceptibilidad del microorganismo a cada AOA, y más. Adicionalmente, es de valor particular para el especialista médico tener imágenes de algunos microorganismos característicos. Estas imágenes pueden tanto almacenarse como parte del

5 análisis normal de la muestra, pero más preferentemente pueden tomarse en un momento separado, donde pueden seleccionarse microorganismos individuales o clones que representan la mediana de valores o valores modales para los parámetros anteriores y posiblemente imágenes bajo condiciones óptimas (por ejemplo, mayor aumento, o mejores objetivos y métodos que son particularmente aptos para inspección visual, a diferencia del análisis mecánico y la tinción que caracterizan el proceso global). Estas imágenes pueden presentarse en forma impresa o en una pantalla de ordenador al especialista médico, cuya imagen puede ayudarle en la identificación del microorganismo.

Debe mencionarse que la microscopía como medida del crecimiento celular tiene una larga historia. Ejemplos del uso de microscopía para demostrar el crecimiento celular se proporcionan por J.R. Lawrence, D.R. Korber, y D.E.

15 Caldwell (1989) "Computer-enhanced darkfield microscopy for the quantitative analysis of bacterial growth and behavior on surfaces", J. Microbiol. Methods 10: 123-138 and A. Elfwing, Y. LeMarc, J. Baryani, and A. Ballagi (2004) "Observing Growth and Division of Large Numbers of Individual Bacteria by Image Analysis", Applied and Environmental Microbiology 70(2):675-678. Debe mencionarse de Elfwing et al. que el crecimiento de bacterias puede medirse bajo flujo laminar por el cual las células hija se cizallan, dando un perfil óptico de diente de sierra en el que el tamaño celular aumenta, y entonces con la eliminación de la célula hija, el tamaño celular disminuye bruscamente. En la presente invención, además del tamaño celular (por ejemplo, el número de píxeles), también puede usarse la cantidad de fluorescencia o la cantidad de dispersión de la luz.

La viabilidad de organismos puede determinarse mediante varios métodos, y pueden incluir tanto métodos que

25 resaltan organismos viables (tinciones vitales), además de organismos muertos (tinciones mortales). Estas tinciones pueden comprender colorantes de etidio o propidio, yoduro de hexidio, tinciones de ácidos nucleicos SYTO, 7aminoactinomicina D, tinciones de ácidos nucleicos SYTOX Green/Orange/Blue, y otras. Una buena introducción a estas y otras tinciones está disponible del manual de Molecular Probes, en www.probes.com, además de "Vigor, vitality, and viability of microorganisms", David Lloyd, Anthony J. Hayes en FEMS Microbiology Letters 133 (1995).

Puede ser útil detectar la presencia de nuevos organismos o el aumento en tamaño de los organismos existentes.

Es de valor particular en la microbiología cuántica interrogar repetidamente a los microorganismos con respecto a su viabilidad o mortalidad. En particular, muchas de las tinciones descritas anteriormente persisten en las células que

35 han sido así teñidas, haciendo la tinción repetida menos precisa. Una tinción de valor particular es la resazurina, que es una tinción redox intracelular, que indica la vitalidad de las células. Una dificultad en usar la resazurina en ciertas aplicaciones es que se disipa de las células, requiriendo exposición repetida o constante. Para reducir esta disipación, se han desarrollado variantes de la resazurina para reducir su pérdida de las células, y están en uso frecuente. Sin embargo, para la aplicación de la presente invención, la disipación de la resazurina no modificada tiene propiedades ventajosas, porque permite la interrogación repetida de células ya que no persiste. Para la presente invención, es preferible usar tinciones vitales y mortales que se disipan hasta el punto que pueden volver a ser aplicadas en menos de o igual a cada hora, o incluso más preferentemente en menos de o igual cada media hora, o lo más preferentemente en menos de o igual cada quince minutos.

45 Detección general de microorganismos

En algunas realizaciones, los métodos de la invención pueden usarse para la rápida detección de la cantidad de microorganismos dentro de una muestra. En el presente documento también se describen composiciones para la rápida detección de la cantidad de microorganismos dentro de una muestra. Similar al uso de crecimiento seguido de monitorización de la densidad óptica para la detección de microorganismos, los presentes sistemas pueden usarse de una manera similar aunque mucho más acelerada. Es decir, monitorizando el crecimiento positivo como se ha explicado resumidamente en el presente documento, y sumando el crecimiento de microorganismos individuales, puede hacerse una determinación rápida de la cantidad de microorganismos.

55 Organización de la identificación y prueba de susceptibilidad a AOA

Como se ha tratado en el presente documento, en algunas realizaciones, los métodos de la invención se hacen como una "matriz", en la que una muestra se divide entre superficies de detección y se ejecutan experimentos individuales (por ejemplo, diferentes agentes antimicrobianos o diferentes concentraciones de agentes antimicrobianos o ambos). Por ejemplo, un sistema puede tener múltiples "canales", cada uno con su propio puerto de entrada. En una realización tal, cada canal puede tener más de una superficie de detección; por ejemplo, una prueba puede dirigirse a la evaluación de cinco microorganismos diferentes en una muestra, cada una con una superficie de detección específica, que entonces se prueban simultáneamente para agentes y/o concentraciones diferentes. Alternativamente, pueden ejecutarse experimentos secuenciales sobre la(s) superficie(s) de detección;

65 por ejemplo, pueden ejecutarse concentraciones crecientes de agentes antimicrobianos, con lavados opcionales entremedias. De manera similar, pueden ejecutarse secuencialmente diferentes agentes antimicrobianos.

En general, cada muestra se distribuirá en varios canales diferentes de manera que puedan realizarse múltiples análisis. En cada canal, pueden realizarse al menos dos tipos diferentes de análisis: cuantificación e identificación de los microorganismos presentes, y determinación de la susceptibilidad a antibióticos. Para personal médico que toma

5 decisiones de tratamiento, es lo mejor tener no solo la identidad de los microorganismos presentes, sino también la susceptibilidad a AOA de los microorganismos en términos de cada tipo de microorganismo. Es decir, si hay dos microorganismos en una muestra en números aproximadamente iguales, uno de los cuales es susceptible y el otro que no es, es preferible conocer cuál de los microorganismos es susceptible.

Con esto en mete, lo más preferible es que en cada canal se realice un panel completo de identificación, y que en los canales se pruebe un panel completo de agentes antiorganismo (AOA), cada AOA a varias concentraciones diferentes. De este modo, cada microorganismo en cada canal puede identificarse, y determinarse la susceptibilidad a AOA para cada microorganismo. En general, debido a que el número de posibles microorganismos diferentes es grande, y debido a que el número de AOA y concentraciones a probar también es grande, aunque el número de

15 canales es, en general, limitado.

Alternativamente, habiendo identificado los microorganismos que constituyen la mayoría de la población en una muestra mediante los métodos descritos en el presente documento, los AOA que son específicos en su acción para aquellos microorganismos pueden elegirse específicamente para probarse en esa muestra. Esto permite tanto un mayor número de AOA específicos para aquellos microorganismos, como alternativamente, permite probar más concentraciones. Así, el controlador de sistemas tiene preferentemente la capacidad de decidir qué AOA y sus concentraciones usar, a diferencia de tener un conjunto fijo de AOA y concentraciones.

Alternativamente, la prueba puede organizarse de manera que en cada canal solo se intenta un subconjunto de las

25 posibles identificaciones, y qué prueba de AOA en cada canal es específica para aquellos microorganismos cuyas identificaciones se intentan. Por ejemplo, si hay un panel de 16 anticuerpos (o marcadores similares) para la identificación y hay dos canales A y B, ocho de los anticuerpos pueden usarse en el canal A y ocho de los anticuerpos pueden usarse en el canal B. Entonces, en el canal A pueden probarse los AOA que son específicos para los microorganismos que se identifican mediante los anticuerpos de identificación usados en ese canal, y en el canal B pueden probarse los AOA que son específicos para los microorganismos que se identifican mediante los anticuerpos de identificación usados en ese canal. Este método es particularmente eficaz si los anticuerpos usados para la identificación en cada canal se eligen de forma que los microorganismos para los que son específicos se agrupan en áreas de susceptibilidad a AOA. Por ejemplo, los anticuerpos para microorganismos que son susceptibles a eritromicinas pueden usarse en un único canal, mientras que los anticuerpos para microorganismos

35 que son susceptibles a cefalosporinas pueden usarse en un único canal, con exposición a AOA por los AOA respectivos en los canales respectivos.

Otra alternativa es usar un AOA diferente en cada canal, y también usar un conjunto diferente de anticuerpos de identificación en cada canal. En este caso, es posible determinar qué fracción de la población de microorganismos es susceptible a cada uno de los AOA, además de determinar qué fracción de la población de microorganismos se representa en cada cepa (es decir, mediante la identificación de anticuerpo). Así, por esta información sola, no es posible asignar inequívocamente la susceptibilidad a cualquier tipo de organismo. Sin embargo, la asignación puede hacerse provisionalmente basándose en tres trozos adicionales de información. En primer lugar, las similitudes numéricas de identificación y susceptibilidad pueden ser altamente indicativas. Por ejemplo, si el 30 % de la

45 población de microorganismos es la cepa A y el 70 % de la población de microorganismos es la cepa B, y el 30 % de la población de microorganismos es susceptible a AOA X y el 70 % de la población de microorganismos no es susceptible a AOA X, entonces puede deducirse provisionalmente que la cepa A es susceptible a AOA X y la cepa B no es susceptible. Además, como se trata anteriormente, ciertas cepas son tanto nunca como normalmente susceptibles a un AOA particular, de manera que en el ejemplo previo, si se sabe que la cepa B rara vez o nunca es susceptible a AOA X, esto proporcionaría información confirmatoria de la asignación previa de susceptibilidad.

Un tercer trozo de información que puede ser reunida en esta asignación de susceptibilidad a cepas particulares es el uso de información física que se observa y se guarda sobre microorganismos individuales, como se describe en cualquier parte en esta memoria descriptiva. Así, si la cepa A es un microorganismo esférico de 1 micrómetro que

55 crece en "cadenas" y la cepa B es un microorganismo en forma de bacilo de dimensiones 1 micrómetro por 3 micrómetros y crece en agrupaciones, entonces si se observa que la cepa susceptible es un microorganismo esférico de 1 micrómetro, la asignación del microorganismo susceptible como cepa A gana apoyo adicional.

Otro método de uso de un número mínimo de canales para realizar tanto la identificación como la prueba de susceptibilidad de AOA es usar múltiples pases durante un periodo de tiempo. Una porción de la muestra se pone en canales donde la identificación se hace con grupos de anticuerpos, y la muestra también se expone a múltiples AOA. Por ejemplo, en el canal A, los microorganismos se identifican con anticuerpos combinados A, B, C y D y en el canal B los microorganismos se identifican con anticuerpos combinados E, F, G y H, y en el canal C los microorganismos se identifican con anticuerpos combinados I, J, K y L, en los que una identificación positiva indica solo que los 65 microorganismos positivos son una de las cuatro cepas para las que los anticuerpos fueron específicos. Por tanto, los microorganismos en el canal A se exponen a los AOA P y Q, en el canal B se exponen a los AOA R y S, y en el

canal C se exponen a los AOA X y Y. Dependiendo de los resultados de este primer pase, en un segundo pase posterior, otras partes de la muestra pueden entonces identificarse con solo aquellos anticuerpos que fueron parte de los resultados positivos del primer pase, y se expusieron solo a aquellos AOA a los que se observó susceptibilidad. Así, en el ejemplo anterior, si la identificación positiva de microorganismos solo se observó en el

5 canal A y la susceptibilidad a AOA se observó solo en el canal B, entonces en un pase posterior en otras partes de la muestra la identificación puede realizarse solo con los anticuerpos A, B, C y D, y se prueban los AOA R y S. En este ejemplo, dependiendo de la distribución de identificaciones y susceptibilidades, tres canales en el primer pase y canales en el segundo pase darían información completa sobre identificaciones y susceptibilidades que podrían ser 12 o más canales en un único pase.

10 Debe entenderse que este método puede usarse únicamente con respecto a la identificación o únicamente con respecto a la susceptibilidad, mientras que la otra prueba puede realizarse en un único pase. Además, en la realización de múltiples pases, los microorganismos de la muestra pueden ser simultáneamente introducidos a todos los canales, para los que la identificación y prueba de susceptibilidad se intenta inicialmente en solo un subconjunto

15 de canales. Los microorganismos en los otros canales se dejan crecer en caldo durante el primer pase, de manera que al principio del segundo pase los microorganismos están en crecimiento de "fase logarítmica", y el número más grande de microorganismos proporciona mejor información para el segundo pase.

El número de pases usado en el análisis puede ser superior a dos, donde la información de los pases iniciales se

20 usa en pases posteriores, y pueden usarse múltiples pases en maneras alternativas. Por ejemplo, en un primer pase, puede usarse la máxima dosis de AOA, con el fin de indicar susceptibilidad global de los microorganismos en la muestra a los AOA específicos. En un segundo pase, usando preferentemente microorganismos que han estado creciendo durante el primer pase, para aquellos AOC que se mostró que eran eficaces, pueden usarse valoraciones con diferentes concentraciones de AOA con el fin de establecer CMI, CMB y otra información más detallada sobre la

25 interacción del AOA con los microorganismos en la muestra.

Cribado de agentes bioactivos que incluyen agentes antimicrobianos

Además, la presente invención también proporciona métodos de cribado de agentes bioactivos que pueden usarse

30 como agentes antimicrobianos. En el presente documento también se describen composiciones para cribar agentes bioactivos que pueden usarse como agentes antimicrobianos. En algunos casos, esto implica probar agentes candidatos para bioactividad contra un microorganismo, por ejemplo, en el desarrollo de fármacos, ya que los métodos de la invención permiten un rápido rendimiento. Adicionalmente, los métodos de la invención y las composiciones como se describen en el presente documento pueden usarse para cribar microorganismos para

35 susceptibilidad a agentes; por ejemplo, como los microorganismos llegan a ser resistentes a algunos agentes antimicrobianos, pueden probarse para susceptibilidad a otros agentes antimicrobianos conocidos, pero actualmente no usados.

Así, las realizaciones de la presente invención incluyen métodos de cribado de agentes candidatos para

40 bioactividad. "Agente candidato", como se usa en el presente documento, describe cualquier molécula, por ejemplo, proteína, ácido nucleico, molécula orgánica pequeña, polisacárido, etc., que pueda ser cribada para actividad como se ha explicado resumidamente en el presente documento. Generalmente, se ejecutan en paralelo una pluralidad de mezclas de ensayo con diferentes concentraciones de agente para obtener una respuesta diferencial a las diversas concentraciones. Normalmente, una de estas concentraciones sirve de control negativo, es decir, a concentración

45 cero o por debajo del nivel de detección.

Los agentes candidatos engloban numerosas clases químicas, aunque normalmente son moléculas orgánicas, preferentemente compuestos orgánicos pequeños que tienen un peso molecular superior a 100 e inferior a aproximadamente 2.500 dalton. Los agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para la 50 interacción estructural con proteínas, particularmente enlace de hidrógeno, y normalmente incluyen al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferentemente al menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos frecuentemente comprenden estructuras de carbono cíclicas o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. También se encuentran agentes candidatos entre las biomoléculas que incluyen péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas,

55 pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos.

Los agentes candidatos se obtienen de una amplia variedad de fuentes, que incluyen bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, están disponibles numerosos medios para la síntesis aleatoria y dirigida de una amplia variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas, que incluyen expresión de oligonucleótidos aleatorizados.

60 Alternativamente, están disponibles o se producen fácilmente bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, de planta y animal. Adicionalmente, las bibliotecas naturales o producidas sintéticamente y los compuestos se modifican fácilmente mediante medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales. Pueden someterse agentes farmacológicos conocidos a modificaciones químicas dirigidas o aleatorias, tales como acilación, alquilación, esterificación, amidificación para producir análogos estructurales.

En una realización preferida, los agentes bioactivos candidatos son proteínas. En el presente documento, por "proteína" se indica al menos dos aminoácidos unidos por enlace covalente, que incluyen proteínas, polipéptidos, oligopéptidos y péptidos. La proteína puede prepararse a partir de aminoácidos que existen de forma natural y enlaces peptídicos, o estructuras de peptidomiméticos sintéticos. Así, "aminoácido", o "resto de péptido", como se

5 usan en el presente documento, significa tanto aminoácidos que existen de forma natural como sintéticos. Por ejemplo, homofenilalanina, citrulina y norleucina se consideran aminoácidos para los fines de esta memoria descriptiva. "Aminoácido" también incluye restos de iminoácido tales como pralina e hidroxiprolina. Las cadenas laterales pueden estar en tanto la configuración (R) como (S). En la realización preferida, los aminoácidos están en la configuración (S) o L. Si se usan cadenas laterales que no existen de forma natural, pueden usarse sustituyentes no de aminoácido, por ejemplo, para prevenir o retardar las degradaciones in vivo.

En una realización preferida, los agentes bioactivos candidatos son proteínas que existen de forma natural o fragmentos de proteínas que existen de forma natural. Así, por ejemplo, pueden usarse extractos celulares que contienen proteínas, o digestos aleatorios o dirigidos de extractos celulares proteináceos. De esta forma pueden

15 prepararse bibliotecas de proteínas procariotas y eucariotas para cribar en los sistemas descritos en el presente documento. Particularmente preferidas en esta realización son bibliotecas de proteínas bacterianas, fúngicas, virales y de mamífero, siendo las últimas preferidas, y siendo las proteínas humanas especialmente preferidas.

En una realización preferida, los agentes bioactivos candidatos son péptidos de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 aminoácidos, siendo preferidos de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 aminoácidos, y siendo particularmente preferidos de aproximadamente 7 a aproximadamente 15. Los péptidos pueden ser digestos de proteínas que existen de forma natural como se ha explicado resumidamente anteriormente, péptidos aleatorios o péptidos aleatorios "polarizados". Por "aleatorizado" o equivalentes gramaticales se indica en el presente documento que cada ácido nucleico y péptido consiste en nucleótidos y aminoácidos esencialmente aleatorios, respectivamente.

25 Como generalmente estos péptidos aleatorios (o ácidos nucleicos, tratados más adelante) se sintetizan químicamente, pueden incorporar cualquier nucleótido o aminoácido en cualquier posición. El proceso de síntesis puede diseñarse para generar proteínas o ácidos nucleicos aleatorizados, para permitir la formación de todas o la mayoría de las posibles combinaciones a lo largo de la longitud de la secuencia, formando así una biblioteca de agentes proteináceos bioactivos candidatos aleatorizados.

En una realización, la biblioteca es completamente aleatorizada, sin preferencias de secuencia o constantes en ninguna posición. En una realización preferida, la biblioteca está polarizada. Es decir, algunas posiciones dentro de la secuencia ni se mantienen constantes ni están seleccionadas de un número limitado de posibilidades. Por ejemplo, en una realización preferida, los nucleótidos o restos de aminoácidos se aleatorizan dentro de una clase

35 definida, por ejemplo, de aminoácidos hidrófobos, restos hidrófilos, restos estéricamente polarizados (tanto pequeños como grandes), hacia la creación de cisteínas, para reticulación, prolinas para dominios SH-3, serinas, treoninas, tirosinas o histidinas para sitios de fosforilación, etc., o a purinas, etc.

En una realización preferida, como se explica resumidamente más completamente a continuación, los agentes candidatos son tanto proteínas aleatorizadas (incluyendo proteínas polarizadas o proteínas con componentes de fusión) como productos de expresión de bibliotecas de ADNc o bibliotecas derivadas de bibliotecas de ADNc, tales como fragmentadas (incluyendo bibliotecas de ADNc aleatoriamente fragmentadas). Éstas se añaden a las células como ácidos nucleicos que codifican estas proteínas. Como será apreciado por aquellos en la materia, estas bibliotecas de ADNc pueden ser de longitud completa o fragmentos, y puede estar en marco, fuera de marco o

45 leerse a partir de la hebra no codificante.

En una realización preferida, los agentes bioactivos candidatos son ácidos nucleicos. En el presente documento, "ácido nucleico" u "oligonucleótido" o equivalentes gramaticales, significa al menos dos nucleótidos unidos entre sí por enlace covalente. Como se describe en el presente documento, un ácido nucleico generalmente contendrá enlaces fosfodiéster, aunque, en algunos casos, como se explica resumidamente más adelante, están incluidos análogos de ácido nucleico que pueden tener esqueletos alternos, que comprenden, por ejemplo, fosforamida (Beaucage, et al., Tetrahedron, 49(10):1925 (1993) y referencias en su interior; Letsinger, J. Org. Chem., 35:3800 (1970); Sprinzl, et al., Eur. J. Biochem., 81:579 (1977); Letsinger, et al., Nucl. Acids Res., 14:3487 (1986); Sawai, et al., Chem. Lett., 805 (1984), Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988); y Pauwels, et al., Chemica 55 Scripta, 26:141 (1986)), fosforotioato (Mag, et al., Nucleic Acids Res., 19:1437 (1991); y la patente de EE.UU. N.º 5.644.048), fosforoditioato (Briu, et al., J. Am. Chem. Soc., 111:2321 (1989)), enlaces O-metilfosforamidito (véase Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press) y esqueletos y enlaces de ácido nucleico peptídico (véanse Egholm, J. Am. Chem. Soc., 114:1895 (1992); Meier, et al., Chem. Int. Ed. Engl., 31:1008 (1992); Nielsen, Nature, 365:566 (1993); Carlsson, et al., Nature, 380:207 (1996)). Otros ácidos nucleicos análogos incluyen aquellos con esqueletos positivos (Denpcy, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6097 (1995)); esqueletos no iónicos (patentes de EE.UU. N.º 5.386.023; 5.637.684; 5.602.240; 5.216.141; y 4.469.863; Kiedrowshi, et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English, 30:423 (1991); Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988); Letsinger, et al., Nucleoside & Nucleotide, 13:1597 (1994); Capítulos 2 y 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook; Mesmaeker, et al., 65 Bioorganic & Medicinal Chem. Lett., 4:395 (1994); Jeffs, et al., J. Biomolecular NMR, 34:17 (1994); Tetrahedron Lett.,

37:743 (1996)) y esqueletos no de ribosa, incluyendo aquellos descritos en las patentes de EE.UU. N. º

5.235.033 y 5.034.506, y Capítulos 6 y 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook. Los ácidos nucleicos que contienen uno o más azúcares carbocíclicos también están incluidos dentro de la definición de ácidos nucleicos (véase Jenkins, et al., Chem. Soc. Rev., (1995) pp. 169-176). Varios análogos de ácido nucleico se describen en Rawls, C & E News, 2 de junio de

5 1997, página 35. Estas modificaciones del esqueleto de ribosa-fosfato pueden hacerse para facilitar la adición de restos adicionales tales como marcas, o para aumentar la estabilidad y semivida de tales moléculas en entornos fisiológicos. Además, pueden prepararse mezclas de ácidos nucleicos que existen de forma natural y análogos. Alternativamente, pueden prepararse mezclas de diferentes análogos de ácido nucleico, y mezclas de ácidos nucleicos que existen de forma natural y análogos. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios, como se especifica, o contener porciones de tanto secuencia bicatenaria como monocatenaria. El ácido nucleico puede ser ADN, tanto genómico como ADNc, ARN o un híbrido, donde el ácido nucleico contiene cualquier combinación de desoxirribo-y ribo-nucleótidos, y cualquier combinación de bases, que incluyen uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xatanina hipoxatanina, isocitosina, isoguanina, etc.

15 Como se ha descrito anteriormente generalmente para proteínas, agentes bioactivos candidatos de ácido nucleico pueden ser ácidos nucleicos que existen de forma natural, ácidos nucleicos aleatorios, o ácidos nucleicos aleatorios "polarizados". Por ejemplo, pueden usarse digestos de genomas procariotas o eucariotas o bibliotecas de ADNc como se explica resumidamente anteriormente para proteínas.

En una realización preferida, los agentes bioactivos candidatos son restos químicos orgánicos, una amplia variedad de los cuales están disponibles en la bibliografía.

En una realización preferida, se usa una biblioteca de diferentes agentes bioactivos candidatos. Preferentemente, la biblioteca debería proporcionar una población suficientemente estructuralmente diversa de agentes aleatorizados 25 para efectuar un intervalo probabilísticamente suficiente de diversidad para permitir la unión a una diana particular. Por consiguiente, una biblioteca de interacción debe ser suficientemente grande de manera que al menos uno de sus miembros tenga una estructura que tenga afinidad por la diana. Aunque es difícil de calibrar el tamaño absoluto requerido de una biblioteca de interacción, la naturaleza proporciona un indicio con la respuesta inmunitaria: diversos 107-108 anticuerpos diferentes proporcionan al menos una combinación con afinidad suficiente para interaccionar con la mayoría de los posibles antígenos afrontados por un organismo. Técnicas de selección in vitro publicadas también han mostrado que un tamaño de biblioteca de 107 a 108 es suficiente para encontrar estructuras con afinidad por la diana. Una biblioteca de todas las combinaciones de un péptido 7 a 20 aminoácidos de longitud, tal como generalmente se propone en el presente documento, tiene el potencial de codificar 207 (109) a 2020. Así, con bibliotecas de 107 a 108 moléculas diferentes, los presentes métodos permiten un subconjunto de "trabajo" de

35 una biblioteca de interacción teóricamente completa durante 7 aminoácidos, y un subconjunto de formas para la biblioteca 2020. Así, en una realización preferida, al menos 106, preferentemente al menos 107, más preferentemente al menos 108 y lo más preferentemente al menos 109 secuencias diferentes, se analizan simultáneamente en los métodos objeto. Métodos preferidos maximizan el tamaño y la diversidad de la biblioteca.

En general, el cribado para agentes activos avanza como se ha explicado resumidamente en el presente documento para la prueba general, sirviendo la modulación del crecimiento (incluyendo nuevamente crecimiento positivo, neutro y negativo) de indicador de bioactividad.

Componentes de biosensor

45 En el presente documento también se describen dispositivos para la detección de microorganismos diana que en general incluyen un cartucho de biosensor y un sistema de detección.

Cartuchos de biosensor

Los cartuchos de biosensor como se describen en el presente documento pueden tomar varios formatos. En general, el cartucho consiste en un primer sustrato "superior" y un segundo sustrato "inferior", separados por un espaciador para permitir la formación de cámaras o módulos entre las superficies. Puertos para la introducción o eliminación de fluidos, interconexiones electrónicas, etc., pueden todos también ser parte del cartucho.

Sustratos

Los cartuchos de biosensor como se describen en el presente documento comprenden al menos un sustrato sólido. El sustrato sólido puede estar hecho de una amplia variedad de materiales y puede configurarse en un gran número de formas, como se trata en el presente documento y será evidente para un experto en la materia. Además, un único dispositivo puede comprender más de un sustrato; por ejemplo, puede haber un casete de "tratamiento de muestra" que interacciona con un casete de "detección" separado; se añade una muestra en bruto al casete de tratamiento de muestra y se manipula para preparar la muestra para la detección, que se elimina del casete de tratamiento de muestra y se añade al casete de detección. Puede haber un casete funcional adicional en el que el dispositivo se 65 ajusta; por ejemplo, un elemento de calentamiento que se coloca en contacto con el casete de muestra para efectuar reacciones tales como el crecimiento de los microorganismos. En algunos casos, una porción del sustrato puede ser

móvil; por ejemplo, el casete de muestra puede tener un casete de detección desmontable, de forma que el casete de muestra entero no se pone en contacto con el aparato de detección.

La composición del sustrato sólido dependerá de varios factores, que incluyen las técnicas usadas para crear el

5 dispositivo, el uso del dispositivo, la composición de la muestra, el analito que va a detectarse, el tamaño de los pocillos y microcanales, la presencia o ausencia de componentes electrónicos, etc. Generalmente, los dispositivos que se ponen en contacto con los microbios como se describen en el presente documento deben ser fácilmente esterilizables y también desechables.

El sustrato sólido como se describe en el presente documento puede estar hecho de una amplia variedad de materiales, que incluyen, pero no se limitan a, silicio tal como obleas de silicio, dióxido de silicio, nitruro de silicio, vidrio y sílice fundida, arseniuro de galio, fosfuro de indio, aluminio, cerámicos, poliimida, cuarzo, plásticos, resinas y polímeros que incluyen poli(metacrilato de metilo), acrílicos, polietileno, poli(tereftalato de etileno), policarbonato, poliestireno y otros copolímeros de estireno, polipropileno, politetrafluoroetileno, superaleaciones, zircaloy, acero,

15 oro, plata, cobre, tungsteno, molibdeno, tántalo, KOVAR, KEVLAR, KAPTON, MYLAR, latón, zafiro, etc. Pueden preferirse vidrios de alta calidad tales como borosilicato de alta fusión o sílices fundidas por sus propiedades de transmisión UV cuando cualquiera de las etapas de manipulación de muestras requiere tecnologías basadas en luz. Además, como se ha explicado resumidamente en el presente documento, porciones de las superficies internas del dispositivo pueden recubrirse con varios recubrimientos según se necesite, para reducir la unión no específica, para permitir la unión de ligandos de unión, para biocompatibilidad, para resistencia al flujo, etc. Por ejemplo, como se ha explicado resumidamente en los ejemplos, puede usarse el uso de recubrimientos resistentes tales como OPTICHEM.

El sustrato sólido como se describe en el presente documento puede configurarse para la manipulación de una única

25 muestra que puede contener una pluralidad de microorganismos diana. Es decir, se añade una única muestra al dispositivo y la muestra puede tanto separarse en alícuotas para el procesamiento paralelo para la detección de los microorganismos (véase la Figura 1) como la muestra puede procesarse en serie, siendo marcas individuales detectadas en un modo en serie. Además, pueden sacarse periódicamente muestras o de diferentes localizaciones para el muestreo en línea.

El sustrato sólido como se describe en el presente documento puede configurarse para manipular múltiples muestras, cada una de las cuales puede contener uno o más microorganismos diana. Véase, por ejemplo, la Figura

1. En general, en la configuración descrita en el presente documento, cada muestra se manipula individualmente; es decir, las manipulaciones y el análisis se hacen en paralelo, con preferentemente sin contacto o contaminación entre

35 ellas. Alternativamente, puede haber algunas etapas en común; por ejemplo, puede desearse procesar diferentes muestras por separado, pero detectar todos los analitos diana en una única superficie de detección.

Además, debe entenderse que mientras que la mayoría de la discusión en el presente documento se refiere al uso de sustratos planos con microcanales y pocillos, también pueden usarse otras geometrías. Por ejemplo, pueden apilarse dos o más sustratos planos para producir un dispositivo tridimensional, que puede contener microcanales que circulan dentro de un plano o entre planos; de manera similar, los pocillos pueden abarcar dos o más sustratos para permitir volúmenes de muestra más grandes. Así, por ejemplo, pueden grabarse ambos lados de un sustrato para contener microcanales; véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N.º 5.603.351 y 5.681.484.

45 Electrodos

Por "electrodo" se indica en el presente documento una composición que, cuando se conecta a un dispositivo electrónico, es capaz de detectar una corriente o carga y convertirla en una señal. Electrodos preferidos son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, ciertos metales y sus óxidos, que incluyen oro; platino; paladio; silicio; aluminio; electrodos de óxido metálico que incluyen óxido de platino, óxido de titanio, óxido de estaño, óxido de indio y estaño (ITO), óxido de paladio, óxido de silicio, óxido de aluminio, óxido de molibdeno (Mo2O6), óxido de tungsteno (WO3) y óxidos de rutenio; y carbono (incluyendo electrodos de carbono vidriado, grafito y pasta de carbono). Los electrodos de ITO son particularmente útiles en aplicaciones que utilizan detección óptica, ya que los electrodos de ITO pueden ser ópticamente transparentes.

55 Los electrodos descritos en el presente documento se representan como una superficie plana, que es solo una de las posibles conformaciones del electrodo y es para fines esquemáticos solo. La conformación del electrodo variará con los métodos usados. Por ejemplo, pueden preferirse electrodos planos llanos para métodos de detección óptica

o facilidad de síntesis.

Microcanales

Los dispositivos descritos en el presente documento pueden incluir al menos un microcanal o canal de flujo que se usa o bien para permitir el flujo de muestra dentro del cartucho entre componentes del cartucho, o bien que sirve 65 para alojar la(s) superficie(s) de detección como se describen en el presente documento. Por ejemplo, en lo primero, pueden usarse microcanales para hacer circular la muestra desde el puerto de entrada de muestra a los otros

componentes o módulos del sistema. Como será apreciado por aquellos en la materia, los canales de flujo pueden configurarse en una amplia variedad de formas, dependiendo del uso del canal. Por ejemplo, un único canal de flujo que empieza en el puerto de entrada de muestra puede separarse en varios canales más pequeños, de forma que la muestra original se divida en distintas submuestras para el procesamiento o análisis paralelo.

5 Alternativamente, varios canales de flujo de diferentes módulos, por ejemplo el puerto de entrada de muestra y un módulo de almacenamiento de reactivo, pueden alimentarse juntos en una cámara de mezcla o una cámara de reacción. Como será apreciado por aquellos en la materia, hay un gran número de posibles configuraciones; lo que es importante es que los canales de flujo permitan el movimiento de muestra y reactivos de una parte del dispositivo a otra. Por ejemplo, las longitudes de trayectoria de los canales de flujo pueden alterarse según se necesite; por ejemplo, cuando se requieren mezcla y reacciones controladas, pueden usarse canales de flujo más largos y algunas veces tortuosos.

También se describe en el presente documento que el cartucho puede comprender uno o más microcanales que

15 alojan superficies de detección. Por ejemplo, la Figura 1 representa un cartucho con una pluralidad de microcanales, cada uno con una pluralidad de superficies de detección. La Figura 4 representa un cartucho con una pluralidad de microcanales, cada uno con una única superficie de detección.

Módulos

Además del sistema de canales de flujo, los dispositivos como se describen en el presente documento pueden configurarse para incluir uno o más de varios componentes, denominados en el presente documento "módulos", que estarán presentes en cualquier dispositivo dado dependiendo de su uso. Estos módulos incluyen, pero no se limitan

a: puertos de entrada de muestra; módulos de introducción o recogida de muestra; módulos de manipulación de

25 células (por ejemplo, eliminación de células, concentración de células, separación o captura de células, crecimiento celular, etc.); módulos de separación, por ejemplo, para electroforesis, dielectroforesis, filtración en gel, intercambio iónico/cromatografía de afinidad (captura y liberación) etc.; módulos de reacción para la alteración química o biológica de la muestra; escisión química, física o enzimática o alteración de restos sobre la superficie de los microorganismos, o modificación química de estos restos; bombas de fluidos; válvulas de fluidos; módulos térmicos para calentar y refrigerar; módulos de almacenamiento para reactivos de ensayo; cámaras de mezcla; y módulos de detección.

Los dispositivos como se describen en el presente documento pueden incluir al menos un puerto de entrada de muestra para la introducción de la muestra al dispositivo. Éste puede ser parte de o estar separado de un módulo de

35 introducción o recogida de muestra; es decir, la muestra puede alimentarse directamente desde el puerto de entrada de muestra a una cámara de separación, o puede pretratarse en un pocillo o cámara de recogida de muestra.

Los dispositivos como se describen en el presente documento pueden incluir un módulo de recogida de muestra, que puede usarse para concentrar o enriquecer la muestra si se requiere; por ejemplo, véase la patente de EE.UU. N.º 5.770.029, que incluye la discusión de canales de enriquecimiento y medios de enriquecimiento.

El módulo de manipulación de células como se describe en el presente documento puede incluir un módulo de separación o captura de células. Utiliza una región de captura de células que comprende sitios de unión capaces de unirse reversiblemente a una molécula de la superficie celular para permitir el aislamiento selectivo (o eliminación)

45 de un tipo de célula particular de la población de muestra, por ejemplo, glóbulos blancos para el análisis de ácido nucleico cromosómico, o subconjuntos de glóbulos blancos. Estos restos de unión pueden inmovilizarse tanto sobre la superficie del módulo como sobre una partícula atrapada dentro del módulo (es decir, una perla) por absorción física o por unión covalente. Restos de unión adecuados dependerán del tipo de célula que va a aislarse o eliminarse, y generalmente incluyen anticuerpos y otros ligandos de unión, tales como ligandos para receptores de la superficie celular, etc. Así, un tipo de célula particular puede eliminarse de una muestra antes de la manipulación adicional, o el ensayo se diseña para unir específicamente el tipo de célula deseado, lavar los tipos de células no deseables, seguido de tanto liberar las células unidas mediante la adición de reactivos o disolventes, eliminación física (es decir, caudales o presiones más altos), como incluso lisis in situ.

55 Alternativamente, puede usarse un "tamiz" celular para separar las células basándose en el tamaño. Esto puede hacerse en varias formas, que incluyen protuberancias de la superficie que permiten la exclusión por tamaño, una serie de canales de estrechamiento, una presa, o un equipo tipo diafiltración.

El módulo de manipulación de células como se describe en el presente documento puede incluir un módulo de eliminación de células. Éste puede usarse cuando la muestra contiene células que no son requeridas en el ensayo o no son deseables. Generalmente, la eliminación de células se hará basándose en exclusión por tamaño como para el "tamizado", anteriormente, con canales que salen del módulo de manipulación de células que son demasiado pequeños para las células.

65 El módulo de manipulación de células como se describe en el presente documento puede incluir un módulo de concentración de células como se ha explicado resumidamente en el presente documento.

Los dispositivos como se describen en el presente documento pueden incluir un módulo de reacción. Éste puede incluir tanto alteración física, química como biológica de uno o más componentes de muestra.

Bombas

5 Los dispositivos como se describen en el presente documento pueden incluir al menos una bomba de fluido. Las bombas generalmente se clasifican en dos categorías: "sobre el chip" y "fuera del chip"; es decir, las bombas (generalmente bombas basadas en electrodo) puede estar contenidas dentro del propio dispositivo, o pueden estar contenidas sobre un aparato en el que está integrado el dispositivo, tal que el alineamiento se produzca de los

10 canales de flujo requeridos para permitir el bombeo de fluidos.

Las bombas como se describen en el presente documento pueden estar contenidas sobre el propio dispositivo. En una configuración, las bombas son bombas basadas en electrodo; es decir, puede usarse la aplicación de campos eléctricos para mover tanto partículas cargadas como disolvente a granel, dependiendo de la composición de la 15 muestra y del dispositivo. Bombas sobre el chip adecuadas incluyen, pero no se limitan a, bombas electroosmóticas (EO) y electrohidrodinámicas (EHD); estas bombas basadas en electrodo se han denominado algunas veces en la materia "bombas electrocinéticas (EK)". Todas estas bombas se basan en configuraciones de electrodos dispuestos a lo largo de un canal de flujo para producir el bombeo de los fluidos que comprenden los componentes de muestra. Como se describe en la materia, las configuraciones para cada una de estas bombas basadas en electrodo son

20 ligeramente diferentes; por ejemplo, la eficacia de una bomba EHD depende de la separación entre los dos electrodos, cuanto más próximos estén, más pequeña es la tensión que se requiere aplicar para efectuar el flujo de fluidos. Alternativamente, para bombas EO, la separación entre los electrodos debe ser mayor, con hasta la mitad de la longitud del canal en el que los fluidos están siendo movidos, ya que los electrodos solo están implicados en aplicar fuerza, y no, como en EHD, en crear cargas sobre las que actuará la fuerza.

25 También se describe en el presente documento el uso de una bomba electroosmótica. La electroosmosis (EO) se basa en el hecho de que la superficie de muchos sólidos, que incluyen cuarzo, vidrio y otros, llega a cargarse de distinta forma, negativamente o positivamente, en presencia de materiales iónicos. Las superficies cargadas atraerán contraiones opuestamente cargados en soluciones acuosas. La aplicación de una tensión produce una

30 migración de los contraiones al electrodo opuestamente cargado, y también mueve la masa del fluido. El caudal volumétrico es proporcional a la corriente, y el flujo volumétrico generado en el fluido también es proporcional a la tensión aplicada. El flujo electroosmótico es útil para líquidos que tienen alguna conductividad y generalmente no es aplicable para disolventes no polares. Las bombas EO se describen en las patentes de EE.UU. N.º 4.908.112 y 5.632.876, PCT/US95/14586, que se publicó como el documento WO 96/39252, y el documento WO 97/43629.

35 También se describe en el presente documento el uso de una bomba electrohidrodinámica (EHD). En EHD, los electrodos en contacto con el fluido transfieren carga cuando se aplica una tensión. Esta transferencia de carga se produce tanto por transferencia como eliminación de un electrón a o del fluido, de forma que el flujo de líquido se produce en la dirección desde el electrodo de carga al electrodo opuestamente cargado. Las bombas EHD pueden

40 usarse para bombear fluidos resistivos tales como disolventes no polares. Las bombas EHD se describen en la patente de EE.UU. N.º 5.632.876.

También se describe en el presente documento el uso de una bomba micromecánica, tanto sobre como fuera del chip, como se conoce en la técnica.

45 También se describe en el presente documento el uso de una bomba "fuera del chip". Por ejemplo, los dispositivos como se describen en el presente documento pueden integrarse en un aparato o dispositivo que tenga un sitio de incorporación para sujetar el dispositivo, que pueda registrar los puertos (es decir, puertos de entrada de muestra, puertos de entrada de fluido y puertos de salida de residuos) e hilos de electrodo. El aparato puede incluir bombas

50 que pueden aplicar la muestra al dispositivo. Tales bombas son muy conocidas en la técnica.

Los dispositivos como se describen en el presente documento pueden incluir al menos una válvula de fluidos que puede controlar el flujo de fluidos dentro o fuera de un módulo del dispositivo, o desviar el flujo en uno o más canales. Se conocen en la técnica varias válvulas. Por ejemplo, la válvula como se describe en el presente 55 documento puede comprender una barrera capilar, como generalmente se describe en el documento PCT/US97/07880, que se publicó como el documento WO 97/43629. El canal como se describe en el presente documento se abre en un espacio más grande diseñado para favorecer la formación de una superficie de líquido que minimiza la energía tal como un menisco en la abertura. Preferentemente, las barreras capilares incluyen una presa que eleva la altura vertical del canal inmediatamente antes de la abertura de un espacio más grande tal como una

60 cámara. Además, como se describe en la patente de EE.UU. N.º 5.858.195, puede usarse un tipo de "válvula virtual".

Los dispositivos como se describen en el presente documento pueden incluir puertos de cierre, para permitir la introducción de fluidos, que incluyen muestras, en cualquiera de los módulos como se describen en el presente 65 documento, con cierre posterior del puerto para evitar la pérdida de la muestra.

Los dispositivos como se describen en el presente documento pueden incluir al menos un módulo de almacenamiento para los reactivos de ensayo. Éstos están conectados a otros módulos del sistema usando canales de flujo y puede comprender pocillos o cámaras, o canales de flujo extendidos. Pueden contener cualquier número de reactivos, tampones, enzimas, mediadores redox, agentes antimicrobianos, sales, etc., que incluyen reactivos

5 secados que pueden reconstituirse usando flujo en línea, almacenamiento, dilución y dispensación selectiva.

También se describe en el presente documento el uso de una pluralidad de módulos de almacenamiento en un cartucho que almacenan una pluralidad de diferentes agentes antimicrobianos y otros reactivos según se necesiten, que incluyen colorantes (por ejemplo, tinciones mortales, ligandos de unión específica, etc.).

Los dispositivos como se describen en el presente documento pueden incluir un módulo de mezcla; otra vez, en cuanto a los módulos de almacenamiento, éstos puede ser canales de flujo extendidos (particularmente útiles para la mezcla controlada), pocillos o cámaras. Particularmente en el caso de los canales de flujo extendidos, pueden tener protuberancias sobre el lado del canal para producir la mezcla.

15 Los dispositivos como se describen en el presente documento pueden incluir un módulo de detección. Como se ha explicado resumidamente en el presente documento, hay varias formas básicas en las que pueden ejecutarse los ensayos como se describen en el presente documento, que generalmente incluyen la presencia o ausencias de marcas.

Fabricación de biosensores

Los dispositivos como se describen en el presente documento pueden estar hechos en varias formas, como será apreciado por aquellos en la materia. Véanse, por ejemplo, el documento WO 96/139260, dirigido a la formación de 25 conductos eléctricos impermeables a fluidos; la patente de EE.UU. N.º 5.747.169, dirigida al sellado; documentos EP 0637996 131; EP 0637998 1311; WO 96/39260; WO 97/16835; WO 98/13683; WO 97/16561; WO 97/43629; WO 96/39252; WO 96/15576; WO 96/15450; WO 97/37755; y WO 97/27324; y las patentes de EE.UU. N.º 5.304.487; 5.071.531; 5.061.336; 5.747.169; 5.296.375; 5.110.745; 5.587.128; 5.498.392; 5.643.738; 5.750.015; 5.726.026; 5.35.358; 5.126.022; 5.770.029; 5.631.337; 5.569.364; 5.135.627; 5.632.876-15.593.838; 5.585.069; 5.637.469; 5.486.335; 5.755.942; 5.681.484; y 5.603.351. Técnicas de fabricación adecuadas dependerán nuevamente de la elección del sustrato, pero métodos preferidos incluyen, pero no se limitan a, varias técnicas de micromecanizado y microfabricación, que incluyen procesos de deposición de película tales como recubrimiento por centrifugación, deposición química de vapor, fabricación por láser, técnicas fotolitográficas y otras de grabado usando tanto procesos químicos en húmedo como procesos de plasma, estampado en relieve, moldeo por inyección y técnicas de

35 unión (véase la patente de EE.UU. N.º 5.747.169).

Sistemas de detección

Varios métodos de detección en tiempo real son convenientes para su uso con el método de la invención, que incluye microscopía confocal conjuntamente con dispersión, fluorescencia, fósforos sobreconversores, puntos cuánticos u otros indicadores, además de resonancia de plasmones superficiales (SPR). La microscopía confocal se aprovecha de una profundidad muy superficial del campo, de forma que objetos lejos de la superficie están fuera de foco y la energía de la luz es tanto dispersada como se reduce mediante filtrado espacial. También es posible la obtención de imágenes similar a la obtención de imágenes confocal usando objetivos de apertura numérica muy

45 grandes que también tienen profundidad superficial de campo. La resonancia de plasmones superficiales usa una disposición de componentes similar a la de la detección usando arquitectura no de guía de ondas de rebote único, como se ha descrito anteriormente, en la que la superficie superior del vidrio está recubierta con una superficie metálica reflectante que es convenientemente oro. En este caso, la cantidad de luz reflejada por el oro se afecta por la presencia de material unido a los microorganismos unidos a la superficie de detección. La resonancia de plasmones superficiales es muy adecuada para el método de la presente invención, en la que la superficie de oro puede servir tanto de superficie reflectante, además de electrodo para su uso en la aceleración de la reacción y la discriminación de fuerzas de unión.

Los métodos anteriores tienen la ventaja de que los microorganismos que se unen a la superficie de detección son

55 visibles y distinguibles incluso en presencia de microorganismo no unido, ya que solo la diana que se une es visible. Sin embargo, en el presente documento también se describen disposiciones alternativas de iluminadores y detectores, dado que los microorganismos no unidos pueden eliminarse de la región de detección, tanto por eliminación de la solución en la que los microorganismos se proporcionan (por ejemplo, como se muestra más adelante en el caso de cámaras para la detección de bacterias), como mediante el secuestro de los microorganismos en otra región. El último método puede implicar, por ejemplo, la electroforesis del microorganismo a otro electrodo que no está en la trayectoria óptica tanto en el detector y/o iluminador.

Algunas de las disposiciones que se describen en el presente documento pueden entenderse con referencia a dos sustratos paralelos (un sustrato más bajo y uno más alto) con electrodos sobre estos sustratos que se enfrentan el 65 uno al otro a través de un hueco interno. Los presentes inventores pueden entonces definir de abajo a arriba cuatro superficies diferentes – la superficie de abajo más baja, la superficie de abajo más alta (es decir, con un electrodo

sobre el que se deposita la sonda), la superficie de arriba más baja (es decir, con un electrodo sin sonda) y una superficie de arriba más alta. El detector en general estará tanto debajo de la superficie de abajo más baja como encima de la superficie de arriba más alta (es decir, no está en el hueco entre los dos sustratos).

5 Si el detector está debajo de la superficie de abajo más baja, entonces el electrodo sobre la superficie de abajo más alta generalmente será transparente, excepto en el caso de resonancia de plasmones superficiales. En el caso de resonancia de plasmones superficiales, el detector también debe estar debajo de la superficie de abajo más baja. La iluminación puede ser también tanto debajo de la superficie de abajo más baja, pasando a través del electrodo de sustrato de abajo, con luz retro-dispersa, luz evanescente (que se refleja de la superficie de abajo más alta), como luz que se indica que excita fluoróforos, fósforos sobreconversores o puntos cuánticos. Alternativamente, la iluminación puede ser desde dentro del sustrato inferior, como se ha descrito anteriormente. Por tanto, la iluminación puede ser de dentro del hueco entre los dos sustratos, que generalmente sería mejor para una aplicación de dispersión de la luz. Alternativamente, la iluminación puede ser desde encima de la superior de arriba más alta, pasando a través del sustrato de arriba, a través del hueco, y luego a la superficie de abajo más alta donde

15 interacciona con la diana o una diana marcada. En aquellos casos, una vez más, el detector puede detectar tanto luz dispersada (por ejemplo, luz dispersada hacia adelante), o fluoróforos, fósforos sobreconversores, o puntos cuánticos, como las muestras pueden visualizarse para campo brillante, campo oscuro, fase u otras formas de obtención de imágenes microscópicas (generalmente usando luz de un condensador).

Si el detector está encima de la superficie de arriba más alta, que recibe luz de la diana marcada, en este caso el electrodo sobre la superficie de abajo más alta no necesita ser transparente, mientras que el electrodo sobre la superficie de arriba más baja debe ser transparente. Si la superficie de abajo más alta es opaca, entonces la iluminación debe tanto proceder de encima de la superficie de electrodo, o generarse en la diana marcada, como podría producirse con quimioluminiscencia. Con una superficie de abajo más alta opaca, la iluminación puede estar

25 dentro de la tapa (lo más probablemente para el análisis de luz dispersada), y de otro modo lo más probablemente para luz dispersada o iluminación de excitación para fluoróforos, fósforos sobreconversores, o puntos cuánticos. Si el electrodo sobre la superficie de abajo más alta es transparente, sin embargo, puede transmitirse luz desde abajo, que incluye por iluminación de onda evanescente como se ha descrito anteriormente.

Aunque el detector es generalmente un generador de imágenes (por ejemplo, una cámara CCD o CMOS), también puede comprender un escáner láser con un PMT u otro dispositivo de recogida de luz. En ciertos casos, el detector también puede implicar un dispositivo de recogida de luz general (PMT, fotodiodo, fotorresistor) con iluminación difusa. El último caso se usará principalmente en aquellos casos en los que la señal promediada con respecto al área proporcione señal adecuada, como se trata más adelante.

35 Si se usa una cámara CCD o CMOS, la información se obtiene píxel por pixel, generalmente en escala de grises de 8-12 bit, aunque en ciertos casos (por ejemplo, con indicadores codificados para color para diferentes dianas) pueden usarse alternativamente una imagen de color. En aquellos casos en los que sea útil o importante registrar eventos de unión a diana individuales, hay posiblemente dos modos de operación. En un primer modo, la unión a diana está limitada, de manera que solo una fracción de los píxeles se registran con una señal – la mayoría de los píxeles están a cierto nivel de fondo, de manera que el cambio del nivel de fondo a un nivel significativamente por encima del nivel de fondo a un píxel indica un evento de unión. Dependiendo del tamaño de la diana (y/o su marca), un único evento de unión puede corresponderse con un aumento en la señal por encima del fondo a varios píxeles contiguos diferentes (la mayoría del software de procesamiento de imágenes tiene rutinas que pueden agrupar

45 juntas regiones de píxeles contiguos en "eventos" distintos). En este caso, el intervalo dinámico del sistema oscila de menos de 100 dianas y es tan pequeño como 1 diana (y está limitado por la variación estadística del número pequeño de dianas), hasta aproximadamente tan alto como el número de píxeles en la cámara dividido entre el número promedio de píxeles por diana (con un suelo de uno), y entonces dividido entre un factor que se aproxima a 10, que es el "punto de saturación" al que las nuevas dianas se solaparían más probablemente con las dianas existentes en vez de depositarse sobre áreas con aproximadamente niveles de fondo de señal. Para una cámara con 5 megapíxeles, y una diana que engloba aproximadamente 2 píxeles, esto se corresponde con un intervalo dinámico que engloba aproximadamente de 10 a 250.000 dianas, o un intervalo dinámico de 25.000. Este intervalo es adecuado para muchas aplicaciones, y en aquellas aplicaciones para las que se requiere un mayor intervalo dinámico, pueden usarse múltiples diluciones.

55 En un segundo modo, pueden discriminarse las diferencias entre una única diana y diferentes números de dianas dentro de un píxel. Por ejemplo, si la señal se mide con un píxel de 8 bit, con 256 niveles, y un señal de fondo es 12, entonces un único evento de unión podría promediar 62, dos dianas en el mismo píxel podrían promediar 112, etc. En este caso, el intervalo dinámico es mucho más alto, y es aproximadamente el número de píxeles por el número de niveles que pueden ser discriminados dividido entre el número promedio de píxeles por diana (con un suelo de uno) y adicionalmente dividido entre un factor de aproximadamente 10, que representa la saturación a la que la unión de diana adicional podría incrementar niveles en un número significativo de píxeles por encima del nivel de saturación de píxeles. En este caso, siendo 5 niveles capaces de ser discriminados y siendo un número promedio de píxeles por diana 1, el intervalo dinámico es todavía aproximadamente un mínimo de 10 (limitado únicamente por

65 consideraciones estadísticas), pero el nivel superior se extiende ahora a aproximadamente 2,5 millones, o un intervalo dinámico de diez veces adicional del ejemplo previo. La dificultad encontrada con este segundo modo de

operación es que cada vez es más difícil distinguir unión específica de no específica basándose en el análisis de imágenes -tanto debido a que en promedio cada diana engloba un número de píxeles más pequeños, como debido a que el contraste entre diferentes niveles es generalmente malo.

5 Aunque estos métodos pueden distinguir eventos de unión individuales, debe observarse que el mayor valor de recuento de eventos de unión individuales se produce cuando hay unión no específica significativa u otras formas de ruido. Por ejemplo, puede sumarse el ruido de fondo de bajo nivel a lo largo de un gran área para comprender una señal de mayor ruido, para el que se requiere mostrar una cantidad grande de señal específica por encima del fondo. Sin embargo, en casos en los que las señales son generalmente grandes por encima del fondo, puede ser conveniente usar un método de suma de señales, en el que la señal se suma tanto añadiendo los valores de señal a cada píxel como usando una técnica de suma análoga tal como el uso de un fotodiodo o un fotorresistor o un tubo fotomultiplicador (PMT).

Debe observarse que mientras que ITO u otro material de electrodo transparente es preferible para monitorizar en

15 tiempo real mediante indicadores visibles, esto no significa que tanto el cátodo como el ánodo necesiten estar comprendidos de ITO. En otros casos, puede ser preferible que uno de los electrodos sea transparente, que permite la observación en la celda de reacción, mientras que el otro electrodo es un electrodo opaco relativamente no reactivo, tal como oro o un metal refractario, tal como platino, paladio o iridio, que son estables en la electroforesis. En estos casos, la resistencia en el electrodo metálico será muy pequeña, que puede reducir los efectos de falta de homogeneidad encima, y además, el potencial sobre el electrodo metálico puede no tener el mismo efecto perjudicial que sobre el electrodo de ITO (por ejemplo, con un electrodo de Pt), que permite potencial más alto que va a usarse en la celda. Alternativamente, ambos electrodos pueden ser opacos, estando un electrodo recubierto con oro. En este caso, la detección puede hacerse ópticamente mediante resonancia de plasmones superficiales.

25 Hay varios otros componentes que comprenden sistemas completos como se describen en el presente documento, que incluye controladores de potencia para establecer las diferencias de potencial entre los electrodos que causarán y controlarán la fuerza electroforética sobre los microorganismos, iluminadores, detectores y controladores de almacenamiento (por ejemplo, controladores y unidades de disco duro) que guardan la información de los detectores y entonces la presentan al usuario o comparan información de múltiples fuentes o veces. Algunos de estos componentes son muy conocidos en la técnica, tales como fuentes de alimentación de electroforesis (que pueden ser controladas por ordenador y que pueden establecerse para proporcionar tanto tensión constante como corriente constante, y que pueden ser complementadas con circuitería electrónica digital o analógica para proporcionar formas de onda de frecuencia de baja a alta como se describe en cualquier parte en esta memoria descriptiva y que también pueden usarse para dielectroforesis), iluminadores (por ejemplo, láseres, lámparas de arco, lámparas

35 incandescentes, condensadores de luz de microscopio, y que pueden implicar métodos de acoplamiento de la luz en guía de onda de luz), indicadores (como se han descrito anteriormente y más adelante), detectores (cámaras, lentes, conjuntos de filtro, software de análisis de imágenes), y similares, aún cuando su disposición y uso sea novedoso y para el efecto novedoso como se describe en el presente documento. Donde los componentes se diferencian del estado de la técnica, se tratarán tanto anteriormente como más adelante.

El detector automatizado puede comprender un detector óptico. El detector óptico puede utilizar métodos de detección óptica que incluyen obtención de imágenes de dispersión de la luz, obtención de imágenes de campo brillante, obtención de imágenes de campo oscuro, resonancia de plasmones superficiales, obtención de imágenes de fase, obtención de imágenes de fluorescencia, obtención de imágenes de fósforo sobreconversor, obtención de

45 imágenes de puntos cuánticos y obtención de imágenes de quimioluminiscencia.

En una realización, se usan técnicas de iluminación evanescente para la detección; véase el documento U.S.S.N. 10/888.828, que se publicó como el documento US 2005-048599.

Los siguientes ejemplos sirven para describir más completamente el modo de uso de la invención anteriormente descrita, además de exponer los mejores modos contemplados para llevar a cabo diversos aspectos de la invención.

Ejemplos

55 Ejemplo 1 -Concentración electrocinética

Se construyó una celda de flujo intercalando dos portaobjetos de microscopio de vidrio modificados con ITO entre una estructura de laminado de plástico que forma una celda de flujo de 4 canales como se ilustra en la Figura 50. La distancia entre las superficies de los portaobjetos es aproximadamente 500 micrómetros. El portaobjetos de ITO inferior se recubrió previamente con OptiChem reactivo con amina (Accelr8) y se modificó químicamente con dietilentriamina (DETA) para dar una superficie de captura de bacterias catiónica.

Se inyectó una mezcla de 1 x 107 UFC/ml de Staphylococcus aureus en hidroquinona 10 mM, OTT 10 mM y CAPS 10 mM a pH 6,5 en una cámara de flujo. Se aplicó una diferencia de potencial (1,6 V) a través de los portaobjetos de 65 ITO durante aproximadamente 3 minutos para concentrar y unir en la superficie las bacterias al electrodo de ITO OptiChem modificado con DETA. Las fotomicrografías de la superficie del ánodo antes de la aplicación del potencial

y 50 segundos después muestran la presencia de microorganismos de S. aureus electrocinéticamente concentrados. El número de bacterias dentro de un área predeterminada se representó en función del tiempo después de la aplicación del potencial, y en el plazo de 30 segundos, el número de bacterias se había saturado, y de otras mediciones se supo que incluía casi todas las bacterias en la muestra original (datos no mostrados).

Ejemplo 2 -Crecimiento de microorganismos

La solución redox del Ejemplo 1 se sustituyó con medio de crecimiento de soja tríptica y se incubó a 37 ºC sobre un microscopio invertido para establecer crecimiento detectable de bacterias unidas a la superficie de DETA. Se tomaron fotomicrogafías de S. aureus al principio del crecimiento y después de diferentes tiempos de incubación (datos no mostrados). Las fotomicrogafías se tomaron con ópticas de fase, y el estallido que rodea las bacterias indica la presencia de bacterias adicionales resultantes de la división celular de las bacterias originales. Así, el crecimiento bacteriano puede seguir la concentración electrocinética.

15 Ejemplo 3 -Susceptibilidad a AOA

Bacterias concentradas y cultivadas como en los Ejemplos 1 y 2 se expusieron a 5 microgramos/ml de oxacilina a la que la cepa de S. aureus usada era susceptible. Simultánea a la administración de oxacilina fue la administración de yoduro de propidio 10 micromolar, que excluye células vivas, y así cuya presencia en imágenes de fluorescencia es indicativa de muerte celular. Se tomaron fotomicrografías de las bacterias al principio del tratamiento con AOA, bajo microscopía de contraste de fases y de fluorescencia, y se tomaron imágenes adicionales una hora después (datos no mostrados). Hubo un gran aumento en la fluorescencia, que indicó la gran cantidad de muerte celular de la administración de oxacilina.

25 Ejemplo 4 -Modelado de la susceptibilidad a AOA

Puede modelarse el efecto de la oxacilina sobre S. aureus usando una función matemática de Hill:

Ømáx

Efecto =

ET50 +

donde Emáx es equivalente al máximo efecto con el tiempo t, ETW es el tiempo al que se logra la mitad del máximo efecto y n es el factor de forma para el efecto. El número de bacterias a tiempo t es equivalente al efecto restado de la población inicial de bacterias (N°).

Ømáx

4 = 44 −

ET50 +

35 El factor de forma n, Emáx y ET50 pueden modelar adecuadamente el crecimiento o la muerte de bacterias en función del tiempo.

La determinación de CMI de la microdilución de caldo NCCLS implica la exposición de un inóculo normalizado (aproximadamente 1 x 105 UFC/ml) a una concentración de antibiótico durante un periodo de tiempo definido (24 h) bajo entorno rigurosamente controlado (caldo de Muellerhinton ajustado con cationes a 37 ºC). La CMI se define como la concentración mínima a la que se impide el crecimiento de organismos por debajo del límite de detección umbral a simple vista (1x107 UFC/ml). La correlación de mediciones cinéticas de velocidades de crecimiento y la viabilidad con métodos de CMI y CMB de NCCLS normalizados puede, por tanto, estimarse usando modelos matemáticos de crecimiento y/o muerte de bacterias.

45 El NCCLS define el punto de ruptura de S. aureus resistente a oxacilina como el crecimiento detectable en un ensayo de microdilución de caldo a o por encima de 0,12-0,5 ug/ml. Es preferible minimizar las concentraciones de antibiótico analizadas de manera que concentraciones individuales de antibióticos a o por encima de los puntos de ruptura puedan usarse para realizar la prueba de susceptibilidad diagnóstica cinética.

El modelado matemático de los efectos de antibióticos sobre el crecimiento de bacterias puede ser muy útil en correlacionar curvas de diagnóstico cinético con puntos de ruptura establecidos usados para clasificar bacterias como susceptibles, intermedias o resistentes. Por ejemplo, puede ajustarse la generación cinética de bacterias e interacciones de fármacos en tiempo real. Una vez se cumplen los parámetros cinéticos, los datos pueden

55 extrapolarse para estimar la concentración bacteriana final a las 24 horas. Pueden definirse ventanas de los criterios de valoración para correlacionar la eficacia de antibiótico con métodos estándar de oro. Muestras bacterianas con concentraciones significativamente inferiores a 1 x 106 UFC/ml se llamaron susceptibles, en el intervalo de 1x1061x107 UFC/ml se llamaron intermedias, y significativamente superiores a 1x107 se llamaron resistentes.

Las curvas de crecimiento de bacterias muestran la curva en forma de "S" que consiste en una fase de latencia inicial, seguida de una fase de crecimiento exponencial, y entonces se logra una fase estacionaria cuando el

crecimiento es de recursos limitados. El crecimiento de bacterias en cultivos de caldo líquido (métodos de microdilución de caldo NCCLS) ralentiza la fase estacionaria a aproximadamente 1x108 a 1x109 UFC/ml. Por tanto, Emáx para bacterias en cultivos líquidos es aproximadamente 1x109 definido para fines de modelado donde n y ET50 definen la velocidad a la que las bacterias crecen. El valor de n y de ET50 se determina a partir de datos de diagnóstico cinético y pueden desarrollarse reglas de ajuste. Por ejemplo, la velocidad máxima de cambio de crecimiento de insectos no puede superar la constante de velocidad de crecimiento definida para las bacterias de fase exponencial (bacterias no expuestas) como se describe por la ecuación exponencial tradicional:

10 donde N = concentración de bacterias a tiempo t, y No es la concentración de bacterias inicial. Las bacterias expuestas a antibióticos probablemente cambian las velocidades de crecimiento en las que la constante ken es relevante. Como ambos modelos describen el crecimiento de bacterias en función del tiempo, pueden ser equivalentes (después del tiempo de latencia y antes de la aparición de la fase estacionaria). El reordenamiento da

15 keg en términos de n, EC50, Emáx y t:

Por tanto, a tiempo t y Emáx previamente definido, n y CE50 no pueden dar Keg> K0. Además, el modelo de Emáx

20 puede convertirse fácilmente en una velocidad de crecimiento que tiene una correlación física intuitiva con el tiempo de duplicación de bacterias. Keg positivo se correlaciona con el crecimiento de bacterias y Ken negativo se correlaciona con la muerte de bacterias. El ajuste de parámetros puede ser completo tras la determinación del máximo efecto del antibiótico, o registro de la cinética hasta el punto de inflexión de la curva de respuesta, o reuniendo mínimamente datos suficientes que permitan la confianza estadística en la definición del factor de forma y

25 EC50 de la curva antes de un punto de inflexión.

Se hicieron gráficos de modelos de crecimiento de diferentes cepas de S. aureus después de la administración de 5 microgramos/ml de oxicilina. Las constantes de crecimiento durante la fase de crecimiento exponencial son aproximadamente 2,3, que se correlacionan con aproximadamente una duplicación cada 20 minutos en el caso de

30 bacterias resistentes a oxicilina. Las curvas muestran los efectos de la oxicilina sobre una tinción de S. aureus de resistencia intermedia (datos no mostrados); el crecimiento después de 24 h es del orden de 1 x 107 UFC/ml, y significativamente más bajo que el de las bacterias resistentes. El crecimiento con una cepa de S. aureus que es susceptible a oxicilina muestra una constante de crecimiento Kef negativa que indica muerte de bacterias en función del tiempo.

35 Una vez las bacterias y antibióticos se describen matemáticamente, los modelos pueden usarse para estimar resultados obtenidos por métodos AST estándar de oro. Los espectaculares efectos sobre las velocidades de crecimiento de bacterias (no se observa crecimiento durante 16 h) y los resultados de viabilidad muestran un buen ajuste entre los datos reales y los modelos para los efectos de 5 microgramos/ml de oxicilina sobre el crecimiento de

40 S. aureus susceptible, usando datos medidos a partir de métodos previamente tratados, con el uso de tinción de yoduro de propidio por encima de un umbral usado para determinar la viabilidad celular. Tal modelado permite la determinación de susceptibilidad de las bacterias como se define por puntos de ruptura predefinidos ya que:

Kef es inferior a cero ya que las bacterias están muriendo con respecto al tiempo.

45 El punto de inflexión encontrado a la hora 1 que determina una pendiente negativa a la máxima velocidad de cambio de bacterias con respecto al tiempo que indica alta velocidad de muerte de bacterias.

Efecto esencialmente completo al final de la hora 2 que reduce la población global de bacterias. No se presenta 50 crecimiento observable en la muestra.

Dada la concentración de los presentes inventores por encima del punto de ruptura definido de NCCLS para oxacilina y S. aureus, los presentes inventores usan diagnósticos cinéticos para identificar una muestra de S. aureus susceptible después de una incubación con oxacilina de 1 -2 horas. El modelado también puede proporcionar

55 medios para describir mejor los efectos de antibióticos que permiten comparaciones cuantitativas de antibióticos caracterizados como susceptibles por las normas de NCCLS, pero con diferentes velocidades de aniquilación. Pueden determinarse antibióticos con la velocidad de aniquilación más rápida y más eficaz e informarse para relevancia clínica.

S. aureus y oxacilina alcanzan el estado estacionario en el que se identificaron dos clases de bacterias dentro de la

muestra de prueba. Una clase de S. aureus se tiñó con yoduro de propidio que indica pérdida de viabilidad, mientras que la otra clase no se tiñó, pero se duplicó durante el transcurso de la exposición a antibiótico. Después de la exposición a antibiótico, los estudios realizados usando S. aureus y oxacilina indicaron que ninguno de los organismos de S. aureus se duplicó después de 3-5 horas de incubación, que indica un estado de inactividad o

5 criptobiosis incapaz de generar velocidades significativas de crecimiento. Esta clase de organismos debe considerarse muerta para los fines de correlación de la cinética de bacterias con la susceptibilidad a NCCLS.

La forma de las bacterias, cinética de antibióticos y dependen mucho del mecanismo de acción de los antibióticos sobre el organismo. Se probó gentamicina, un inhibidor de la síntesis de proteínas, y sus efectos cinéticos sobre E. coli susceptible. ken es negativa, el punto de inflexión se produjo alrededor de la hora 2 con Em.., y estuvo completo después de aproximadamente 4 horas de exposición. Las diferencias cinéticas son evidentes en comparación con S. aureus y los efectos de oxicilina.

Ejemplo 4

15 Demostración del dispositivo y método para la concentración rápida y detección de microorganismos en una superficie de detección

En este ejemplo los presentes inventores demuestran un dispositivo y método rápido para concentrar microorganismos en una superficie de detección usando concentración electrocinética (EKC).

Celda de flujo microfluídica. El dispositivo de celda de flujo descrito en este ejemplo proporciona funcionalidad microfluídica, electroquímica y óptica. El dispositivo consiste en una junta que define una celda de flujo con dimensiones de canal 30 x 2,5 x 0,5 mm (L x W x H) (Grace BioLabs, Inc.). La junta está intercalada entre dos

25 portaobjetos de vidrio recubiertos con óxido de indio y estaño (ITO) (Delta Technologies). Con el fin de proporcionar acceso del fluido a la celda de flujo, se taladraron orificios a través del electrodo de ITO superior en localizaciones que proporcionan acceso a una cámara de junta cuando el dispositivo se ensambla. La parte de atrás o el exterior de estos orificios se ajustan con accesorios adhesivos NanoPort ™ (Upchurch Scientific), que permiten la conexión de tubería de plástico a la celda de flujo. El bombeo de fluido a través de la tubería es mediante una bomba de jeringa (Kloehn, Inc.). Un sistema de válvulas unido a la bomba Kloehn permite que soluciones de reactivo de diferentes depósitos sean bombeadas en la celda de flujo. Está disponible un puerto de acceso de jeringa adicional en entrada de tubería a la celda de flujo, que permite introducir reactivos, materiales o muestras bacterianas de bajo volumen a la celda de flujo. Debido a que los portaobjetos de ITO-vidrio son transparentes, hay acceso óptico a la celda de flujo completa. Para aplicaciones electroquímicas, los electrodos de ITO superior e inferior se unieron a una fuente de

35 alimentación mediante clips de alambre unidos directamente al portaobjetos.

Además de la celda de flujo basada en junta descrita en el párrafo previo, los ensayos en este ejemplo también se han realizado en cartuchos de plástico laminado equipados con electrodos de portaobjetos de ITO-vidrio, tales como los mostrados en la Figura 4D y 4E.

La celda de flujo se mantiene a aproximadamente 35 ºC calentando resistivamente el portaobjetos de ITO superior. Se une una fuente de alimentación mediante clips en extremos opuestos del portaobjetos. Los flujos de corriente a través de la superficie de ITO causan el calentamiento. Con el fin de monitorizar la temperatura, se inserta un termopar en un pocillo de fluido detector de temperatura en el portaobjetos.

45 Preparación de superficies de afinidad. Antes de ensamblar la celda, el electrodo inferior o de captura se recubrió con un componente de afinidad al que se une irreversiblemente el microorganismo. El componente de afinidad en este experimento era un recubrimiento de dos partes que comprendía albúmina de suero bovino (BSA) y el polipolímero catiónico poli-L-lisina (PLL). El recubrimiento de componente de afinidad se preparó del siguiente modo. Primero, los portaobjetos de ITO-vidrio se limpiaron cuidadosamente usando una sonicación en detergente (Alconox) caliente (60 ºC) de 15 minutos, seguido de una sonicación en agua caliente de 15 minutos. Después de sacar del segundo sonicador, el portaobjetos se lavó ampliamente con agua ultrapura y se centrifugó en una centrífuga (Beckman) equipada con un portador de portaobjetos de brazo articulado. Una vez secos, los portaobjetos secos se recubrieron con PLL usando protocolos de la bibliografía bien establecidos. Brevemente, los portaobjetos se

55 sumergieron en una solución que contenía aproximadamente 0,01 % de PLL en 0,1X solución salina tamponada con fosfato (PBS). Los portaobjetos se incubaron en la solución de PLL a temperatura ambiente durante una hora, luego se aclararon con agua ultrapura y entonces se centrifugaron. Los portaobjetos de PLL secos se sellaron entonces por calor con una bolsa de desecante en una bolsa de barrera de lámina y se dejó que envejecieran durante cuatro días a temperatura ambiente.

Después de cuatro días de envejecimiento, los portaobjetos se sacaron del envase y se sumergieron en una solución que contenía 5 % (peso/volumen) de BSA (Sigma) en PBS. La incubación de BSA avanzó a temperatura ambiente durante una hora, momento en el que los portaobjetos se aclararon con PBS que contenía 0,01 % de Tween20 (PBST) y luego con agua ultrapura. Entonces, los portaobjetos se centrifugaron y estuvieron listos para

65 uso. Aunque se desea unir fuertemente los microorganismos al electrodo de abajo, es generalmente deseable mantener

los microorganismos fuera de todas las superficies en el dispositivo microfluídico. Se trata particularmente del portaobjeto de ITO superior, que además de servir de electrodo superior también define la parte superior del flujo. Por este motivo, el electro de ITO superior se recubrió con una superficie de polímero no específico de baja unión llamada OptiChem® (patente de EE.UU. 6.844.028).

5 Concentración electrocinética (EKC). Se realizó EKC de un modo idéntico para cada microorganismo. Las etapas fueron las siguientes. Se centrifugaron soluciones de caldo de soja tríptica bacteriana de reserva para sedimentar organismos. El sedimento se resuspendió en histidina 1 mM como una etapa de lavado y entonces se re-sedimentó. Este sedimento se resuspendió entonces en tampón de concentración electrocinética (EKC). El tampón EKC era una solución acuosa que contenía histidina 1 mM, hidroquinona 10 mM y DTT 40 mM a pH 6,8. La resuspensión fue a una concentración de organismo estimada de 1E+07 UFC/ml. La suspensión de bacterias/tampón EKC se bombeó entonces en la celda de flujo microfluídica. Se monitorizó un campo de vista de microscopio en la celda de flujo, 0,593 x 0,444 mm, durante todo el procedimiento completo. La bomba se detuvo una vez la celda de flujo estaba llena. En ese momento, se encendió la alimentación a los electrodos de ITO, y la concentración electrocinética

15 avanzó durante 5 minutos a 1,6 V. Al final de los 5 minutos, esencialmente todos los organismos migraron a la superficie de afinidad (BSA-PLL) donde se unieron a la superficie, y se apagó la alimentación a los electrodos.

Tras la EKC, la celda de flujo se lavó bombeando aproximadamente 1 ml de tampón de histidina a través del sistema. Éste eliminó cualquier organismo unido libremente y, lo que es más importante, desalojó el tampón de EKC. El lavado de histidina fue entonces seguido de un lavado de medio de crecimiento de caldo de soja tríptico.

Obtención de imágenes. La detección en este ejemplo es por microscopía de campo oscuro realizada en un microscopio invertido Olympus IX71 personalizado equipado con un objetivo 20X LCPlan Fluor con una 0,40 NA. El microscopio está equipado con una cámara Optronics MicroFire CCD y software de adquisición de imágenes.

25 Cepas bacterianas modelo. La cepa bacteriana primaria usada en este y varios ejemplos siguientes es Klebsiella pneumoniae (ATCC 700603). Cepas bacterianas adicionales investigadas incluyen: Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Escherichia coli (ATCC 25922), Escherichia coli 0157:H7, Pseudomonas aeruginosa (ATCC 49189), Stenotrophomonas maltophilia (ATCC 13637), Klebsiella pneumoniae (ATCC 49472), Acinetobacter (ATCC 49139), Streptococcus pneumoniae (ATCC 49136) y Haemophilus influenzae (ATCC 10211). Estas bacterias constituyen un panel importante de microorganismos patógenos con relevancia particular para la neumonía intrahospitalaria.

Imágenes representativas de lapso de tiempo. Se proporcionan imágenes de microscopía de campo oscuro representativas de K. pneumoniae (ATCC 700603) durante la concentración electrocinética en la Figura 5. La Figura

35 5(a) muestra la superficie de detección en el momento de introducción de la muestra en la celda EKC. Esta imagen muestra que inicialmente muy pocos organismos están localizados en la superficie. La Fig. 5b proporciona una imagen de la superficie de detección después de 1 minuto de EKC. Pueden observarse un gran número de microorganismos en el plano de la superficie de detección. Las bacterias que se aproximan a la superficie de detección aparecen como fuera de manchas de foco. La Fig. 5(c) muestra la superficie de detección después de 2 minutos de EKC. Aquí un número incluso más grande de bacterias están en el plano de detección. Finalmente, la Fig. 5(d) muestra la superficie de detección después de 3 minutos de EKC, momento en el que la concentración es completa, esencialmente no más bacterias entran en el campo de vista. Esta secuencia de fotos demuestra la rápida concentración de la muestra bacteriana en la superficie de detección.

45 Resultados de EKC para un panel de microorganismos. Se ha probado varias bacterias patógenas con el fin de demostrar la amplia compatibilidad del enfoque de EKC con microorganismos clínicamente relevantes. La Figura 6 muestra perfiles de concentración electrocinética en forma del número de bacterias capturadas en función del tiempo. Los resultados demuestran claramente que todos los microorganismos en este panel de neumonía clínicamente relevante pueden ser rápidamente concentrados a una superficie de detección.

Ejemplo 5

Demostración del dispositivo y método para la identificación rápida y mapeo de microorganismos en una superficie de detección usando inmunoquímica

55 En este ejemplo los presentes inventores demuestran un dispositivo y método rápido para identificar especies de microorganismos usando inmunoquímica. El punto de partida para este ejemplo es la superficie de detección después de la concentración electrocinética de K. pneumoniae (ATCC 700603) como se describe en el Ejemplo 4. Aquí, los presentes inventores demuestran inmuno-identificación de estas especies de control conocidas.

Inmunoensayo. El inmunoensayo en este ejemplo es un método de identificación de dos etapas. El anticuerpo primario era una IgG anti-Klebsiella de ratón (abCAM, #ab8065-1). El anticuerpo secundario, o de detección, era IgG anti-ratón de cabra marcada con el colorante fluorescente Alexa 546 (Molecular Probes). Los anticuerpos primario y secundario se suspendieron en caldo de soja tríptico (TSB) a una concentración de anticuerpo de aproximadamente

65 5 ug/ml inmediatamente antes de uso. El anticuerpo primario se introdujo a la celda de flujo microfluídica a través del puerto de entrada. Después de que la solución de anticuerpo primario llenara la celda de flujo, el flujo se detuvo y el

anticuerpo se dejó incubar durante 15 minutos. La célula se aclaró entonces con 2,5 ml de TSB y luego se introdujo el secundario y se incubó durante 15 minutos. Después de la incubación del anticuerpo secundario, la celda de flujo se aclaró finalmente con TSB y se obtuvieron imágenes de los microorganismos en la superficie de detección.

5 Obtención de imágenes. Para cada campo de vista en el ensayo, se toman dos imágenes usando la Olympus IX-71 descrito en el Ejemplo 4. Primero se toma una imagen de campo oscuro (como se ha descrito anteriormente) para observar la localización de todos los objetos en la superficie de detección. Sin reposicionar el campo de vista, el microscopio se cambia entonces a modo de epi-fluorescencia, que para Alexa546 requiere el cubo de filtro verde de Olympus. Registrando el campo oscuro con la imagen de fluorescencia, aquellos organismos que tiñen con un

10 anticuerpo dado se designan una especie conocida.

Resultados. Se proporcionan imágenes de inmunoensayo representativas en la Fig. 7. La Fig. 7(a) proporciona imagen de campo oscuro de la superficie de detección inmediatamente después de EKC (véase el Ejemplo 4). La Fig. 7(b) muestra el mismo campo de vista en el canal de fluorescencia. Aquí, los presentes inventores mencionan

15 que esencialmente todos los microorganismos se marcan con los anticuerpos, como era de esperar en este experimento de control. Obsérvese que algunos de los microorganismos aparecen significativamente más brillantes con las tinciones de anticuerpos que otros. Obsérvese también que la imagen de fluorescencia da manchas más difusas que la imagen de campo oscuro.

20 Ejemplo 6

Demostración del dispositivo y método para la identificación rápida de microorganismos en un espécimen de lavado broncoalveolar (BAL) modelo usando inmunoquímica

25 Este ejemplo demuestra la selectividad de anticuerpos por su diana relacionada en el sistema modelo de K. pneumoniae descrito en el Ejemplo 5. En este ejemplo, en lugar de introducir una suspensión pura de K. pneumoniae en la celda de flujo, las bacterias se enriquecieron primero en un muestra de lavado broncoalveolar (BAL) de oveja. El BAL de oveja se realizó en ovejas sanas en el Colegio Universitario del Estado de Colorado de Veterinaria. Se usó solución salina normal estéril como líquido de lavado. K. pneumoniae se enriqueció a una

30 concentración de 107 UFC/ml.

Esta muestra se introdujo a la celda de flujo y el inmunoensayo se realizó del mismo modo que se describe en el Ejemplo 5. En este ejemplo, se usó microscopía de contraste de fases en lugar de campo oscuro. La detección de anticuerpo fue con microscopía de epi-fluorescencia como se ha descrito anteriormente.

35 Los resultados se presentan en la Figura 8. Los recuadros se han dibujado sobre las dos imágenes para resaltar los componentes de BAL de oveja que no se tiñeron, demostrando la selectividad de los anticuerpos por su microorganismo relacionado.

40 Ejemplo 7

Demostración del dispositivo y método para el seguimiento temporal simultáneo del crecimiento de microorganismos individuales en un conjunto de grandes números de microorganismos

45 En este ejemplo, los presentes inventores demuestran un dispositivo y método para seguir simultáneamente el crecimiento de un gran número microorganismos individuales con el tiempo. El punto de partida para este ejemplo es la superficie de detección después de la concentración electrocinética y el inmunoensayo de K. pneumoniae (ATCC 700603) como se describen en los Ejemplos 4 y 5.

50 Crecimiento. Se incubaron organismos capturados en TSB bajo condiciones estáticas. El volumen de la celda de flujo es grande con respecto al número de microorganismos sobre la superficie de detección, por lo que el flujo de nutrientes y de residuos no se considera que sea un problema durante este ensayo de crecimiento de tiempo corto.

Seguimiento de microorganismos individuales/clones. Dentro de un campo de vista dado, la localización de todos los

55 microorganismos capturados puede determinarse usando herramientas de análisis de imágenes. Estas localizaciones se almacenan en software. Como el inmunoensayo ha sido completado, se conoce la localización e identidad de especies de los organismos fundadores en el campo de vista y pueden monitorizarse con el tiempo. La Figura 9(a) muestra el campo de vista de la superficie de detección con cada microorganismo fundador o clon asignado a un identificador único. La Fig. 9(b) muestra el mismo campo de vista sin los identificadores. Esto se

60 designa el momento de tiempo = 0 para el crecimiento, aunque debe observarse que ha habido previamente 30 minutos de incubación en TSB durante la etapa de inmunoensayo. El recuadro muestra cuatro microorganismos individuales o clones, a los que se asignaron los identificadores 158, 161, 171, 180 en la imagen superior. El microorganismo en la parte superior izquierda de la imagen insertada (#158) es probablemente un bacteria en forma de bacilo orientada perpendicular al plano de captura.

La Fig. 9(c) muestra el mismo campo de vista después de 20 minutos de crecimiento. Los microorganismos individuales / clones han aumentado en tamaño. La Fig. 9(d) muestra el mismo campo de vista después de 45 minutos de crecimiento. En este momento muchos de los individuos se han duplicado en tamaño aparente.

5 Este conjunto de imágenes demuestra la capacidad de los presentes inventores para seguir individuos en crecimiento con el tiempo.

La Figura 10 proporciona una representación de las curvas de crecimiento de todos los clones individuales en el campo de vista en la superficie de detección. La finalidad de incluir esta figura es para ilustrar que los presentes inventores pueden seguir y obtener información de crecimiento cuantitativa para cada clon individual dentro del campo de vista. La métrica usada para seguir el crecimiento en este ejemplo es la intensidad integrada, que se basa en el análisis de manchas de imágenes de campo oscuro y es una función matemática del área proyectada bidimensional y la intensidad de píxeles de un clon dado. La superposición de todas las curvas de crecimiento muestra que una gran fracción de clones tiene crecimiento casi logarítmico muy similar. Un subconjunto son de

15 crecimiento lento y un subconjunto adicional no muestra crecimiento en absoluto.

Ejemplo 8

Demostración del dispositivo y método para monitorizar la susceptibilidad a antibióticos de microorganismos individuales en un conjunto de grandes números de microorganismos

Este ejemplo es una continuación del Ejemplo 7, en el que los presentes inventores demuestran la capacidad para monitorizar la susceptibilidad a antibióticos de microorganismos individuales en un conjunto de un gran número de microorganismos. El punto de partida para el ejemplo es el campo de vista en la superficie de detección del

25 dispositivo después de 45 minutos de crecimiento como se describe en los Ejemplos 4-7.

Introducción de antibiótico y tinción mortal. Se suspendió el antibiótico ciprofloxacina a una concentración de 100 ug/ml en soja tríptica. La solución también contuvo la tinción mortal de fluorescencia YO-PRO-1 (Molecular Probes) a una concentración de 1 uM. YO-PRO-1 es tinción mortal y no penetra en las células vivas. Cuando una célula muerta o moribunda pierde la integridad de membrana, el colorante YO-PRO-1 entra en la célula e interacciona con los ácidos nucleicos.

Se bombeó esta solución de ciprofloxacina/YO-PRO/soja tríptica en la celda de flujo y entonces se interrumpió el flujo. Entonces se dejó que los microorganismos se incubaran en la superficie de detección bajo condiciones

35 estáticas a 35 ºC. Se recogió un par de imágenes cada 10 minutos – primero una imagen de campo oscuro como se ha descrito anteriormente, luego una imagen de epi-fluorescencia para detectar YO-PRO.

Resultados. Se proporcionan imágenes representativas de lapso de tiempo en la Figura 11. Se presentan un par de imágenes para cada momento de tiempo. La imagen de campo oscuro de todos los microorganismos en la superficie de detección se muestra a la izquierda. La imagen de fluorescencia de YO-PRO del mismo campo de vista se muestra a la derecha. La Fig. 11 (a) muestra el par de imágenes en el momento de la introducción de antibiótico. Solo un número muy pequeño de microorganismos muestra cualquier señal en el canal de YO-PRO, que indica que casi todos son viables en el momento de la introducción de antibiótico. La Figura 11 (b) proporciona el par de imágenes después de 80 minutos de exposición a antibióticos. Aunque la imagen de campo oscuro está en gran

45 parte sin cambiar, con respecto al momento de tiempo inicial, grandes números de microorganismos están claramente teñidos con YO-PRO, que indica aniquilación eficaz con el antibiótico. La Figura 11 (c) proporciona el par de imágenes después de 170 minutos de exposición a antibiótico. Otra vez, grandes números de microorganismos individuales están teñidos como muertos. Debido a que todos los microorganismos / clones son seguidos individualmente, cada uno tiene un momento de tiempo en el que se declara muerto por tinción mortal.

La Figura 12 proporciona una evaluación cuantitativa de la velocidad de aniquilación por antibiótico (curva de tiempo-aniquilación) informando el número de clones no teñidos (es decir, vivos) en función del tiempo. Aquí, los presentes inventores ven que ciprofloxacina a 100 ug/ml ha aniquilado eficazmente esencialmente todos los clones de K. pneumoniae en el plazo de 90 minutos de exposición.

Ejemplo 9

Demostración del dispositivo y método de detección de microorganismos resistentes minoritarios en un conjunto de grandes números de microorganismos expuestos a antibióticos

En este ejemplo, los presentes inventores demuestran un dispositivo y método de detección de organismos resistentes minoritarios en un conjunto de grandes números de microorganismos expuestos a antibióticos. El instrumento descrito en el Ejemplo 4 se usa aquí, pero se usa microscopía de contraste de fases en lugar de campo oscuro.

65 Descripción del sistema modelo de resistencia minoritaria. Se usaron dos especies bacterianas para este ejemplo.

La primera es E. coli (ATCC 25922), que se sabe que es susceptible a antibióticos β-lactámicos. La segunda es K. pneumoniae ESBL blaSHV-18 (ATCC 700603), que se sabe que es resistentes a antibióticos β-lactámicos. Con el fin de simular un espécimen que contiene organismos resistentes minoritarios, se mezclaron E. coli y K. pneumoniae a una relación 100:1. Así, se sabía que el 1 % de clones en el espécimen de partida era organismos resistentes.

5 Ensayo. Se introdujeron las especies mixtas en la celda de flujo y se condujeron a la superficie de detector como se describe en el Ejemplo 5. La Figura 13(a) muestra un área pequeña del campo de vista en la superficie del detector después de EKC. Obsérvese que ambas especies son bacilos Gram-negativos y es imposible determinar especies basándose en la morfología. Sin embargo, puede usarse inmunoensayo para la identificación de especies. En este experimento, los presentes inventores usaron el sistema de anticuerpos descrito en detalle en el Ejemplo 5. La Fig. 13(b) muestra una imagen del canal de fluorescencia del inmunoensayo de K. pneumoniae. La imagen muestra claramente que uno de los microorganismos / clones en el campo de vista, designado #675, se tiñó positivamente como K. pneumoniae. Ninguno de los otros clones en la imagen dio señal de anticuerpo, de manera que se supuso que todos aquellos organismos eran E. coli ATCC 25922 por defecto.

15 El antibiótico β-lactámico ampicilina se suspendió en caldo de soja tríptico a una concentración de 40 ug/ml y se suministró a la celda de flujo. Los clones se sometieron entonces a incubación estática en presencia de este antibiótico. Se recogió una secuencia de imágenes de lapso de tiempo cada 15 minutos, un conjunto representativo de los cuales se muestra en la Fig. 13(c-f). La Fig. 13(c) muestra los clones después de 30 minutos de exposición a antibiótico. La mayoría de los clones muestra poco o ningún crecimiento en este marco de tiempo, y de hecho una gran fracción se tiñe como muerta con YO-PRO-1 (datos no mostrados, véase el método del Ejemplo 8). El clon de

K. pneumoniae #675, el resistente conocido, se ha casi duplicado en longitud durante estos primeros 30 minutos de exposición a antibiótico. La Fig. 13(d) muestra los clones después de 60 minutos de exposición a antibiótico. Aquí, la mayoría de los clones de E. coli están perdiendo su integridad física a medida que hace efecto. El clon de K.

25 pneumoniae #675, sin embargo, continúa creciendo, y en las imágenes ha pasado a través de al menos una duplicación completa. Las Figs. 13(e) y (f) proporcionan imágenes a los 90 y 120 minutos de exposición a antibiótico. En estos momentos de tiempo casi de E. coli están muertas (confirmado con YO-PRO). Pero es fácilmente evidente que ESBL blaSHV-18 de K. pneumoniae está de hecho mostrando resistencia en este ensayo ya que el organismo fundador original ha llegado ahora a ser un clon multicelular.

Esta clara demostración de la identificación y detección de cepas resistentes minoritarias es una demostración importante de la tecnología desvelada. Una debilidad conocida del cultivo bacteriano tradicional y métodos de aislamiento es que pierden microorganismos resistentes minoritarios. En este caso, 1:100 de organismo minoritario no se seleccionaría para el aislamiento y se perdería en el diagnóstico. Si, sin embargo, esto fuera una muestra de

35 paciente y los resultados de cultivo de E. coli positivo se usaran para dirigir terapia con ampicilina como antibiótico, este ejemplo muestra claramente que la cepa patógena de K. pneumoniae no se afectaría por la terapia seleccionada y la infección continuaría. El dispositivo y el rápido método descrito para detectar e identificar organismos resistentes minoritarios en un gran conjunto de microorganismos tienen importantes implicaciones para el diagnóstico clínico y mejorar los desenlaces de pacientes.

Ejemplo 10

Demostración del dispositivo y método para la rápida detección de resistencia a clindamicina inducida por eritromicina en una cepa de Staphylococcus aureus MLSBi

45 En este ejemplo los presentes inventores demuestran un ensayo de diagnóstico in vitro rápido inferior a 4 horas para identificar correctamente los fenotipos de resistencia de tres cepas de S. aureus modelo. El ensayo se ha realizado en dos configuraciones de celda de flujo microfluídica / electrocinética diferentes, ambas de las cuales incluyen electrodos ópticamente transparentes. La detección en este ejemplo es por microscopía de contraste de fases, aunque también se han demostrado fluorescencia y campo oscuro. La obtención de imágenes se realiza en un microscopio invertido Olympus IX71 personalizado equipado con un objetivo 20X y una cámara Optronics MicroFire CCD.

Preparación de superficies de afinidad. Antes de ensamblar la celda, el electrodo de abajo o de captura se recubrió

55 con un componente de afinidad al que se une el microorganismo irreversiblemente. El componente de afinidad en este experimento era un recubrimiento de dos partes que comprendía albúmina de suero bovino (BSA) y el polipolímero catiónico poli-L-lisina (PLL). El recubrimiento de componente de afinidad se preparó del siguiente modo. Primero, los portaobjetos de ITO-vidrio se limpiaron cuidadosamente usando una sonicación en detergente (Alconox) caliente (60 ºC) de 15 minutos, seguido de una sonicación en agua caliente de 15 minutos. Después de sacar del segundo sonicador, el portaobjetos se lavó ampliamente con agua ultrapura y se centrifugó en una centrífuga (Beckman) equipada con un portador de portaobjetos de brazo articulado. Una vez secos, los portaobjetos secos se recubrieron con PLL usando protocolos de la bibliografía bien establecidos. Brevemente, los portaobjetos se sumergieron en una solución que contenía aproximadamente 0,01 % de PLL en 0,1X solución salina tamponada con fosfato (PBS). Los portaobjetos se incubaron en la solución de PLL a temperatura ambiente durante una hora, luego

65 se aclararon con agua ultrapura y entonces se centrifugaron. Los portaobjetos de PLL secos se sellaron entonces por calor con una bolsa de desecante en una bolsa de barrera de lámina y se dejó que envejecieran durante cuatro

días a temperatura ambiente.

Después de cuatro días de envejecimiento, los portaobjetos se sacaron del envase y se sumergieron en una solución que contenía 5 % (peso/volumen) de BSA (Sigma) en PBS. La incubación de BSA avanzó a temperatura

5 ambiente durante una hora, momento en el que los portaobjetos se aclararon con PBS que contenía 0,01 % de Tween20 (PBST) y luego con agua ultrapura. Entonces, los portaobjetos se centrifugaron y estuvieron listos para uso.

Aunque se desea unir fuertemente los microorganismos al electrodo de abajo, es generalmente deseable mantener los microorganismos fuera de todas las superficies en el dispositivo microfluídico. Se trata particularmente del portaobjeto de ITO superior, que además de servir de electrodo superior también define la parte superior del flujo. Por este motivo, el electro de ITO superior se recubrió con una superficie de polímero no específico de baja unión llamada OptiChem® (patente de EE.UU. 6.844.028).

15 Casete microfluídico. Se han usado dos configuraciones de celda de flujo microfluídica / electrocinética diferentes para realizarse satisfactoriamente el ensayo descrito. El primero es un dispositivo simple en el que una junta de goma con dimensiones de canal 30 x 2,5 x 0,5 mm (L x W x H) (Grace BioLabs, Inc.) se intercala entre dos portaobjetos de vidrio recubiertos con óxido de indio y estaño (ITO) (Delta Technologies). Con el fin de proporcionar acceso del fluido a la celda de flujo, se taladraron orificios a través del electrodo de ITO superior en localizaciones que proporcionan acceso a una cámara de junta cuando el dispositivo se ensambla. La parte de atrás o el exterior de estos orificios se ajustó con accesorios adhesivos NanoPort ™ (Upchurch Scientific), que permiten la conexión de tubería de plástico a la celda de flujo. El bombeo de fluido a través de la tubería fue mediante una bomba de jeringa (Kloehn, Inc.). Cuando los dos portaobjetos se intercalaron alrededor de la junta, se definió una celda de flujo, una que tiene acceso óptico a través de los electrodos transparentes y acceso fluídico a través de los accesorios

25 NanoPort ™. La celda de flujo también era una celda electroquímica, ya que los electrodos de arriba y de abajo de ITO paralelos estaban unidos a una fuente de alimentación mediante clips de alambre unidos directamente al portaobjetos.

La segunda configuración comprendió un casete microfluídico de plástico laminado simple. El casete caracteriza una celda de cámara de flujo individual (20 x 4 x 0,7 mm) con puertos de entrada y salida y válvulas integradas en el casete de plástico. El acceso de fluido es mediante un colector en el extremo del casete que se comunica con la estación de bomba microfluídica (Micronics MicroFlow). El casete de laminado de plástico usa los mismos portaobjetos de ITO-vidrio superior e inferior que se han descrito anteriormente. Están unidos al casete mediante una capa de adhesivo sensible a la presión que proporciona un sellado sin fuga.

35 La celda de flujo se mantuvo a aproximadamente 37 ºC calentando resistivamente el portaobjetos de ITO superior. Se unió una fuente de alimentación mediante clips en extremos opuestos del portaobjetos. Los flujos de corriente a través de la superficie de ITO causan el calentamiento. Con el fin de monitorizar la temperatura, se inserta un termopar en un pocillo de fluido detector de temperatura en el portaobjetos.

Cepas bacterianas modelo. Se usaron tres cepas modelo de Staphylococcus aureus de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA) en este experimento. La cepa ATCC 29213 es una cepa de control conocida susceptible a tanto clindamicina como eritromicina. La cepa BAA-976 es resistente a eritromicina, pero susceptible a clindamicina. La cepa BAA-977 es el organismo MLSBi modelo. Las susceptibilidades conocidas de los tres

45 organismos, que incluyen inducibilidad, se confirmaron experimentalmente en el laboratorio de los presentes inventores usando procedimientos de prueba D estándar.

Ensayo de inducción. El ensayo de inducción se realizó de un modo idéntico para cada organismo. Las etapas fueron las siguientes. Se centrifugaron soluciones de caldo de soja tríptica bacteriana de reserva para sedimentar organismos. El sedimento se resuspendió en histidina 1 mM como una etapa de lavado y entonces se re-sedimentó. Este sedimento se resuspendió entonces en tampón de concentración electrocinética (EKC). El tampón EKC era una solución acuosa que contenía histidina 1 mM, hidroquinona 10 mM y DTT 40 mM a pH 6,8. La resuspensión fue a una concentración de organismo estimada de 1E+07 UFC/ml. La suspensión de bacterias/tampón EKC se bombeó entonces en la celda de flujo microfluídica. Se monitorizó un campo de vista de microscopio en la celda de flujo,

55 0,593 x 0,444 mm, durante todo el procedimiento completo. La bomba se detuvo una vez la celda de flujo estaba llena. En ese momento, se encendió la alimentación a los electrodos de ITO, y la concentración electrocinética avanzó durante 5 minutos a 1,6 V. Al final de los 5 minutos, esencialmente todos los organismos migraron a la superficie de afinidad (BSA-PLL) donde se unieron a la superficie, y se apagó la alimentación a los electrodos.

Tras la EKC, la celda de flujo se lavó bombeando aproximadamente 1 ml de tampón de histidina a través del sistema. Éste eliminó cualquier organismo unido libremente y, lo que es más importante, desalojó el tampón de EKC. El lavado de histidina fue entonces seguido de un lavado de medio de crecimiento de caldo de soja tríptico. Una vez los organismos inmovilizados se expusieron al medio de crecimiento, el flujo se detuvo y los organismos se dejaron crecer sobre la superficie durante una hora. En ese momento, se inició la etapa de inducción. La celda de flujo se 65 llenó con 0,07 ug/ml de eritromicina en medio de crecimiento y se dejó incubar durante una hora. Esto se define como el periodo de inducción. Tras la inducción, la celda de flujo se intercambió con 8 ug/ml de clindamicina

mezclada con 0,07 ug/ml de eritromicina en medio de crecimiento. Obsérvese que el punto de ruptura de la susceptibilidad para S. aureus para ambos de estos antibióticos es 0,5 ug/ml. Así, en este ensayo, la concentración de inducción está muy por debajo de CMI, mientras que la prueba de susceptibilidad es a una concentración muy por encima de CMI. Se dejó que los organismos crecieran durante 4 horas bajo estas condiciones. Esto se definió

5 como el periodo de prueba de susceptibilidad y también se llama la fase de aniquilación. Los presentes inventores mencionan otra vez que el campo de vista del microscopio permanece fijo durante todo el proceso, desde la introducción de muestra hasta los tratamientos finales con antibióticos, que permite monitorizar en tiempo real todos los organismos individuales en el campo.

Este proceso se realizó en tres organismos modelo descritos anteriormente. En un experimento separado, también se realizó la cepa BAA-977 MLSBi sin la etapa de inducción.

Resultados. La Figura 14 muestra los perfiles de crecimiento para las cepas BAA-977 y BAA-976 durante el periodo de prueba de susceptibilidad. La curva marcada BAA-977 inducida claramente muestra que después de la inducción

15 con eritromicina de baja concentración, el organismo crece en presencia de > CMI de clindamicina. El organismo está mostrando resistencia inducida. La disminución aparente en los recuentos bacterianos en el momento de tiempo de 240 minutos es un artefacto del sistema de medición. A los 240 minutos, la concentración superficial de S. aureus ha crecido más allá de lo que es contable con el actual software de análisis de imágenes.

La cepa de control BAA-976 no muestra crecimiento bajo las mismas condiciones. Esto es de esperar, ya que se sabe que BAA-976 es susceptible a clindamicina.

La curva "Clindamicina solo" de BAA-977 es una demostración importante. La falta de crecimiento mostrada en esa curva muestra que en ausencia de inducción de eritromicina, la cepa BAA-977 parece susceptible a clindamicina.

25 Esto es un diagnóstico incorrecto de la cepa MLlSBi. La cepa ATCC 29213, que se sabe que es susceptible a ambos antibióticos, no mostró crecimiento en este ensayo (datos no mostrados).

Los resultados en la Fig. 13 muestran que puede encontrarse evidencia estadísticamente significativa de resistencia inducida en el plazo de dos horas desde la introducción de clindamicina a la celda de flujo. El tiempo de ciclo completo de este ensayo después de la introducción de la muestra bacteriana al casete fue inferior a 4 horas. Esto es una mejora espectacular con respecto al actual método de prueba D, que requiere un crecimiento durante la noche de organismos en placa.

Se entiende que estos ejemplos no sirven de ninguna forma para limitar el verdadero alcance de la presente

35 invención, sino que se presentan para fines ilustrativos. Hay numerosas fórmulas matemáticas específicas que combinarán, a un grado u otro, fenómenos de este tipo.

Los métodos de la presente invención y los dispositivos como se describen en el presente documento se han descrito principalmente con respecto a la identificación y susceptibilidad a AOA de microorganismos. Sin embargo, como se ha mencionado anteriormente en esta memoria descriptiva, también es posible usar los métodos de la presente invención con respecto a otras afecciones veterinarias o médicamente importantes distintas de la infección bacteriana a condición que el método sea para detectar el crecimiento de células de microorganismos individuales en una muestra. También se describe en el presente documento probar la eficacia de fármacos antivirales en un paciente con una infección viral. Con el fin de hacer esto, células huésped adecuadas (que, dependiendo de la

45 naturaleza de la infección, pueden recogerse del paciente, o alternativamente de células huésped cultivadas para la tarea) pueden recogerse sobre una superficie, y entonces exponerse a muestras del virus del paciente. En cada canal, diferentes agentes antivirales, a concentraciones posiblemente diferentes, pueden ponerse en el sistema, y observarse el progreso de la infección viral. Tal observación puede incluir la reactividad de anticuerpos con marcadores celulares de infección, con biomarcadores asociados directamente a virus, con cambio en la fisiología celular (por ejemplo, velocidades de respiración), con velocidades de división celular, con patrones de división celular (por ejemplo, células que crecen fuera de una monocapa), o con cambios en la estructura celular observable por microscopía (posiblemente conjuntamente con tinciones).

También se describe en el presente documento el uso del sistema con respecto a antitumor/anticáncer, agentes que

55 pueden implicar el uso de células cancerosas obtenidas de un paciente en una biopsia o muestra de sangre. Si las células se toman de un tumor sólido, las células pueden dispersarse por medios mecánicos y/o enzimáticos (por ejemplo, tratamiento con proteasa). En este momento, las células pueden introducirse en el sistema en el modo de microorganismos, usándose concentración electrocinética si fuera necesario para llevar las células a la superficie para la unión. En este momento, pueden introducirse agentes antineoplásicos, y pueden observarse y medirse cambios en las células cancerosas, tanto muerte, cese de la división celular, como cambios en la morfología celular. Esta forma de análisis puede usarse no solo para calibrar el efecto de los agentes antineoplásicos sobre las células cancerosas, sino también para determinar la toxicidad de estos agentes para células no cancerosas, en caso de que la toxicidad sea altamente variable entre personas.

65 De un modo similar, el sistema como se describe en el presente documento puede usarse para calibrar la presencia

o ausencia de efectos secundarios de un fármaco beneficioso, tomando muestras de células de paciente, y

exponiéndolas a los fármacos para calibrar la aparición de los efectos secundarios por examen microscópico de las células, tanto por morfología, características de crecimiento, como por tinción con agentes bioquímicos que reflejan la fisiología de las células, o por tinción con anticuerpos o tinciones similares que indican la presencia o niveles de diversos biomarcadores.

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método de detección del crecimiento de células de microorganismos individuales en una muestra, que

   comprende: 5

   (a)

   poner en contacto la muestra con un biosensor que comprende al menos una superficie de detección y un módulo de detección;

   (b)

   concentrar las células de microorganismos individuales sobre la al menos una superficie de detección de forma que cada célula individual esté en un sitio discreto que está espacialmente separado;

   10 (c) someter las células de microorganismos individuales a condiciones de crecimiento durante un primer periodo de tiempo en presencia o en ausencia de uno o más agentes antimicrobianos; y

   (d) detectar el crecimiento de la célula o las células de microorganismo individual sobre la al menos una superficie de detección como una indicación de su viabilidad.

   15 2. El método según la reivindicación 1, que adicionalmente comprende añadir al menos un agente bioactivo durante dichas condiciones de crecimiento.
2. 3. El método según la reivindicación 2, que adicionalmente comprende medir el crecimiento de las células de microorganismos individuales antes de la adición del uno o más agentes antimicrobianos; y medir el crecimiento de

   20 las células de microorganismos individuales después de un segundo periodo de crecimiento en presencia del uno o más agentes antimicrobianos.
3. 4. El método según la reivindicación 1, en el que se establece la identidad de al menos un microorganismo.

   25 5. El método según la reivindicación 1, en el que dicha detección comprende monitorizar alteraciones en el área física sobre dicha superficie asociada a una célula de microorganismo individual a medida que crece.
4. 6. Un método según la reivindicación 1, en el que dicha detección comprende detectar la presencia de células hija

   en sustancialmente la misma localización sobre la al menos una superficie de detección como las células de 30 microorganismos individuales de las que se derivan.
5. 7. El método según la reivindicación 1, en el que el biosensor comprende una pluralidad de canales, cada uno de los cuales comprende una superficie de detección.

   35 8. El método según la reivindicación 1, en el que el biosensor comprende además una pluralidad de módulos de almacenamiento, conteniendo cada módulo un agente antimicrobiano diferente.
6. 9. El método según la reivindicación 1, en el que la al menos una superficie de detección comprende una pluralidad

   de sitios de detección individuales. 40

7. 10.

   El método según la reivindicación 1, que adicionalmente comprende identificar al menos una de las células de microorganismos individuales concentradas sobre la al menos una superficie de detección.

8. 11.

   El método según la reivindicación 1, en el que la concentración de las células de microorganismos individuales

   45 sobre la al menos una superficie de detección se logra por un método seleccionado del grupo que consiste en electroforesis, dielectroforesis, centrifugación, captura por afinidad, reparto de fases, captura por campo magnético, filtración, gravedad, recirculación, difusión, o una combinación de estos métodos.