CN110234749A - 分析和使用微生物的运动性运动学 - Google Patents

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Abstract

特别表征了至少一种个体微生物的运动性或至少一种个体微生物的运动性变化或两者。使用表征的运动性或运动性变化来检测至少一种个体微生物的存在或计数，或确定至少一种个体微生物的物种或菌株的身份，或确定至少一种个体微生物对一种或多种抗生素或其他抗微生物剂的易感性。

Description

分析和使用微生物的运动性运动学
本申请有权享有美国专利申请序列号62/453,605的申请日的优先权，该专利于2017年2月2日提交并通过引用完整并入本文。
发明背景
本描述涉及分析和使用微生物的运动性运动学。
已经分析并使用了运动性运动学，例如在精子研究的背景下。例如，Green(美国专利公开文本2007/0298454)描述了以确定精子是否表现出正常的形态和运动性为目的追踪样品中的精子并且取得运动性特性(例如速度和轨迹)。
King et al.(Antibiotics:Effect on cryopreserved-thawed human spermmotility in vitro,Fertility and Sterility,1997,第67卷,第6期,第1146-1151页)使用商业系统分析在抗生素存在下在48小时时段内温育的精子的运动性以评估其受精能力。
使用检测细菌存在和计数、鉴定(ID)和抗生素易感性测试(AST)确定细菌感染的最佳治疗选择。
发明概述
通常，在一方面，表征了至少一种个体微生物的运动性或至少一种个体微生物的运动性变化或两者。使用表征的运动性或运动性的变化来检测至少一种个体微生物的存在或计数，或确定至少一种个体微生物的物种或菌株的身份，或确定至少一种个体微生物对一种或多种抗生素或其他抗微生物剂的易感性。
实施方案可以包括以下特征中的一种或两种或更多种的组合。使用成像装置在连续时间时捕获所述至少一种个体微生物的两个或更多个数字图像。通过计算机处理图像以确定至少一种个体微生物的轨迹数据。对于至少一种个体微生物或个体微生物的群体，通过计算机处理运动性运动学数据。通过计算机将产生的运动性运动学数据与一种或多种微生物的可用运动性运动学数据进行比较。将由计算机产生的运动性运动学数据与一种或多种微生物的可用运动性运动学数据进行比较，以确定至少一种个体微生物的物种或菌株的身份，或确定至少一种个体微生物对一种或多种抗生素或其他抗微生物剂的易感性。从包含至少一种个体微生物的样品的第一部分捕获的数字图像获得产生的运动性运动学数据，并且一种或多种微生物的所述可用运动性运动学数据包括从在不同时间时从所述样品的第一部分捕获的数字图像或在相同时间时或在不同时间时从所述样品的不同部分捕获的数字图像确定的运动性运动学数据。至少一种个体微生物经受两种不同的抗生素或其他抗微生物条件，包括以下中的至少一种：存在和缺乏抗生素或其他抗微生物剂、两种或更多种不同抗生素或其他抗微生物剂的存在，不同浓度的抗生素或其他抗微生物剂的存在、或一种或多种抗生素或其他抗微生物剂的不同组合的存在。至少一种个体微生物在包括以下中的一种或两种或更多种的组合的样品中：身体样品、细菌培养物、流体、固体、碎片、非流体样品材料、磨碎食品、食品颗粒、环境样品、防腐剂、抗凝血剂、凝块活化剂、凝胶屏障、细菌生长稳定剂、抗糖酵解剂或添加剂。通过计算机确定表征的运动性或运动性变化的统计学显著性。一种或多种微生物的可用运动性运动学数据存储在作为数据库管理系统的一部分的运动性数据库中。将一种或多种微生物的物种或菌株的已知身份存储在作为数据库管理系统一部分的数据库中。通过计算机确定单独的或与至少一种其他特征组合的表征的运动性或运动性变化的统计学显著性。至少一个其他特征包括两种或更多种微生物的计数、形态特征或空间排列。形态特征包括以下中的一种或两种或更多种的组合：形状、长宽比、凸度、面积、大小、尺寸、长轴方向、偏离球形形状或强度分布。空间排列包括分裂的微生物的空间排列、个体微生物的簇的空间排列、两种或更多种微生物相对于彼此的位置、它们之间的一个或多个距离、微生物的特定簇或链的形成。至少一种个体微生物包括以下中的一种或两种或更多种的组合：细菌病原体、其他细菌、其他病原体、真菌、古细菌、原生生物、浮游生物或真核细胞。至少一种个体微生物在样品中并且对所述样品中的一种或多种抗生素或其他抗微生物剂是易感的或对所述样品中的一种或多种抗生素或其他抗微生物剂有抗性。计算机确定和存储关于样品中个体微生物的计数或样品中个体微生物的形态特征或样品中两种或更多种个体微生物的空间排列的信息。处理图像以确定至少一种个体微生物的轨迹数据包括(a)基于颜色、像素强度梯度、形状、长宽比、凸度、面积、大小阈值、水平和垂直位置、大小、强度、长轴方向、偏离球形形状或强度分布中的至少一种来定位图像中的微生物，以及(b)基于位置、位置接近性、方向、速度、加速度或搜索半径中的至少一种，通过连接位于两个或更多个图像中的相同微生物来构建轨迹数据。用于至少一种个体微生物的运动性运动学数据的产生包括通过计算机确定以下中的至少一种：轨迹、轨迹形状、速度、加速度、均方位移、游动方向、转动速率、转动角度、转动角度的时间顺序、扩散率、净毛位移比、曲率、运动细胞的浓度、或运动细胞与非运动细胞的比率。使用所述成像装置在连续时间时捕获含有所述至少一种个体微生物的样品的一个、两个或更多个数字图像，该样品含有一种或多种抗生素或其他抗微生物剂，并且使用所述成像装置在所述连续时间前的时间时捕获所述样品中个体微生物的一个、两个或更多个数字图像，先前时间时的样品含有不同比例的抗微生物剂或先前时间时的样品不含抗微生物剂。使用所述成像装置同时捕获两个或更多个含有至少一种个体微生物的样品的一个、两个或更多个数字图像，所述样品中的至少一个样品含有一种或多种抗生素或其他抗微生物剂，并且使用所述成像装置同时捕获两个或更多个含有至少一种个体微生物的样品的一个、两个或更多个数字图像，所述样品中的至少一个样品含有不同比例的抗生素或其他抗微生物剂或所述样品中的至少一个样品不含所述抗生素或其他抗微生物剂。在预筛选步骤中确定活动微生物的存在、缺乏或计数。改变至少一种环境条件来刺激所述至少一种个体微生物的运动性，以有利于检测所述微生物，鉴定所述微生物的物种或菌株，或确定所述微生物的抗微生物剂易感性。通过图像分析从图像中除去非移动实体，或者在成像前物理地从所述样品除去非移动实体。将对应于产生的运动性运动学数据的所述至少一种个体微生物在第一时间时经受第一抗生素或其他抗微生物剂，并且所述可用运动性运动学数据与第二时间时经受所述第一抗生素或抗微生物剂或第二时间时经受不同抗生素或其它抗微生物剂的个体微生物相关联。对应于产生的运动性运动学数据的至少一种个体微生物包括物种的至少一种个体微生物，并且可用的运动性运动学数据与物种相关。将含有至少一种个体微生物的样品部分装入一个或多个孔中，并且所述样品的各部分中无一或一个或多个经受抗生素或其他抗微生物剂。将含有至少一种个体微生物的样品的两个部分装入两个不同的孔中，并经受两种不同的抗生素或抗微生物条件。在不需要确定所述至少一种个体微生物的物种或菌株的身份的情况下确定所述至少一种个体微生物的易感性。
通常，在一方面，孔(我们指的是可以包含如下讨论的样品的任何装置)可以是筒的部分。实施方案可以包括以下特征中的一种或两种或更多种的组合。将样品的一个或多个部分加载到筒的一个或多个孔中。在无一孔、孔的1或2或更多个中对样品添加一种或多种抗生素或其他抗微生物剂。可以在相同或不同的孔中对样品添加不同的抗生素或其他抗微生物剂。可以在相同或不同的孔中对样品添加不同浓度的一种或多种抗生素或其他抗微生物剂。至少一个孔从基板突出。至少一个孔在基板中凹入。每孔可以具有暴露的开口。每孔可以没有暴露的开口。覆盖物密封孔的任何暴露的开口。每孔或覆盖物或两者的特征在于以下中的至少一种：未处理的表面、经处理以对微生物附着有抗性的表面、或经处理以支持微生物附着的表面、促进微生物附着的材料、或阻止微生物附着的材料。
覆盖物包括固体材料。固体材料包括玻璃。固体材料包括塑料。固体材料包括金属。覆盖物包括膜。膜包括粘性膜。膜包括非粘性膜。覆盖物具有一个或多个开口。覆盖物没有开口。覆盖物包括固体材料。覆盖物是柔性的。覆盖物是刚性的。覆盖物是透气的。覆盖物是不透气的。覆盖物是平的。覆盖物是图案化的。覆盖物包括膜。覆盖物是可再密封的。
这些和其他方面、特征、实施方案和优点可以表示为用于执行功能的方法、装置、系统、组件、程序产品、业务方法、手段或步骤，以及以其他方式表示。
根据以下描述和权利要求书，这些和其他方面、特征、实施方案和优点将变得显而易见。
描述
图1、4、5、6、7和8是框图。
图2和3是流程图。
图9、10、16和21是图像。
图11、12、13、14、15、17、18和19是图表。
图20是筒的示意性侧视图。
我们提出对于许多微生物，使用关于快速微生物(例如细菌)检测(存在、缺乏或计数)、ID(即鉴定)和AST(即抗生素或其他抗微生物剂易感性测试)(和其他应用)的运动性运动学信息(和相应的技术)可以特别导致短得多的获得结果的时间(time-to-result)，例如在病原体的情况下的诊断结果。
我们广泛使用术语“微生物”来包括例如微观或超微观尺寸的任何微生物或其他生物体。微生物包括细菌、古细菌、真菌、原生生物、真核生物体和其他微生物。
我们广泛使用术语“抗微生物剂”来包括例如能够破坏或抑制或损害或影响一种或多种微生物，例如细菌、古细菌、真菌、原生生物、真核生物体和其他微生物，特别包括病原性微生物的存活力或生长或运动性的任何形式，相的任何材料、元件、组分、物质、成分或其他物质。我们有时使用词语“抗生素”，所述抗生素与广义上使用的词语“抗微生物剂”可互换使用。我们有时说微生物对抗微生物剂是“易感的”。我们有时说微生物对抗微生物剂“有抗性”。特别地，抗生素、抗真菌剂、抗细菌剂、防腐剂、消毒剂和洗涤剂是抗微生物剂并且可以被认为是抗微生物剂。
我们广泛使用术语“AST”来包括例如抗生素易感性测试或微生物对任何种类的抗微生物剂的易感性的任何测试。
微生物(例如细菌)的大多数现有的AST方法需要长测试时间。继而，这与大多数方法基于的度量相关：细菌的生长以及由暴露于抗生素引起的此种生长的破坏或降低。由于微生物产生平均持续30分钟左右，并且可能必需几代才能获得准确的读数，因此使用该度量无法获得快速结果。
已经使用MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/电离飞行时间)质谱法显著加快病原体鉴定(ID)，特别是在诊所中，所述MALDI-TOF质谱法仅花费几分钟来报告测试结果。然而，涉及病原体分离和耗时的培养富集步骤的样品制备在可发生实际ID测试前花费至少一天。
我们使用术语“个体微生物”来指物种或菌株的单一个体(例如细胞)，例如单一大肠杆菌个体。微生物包括细菌和其他病原体等。类似地，我们使用术语“个体细菌”或“细菌”和“个体病原体”和“个体微生物”来指物种或菌株的单一个体。我们通常使用术语“微生物”或“病原体”来指物种或菌株，且术语“微生物”或“病原体”或“细菌”指一种或多种物种或菌株。我们有时广泛使用术语“物种”来包括例如“菌株”。认为病原体和细菌是微生物的类型。
我们广泛使用术语“运动性”来包括例如病原体或其他微生物的任何自发运动，例如个体微生物的运动或个体微生物群的运动。运动性包括通过鞭毛游动和群游运动性；通过菌毛、纤毛和其他细胞附属物的搐动和滑动运动性；潜在运动机制仍未知的运动性；和其他运动性。
我们广泛使用术语“运动性运动学”来包括在介质(例如流体或其他样品)内或表面上或表面附近的微生物或微生物群的运动和移动策略的任何特征或特性。此类运动和移动策略包括例如游动、群游、搐动或滑行。我们有时将“游动运动学”称为任何种类的运动性运动学的一个良好例子，并且作为任何种类的运动性运动学的速记参考。游动运动学包括例如轨迹、轨迹形状、游动方向、运动细胞浓度、速度、加速度、均方位移、转动速率、转动角度、不同转动角度的时间顺序、扩散率、净毛位移比、曲率、波动、运动细胞与非运动细胞的比率，以及可以从这些或者一般从个体微生物的轨迹导出的任何量，等等。微生物或微生物群的运动和移动可以基本上受布朗运动，即由热搅动引起的流体中微观物体的随机运动的影响。布朗运动对游动微生物的公认影响是游动轨迹与直线路径的随机偏差。偏差是由微生物与周围水分子之间的碰撞引起的。
通常由鞭毛或菌毛等附属物介导的运动是许多细菌物种拥有的高等行为，特别是许多病原体，包括大肠杆菌、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)和其他弧菌菌株、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)和其他疏螺旋体菌株、一些芽孢杆菌属(Bacillus)菌株、巴尔通体属(Bartonella)菌株、梭菌属(Clostridium)菌株、军团菌属(Legionella)菌株、钩端螺旋体属(Leptospira)菌株、奈瑟氏菌属(Neisseria)菌株、支原体(Mycoplasma)、密螺旋体属(Treponema)等。可以包括在该分析中的病原体不限于人类病原体(也包括食源性病原体)，但也包括其他生物体，特别是动物和植物的病原体。运动性包括流体中的游动运动性，包括与表面相邻的流体中的运动性，以及表面上的运动性，特别包括搐动、滑动和群游运动性。由于运动所需要的高等的细胞协调，以及其对微生物的生理状态和物理特性(例如，大小和形状)两者的依赖性，(i)运动性是细菌(或其他微生物)的每种物种特征性的，(ii)运动性在暴露于抗生素及其他化学品和物质后变化。
我们在此描述的运动性技术的一些实施方案基于以下中的一种或两种或更多种的组合：(1)关于单细胞运动性运动学的信息的产生、分析和维持，例如微生物的游动运动学，(2)检测个体微生物的存在、缺乏或计数的运动性的量化，(3)鉴定微生物的运动性运动学的量化，和(4)检测微生物的运动性变化作为对抗生素或其他抗微生物剂的易感性的生物标志物。
例如，不同细菌具有不同的游动运动学。例如，肠细菌大肠杆菌以一种所谓的运行翻滚(run-and-tumble)模式游动，其中几乎直的、长约1秒钟的“运行”被再定向(“翻滚”)中断，所述再定向在方向上几乎是随机的。相比之下，海洋细菌(包括例如弧菌)的许多物种以运行-反向轻弹(run-reverse-and-flick)模式游动，其中向前运行之后是180度逆转，然后是另一个180度逆转，然后随机再定向(“轻弹”)。游动运动学也可以是一类流体的函数，包括粘度、化学成分、营养物含量和微生物在其中移动的流体或其他材料的温度、或者微生物在其上或附近移动的表面的特性。
对于某些细菌物种，已经准确地表征和量化了个体微生物的一些运动性运动学和其他特征。对于其他物种，可以经由在个体微生物的分辨率下的成像方法来表征和量化个体微生物的运动性模式和运动学以及特征性特点。我们在此描述的表征和量化技术包括创建、维护和使用运动性运动学的运动性数据库以及个体微生物的特征性特点的形态学数据库，其是数据库管理系统的一部分，其中每类微生物与其特征性运动性运动学的特性相关，包括轨迹、轨迹形状、游动方向、方均位移、运动细胞的浓度、速度、加速度、转动速率、转动角度、不同转动角度的时间顺序、扩散率、净毛位移比、曲率、波动、运动细菌与非运动细菌的比率以及可以从这些或者一般从个体微生物的轨迹中导出的任何量，等等。我们在此描述的表征和量化技术包括创建、维护和使用个体微生物特征性特点的形态学数据库，该数据库是数据库管理系统的一部分，其中每类微生物与其特征性特点的特性相关，包括相对于相同样品中的其他个体微生物，形状、长宽比、凸度、面积、大小、尺寸、长轴方向、偏离球形形状、强度、强度分布或空间排列中的一个或多个。个体微生物的其他特征性特点包括荧光表达、自发荧光、荧光探针、与外部试剂如微米和纳米颗粒的结合、抗体、量子点和其他颗粒，它们可以是荧光的或非荧光的。
我们广泛使用术语“形态学”来包括例如微生物或其任何部分的形式或结构的任何方面或个体微生物相对于其他个体微生物的空间排列。
因此，在例如体液样品中移动的未知微生物的运动性的成像可以与存储于运动性数据库中的数据结合使用以快速(例如，在几分钟内)鉴定哪个微生物(若有的话)在样品中，其通过比较从图像导出的运动性运动学特性与存储于数据库中的已知微生物的已知运动学特性进行。此外，微生物对抗生素或其他抗微生物剂的易感性可以通过比较一个时间时或一个样品中的微生物的运动性运动学特性与源自另一组图像的另一个时间时或另一个样品中的微生物的运动性运动学特性来快速确定。例如，另一个样品可以是相同流体的但不添加或添加不同浓度的抗生素或其他抗微生物剂的样品，或者在不同状态或条件中或在不同时间时的相同流体的样品。
样品(例如，体液样品)中未知微生物的个体细胞的成像(在确定或不确定运动性特征的情况下)也可以与存储于形态学数据库中的数据结合使用以快速(例如在几分钟内)鉴定哪些微生物(若有的话)在样品中，其通过比较从图像导出的特征性特点与存储于形态学数据库中的已知微生物的已知特征性特点进行。此外，微生物对抗生素或其他抗微生物剂的易感性可以通过比较一个时间时或一个样品中的微生物的特征性特点与源自另一组图像的另一个时间时或另一个样品中的微生物的特征性特点来快速确定。
在一些实例中，微生物对抗生素或其他化学品或物质的易感性可以通过比较一个时间时或一个样品中的微生物的布朗运动与源自另一组图像的另一个时间时或另一个样品中的微生物的布朗运动来快速确定。例如，另一个样品可以是相同流体的但不添加或添加不同浓度的抗生素或其他抗微生物剂的样品，或者在不同状态或条件下或在不同时间时的相同流体的样品。由于获得运动性运动学的定量性质(或定性信息)的运动性成像和运动性图像数据的处理两者是非常速的并且也可以在具有低微生物计数的样品(例如，直接患者样品)中进行，此种方法适合于克服基于生长的传统方法的基本限制，并且因此提供关于病原体的存在/缺乏、计数、ID和AST和其他应用的快得多的结果。
我们的运动性技术使用当一个或多个个体细菌或微生物在样品中移动时追踪它们(我们有时使用术语细菌作为一个例子来广泛指代任何微生物)并表征和测量它们的运动性运动学。简言之，我们的运动性技术的一些实施方案包括获取和处理样品，在一些情况下细菌悬浮液的显微术视频。在一些情况下，细菌悬浮液可以是体液、其他流体、细菌培养物、或已经添加了微生物的流体、或含有具有固体或其他非流体材料的样品的流体，例如地面食物、食物颗粒或环境样品，或伤口样品。在一些情况下，细菌样品不需要是流体或不需要悬浮在流体中，而是可以是固体或其他非流体材料。对于微生物(例如细菌)鉴定(ID)，在一些应用中，仅对未知样品进行成像，并将得到的信息用于与运动学数据库和形态学数据库中的信息进行比较。对于微生物(例如，细菌)ID，在一些应用中，比较关于不同环境条件(例如，温度，pH)下的至少两个样品的运动性运动学的信息。形态学数据库和运动性数据库在某些情况下可以是同一个数据库，并且我们有时使用简单的术语“数据库”来指代一个或另一个或组合的数据库。形态学数据库和运动性数据库中的信息可以取决于其他参数，包括与测试条件相关的参数(例如，温度，pH)。
我们有时广泛地使用术语“流体”来包括例如微生物表现出运动性的任何相的任何介质或材料。
通常，对于AST，使用关于至少两个样品(一个添加有抗生素而一个不添加抗生素)的运动性运动学信息。然而，在一些实施方案中，对于AST，通过在两个或更多个时间时比较相同样品的运动性运动学，使用仅关于已添加抗生素的一个样品的运动性运动学信息。(我们有时使用术语“抗生素易感性测试”或AST广泛地包括对微生物对一种或多种抗生素或其他抗微生物剂的易感性的任何分析)。
在一些实例中，将细菌悬浮液加载到筒或其他装置的两个或更多(例如，许多)孔中以容纳样品，特别是设计用于高通量视频显微术的装置，以在单一测试中几乎同时测试微生物对一种或多种(例如，许多)抗生素条件(例如抗生素的类型、抗生素的浓度、抗生素暴露时间、抗生素的组合、或补充抗生素的其他物质，例如一种或多种酶抑制剂(例如，β-内酰胺酶抑制剂))的易感性。为此，可以使用配备有物镜、相机和可选地自动化平台和温度控制系统的显微镜。相机获取每孔中细菌悬浮液的图像序列。可以以捕获细菌运动的连续影片的速率(例如，每秒15帧；通常对于搐动运动性而言更小)来获取图像序列。无论帧捕获率如何，我们将图像序列称为视频。
在一些实施方案中，图像分析软件(我们称为ASK-游动运动学分析-软件的部分)处理图像序列以确定个体微生物的轨迹，通常与以近实时一样快或更慢，这取决于计算资源。例如，“近实时”指几乎与获取视频同时，或者延迟不超过几秒。从轨迹中，软件提取运动性运动学的定量度量，例如游动运动学，包括速度、加速度、转动速率、转动角度、均方位移、运动细胞浓度、不同转动角度的时间顺序、扩散率、净毛位移比、曲率、波动、运动细菌与非运动细菌的比率以及可以从这些或者一般从个体微生物的轨迹中导出的任何量。ASK软件然后进行以下活动中的一个或两个或更多个，以及潜在其他活动：(i)使用提取的游动运动学度量来检测个体微生物的存在、缺乏或计数；或者(ii)使用提取的游动运动学度量和存储于数据库管理系统的运动性数据库中的游动运动学的已知度量来鉴定细菌(或其他微生物)；或(iii)使用提取的特征性特点的度量和存储于数据库管理系统的形态学数据库中的特征性特点的已知度量，以鉴定细菌(或其他微生物)；或(iv)基于例如暴露于不同抗生素或其他抗微生物条件(包括完全缺乏抗生素)的样品中微生物的游动运动学(包括布朗运动效应)的差异来确定细菌对每种抗生素或其他抗微生物条件的易感性。游动运动学信息的其他应用也是可能的。
我们的运动性技术具有广泛的适用性以检测(存在、缺失、计数)、鉴定和确定它可以在其中移动的任何流体，例如液体悬浮液中存在或制备的任何能动细菌(或其他微生物)的抗生素易感性，这是因为我们的技术专注于分析运动性运动学作为检测、ID和AST以及其他应用的生物标志物。临床环境和食品、农业和制药业中的能动细菌的实例包括但不限于：大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和其他弧菌属菌株、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)和其他疏螺旋体属(Borrelia)菌株、一些芽孢杆菌属(Bacillus)菌株、巴尔通体属(Bartonella)菌株、梭菌属(Clostridium)菌株、军团菌属(Legionella)菌株、钩端螺旋体属(Leptospira)菌株、奈瑟氏菌属(Neisseria)菌株、支原体、密螺旋体属等。我们的运动性技术适用于在液体中经由鞭毛运动的细菌，包括接近表面，并且还适用于经由其他附属物(例如菌毛和纤毛)在表面上运动(例如，搐动、滑动和群游运动性)的细菌。(因此，当我们提到液体中的运动性时，我们有时也指表面附近或表面上的运动性。)
我们的运动性技术也具有用于测试微生物对任何抗生素或其他抗微生物剂的易感性的宽适用性，包括属于不同类别的抗生素(如β-内酰胺或非β-内酰胺)，或更广泛地，以影响微生物生长、存活力或运动性的方式使它易感的任何化学品或其它物质，包括但不限于：阿米卡星、阿莫西林-克拉维酸盐、氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、阿奇霉素、阿洛西林、氨曲南、氨曲南-阿维巴坦(avibactam)、贝西沙星比阿培南(Besifloxacin Biapenem)、羧苄西林、头孢克洛、头孢孟多、头孢唑啉、头孢地尼、头孢托仑、头孢吡肟、头孢他美、头孢克肟、头孢美唑、头孢尼西、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢替坦、头孢西丁、头孢泊肟、头孢丙烯、头孢洛林(Ceftaroline)、头孢洛林-阿维巴坦、头孢他啶、头孢他啶-阿维巴坦、头孢布烯、头孢唑肟、头孢吡普(Ceftobiprole)、头孢洛扎(Ceftolozane)-他唑巴坦、头孢曲松、头孢呋辛、头孢噻吩、氯霉素、西诺沙星、环丙沙星、克拉霉素、克林沙星、克林霉素f(Clindamycinf)、粘菌素、达巴万星(Dalbavancin)、达托霉素、地红霉素、多利培南、多西环素、依诺沙星、厄他培南、红霉素，法罗培南，非达霉素(Fidaxomicin)，非那沙星(Finafloxacin)，氟罗沙星，磷霉素，夫西地酸，加雷沙星，加替沙星，吉米沙星，庆大霉素(Gentamicink)，格帕沙星，埃拉普林亚胺培南(Iclaprim Imipenem)、卡那霉素、左氧氟沙星、利奈唑胺、Linopristin-flopristin、洛美沙星、氯碳头孢、美西林、美罗培南、甲氧西林、美洛西林、米诺环素、拉氧头孢、莫西沙星、萘夫西林、萘啶酸、奈替米星、呋喃妥因、诺氟沙星、氧氟沙星、奥马环素(Omadacycline)、奥利万星、苯唑西林、青霉素、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、普拉佐米星(Plazomicin)、多粘菌素B、奎奴普丁-达福普汀、阿祖培南(Razupenem)、利福平、索利霉素(Solithromycin)、司帕沙星(Sparfloxacin)、磺胺异恶唑(Sulfisoxazole)、硫培南(Sulopenem)、Tedizolid、替考拉宁、替拉万星(Telavancin)、泰利霉素、四环素，替卡西林，替卡西林-克拉维酸盐、替吉环素、妥布霉素、甲氧苄啶、甲氧苄啶、磺胺甲恶唑、丙大观霉素、曲伐沙星、尤利沙星(Ulifloxacin)(普卢利沙星)、万古霉素。
我们的运动性技术也具有用于测试微生物对其他物质的易感性的广泛适用性，包括未被归类为抗生素但已知或假设对微生物具有效果，包括与抗生素的效果类似的效果的物质。一些例子是防腐剂。一些例子是洗涤剂。一个例子是天然产物，诸如酸果蔓汁。我们的运动性技术具有用于测试任何物质对微生物运动性的影响的广泛适用性。我们的运动性技术也适用于两种或更多种抗生素或其他物质，包括酶抑制剂(例如，β-内酰胺酶抑制剂)的组合，可能与其他运动性影响因素结合，包括但不限于流体类型、流体性质(例如，粘度)、化学品(如营养补充剂，毒素)和温度。所有这些例子都在“抗微生物剂”或“抗生素”的范围内，因为我们在最广泛的意义上使用那些术语。
多种机制可以引起抗生素暴露后细菌的游动运动学的变化。一种机制是游动机制的变化。例如，抑制细胞壁生物合成的β-内酰胺抗生素(例如，青霉素、青霉烯(penem)或头孢烯类)引起细胞形状的变化(参见例如图21)，其继而直接影响细胞如何游动。第二种机制是生物化学品。非β-内酰胺抗生素(例如，氨基糖苷类、喹诺酮类或四环素类)抑制蛋白质、DNA或RNA合成，其不利地影响病原体的生理状态，其通常是运动性的决定因素。
我们的运动性技术的一些实施方案可以使用下面描述的元件、装置、技术及它们的组合。极其多种其他实施方案也是可能的。
如图1中且更具体地在图20中所示，在一些实施方案中，使用具有多个(2至1000；例如，100)孔12的筒10以在孔中含有细菌悬浮液(或“样品”)14，用于成像。在一些情况下，孔是约4mm x 4mm x 2mm(但尺寸可以变化)，使得许多孔安在小筒(例如，显微镜载玻片或96孔板的大小)上。孔可以具有任何形状，例如正方形或圆形或椭圆形或矩形或具有圆形边缘的矩形等，以及任何高度。例如，典型的高度可以是10μm至10mm。许多孔的使用允许AST中的高通量(使许多抗生素，或许多抗生素条件，或许多样品，或这些的组合能够在相应的孔中进行测试)，例如遵循肉汤稀释法的构思以测试不同的浓度。用户可以根据特定测试的需要使用多个孔。不同的筒也可以具有不同数量的孔。给定筒的不同孔不需要都具有相同的大小、形状、高度或配置，但是那些参数中的一个或多个可以在筒的不同孔之间不同。尽管图20中仅显示了两个孔，但实际的筒通常具有超过两个孔。
我们描述的用于加载、容纳、成像和分析一个或多个样品的技术可以应用于任何种类的孔，如以其最广义使用的。
我们广泛使用术语“孔”来包括例如任何容器、贮器、贮存器、隔室、凹槽、微流体或其他通道、腔、持器、表面、容纳装置或保持、容纳、保护、隔离样品或以其他方式隔离样品与另一样品或环境的其他装置。我们有时与词语“孔”可互换使用词语“通道”，如以其最广义使用。
对于病原体ID目的，至少需要一个孔。在一些情况下，可以使用最少两个孔来在不同环境条件下在大致相同或完全相同的时间时比较两个流体样品之间的运动性运动学。对于病原体AST目的，若用户意图在大致相同或完全相同的时间时比较两个流体样品(例如，一个具有抗生素或其它抗微生物剂而一个没有抗生素或其它抗微生物剂)之间的运动性运动学，则通常使用最少两个孔。在一些情况下，例如，可以比较孔中样品的运动性运动学与存储于运动性数据库中的相同微生物的运动性运动学。在一些情况下，例如，可以比较孔中样品的运动性运动学与在较早时间点时对相同孔获得和存储的运动性运动学。
除了筒上仅使用少量空间的每孔之外，孔的微小性减少分析所需要的样品量，其在仅可用低体积样品，例如某些身体样品时是特别有益的。孔的微小性也减少每孔内的残留流体流动。当液体被包含在大孔或具有自由表面的孔中时，已知发生此类残留流体流动(也就是说，即使例如用户不有意引起它们也会发生的流体的小移动)，例如由于不均匀的温度分布。由于在存在此类流动的情况下，细菌的游动运动学分析被流体的运动所混淆，减少或避免这些流动有助于细菌的可靠追踪。然而，若细菌的运动性运动学被残留流体流动的存在混淆并且这些残留流动的量级是适度的，则ASK软件可以考虑到这点，并通过扣除流动对细菌移动的贡献来确定细菌的运动性运动学。为了减少残留流动的影响，在一些实例中，在填充孔之后，用膜或其他覆盖物16(例如，透气覆盖物以允许气体通过)密封筒。在一些情况下，覆盖物可以(i)在填充之前存在于筒上(例如以确保无菌性)，(ii)由用户暂时剥离以填充孔，然后重新施加，或(iii)保持原样并且使用针在样品注射期间穿孔。
我们广泛使用术语“覆盖物”以包括例如覆盖、保护、隔离孔的内部或以其他方式隔离孔的内部与环境的任何膜、层、片、表面或其他装置。我们有时与词语“覆盖物”可互换使用词语“膜”，如以其最广义使用。
为了避免由于附着于孔表面或密封覆盖物所致的游动细菌的固定化，孔的表面或密封覆盖物可以由材料形成或用化学品(例如，牛血清白蛋白，或PLL-g-PEG或PLL-g-PMOXA)预先包被18或两者以防止细菌附着于那些表面。在某些情况下，例如当期望观察表面上的运动性时，孔的表面可以由材料制成或用有利于细菌附着到那些表面的化学品(例如PLL)预先包被。
筒上的各个孔可以容纳一个样品的子部分或多个不同样品(例如，在多个孔中分开的单一样品，或在不同孔中的不同样品，或那些的组合)，并且这些可以暴露于一种或多种抗生素或其他抗微生物剂(例如，多个孔中的一种抗生素，或不同孔中的不同抗生素，或特定孔中的多种抗生素，或那些的组合)，其具有一种或多种抗生素条件(例如，浓度，不同抗生素组合)(例如，多个孔中的一种抗生素条件，不同孔中的不同抗生素条件，或那些的组合)。在一些实例中，将单一样品(例如，体液)填充到两个或更多个孔中，并暴露于一批不同浓度的不同抗生素(对于每孔的一种抗生素和浓度)。也可以使用重复孔(超过一个孔中的相同样品和抗生素条件)。
在一些应用中，用户将一个或多个样品加载到孔中，例如经由移液管(例如，相同的样品进入所有孔中)。例如，选项包括从顶部加载(例如逐个孔或多个孔，同时用多通道移液器或机器人系统加载)或注射入主要贮存器中，内置流控或其他流体分配系统从所述主要贮存器中将样品取到个别孔中。
在一些实施方案中，筒可以在不同孔中预先加载预先确定组的预先确定浓度的抗生素或其他条件，用户对所述不同孔添加一个或多个样品。预先加载的抗生素可以是冻干的。
在一些实施方案中，用户将一种或多种抗生素和一个或多个样品两者添加到孔。
在一些实施方案中，用户将一种或多种抗生素和一个或多个样品序贯添加到孔，或反之亦然(首先是一个或多个样品，然后是一种或多种抗生素)。
可以使用密封筒的各孔的覆盖物来维持无菌性。覆盖物通常是透明的，筒也是如此。例如，覆盖物可以是透气的。例如，覆盖物可以是可拆卸的。例如，覆盖物可以是柔性的或刚性的。例如，覆盖物可以是平的或有图案的。例如，筒可以带有应用的覆盖物，用户可以瞬间移除所述覆盖物以进行填充，之后重新密封。例如，覆盖物可以由易于用针刺穿以进行填充的材料制成。覆盖物可以例如由固体材料制成。覆盖物可以例如具有一个或多个孔。其他类型的覆盖物也是可能的。
在某些情况下，AST的目的是测试细菌对一种或多种抗生素的条件范围的易感性。
在一些实施方案中，用户在每孔中添加期望的一种或多种抗生素或其他抗微生物剂，各自处于期望的一种或多种条件(例如浓度)。通常在液体储备溶液中制备期望的抗生素。对于一些抗生素，抗生素也可以以粉末形式添加，例如当贮存液体原液成问题时。
在一些实施方案中，在贮存器内在筒上预先加载一种或多种抗生素。然后，构建到筒中的流控装置或其他流体分配系统自动将适当浓度的一种或多种抗生素递送至个别孔中。
在一些实施方案中，在个别孔中在筒上预先加载一种或多种抗生素，每孔潜在具有不同浓度的给定的一种或多种抗生素。因此，当用户将抗生素加载到孔上时，细菌暴露于抗生素。
也可以使用两种或更多种用于加载筒的上述技术的组合。
如图1所示，在一些情况下，将筒定位于光学显微镜22的动力化台20上，以进行细菌的成像和追踪(我们使用术语“追踪”来指确定轨迹)。显微镜的基本元件是(i)物镜，(ii)(可选地)自动移动台20，以及(iii)(可选地)温度控制单元24。在某些情况下，筒的位置可以是固定的，并且成像系统(通常由物镜和相机构成)可以从孔到孔移动。在一些情况下，显微镜可以具有多个成像系统(例如，多个物镜和相机)以同时或非同时获取相同孔或不同孔的多个视频。其他组合是可能的。
自动移动台使得显微镜能够在计算机程序的控制下经由装置操作层34实现以下中的任一个或两个或更多个的组合：(i)在筒中从孔到孔水平移动，使得继而可以对每孔或选定的孔组成像；(ii)在任何给定的孔中垂直或水平扫描不同位置，以获得该孔的更多数据；或者(iii)对孔的底部表面成像，例如以追踪通过表面运动性，例如搐动，滑动或群游运动性移动的细菌。该台通常具有几微米的精确性。
物镜可以具有任何放大倍数。典型的放大倍数是10倍或20倍，但其他放大倍数是可能的。
温度控制单元24可以用于将样品维持于例如正常体温(通常37℃)。温度控制单元通常具有安装在显微镜台上的温度控制插入物或围绕筒、或台或整个显微镜或整个装置的温度控制外壳。
可以使用不同类型的显微术技术。通常使用相差显微术，但也可以使用暗视场显微术、明视场显微术、荧光显微术或其他显微术技术。
显微镜台上的筒的运动由计算机经由专用软件28控制。
连接到显微镜的是用于获取每孔中的样品的视频(即，图像序列)的相机30。相机通常具有黑白传感器或颜色传感器。在一些实施方案中，传感器可以具有每像素5μm至20μm以及500x500至2000x2000像素的分辨率(其他规格也是可能的)。图像序列由两个或更多个图像构成，但是在一些实施方案中，它可以是单一图像。
在一些情况下，成像以每秒15帧的速率进行，但是更慢的速率(例如，每秒1帧或每秒5帧)或更快的速率(例如，每秒100帧)是可能的，这取决于样品和被追踪的运动性类型。
在一些情况下，每孔获取一个视频(或者有时在每孔内的多个位置处获得多个视频)。视频通常持续1-30秒，其通常是足以从细菌的轨迹获得运动性运动学信息的时间。在某些情况下，视频也可以短于1秒或长于30秒。
在某些情况下，每个视频的持续时间可以是自适应的。例如，软件(见下文)以近实时处理每个视频(也就是说，几乎在获取视频同时提供游动运动学，或者延迟几秒)，决定运动性运动学是否已经得到可靠量化，并继续视频采集，直到获得了足以可靠量化运动性运动学的数据，直到最大时间(例如，5分钟，但可以长达30分钟或更长)。
在一些实施方案中，可以通过调整相机设置中的框并(binning)(即，组合相邻像素)来使每个图像的分辨率自适应。在这些实施方案中，若需要更快的读出，则软件调整(通常降低)图像分辨率。样品中细菌的大小及其运动性运动学是设定图像分辨率以及因此框并的重要标准(例如，可以用较低的图像分辨率追踪具有快速运动性速度的微生物)。
在一些实施方案中，根据样品中细菌的浓度，可以使每个图像(即视场)的大小自适应。例如，拍摄小视场的图像足以量化具有高细胞浓度的样品中细菌的游动运动学。
控制显微镜的计算机上安装的相同软件可用于控制相机。
计算机将由相机获取的视频存储于临时数据存储单元40(例如，RAM)中。通常，安装于控制显微镜和相机的计算机上的相同软件可用于控制视频的存储。
在一些实施方案中，该过程每孔每个成像位置(若每孔中存在多个成像位置)产生一个视频(即，图像序列)。存储每个视频(即，该视频中的所有图像)。使用合适的标记方案和目录结构。图像的存储可以以不同的格式发生，例如jpeg或tiff格式。视频也可以直接以不同的格式存储，例如avi格式。视频可以解压缩。可以使用视频编解码器压缩视频，例如H.264/MPEG-4AVC。包括其他压缩方法。
ASK软件42处理视频，计算细菌的轨迹并分析样品中个体细菌的游动运动学。在一些实施方案中，可以包括预筛选步骤，其中对一个或多个孔，例如无抗生素孔成像以获得运动性的初始评估，例如以经由图像分析技术快速(例如，实时)确定活动细菌的存在。例如，用于该目的的图像分析技术的一些实例使用最小强度投影，如图9所示(例如，适合于具有白色或在其它情况下亮背景的图像)；一些实例使用最大强度投影(例如，适合于具有黑色或在其它情况下深色背景的图像)。在这些方法中，创建最小(或最大)强度投影图像，其中对每个像素给予该像素在视频中的所有图像间具有的最小(或最大)强度。以此种方式，细菌轨迹表现为条纹50，52，它们经常使得运动性或运动性的变化立即变得明显。ASK软件通过在最小(或最大)强度投影图像中鉴定这些条纹来确定给定样品中运动性的存在。此信息可以非常快速地获得并且若不存在运动细菌或者存在非常少的运动细菌，则可以用于中断或以其它方式调整工作流或者通过改变环境条件(例如，添加化学物质，诸如乙二胺四乙酸(EDTA))来刺激运动性。任选地，用户可以包括预筛选步骤。最小或最大强度投影方法仅是从视频获得运动性运动学的一大批图像分析技术的实例。
如图4所示，ASK软件包括三个主要部件：游动运动学分析器56、包括运动性数据库等的ASK数据库管理系统58和ASK调谐器(turner)60。若样品中存在运动细菌，如通过预筛选步骤(如关于图9所讨论)确定，则ASK软件中的游动运动学分析器(也参见图5)对来自临时存储器63(图5)的图像数据(“图像帧”)62以及来自ASK调谐器60的更新的调谐数据64(例如，用于细菌检测和追踪的参数)(若存在先前的测量)进行图像和数据分析例程，以(i)使用细菌检测器70(也参见图6)在视频的每个图像中找到个体细菌，(ii)连接视频中图像与图像间的个体细菌，以使用细菌追踪器101(也参见图7)追踪和重建它们的轨迹并且(iii)使用ASK数据生成器103(也参见图8)获得细菌的游动运动学数据。游动运动学分析器56产生存储于ASK数据库管理系统58中的ASK数据和调谐数据68。选择的图像帧62(例如，视频的子集或整个视频)也可以存储于ASK数据库管理系统58中。
如图6所示，在一些实例中，基于图像分析技术，使用多个细菌标识符在每个图像帧中检测个体细菌。这些包括但不限于颜色鉴定72(例如，像素强度梯度)、形状鉴定74(例如，长宽比，凸度)、面积鉴定76(例如，大小阈值)和潜在一大批其他标识符78。标识合成器80可以按顺序或并行地且在对每种标识符加权和不加权的两种情况下应用这些标识符，以产生检测到的细菌数据82。在一些情况下，任何两个标识符可以在没有第三种的情况下组合使用。细菌检测器可以使用初始图像(即原始)或经处理的图像两者来鉴定细菌。经处理的图像的一个实例是由扣除背景图像产生的图像，其中背景图像可以计算为例如图像序列的平均或中值图像，或者例如序列中的初始图像。
在一些实施方案中，关于细菌的信息存储于数据库管理系统中的数据结构中，包括针对该细菌确定的属性，包括其水平和垂直位置、其大小、其强度、其形状、其长轴的方向(若细长的话)、任何其他与球形形状的偏离、其强度的分布、相对于样品中其他细菌的空间排列、以及可以从其图像获得的任何其他参数。
如图7所示，使用细菌追踪器101中的追踪技术，基于检测到的细菌数据82(例如，坐标、面积、形状)在图像帧与图像帧间追踪个体细菌。通过追踪，我们指的是在帧中检测到的个体细菌的数据与其他帧中相同个体细菌的数据相关。例如，对于在给定图像帧中检测到的给定细菌，一个或多个轨迹标识符基于位置的接近度90(一个实例是具有特定回溯深度的最近邻方法)、速度92、方向94和加速度以及一批其他标准96将当前检测到的细菌分配到搜索半径内的先前鉴定的轨迹。搜索半径可以由用户定义或由软件(例如，ASK调谐器60)基于存储于ASK数据库管理系统的数据库中的先前追踪信息自适应设置。若在搜索半径内没有先前鉴定的轨迹，则将当前检测到的细菌分配给新的轨迹。然后，使用利用上述一个或多个标准的评分函数来基于评分函数98确定一定数量的候选细菌中的最佳匹配100，因此将连续帧中的细菌位置连接到给定细菌的轨迹102中。将细菌连接到轨迹的标准可以是概率性的。
可以使用鉴定的游动轨迹来获得样品中活动细菌数量的计数。可以使用鉴定的布朗运动轨迹来获得样品中非运动细菌数量的计数。由于成像体积是已知的，此计数可以转换成运动细菌或非运动细菌或两者的浓度。源自追踪过程的信息可以包括样品中活动细菌的存在、缺乏、计数、百分比或浓度(或那些类别的组合)，它们可以提供例如感染的存在、性质和潜在严重性的测量。例如，缺乏运动细菌或其他病原体也可以帮助支持下述结论，即与细菌性形成对比，感染是病毒起源的。运动细菌数量随时间的变化或运动细菌与非运动细菌的分数随时间的变化可以提供细菌对给定抗生素的易感性的信息。然后，可以将细胞浓度与下文所述的关于微生物身份(ID)的信息一起使用。
在一些实施方案中，可以使用标准来从分析中消除样品中存在的非游动颗粒或其他实体。非微生物的颗粒或其他实体通常存在于样品中，并且可以是生物或非生物起源或两者。用于从分析中消除它们的标准包括大小、形状、移动(例如，表面附着的颗粒或其他实体的移动的缺乏)等，以及它们的组合。从分析中消除颗粒或其他实体可以用于简化分析，特别是对于混浊样品。
游动运动学通常是细菌的运动和轨迹的定量特征，在个体细菌的水平上计算，并且有时在样品中成像的所有细菌或子集中取平均值。
如图8所示，在ASK数据生成器103中以两种模式之一聚集并统计分析110个体细菌的游动运动学：(i)使用所有追踪的轨迹，或(ii)使用选定的轨迹112，其满足某个用户限定的标准，例如关于轨迹长度、移动的总距离、速度等的标准。数据的聚合可以通过多种数学过程，例如给定属性的值的简单平均值应用于几个、数十、数百或数千个个体细菌。
在一些实施方案中，ASK数据68可以包括以下游动运动特征。
1.速度。例如，通过将行进的绝对距离(沿着轨迹)除以轨迹的持续时间，从个体细菌的轨迹获得速度。
2.加速度。例如，通过测量沿着轨迹的速度变化从个体细菌的轨迹获得加速度。
3.转动速率。例如，转动速率(也称为翻滚速率)通过限定转动标准(例如，在给定时间间隔内某个阈值角度以上的方向变化，可能伴随着某个阈值以下的瞬时游动速度降低)，鉴定轨迹中的所有转动事件，并将转动事件的数量除以轨迹的持续时间从个体细菌的轨迹获得。
4.转动角度。例如，通过首先鉴定转角(使用上述第3点中描述的相同标准)，然后确定转角前方向和转角后方向之间的方向变化，从个体细菌的轨迹获得转动角度。
5.轨迹的整体运动性模式或“形状”。具有某种“节奏”(例如，几乎直线运行、转角、反转、停止)的轨迹的不同分量的交替是给定物种特征性的并且表示其运动性模式。
6.细菌的扩散率，计算为在给定时间内覆盖的面积。扩散率代表细菌在其运动中所覆盖的总面积的测量。
7.细菌的净毛位移比(NGDR)，计算为从轨迹的起点到终点行进的线性距离除以沿轨迹本身行进的距离。NGDR代表轨迹多么直(相对于弯曲)的测量。
8.细菌的均方位移(msd)，计算为给定时间段内行进的线性距离的平方。
9.轨迹的曲率，其例如通过确定游动期间的方向变化获得。
10.主要运动模式周围的波动(“摆动”)。
11.运动与非运动细菌的分数随时间的变化。
12.从这些游动运动学的组合导出或者在其它情况下从轨迹的分析导出的量。
游动运动学是每种细菌物种特征性的，为病原体鉴定提供了有力的标准。例如，大肠杆菌(一种用于研究细菌运动性的充分表征的模型生物体)以所谓的“运行翻滚”运动性模式通过交替直线游动与几乎随机方向上的偶尔转动游动(图10a，b)。另一方面，铜绿假单胞菌主要以所谓的“运行-反向”运动性模式来回游动(图10c，d)。
在一些实施方案中，为了鉴定微生物，通过ASK软件将从每孔获得的游动运动学与存储于运动性数据库中的已知微生物的已知游动运动学数据进行比较130(参见图2)。若测量的游动运动学足够接近存储于运动性数据库中的已知游动运动学，则建立微生物的阳性ID。“足够接近”是指进行统计分析并且对微生物的阳性鉴定建立置信度水平。大肠杆菌和铜绿假单胞菌的示例性标准是转动角度，其在特征上是不同的(图10)。ID的最稳健的潜在多参数标准(例如，速度、转动角度和转动速率的组合)确定为分析的一部分。图10显示了大肠杆菌(图10a)以“运动-翻滚”运动性模式游动(图10b)，并且铜绿假单胞菌(图10c)以“运行-反向”运动性模式游动(图10d)。图10a和10c从疾病控制和预防中心(CDC)，“AntibioticResistance Threats in the United States”，2013改编。图10b从H.Berg,‘E.coli inmotion’,Springer 2004改编。在一些实施方案中，为了鉴定微生物，通过ASK软件将从每孔检测到的个体微生物的特征性特点与存储于形态学数据库中的已知微生物的已知特征性特点数据进行比较130(参见图2)。若测量的特征性特点足够接近存储于形态学数据库中的已知特征性特点，则建立微生物的阳性鉴定。“足够接近”是指进行统计分析并且对微生物的阳性鉴定建立置信度水平。杆菌和球菌的一个示例性标准是细胞形状，其在特征上是不同的：杆状具有杆的形状，球菌具有球形的形状。弧菌具有不同的新月体样形状，我们广泛地解释形态学，其也包括个体微生物相对于其他个体微生物的空间排列。实例以葡萄球菌属种和链球菌属种代表，它们的空间排列在特征上是不同的：葡萄球菌属种形成葡萄状簇，链球菌属种形成链状簇。因此，空间排列为ID提供了额外的标准。确定最稳健的标准(其潜在是多参数标准(例如，运动性、大小、形状和空间排列的组合))为分析的一部分。在一些实施方案中，为了鉴定微生物，使用属于运动性和形态学两者的个体微生物的特征性特点。
从先前获得的已知游动运动学，例如从新鲜临床隔离群、临床原种隔离群、其他隔离群，从疾病控制和预防中心(CDC)可获得的攻击生物体、或由临床和实验室标准协会(Clinical&Laboratory Standards Institute，CLSI)或其他机构设定的质量控制标准参照菌株等构建存储于ASK数据库管理系统中的运动性数据。此种预先获取的数据存储于运行ASK软件的计算机内的运动性和形态学数据库中或者在线可获得以快速访问(对于连接到因特网的系统)。可以经由创建覆盖多个条件的数据库(例如，每个感染或每个体液的一个数据库)和多参数比较标准的使用(例如，游动速度和转动速率两者的比较)来增强比较的准确性。ASK软件也确定比较的统计学(即，在统计学上是否显著和处于何种显著性水平)，提供病原体或其他微生物身份的置信度度量。此外，该软件可以鉴定含有多种病原体物种的样品中的多种病原体物种，并提供鉴定每种中的置信度的统计度量。此外，该软件可以鉴定样品中单一细菌物种内的多种基因型。例如，在其抗生素易感性上不同的两种基因型的共存从运动性运动学的双峰分布看可以是明显的。
游动运动学在暴露于抗生素后变化，为AST提供生物标志物。AST可以以两种方式之一或它们的组合来进行：不使用或使用参考数据库。如图2所示，在一些情况下，ASK软件在相同的筒上进行在存在抗生素的情况下测量132的游动运动学与在缺乏抗生素的情况下测量的游动运动学的比较130。该软件还确定比较的统计学(即，在统计学上是否显著和处于何种显著性水平)，提供病原体对抗生素的易感性的置信度度量。
在某些情况下，基于一组先验定义和存储的定量标准完成比较。为了实现这点，使用已知单一微生物的游动运动学在暴露于抗生素后如何变化的数据库。使用每个靶病原体或其他微生物的一个数据库：对于每个，对不同的抗生素、不同的条件(例如，不同的温度、样品的不同化学组成)和不同的暴露时间量化限定病原体的游动运动学的多个参数(例如，速度、转动角度、转动速率或运动性模式、均方位移等)的变化。然后，该数据库充当限定一组定量标准的尺度，包括绝对和相对变化两者，以确定诊断期间给定样品中细菌的抗生素易感性。该软件还确定比较的统计学(即，在统计学上是否显著和处于何种显著性水平)，提供病原体对抗生素的易感性的置信度度量。
在上述两种情况下，当测定多种抗生素条件时，软件计算抗生素对该细菌的最小抑制浓度(MIC)(图19)。然后，软件或用户确定从运动性确定的此MIC是否位于从文献可获得的质量控制范围内或者直接将从运动性确定的MIC与从用金标准测定法(例如肉汤微量稀释测试)的平行测试确定的该细菌的MIC进行比较。基于临床和实验室标准协会(CLSI)或欧洲抗微生物剂易感性测试委员会(EUCAST)发布的临床断点，MIC还可以产生诊断性能，包括细菌的类别一致性(易感/中间/抗性)和差异率(主要、次要和非常大的差异)。
虽然运动性是测定的一种非常快速的表型，但是单一微生物水平成像也提供了关于其他重要表型的信息，包括细胞数量、细胞大小、细胞形状以及它们是否处于分裂过程中。如图5和8所示，这些额外的表型可得自从细菌标识符获得的检测到的细菌数据，而无需经由细菌追踪器进一步处理。例如，形状可以用于区分球菌、杆菌和弧菌。若在每孔中以短间隔(例如，5至15分钟)发生成像以评估生长，则可以使用大小。细胞数量同样可用于评估生长。在一些实施方案中，ASK软件通过使用进一步增强AST的可靠性的标准的组合来利用运动性信息以及这些其他关键表型中任一个的变化。可以在统计模型中评估表型变化的组合，所述统计模型将抗生素处理结果与无抗生素对照结果进行比较。
游动运动学分析器生成两个数据集(图8)：(i)ASK数据68，以及(ii)调谐数据68。ASK数据包括所有量化的游动运动学信息或检测到的细菌数据或两者。调谐数据包括用于当前分析中的微生物ID或AST或两者的所有标准。游动运动学分析器发送从当前分析获得的调谐数据并将它们存储于ASK数据库管理系统中(图4)。ASK调谐器模块利用存储于数据库中的先前数据(即历史数据)来持续升级游动运动学分析仪，并在后续测试中增强ID或AST(或两者)例程的准确性。
其他实施方案也在所附权利要求的范围内。
例如，虽然我们已经讨论了抗生素及其对细菌运动性的影响，但我们描述的运动性技术也适用于任何微生物和意图对微生物具有在其运动性变化上反映的效果的任何化学品-抗生素或其他物质。
该方法的范围也可以扩展到样品中的微生物不移动但具有运动能力或显示降低的运动性的条件，例如经由添加刺激运动性的化学试剂(包括例如特定营养物或EDTA)。在这些实施方案中，用户首先添加运动性刺激物，然后应用上述ID和AST技术或其他技术。该方法也可以是迭代的，例如，它可以在例如首先已经对样品进行成像并且尚未检测活动细菌的预筛选步骤之后应用，以增强运动病原性细菌的缺乏的置信度或检测那些。
实施例
在这里，我们描述了细菌的从其个体轨迹计算的游动运动学的选定实施例。
使用高毒力临床参考菌株铜绿假单胞菌PA14获得的未发表的实验数据证明了对抗生素的暴露改变病原体的单细胞水平游动运动学，表明个体微生物的运动性是卓越的候选者，作为确定抗生素易感性的快速诊断生物标志物。对于头孢他啶(一种β-内酰胺抗生素)，我们观察到当将铜绿假单胞菌PA14细胞暴露于抗生素时平均游动速度降低(图11和12)。图11呈现的数据证明在时间0时暴露于头孢他啶(1μg/ml)后铜绿假单胞菌PA14的游动速度随时间的降低。图11中的概率密度表示个体细胞间的速度分布(其中将每个时间点的至少257个细菌轨迹成像和分析)。具体地，当将铜绿假单胞菌PA14细胞暴露于浓度1μg/ml的β-内酰胺抗生素头孢他啶(图11和12)时，与相同时间点时无抗生素对照相比，细胞平均游动速度在30分钟后降低14％(49.7μm/s→42.6μm/s)，在50分钟后降低23％(45.9μm/s→35.4μm/s)，并且在70分钟后降低33％(46.5μm/s→31.2μm/s)。重要的是，游动运动学分析(ASK)软件在小于细胞分裂时间的时间内检测到游动运动学的变化(见图12中20分钟的时间点)，这意味着运动性可以是一种比生长快得多检测的生物标志物。在暴露于10μg/ml头孢他啶后观察到游动速度的类似变化(图12)，而在0.1μg/ml头孢他啶时未测量到与无抗生素对照相比游动速度的显著变化(图12)。在图12中，垂直误差棒表示标准差：在不可见的情况下，垂直误差棒小于符号。
当将铜绿假单胞菌细胞暴露于庆大霉素(一种非β-内酰胺抗生素)时，ASK软件也在一个细胞分裂内提供快速的AST结果。通过暴露于10μg/ml庆大霉素(图12)而非暴露于1和0.1μg/ml庆大霉素，病原体的游动速度显著降低。对于这里显示的实施例，使用数码相机通过相差显微术(20X物镜)以30帧/秒在孔的中间深度对游动细菌成像。所有分析均使用ASK软件(在C++中实施)进行，以鉴定细胞，重建其轨迹并量化其游动运动学。
ASK软件可以使用一个或多个用于快速AST的标准，如本文对头孢他啶和庆大霉素所示(图13)。例如，样品中细菌随时间的数量(图13)可以与游动运动学数据(图12)结合使用以提高AST的准确性。图13显示了细菌计数，并证明了在时间0时暴露于β-内酰胺抗生素头孢他啶(图12a)和非β-内酰胺抗生素庆大霉素(图12b)后铜绿假单胞菌PA14细胞数量随时间的变化，在该图的图例中给出选择浓度测试的两种抗生素中的每种。
如图14和15所示，对于给定的抗生素，ASK软件可以区分易感性菌株和抗性菌株，如本文在铜绿假单胞菌暴露于环丙沙星的情况下所示(图14和15)。图14显示环丙沙星损害铜绿假单胞菌的易感性临床隔离群的运动性(PSA9/53，MIC<0.125μg/ml)，并且图15显示环丙沙星不损害铜绿假单胞菌的抗性临床隔离群的运动性(PSA 71/36，MIC＝8μg/ml)。在图14a和图14c中，显示了相对于无抗生素对照(值为1的直线)的4μg/ml环丙沙星的PSA9/53的两个重复实验(CLSI抗性断点：≥4μg/ml)。通过对照中的速度(因此其变为1处的虚线)标准化游动速度(y轴)。当相对于对照的速度降低变得统计学显著(p＝0.001)时，抗生素处理显示为实线，并且当没有统计学显著性差异时显示为虚线。在图14b和图14d中，显示了相对于无抗生素对照(值为1的直线)标准化的8μg/ml环丙沙星的PSA9/53的两个重复实验。显示了图15a和图15b，相对于无抗生素对照(值为1的直线)标准化的暴露于4和8μg/ml环丙沙星的抗性菌株铜绿假单胞菌71/36的实验。注意，对于此种抗性菌株，速度从未与对照(线总是虚线)显著不同。图16显示了对于无抗生素对照(图16a)和4μg/ml环丙沙星(图16b)，过夜温育后评估的PSA71/36的运动性-板测定法。注意两种情况下的向外扩张(表示环丙沙星对此抗性菌株的运动性没有损害)，如用ASK软件在小于30分钟内获得的(图15a)。
ASK软件在1小时下(通常在30分钟内)，潜在地甚至更快提供微生物对抗生素的易感性的结果(图17)。图17显示了暴露于4μg/ml环丙沙星(图17a和图17b，显示了两个重复实验)、0.5μg/ml的美罗培南(图17c和图17d，显示两个重复实验)、8μg/ml的庆大霉素(图17e和图17f，显示两个重复实验)的临床隔离群铜绿假单胞菌9/53的游动速度。图17a至17f中的每个显示游动速度(相对于无抗生素对照情况下的速度)作为时间的函数，其中当速度比在对照中显著更低(p＝0.001)时线变为实线。对于图17a至17f所示的所有六种情况，图18显示首先检测易感性的时间(图17a至17f中的线变为实线的时间)。注意通常在10-50分钟内检测到易感性。注意运动性对环丙沙星和庆大霉素是非常敏感的，对美罗培南的敏感性较小，其显示较高的变异性，但仍提供统计学显著的结果。MIC(通过肉汤微量稀释测定法测定)<0.125μg/ml(对于环丙沙星)、0.5μg/ml(对于美罗培南)和1μg/ml(对于庆大霉素)。
如图19所示，用ASK软件确定的游动速度的变化可以用于量化抗生素的MIC。图19显示了对于暴露于不同浓度的庆大霉素(MIC 1μg/ml，如通过肉汤微量稀释测定法测定)的参考菌株铜绿假单胞菌ATCC 27853，游动速度(相对于无抗生素对照情况)作为时间的函数。当速度显著低于对照(p＝0.001)时，线变为实线。注意1μg/ml曲线如何揭示在暴露35分钟后的易感性。
参照
临床微生物学实验室中广泛使用的AST方法依赖于抗生素暴露后细菌生长的手动或自动测量(1,2)；所有数字引用针对下文所述的参考文献。手动方法(包括圆盘扩散测试和Etest梯度扩散测试)是简单且标准化的(1,2)，并提供定性信息(将细菌分类为易感、中间或抗性)和定量信息(最小抑制浓度，MIC)两者。自动化系统基于肉汤稀释测试(在(3)中综述)，经由灵敏光学系统检测生长的微妙变化，并提供与手动测试相同的信息。存在由FDA批准用于美国的多个自动化系统(2)，包括MicroScan WalkAway(Siemens HealthcareDiagnostics)、BD Phoenix自动微生物系统(BD Diagnostics)和Vitek 2系统(bioMerieux)。这些常规方法依赖于细菌生长并且依赖于样品，所述样品达到足够高的细菌浓度以进行稳健检测，这花费数小时至数天。
基于在单细胞水平测量的表型性状，在过去几年中出现了许多系统来加速ID/AST。这些测定法通常仍然基于生长测量，有时与表面上固定化的细胞的形态学相结合(4,5)。商业系统包括：
·Accelerate Pheno system(Accelerate Diagnostics；www.acceleratediagnostics.com)使用单细胞水平成像来以自动化方式测量形态变化作为AST的生物标志物。荧光原位杂交用于相同系统中的ID。得到结果的平均时间对于ID为90分钟且对于AST为7小时，从通常需要过夜温育的阳性血液培养开始。虽然它使用单细胞成像，但此种方法仅限于测量形态的变化，并且仅适用于固定化在表面上的细胞。
·QMAC dRAST系统(Quanta Matrix；www.quantamatrix.com)使用微流体技术和单细胞成像来测量形态变化，作为AST的生物标志物(4)。AST的得到结果的平均时间是从通常需要过夜温育的阳性血液培养起的4小时。该方法适用于固定化(凝胶中包埋)并需要关于病原体ID的先验信息的细胞。
·LifeScale AST system (LifeScale；www.affinitybio.com/products/lifescale.php)使用微流体技术检测细胞数量和单细胞质量的变化，作为AST的生物标志物。视频显微术进一步产生单细胞形态学信息。AST的得到结果的时间是从通常需要过夜温育的阳性血液培养起的约3到4小时。此种方法需要关于病原体ID的先验信息。
·216Dx UTI系统(Bacterioscan；www.bacterioscan.com)使用激光散射技术测量悬浮液中细菌的生长，以便将尿液样本筛选为阳性或阴性，周转时间为3小时。另一个宣传为正在制造的系统(216R AST)预计将相同的技术扩展到AST，但仍处于开发。
·oCelloScope系统(BioSense Solutions；www.biosensesolutions.dk/technology/)使用附着于96孔板中孔表面的细胞的时延成像，以进行快速生长测量。生长的变化可以用作AST的生物标志物。
·mariPOC和mariAST系统(Arcdia；www.arcdia.com/eng/)提供基于细菌生长的ID，所述细菌生长用乳胶微珠上的免疫测定结合反应测量，并使用双光子激发荧光测定法检测。对于在至少过夜温育后获得的阳性接种物，该系统在20分钟内产生ID并且在2小时内产生AST。
·fASTest系统(6)使用称为母机(Mother Machine)(7)的已知微流体芯片设计，使用显微术测量抗生素存在下的单细胞生长速率。用纯隔离群使用细菌培养物，AST的得到结果的时间可以小于30分钟。在此种方法中，在高度约束的微通道内捕获细菌。此种方法需要关于病原体ID的先验信息。
·快速dLAMP系统(8)使用数字环介导的等温扩增(dLAMP)来测量临床尿液样品中大肠杆菌的抗生素易感性。研究将方法称为“表型的”，但评估基于数字核酸定量。AST的得到结果的时间是从临床尿液样品起的小于30分钟。
存在其他商业表型方法。
已经提出了其他系统来加速基于基因型方法的AST，其能够检测抗性基因。存在大量的其他基因型方法。
测试精子存活力的其他长期已知和使用的方法基于形态、计数和运动性。一个例子是Green(美国专利公开2007/0298454)。King等人(Antibiotics:effect oncryopreserved-thawed human sperm motility in vitro,Fertility and Sterility,1997,第67卷,第6期,第1146-1151页)使用商业系统分析在48小时时段内在抗生素存在下温育的精子的运动性以评估其受精能力。
此外，大量文献论述了抗生素对运动性的影响。这些中大多数是群体水平研究，其已经证明了几种抗生素对几种细菌物种的影响(9-11)。这些方法通常基于经典的圆盘扩散运动性测定法，并且具有有限的辨别力(仅测量群体的向外移动；图16)。少数研究使用可单细胞方法来研究抗生素存在下的运动性，并主要关注抗生素暴露的生态学意义。Cheong等人(12)使用全息显微术成像单细胞运动，并提出了一种单一概念验证实验，其将大肠杆菌暴露于非常高浓度的庆大霉素(15mg/mL；比来自CLSI的易感断点浓度高大于4000倍的浓度)。在一项生态学研究中，Graff等人(13)将霍乱弧菌暴露于由海洋中的竞争细菌产生的抗生素(andrimid)梯度，并使用单细胞成像显示高抗生素浓度的回避应答。他们量化了选定的游动运动学。沿抗生素梯度进行不同抗生素浓度的比较。Hol等人(14)使用大肠杆菌的单细胞成像显示当细菌处于非常高的浓度(>5x109个细胞/ml；例如，在用于AST的金标准肉汤微量稀释测定法中，初始接种物浓度通常为5x105个CFU/ml；CFU＝菌落形成单位)时，细菌可以定殖抗生素(卡那霉素)景观。这些作者证明，这些高浓度的细菌向较高浓度的抗生素游动。
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其他实施方案也在所附权利要求书的范围内。

Claims (30)

1.一种方法，其包括：
表征至少一种个体微生物的运动性或至少一种个体微生物的运动性变化或两者，以及
使用表征的运动性或运动性的变化来检测所述至少一种个体微生物的存在或计数，或确定所述至少一种个体微生物的物种或菌株的身份，或确定所述至少一种个体微生物对一种或多种抗生素或其他抗微生物剂的易感性。
2.权利要求1的方法，其包括使用成像装置在连续时间时捕获所述至少一种个体微生物的两个或更多个数字图像。
3.权利要求2的方法，其包括通过计算机处理所述图像以确定所述至少一种个体微生物的轨迹数据。
4.权利要求1的方法，其包括通过计算机产生所述至少一种个体微生物或所述个体微生物的群体的运动性运动学数据。
5.权利要求4的方法，其包括通过计算机将产生的运动性运动学数据与一种或多种微生物的可用运动性运动学数据进行比较。
6.权利要求5的方法，其包括将由计算机产生的所述运动性运动学数据与一种或多种微生物的可用运动性运动学数据进行比较，以确定所述至少一种个体微生物的物种或菌株的身份，或确定所述至少一种个体微生物对所述一种或多种抗生素或其他抗微生物剂的易感性。
7.权利要求5的方法，其中从对含有所述至少一种个体微生物的样品的第一部分捕获的数字图像获得所述产生的运动性运动学数据，并且一种或多种微生物的所述可用运动性运动学数据包括从在不同时间时从所述样品的第一部分捕获的数字图像或在相同时间时或在不同时间时从所述样品的不同部分捕获的数字图像确定的运动性运动学数据。
8.权利要求1的方法，其中所述至少一种个体微生物经受两种不同的抗生素或其他抗微生物条件，包括以下中的至少一种：抗生素或其他抗微生物剂的存在和缺乏、两种或更多种不同抗生素或其他抗微生物剂的存在、不同浓度的抗生素或其他抗微生物剂的存在、或一种或多种抗生素或其他抗微生物剂的不同组合的存在。
9.权利要求1的方法，其中所述至少一种个体微生物在包含以下中的一种或两种或更多种的组合的样品中：身体样品、细菌培养物、流体、固体、碎片、非流体样品材料、磨碎食品、食品颗粒、环境样品、防腐剂、抗凝血剂、凝块活化剂、凝胶屏障、细菌生长稳定剂、抗糖酵解剂或添加剂。
10.权利要求1的方法，其包括通过计算机确定表征的运动性或运动性变化的统计学显著性。
11.权利要求5的方法，其中将所述一种或多种微生物的可用运动性运动学数据存储在作为数据库管理系统的一部分的运动性数据库中。
12.权利要求1的方法，其中将一种或多种微生物的物种或菌株的已知身份存储在作为数据库管理系统的一部分的数据库中。
13.权利要求1的方法，其包括通过计算机确定单独的或与至少一种其他特征组合的表征的运动性或运动性变化的统计学显著性。
14.权利要求13的方法，其中所述至少一种其他特征包括两种或更多种微生物的计数、形态特征或空间排列。
15.权利要求14的方法，其中所述形态特征包括以下中的一种或两种或更多种的组合：形状、长宽比、凸度、面积、大小、尺寸、长轴方向、偏离球形形状或强度分布，并且所述空间排列包括以下中的一种或两种或更多种的组合：分裂的微生物的空间排列、个体微生物的簇的空间排列、两种或更多种微生物相对于彼此的位置、它们之间的一个或多个距离、微生物的特定簇或链的形成。
16.权利要求1的方法，其中所述至少一种个体微生物包含以下中的一种或两种或更多种的组合：细菌病原体、其他细菌、其他病原体、真菌、古细菌、原生生物、浮游生物或真核细胞。
17.权利要求1的方法，其中所述至少一种个体微生物在样品中并且对所述样品中的一种或多种抗生素或其他抗微生物剂是易感的或对所述样品中的一种或多种抗生素或其他抗微生物剂有抗性。
18.权利要求1的方法，其包括通过计算机确定和存储关于样品中个体微生物的计数或样品中个体微生物的形态特征或样品中两种或更多种个体微生物的空间排列的信息。
19.权利要求3的方法，其中处理所述图像以确定所述至少一种个体微生物的轨迹数据包括：(a)基于颜色、像素强度梯度、形状、长宽比、凸度、面积、大小阈值、水平和垂直位置、大小、强度、长轴方向、偏离球形形状或强度分布中的至少一种来定位图像中的微生物，以及(b)基于位置、位置接近性、方向、速度、加速度或搜索半径中的至少一种，通过连接位于两个或更多个图像中的相同微生物来构建轨迹数据。
20.权利要求4的方法，其中对所述至少一种个体微生物产生运动性运动学数据包括通过计算机确定以下中的至少一种：轨迹、轨迹形状、速度、加速度、均方位移、游动方向、转动速率、转动角度、转动角度的时间顺序、扩散率、净毛位移比、曲率、运动细胞的浓度、或运动细胞与非运动细胞的比率。
21.权利要求2的方法，其包括：
使用所述成像装置在连续时间时捕获含有所述至少一种个体微生物的样品的一个、两个或更多个数字图像，该样品含有一种或多种抗生素或其他抗微生物剂，以及
使用所述成像装置在所述连续时间前的时间时捕获所述样品中个体微生物的一个、两个或更多个数字图像，先前时间时的样品含有不同比例的抗生素或其他抗微生物剂或先前时间时的样品不含所述抗生素或其他抗微生物剂。
22.权利要求2的方法，其包括：
使用所述成像装置同时捕获两个或更多个样品的两个或更多个数字图像，所述样品中的至少一个含有一种或多种抗生素或其他抗微生物剂，以及
使用所述成像装置同时捕获两个或更多个样品的两个或更多个数字图像，所述样品中的至少一个含有不同比例的抗生素或其他抗微生物剂或所述样品中的至少一个不含所述抗生素或其他抗微生物剂。
23.权利要求1的方法，其包括在预筛选步骤中确定活动微生物的存在、缺乏或计数。
24.权利要求23的方法，其包括改变至少一种环境条件来刺激所述至少一种个体微生物的运动性，以有利于检测所述微生物，鉴定所述微生物的物种或菌株，或确定所述微生物的抗微生物剂易感性。
25.权利要求2的方法，其包括通过图像分析从图像中除去非移动实体，或者在成像前物理地从所述样品除去非移动实体。
26.权利要求4的方法，其中将对应于产生的运动性运动学数据的所述至少一种个体微生物在第一时间时经受第一抗生素或其他抗微生物剂，并且其中所述可用运动性运动学数据与第二时间时经受所述第一抗生素或抗微生物剂或第二时间时经受不同抗生素或其它抗微生物剂的个体微生物相关联。
27.权利要求4的方法，其中将未知物种的至少一种个体微生物的产生的运动性运动学数据与已知物种的可用运动性运动学数据相关联，以确定所述至少一种个体微生物的物种或菌株的身份。
28.权利要求1的方法，其中将含有所述至少一种个体微生物的样品的部分加载到一个或多个孔中，并且所述样品的各部分中无一或一个或多个经受抗生素或其他抗微生物剂。
29.权利要求1的方法，其中将含有所述至少一种微生物的样品的两个部分加载到两个不同的孔中并经受两种不同的抗生素或抗微生物条件。
30.权利要求1的方法，其中在不需要确定所述至少一种个体微生物的物种或菌株的身份的情况下确定所述至少一种个体微生物的易感性。
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