JP7466598B2 - 微生物の運動性運動学の分析および使用 - Google Patents

Description

本出願は、参照によりその内容全体が組み込まれている、２０１７年２月２日に出願した米国特許出願第６２／４５３，６０５号の出願日の優先権の利益を受ける権利を有する。

本明細書は、微生物の運動性運動学の分析および使用に関する。

運動性運動学は、例えば、精子の研究に関連して分析され、使用されてきた。例えば、Ｇｒｅｅｎ（米国特許公開第２００７／０２９８４５４号）は、試料中の精子を追跡し、精子が正常な形態と運動性を示すかどうかを決定する目的で、運動性（速度および軌跡など）の特性を得ることを記載した。

Ｋｉｎｇら（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ：Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ‐ｔｈａｗｅｄ ｈｕｍａｎ ｓｐｅｒｍ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ、Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ、１９９７、６７巻、６号、１１４６～１１５１頁）は、精子の受精能力を評価するために、市販のシステムを使用して、抗生物質の存在下で４８時間にわたってインキュベートされた精子の運動性を分析した。

細菌の存在と数の検出、同定（ＩＤ）、および抗生物質感受性試験（ＡＳＴ）は、細菌感染症に関する治療法の最良の選択肢を決定するために使用される。

一般的に、一態様では、少なくとも１つの個体微生物の運動性もしくは少なくとも１つの個体微生物の運動性の変化、または両者は特徴付けられる。特徴付けられた運動性または運動性の変化は、少なくとも１つの個体微生物の存在もしくは数を検出するため、または少なくとも１つの個体微生物の種もしくは株のアイデンティティーを決定するため、または１つもしくは複数の抗生物質もしくは他の抗菌剤に対する少なくとも１つの個体微生物の感受性を決定するために使用される。

実施態様は、以下の特徴の１つ、または２つ以上の組合せを含んでもよい。撮像装置は、少なくとも１つの個体微生物の２つ以上のデジタル画像を連続する時点に取得するために使用される。少なくとも１つの個体微生物の軌跡データを決定するために、画像はコンピュータによって処理される。少なくとも１つの個体微生物または個体微生物の集団について、運動性運動学データはコンピュータによって処理される。生成された運動性運動学データは、１つまたは複数の微生物の利用可能な運動性運動学データとコンピュータによって比較される。少なくとも１つの個体微生物の種もしくは株のアイデンティティーを決定するため、または１つもしくは複数の抗生物質もしくは他の抗菌剤に対する少なくとも１つの個体微生物の感受性を決定するため、コンピュータによって生成された運動性運動学データは、１つまたは複数の微生物の利用可能な運動性運動学データと比較される。生成された運動性運動学データは、少なくとも１つの個体微生物を含む試料の第１の部分について取得されたデジタル画像から得られ、１つまたは複数の微生物の利用可能な運動性運動学データは、異なる時点に試料の第１の部分から、または同時にもしくは異なる時点に試料の異なる部分から取得されたデジタル画像から決定された運動性運動学データを含む。少なくとも１つの個体微生物は、抗生物質もしくは他の抗菌剤の存在および非存在、２つ以上の異なる抗生物質もしくは他の抗菌剤の存在、異なる濃度の抗生物質もしくは他の抗菌剤の存在、または１つもしくは複数の抗生物質もしくは他の抗菌剤の異なる組合せの存在の少なくとも１つを含む、２つの異なる抗生物質または他の抗菌剤条件にさらされる。少なくとも１つの個体微生物は、身体試料、細菌培養、流体、固形物、破片、非流体試料材料、破砕した食品、食品粒子、環境試料、防腐剤、抗凝固剤、血餅活性化因子、ゲルバリア、細菌増殖安定剤、抗解糖剤、または添加物の１つ、または２つ以上の組合せを含む試料中に存在する。特徴付けられた運動性または運動性の変化の統計的有意性はコンピュータによって決定される。１つまたは複数の微生物の利用可能な運動性運動学データはデータベース管理システムの一部である運動性データベースに保存される。１つまたは複数の微生物の種または株の既知のアイデンティティーはデータベース管理システムの一部であるデータベースに保存される。特徴付けられた運動性または運動性の変化の、単独または少なくとも１つの他の特徴と組み合わせた場合の統計的有意性は、コンピュータ処理によって決定される。少なくとも１つの他の特徴は、数、形態的特徴、または２つ以上の微生物の空間的配置を含む。形態的特徴は、形状、アスペクト比、凸性、面積、サイズ、寸法、長軸方向、球面形状からの逸脱、または強度分布の１つ、または２つ以上の組合せを含む。空間的配置は、微生物の空間的配置、すなわち、分裂、個体微生物のクラスターの空間的配置、２つ以上の微生物の互いに対する位置、それらの１つもしくは複数の間の距離、特異的なクラスターの形成または微生物の鎖を含む。少なくとも１つの個体微生物は、細菌性病原体、他の細菌、他の病原体、菌類、古細菌、原生生物、プランクトン、または真核細胞の１つ、もしくは２つ以上の組合せを含む。少なくとも１つの個体微生物は試料中に存在し、試料中の１つもしくは複数の抗生物質もしくは他の抗菌剤に対して感受性であり、または試料中の１つもしくは複数の抗生物質もしくは他の抗菌剤に対して耐性である。コンピュータは、試料中の個体微生物の数、または試料中の個体微生物の形態的特徴、または試料中の２つ以上の個体微生物の空間的配置についての情報を決定し保存する。少なくとも１つの個体微生物の軌跡データを決定するための画像処理は、（ａ）色、画素強度勾配、形状、アスペクト比、凸性、面積、サイズの閾値、水平位置と垂直位置、サイズ、強度、長軸の方向、球面形状からの逸脱、または強度の分布のうちの少なくとも１つに基づいて、画像内の微生物の位置を特定するステップ、および（ｂ）位置、位置の近さ、方向、速度、加速度、または探索半径のうちの少なくとも１つに基づいて、２つ以上の画像内に位置する同一微生物を結びつけることによって軌跡データを構築するステップを含む。少なくとも１つの個体微生物についての運動性運動学データの生成は、コンピュータによって、軌跡、軌跡の形状、速度、加速度、平均二乗変位、遊泳方向、旋回速度、旋回角度、旋回角度の時系列、拡散度、ネット対グロス変位比、曲率、運動性細胞の濃度、または運動性対非運動性細胞の比のうちの少なくとも１つを決定するステップを含む。少なくとも１つの個体微生物を含有する試料の１つ、２つ、またはそれ以上のデジタル画像を連続する時点に取得するために撮像装置は使用され、試料は、１つまたは複数の抗生物質または他の抗菌剤を含有し、および試料中の個体微生物の１つ、２つ、またはそれ以上のデジタル画像を連続する時点より前の時点で取得するために撮像装置は使用され、前の時点の試料は、異なる割合の抗菌剤を含有し、または前の時点の試料は、抗菌剤を含まない。少なくとも１つの個体微生物を含有する２つ以上の試料の１つ、２つ、またはそれ以上のデジタル画像を同時に取得するために撮像装置は使用され、試料の少なくとも１つの試料は、１つまたは複数の抗生物質または他の抗菌剤を含有し、および少なくとも１つの個体微生物を含有する２つ以上の試料の１つ、２つ、またはそれ以上のデジタル画像を同時に取得するために撮像装置は使用され、少なくとも１つの試料は、異なる割合の抗生物質もしくは他の抗菌剤を含有し、または試料の少なくとも１つの試料は、抗生物質もしくは他の抗菌剤を含まない。運動性微生物の存在、非存在、または数は、プレスクリーニングステップにおいて決定される。微生物の検出、微生物の種もしくは株の同定、または微生物の抗菌剤感受性の定量に有利に働くように、少なくとも１つの個体微生物の運動性を促進するように少なくとも１つの環境条件を変化させる。画像分析によって画像からまたは撮像前に物理的に試料から不動物は除去される。生成された運動性運動学データに対応する少なくとも１つの個体微生物は、第１の時点で第１の抗生物質または他の抗菌剤にさらされ、および利用可能な運動性運動学データは、第２の時点で第１の抗生物質もしくは抗菌剤に、または第２の時点で異なる抗生物質もしくは他の抗菌剤にさらされる個体微生物に関連付けられる。生成された運動性運動学データに対応する少なくとも１つの個体微生物は、少なくとも１つの個体微生物の種を含み、および利用可能な運動性運動学データは種と関連付けられる。少なくとも１つの個体微生物を含有する試料の一部は１つまたは複数のウェルにロードされ、試料のいずれの部分も抗生物質もしくは他の抗菌剤にさらされないか、または試料の一部もしくは複数の部分が抗生物質もしくは他の抗菌剤にさらされる。少なくとも１つの個体微生物を含有する試料の２つの部分は２つの異なるウェルにロードされ、２つの異なる抗生物質または抗菌剤条件にさらされる。少なくとも１つの個体微生物の感受性は、決定されるべき少なくとも１つの個体微生物の種または株のアイデンティティーを必要とせずに決定される。

一般的に、一態様では、ウェル（後述するように、それによって試料を含むことができる任意の装置を意味する）は、カートリッジの一部であり得る。実施態様は、以下の特徴の１つ、または２つ以上の組合せを含んでもよい。試料の１つまたは複数の部分は、カートリッジの１つまたは複数のウェルへロードされる。１つもしくは複数の抗生物質または他の抗菌剤は、０、１、または２つ以上のウェル中の試料に添加される。異なる抗生物質または他の抗菌剤は、同一または異なるウェル中の試料に添加され得る。異なる濃度の１つもしくは複数の抗生物質または他の抗菌剤は、同一または異なるウェル中の試料に添加され得る。少なくとも１つのウェルはベースプレートから突き出ている。少なくとも１つのウェルはベースプレートにくぼんでいる。各ウェルは露出した開口部を持つことができる。各ウェルは露出した開口部を持つことができない。カバーはウェルの露出した開口部を密封する。各ウェルもしくはカバーまたはその両方は、未処理の表面、微生物の付着に対して耐性があるように処理された表面、または、微生物の付着を支持するように処理された表面、微生物の付着を促進する材料、または微生物の付着を妨げる材料のうちの少なくとも１つによって特徴付けられる。

カバーは固体材料を含む。固体材料はガラスを含む。固体材料はプラスチックを含む。固体材料は金属を含む。カバーはフィルムを含む。フィルムは接着フィルムを含む。フィルムは非接着フィルムを含む。カバーは１つまたは複数の開口部を持つ。カバーは開口部を持たない。カバーは固体材料を含む。カバーは柔軟性がある。カバーは剛性である。カバーはガス透過性である。カバーはガス非透過性である。カバーはフラットである。カバーは模様がある。カバーは膜を含む。カバーは再密封可能である。

これらおよび他の態様、特徴、実施態様、および長所は、方法、装置、システム、構成要素、プログラム製品、業務方法、機能を実行するための手段またはステップ、および他の方法として表される。

これらおよび他の態様、特徴、実施態様、ならびに長所は、以下の明細書および特許請求の範囲から明らかになる。

ブロック図である。 フロー図である。 フロー図である。 ブロック図である。 ブロック図である。 ブロック図である。 ブロック図である。 ブロック図である。 画像の図である。 画像の図である。 グラフの図である。 グラフの図である。 グラフの図である。 グラフの図である。 グラフの図である。 画像の図である。 グラフの図である。 グラフの図である。 グラフの図である。 カートリッジの概略側面図である。 画像の図である。

迅速な微生物（例えば細菌）の検出（存在、非存在、または数）、ＩＤ（すなわち同定）、およびＡＳＴ（すなわち抗生物質または他の抗菌剤感受性試験）（および他の用途）に運動性運動学情報（および対応する技術）を使用することは、特に、多くの微生物にとって、病原体の場合の診断結果のように、結果までの時間がはるかに短くなる可能性があることを、本発明者らは提案する。

本発明者らは、「微生物」という用語を、例えば、任意の微生物、または顕微鏡的もしくは超顕微鏡的サイズの他の生物を含むように幅広く使用する。微生物は、細菌、古細菌、菌類、原生生物、真核生物および他の微生物を含む。

本発明者らは、「抗菌剤」という用語を、例えば、細菌、古細菌、菌類、原生生物、真核生物および、特に病原性微生物を含む他の微生物、のような１つまたは複数の微生物の生存率または増殖または運動性を破壊するまたは阻害するまたは損なうまたは影響を及ぼすことができる、任意の形態、相での、任意の材料、要素、構成要素、物質、成分、または他の物体を含むように幅広く使用する。本発明者らは、「抗生物質」という単語を、その広範の意味で使用されている「抗菌剤」という単語と同じ意味で使用することがある。本発明者らは、微生物が抗菌剤に対して「感受性」である、と言うことがある。本発明者らは、微生物が抗菌剤に対して「耐性」であると言うことがある。特に、抗生物質、抗真菌剤、抗細菌剤、防腐剤、消毒剤、および洗浄剤は抗菌剤であり、抗菌剤であると考えてもよい。

本発明者らは、「ＡＳＴ」という用語を、例えば、抗生物質感受性試験、または任意の種類の抗菌剤に対する微生物の感受性の任意の試験を含むように幅広く使用する。
微生物、例えば細菌のＡＳＴの最新の方法は、長い試験時間を必要とする。次に、多くの方法が基づいている、細菌の増殖、および抗生物質への曝露によって引き起こされるこの増殖の破壊または減少という測定基準に、このことは関連している。微生物世代は平均して３０分程度持続し、正確な読み出しを得るために数世代が必要となる可能性があるので、この測定基準では迅速な結果は達成できない。

特に外来診療所における病原体同定（ＩＤ）は、ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型）質量分析の使用により著しく促進され、試験結果の報告に数分しかかからない。しかし、病原体の単離と時間のかかる培養濃縮ステップを含む試料調製は、実際のＩＤ試験が行われる前に少なくとも１日かかる。

本発明者らは、「個体微生物」という用語を、種または株の単一の個体（例えば細胞）、例えば単一のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ個体を表すために使用する。微生物は、とりわけ細菌および他の病原体を含む。同様に、本発明者らは、「個体細菌」または「細菌」および「個体病原体」および「個体微生物」という用語を、種または株の単一の個体を表すために使用する。本発明者らは、「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」または「病原体（ｐａｔｈｏｇｅｎ）」という用語を、種または株を表すために、「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）」または「病原体（ｐａｔｈｏｇｅｎｓ）」または「細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）」という用語を、１つまたは複数の種または株を表すために一般的に使用する。本発明者らは、「種」という用語を、例えば、「株」を幅広く含むように使用することがある。病原体および細菌は、微生物のタイプであると考えられている。

本発明者らは、「運動性」という用語を、例えば、個体微生物の運動または個体微生物の群の運動のような、病原体または他の微生物の任意の自発運動を含むように幅広く使用する。運動性は、鞭毛による遊泳運動および遊走運動；繊毛、線毛および他の細胞付属器官による収縮運動および滑走運動；根本的な運動機構がまだ知られていない運動；および他の運動を含む。

本発明者らは、「運動性運動学」という用語を、流体または他の試料のような培地内または表面上または表面近くの微生物または微生物群の、運動および動作戦略の任意の特徴または特性を幅広く含むように使用する。そのような運動および動作戦略は、例えば、遊泳、遊走、収縮、または滑走を含む。本発明者らは、「遊泳運動学」を、任意の種類の運動性運動学の好例として、またその簡潔な表現として表す場合がある。遊泳運動学は、例えば、軌跡、軌跡の形状、遊泳方向、運動性細胞の濃度、速度、加速度、平均二乗変位、旋回速度、旋回角度、異なる旋回角度の時系列、拡散度、ネット対グロス変位比、曲率、変動、運動性対非運動性細菌の比、およびこれらから、または一般的に特に個体微生物の軌跡から導き出すことができる任意の量を含む。微生物または微生物群の運動および動作は、ブラウン運動、すなわち熱的攪拌によって引き起こされる流体中の顕微鏡的物体のランダムな動き、によって実質的に影響を受ける可能性がある。遊泳微生物に対するブラウン運動の一般的に認識されている影響は、直進経路からの遊泳軌跡のランダムな逸脱である。逸脱は、微生物と周囲の水分子との衝突によって引き起こされる。

鞭毛または繊毛のような付属器官によって媒介されることが多い運動性は、特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅおよび他のＶｉｂｒｉｏ株、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉおよび他のＢｏｒｒｅｌｉａ株、いくつかのＢａｃｉｌｌｕｓ株、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ株、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ株、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ株、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ株、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ株、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａを含む多くの種類の細菌、特に多くの病原体が持つ高度な行動である。この分析に含めることができる病原体は、ヒト病原体（食品媒介病原体も含む）に限定されず、他の生物、特に動物や植物の病原体も含む。運動性は、特に収縮、滑走、および遊走運動を含む表面上の運動性と同様に、表面に隣接する流体中の運動性を含む、流体中の遊泳運動性を含む。運動性に必要とされる高度な細胞協調、ならびに微生物の生理学的状態および物理的特性（例えば、サイズおよび形状）の両方へのその依存性のために、（ｉ）運動性は、細菌（または他の微生物）の各々の種に特徴的であり、および（ｉｉ）抗生物質および他の化学物質や物質へ曝露されると運動性が変化する。

本明細書に記載する運動性技術のいくつかの実施態様は、以下のうちの１つ、または２つ以上の組合せに基づいている：（１）単一細胞運動性運動学、例えば、微生物の遊泳運動学に関する情報の生成、分析、および維持、（２）個体微生物の存在、非存在、または数を検出するための運動性の定量化、（３）微生物の同定のための運動性運動学の定量化、および（４）抗生物質または他の抗菌剤に対する感受性のバイオマーカーとしての微生物の運動性の変化の検出。

例えば、異なる細菌には異なる遊泳運動学がある。例えば、腸内細菌Ｅ．ｃｏｌｉはいわゆる、前進‐および‐回転様式で泳ぎ、この様式では、ほぼ直線の、約１秒の長さの「前進」が、方向がほぼランダムな方向転換（「回転」）によって中断されている。一方、例えばＶｉｂｒｉｏｓを含む多くの種類の海洋細菌は、前進‐反転‐および‐フリック様式で泳ぎ、順方向走行の後に１８０度の反転、その後の１８０度の反転、そしてその後のランダムな方向転換（「フリック」）の順で泳ぐ。遊泳運動学はまた、粘度、化学組成、流体または微生物が動いている他の材料の栄養素含有量および温度、または微生物が動いているところの上または近くにある表面の特性を含む流体の種類の関数でもあり得る。

いくつかの種の細菌については、いくつかの運動性運動学および個体微生物の他の特有の特徴が正確に特徴付けられ定量化されている。その他については、個体微生物の運動性様式および運動学ならびに特有の特徴は、個体微生物の分解能での撮像方法によって特徴付けおよび定量化することができる。本明細書に記載する特徴付けと定量化のための技術は、運動性運動学の運動性データベース、およびデータベース管理システムの一部である個体微生物の特有の特徴の形態データベースの作成、維持、および使用を含み、各タイプの微生物は、軌跡、軌跡の形状、遊泳方向、平均二乗変位、運動性細胞の濃度、速度、加速度、旋回速度、旋回角度、異なる旋回角度の時系列、拡散度、ネット対グロス変位比、曲率、変動、運動性対非運動性細菌の比、およびこれらから、または一般的に特に個体微生物の軌跡から導き出すことができる任意の量を含む、その特徴的な運動性運動学の特性と関連している。本明細書に記載する特徴付けと定量化のための技術は、データベース管理システムの一部である個体微生物の特有の特徴の形態データベースの作成、維持、および使用を含み、各タイプの微生物は、形状、アスペクト比、凸性、面積、サイズ、長軸方向、球面形状からの逸脱、強度、強度分布、または同一試料中の他の個体微生物に対する空間的配置の１つまたは複数を含むその特有の特徴の特性と関連している。個体微生物のさらなる特有の特徴は、蛍光、自己蛍光、蛍光プローブの発現、マイクロ粒子およびナノ粒子、抗体、量子ドット、ならびに蛍光性または非蛍光性であり得る他の粒子のような外部物質への結合を含む。

本発明者らは、「形態」という用語を、例えば、微生物の形態もしくは構造の任意の態様、またはその任意の部分、または他の個体微生物に対する個体微生物の空間的配置を含むように幅広く使用する。

画像から得られた運動性運動学特性を、データベースに保存されている既知の微生物の既知の運動学特性と比較することによって、（存在するならば）どの微生物が試料中に存在するか、迅速に（例えば数分で）同定するために、したがって、例えば体液の試料中を移動する未知の微生物の運動性の撮像法を、運動性データベースに保存されたデータと併せて使用することができる。さらに、抗生物質または他の抗菌剤に対する微生物の感受性は、ある時点またはある試料中の微生物の運動性運動学特性を、別の時点または別の組の画像から得られる別の試料中の微生物の運動性運動学的特性と比較することによって迅速に決定できる。例えば、他の試料は、同一の流体の試料であるが、異なる濃度の抗生物質もしくは他の抗菌剤を添加していない、または添加した試料、または異なる状態もしくは条件または異なる時点の同一の流体の試料であり得る。

画像から得られた特有の特徴を、形態データベースに保存されている既知の微生物の既知の特有の特徴と比較することによって、（存在するならば）どの微生物が試料中に存在するか、迅速に（例えば数分で）同定するために、例えば体液の試料中の未知の微生物の個々の細胞（運動性特性の決定の有無にかかわらず）の撮像法を、形態データベースに保存されたデータと併せて使用することができる。さらに、抗生物質または他の抗菌剤に対する微生物の感受性は、ある時点またはある試料中の微生物の特有の特徴を、別の時点または別の組の画像から得られる別の試料中の微生物の特有の特徴と比較することによって迅速に決定できる。

一部の例では、抗生物質または他の化学物質もしくは物質に対する微生物の感受性は、ある時点またはある試料中の微生物のブラウン運動を、別の時点または別の組の画像から得られる別の試料中の微生物のブラウン運動と比較することによって迅速に決定できる。例えば、他の試料は、同一の流体の試料であるが、異なる濃度の抗生物質もしくは他の抗菌剤を添加していない、または添加した試料、または異なる状態もしくは条件または異なる時点の同一の流体の試料であり得る。運動性運動学の定量的特性（またはそれに関する定性的情報）を得るための運動性の撮像法および運動性画像データの処理の両方が非常に迅速であり、微生物数が少ない試料（例えば、直接患者試料）でも実施することができるので、この方法は、伝統的な増殖に基づく方法の根本的な限界を克服するのに適しており、したがって病原体の存在／非存在、数、ＩＤおよびＡＳＴおよび他の用途に関してはるかに迅速な結果をもたらす。

本発明者らの運動技術では、試料内を移動するときに１つもしくは複数の個体細菌または個体微生物を追跡し（例として細菌という用語を使って任意の微生物を幅広く表すことがある）、それらの運動性運動学を特徴付けて測定する。手短に言うと、本発明者らの運動性技術のいくつかの実施態様は、試料、場合によっては細菌懸濁液の顕微鏡ビデオを取得し、処理することを含む。ある場合には、細菌懸濁液は、体液、他の流体、細菌培養物、または微生物が添加された流体、または固形食品もしくは他の非流体材料、例えば破砕した食品、食品粒子、もしくは環境試料、もしくは創傷試料を有する試料を含有する流体であり得る。ある場合には、細菌試料は流体である必要はなく、または流体中に懸濁する必要はないが、固体または他の非流体材料であり得る。微生物（例えば、細菌）同定（ＩＤ）の場合、ある用途では、未知のサンプルだけが画像化され、得られた情報が運動性データベースおよび形態データベース内の情報との比較に使用される。微生物（例えば、細菌）ＩＤの場合、ある用途では、異なる環境条件（例えば、温度、ｐＨ）下での少なくとも２つの試料についての運動性運動学に関する情報が比較される。形態データベースおよび運動性データベースは、場合によっては、同じ１つのデータベースであってもよく、「データベース」という単純な用語を使用して、どちらか一方または組み合わせたデータベースを表す。形態データベースおよび運動性データベース内の情報は、試験条件（例えば、温度、ｐＨ）に関連するパラメータを含む他のパラメータによって決まる可能性がある。

本発明者らは、例えば、微生物が運動性を示す任意の相の任意の培地または材料を含むように、「流体」という用語を幅広く使用することがある。
一般的に、ＡＳＴについては、抗生物質を添加したものと添加していないものの少なくとも２つの試料についての運動性運動学情報が使用される。しかし、一部の実施態様では、ＡＳＴについては、抗生物質が添加されている１つの試料のみについての運動性運動学情報が、同一試料についての運動性運動学を２回以上比較することによって使用される。（１つまたは複数の抗生物質または他の抗菌剤に対する微生物の任意の感受性の分析を含むために、本発明者らは、「抗生物質感受性試験」という用語またはＡＳＴを幅広く使用することがある）。

一部の例では、１回の試験で、ほぼ同時に、１つまたは複数の（例えば、多くの）抗生物質条件（例えば、抗生物質の種類、抗生物質の濃度、抗生物質曝露時間、抗生物質の組合せ、または１つもしくは複数の酵素阻害剤（例えば、β‐ラクタマーゼ阻害剤）のような抗生物質を補う追加の物質）に対する微生物の感受性を試験するために、細菌懸濁液は、試料を保持するためのカートリッジまたは他の装置、特にハイスループットビデオ顕微鏡用に設計された装置、の２つ以上（例えば多数）のウェルにロードされる。この目的に向けて、対物レンズ、カメラならびに任意選択的に自動化ステージおよび温度コントロールシステムを装備した顕微鏡を使用することができる。カメラは各ウェル中の細菌懸濁液の一連の画像を取得する。画像シーケンスは、細菌の運動の連続的な動画を取得する速度で取得することができる（例えば、毎秒１５フレーム、一般的には収縮運動より少ない）。本発明者らは、フレームキャプチャレートに関係なく、画像シーケンスをビデオと呼ぶ。

一部の実施態様では、画像分析ソフトウェア（ＡＳＫ‐Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｗｉｍｍｉｎｇ Ｋｉｎｅｍａｔｉｃｓ‐ソフトウェアと呼ばれるものの一部）は画像シーケンスを処理し、個体微生物の軌跡を計算リソースに応じて一般的にほぼリアルタイムに近い速度で、またはより低速で決定する。「ほぼリアルタイム」とは、例えば、ビデオが取得されるのとほぼ同時に、またはわずか数秒の遅延で、ということを意味する。軌跡から、ソフトウェアは、運動性運動学の定量的測定基準、例えば、速度、加速度、旋回速度、旋回角度、平均二乗変位、運動性細胞の濃度、異なる旋回角度の時系列、拡散度、ネット対グロス変位比、曲率、変動、運動性対非運動性細菌の比、およびこれらから、または一般的に個体微生物の軌跡から導き出すことができる任意の量を含む遊泳運動学を抽出する。ＡＳＫソフトウェアは、次いで、次のうちの１つまたは２つ以上のアクティビティ、および場合によっては他のアクティビティを実行する（ｉ）遊泳運動学の抽出された測定基準を使用して、個体微生物の存在、非存在または数を検出する、または（ｉｉ）遊泳運動学の抽出された測定基準およびデータベース管理システムの運動性データベースに保存されている遊泳運動学の既知の測定基準を使用して、細菌（または他の微生物）を同定する、または（ｉｉｉ）特有の特徴の抽出された測定基準およびデータベース管理システムの形態データベースに保存された特有の特徴の既知の測定基準を使用して、細菌（または他の微生物）を同定する、または（ｉｖ）例えば、異なる抗生物質または他の抗菌剤条件（抗生物質の完全な非存在を含む）にさらされた試料中の微生物の遊泳運動学（ブラウン運動の影響を含む）の違いに基づいて、試験した各抗生物質または他の抗菌剤条件に対する細菌の感受性を決定する。遊泳運動学情報を、他の用途にも利用できる。

本発明者らの技術は、検出、ＩＤ、およびＡＳＴ、ならびに他の用途のバイオマーカーとして運動性運動学の分析に焦点を当てているので、本発明者らの運動性技術は、検出（存在、非存在、数）、同定、および動くことができる任意の流体、例えば液体懸濁液中に存在するまたは調製された任意の運動性細菌（または他の微生物）の抗生物質感受性を決定するために広く適用できる。臨床環境および食品業界、農業および医薬品業界における運動性細菌の例は、これらに限定されないが、特に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅおよび他のＶｉｂｒｉｏ株、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉおよび他のＢｏｒｒｅｌｉａ株、いくつかのＢａｃｉｌｌｕｓ株、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ株、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ株、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ株、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ株、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ株、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａが挙げられる。本発明の運動性技術は、表面近くを含む流体中で鞭毛によって運動する細菌、ならびに繊毛および線毛のような他の付属器官によって表面を運動する細菌（例えば、収縮、滑走、および遊走運動）に適用できる。（したがって、流体中の運動性について言及する場合、本発明は表面近くまたは表面上の運動性も言及する。）
本発明者らの運動性技術はまた、異なるクラスに属する抗生物質（例えば、β‐ラクタムまたは非β‐ラクタム）を含む任意の抗生物質または他の抗菌剤、または微生物の増殖、生存率もしくは運動性に影響を及ぼす形で微生物が感受性であるより幅広い任意の化学物質もしくは他の物質、に対する微生物の感受性を試験するために広く適用でき、それらには、アミカシン、アモキシリン‐クラブラネート、アンピシリン、アンピシリン‐スルバクタム、アジスロマイシン、アズロシリン、アズトレオナム、アズトレオナム‐アビバクタム、ベシフロキサシンビアペネム、カルベニシリン、セファクロル、セファマンドール、セファゾリン、セフジニル、セフジトレン、セフェピム、セフェタメット、セフィキシム、セフメタゾール、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフォテタン、セフォキシチン、セフポドキシム、セフプロジル、セフタロリン、セフタロリン‐アビバクタム、セフタジジム、セフタジジム‐アビバクタム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトビプロール、セフトロザン‐タゾバクタム、セフトリアキソン、セフロキシム、セファロチン、クロラムフェニコール、シノキサシン、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリナフロキサシン、クリンダマイシンｆ、コリスチン、ダルババンシン、ダプトマイシン、ジリスロマイシン、ドリペネム、ドキシサイクリン、エノキサシン、エルタペネム、エリスロマイシン、ファロペネム、フィダキソマイシン、フィナフロキサシン、フレロキサシン、ホスホマイシン、フシジン酸、ガレノキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、ゲンタマイシンｋ、グレパフロキサシン、イクラプリム、イミペネム、カナマイシン、レボフロキサシン、リネゾリド、リノプリスチン‐フロプリスチン、ロメフロキサシン、ロラカルベフ、メシリナム、メロペネム、メチシリン、メズロシリン、ミノサイクリン、モキサラクタム、モキシフロキサシン、ナフシリン、ナリジクス酸、ネチルマイシン、ニトロフラントイン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オマダサイクリン、オリタバンシン、オキサシリン、ペニシリン、ピペラシリン、ピペラシリン‐タゾバクタム、プラゾマイシン、ポリミキシンＢ、キヌプリスチン‐ダルホプリスチン、ラズペネム、リファンピン、ソリスロマイシン、スパルフロキサシン、スルフィソキサゾール、スロペネム、テジゾリド、テイコプラニン、テラバンシン、テリスロマイシン、テトラサイクリン、チカルシリン、チカルシリン‐クラブラネート、チゲサイクリン、トブラマイシン、トリメトプリム、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、トロスペクトマイシン、トロバフロキサシン、ウリフロキサシン（プルリフロキサシン）、バンコマイシン、が含まれるがこれに限定されるものではない。

本発明者らの運動性技術は、抗生物質として分類されていないが、微生物に対して抗生物質の効果に類似した効果を含め、効果があることが知られているかまたは仮定されている物質を含む他の物質に対する微生物の感受性を試験するために広く適用できる。いくつかの例は防腐剤である。いくつかの例は洗浄剤である。１つの例は、クランベリージュースのような天然物である。本発明者らの運動性技術は、微生物の運動性に対する任意の物質の影響を試験するために広く適用できる。本発明者らの運動性技術はまた、酵素阻害剤（例えば、β‐ラクタマーゼ阻害剤）を含む２つ以上の抗生物質または他の物質の組合せに、これらに限定されないが、流体のタイプ、流体の特性（例えば、粘度）、化学物質（例えば、栄養素サプリメント、トキシン）、および温度を含む運動性に影響を及ぼす他の因子とおそらく組み合わせて適用できる。本発明者らはこれらの用語を最も広い意味で使用しているため、これらの例はすべて「抗菌剤」または「抗生物質」という用語の範囲内にある。

抗生物質に曝露されると、複数の機構が細菌の遊泳運動学の変化を引き起こす可能性がある。一つの機構は遊泳機構の変化である。例えば、細胞壁生合成を阻害するβ‐ラクタム系抗生物質（例えば、ペニシリン、ペネムまたはセフェム類）は細胞形状の変化を引き起こし（例えば図２１参照）、それは次に細胞がどのように泳ぐかに直接影響を及ぼす。第２の機構は生化学的である。非β‐ラクタム系抗生物質（例えば、アミノグリコシド、キノロンまたはテトラサイクリン類）はタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡの合成を阻害し、これは病原体の生理的状態に悪影響を与え、多くの場合、運動性の決定要因である。

本発明者らの運動性技術のいくつかの実施態様は、以下に記載された要素、装置、技術、およびそれらの組合せを使用することができる。多岐にわたる他の実施態様もまた可能である。

図１に示すように、より具体的には図２０に示すように、一部の実施態様では、複数（２～１０００、例えば１００）のウェル１２を有するカートリッジ１０を用いて、撮像のためにウェル内に細菌懸濁液（または「試料」）１４を入れる。場合によっては、ウェルは約４ｍｍ×４ｍｍ×２ｍｍであり（しかし、寸法は異なる場合がある）、そのため、多くのウェルが小さなカートリッジ（例えば、顕微鏡スライドまたは９６ウェルプレートのサイズ）に収まる。ウェルは、正方形または円形または楕円形または長方形または縁が丸い長方形のような任意の形状で、特に、任意の高さを有することができる。代表的な高さは、例えば１０μｍから１０ｍｍであり得る。例えば、異なる濃度を試験するための培養液希釈法の概念に従って、多くのウェルを使用することにより、ＡＳＴにおいてハイスループットが可能になる（多数の抗生物質、または多数の抗生物質条件、または多数の試料、またはこれらの組合せをそれぞれのウェルで試験することを可能にする）。ユーザは特定の試験に必要なだけのウェルを使用することができる。カートリッジが異なれば、ウェル数も異なる。所与のカートリッジの異なるウェルがすべて同じサイズ、形状、高さ、または構造を有する必要はないが、これらのパラメータのうちの１つまたは複数はカートリッジの異なるウェル間で異なる可能性がある。図２０には２つのウェルしか示されていないが、実際のカートリッジは一般的には２つより多いウェルを有する。

１つまたは複数の試料のロード、包含、撮像法、および分析について記載した技術は、その最も広い意味で使用されている任意の種類のウェルに適用できる。
本発明者らは、「ウェル」という用語を、例えば、任意の容器、レセプタクル、リザーバ、コンパートメント、凹部、マイクロ流体もしくは他のチャネル、チャンバ、ホルダ、表面、格納装置、またはある試料を他の試料もしくは環境から保持、収容、保護、単離、または別の方法で分離する他の装置を含むように広く使用する。最も広い意味で使用されているように、本発明者らは、「チャネル」という単語を「ウェル」という単語と同じ意味で使用することがある。

病原体ＩＤの目的では、少なくとも１つのウェルが必要である。場合によっては、少なくとも２つのウェルを使用して、異なる環境条件下で２つの流体試料間の運動性運動学をほぼまたは全く同時に比較することが可能である場合がある。病原体ＡＳＴの目的では、ユーザが２つの流体試料（例えば、抗生物質または他の抗菌剤を含むものと含まないもの）の間の運動性運動学をほぼまたは全く同時に比較しようとする場合、一般的に少なくとも２つのウェルが用いられる。場合によっては、例えば、ウェル内の試料の運動性運動学を、運動性データベースに保存されている同一微生物の運動性運動学と比較することが可能である場合がある。場合によっては、例えば、ウェル内の試料の運動性運動学を、以前の時点で同一ウェルについて得られ保存された運動性運動学と比較することが可能である場合がある。

カートリッジ上のごく少量のスペースを使用する各ウェルに加えて、ウェルが小さいため、分析に必要な試料の量が減り、これは、特定の身体試料のような、少量の試料しか利用できない場合に特に有益である。ウェルが小さいことはまた、各ウェル内の残留流体の流れを減少させる。そのような残留流体の流れ（すなわち、例えばユーザが意図的にそれらを引き起こさない場合でさえも生じる、流体の小さな動き）は、大きなウェル、または、例えば、不均一な温度分布による自由表面を有するウェルに液体が含まれるときに生じることが知られている。このような流れの存在下では細菌の遊泳運動学の分析は流体の動きによって混乱させられるので、これらの流れを減らすかまたは避けることで細菌の追跡が信頼性のあるものになる。それでも細菌の運動性運動学が残留流体の流れが存在することによって混乱し、これらの残留流の大きさが控えめである場合、ＡＳＫソフトウェアはこれを考慮に入れ、細菌の動きに対する流れの寄与を差し引くことによって細菌の運動性運動学を決定することができる。残留流の影響を減らすために、一部の例では、カートリッジは、ウェルを満たした後に、膜または他のカバー１６（例えば、ガスが通過することを可能にするための通気性カバー）で密封される。ある場合には、カバーは（ｉ）充填前に（例えば、無菌状態を確実にするために）カートリッジ上に存在する、（ｉｉ）ウェルを充填するために使用者によって一時的に剥がされ、次いで再適用される、または（ｉｉｉ）所定位置に留まり試料注入中に針を使用して穿孔される。

本発明者らは、「カバー」という用語を、例えば、任意の膜、層、シート、表面、または周囲からウェルの内部を被覆、保護、単離、または別の方法で分離する他の装置を含むように広く使用する。最も広い意味で使用されているように、本発明者らは、「膜」という単語を「カバー」という単語と同じ意味で使用することがある。

ウェルの表面または密封カバーへの付着による遊泳細菌の固定化を避けるために、それらの表面に細菌の付着を防ぐための材料、または化学物質（例えば、ウシ血清アルブミン、またはＰＬＬ‐ｇ‐ＰＥＧもしくはＰＬＬ‐ｇ‐ＰＭＯＸＡ）でプレコートした１８またはその両方で、ウェルの表面または密封カバーまたはその両方を形成することができる。ある場合には、例えば、表面の運動性を調べることが望ましい場合、ウェルの表面は、それらの表面への細菌の付着に有利に働く材料で作られるか、または化学物質で予めコーティングされることができる（例えばＰＬＬ）。

カートリッジ上のそれぞれのウェルは、１つの試料または複数の異なる試料の小部分を保管することができ（例えば、複数のウェルに分割された単一のサンプル、異なるウェルの異なるサンプル、またはそれらの組合せ）、およびこれらは、１つまたは複数の抗生物質条件（例えば、濃度、異なる抗生物質の組合せ）（例えば、複数のウェルにおける１つの抗生物質条件、異なるウェルにおける異なる抗生物質条件、またはそれらの組合せ）を有する、１つまたは複数の抗生物質または他の抗菌剤（例えば、複数のウェルに１つの抗生物質、または異なるウェルに異なる抗生物質、または特定のウェルに複数の抗生物質、またはそれらの組合せ）に曝露される可能性がある。一部の例では、単一の試料（例えば、体液）を２つ以上のウェルに充填し、異なる濃度で一連の異なる抗生物質に曝露する（各ウェルが１つの抗生物質の１つの濃度）。反復されたウェルもまた使用することができる（２つ以上のウェルにおいて同一試料および抗生物質条件）。

ある用途では、ユーザは、例えばピペットによって、１つまたは複数の試料をウェルにロードする（例えば、同一試料がすべてのウェルに入る）。選択肢には、例えば、上部からロードすること（例えば、マルチチャネルピペッターまたはロボットシステムを用いて、同時にウェルごとまたは複数のウェルに）またはメインのリザーバに注入し、そこから組込み流体工学または他の流体分配システムが試料を個々のウェルに入れることが含まれる。

一部の実施態様では、カートリッジには、所定の濃度の所定のセットの抗生物質または他の条件が異なるウェル内に予めロードされている可能性があり、それにユーザが１つまたは複数の試料を添加する。予めロードされた抗生物質を凍結乾燥することができる。

一部の実施態様では、ユーザは１つまたは複数の抗生物質および１つまたは複数の試料の両方をウェルに添加する。
一部の実施態様では、ユーザは、１つまたは複数の抗生物質および１つまたは複数の試料を、順番に、またはその逆に（最初に１つまたは複数の試料、次いで１つまたは複数の抗生物質）ウェルに添加する。

無菌状態を維持するために、カートリッジのウェルを密封するカバーを使用することができる。カバーは一般的に、カートリッジのように透明である。カバーは、例えばガス透過性であり得る。カバーは、例えば取り外し可能であり得る。カバーは、例えば柔軟性または剛性であり得る。カバーは、例えばフラットであるまたは模様がある可能性がある。カートリッジは、例えば、カバーをかけた状態で提供されることができ、ユーザは、再密封する前に、充填のために一時的にそれを取り除くことができる。カバーは、例えば、充填のために針で穿刺するのが容易な材料で作ることができる。カバーは、例えば固体材料で作ることができる。カバーは、例えば１つまたは複数の穴を有することができる。他のタイプのカバーもまた、可能である。

場合によっては、ＡＳＴの目的は、１つまたは複数の抗生物質のさまざまな条件に対する細菌の感受性を試験することである。
一部の実施態様では、ユーザは、所望の１つまたは複数の抗生物質または他の抗菌剤を、それぞれ所望の１つまたは複数の条件（例えば濃度）で各ウェルに添加する。所望の抗生物質は通常液体のストック溶液に調製される。いくつかの抗生物質については、例えば液体ストックを保存することが問題である場合には、抗生物質を粉末形態で添加することもできる。

一部の実施態様では、１つまたは複数の抗生物質は、リザーバ内のカートリッジに予めロードされている。カートリッジに組み込まれた流体工学または他の流体分配システムは、次いで、適切な濃度の１つまたは複数の抗生物質を個々のウェルに自動的に送達する。

一部の実施態様では、１つまたは複数の抗生物質は個々のウェル内のカートリッジに予めロードされており、各ウェルは潜在的に異なる濃度の所与の１つまたは複数の抗生物質を有する。したがって、細菌がユーザによってウェルにロードされる場合に、細菌は抗生物質に曝露される。

カートリッジをロードするための上記技術の２つ以上の組合せもまた使用され得る。
図１に示すように、ある場合には、カートリッジは、細菌の撮像および追跡（本発明者らは、「追跡」という用語を、軌跡を決定することを表すために使用する）のために光学顕微鏡２２の電動ステージ２０上に配置される。顕微鏡の基本要素は（ｉ）対物レンズ、（ｉｉ）（任意選択的に）自動移動ステージ２０、および（ｉｉｉ）（任意選択的に）温度コントロールユニット２４である。ある場合には、カートリッジの位置は固定することができ、撮像システム（一般的に対物レンズとカメラで構成されている）はウェルからウェルへ移動することができる。場合によっては、顕微鏡は、同時または非同時のいずれかで、同一ウェルまたは異なるウェルのいずれかの複数のビデオを取得するために、複数の撮像システム（例えば、複数の対物レンズおよびカメラ）を有することができる。他の組合せが可能である。

自動移動ステージは、デバイス操作層３４を介してコンピュータプログラムの制御下で、顕微鏡が以下のうちの任意の１つ、または２つ以上の組合せを達成できるようにする：（ｉ）各ウェルまたは選択されたウェルのセットを順番に画像化できるように、カートリッジ内でウェルからウェルへ水平に移動する、（ｉｉ）そのウェルについてより多くのデータを取得するために、任意の所与のウェルにおいて、異なる位置を垂直または水平にスキャンする、または（ｉｉｉ）例えば、収縮、滑走、遊走運動性のような表面運動性によって動く細菌を追跡するために、ウェルの底面を画像化する。ステージは、一般的に数マイクロメートルの精度を有する。

対物レンズは任意の倍率を持つことができる。代表的な倍率は１０×または２０×であるが、他の倍率も可能である。
温度コントロールユニット２４は、例えば正常体温（一般的には３７°C）に試料を維持するために使用され得る。温度コントロールユニットは、一般的に、顕微鏡のステージ上に取り付けられた温度コントロールインサート、またはカートリッジ、もしくはステージもしくは顕微鏡全体もしくは装置全体を囲む温度コントロールエンクロージャを有する。

異なるタイプの顕微鏡技術を使用することができる。位相差顕微鏡が一般的に使用されるが、暗視野顕微鏡、明視野顕微鏡、蛍光顕微鏡、または他の顕微鏡技術も使用できる。
顕微鏡のステージ上のカートリッジの動きは、専用ソフトウェア２８を介してコンピュータによって制御される。

顕微鏡に接続されているのは、各ウェル内の試料のビデオ（すなわち連続した画像）を取得するために使用されるカメラ３０である。カメラは、一般的に、白黒センサーまたはカラーセンサーを備えている。一部の実施態様では、センサーは、１ピクセル当たり５μｍ～２０μｍ、５００×５００から２０００×２０００ピクセルの間の解像度を有することができる（他の仕様も可能である）。連続した画像は２つ以上の画像で構成されるが、一部の実施態様では、単一の画像になることもある。

ある場合には、撮像は毎秒１５フレームの速度で行われるが、試料および追跡する運動性のタイプに応じて、より遅い速度（例えば、毎秒１フレームまたは毎秒５フレーム）またはより速い速度（例えば、毎秒１００フレーム）が可能である。

ある場合には、ウェルごとに１つのビデオを取得する（または各ウェル内の複数の位置にある複数のビデオの場合もある）。ビデオは一般的に１～３０秒の間持続し、これは一般的に細菌の軌跡から運動性運動学情報を得るのに十分な時間である。場合によっては、ビデオが１秒より短くなること、３０秒より長くなることもあり得る。

ある場合には、各ビデオの長さは適応的であり得る。例えば、ソフトウェア（下記参照）は各ビデオをほぼリアルタイムで処理し（すなわち、ビデオの取得とほぼ同時に、または数秒の遅れで遊泳運動学を提供する）、運動性運動学が信頼性を持って定量化されているかどうかを判断し、および運動性運動学の信頼性のある定量化のための十分なデータが取得されるまで、最大時間（例えば、５分、ただし３０分以上になることがある）までビデオの取得を継続する。

一部の実施態様では、各画像の解像度は、カメラ設定のビニングを調整する（すなわち、隣接するピクセルを組み合わせる）ことによって適合させることができる。これらの実施態様では、より速い読み出しが必要な場合、ソフトウェアは画像の解像度を調整する（一般的に下げる）。試料中の細菌のサイズおよびそれらの運動性運動学は、画像の解像度を設定し、したがってビニングを設定するための重要な基準である（例えば、迅速な運動速度を有する微生物はより低い画像解像度で追跡することができる）。

一部の実施態様では、各画像のサイズ（すなわち視野）は、試料中の細菌の濃度に応じて適合させることができる。例えば、狭い視野の画像を撮ることは、高い細胞濃度を有する試料中の細菌の遊泳運動学を定量化するのに十分である。

顕微鏡を制御するコンピュータにインストールされているのと同じソフトウェアを使用してカメラを制御できる。
コンピュータは、カメラによって取得されたビデオを一時データ記憶装置ユニット４０（例えばＲＡＭ）に保存する。一般的に、顕微鏡およびカメラを制御するコンピュータにインストールされているのと同じソフトウェアを使用してビデオの保存を制御できる。

一部の実施態様では、この手法は、ウェルごとに（各ウェルに複数の撮像位置がある場合）撮像位置ごとに１つのビデオ（すなわち連続した画像）を生成する。各ビデオ（すなわち、ビデオの中のすべての画像）を保存する。適した標識スキームおよびディレクトリ構造を使用する。画像の保存は、例えばｊｐｅｇ形式やｔｉｆｆ形式など、さまざまな形式で行うことができる。ビデオは、異なる形式、例えばａｖｉ形式で直接保存することもできる。ビデオは非圧縮にすることができる。ビデオはビデオコーデック、例えばＨ．２６４／ＭＰＥＧ‐４ＡＶＣで圧縮できる。他の圧縮方法が含まれる。

ＡＳＫソフトウェア４２は、ビデオを処理し、細菌の軌跡を計算し、および試料中の個体細菌の遊泳運動学を分析する。一部の実施態様では、プレスクリーニングステップを含めることができ、例えば、画像分析技術によって運動性細菌の存在を迅速に（例えば、リアルタイムで）決定するために、１つまたは複数のウェル、例えば抗生物質を含まないウェルを画像化して運動性の初期評価を得る。この目的のための画像解析技術のいくつかの例は、図９に示されるように最小値投影を使用し（例えば、白または他の明るい背景を有する画像に適している）、いくつかの例は、最大値投影を使用する（例えば、黒または他の暗い背景を有する画像に適している）。これらの手法では、各ピクセルに、そのピクセルがビデオ内のすべての画像にわたって有する最小（または最大）値が与えられた、最小（または最大）値投影画像が作成される。このようにして、細菌の軌跡は、運動性または運動性の変化をすぐに明らかにする縞５０、５２として現れる。ＡＳＫソフトウェアは、最小（または最大）値投影画像でこれらの縞を識別することで、所与の試料の運動性の存在を判定する。この情報は非常に迅速に得ることができ、運動性細菌が存在しないかまたはごくわずかしか存在しない場合に環境条件を変えること（例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような化学物質の添加）によって、ワークフローを中断または調整するか、または運動性を促進するために使用できる。プレスクリーニングステップは任意選択的にユーザによって含められ得る。最小または最大値投影法は、ビデオから運動性運動学を得るためのはるかに広範囲の画像解析技術の例にすぎない。

図４に示すように、ＡＳＫソフトウェアは３つの主要構成要素、遊泳運動学分析器５６、特に運動性データベースを含むＡＳＫデータベース管理システム５８、およびＡＳＫチューナ６０を含む。プレスクリーニングステップによって決定されるように、運動性細菌が試料中に存在する場合（図９に関して論じたように）、ＡＳＫソフトウェアの遊泳運動学分析器（図５も参照）は、一時記憶装置６３からの画像データ（「画像フレーム」）６２（図５）、およびＡＳＫチューナ６０からの（以前の測定値が存在する場合）更新されたチューニングデータ６４（例えば細菌の検出および追跡のためにパラメータを使用する）に対して画像およびデータ分析ルーチンを実行して（ｉ）細菌検出器７０を用いてビデオの各画像から個体細菌を見つけ（図６も参照）、（ｉｉ）細菌追跡装置１０１を用いてそれらの軌跡を追跡し再構成するために、ビデオ内の画像から画像へ個体細菌をつなげ（図７も参照）、および（ｉｉｉ）ＡＳＫデータ生成プログラム１０３を用いて細菌の遊泳運動学データを得る（図８も参照）。遊泳運動学分析器５６は、ＡＳＫデータベース管理システム５８に保存されているＡＳＫデータおよびチューニングデータ６８を生成する。選択された画像フレーム６２（例えば、ビデオのサブセットまたはビデオ全体）もまた、ＡＳＫデータベース管理システム５８に保存することができる。

図６に示すように、一部の例では、個体細菌は、画像分析技術に基づく複数の細菌識別子を使用して各画像フレームに検出される。これらは、色識別７２（例えば、ピクセル強度勾配）、形状識別７４（例えば、アスペクト比、凸面）、面積識別７６（例えば、サイズ閾値）、および潜在的に広範囲の他の識別子７８を含むが、これらに限定されない。これらの識別子は、検出された細菌データ８２を生成するために、識別合成器８０によって、各識別子を重み付けしてもしなくても、順番にまたは並列に適用することができる。ある場合には、任意の２つの識別子を第３の識別子なしで組み合わせて使用できる。細菌検出器は、細菌を同定するために元の画像（すなわち未加工の）または処理された画像の両方を使用することができる。処理された画像の一例は、バックグラウンド画像の減算から生じる画像であり、ここでバックグラウンド画像は、例えば画像シーケンスの平均画像もしくはメジアン画像、または例えばシーケンス内の初期画像として計算することができる。

一部の実施態様では、細菌に関する情報は、該細菌について決定された属性を含むデータベース管理システムのデータ構造に保存され、該細菌の水平位置と垂直位置、サイズ、強度、形状、主要軸の方向（細長い場合）、任意の他の球面形状からの逸脱、強度分布、試料中の他の細菌に対する空間的配置、およびその画像から取得できる他のパラメータを含む。

図７に示すように、個体細菌は、細菌追跡装置１０１内の追跡技術を用いて、検出された細菌データ８２（例えば、座標、面積、形状）に基づいて画像フレームから画像フレームへ追跡される。追跡するとは、フレーム内で検出された個体細菌のデータが、他のフレーム内の同じ個体細菌のデータと関連付けられることを意味する。例えば、所与の画像フレーム内で検出された所与の細菌について、現在検出されている細菌は、位置の近接度９０（一例は、一定のバックトラッキング深度を有する最近傍法）、速度９２、方向９４、および加速度、ならびに他の基準範囲９６に基づく１つまたは複数の軌跡識別子によって探索半径内の以前に識別された軌跡に割り当てられる。検索半径は、ユーザによって定義されるか、またはＡＳＫデータベース管理システムのデータベースに保存された以前の追跡情報に基づいて、ソフトウェア（例えばＡＳＫチューナ６０）によって適応的に設定されることができる。探索半径内に以前に識別された軌跡が存在しない場合、現在検出されている細菌は新しい軌跡に割り当てられる。次いで、上記の基準の１つまたは複数を利用するスコアリング関数を使用して、スコアリング関数９８に基づいて一定数の候補細菌の中でベストマッチ１００を決定し、したがって連続したフレーム内の細菌の位置を所与の細菌の軌跡１０２に結びつける。細菌を軌道に結びつける基準は確率的であり得る。

識別された遊泳軌跡は、試料中の運動性細菌の数を得るために使用することができる。識別されたブラウン運動軌跡は、試料中の非運動性細菌の数を得るために使用することができる。撮像体積が既知であるので、このカウントは運動性細菌もしくは非運動性細菌またはその両方の濃度に変換することができる。追跡プロセスから得られる情報は、試料中の運動性細菌の存在、非存在、数、割合もしくは濃度（またはそれらのカテゴリーの組合せ）を含むことができ、それは、例えば感染の存在、特質および潜在的な重症度の尺度を提供することができる。運動性細菌または他の病原体が存在しないことは、例えば感染は、感染源が細菌性ではなくウイルス性であるという結論を支持するのにも役立ち得る。運動性細菌数の経時変化または運動性細菌と非運動性細菌の割合の経時変化は、所与の抗生物質に対する細菌の感受性についての情報を提供することができる。次いで、細胞濃度は、以下に記載される微生物のアイデンティティー（ＩＤ）についての情報と共に利用され得る。

一部の実施態様では、基準を使用して、試料中に存在する非遊泳微粒子または他の物を分析から排除することができる。微生物ではない微粒子または他の物は、多くの場合試料中に存在し、生物学的もしくは非生物学的起源またはその両方であり得る。分析からそれらを排除するために利用される基準には、サイズ、形状、動き（例えば、表面に付着している粒子または他の物の動きがない）、およびその他、ならびにそれらの組合せが含まれる。分析から微粒子または他の物を排除することは、特に濁った試料について、分析を単純化するのに有用であり得る。

遊泳運動学は一般的に、細菌の運動と軌跡の定量的特徴であり、個体細菌のレベルで計算され、試料中で画像化された細菌の全部またはサブセットの平均値をとることもある。
図８に示すように、個体細菌の遊泳運動学は、（ｉ）追跡されたすべての軌跡を使用する、または（ｉｉ）軌跡の長さ、移動した総距離、速度などに関する基準のような、特定のユーザ定義の基準を満たす選択された軌跡１１２を使用する、の２つのモードのうちの１つでＡＳＫデータ生成プログラム１０３において集約され、統計的に分析される１１０。データの集計は、所与の属性の値の単純平均のような、さまざまな数学的プロセスによって、数個、数十個、数百個、または数千個の個体細菌に適用できる。

一部の実施態様では、ＡＳＫデータ６８は以下の遊泳運動学特徴を含むことができる。
１．速度。速度は、個体細菌の軌跡から、例えば（軌跡に沿って）移動した絶対距離を軌跡の持続時間で除すことによって得られる。
２．加速度。加速度は、個体細菌の軌跡から、例えば軌跡に沿った速度の変化を測定することによって得られる。
３．旋回速度。回転速度としても知られている旋回速度は、個体細菌の軌跡から、例えば旋回の基準（例えば、所与の時間間隔内の一定の閾値角度を上回る方向の変化、場合によっては一定の閾値未満の瞬間的な遊泳速度の低下を伴う）を定義することによって、軌跡内のすべての旋回事象を識別することによって、および旋回事象の数を軌跡の持続時間で除すことによって得られる。
４．旋回角度。旋回角度は、個体細菌の軌跡から、例えば最初に旋回を識別し（上記の項目３に記載したのと同じ基準を使用して）、次に旋回前の方向と旋回後の方向との間の方向の変化を決定することによって得られる。
５．全体的な運動性様式または軌跡の「形状」。一定の「速さ」（例えば、ほぼ直線的な走行、旋回、反転、停止）を伴う、軌跡の異なる構成要素の交代は、所与の種に特徴的であり、その運動性様式を表す。
６．所与の時間にカバーされた面積として計算された細菌の拡散度。拡散度は、その運動において細菌によってカバーされた全体的な面積の尺度を表す。
７．軌跡の始点から終点までに移動した直線距離として計算し、軌跡自体に沿って移動した距離で除した、細菌のネット対グロス‐変位‐比（ＮＧＤＲ）。ＮＧＤＲは、軌跡がどれだけ直線的である（蛇行している）かを示す尺度である。
８．所与の時間内に移動した直線距離の二乗として計算された、細菌の平均二乗変位（ｍｓｄ）。
９．軌跡の曲率、例えば遊泳中の方向の変化を決定することによって得られる。
１０．主な運動様式（「揺れ」）の周りの変動。
１１．運動性細菌と非運動性細菌の割合の経時変化。
１２．これらの遊泳運動学の組合せから得られた、または別の方法で軌跡の分析から得られた量。

遊泳運動学は細菌の各々の種に特徴的であり、病原体同定のための強力な基準を提供する。例えば、細菌の運動性の研究のために十分に特徴付けられたモデル生物であるＥ．ｃｏｌｉは、直進遊泳と、ほぼランダムな方向に時折旋回することを交互に繰り返すことによって、いわゆる「前進‐および‐回転」運動性様式で泳ぐ（図１０ａ、ｂ）。他方では、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは、主にいわゆる「前進‐および‐反転」運動性様式で前後に泳ぐ（図１０ｃ、ｄ）。

一部の実施態様では、微生物を同定する目的で、各ウェルから得られた遊泳運動学を、ＡＳＫソフトウェアによって、運動性データベースに保存されている既知の微生物についての既知の遊泳運動学データと比較する１３０（図２参照）。測定された遊泳運動学が運動性データベースに保存されている既知の遊泳運動学に十分に近い場合、微生物の確実なＩＤが確立される。「十分に近い」とは、統計的分析が行われ、微生物を確実に同定するために、信頼度が確立されることを意味する。Ｅ．ｃｏｌｉおよびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａについての基準例は旋回角度であり、これは特徴的に異なる（図１０）。ＩＤについての最も頑強で、潜在的にマルチパラメータの基準（例えば、速度、旋回角度、および旋回速度の組合せ）は、分析の一部として決定される。図１０は、「前進‐および‐回転」運動性様式（図１０ｂ）で遊泳するＥ．ｃｏｌｉ（図１０ａ）および「前進‐および‐反転」運動性様式（図１０ｄ）で遊泳するＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（図１０ｃ）を示す。図１０ａおよび１０ｃはＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ （ＣＤＣ）、「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｔｈｒｅａｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ」、２０１３、から作成されている。図１０ｂはＨ．Ｂｅｒｇ、「Ｅ．ｃｏｌｉ ｉｎ ｍｏｔｉｏｎ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２００４、から作成されている。一部の実施態様では、微生物を同定する目的で、各ウェルから検出された個体微生物の特有の特徴を、ＡＳＫソフトウェアによって、形態データベースに保存されている既知の微生物についての既知の特有の特徴データと比較する１３０（図２参照）。測定された特有の特徴が形態データベースに保存されている既知の特有の特徴に十分に近い場合、微生物の確実な同定が確立される。「十分に近い」とは、統計的分析が行われ、微生物を確実に同定するために、信頼度が確立されることを本発明者らは意味する。桿菌および球菌についての基準例は細胞形状である。桿菌はロッドの形状、球菌は球形の形状であるので、特徴的に異なる。Ｖｉｂｒｉｏ属はさらに異なる、三日月様の形状である。本発明者らは、形態学を他の個体微生物に対する個体微生物の空間的配置も含むものとして広く解釈する。一例はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の種およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の種で示される。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の種がブドウ様クラスターを形成し、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の種が鎖様クラスターを形成するので、それらの空間的配置は特徴的に異なる。したがって、空間的配置は、ＩＤに関する追加の基準を提供する。最も頑強な基準、潜在的にマルチパラメータの基準（例えば、運動性、サイズ、形状、および空間的配置の組合せ）は、分析の一部として決定される。一部の実施態様では、運動性と形態の両方に関する個体微生物の特有の特徴は、微生物を同定する目的で使用される。

ＡＳＫデータベース管理システムに保存されている運動性データは、以前に得られた既知の遊泳運動学、例えば、特に、新鮮な臨床分離菌、臨床ストック分離菌、他の分離菌、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（ＣＤＣ）から入手可能なチャレンジ生物、またはＣｌｉｎｉｃａｌ ＆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）もしくは他の機関によって設定された品質管理のための標準参照株から構築される。この事前に取得されたデータは、ＡＳＫソフトウェアを実行するコンピュータ内の運動性および形態データベースに保存されるか、またはインターネットに接続されたシステムで、オンラインで迅速に利用される。比較の精度は、複数の条件を網羅するデータベース（例えば、感染ごとまたは体液ごとに１つのデータベース）を作成すること、およびマルチパラメータ比較基準（例えば、遊泳速度と旋回速度の両方を比較する）の使用によって高めることができる。ＡＳＫソフトウェアはまた、比較の統計量（すなわち、統計的に有意であるかどうか、およびどの程度の有意性であるか）を決定し、病原体または他の微生物のアイデンティティーにおける信頼度の測定基準を提供する。さらに、ソフトウェアは、複数の種類の病原体を含む試料中の複数の種類の病原体を同定し、それぞれの同定における信頼度の統計的測定基準を提供することができる。さらに、ソフトウェアは、試料中の単一の細菌種内の複数の遺伝子型を同定することができる。例えば、抗生物質感受性が異なる２つの遺伝子型が共発生することは、運動性運動学の二峰性分布から明らかである。

遊泳運動学は、抗生物質に曝露されると変化し、ＡＳＴのバイオマーカーを提供する。ＡＳＴは、参照データベースを使用せずに、または使用する、の２つの方法のいずれかで、またはそれらを組み合わせて実行できる。図２に示すように、ある場合には、ＡＳＫソフトウェアは、同一カートリッジ上で、抗生物質の存在下で測定された遊泳運動学と抗生物質の非存在下で測定された遊泳運動学との比較１３０を行う。ソフトウェアはまた、比較の統計量（すなわち、統計的に有意であるかどうか、およびどの程度の有意性であるか）を決定し、抗生物質に対する病原体の感受性における信頼度の測定基準を提供する。

ある場合には、比較は、事前に定義され保存された一連の定量的基準に基づいて行われる。このことを達成するために、単一の微生物の遊泳運動学が抗生物質へ曝露されるとどのように変化するのかを知られているかということについてのデータベースが使用される。標的病原体または他の微生物ごとに１つのデータベースが使用される。それぞれについて、病原体の遊泳運動学を定義する複数のパラメータ（例えば、特に、速度、旋回角度、旋回速度、または運動性様式、平均二乗変位）の変化を、異なる抗生物質について、異なる条件（例えば、異なる温度、試料の異なる化学組成）、および異なる曝露時間で定量化する。本データベースは、診断中に所与の試料中の細菌の抗生物質感受性を決定するために、絶対変化と相対変化の両方を含む一連の定量的基準を定義づけるための基準として役立つ。ソフトウェアはまた、比較の統計量（すなわち、統計的に有意であるかどうか、およびどの程度の有意性であるか）を決定し、抗生物質に対する病原体の感受性における信頼度の測定基準を提供する。

上記の両方の場合、複数の抗生物質条件がアッセイされると、ソフトウェアはその細菌についての抗生物質の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を計算する（図１９）。ソフトウェアまたはユーザは、次いで、運動性から決定されたこのＭＩＣが文献から入手可能な品質管理の範囲内にあるかどうかを決定し、または運動性から決定されたＭＩＣを、ブロス微量希釈試験のようなゴールドスタンダードアッセイを用いた並行試験から決定されたその細菌のＭＩＣと直接比較する。Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）またはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ（ＥＵＣＡＳＴ）によって公開された臨床的ブレークポイントに基づいて、ＭＩＣはまた、細菌のカテゴリー一致（感受性／中間／耐性）および矛盾率（大きい、小さい、および非常に大きい矛盾）を含む診断性能ももたらす。

運動性は、アッセイが非常に迅速な表現型であるが、単一微生物レベルの撮像はまた、細胞数、細胞のサイズ、細胞の形状、およびそれらが分裂の過程にあるかどうかを含む他の重要な表現型に関する情報も提供する。図５および８に示すように、これらの追加の表現型は、細菌追跡装置によるさらなる処理を必要とせずに、細菌識別子から得られた検出された細菌データから入手可能である。例えば、形状は球菌、桿菌およびＶｉｂｒｉｏ属を区別するために使用することができる。増殖を評価するために各ウェルにおいて短い間隔（例えば、５～１５分）で撮像が行われる場合、サイズを使用することができる。増殖を評価するために、細胞数を同様に使用することができる。一部の実施態様では、ＡＳＫソフトウェアは、ＡＳＴの信頼性をさらに高めるために、基準の組合せを使用することによって、これらの他の重要な表現型のいずれか１つの変化と共に運動性情報を利用する。表現型の変化の組合せは、抗生物質治療の結果と抗生物質を含まない対照の結果とを比較する統計量モデルで評価することができる。

遊泳運動学分析器は、（ｉ）ＡＳＫデータ６８、および（ｉｉ）チューニングデータ６８、の２つのデータセットを生成する（図８）。ＡＳＫデータは、すべての定量化された遊泳運動学情報もしくは検出された細菌データ、またはその両方を含む。チューニングデータは、現在の分析において、微生物ＩＤもしくはＡＳＴ、またはその両方に使用されているすべての基準を含む。遊泳運動学分析器は、現在の分析から得られたチューニングデータを送信し、それらをＡＳＫデータベース管理システムに保存する（図４）。データベースに保存された以前のデータ（すなわち、履歴データ）は、遊泳運動学分析器を継続的に改善し、その後の試験におけるＩＤまたはＡＳＴ（または両方）ルーチンの精度を高めるために、ＡＳＫチューナモジュールによって利用される。

他の実施態様も、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
例えば、抗生物質とそれが細菌の運動性に与える影響については論じたが、本発明者らが記載する運動技術は、任意の微生物、およびその微生物の運動性の変化に反映されるような影響を微生物に与えることを意図している、任意の化学物質（抗生物質またはその他）にも適用される。

また、本方法の範囲は、試料中の微生物が動いていないが、運動能力がある、または、例えば、運動性を刺激する化学物質（例えば、特定の栄養素またはＥＤＴＡを含む）の添加によって運動性の低下を示す、などの条件に拡大することができる。これらの実施態様では、ユーザは、最初に運動性刺激剤を添加し、次いでＩＤおよびＡＳＴ技術または上記の他の技術を適用する。このアプローチは反復的である可能性があり、それは、例えば、運動性病原性細菌が存在しない場合の信頼度を高めるため、またはそれらを検出するために、最初に試料が画像化され、運動性細菌が検出されないプレスクリーニングステップの後に適用できる。

ここではそれらの個々の軌跡から計算された細菌の遊泳運動学の選択された例を本発明者らが記載する。
抗生物質へ曝露されると、病原体の単一細胞レベルの遊泳運動学が変化するので、個体微生物の運動性は、抗生物質感受性を決定するための迅速診断バイオマーカーとして優れた候補であることを、毒性の高い臨床参考株であるＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡ１４を使用して得られた未発表の実験データは実証している。β‐ラクタム系抗生物質であるセフタジジムでは、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡ１４細胞を抗生物質に曝露した場合に平均遊泳速度の低下が観察された（図１１および１２）。図１１は、時間ゼロでセフタジジム（１μｇ／ｍｌ）へ曝露後の、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡ１４の遊泳速度の経時的な減少を示すデータを提示する。図１１の確率密度は、個々の細胞にわたる速度の分布を示す（ここでは、１時点あたり少なくとも２５７の細菌の軌跡が画像化され分析された）。具体的には、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡ１４細胞を１μｇ／ｍｌの濃度のβ‐ラクタム系抗生物質セフタジジムに曝露した場合（図１１および１２）、細胞の平均遊泳速度は、同じ時点で抗生物質を含まない対照と比較して、３０分後に１４％（４９．７μｍ／ｓ→４２．６μｍ／ｓ）、５０分後に２３％（４５．９μｍ／ｓ→３５．４μｍ／ｓ）、および７０分後に３３％（４６．５μｍ／ｓ→３１．２μｍ／ｓ）減少した。重要なことに、遊泳運動学分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｗｉｍｍｉｎｇ Ｋｉｎｅｍａｔｉｃｓ）（ＡＳＫ）ソフトウェアは、細胞分裂時間より短い時間にわたって遊泳運動学の変化を検出し（図１２の２０分の時点を参照）、運動性は増殖よりも検出がはるかに速いバイオマーカーである可能性があることを意味する。１０μｇ／ｍｌのセフタジジムへの曝露時に同様の遊泳速度の変化が観察されたが（図１２）、０．１μｇ／ｍｌのセフタジジムでは抗生物質を含まない対照と比較して遊泳速度の有意な変化は測定されなかった（図１２）。図１２では、縦のエラーバーは標準誤差を表し、表示されていない場合、縦のエラーバーは記号より小さくなる。

ＡＳＫソフトウェアはまた、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ細胞を非β‐ラクタム系抗生物質であるゲンタマイシンに曝露したときに、１細胞分裂以内に迅速なＡＳＴ結果を提供した。病原体の遊泳速度は、１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンへの曝露によって有意に低下したが（図１２）、１および０．１μｇ／ｍｌのゲンタマイシンへの曝露によっては低下しなかった。ここに示す例では、遊泳細菌は、デジタルカメラを使用して位相差顕微鏡（対物レンズ２０倍）により１秒当たり３０フレームでウェルの深さ中央で画像化された。細胞を同定し、それらの軌跡を再構築し、およびそれらの遊泳運動学を定量化するために、すべての分析はＡＳＫソフトウェア（Ｃ＋＋で実行される）を用いて行われた。

セフタジジムとゲンタマイシンについてここに示されているように、迅速なＡＳＴのために、ＡＳＫソフトウェアは１つまたは複数の基準を使うことができる（図１３）。例えば、ＡＳＴの精度を高めるために、試料中の細菌数の経時的変化（図１３）を遊泳運動学データ（図１２）と組み合わせて使用することができる。図１３は、細菌数を示し、時間ゼロで、β‐ラクタム系抗生物質セフタジジム（図１２ａ）および非β‐ラクタム系抗生物質ゲンタマイシン（図１２ｂ）に曝露した時の、経時的なＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡ１４細胞数の変化を示し、２つの抗生物質のそれぞれがその図の凡例に与えられた選択された濃度で試験された。

図１４および１５に示すように、シプロフロキサシンに曝露されたＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａで本明細書に示されているように、ＡＳＫソフトウェアは、与えられた抗生物質に対して感受性株と耐性株を識別することができる（図１４および１５）。図１４は、シプロフロキサシンがＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの感受性臨床分離菌の運動性を損なうことを示し（ＰＳＡ９／５３、ＭＩＣ＜０．１２５μｇ／ｍｌ）、および図１５は、シプロフロキサシンがＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの耐性臨床分離菌の運動性を損なうことを示す（ＰＳＡ７１／３６、ＭＩＣ＝８μｇ／ｍｌ）。図１４ａおよび図１４ｃでは、抗生物質を含まない対照（値が１の直線）に対して正規化された４μｇ／ｍｌシプロフロキサシンについてのＰＳＡ９／５３の２回の反復実験が示されている（ＣＬＳＩ耐性ブレークポイント：≧４μｇ／ｍｌ）。遊泳速度（ｙ軸）は対照における速度によって正規化された（したがって、それは１で破線となる）。対照に対する速度の減少が統計的に有意になると（ｐ＝０．００１）、抗生物質治療は実線で表示され、統計的に有意差がないと点線で表示される。図１４ｂおよび図１４ｄでは、抗生物質を含まない対照（値が１の直線）に対して正規化された８μｇ／ｍｌシプロフロキサシンについてのＰＳＡ９／５３の２回の反復実験が示されている。図１５ａおよび図１５ｂ、抗生物質を含まない対照（値が１の直線）に対して正規化された４および８μｇ／ｍｌシプロフロキサシンに曝露された耐性株Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ７１／３６の実験が示されている。耐性株については、速度が対照と有意に異なることはないことに注目されたい（線は常に点線である）。図１６は、抗生物質を含まない対照（図１６ａ）および４μｇ／ｍｌシプロフロキサシン（図１６ｂ）について、一晩インキュベートした後に評価したＰＳＡ７１／３６についての運動性プレートアッセイを示す。ＡＳＫソフトウェアで３０分未満に得られたように、両方の場合における外側への拡大は、この耐性株でシプロフロキサシンによる運動性の障害がないことを示していることに注目されたい（図１５ａ）。

ＡＳＫソフトウェアは、１時間以内に、多くの場合３０分以内に（図１７）、場合によってはさらに迅速に、抗生物質に対する微生物の感受性に関する結果を提供する。図１７は、４μｇ／ｍｌのシプロフロキサシン（図１７ａおよび図１７ｂ、２回の反復実験を示す）、０．５μｇ／ｍｌのメロペネム（図１７ｃおよび図１７ｄ、２回の反復実験を示す）および８μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（図１７ｅおよび図１７ｆ、２回の反復実験を示す）に曝露された臨床分離菌Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ９／５３の遊泳速度を示す。図１７ａから１７ｆは、それぞれ、時間の関数として遊泳速度（抗生物質を含まない対照の場合の速度に対する相対値）を示しており、速度が対照より有意に低い場合に線が実線になる（ｐ＝０．００１）。図１８は、図１７ａから図１７ｆに示される６つすべての場合について、感受性が最初に検出される時間（図１７ａから図１７ｆにおいて線が実線になる時間）を示す。感受性が一般的に１０～５０分でどのように検出されるかに注目されたい。運動性がシプロフロキサシンとゲンタマイシンに対して非常に感受性であり、メロペネムに対しては感受性が低いことに注目されたい。このことはより高い変動性を示すが、それでも統計的に有意な結果を提供する。ＭＩＣ（ブロス微量希釈アッセイにより決定）は、＜０．１２５μｇ／ｍｌ（シプロフロキサシンの場合）、０．５μｇ／ｍｌ（メロペネムの場合）および１μｇ／ｍｌ（ゲンタマイシンの場合）であった。

図１９に示すように、ＡＳＫソフトウェアで決定された遊泳速度の変化を使用して、抗生物質のＭＩＣを定量することができる。図１９は、異なる濃度のゲンタマイシン（ＭＩＣ １μｇ／ｍｌ、ブロス微量希釈アッセイにより決定）に曝露された参考株Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ２７８５３について、時間の関数として遊泳速度（抗生物質を含まない対照の場合に対する相対値）を示す。速度が対照より有意に低い場合に線が実線になる（ｐ＝０．００１）。曝露後３５分に１μｇ／ｍｌの曲線がどのような感受性を示すかに注目されたい。
参考文献
臨床微生物検査室で広く使用されているＡＳＴ法は、抗生物質曝露による細菌増殖の手動または自動測定に依存している（１、２）。すべての引用番号は、以下に記載の参考文献に対するものである）。ディスク拡散試験およびＥｔｅｓｔ勾配拡散試験を含む手動の方法は単純で標準化されており（１、２）、定性的情報（感受性、中程度、または耐性として細菌を分類）と定量的情報（最小発育阻止濃度、ＭＩＣ）の両方を提供する。自動化システムはブロス希釈テストに基づいており（（３）に概説）、感度の高い光学システムを介して増殖の微妙な変化を検出し、手動試験と同じ情報を提供する。米国で使用するためにＦＤＡによって承認された複数の自動化システムが存在し（２）、ＭｉｃｒｏＳｃａｎ ＷａｌｋＡｗａｙ（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ＢＤ Ｐｈｏｅｎｉｘ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）およびＶｉｔｅｋ ２ Ｓｙｓｔｅｍ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）が含まれる。これらの従来の方法は、細菌の増殖および頑強な検出のために十分に高い細菌濃度に達する試料に依存しており、これは何時間から何日もかかる。

単一細胞レベルで測定された表現型形質に基づいて、ＩＤ／ＡＳＴを加速するために、過去数年にわたって多くのシステムが出現した。これらのアッセイは、時には表面上に固定化されている細胞の形態と組み合わせた、増殖の測定に基づくことが依然として多い（４、５）。市販のシステムは以下を含む：
・Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ Ｐｈｅｎｏシステム（Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．ｃｏｍ）は単一細胞レベルの撮像を使用して、自動化された方法でＡＳＴのためのバイオマーカーとして形態的変化を測定する。蛍光ｉｎ‐ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、同じシステムにおけるＩＤに使用される。結果が出るまでの平均時間、はＩＤでは９０分、およびＡＳＴでは７時間であり、一般的に一晩のインキュベーションを必要とする陽性の血液培養から始まる。一方それは単一細胞撮像を使用しているが、この方法は形態変化を測定することに限定されており、表面に固定化された細胞にのみ適用可能である。
・ＱＭＡＣｄＲＡＳＴシステム（Ｑｕａｎｔａ Ｍａｔｒｉｘ、ｗｗｗ．ｑｕａｎｔａｍａｔｒｉｘ．ｃｏｍ）はマイクロ流体技術および単一細胞撮像を使用して、ＡＳＴのためのバイオマーカーとして形態的変化を測定する（４）。ＡＳＴの結果が出るまでの平均時間は、一般的に一晩のインキュベーションを必要とする陽性の血液培養から４時間である。この方法は固定化された（ゲルに包埋した）細胞に適用可能であり、病原体ＩＤについての事前の情報を必要とする。
・ＬｉｆｅＳｃａｌｅ ＡＳＴシステム（ＬｉｆｅＳｃａｌｅ、ｗｗｗ．ａｆｆｉｎｉｔｙｂｉｏ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｌｉｆｅｓｃａｌｅ．ｐｈｐ）はマイクロ流体技術を使用して、ＡＳＴのためのバイオマーカーとして細胞数や単一細胞量の変化を検出する。ビデオ顕微鏡はさらに単一細胞形態情報をもたらす。ＡＳＴの結果が出るまでの時間は、一般的に一晩のインキュベーションを必要とする陽性の血液培養からおよそ３～４時間である。この方法は病原体ＩＤについての事前の情報を必要とする。
・２１６ＤｘＵＴＩシステム（Ｂａｃｔｅｒｉｏｓｃａｎ、ｗｗｗ．ｂａｃｔｅｒｉｏｓｃａｎ．ｃｏｍ）は、レーザー散乱技術を使用して３時間のターンアラウンドタイムで、尿検体を陽性または陰性としてスクリーニングするために、懸濁液中の細菌の増殖を測定する。作製中であると宣伝されている他のシステム（２１６Ｒ ＡＳＴ）は、同じ技術をＡＳＴに拡張すると計画されているが、まだ開発中である。
・ｏＣｅｌｌｏＳｃｏｐｅシステム（ＢｉｏＳｅｎｓｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、ｗｗｗ．ｂｉｏｓｅｎｓｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．ｄｋ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／）は、迅速な増殖測定のために９６ウェルプレートのウェルの表面に取り付けられた細胞のタイムラプス撮像を使用している。増殖の変化をＡＳＴのためのバイオマーカーとして使用できる。
・ｍａｒｉＰＯＣおよびｍａｒｉＡＳＴシステム（Ａｒｃｄｉａ、ｗｗｗ．ａｒｃｄｉａ．ｃｏｍ／ｅｎｇ／）ラテックスマイクロビーズ上のイムノアッセイ結合反応で測定され、二光子励起蛍光光度法を用いて検出された、細菌増殖に基づくＩＤを提供する。このシステムは、少なくとも一晩のインキュベーション後に得られる陽性接種材料について、２０分でＩＤを、および２時間でＡＳＴを生じる。
・ｆＡＳＴｅｓｔシステム（６）は、Ｍｏｔｈｅｒ Ｍａｃｈｉｎｅ（７）と呼ばれる既知のマイクロ流体チップ設計を使用して、顕微鏡を用いて抗生物質の存在下で単一細胞増殖率を測定する。純粋な分離菌を含む細菌培養を使用すると、ＡＳＴの結果が出るまでの時間は３０分未満であり得る。この方法では、細菌が高度に密閉されたマイクロチャネル内に捕捉されている。この方法は病原体ＩＤについての事前の情報を必要とする。
・迅速なｄＬＡＭＰシステム（８）は、デジタルループ媒介等温増幅（ｄＬＡＭＰ）を使用して、臨床尿試料内のＥ．ｃｏｌｉの抗生物質感受性を測定する。この試験ではこの方法を「表現型」と表すが、評価はデジタル核酸定量に基づいている。ＡＳＴの結果が出るまでの時間は、臨床尿試料から３０分未満である。

他の市販の表現型の方法が存在する。
遺伝子型の方法に基づいてＡＳＴを加速するための他のシステムが提案され、これにより耐性遺伝子の検出が可能になる。他の、多数の遺伝子型の方法が存在する。

精子の生存率を試験するための、長い間知られ、使用されている他の方法は、形態、数、および運動性に基づいている。一例は、Ｇｒｅｅｎ（米国特許公開第２００７／０２９８４５４号）である。Ｋｉｎｇら、（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ： ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ‐ｔｈａｗｅｄ ｈｕｍａｎ ｓｐｅｒｍ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ、Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ、１９９７、６７巻、６号、１１４６～１１５１頁）は、精子の受精能力を評価するために、市販のシステムを使用して、抗生物質の存在下で４８時間にわたってインキュベートされた精子の運動性を分析した。

さらに、一連の文献は、運動性に及ぼす抗生物質の影響を扱っている。これらの大半は集団レベルの研究であり、いくつかの細菌種に対するいくつかの抗生物質の影響を実証している（９～１１）。これらの方法は、多くの場合古典的なディスク拡散運動性アッセイに基づいており、限定された識別力を有する（集団の外向きの動きのみが測定される、図１６）。少数の研究が単一細胞の方法を使用して、抗生物質の存在下で運動性を研究し、抗生物質曝露の生態学的意義に主に焦点を合わせてきた。Ｃｈｅｏｎｇら（１２）は、ホログラフィー顕微鏡法を使用して単一細胞運動性を画像化し、非常に高濃度のゲンタマイシン（１５ｍｇ／ｍＬ；ＣＬＳＩの感受性ブレークポイント濃度より４０００倍以上高い濃度）にＥ．ｃｏｌｉを曝露する単一の概念実証実験を提示した。生態学的試験では、Ｇｒａｆｆら（１３）はＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅを海洋中の競合細菌によって産生された抗生物質（アンドリミド）の勾配に曝露し、単一細胞撮像を使用して、高い抗生物質濃度の回避反応を示した。彼らは選択された遊泳運動学を定量した。異なる抗生物質濃度の比較は抗生物質勾配に沿って行われた。Ｈｏｌら（１４）は、Ｅ．ｃｏｌｉの単一細胞撮像を使用して、細菌が非常に高濃度（＞５×１０<９>細胞ｓ／ｍｌ、例えば、ＡＳＴに使用されるゴールドスタンダードブロス微量希釈アッセイでは、初期接種材料濃度は一般的に５×１０<５>ＣＦＵ／ｍｌである、ＣＦＵ＝コロニー形成ユニット）である場合に、細菌は抗生物質（カナマイシン）の状況でコロニー形成できることを示した。これらの筆者は、これらの高濃度の細菌が高濃度の抗生物質に向かって泳ぐことを実証した。
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他の実施態様もまた、以下の特許請求の範囲の範囲内である。

Claims (11)

1. 少なくとも１つの個体細菌を含有するヒト又は動物の身体試料を、２つの異なる濃度の抗生物質条件にさらすステップと、
   前記少なくとも１つの個体細菌の２つ以上のデジタル画像を連続する時点に取得するために、撮像装置を使用するステップと、
   前記少なくとも１つの個体細菌の軌跡データを決定するためにコンピュータによって画像を処理するステップと、
   前記少なくとも１つの個体細菌の軌跡データから運動性運動学データをコンピュータによって生成するステップと、
   コンピュータによって、抗生物質に対する細菌の感受性を決定するために、２つの異なる濃度の抗生物質条件について生成された運動性運動学データの差を比較するステップ、またはコンピュータによって、抗生物質に対する細菌の感受性を決定するために、２つの異なる濃度の抗生物質条件について生成された運動性運動学データを、１つの細菌の運動性運動学が抗生物質に曝露されるとどのように変化するかについて既知のデータベース内のデータと比較するステップ、
   を含む方法。
2. コンピュータによって、前記特徴付けられた運動性運動学データの統計的有意性を、単独で、または少なくとも1つの他の特徴と組み合わせて決定することを含む、請求項1に記載の方法。
3. 前記少なくとも１つの他の特徴は、２以上の細菌の数、形態的特徴、又は空間配置を含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記形態的特徴は、形状、アスペクト比、凸性、面積、サイズ、寸法、長軸方向、球面形状からの逸脱、または強度分布の１つ、または２つ以上の組合せを含み、および前記空間的配置は、分裂している細菌の空間的配置、個体細菌のクラスターの空間的配置、２つ以上の細菌の互いに対する位置、それらの１つもしくは複数の間の距離、特異的なクラスターの形成または前記細菌の鎖様クラスターの１つ、または２つ以上の組合せを含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記少なくとも１つの個体細菌の軌跡データを決定するための前記画像の前記処理は、（ａ）色、画素強度勾配、形状、アスペクト比、凸性、面積、サイズの閾値、水平位置と垂直位置、サイズ、強度、長軸の方向、球面形状からの逸脱、または強度の分布のうちの少なくとも１つに基づいて、画像内の細菌の位置を特定するステップ、および（ｂ）位置、位置の近さ、方向、速度、加速度、または探索半径のうちの少なくとも１つに基づいて、前記２つ以上の画像内に位置する同一細菌を結びつけることによって軌跡データを構築するステップを含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記少なくとも１つの個体細菌についての運動性運動学データの前記生成は、コンピュータによって、軌跡、軌跡の形状、速度、加速度、平均二乗変位、遊泳方向、旋回速度、旋回角度、旋回角度の時系列、拡散度、ネット対グロス変位比、曲率、運動性細胞の濃度、または運動性対非運動性細胞の比のうちの少なくとも１つを決定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記少なくとも１つの個体細菌を含有する試料の１つ、２つ、またはそれ以上のデジタル画像を連続する時点に取得するために、前記撮像装置を使用するステップであって、前記試料が、１つまたは複数の抗生物質を含有するステップと、
   前記試料中の個体細菌の１つ、２つ、またはそれ以上のデジタル画像を連続する時点より前の時点で取得するために、前記撮像装置を使用するステップであって、前記前の時
   点の前記試料が、異なる割合の抗生物質を含有し、または前記前の時点の前記試料が、前記抗生物質を含まないステップと、
   を含む、請求項１に記載の方法。
8. ２つ以上の試料の２つ以上のデジタル画像を同時に取得するために前記撮像装置を使用するステップであって、少なくとも１つの前記試料が、１つまたは複数の抗生物質を含有する、ステップと、
   ２つ以上の試料の２つ以上のデジタル画像を同時に取得するために前記撮像装置を使用するステップであって、少なくとも１つの前記試料が、異なる割合の抗生物質を含有し、または少なくとも１つの前記試料が、抗生物質もしくは他の抗菌剤を含有しない、ステップと、
   を含む、請求項１に記載の方法。
9. プレスクリーニングステップにおける運動性細菌の存在、非存在、または数を決定するステップを含む、請求項1に記載の方法。
10. 前記方法が前記細菌の抗生物質感受性の前記決定に有利に働くように、前記少なくとも１つの個体細菌の運動性を促進するように少なくとも１つの環境条件を変化させるステップを含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記少なくとも１つの個体細菌の抗生物質に対する感受性は、決定されるべき前記少なくとも１つの個体細菌の前記種または株の前記アイデンティティーを必要とせずに決定される、請求項１に記載の方法。

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