CN112651305B - 一种微生物种类的鉴别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种微生物种类的鉴定方法，本鉴定方法基于同一种类微生物形态的相似性以及不同种类微生物间形态的较大差异性，利用图像处理的手段提取和识别微生物的形态特征，根据不同参数的提取结果建立微生物种类随时间的综合鉴别函数模型，进行不同微生物种类的快速、有效鉴别，能够提供较高的微生物种类鉴别精度，又能够在较大程度上重复性的对微生物种类进行鉴别操作，并将鉴别结果存储和建库。

Description

一种微生物种类的鉴别方法
技术领域
本发明涉及一种微生物种类的鉴别方法。
背景技术
有益和有害的微生物存在于我们生活的各个角落，环境的不同会导致细菌、真菌等微生物的产生种类和数量也存在很大的差异，因此实现对微生物的鉴别和提取，对于有益微生物的提取、分离培养，对于有害微生物的去除杀灭和不同类型的广谱抗菌药物的生产，以及具有针对性的微生物研究，以及微生物在不同领域内产生作用和影响的研究都具有非常重要的实际意义。现今市面上具有较多的微生物鉴定设备和鉴定方法，主要有比色法、碳源利用法、荧光法等传统的微生物鉴别方法，以及核酸分子杂交方法、蛋白质分析方法、氨基酸顺序方法和血清学试验等现代微生物鉴别方法。传统的微生物鉴别方法是现有的主要微生物鉴别方法，通常是实验人员根据培养液中微生物的形态差异、培养液的浓度差异、培养液的颜色差异、微生物的酸碱度环境差异及不同类型微生物的荧光反映差异来进行人眼鉴别的，这种方法往往需要试验人员具有专业的知识储备，同时测量和鉴别的过程费时费力，有时由于环境的差异，主观人为判断标准的干扰和区别，往往使得同一微生物的鉴别结果产生较大的分歧；现代微生物鉴别方法是根据微生物的分子生物学指标差异进行核酸状况、蛋白质的类型和含量、氨基酸的顺序等进行比对和识别的，虽然这种方法识别精度很高，但是由于测量程序繁琐，测量仪器造价昂贵，往往只局限于在专业的医院或大型的科研实验室等领域应用，且受到实验环境，仪器设备和鉴别时间等因素的限制，普及的情况和程度较差。由于实验环境复杂，往往在培养过程中，微生物种类并不是唯一的，这就可能遇到包括观测和鉴别微生物过程中遇到的由于多种微生物重叠而无法准确识别，微生物早期由于形状相似而无法鉴别区分，形态相似的微生物因大小差异而无法准确识别，由于微生物的变异或观测人员知识储备欠缺等情况所导致某些微生物无法正确的识别或漏分等问题和现象。此外，通过实验人员人眼观察和鉴别微生物过程往往需要较高的专业领域知识，且微生物种类的鉴别过程非常消耗时间，处理过程往往成本较高，且鉴别微生物过程时间长，鉴别效率低下，难于进行批量处理，对于某一状态或发育状况下的微生物也难以进行重复性的观测。
发明内容
鉴于人工观测和鉴别微生物种类过程中所遇到的各种区分精度差，区分耗时且效率低下等问题，本发明的目的是提供一种微生物种类的鉴别方法，能够提供较高的微生物种类鉴别精度，又能够在较大程度上重复性的对微生物种类进行鉴别操作，并将鉴别结果存储和建库。
本发明所采用的技术如下：一种微生物种类的鉴别方法，步骤如下：
步骤1、微生物发育状况的标准化测量
根据培养皿的外边界的直径长度D1厘米作为边长，制作正方形黑白相间的正方形格网定标板，每个正方形的边长为2毫米，用于对数码相机拍照的结果进行几何畸变的校正，并计算单个像素的真实尺寸，在固定光照强度下进行相机的白平衡处理，设置并确定相机统一的曝光时间和光圈大小，然后将定标板放置在相机镜头的正下方，拍摄定标板相片作为标准化定标图像，选择微生物的发育过程中，每间隔半小时，记录一个时间节点t1，t2，t3…tn，分别对培养皿内不同微生物进行拍照作为发育过程中的微生物图像；
步骤2、微生物图像的前期标准化处理
针对不同时间节点拍摄的微生物图像和定标板图像，对图像内产生畸变的黑白格网线进行几何校正，建立多项式定标方程系数，将该定标方程作为标准几何定标公式，对不同微生物发育过程中的微生物图像进行统一的几何畸变校正，选择直径为N个像元的圆形裁剪框对几何校正过的微生物图像进行裁剪，获取标准化微生物图像，选择边长为N个像元的正方形裁剪框对标准化定标板图像，同时进一步裁剪一个格网大小，统计该格网区域的行号L和列号C，由于每个格网块是2×2平方毫米的正方形，计算像素的真实边长尺寸大小和真实面积大小；
步骤3、微生物种类鉴定指标参数的确定
在MATLAB软件中，读取某一时间节点ti下的标准微生物图像，其中i是每隔半小时记录的时间节点，i＝1,2,3…n，根据先验知识和经验，针对每一个待识别的微生物类，利用多边形矩形框选择并裁剪m个独立微生物体图像区域作为彩色训练样本Aj，其中，j是待鉴别微生物的训练样本编号，j＝1,2,3…m；针对在该特定时刻ti下待鉴别微生物类的所有彩色训练样本Aj，对每一个训练样本Aj裁剪固定大小的待鉴别微生物内部采样区域Sj，裁剪区域为边长为100像元的矩形区域，计算每个训练样本Aj对应的内部区域Sj内所有像元的红色分量值取算数平均作为该训练样本的红色分量Rj，计算每个训练样本Aj对应的内部区域Sj内所有像元的绿色分量值取算数平均作为该训练样本的绿色分量Gj，计算每个训练样本Aj对应的内部区域Sj内所有像元的蓝色分量值取算数平均作为该训练样本的蓝色分量Bj，利用公式1进一步对待鉴别微生物的所有训练样本进一步处理，得到该时刻ti下待鉴别微生物的颜色均值参数f1，利用公式2进一步对待鉴别微生物的所有训练样本进一步处理，得到该时刻ti下待鉴别微生物的颜色标准差参数f2，
对应不同的时间点ti建立待鉴别微生物的颜色均值参数随时间变化的函数f1(ti)和待鉴别微生物的颜色标准差参数随时间变化的函数f2(ti)
Figure BDA0002826793800000031
Figure BDA0002826793800000032
其中，
Figure BDA0002826793800000033
表示待鉴别微生物所有训练样本间个体红色分量提取结果的均值
Figure BDA0002826793800000034
Figure BDA0002826793800000035
表示待鉴别微生物所有训练样本间个体绿色分量提取结果的均值
Figure BDA0002826793800000036
Figure BDA0002826793800000037
表示待鉴别微生物所有训练样本间个体蓝色分量提取结果的均值
Figure BDA0002826793800000038
按照M＝(R+G+B)/3将该菌种在某一时刻ti的彩色训练样本图像Aj进行灰度转换，转换结果为Mj，通过统计灰度图像的灰度级分布，设置阈值参数对Mj进行二值化处理，处理结果为Ei，在二值化结果中，白色区域代表微生物体训练样本，黑色区域代表微生物的培养皿背景。
在MATLAB软件中，提取训练样本Aj内包含的完整微生物个体的所有白色像元总数Qj，利用像元个数Qj和每个像元面积T，计算该训练样本Aj内待鉴别微生物个体的面积Pj＝Qj×T，利用公式3进一步对待鉴别微生物的所有训练样本进一步处理，得到该时刻ti下待鉴别微生物的面积均值参数f3，利用公式4进一步对待鉴别微生物的所有训练样本进一步处理，得到该时刻ti下待鉴别微生物的面积标准差参数f4，对应不同的时间点ti建立待鉴别微生物的面积均值随时间变化的函数f3(ti)和待鉴别微生物的面积标准差随时间变化的函数f4(ti)
Figure BDA0002826793800000041
Figure BDA0002826793800000042
在MATLAB软件中识别待鉴定微生物类型在ti时刻下，训练样本二值化图像Ej中微生物白色区域在各个方向的长度，将最长方向的长度标记为Wj个像素个数，最长真实长度Xj＝Wj×U cm，最短方向的长度标记为Yj个像素个数，最短真实长度Zj＝Yj×U cm，计算微生物的长宽比作为该微生物训练样本的长宽比参数Vj＝Xj/Zj，利用公式5进一步对待鉴别微生物的所有训练样本进一步处理，得到该时刻ti下待鉴别微生物的长宽比均值参数f5，利用公式6进一步对待鉴别微生物的所有训练样本进一步处理，得到该时刻ti下待鉴别微生物的长宽比标准差参数f6，对应不同的时间点ti建立待鉴别微生物的长宽比均值参数随时间变化的函数f5(ti)和待鉴别微生物的长宽比标准差参数随时间的变化函数f6(ti)
Figure BDA0002826793800000043
Figure BDA0002826793800000044
步骤4、微生物种类的鉴别
微生物的发育过程中，每一个待鉴别微生物的颜色均值参数f1，每一个待鉴别微生物的颜色标准差参数f2，每一个待鉴别微生物的面积均值参数f3，每一个待鉴别微生物的面积标准差参数f4，每一个待鉴别微生物的长宽比均值参数f5以及每一个待鉴别微生物的长宽比标准差参数f6都有各自固定的变化范围；
f1(ti)函数的变化范围是当i＝1,2,3…n时，所有时刻下待鉴别微生物的颜色均值参数计算结果的最小值F1min到所有时刻下待鉴别微生物的颜色均值参数计算结果的最大值F1max，对应待鉴别微生物的颜色均值参数f1的变化区间就是[F1min,F1max]；
f2(ti)函数的变化范围是当i＝1,2,3…n时，所有时刻下待鉴别微生物的颜色标准差参数计算结果的最小值F2min到所有时刻下待鉴别微生物的颜色标准差参数计算结果的最大值F2max，对应待鉴别微生物的颜色标准差参数f2的变化区间就是[F2min,F2max]；
f3(ti)函数的变化范围是当i＝1,2,3…n时，所有时刻下待鉴别微生物的面积均值参数计算结果的最小值F3min到所有时刻下待鉴别微生物的面积均值参数计算结果的最大值F3max，对应待鉴别微生物的面积均值参数f3的变化区间就是[F3min,F3max]；
f4(ti)函数的变化范围是当i＝1,2,3…n时，所有时刻下待鉴别微生物的面积标准差参数计算结果的最小值F4min到所有时刻下待鉴别微生物的面积标准差参数计算结果的最大值F4max；
f5(ti)函数的变化范围是当i＝1,2,3…n时，所有时刻下待鉴别微生物的长宽比均值参数计算结果的最小值F5min到所有时刻下待鉴别微生物的长宽比均值参数计算结果的最大值F5max，对应待鉴别微生物的长宽比均值参数f5的变化区间就是[F5min,F5max]；
f6(ti)函数的变化范围是当i＝1,2,3…n时，所有时刻下待鉴别微生物的长宽比标准差参数计算结果的最小值F6min到所有时刻下待鉴别微生物的长宽比标准差参数计算结果的最大值F6max，对应待鉴别微生物的长宽比标准差参数f6的变化区间就是[F6min,F6max]；
对于多个微生物体和单个微生物体，具体微生物种类的鉴定步骤如下：
根据先验专家知识针对不同的微生物种类，对不同种类微生物的上述单个变化函数范围进行建库，同时针对每一种微生物类型确定鉴别函数模型：
F(ti)＝k1×f1(ti)+k2×f2(ti)+k3×f3(ti)+k4×f4(ti)+k5×f5(ti)+k6×f6(ti)，
并对每一种微生物类型的鉴别函数模型计算结果F(ti)进行建库，
其中k1表示该类型微生物体颜色均值参数f1的权重系数，
k2表示该类型微生物体颜色标准差参数f2的权重系数，
k3表示该类型微生物体面积均值参数f3的权重系数，
k4表示该类型微生物体面积标准差参数f4的权重系数，
k5表示该类型微生物体长宽比均值参数f5的权重系数，
k6表示该类型微生物体长宽比标准差参数f6的权重系数，在计算时保证每一种微生物f1，f2，f3，f4，f5，f6参数的权重系数满足归一化公式，即k1+k2+k3+k4+k5+k6＝1；
如果待鉴别微生物类型在发育过程中只有单一的微生物个体，则根据该微生物体颜色均值参数f1，根据该微生物体面积均值参数f3，根据该微生物体长宽比均值参数f5的分布范围进行数据库查找确定是否满足参数范围，同时验证鉴别待识别微生物是否满足鉴别函数F(ti)＝k1×f1(ti)+k3×f3(ti)+k5×f5(ti)，最后确定该微生物种类；
如果待鉴别微生物类型在发育过程中具有多个同类微生物个体，则根据该微生物体颜色均值参数f1，根据该微生物体颜色标准差参数f2，根据该微生物体面积均值参数f3，根据该微生物体面积标准差参数f4，根据该微生物体长宽比均值参数f5，根据该微生物体长宽比标准差参数f6的分布范围进行数据库查找确定是否满足参数范围，同时验证鉴别待识别微生物是否满足鉴别函数F(ti)＝k1×f1(ti)+k2×f2(ti)+k3×f3(ti)+k4×f4(ti)+k5×f5(ti)+k6×f6(ti)，最后确定该微生物的种类。
本发明突出的有益效果及优点：该方法基于同一种类微生物形态的相似性以及不同种类微生物间形态的较大差异性，利用图像处理的手段提取和识别微生物的形态特征并利用形态特征进行不同微生物种类的快速、有效鉴别。与比色法、碳源利用法、荧光法等传统的微生物鉴别方法在微生物发育的早期由于个体形态差异小，因此人眼鉴别效率低的劣势相比，本发明涉及的方法可以根据微生物发育过程中的各生长阶段形态参数对其进行鉴别，而不需要等待微生物发育到一定阶段后才可以进行识别，因此本发明涉及的微生物种类鉴别方法在鉴别时间的选择上相比于传统的微生物种类鉴别方法更加灵活，实用性更强，鉴别效率也更高；此外，与传统的微生物鉴别方法相比，而本发明涉及的微生物种类鉴别方法对鉴别人员的鉴别经验、技术背景和知识储备要求较低，可以更好的普及，且鉴别过程自动化水平高，可以有效地避免传统微生物种类鉴别方法出现的错分和漏分的现象。与根据微生物的分子生物学指标差异进行核酸状况、蛋白质的类型和含量、氨基酸的顺序等进行比对和识别的现代微生物种类鉴别方法相比，本发明涉及的微生物鉴别方法不需要昂贵的设备，设备占用空间小，对环境的要求也较低，因此可以保证在获取较高的鉴别精度下大大减少鉴别成本，因此应用范围和面对客户群体也更为广泛，此外本发明涉及的微生物种类鉴别方法本身操作难度更小，成本更低，也更容易普及。
附图说明
图1为本发明的实施例1的试验图；
图2为本发明的实施例1的细菌灰度图；
图3为本发明的实施例1的细菌红色分量图；
图4为本发明的实施例1的细菌绿色分量图；
图5为本发明的实施例1的细菌蓝色分量图；
图6为本发明的实施例1的细菌二值图。
具体实施方式
下面根据说明书附图举例对本发明做进一步说明：
实施例1
一种微生物种类的鉴别方法，步骤如下：
步骤1：如图1所示，试验设备包括试验台1，金属支架2、数码相机3、笔记本电脑4、格网定标板5和微生物培养皿6，测量培养皿的外边界的直径长度D1厘米，制作一个边长也为D1厘米的正方形定标板以保证正方形定标板的边界与圆形的培养皿相切，整个正方形定标板内部用2mm×2mm的边长绘制黑白相间的格网，该格网用于对数码相机拍照的结果进行几何畸变的校正，同时也用于对图像像素代表实际尺寸的定标。将金属支架固定在实验台上，再将数码相机安装在金属支架上，调整相机保证镜头垂直向下拍摄，设置相机的光圈大小，曝光时间，结合分光光度计调整并确定实验室内的光照强度，在该固定光照强度下进行相机的白平衡处理，然后将定标板放置在相机镜头的正下方，保证定标板的中心与相机镜头中心的垂直投影点相重合，拍摄定标板相片作为标准化定标图像，最后将培养皿放置在定标板上方，保证培养皿的圆心与定标板中心重合，从微生物培养的起始时刻开始，每间隔半小时，记录一个时间节点t1，t2，t3…tn，分别对培养皿内不同微生物进行拍照作，将拍照结果作为发育过程不同时间节点下的微生物图像。
步骤2：针对步骤1中待鉴别微生物类型在不同时间节点下的图像，对图像内产生畸变的黑白格网线进行几何校正，使所有格网线均互相垂直，完成对标准化定标图像的几何校正，同时记录用于该几何校正过程的多项式定标方程系数。由于定标板和微生物图像的拍照条件和拍照环境完全相同，因此微生物图像的几何形变与定标板图像也完全一致，根据这个特点，将利用定标板获取的定标方程作为标准几何定标公式，处理待鉴别微生物在发育过程中各时间节点下的微生物图像，实现对标准化微生物图像进行统一的几何畸变校正。记录几何校正后圆形微生物图像的直径对应的像元个数N，以N为直径设置一个圆形的裁剪框对几何校正过的微生物图像进行裁剪，获取标准化微生物图像；由于正方形的定标板制作时边长与微生物培养皿的直径相同，因此本步骤同样以像元个数N作为边长设置一个正方形裁剪框对标准化定标图像进行裁剪作为标准定标板图像，对标准定标板图像进一步裁剪一个格网大小，统计该格网区域的行号L和列号C，由于格网块是2mm×2mm的正方形，因此行号L与列号C相同，因此一个像素的真实边长尺寸大小U＝2/L，单位是mm，每个像素的真实面积为T＝4/L2，单位是mm2。
步骤3：在MATLAB软件中，读取某一时间节点ti下的标准微生物图像，其中i是每隔半小时记录的时间节点，i＝1,2,3…n，根据先验知识和经验，针对每一个待识别的微生物类，利用多边形矩形框选择并裁剪m个独立微生物体图像区域作为彩色训练样本Aj，其中，j是待鉴别微生物的训练样本编号，j＝1,2,3…m。针对在该特定时刻ti下待鉴别微生物类的所有彩色训练样本Aj，对每一个训练样本Aj裁剪固定大小的待鉴别微生物内部采样区域Sj，裁剪区域为边长为100像元的矩形区域，计算每个训练样本Aj对应的内部区域Sj内所有像元的红色分量值取算数平均作为该训练样本的红色分量Rj，计算每个训练样本Aj对应的内部区域Sj内所有像元的绿色分量值取算数平均作为该训练样本的绿色分量Gj，计算每个训练样本Aj对应的内部区域Sj内所有像元的蓝色分量值取算数平均作为该训练样本的蓝色分量Bj，利用公式1进一步对待鉴别微生物的所有训练样本进一步处理，得到该时刻ti下待鉴别微生物的颜色均值参数f1，利用公式2进一步对待鉴别微生物的所有训练样本进一步处理，得到该时刻ti下待鉴别微生物的颜色标准差参数f2，
对应不同的时间点ti建立待鉴别微生物的颜色均值参数随时间变化的函数f1(ti)和待鉴别微生物的颜色标准差参数随时间的变化函数f2(ti)
Figure BDA0002826793800000081
Figure BDA0002826793800000082
其中，
Figure BDA0002826793800000091
表示待鉴别微生物所有训练样本间个体红色分量提取结果的均值
Figure BDA0002826793800000092
Figure BDA0002826793800000093
表示待鉴别微生物所有训练样本间个体绿色分量提取结果的均值
Figure BDA0002826793800000094
Figure BDA0002826793800000095
表示待鉴别微生物所有训练样本间个体蓝色分量提取结果的均值
Figure BDA0002826793800000096
按照M＝(R+G+B)/3将该菌种在某一时刻ti的彩色训练样本图像Aj进行灰度转换，转换结果为Mj，通过统计灰度图像的灰度级分布，设置阈值参数对Mj进行二值化处理，处理结果为Ei，如图6所示，在二值化结果中，白色区域代表微生物体训练样本，黑色区域代表微生物的培养皿背景。
在MATLAB软件中，提取训练样本Aj内包含的完整微生物个体的所有白色像元总数Qj，利用像元个数Qj和每个像元面积T，计算该训练样本Aj内待鉴别微生物个体的面积Pj＝Qj×T，利用公式3进一步对待鉴别微生物的所有训练样本进一步处理，得到该时刻ti下待鉴别微生物的面积均值参数f3，利用公式4进一步对待鉴别微生物的所有训练样本进一步处理，得到该时刻ti下待鉴别微生物的面积标准差参数f4，
对应不同的时间点ti建立待鉴别微生物的面积均值随时间变化的函数f3(ti)和待鉴别微生物的面积标准差随时间的变化函数f4(ti)
Figure BDA0002826793800000097
Figure BDA0002826793800000098
在MATLAB软件中识别待鉴定微生物类型在ti时刻下，训练样本二值化图像Ej中微生物白色区域在各个方向的长度，将最长方向的长度标记为Wj个像素个数，最长真实长度Xj＝Wj×U cm，最短方向的长度标记为Yj个像素个数，最短真实长度Zj＝Yj×U cm，计算微生物的长宽比作为该微生物训练样本的长宽比参数Vj＝Xj/Zj，利用公式5进一步对待鉴别微生物的所有训练样本进一步处理，得到该时刻ti下待鉴别微生物的长宽比均值参数f5，利用公式6进一步对待鉴别微生物的所有训练样本进一步处理，得到该时刻ti下待鉴别微生物的长宽比标准差参数f6，对应不同的时间点ti建立待鉴别微生物的长宽比均值参数随时间变化的函数f5(ti)和待鉴别微生物的长宽比标准差参数随时间的变化函数f6(ti)
Figure BDA0002826793800000101
Figure BDA0002826793800000102
步骤4：在微生物的发育过程中，每一个待鉴别微生物的颜色均值参数f1，每一个待鉴别微生物的颜色标准差参数f2，每一个待鉴别微生物的面积均值参数f3，每一个待鉴别微生物的面积标准差参数f4，每一个待鉴别微生物的长宽比均值参数f5以及每一个待鉴别微生物的长宽比标准差参数f6都有各自固定的变化范围。
f1(ti)函数的变化范围是当i＝1,2,3…n时，所有时刻下待鉴别微生物的颜色均值参数计算结果的最小值F1min到所有时刻下待鉴别微生物的颜色均值参数计算结果的最大值F1max，对应待鉴别微生物的颜色均值参数f1的变化区间就是[F1min,F1max]；
f2(ti)函数的变化范围是当i＝1,2,3…n时，所有时刻下待鉴别微生物的颜色标准差参数计算结果的最小值F2min到所有时刻下待鉴别微生物的颜色标准差参数计算结果的最大值F2max，对应待鉴别微生物的颜色标准差参数f2的变化区间就是[F2min,F2max]；
f3(ti)函数的变化范围是当i＝1,2,3…n时，所有时刻下待鉴别微生物的面积均值参数计算结果的最小值F3min到所有时刻下待鉴别微生物的面积均值参数计算结果的最大值F3max，对应待鉴别微生物的面积均值参数f3的变化区间就是[F3min,F3max]；
f4(ti)函数的变化范围是当i＝1,2,3…n时，所有时刻下待鉴别微生物的面积标准差参数计算结果的最小值F4min到所有时刻下待鉴别微生物的面积标准差参数计算结果的最大值F4max；
f5(ti)函数的变化范围是当i＝1,2,3…n时，所有时刻下待鉴别微生物的长宽比均值参数计算结果的最小值F5min到所有时刻下待鉴别微生物的长宽比均值参数计算结果的最大值F5max，对应待鉴别微生物的长宽比均值参数f5的变化区间就是[F5min,F5max]；
f6(ti)函数的变化范围是当i＝1,2,3…n时，所有时刻下待鉴别微生物的长宽比标准差参数计算结果的最小值F6min到所有时刻下待鉴别微生物的长宽比标准差参数计算结果的最大值F6max，对应待鉴别微生物的长宽比标准差参数f6的变化区间就是[F6min,F6max]。
因此可以根据不同参数的提取结果建立微生物种类随时间的综合鉴别函数模型：如果待鉴定微生物类型具有多个微生物体，可以针对该待鉴定微生物类型的每个微生物体选择一个训练样本，因此针对多个微生物体，f1，f2，f3，f4，f5，f6六个参数都可以用于该微生物的鉴定。如果待鉴定微生物类型只有单个微生物体，只能针对该待鉴定微生物类型的单个微生物体选择唯一训练样本，训练样本个数的最大值m＝1，因此反映不同训练样本间均值类型的参数f1，f3，f5等于这个唯一的训练样本在该时刻下f1，f3，f5三个参数的计算结果本身，而标准差类型的参数f2，f4，f6均为0，这表明只有f1，f3，f5三个参数可以用于该微生物种类的鉴定。
对于多个微生物体和单个微生物体，具体微生物种类的鉴定步骤如下：
根据先验专家知识针对不同的微生物种类，对不同种类微生物的上述单个变化函数范围进行建库，同时针对每一种微生物类型确定鉴别函数模型F(ti)＝k1×f1(ti)+k2×f2(ti)+k3×f3(ti)+k4×f4(ti)+k5×f5(ti)+k6×f6(ti)，并对每一种微生物类型的鉴别函数模型计算结果F(ti)进行建库，其中k1表示该类型微生物体颜色均值参数f1的权重系数，k2表示该类型微生物体颜色标准差参数f2的权重系数，k3表示该类型微生物体面积均值参数f3的权重系数，k4表示该类型微生物体面积标准差参数f4的权重系数，k5表示该类型微生物体长宽比均值参数f5的权重系数，k6表示该类型微生物体长宽比标准差参数f6的权重系数，不同类型微生物体，f1，f2，f3，f4，f5，f6参数的作用不同，因此不同类型微生物f1，f2，f3，f4，f5，f6参数的权重系数k1，k2，k3，k4，k5，k6也是不同的，为了便于在统一标准下量化不同参数的贡献，在计算时保证每一种微生物f1，f2，f3，f4，f5，f6参数的权重系数满足归一化公式，即k1+k2+k3+k4+k5+k6＝1。在实际应用中，就可以针对不同发育状况对应的时间下，通过获取标准化微生物图像对微生物种类进行识别，
如果待鉴别微生物类型在发育过程中只有单一的微生物个体，则根据该微生物体颜色均值参数f1，根据该微生物体面积均值参数f3，根据该微生物体长宽比均值参数f5的分布范围进行数据库查找确定是否满足参数范围，同时验证鉴别待识别微生物是否满足鉴别函数F(ti)＝k1×f1(ti)+k3×f3(ti)+k5×f5(ti)，最后确定该微生物种类；
如果待鉴别微生物类型在发育过程中具有多个同类微生物个体，则根据该微生物体颜色均值参数f1，根据该微生物体颜色标准差参数f2，根据该微生物体面积均值参数f3，根据该微生物体面积标准差参数f4，根据该微生物体长宽比均值参数f5，根据该微生物体长宽比标准差参数f6的分布范围进行数据库查找确定是否满足参数范围，同时验证鉴别待识别微生物是否满足鉴别函数F(ti)＝k1×f1(ti)+k2×f2(ti)+k3×f3(ti)+k4×f4(ti)+k5×f5(ti)+k6×f6(ti)，最后确定该微生物的种类。

Claims (1)

1.一种微生物种类的鉴别方法，其特征在于，方法步骤如下：
步骤1、微生物发育状况的标准化测量
根据培养皿的外边界的直径长度D1厘米作为边长，制作正方形黑白相间的正方形格网定标板，每个正方形的边长为2毫米，用于对数码相机拍照的结果进行几何畸变的校正，并计算单个像素的真实尺寸，在固定光照强度下进行相机的白平衡处理，设置并确定相机统一的曝光时间和光圈大小，然后将定标板放置在相机镜头的正下方，拍摄定标板相片作为标准化定标图像，选择微生物的发育过程中，每间隔半小时，记录一个时间节点t1，t2，t3…tn，分别对培养皿内不同微生物进行拍照作为发育过程中的微生物图像；
步骤2、微生物图像的前期标准化处理
针对不同时间节点拍摄的微生物图像和定标板图像，对图像内产生畸变的黑白格网线进行几何校正，建立多项式定标方程系数，将该定标方程作为标准几何定标公式，对不同微生物发育过程中的微生物图像进行统一的几何畸变校正，选择直径为N个像元的圆形裁剪框对几何校正过的微生物图像进行裁剪，获取标准化微生物图像，选择边长为N个像元的正方形裁剪框对标准化定标板图像，同时进一步裁剪一个格网大小，统计该格网区域的行号L和列号C，由于每个格网块是2×2平方毫米的正方形，计算像素的真实边长尺寸大小和真实面积大小；
步骤3、微生物种类鉴定指标参数的确定
在MATLAB软件中，读取某一时间节点ti下的标准微生物图像，其中i是每隔半小时记录的时间节点，i＝1,2,3…n，根据先验知识和经验，针对每一个待识别的微生物类，利用多边形矩形框选择并裁剪m个独立微生物体图像区域作为彩色训练样本Aj，其中，j是待鉴别微生物的训练样本编号，j＝1,2,3…m；针对在该特定时刻ti下待鉴别微生物类的所有彩色训练样本Aj，对每一个训练样本Aj裁剪固定大小的待鉴别微生物内部采样区域Sj，裁剪区域为边长为100像元的矩形区域，计算每个训练样本Aj对应的内部区域Sj内所有像元的红色分量值取算数平均作为该训练样本的红色分量Rj，计算每个训练样本Aj对应的内部区域Sj内所有像元的绿色分量值取算数平均作为该训练样本的绿色分量Gj，计算每个训练样本Aj对应的内部区域Sj内所有像元的蓝色分量值取算数平均作为该训练样本的蓝色分量Bj，利用公式1进一步对待鉴别微生物的所有训练样本进一步处理，得到该时刻ti下待鉴别微生物的颜色均值参数f1，利用公式2进一步对待鉴别微生物的所有训练样本进一步处理，得到该时刻ti下待鉴别微生物的颜色标准差参数f2，
对应不同的时间点ti建立待鉴别微生物的颜色均值参数随时间变化的函数f1(ti)和待鉴别微生物的颜色标准差参数随时间变化的函数f2(ti)
Figure FDA0002826793790000021
Figure FDA0002826793790000022
其中，
Figure FDA0002826793790000023
表示待鉴别微生物所有训练样本间个体红色分量提取结果的均值
Figure FDA0002826793790000024
Figure FDA0002826793790000025
表示待鉴别微生物所有训练样本间个体绿色分量提取结果的均值
Figure FDA0002826793790000026
Figure FDA0002826793790000027
表示待鉴别微生物所有训练样本间个体蓝色分量提取结果的均值
Figure FDA0002826793790000028
按照M＝(R+G+B)/3将菌种在某一时刻ti的彩色训练样本图像Aj进行灰度转换，转换结果为Mj，通过统计灰度图像的灰度级分布，设置阈值参数对Mj进行二值化处理，处理结果为Ei，在二值化结果中，白色区域代表微生物体训练样本，黑色区域代表微生物的培养皿背景；
在MATLAB软件中，提取训练样本Aj内包含的完整微生物个体的所有白色像元总数Qj，利用像元个数Qj和每个像元面积T，计算该训练样本Aj内待鉴别微生物个体的面积Pj＝Qj×T，利用公式3进一步对待鉴别微生物的所有训练样本进一步处理，得到该时刻ti下待鉴别微生物的面积均值参数f3，利用公式4进一步对待鉴别微生物的所有训练样本进一步处理，得到该时刻ti下待鉴别微生物的面积标准差参数f4，对应不同的时间点ti建立待鉴别微生物的面积均值随时间变化的函数f3(ti)和待鉴别微生物的面积标准差随时间变化的函数f4(ti)
Figure FDA0002826793790000029
Figure FDA0002826793790000031
在MATLAB软件中识别待鉴定微生物类型在ti时刻下，训练样本二值化图像Ej中微生物白色区域在各个方向的长度，将最长方向的长度标记为Wj个像素个数，最长真实长度Xj＝Wj×U cm，最短方向的长度标记为Yj个像素个数，最短真实长度Zj＝Yj×U cm，计算微生物的长宽比作为该微生物训练样本的长宽比参数Vj＝Xj/Zj，利用公式5进一步对待鉴别微生物的所有训练样本进一步处理，得到该时刻ti下待鉴别微生物的长宽比均值参数f5，利用公式6进一步对待鉴别微生物的所有训练样本进一步处理，得到该时刻ti下待鉴别微生物的长宽比标准差参数f6，对应不同的时间点ti建立待鉴别微生物的长宽比均值参数随时间变化的函数f5(ti)和待鉴别微生物的长宽比标准差参数随时间的变化函数f6(ti)
Figure FDA0002826793790000032
Figure FDA0002826793790000033
步骤4、微生物种类的鉴别
微生物的发育过程中，每一个待鉴别微生物的颜色均值参数f1，每一个待鉴别微生物的颜色标准差参数f2，每一个待鉴别微生物的面积均值参数f3，每一个待鉴别微生物的面积标准差参数f4，每一个待鉴别微生物的长宽比均值参数f5以及每一个待鉴别微生物的长宽比标准差参数f6都有各自固定的变化范围；
f1(ti)函数的变化范围是当i＝1,2,3…n时，所有时刻下待鉴别微生物的颜色均值参数计算结果的最小值F1min到所有时刻下待鉴别微生物的颜色均值参数计算结果的最大值F1max，对应待鉴别微生物的颜色均值参数f1的变化区间就是[F1min,F1max]；
f2(ti)函数的变化范围是当i＝1,2,3…n时，所有时刻下待鉴别微生物的颜色标准差参数计算结果的最小值F2min到所有时刻下待鉴别微生物的颜色标准差参数计算结果的最大值F2max，对应待鉴别微生物的颜色标准差参数f2的变化区间就是[F2min,F2max]；
f3(ti)函数的变化范围是当i＝1,2,3…n时，所有时刻下待鉴别微生物的面积均值参数计算结果的最小值F3min到所有时刻下待鉴别微生物的面积均值参数计算结果的最大值F3max，对应待鉴别微生物的面积均值参数f3的变化区间就是[F3min,F3max]；
f4(ti)函数的变化范围是当i＝1,2,3…n时，所有时刻下待鉴别微生物的面积标准差参数计算结果的最小值F4min到所有时刻下待鉴别微生物的面积标准差参数计算结果的最大值F4max；
f5(ti)函数的变化范围是当i＝1,2,3…n时，所有时刻下待鉴别微生物的长宽比均值参数计算结果的最小值F5min到所有时刻下待鉴别微生物的长宽比均值参数计算结果的最大值F5max，对应待鉴别微生物的长宽比均值参数f5的变化区间就是[F5min,F5max]；
f6(ti)函数的变化范围是当i＝1,2,3…n时，所有时刻下待鉴别微生物的长宽比标准差参数计算结果的最小值F6min到所有时刻下待鉴别微生物的长宽比标准差参数计算结果的最大值F6max，对应待鉴别微生物的长宽比标准差参数f6的变化区间就是[F6min,F6max]；
对于多个微生物体和单个微生物体，具体微生物种类的鉴定步骤如下：
根据先验专家知识针对不同的微生物种类，对不同种类微生物的上述单个变化函数范围进行建库，同时针对每一种微生物类型确定鉴别函数模型：
F(ti)＝k1×f1(ti)+k2×f2(ti)+k3×f3(ti)+k4×f4(ti)+k5×f5(ti)+k6×f6(ti)，
并对每一种微生物类型的鉴别函数模型计算结果F(ti)进行建库，
其中k1表示该类型微生物体颜色均值参数f1的权重系数，
k2表示该类型微生物体颜色标准差参数f2的权重系数，
k3表示该类型微生物体面积均值参数f3的权重系数，
k4表示该类型微生物体面积标准差参数f4的权重系数，
k5表示该类型微生物体长宽比均值参数f5的权重系数，
k6表示该类型微生物体长宽比标准差参数f6的权重系数，在计算时保证每一种微生物f1，f2，f3，f4，f5，f6参数的权重系数满足归一化公式，即k1+k2+k3+k4+k5+k6＝1；
如果待鉴别微生物类型在发育过程中只有单一的微生物个体，则根据该微生物体颜色均值参数f1，根据该微生物体面积均值参数f3，根据该微生物体长宽比均值参数f5的分布范围进行数据库查找确定是否满足参数范围，同时验证鉴别待识别微生物是否满足鉴别函数F(ti)＝k1×f1(ti)+k3×f3(ti)+k5×f5(ti)，最后确定该微生物种类；
如果待鉴别微生物类型在发育过程中具有多个同类微生物个体，则根据该微生物体颜色均值参数f1，根据该微生物体颜色标准差参数f2，根据该微生物体面积均值参数f3，根据该微生物体面积标准差参数f4，根据该微生物体长宽比均值参数f5，根据该微生物体长宽比标准差参数f6的分布范围进行数据库查找确定是否满足参数范围，同时验证鉴别待识别微生物是否满足鉴别函数F(ti)＝k1×f1(ti)+k2×f2(ti)+k3×f3(ti)+k4×f4(ti)+k5×f5(ti)+k6×f6(ti)，最后确定该微生物的种类。
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