CN108827887B - 一种商陆基因组大小估计方法及基因组大小测量系统 - Google Patents

Abstract

本发明属于电光特性技术领域，公开了一种商陆基因组大小估计方法及基因组大小测量系统，包括制备装片；观察使用Leica DME显微镜，拍照数码相机微距模式，拍照，编号；选取细胞标准，染色体数目完整，染色体清晰，单色彩像素密度不超过250，染色体重叠区面积不超过5％；测量选取绿色光通道，对每一条染色体进行分割；再用驱除噪声工具减少误选；对所有分割后的染色体，使用选取目标工具，使计算机记录所有选中目标；计算包括积分光密度在内的所有有关数值，导出结果excel表格，保存分割后的图像结果；每个种都测量20张满足标准的照片；同时，在同一张图片上选取染色体周围的狭小区域进行同样分割，导出本底光密度表格。

Description

一种商陆基因组大小估计方法及基因组大小测量系统

技术领域

本发明属于电光特性技术领域，尤其涉及一种商陆基因组大小估计方法及基因组大小测量系统。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：随着模式植物的研究的不断深入和对基因组复杂性的认识的深入，人们起初认为生物越高等基因组越大的观点受到了严重的挑战。我们简单的用模式植物来代表所有植物的基因组的情况的设想越来越无法实现。每一个植物都有它自己独特的基因，虽然他们功能没有太多的变化，而基因的大小却有着很大的不同，即使在同一物种的不同个体之间，基因变异也是非常常见的现象。不研究每一个植物的基因组的具体情况，将无法准确的说明每一种植物的基因的变化和基因之间的差异。所以对每一种植物与人们的生活密切相关的基因进行研究是未来植物基因组研究的主要方向。要研究每一种植物的基因组的具体情况，对植物的基因组的大小进行估计是开展研究工作的一个重要步骤，也是对研究工作的安排有着重要意义的工作。植物细胞中，未复制的单倍体或配子体的核DNA含量称为C值，而C值在二倍体植物里相当于基因组大小，单位为pg或Mbp，而1pg相当于978Mb。迄今为止，已建立起含有4427种被子植物的DNA-C值数据库。人们起初认为生物体越复杂，进化程度越高，其基因组应该越大。然而，20多年间研究结果却并不是这样，人们称这种现象为C值矛盾。后来的研究表明，非编码DNA是导致物种间基因组大小差异的主要原因。因此，2003年，人们用“C值谜”替代了“C值矛盾”。在1948年就第一个详细测量了核DNA含量，比沃森和克里克确定DNA 分子结构还早几年。基因组大小的变化非常重要，尤其在基因组结构和进化的细节分析中更凸显其重要性，基因组序列分析工程将依赖于基因组大小的知识。具体有以下几个用途：1作为AFLP引物中选择性碱基个数确定的依据。若基因组较大，则选择性碱基相应地增加。2同一物种的基因组大小是稳定的，是各个物种固有的特征参数。对基因组大小(即染色体组大小)的评价就可以为物种的系统进化、分类和遗传等研究提供客观的证据。3与微卫星的扩增效率相关。主要是由于大的基因组稀释了靶位点在基因组中所占的比例，致使引物与靶位点结合的几率降低。既然基因组大小在许多生物领域里被应用，那么这种方法就应当简便易行，且成本低廉。目前，基因组大小测量方法主要分为显微分光光密度测量法和流式细胞仪法两种。显微分光光密度法，由于在生命科学领域应用有限，仪器昂贵，而且显微分光光密度对均匀的液体测量是快速准确的，而对于细胞这种不均匀的液体用该仪器的测量也是比较难的，因此应用越来越少；流式细胞仪法实验过程复杂，需要细胞悬液，植物细胞因有细胞壁，制备细胞悬液难度大。流式细胞仪用荧光染料染色，不论用PI(碘化丙啶)还是用DAPI (4，4，6-二脒基二苯基吲哚)染色，都是和DNA上的碱基对结合，如果特定的碱基对所占比例发生变化，就会造成DNA含量测定的不准确。尽管使用显微分光光密度测量法的趋势在减少，但是流式细胞仪技术也不能代替显微分光光密度测量法，流式细胞仪对于特定动物的细胞的DNA的含量的测定具有快速准确的特点，而对于植物的DNA含量的测定是太复杂，而且有一定的误差。因为使用流式细胞仪时是看不到细胞核的，染色体数目必须另行细胞学分析，而且流式细胞仪价格不菲，不符合低成本要求；而显微分光光密度测量法可以在同一张玻片上，同时估计C值并检查染色体数目及其倍性，目前国际上流行用软件与显微镜成像系统配合测量。曾有人用扫描显微镜光度计做过，但是扫描显微镜光度计价格昂贵，在生物方面又没有其他的应用，所以极少在普通高校或科研院所见到它。除此之外，国内目前还没有详细介绍利用显微分光光密度测量法的报道，主要原因生命科学研究机构没有显微分光光密度仪。显微分光光密度测量法依赖于简单的物理原理，就是染色量直接与DNA数量成比例，染色量本身决定光吸收量。但是，吸光率(OD)是不能直接测量的，而是由光通过物体的量来代替。在理想条件下，光通过单一溶液的量，是与溶液的浓度和厚度成比例的(lambert-beer定理)。但是单一点密度测量忽视了不同核物质间的大小变化，这样就需要测量一系列点密度来覆盖整个要测量的区域。单个点的光密度总和称为积分光密度(IOD)。计算机软件单通道分析一张染色核的彩色数码相片，可以处理成单一线性像素刻度，从而形成深浅不同的单像素色彩点，像素密度在0-255区间。切割测量这些点，得到：

n＝染色体像素总数；

IFi＝前景密度(染色体)像素；

IBi＝背景密度(背景区域)像素；

测量未知物种的核IOD的平均值，与已知标准物的核IOD的平均值相比，即得到结论。

CVu＝C-value未知物种；

CVs＝C-value标准物种；

IODu＝平均值IOD未知物种；

IODs＝平均值IOD标准物种；

有人建议说需要在未知物种的同一载玻片上放置标准细胞作为内参。其实并不是必要的，只要标准物种和未知物种的细胞选取的标准和时期一致就可以了。

综上所述，现有技术存在的问题是：现有的基因组大小测量方法使用成本较高。

解决上述技术问题的难度和意义：进行DNA含量的测量在进行完全测序之前都是经过对DNA含量的间接估计来实现，以前所使用的方法在技术上都需要昂贵的仪器。本发明通过显微光学特性进行DNA含量计算的方法。DNA-C值的研究是植物分子生物学研究的基础资料，也是植物进化研究的一个重要的方面。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种商陆基因组大小估计方法及基因组大小测量系统。

本发明是这样实现的，一种商陆基因组大小估计方法，通过染色体聚缩后经苯酚品红染色，通常不发生过染，染色体不重叠时颜色不会达到饱和的特点来设计，通过对被测材料的染色体IOD值的测量，同时测量已知材料的染色体的IOD值，通过计算得出被测材料的DNA含量。所有的计算过程由计算机完成，使用显微镜所带的分析软件进行分析计算。所述商陆基因组大小估计方法包括以下步骤：

步骤一，将材料种子洗净，在培养皿中铺浸湿的滤纸，种子分散在上，26℃温箱，每天换水2次，2-3天后胚根长出；1-2cm时，取根尖，用0.004mol/L浓度的8-羟基喹啉溶液处理4小时，双蒸水洗2次，放入卡诺固定液，固定2-24 小时，双蒸水洗2次，70％酒精中暂存，1mol/L HCl于58-60℃水浴中解离10min，双蒸水洗2次；

步骤二，用3g碱性品红溶于70％乙醇100ml备用，取10ml与90ml的5％苯酚水溶液混匀，再从中取55ml，加入冰醋酸6ml，甲醛溶液6ml；配制成染色液时取20ml，加入45％冰醋酸30ml，染色15min，同时放入双蒸水中备用，室温晾干，用中性树胶封片，待测；

步骤三，观察使用Leica DME显微镜，物镜100×/1.25oil，目镜10×/18，光圈100×；拍照数码相机微距模式，焦距32-38毫米，F值5.1，曝光时间1/28-38， ISO速度ISO-100，拍照，编号；

步骤四，测量选取绿色光通道，使用分割工具，具体分割过程由电脑控制，对每一条染色体进行分割，保证每条染色体不因边缘大造成总的OD值偏大；染色体分割是指将染色体边缘进行描画成一个封闭的图形，与周围的背景分开，以便确定染色体的投影面积，进行积分光密度的计算。再用驱除噪声工具减少由于本底存在而造成的误选；对所有分割后的染色体，使用选取目标工具，使计算机记录所有选中目标；最后，用“计算”工具计算包括积分光密度在内的所有有关数值，导出结果excel表格，保存分割后的图像结果；

步骤五，每个种都测量20张满足标准的照片；同时，在同一张图片上选取染色体周围的狭小区域进行同样分割，导出本底光密度表格。在选取所有的染色体时，染色体的颜色深度是不饱和的，细胞质等所染的颜色会增加染色体的 IOD值，导出本底光密度后，从染色体的同等面积的IOD值减去本底光密度值，就使得染色体的IOD值更准确地反映DNA的含量。

进一步，所述8-羟基喹啉溶液的浓度是0.004mol/L,处理时间是4小时。

进一步，在Excel里汇总数据，算出其平均值、标准差和相对误差，做出图表；手动去本底的IOD值＝(染色体平均OD值-本底平均OD值)*染色体面积。

本发明的另一目的在于提供一种应用所述商陆基因组大小估计方法的基因组大小测量系统。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：成本低，不需要专门购置专用仪器，方法简单，易于掌握，结果与用其他方法所得结果相同。可以在研究染色体核型时完成，特别适合于植物基因组大小的测定。

附图说明

图1是本发明实施例提供的商陆基因组大小估计方法方法流程图。

图2是本发明实施例提供的商陆积分光密度雷达图。

图3是本发明实施例提供的大豆积分光密度雷达图。

图4是本发明实施例提供的商陆染色体示意图。

图5是本发明实施例提供的大豆染色体示意图。

图6是本发明实施例提供的散点图。

图7是本发明实施例提供的商陆两种IOD值比较示意图。

图8是本发明实施例提供的大豆两种IOD值比较示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

如图1所示，本发明实施例提供的商陆基因组大小估计方法包括以下步骤：

S101：将材料种子洗净，在培养皿中铺浸湿的滤纸，种子分散在上，26℃温箱，每天换水2次，2-3天后胚根长出。约1-2cm时，取根尖，用0.004mol/L8- 羟基喹啉溶液处理4小时，双蒸水洗2次，放入卡诺固定液(无水乙醇：冰醋酸＝3：1)，固定2-24小时，双蒸水洗2次，70％酒精中暂存，1mol/L HCl于58-60℃水浴中解离10min，双蒸水洗2次；

S102：用3g碱性品红溶于70％乙醇100ml备用，取10ml与90ml的5％苯酚水溶液混匀，再从中取55ml，加入冰醋酸6ml，甲醛溶液6ml。配制成染色液时取20ml，加入45％冰醋酸30ml，染色15min，同时放入双蒸水中备用，室温晾干，用中性树胶封片，待测；

S103：观察使用Leica DME显微镜，物镜100×/1.25oil，目镜10×/18，光圈100×；拍照数码相机微距模式，焦距32-38毫米，F值5.1，曝光时间1/28-38， ISO速度ISO-100，拍照，编号；

S104：测量选取绿色光通道，使用“分割”工具，具体分割过程由电脑控制，对每一条染色体进行分割；再用“驱除噪声”工具减少由于本底存在而造成的误选；对所有分割后的染色体，使用“选取目标”工具，使计算机记录所有选中目标；最后，用“计算”工具计算包括积分光密度在内的所有有关数值，导出结果excel 表格，保存分割后的图像结果；

S105：每个种都测量20张满足标准的照片。同时，在同一张图片上选取染色体周围的狭小区域进行同样分割，导出本底光密度表格。

下面结合实验对本发明的应用原理作进一步的描述。

1材料与方法

1.1材料

商陆(Phytolacca americana)：北京中关村热物理所院内野生

大豆(Glycine max)：购买自山东嘉祥秋收种业公司的合豆5号

1.2过程与方法

1.2.1制备装片

将上述材料种子洗净，在培养皿中铺浸湿的滤纸，种子分散在上，26℃温箱，每天换水2次，2-3天后胚根长出。约1-2cm时，取根尖，用8-羟基喹啉处理4小时，双蒸水洗2次，放入卡诺固定液(无水乙醇：冰醋酸＝3：1)，固定 2-24小时，双蒸水洗2次，70％酒精中暂存，1mol/L HCl于58-60℃水浴中解离10min，双蒸水洗2次，此时根尖非常脆弱，拨弄时要小心。用3g碱性品红溶于70％乙醇100ml备用，取10ml与90ml的5％苯酚水溶液混匀，再从中取55ml，加入冰醋酸6ml，甲醛溶液6ml。配制成染色液时取20ml，加入45％冰醋酸30ml，染色15min，同时放入双蒸水中备用。将染色根尖压片，压片时尽量将细胞分散开，便于观察。然后液氮中冰冻，冻后快速揭片，揭片时用刀片在四周各划一下，再轻轻一碰，盖玻片就不会碎裂了。室温晾干，用中性树胶封片，待测。

1.2.2拍照、测量与计算

观察使用Leica DME显微镜，物镜100×/1.25oil，目镜10×/18，光圈100×，灯光强度最大，并保持不变。分别从商陆和大豆各10张压片上选取染色体清晰并且在同一个平面上的细胞核。

拍照数码相机为Nikon coolpix 4500，微距模式，焦距32-38毫米，F值5.1，曝光时间1/28-38，ISO速度ISO-100，拍照，编号。挑选同时满足以下标准的照片：a处于分裂前期I(未复制)和后期的细胞b没有丢失染色体(商陆36条，大豆40条)且分散较好的细胞。保证拍照时没有震动。

测量使用Motic ImageAdvanced 3.2软件包，麦克奥迪实业集团有限公司深圳分公司出品。首先，在设置中选取绿色光通道，使用“分割”工具，具体分割过程由电脑控制，对每一条染色体进行分割。再用“驱除噪声”工具减少由于本底存在而造成的误选。然后对所有分割后的染色体，使用“选取目标”工具，使计算机记录所有选中目标。最后，用“计算”工具计算包括积分光密度在内的所有有关数值，导出结果excel表格，保存分割后的图像结果。每个种都测量20张满足标准的照片。同时，在同一张图片上选取染色体周围的狭小区域进行同样分割，导出本底光密度表格。

在Excel里汇总数据，算出其平均值、标准差和相对误差，做出图表。手动去本底的IOD值＝(染色体平均OD值-本底平均OD值)*染色体面积。

2结果与分析

2.1测量数据

表格

表1商陆、大豆积分光密度(IOD)和染色体数据

2.2统计分析

由雷达图可以看出，大豆的光密度分布总体还是比较均匀的，没有偏离较大的点，全部都在2210-3700范围内。平均值为2967.58，标准差为427.4785，相对误差为0.147。商陆的光密度分布大部分比较均匀，都在4000左右，也没有偏离太大的点，均落在3297-4575范围内。平均值为4079.43，标准差为 419.2913，相对误差为0.143。由两个折线图看出，两种方法得出的结论是一致的，趋势基本相同。手动去本底后的结果数据变化幅度缩小。大豆的IOD值变动幅度缩小24.32％，商陆的IOD值变动幅度缩小4.4％

2.3结果

1999年对商陆2C核DNA含量进行了测定，其值为2.9pg。

2.4结果分析

本实验测得商陆2C值为3.09pg，手动去本底的IOD值为3.03pg。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种商陆基因组大小估计方法，其特征在于，所述商陆基因组大小估计方法通过对被测材料的染色体IOD值的测量，同时测量已知材料的染色体的IOD值，通过计算得出被测材料的DNA含量；所述商陆基因组大小估计方法包括以下步骤：

步骤一，将材料种子洗净，在培养皿中铺浸湿的滤纸，种子分散在上，26℃温箱，每天换水2次，2-3天后幼根长出；1-2cm时，取根尖，用0.004mol/L8-羟基喹啉处理4小时，双蒸水洗2次，放入卡诺固定液，固定2-24小时，双蒸水洗2次，70％酒精中暂存，1mol/L HCl于58-60℃水浴中解离10min，双蒸水洗2次；

步骤二，用3g碱性品红溶于70％乙醇100ml备用，取10ml与90ml的5％苯酚水溶液混匀，再从中取55ml，加入冰醋酸6ml，甲醛溶液6ml；配制成染色液时取20ml，加入45％冰醋酸30ml，染色15min，同时放入双蒸水中备用，室温晾干，用中性树胶封片，待测；

步骤三，观察使用Leica DME显微镜，物镜100×/1.25oil，目镜10×/18，光圈100×；拍照数码相机微距模式，焦距32-38毫米，F值5.1，曝光时间1/28-38，ISO速度ISO-100，拍照，编号；

步骤四，测量选取绿色通道，使用分割工具，具体分割过程由电脑控制，对每一条染色体进行分割；再用驱除噪声工具减少由于本底存在而造成的误选；对所有分割后的染色体，使用选取目标工具，使计算机记录所有选中目标；最后，用“计算”工具计算包括积分光密度在内的所有有关数值，导出结果excel表格，保存分割后的图像结果；

步骤五，每个种都测量20张满足标准的照片；同时，在同一张图片上选取染色体周围的狭小区域进行同样分割，导出本底光密度表格；选取照片的标准：染色体分散良好，边界清晰，染色体重叠部分不超过染色体总面积的5％，且面积易于测定。

2.如权利要求1所述的商陆基因组大小估计方法，其特征在于，卡诺固定液按照体积比无水乙醇：冰醋酸＝3：1。

3.如权利要求1所述的商陆基因组大小估计方法，其特征在于，在Excel里汇总数据，算出其平均值、标准差和相对误差，做出图表；手动去本底的IOD值＝(染色体平均OD值-本底平均OD值)*染色体面积。

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