CN113728110A - 用于微集落生长和微生物细胞表征的系统和方法 - Google Patents
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Abstract
采用集成流体装置进行微生物细胞分离，原位微菌落生长，以及任选的鉴定和抗微生物易感性测试。当集成流体装置保持在关闭状态时，执行微生物细胞分离以提供与固相生长培养基接触的微生物细胞悬浮液。除去悬浮液的液体组分，从而将微生物细胞保留在生长培养基上，用于孵育、生长和随后的收获和表征。在一些实施方案中，通过使生长培养基与具有提供于其上的抗微生物剂的固体支持物接触来进行抗微生物剂敏感性测试，使得抗微生物剂扩散到生长培养基的子区域中，所述子区域通过至少部分地被固体支持物包围的孔可进入。在存在抗微生物剂的情况下，可以评估保留在子区域表面上的微生物细胞的生长或抑制。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年12月21日提交的题为“SYSTEMS AND METHODS FORPERFORMING AND MONITORING RAPID MICROBIAL COLONY GROWTH(用于执行和监测微生物集落快速生长的系统和方法)”的美国临时专利申请No.62/784,234的优先权，其全部内容通过引用并入本文，以及2019年10月31日提交的标题为“SYSTEMS AND METHODS FORMICROCOLONY GROWTH AND MICROBIAL CELL CHARACTERIZATION(用于微生物生长和微生物细胞表征的系统和方法)”美国临时专利申请62/928,935的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
本发明涉及微生物细胞的生长、检测和表征。更具体地，本发明涉及微集落生长和表征以及抗微生物敏感性测试。
在临床微生物学实验室中，鉴定微生物感染的病原生物并确定其抗微生物敏感性分布是诊断路线的主要目标。作为通常的实践，该任务目前通过将患者血液吸入含有抗生素吸收剂的培养瓶中，在促进血液微生物细胞内容物生长的环境中孵育该瓶，进行革兰氏染色以根据细胞壁特征和形态对细菌细胞分类，在诸如琼脂平板的固相生长培养基上继代培养细胞来获得纯的微生物集落，部分或完全鉴定微生物细胞，以细胞浓度落在所需范围内的方式将集落内容物悬浮在培养基中，将等分试样的细胞悬浮液与不同剂量的选择的抗微生物剂在适当的培养基中接触，并从细胞等分试样的生长曲线确定最小抑制浓度(MIC)。这种诊断路线的主要缺点是产生的时间长(几天的数量级)和在多微生物样品的情况下优先生长的可能性。
发明内容
采用集成流体装置进行微生物细胞分离，原位微集落生长，以及任选的鉴定和抗微生物易感性测试。当集成流体装置保持在关闭状态时，进行微生物细胞分离以提供与固相生长培养基接触的微生物细胞悬浮液。除去悬浮液的液体组分，从而将微生物细胞保留在生长培养基上，用于培养、生长和随后的收获和表征。在一些实施方案中，通过使生长培养基与具有提供于其上的抗微生物剂的固体支持物接触来进行抗微生物剂敏感性测试，使得抗微生物剂扩散到生长培养基的子区域中，所述子区域通过至少部分地被固体支持物包围的孔可进入。在存在抗微生物剂的情况下，可以评估保留在子区域表面上的微生物细胞的生长或抑制。
因此，在第一方面，提供了一种处理含有微生物细胞的样品的方法，所述方法包含：
将所述样品引入集成流体装置，所述集成流体装置包含样品处理模块和生长模块；
同时将所述集成流体装置保持在关闭状态以防止外部微生物细胞进入：
在所述样品处理模块内处理所述样品以从所述样品分离所述微生物细胞并获得微生物细胞悬浮液，所述微生物细胞悬浮液包含悬浮在液体内的所述微生物细胞；
将所述微生物细胞悬浮液从所述样品处理模块输送到所述生长模块，使得所述微生物细胞悬浮液接触存在于所述生长模块内的固相生长培养基，所述固相生长培养基被配置为促进微生物细胞生长；
从所述微生物细胞悬浮液去除所述液体的至少一部分，使得至少一种微生物细胞保留在所述固相生长培养基的表面上；以及
在适于促进菌落生长的条件下孵育至少所述生长模块。
在所述方法的一些实现方式中，通过所述固相生长培养基吸收所述液体的至少一部分来去除所述液体的至少一部分。
在所述方法的一些实施方式中，所述液体是第一液体并且所述固相生长培养基是基于凝胶的培养基，所述方法进一步包含在使所述微生物细胞悬浮液与所述固相生长培养基接触之前，使所述集成流体装置经受离心力，以从所述固相生长培养基去除第二液体，从而获得部分脱水的固相生长培养基，使得当所述微生物细胞悬浮液与所述部分脱水的固相生长培养基接触时，所述第一液体的所述至少一部分通过所述部分脱水的固相生长培养基的吸收而去除。离心力可以在1,000g与10,000g之间的范围内。可以在所述样品处理模块内处理所述样品以根据基于离心分离的分离方法从所述样品分离所述微生物细胞，并且其中在所述基于离心分离的分离方法期间向所述固相生长培养基施加所述离心力。可以在离与所述固相生长培养基的表面相关联的表面法线小于30度的方向上施加所述离心力。可以在垂直于固相生长培养基的表面的方向上施加离心力。
在所述方法的一些实施方式中，接触所述微生物细胞悬浮液的所述表面是第一表面，所述固相生长培养基进一步包含与所述第一表面相对的第二表面，施加所述离心力使得所述第二液体从邻近所述第二表面的区域移除。
在所述方法的一些实施方式中，接触所述微生物细胞悬浮液的所述表面是第一表面，所述固相生长培养基进一步包含与所述第一表面相对的第二表面，施加所述离心力使得所述固相生长培养基的邻近所述第一表面的第一区域比所述固相生长培养基的邻近所述第二表面的第二区域脱水得更多。
在该方法的一些实现方式中，所述第二液体被与所述固相生长培养基流动连通的吸收材料吸收。
在该方法的一些实现方式中，多孔膜位于所述固相生长培养基和所述吸收材料之间。
在所述方法的一些实施方式中，所述离心力是第一离心力，所述方法进一步包含在已经使所述部分脱水的固相生长培养基与所述微生物细胞悬浮液接触之后，使所述集成流体装置经受第二离心力，以促进来自所述微生物细胞悬浮液的至少一部分液体被部分脱水的固相生长培养基吸收并促进至少一种微生物细胞保留在表面上。第二离心力可以在500g与4000g之间的范围内。
在该方法的一些实现方式中，所述固相生长培养基配置成被动地吸收所述液体的至少一部分。所述固相生长培养基包含多孔网络并且在与所述微生物细胞悬浮液接触之前处于至少部分脱水的状态。所述固相生长培养基可以作为部分脱水的水凝胶提供。
在该方法的一些实现方式中，所述液体的所述至少一部分通过气体可渗透膜蒸发地去除。
在该方法的一些实现方式中，所述液体的所述至少一部分通过空气的主动循环蒸发地去除。
在该方法的一些实现方式中，通过由选自由以下组成的组的分离方法分离所述微生物细胞：过滤、免疫磁分离和微流体分离。
在所述方法的一些实施方式中，保留在所述固相生长培养基表面上的至少一种微生物细胞是肺炎链球菌微生物细胞，并且其中在不控制所述生长模块内的二氧化碳环境的情况下实现与所述肺炎链球菌微生物细胞相关的集落生长。
在所述方法的一些实现方式中，所述样品是全血样品，并且所述微生物细胞在所述样品处理模块中通过以下步骤与所述样品分离：(i)将所述全血样品与血液裂解试剂混合，所述血液裂解试剂包含皂苷类、聚赖氨酸磺酸钠和碱性缓冲液，以获得皂苷类浓度介于0.75与60mg/ml之间、聚赖氨酸磺酸钠浓度介于0.35与50mg/ml之间、pH介于7.8与10之间的混合物；和(ii)从所述混合物中分离微生物细胞。
在一些实现方式中，所述方法进一步包含：(i)检测所述固相生长培养基上集落的存在，所述集落具有小于100微米的直径；和(ii)从所述集落收获微生物细胞。
在该方法的一些实现方式中，检测固相生长培养基上集落的存在包含：(i)获得固相生长培养基的第一图像；(ii)获得所述固相生长培养基的第二图像，其中所述第二图像是在所述生长模块孵育期间经过时间延迟后获得的；(iii)使用所述图像中存在的表面伪影将所述第一图像配准到所述第二图像；(iv)对配准后的第一图像和第二图像进行图像相减，去除所述第二图像中的表面伪影，从而得到相减图像；以及(v)处理所述相减图像以标识所述集落的位置。这些表面伪影的至少一个子集可以是固相生长培养基的表面中的不均匀性，和/或这些表面伪影的至少一个子集可以是驻留在固相生长培养基的表面上的裂解碎屑颗粒，通过用样品处理模块裂解样品产生的裂解碎片颗粒，其中裂解碎片颗粒可以是血液裂解碎片颗粒，并且其中血液裂解碎片颗粒的平均粒径可以小于10微米。样品处理模块可以配置成使得固相生长培养基被裂解碎片颗粒覆盖的面积分数小于20％、50％或90％。
在一些实施方式中，所述方法进一步包含使用所收获的微生物细胞进行抗微生物易感性测试。在从所述集落收获所述微生物细胞之前，所述方法可包括在从所述集落中收获所述微生物细胞之前，在不损害所述集落的活力的情况下查询所述集落，以将所述微生物细胞分类为属于选自一组微生物种类的一种微生物细胞种类。可以至少部分地基于所测量的所述集落的生长速率来确定所述选定的微生物细胞种类。所述微生物细胞的所选择的微生物细胞类别可以选自包括细菌细胞和真菌细胞的一组微生物细胞种类。所述微生物细胞的所述选定的微生物细胞种类可以选自由细菌细胞和真菌细胞组成的一组微生物细胞种类。所述微生物细胞的所述选定的微生物细胞种类可以选自包含革兰氏阳性菌细胞、革兰氏阴性菌细胞和真菌细胞的一组微生物细胞种类。所述微生物细胞的所述选定微生物细胞种类可选自由革兰氏阳性菌细胞、革兰氏阴性菌细胞和真菌细胞组成的一组微生物细胞种类。
所述抗微生物易感性测试可以使用一种或多种抗生素进行，其中所述一种或多种抗生素根据所述选定的微生物细胞种类来选择。在一些实施方式中，所述方法进一步包含使用所述选定的微生物细胞种类来确定何时预期所述集落含有足够量的微生物细胞以进行抗微生物易感性测试；其中所述收获的微生物细胞是在确定所述集落含有足够量的微生物细胞后收获的。可以基于所述选定的微生物细胞种类和与集落大小相关的光学检测的集落大小量度，确定所述集落含有足够量的微生物细胞。确定所述集落何时含有足够量的微生物细胞可以基于所述选定微生物细胞种类和所述集落大小量度之间的预定关系。确定所述集落何时含有足够量的微生物细胞可以基于所述选定的微生物细胞种类和生长持续时间之间的预定关系。确定所述集落何时含有足够量的微生物细胞可以至少部分基于测得的集落生长速率。可以基于与集落大小相关的光学检测的集落大小量度进一步确定集落含有足够量的微生物细胞。
所述固相生长培养基可以是生色生长培养基，并且其中所述选定的微生物细胞种类基于所述集落的检测的光谱特征确定，并且所述光谱特征可以通过拉曼显微术、通过傅里叶变换红外光谱显微术或通过荧光显微术检测。
在该方法的一些实现方式中，查询所述集落以确定所述选择的微生物细胞种类包含：(i)将光束引导到所述集落上；(ii)从所述集落获得散射光图像；以及(iii)处理所述图像以确定所述选定的微生物细胞种类。
在所述方法的一些实施方式中，在所述集落通过肉眼可检测之前从所述集落收获微生物细胞。在该方法的一些实现方式中，当所述集落具有在70微米与100微米之间的直径时从所述集落收获微生物细胞。在该方法的一些实现方式中，在所述集落达到100微米的直径之前从所述集落收获微生物细胞。在该方法的一些实现方式中，在所述集落达到50微米的直径之前从所述集落收获微生物细胞。在该方法的一些实现方式中，在所述集落达到70微米的直径之前从所述集落收获微生物细胞。
在该方法的一些实现方式中，集落是第一集落，从第一集落收获的微生物细胞是第一微生物细胞，并且所述方法进一步包含：(i)检测固相生长培养基上第二集落的存在；和(ii)从所述第二集落收获第二微生物细胞。在该方法的一些实现方式中，使用从所述第一集落和所述第二集落收获的微生物细胞进行抗微生物易感性测试。
在一些实施方案中，所述方法进一步包含在进行所述抗微生物易感性测试之前，查询所述第一集落和所述第二集落以确定所述第一集落和所述第二集落之间表型对应的存在或不存在。所述第一集落与所述第二集落之间的表型对应的存在或不存在可以通过将从所述第一集落检测到的第一光信号与从所述第二集落检测到的第二光信号进行比较来确定。可以通过将所述第一集落的第一光学图像与所述第二集落的第二光学图像进行比较来确定所述第一集落与所述第二集落之间是否存在所述表型对应。
在该方法的一些实现方式中，所述选定的微生物细胞种类是与所述第一集落内的第一类型的第一微生物细胞相关联的第一选定的微生物细胞种类，并且其中所述第一集落与所述第二集落之间的表型对应关系的存在与否可以通过以下确定：(i)在不损害所述集落的活力的情况下查询所述第二集落，以确定与所述第二集落内的第二微生物细胞的第二类型相关的第二选定微生物细胞种类，其中所述第二选定微生物细胞种类选自所述一组微生物细胞种类；和(ii)确定所述第一微生物细胞种类与所述第二微生物细胞种类是否相同。
在所述方法的一些实施方案中，所述第一微生物细胞种类与所述第一集落的第一微生物细胞的第一物种相关联，并且其中所述第二微生物细胞种类与所述第二集落的第二微生物细胞的第二物种相关联，并且其中当确定所述第一物种与所述第二物种相同时建立所述表型对应的存在。
在已经确定所述第一集落与所述第二集落之间所述表型对应的存在之后，可以使用来自所述第一微生物细胞和所述第二微生物细胞两者的微生物细胞进行所述抗微生物易感性测试。
可以确定所述第一微生物细胞与所述第二微生物细胞之间不存在所述表型对应，并且可以使用所述第一微生物细胞和所述第二微生物细胞分开进行抗微生物易感性测试以确定针对所述第一微生物细胞和所述第二微生物细胞的分开的抗微生物易感性量度。
在所述方法的一些实施方式中，所述选定的微生物细胞种类是初步选定的微生物细胞种类，并且根据第一分类方法确定所述初步选定的微生物细胞种类，并且其中所述一组微生物细胞种类是第一组微生物细胞种类，所述方法可以进一步包含：在已经确定第一集落和第二集落之间的表型对应之后，查询从第二集落收获的第二微生物细胞以确定与第二微生物细胞的类别相关的补充微生物细胞种类，其中所述补充微生物细胞种类选自第二组微生物细胞种类，其中补充微生物细胞种类根据第二分类方法确定。第二组微生物细胞种类可以包括比第一组微生物细胞种类更多数量的微生物细胞种类。所述补充微生物细胞种类可以不存在于所述第一组微生物细胞种类中。所述补充微生物细胞种类可以是物种水平的微生物细胞种类。所述第一组微生物细胞种类可以不存在物种水平的微生物细胞种类，并且其中所述第二组微生物细胞种类可以包含多种物种水平的微生物细胞种类。所述第二分类方法能够以比所述第一分类方法更高的置信度确定给定的微生物细胞种类。补充微生物细胞种类可以使用以下测定：基质辅助激光解吸/电离质谱法、拉曼检测和/或傅里叶变换红外光谱法。
在该方法的一些实现方式中，从所述第一集落收获所述第一微生物细胞之后，从所述第二集落收获所述第二微生物细胞，并且其中可以将所述第二集落孵育比所述第一集落更长的持续时间，使得当收获时所述第二集落大于当收获时所述第一集落。
在一些实施方案中，该方法进一步包含：确定所述第二集落何时预期含有足够量的微生物细胞以便于通过所述第二分类方法确定所述补充微生物细胞种类；其中在确定所述第二集落含有足够量的微生物细胞后，从所述第二集落收获所述第二微生物细胞。在已经对来自所述第一集落的第一微生物细胞开始抗微生物易感性测试之后，可以确定所述第二集落含有足够数量的微生物细胞，并且其中在所述抗微生物易感性测试完成之前，确定与所述第二微生物细胞相关的所述补充微生物细胞种类。可在收获所述第一微生物细胞之后且在收获所述第二微生物细胞之前孵育所述第二集落以促进进一步的集落生长。
在一些实现方式中，该方法进一步包含报告与所述第二微生物细胞相关的所述补充微生物细胞种类和与所述第一微生物细胞相关的最小抑制浓度。
在该方法的一些实现方式中，所述固相生长培养基是第一固相生长培养基并且所述微生物细胞悬浮液是第一微生物悬浮液，并且其中所述抗微生物易感性测试是通过以下步骤进行的：(i)重新悬浮所收获的微生物细胞，从而获得第二微生物细胞悬浮液；(ii)在多个位置将所述第二微生物细胞悬浮液分配到另外的固相生长培养基上，每个位置具有不同的局部抗生素浓度；以及(iii)监测所述多个位置以推断所述微生物细胞的抗微生物易感性。所述另外的固相生长培养基可以具有设置在其上的疏水层和形成在所述疏水层中的多个孔，其中每个孔形成在相应的位置上，并且其中所述液体在每个位置处通过相应的孔分配。
在该方法的一些实现方式中，所述固相生长培养基是第一固相生长培养基并且所述微生物细胞悬浮液是第一微生物悬浮液，并且其中所述抗微生物易感性测试可以通过以下步骤进行：(i)重新悬浮所收获的微生物细胞，从而获得第二微生物细胞悬浮液；(ii)提供至少部分包围孔的固体支持物，所述固体支持物包含接触表面，其中化学剂提供在所述接触表面上和/或浸渍在所述接触表面下方；(iii)使第二相生长培养基与所述固体支持物的所述接触表面接触，使得所述第二固相生长培养基的子区域通过所述孔可进入，并且使得所述化学试剂的至少一部分向内扩散到所述子区域中；(iv)将一定体积的所述第二微生物细胞悬浮液沉积到所述子区域的表面上，使得所述第二微生物细胞悬浮液内的微生物细胞保留在所述子区域的表面上；(v)在足够长的持续时间内孵育所述第二固相生长培养基以允许所述保留的微生物细胞暴露于所述化学试剂；以及(vi)检测所述子区域内微生物细胞生长的存在或不存在。
在另一方面，提供了一种处理怀疑含有微生物细胞的样品的方法，所述方法包含：
在适于促进活微生物细胞生长的条件下使所述活微生物细胞的悬浮液与固相生长培养基接触；
检测所述固相生长培养基上集落的存在，所述集落具有小于100微米的直径；
光学查询所述集落以鉴定与所述集落相关的微生物细胞种类；
使用所述微生物细胞种类来确定何时预期所述集落含有足够量的微生物细胞以进行抗微生物易感性测试；
在所述集落生长至含有足够量的微生物细胞用于抗微生物易感性测试后，从所述集落收获微生物细胞；以及
使用所述收获的微生物细胞进行抗微生物易感性测试。
在该方法的一些实现方式中，集落是第一集落，从第一集落收获的微生物细胞是第一微生物细胞，并且所述方法进一步包含：(i)检测固相生长培养基上第二集落的存在；和(ii)从所述第二集落收获第二微生物细胞。可以使用从所述第一集落和所述第二集落收获的微生物细胞进行抗微生物易感性测试。
在一些实施方案中，所述方法进一步包含在进行所述抗微生物易感性测试之前，查询所述第一集落和所述第二集落以确定所述第一集落和所述第二集落之间表型对应的存在或不存在。所述第一集落与所述第二集落之间的表型对应的存在或不存在可以通过将从所述第一集落检测到的第一光信号与从所述第二集落检测到的第二光信号进行比较来确定。可以通过将所述第一集落的第一光学图像与所述第二集落的第二光学图像进行比较来确定所述第一集落与所述第二集落之间是否存在所述表型对应。
在该方法的一些实现方式中，所述选定的微生物细胞种类是与所述第一集落内的第一类型的第一微生物细胞相关联的第一选定的微生物细胞种类，并且其中所述第一集落与所述第二集落之间的表型对应关系的存在与否可以通过以下确定：(i)在不损害所述集落的活力的情况下查询所述第二集落，以确定与所述第二集落内的第二微生物细胞的第二类型相关的第二选定微生物细胞种类，其中所述第二选定微生物细胞种类选自所述一组微生物细胞种类；和(ii)确定所述第一微生物细胞种类与所述第二微生物细胞种类是否相同。所述第一微生物细胞种类可以与所述第一集落的第一微生物细胞的第一物种相关联，并且其中所述第二微生物细胞种类可以与所述第二集落的第二微生物细胞的第二物种相关联，并且其中当确定所述第一物种与所述第二物种相同时建立所述表型对应的存在。
在该方法的一些实现方式中，在已经确定所述第一集落与所述第二集落之间的表型对应之后，使用来自所述第一微生物细胞和所述第二微生物细胞两者的微生物细胞进行所述抗微生物易感性测试。
在所述方法的一些实施方式中，确定所述第一微生物细胞与所述第二微生物细胞之间不存在所述表型对应，并且使用所述第一微生物细胞和所述第二微生物细胞分开进行抗微生物易感性测试以确定针对所述第一微生物细胞和所述第二微生物细胞的分开的抗微生物易感性量度。
在所述方法的一些实现方式中，所述选定的微生物细胞种类是初步选定的微生物细胞种类，并且其中根据第一分类方法确定所述初步选定的微生物细胞种类，并且其中所述一组微生物细胞种类是第一组微生物细胞种类，所述方法进一步包含：在已经确定第一集落和第二集落之间的对应之后，查询从第二集落收获的第二微生物细胞以确定与第二微生物细胞的类别相关的补充微生物细胞种类，其中所述补充微生物细胞种类选自第二组微生物细胞种类，其中补充微生物细胞种类根据第二分类方法确定。第二组微生物细胞种类可以包括比第一组微生物细胞种类更多数量的微生物细胞种类。所述补充微生物细胞种类可以不存在于所述第一组微生物细胞种类中。所述补充微生物细胞种类可以是物种水平的微生物细胞种类。所述第一组微生物细胞种类可以不存在物种水平的微生物细胞种类，并且其中所述第二组微生物细胞种类包含多种物种水平的微生物细胞种类。所述第二分类方法能够以比所述第一分类方法更高的置信度确定给定的微生物细胞种类。补充微生物细胞种类可以使用基质辅助激光解吸/电离质谱法测定。补充微生物细胞种类可以使用拉曼检测和/或傅里叶变换红外光谱测定。
在该方法的一些实现方式中，从所述第一集落收获所述第一微生物细胞之后，从所述第二集落收获所述第二微生物细胞，并且其中将所述第二集落孵育比所述第一集落更长的持续时间，使得当收获时所述第二集落大于当收获时所述第一集落。
在一些实施方案中，该方法进一步包含：确定所述第二集落何时预期含有足够量的微生物细胞以便于通过所述第二分类方法确定所述补充微生物细胞种类；其中在确定所述第二集落含有足够量的微生物细胞后，从所述第二集落收获所述第二微生物细胞。在已经对来自所述第一集落的第一微生物细胞开始抗微生物易感性测试之后，可以确定所述第二集落含有足够数量的微生物细胞，并且其中在所述抗微生物易感性测试完成之前，确定与所述第二微生物细胞相关的所述补充微生物细胞种类。可在收获所述第一微生物细胞之后且在收获所述第二微生物细胞之前孵育所述第二集落以促进进一步的集落生长。
在一些实现方式中，该方法进一步包含报告与所述第二微生物细胞相关的所述补充微生物细胞种类和与所述第一微生物细胞相关的最小抑制浓度。
在该方法的一些实现方式中，活微生物细胞的悬浮液从全血样品获得。
在另一方面，提供了一种用于分离和培养活微生物细胞的集成流体装置，所述集成流体装置包含：
分离区，所述分离区配置成便于在所述集成流体装置的适当致动下从样品分离微生物细胞；以及
包含固相生长培养基的集落生长区域，其中所述集落生长区域配置成在所述集成流体装置的适当致动下接收来自所述分离区域的输出的分离的微生物细胞，使得所述分离的微生物细胞与所述固相生长培养基接触，同时保持所述集成流体装置的内部流动路径处于关闭状态，从而防止外部微生物细胞进入。
在该装置的一些实现方式中，所述集落生长区配置成便于在适于促进所述分离的微生物细胞生长的条件下得孵育期间，监测存在于所述固相生长培养基上的所述分离的微生物细胞的生长。所述固相生长培养基可以配置成被动地吸收液体，所述分离的微生物细胞在所述液体中从所述分离区域递送。
所述固相生长培养基可以包含多孔网络并且被提供为处于部分水合状态。所述固相生长培养基可以作为部分水合的水凝胶提供。
在该装置的一些实现方式中，集落生长区域可从集成流体装置的剩余部分可拆卸地移除。
在另一方面，提供了一种确定化学剂对微生物细胞生长的影响的方法，所述方法包含：
提供含有微生物细胞的微生物细胞悬浮液；
提供至少部分包围孔的固体支持物，所述固体支持物包含接触表面，其中化学剂提供在所述接触表面上和/或浸渍在所述接触表面下方；
使固相生长培养基与所述固体支持物的所述接触表面接触，使得所述固相生长培养基的子区域通过所述孔可进入，并且使得所述化学试剂的至少一部分向内扩散到所述子区域中；
将一定体积的所述微生物细胞悬浮液沉积到所述子区域的表面上，使得所述微生物细胞悬浮液内的微生物细胞保留在所述子区域的表面上；
在足够长的持续时间内孵育所述固相生长培养基以允许保留的微生物细胞暴露于所述化学试剂；以及
检测所述子区域内微生物细胞生长的存在或不存在。
在所述方法的一些实现方式中，所述接触表面可以包括平面接触表面，并且其中所述固体支持物与所述固相生长培养基接触，使得所述平面接触表面接触所述固相生长培养基的表面并且至少部分地包围所述子区域，并且使得所述化学试剂的一部分从所述平面接触表面扩散到所述子区域中。所述固体支持物可以完全包围所述孔。所述固体支持物进一步包含位于所述孔附近的防水特征，所述防水特征配置成使得当所述平面接触表面与所述固相生长培养基接触时，所述防水特征浸没在所述固相生长培养基的所述表面下方，从而防止或减少所述微生物细胞悬浮液进入所述固相生长培养基的接触表面和表面之间。所述防水特征配置成穿透所述固相生长培养基至小于250微米的深度。所述防水特征配置成穿透所述固相生长培养基至小于100微米的深度。
在所述方法的一些实施方式中，所述固体支持物的至少一部分可以具有环形形状。
在所述方法的一些实施方式中，所述固体支持物可以包括比所述平面接触表面更远离所述孔定位的侧向限制部件，所述侧向限制部件被配置为使得当所述平面接触表面与所述固相生长培养基接触时，所述侧向限制部件浸没在所述固相生长培养基内。所述侧向限制部件可以完全包围所述孔。
在该方法的一些实现方式中，所述接触表面可以包含比所述平面接触表面更远离所述孔定位的侧向接触表面，所述侧向接触表面配置成使得当所述平面接触表面与所述固相生长培养基接触时，所述侧向接触表面浸没在所述固相生长培养基内，其中所述侧向接触表面面向所述子区域，使得所述化学试剂从所述平面接触表面和所述侧向接触表面两者扩散到所述子区域中。所述侧向接触表面可以完全包围所述孔。所述侧向接触表面可以配置成使得当所述平面接触表面与所述固相生长培养基接触时，所述侧向接触表面插入所述固相生长培养基中的深度超过1mm。所述侧向接触表面可以配置成使得当所述平面接触表面与所述固相生长培养基接触时，所述侧向接触表面插入所述固相生长培养基中的深度超过2mm。
在所述方法的一些实施方式中，所述固体支持物可包含管状部件，并且其中所述管状部件的内表面的至少远侧表面区域用所述化学试剂涂覆和/或浸渍，并且其中所述管状部件与所述固相生长培养基接触，使得所述远侧表面区域的至少一部分浸没在所述固相生长培养基内，并且使得所述化学试剂在所述固相生长培养基的驻留在所述管状部件的管腔内的子区域内向内扩散。可以将所述管状部件插入所述固相生长培养基中，使得所述管状部件的近侧部分从所述固相生长培养基向外延伸，并且其中将所述一定体积的微生物细胞悬浮液分配到所述管状部件的所述近侧部分中。可以插入所述管状部件使得所述管状部件的远端接触支撑所述固相生长培养基的支撑表面，从而封闭所述子区域并限制所述管状部件内的所述化学试剂的扩散。所述支撑表面可以包含设置在其中或其上的一个或多个配合特征，所述一个或多个配合特征配置成接触所述管状部件的远端。所述一个或多个配合特征可以包含突起和凹陷中的一者或两者。所述一个或多个配合特征可以完全包围所述管状部件的远端。管状部件可以是圆柱形部件。管状部件的远端部分的壁厚可以小于500微米。
在该方法的一些实现方式中，所述化学剂均匀分布在所述接触表面上。
在该方法的一些实现方式中，在所述接触表面上的多个分离区域处提供所述化学试剂。
在所述方法的一些实现方式中，所述化学试剂的面积密度和表面下密度中的一个或多个沿着所述接触表面在空间上变化。可以根据所述局部面积密度和所述表面下密度中的一个或多个的梯度在所述接触表面上提供所述化学试剂。所述梯度可以设置成使得所述化学试剂的所述局部面积密度和所述表面下密度中的一个或多个在最接近所述孔的表面区域中最低。
在所述方法的一些实施方式中，可以以合适的量和合适的空间分布在所述接触表面上提供所述化学试剂，使得在所述接触表面与所述固相生长培养基接触后一小时和三小时之间，紧挨在所述子区域的表面的中心部分下方的所述化学试剂的浓度变化小于10％。
在所述方法的一些实施方式中，可以以合适的量和合适的空间分布在所述接触表面上提供所述化学试剂，使得在所述接触表面与所述固相生长培养基接触后一小时和三小时之间，紧挨在所述子区域的表面的中心部分下方的所述化学试剂的浓度变化小于5％。
在所述方法的一些实施方式中，可以以合适的量和合适的空间分布在所述接触表面上提供所述化学试剂，使得在所述接触表面与所述固相生长培养基接触后两小时和四小时之间，紧挨在所述子区域的表面的中心部分下方的所述化学试剂的浓度变化小于10％。
在所述方法的一些实施方式中，可以以合适的量和合适的空间分布在所述接触表面上提供所述化学试剂，使得在所述接触表面与所述固相生长培养基接触后两小时和四小时之间，紧挨在所述子区域的表面的中心部分下方的所述化学试剂的浓度变化可以小于5％。
在该方法的一些实现方式中，可以使所述固相生长培养基与所述接触表面接触，使得在所述固相生长培养基与所述接触表面之间接触的30分钟内，紧挨在所述子区域的表面的中心部分下方的所述化学试剂的浓度达到最大浓度。
在该方法的一些实现方式中，所述固体支持物可以包含疏水性上表面，所述疏水性上表面配置成促进所述一定体积的所述微生物细胞悬浮液在所述子区域上的保留。所述疏水性上表面可以朝所述孔倾斜以帮助将所述一定体积的微生物细胞悬浮液在所述子区域上的保留。
在该方法的一些实现方式中，所述孔的最小宽度可以是小于5mm、小于2mm、或小于1mm。
在该方法的一些实现方式中，沉积在所述子区域的表面上的所述微生物细胞悬浮液的体积内的微生物细胞的数目可以小于50、小于20、或小于10。
在该方法的一些实现方式中，沉积在所述子区域的表面上的所述微生物细胞悬浮液的体积可以是小于5微升或小于2微升。
在所述方法的一些实施方式中，所述固相生长培养基保留在微孔内，并且其中所述固相生长培养基的体积可以小于100微升或小于50微升。
在该方法的一些实现方式中，所述固相生长培养基的厚度可以小于2mm或小于1mm。
在所述方法的一些实施方式中，所述化学试剂可以是抗微生物剂。
在所述方法的一些实现方式中，所述微生物细胞悬浮液可以通过在不存在血液培养物的情况下处理全血样品来获得。
在该方法的一些实现方式中，所述微生物细胞悬浮液可以在不进行传代培养的情况下从血液培养瓶获得。所述微生物细胞悬浮液可通过稀释血液培养物样品获得。
在该方法的一些实现方式中，可以通过获得所述子区域的表面的一个或多个图像并处理所述一个或多个图像来执行检测所述子区域内微生物细胞生长的存在或不存在。
在一些实现方式中，所述方法进一步包含：(i)提供一个或多个另外的固体支持物，每个另外的固体支持物至少部分地包围相应的另外的孔，每个另外的固体支持物包含相应的另外的接触表面，其中每个另外的接触表面具有提供在其上和/或浸渍在其下方的不同量的所述化学试剂；(ii)使所述固相生长培养基与每个另外的接触表面接触，使得所述固相生长培养基的另外的子区域通过所述相应的另外的孔可进入，并且使得所述化学试剂的至少一部分从每个相应的另外的接触表面向内扩散到每个相应的另外的子区域中；(iii)将另外体积的所述微生物细胞悬浮液沉积到每个另外子区域的相应表面上，使得所述微生物细胞悬浮液内的微生物细胞保留在所述另外子区域的相应表面上；和(iv)在孵育所述固相生长培养基之后，检测每个子区域内微生物细胞生长的存在或不存在。
在该方法的一些实现方式中，可以进一步包括基于对所述子区域内存在或不存在微生物细胞生长的评估来确定所述化学试剂的最小抑制浓度。所述最小抑制浓度可以根据在所述固相生长培养基的孵育期间所述化学试剂在每个子区域的表面下方的估计浓度或浓度范围来确定。所述固体支持物和所述另外的固体支持物可以机械联接并形成固体支持物阵列。所述固相生长培养基可以由固相生长培养基支撑结构支撑，所述支撑结构包含多个微孔，每个微孔包含相应体积的所述固相生长培养基，并且其中所述固体支持物阵列与所述固相生长培养基接触，使得所述固体支持物阵列的每个接触表面在不同的相应微孔中与所述固相生长培养基的不同的相应体积接触。所述固体支持物阵列和所述固相生长培养基支持物结构中的一个或多个可以包含促进所述相应接触表面和所述相应微孔之间的对齐的带键特征。所述带键特征可以便于每个接触表面的侧向位置和深度中的一个或多个相对于所述相应微孔的对准。
在另一方面，提供了一种确定化学剂对微生物细胞生长的影响的方法，所述方法包含：
提供含有微生物细胞的微生物细胞悬浮液；
使固相生长培养基与所述化学试剂在一个或多个接触区域接触，所述接触区域至少部分包围所述固相生长培养基的子区域并位于所述子区域附近，使得所述化学试剂的至少一部分从所述一个或多个接触区域扩散到子区域，其中所述一个或多个接触区域设置成使得当在平行于所述固相生长培养基的表面的至少一个方向上测量时，所述子区域的空间范围小于5mm；
将一定体积的所述微生物细胞悬浮液沉积到所述子区域的表面上，使得所述微生物细胞悬浮液内的微生物细胞保留在所述子区域的表面上；
在足够长的持续时间内孵育所述固相生长培养基以允许保留的微生物细胞暴露于所述化学试剂；以及
检测所述子区域内微生物细胞生长的存在或不存在。
在另一方面，提供了一种将化学试剂引入固相生长培养基中的方法，所述方法包含：
提供至少部分包围孔的固体支持物，所述固体支持物包含接触表面，其中化学剂提供在所述接触表面上和/或浸渍在所述接触表面下方；
使所述固相生长培养基与所述固体支持物的所述接触表面接触，使得所述固相生长培养基的子区域通过所述孔可进入，并且使得所述化学试剂的至少一部分向内扩散到所述子区域中；
在另一方面，提供了用于评估化学剂对微生物细胞的作用的装置，所述装置包含：
至少部分地包围孔的固体支持物，所述固体支持物包含其上提供有所述化学试剂和/或在其下方浸渍有所述化学试剂的接触表面，使得在所述固体支持物的所述接触表面与固相生长培养基接触之后，所述化学试剂至少部分地从所述接触表面向内扩散进入所述固相生长培养基的子区域，所述子区域通过所述孔可进入，由此当含有所述微生物细胞的微生物细胞悬浮液接种到所述子区域时，允许微生物细胞暴露于所述抗微生物剂。
在该装置的一些实现方式中，所述接触表面可以包含平坦的接触表面。所述固体支持物可以完全包围所述孔。所述固体支持物进一步包含位于所述孔附近的防水特征，所述防水特征配置成使得当所述平面接触表面与所述固相生长培养基接触时，所述防水特征浸没在所述固相生长培养基的所述表面下方，从而防止或减少所述微生物细胞悬浮液进入所述固相生长培养基的接触表面和表面之间。所述防水特征可以配置成当所述平面接触表面接触所述固相生长培养基的表面时穿透所述固相生长培养基至小于250微米的深度。所述防水特征可以配置成当所述平面接触表面接触所述固相生长培养基的表面时穿透所述固相生长培养基至小于100微米的深度。
在该装置的一些实现方式中，所述固体支持物的至少一部分具有环形形状。
在所述装置的一些实现方式中，所述固体支持物可以包括比所述平面接触表面更远离所述孔定位的侧向限制部件，所述侧向限制部件被配置为使得当所述平面接触表面与所述固相生长培养基接触时，所述侧向限制部件浸没在所述固相生长培养基内。所述侧向限制部件可以完全包围所述孔。
在该装置的一些实现方式中，所述接触表面可以包含比所述平面接触表面更远离所述孔定位的侧向接触表面，所述侧向接触表面配置成使得当所述平面接触表面与所述固相生长培养基接触时，所述侧向接触表面浸没在所述固相生长培养基内，其中所述侧向接触表面面向所述子区域，使得所述化学试剂从所述平面接触表面和所述侧向接触表面两者扩散到所述子区域中。所述侧向接触表面可以完全包围所述孔。所述侧向接触表面可以配置成使得当所述平面接触表面与所述固相生长培养基接触时，所述侧向接触表面插入所述固相生长培养基中的深度超过1mm。所述侧向接触表面可以配置成使得当所述平面接触表面与所述固相生长培养基接触时，所述侧向接触表面插入所述固相生长培养基中的深度超过2mm。
在该装置的一些实现方式中，所述固体支持物包含管状部件，并且其中所述管状部件的内表面的至少远侧表面区域用所述化学试剂涂覆和/或浸渍，使得当所述远侧表面区域的至少一部分浸没在所述固相生长培养基内时，所述化学试剂在所述固相生长培养基的位于所述管状部件的管腔内的子区域内向内扩散。可以将所述管状部件插入所述固相生长培养基中，使得所述管状部件的近侧部分从所述固相生长培养基向外延伸，并且其中将所述一定体积的微生物细胞悬浮液分配到所述管状部件的所述近侧部分中。可以插入所述管状部件使得所述管状部件的远端接触支撑所述固相生长培养基的支撑表面，从而封闭所述子区域并限制所述管状部件内的所述化学试剂的扩散。管状部件可以是圆柱形部件。管状部件的远端部分的壁厚可以小于500微米。
在该装置的一些实现方式中，所述化学剂可以均匀分布在所述接触表面上。
在该装置的一些实现方式中，可以在所述接触表面上的多个分离区域处提供所述化学试剂。
在装置的一些实施方式中，所述化学试剂的局部面积密度和表面下密度中的一个或多个沿着所述接触表面在空间上变化。可以根据所述局部面积密度和所述表面下密度中的一个或多个的梯度在所述接触表面上提供所述化学试剂。所述面积密度梯度可以设置成使得所述化学试剂的所述局部面积密度和所述表面下密度中的一个或多个在最接近所述孔的表面区域中最低。
在该装置的一些实现方式中，所述固体支持物可以包含疏水性上表面。所述疏水性上表面可以朝所述孔倾斜以帮助将所述一定体积的微生物细胞悬浮液在所述子区域上的保留。
在该装置的一些实现方式中，所述孔的最小宽度可以是小于5mm、小于2mm、或小于1mm。
在所述装置的一些实现方式中，所述化学试剂是抗微生物剂。
在一些实现方式中，所述装置进一步包括提供一个或多个另外的固体支持物，每个另外的固体支持物至少部分地包围相应的另外的孔，每个另外的固体支持物包含相应的另外的接触表面，其中每个另外的接触表面具有提供在其上和/或浸渍在其下方的不同量的所述化学试剂。所述固体支持物和所述另外的固体支持物可以机械联接并形成固体支持物阵列。
在另一方面，提供了试剂盒，其包含：(i)如上所述的装置，其进一步包含一个或多个另外的固体支持物，每个另外的固体支持物至少部分地包围相应的另外的孔，每个另外的固体支持物包含相应的另外的接触表面，其中每个另外的接触表面具有提供在其上和/或浸渍在其下方的不同量的所述化学试剂；以及(ii)固相生长培养基支撑结构，所述支撑结构包含多个微孔，每个微孔包含相应体积的所述固相生长培养基，所述固相生长培养基支撑结构配置成与所述固相支持物阵列可接触，所述固相支持物阵列的每个接触表面在不同的相应微孔中与所述固相生长培养基的不同的相应体积接触。固体支持物阵列和固相生长培养基支持物结构中的一个或多个可以包括有助于在相应接触表面和相应微孔之间对齐的带键特征。所述带键特征可以便于每个接触表面的侧向位置和深度中的一个或多个相对于所述相应微孔的对准。
通过参考以下详细描述和附图，可以实现对本发明的功能和有利方面的进一步理解。
附图说明
现在将仅通过示例并参考以下附图来描述实施方案，其中：
图1示意性地示出了示例集成流体盒的两个示例功能模块，该示例集成流体盒旨在用于将微生物细胞从样品中分离并且随后将分离的微生物细胞接种到处于闭合盒构型的固相生长培养基上。
图2A和2B分别显示了集成的样品处理和生长流体盒的示例生长模块的俯视图和侧视图，所述集成样品处理和生长流体盒用于接收和接种微生物细胞悬浮液以用于随后的微集落生长。
图3A示出了通过具有5×无限平面物镜的直立反射照明(epi)明视场(BF)金相显微镜成像的血琼脂板的截面。将从全血获得的一μL的微生物细胞悬浮液分配在该板上并且使其风干，然后获得显微图像，该全血是通过用由皂苷和多聚茴香脑磺酸钠(SPS)组成的血液裂解试剂选择性裂解，然后进行两个离心洗涤循环而处理的。样品在其上展开的区域用312表示。
图3B示出了通过具有5×无限平面物镜的直立反射照明(epi)明视场(BF)金相显微镜成像的血琼脂板的截面。将从全血获得的一μL的微生物细胞悬浮液分配在板上并使其风干，然后拍摄显微图像，该全血通过用包括皂苷、SPS、Triton-X100和碳酸根-碳酸氢盐缓冲液的碱性血液裂解试剂选择性裂解，然后进行2个洗涤循环来处理。
图3C示出了当根据参考图3B描述的方法处理样品时使用的血液裂解试剂获得的血液碎片大小分布。将从全血获得的一μL的微生物细胞悬浮液分配在板上并使其风干，然后通过10×无限平面物镜拍摄显微图像，该全血通过用包括皂苷、SPS、Triton-X100和碳酸根-碳酸氢盐缓冲液的碱性血液裂解试剂选择性裂解，然后进行2或4个洗涤循环来处理。分析图像的粒度分布，并且绘制2次洗涤循环(左)和4次洗涤循环(右)的粒度分布的直方图。
图4A-C示意性地示出了示例生长模块，该生长模块可任选地与集成流体盒分离，用于在微生物细胞接种之后(在用于微生物细胞微集落生长的合适环境条件下)单独培养和监测。
图5A-D示意性地示出了用于在生长模块的生长室中接触基于凝胶的固相生长培养基上的样品的微生物悬浮液的示例离心方法。当凝胶在图5A中离心并经受离心力时，其液体(例如水)组分的一部分被迫向外(相对于离心轴线)并且使得在离心之后，如图5B中所示，凝胶表面部分脱水。在图5C中，微生物细胞悬浮液与凝胶表面接触，并且其液体组分被脱水的凝胶表面吸收(例如，任选地通过重力辅助或通过进一步离心)，从而将微生物细胞保留在凝胶表面上，如图5D所示。
图5E绘制了离心后各种组合物凝胶的部分失水。将各凝胶置于孔径为0.45μm的膜上并在3200g下离心8分钟。
图5F画出离心后各种组合物凝胶的部分失水。将各凝胶置于孔径为5nm的膜上并在3200g下离心8分钟。
图5G绘制了在孔径为5nm的膜上离心，在3200g下离心8分钟，然后在水中浸泡20分钟后，具有不同组成的凝胶的脱水(失水)和再水化(水增加)水平。
图5H绘制了通过蒸发然后通过在水中浸泡再水化的各种凝胶的部分脱水水平。
图5I示意性地示出了在图5A和5B所示的步骤期间用于通过加强膜从凝胶去除离心渗出的液体的一个示例实施方案。
图5J示意性地示出了在图5A和5B所示的步骤期间通过通道从凝胶中除去离心渗出的液体的另一示例实施方案。
图5K示意性地示出了用于测试图5J所示实施方案的实施方案的生长室。
图5L显示了在灌注凝胶后的不同时间点的图5K的生长室的实验实现的照片。
图5M示出了在3200g离心8分钟并在4个点分配100μL染料溶液并使液体沉降5分钟之后，在不同时间点的图5K的生长室的实验实现的照片。
图6展示了在分配1μL的微生物细胞悬浮液之后在琼脂板上形成的微小培养区域(MCR)的截面，在孵育后0小时、2小时、3小时、和4小时的时间点通过具有5×无限平面物镜的明视场(BF)金相显微镜成像，该微生物细胞悬浮液是通过离心分离掺有奇异变形杆菌(PM)的全血样品而获得的。箭头指示一些PM微集落，这些微集落可以相对于血液裂解碎片在视觉上辨别。
图7示出了通过时间推移图像分析将图6的MCR上的微生物集落与血液裂解碎片区分开的示例步骤。将在不同时间点(接种后0、2、3和4小时)获得的成像数据相对于0小时图像在空间上对齐(记录)，然后减去0小时图像。将在0小时图像内存在的强度特征分类为背景(溶血碎片)，而将在减去的图像中出现的强度特征分类为前景微集落。
图8A绘制了不同时间点PM细菌细胞的集落形成单位(CFU)的数目，其中PM细菌细胞在离心分离后回收，随后接种到来自掺加的全血样品的微生物细胞的琼脂上(如在图6的实验中所使用的)，随后接种最终细胞悬浮液并在37℃孵育4小时。
图8B绘制了不同时间点表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)细菌细胞的集落形成单位(CFU)的数目，其中表皮葡萄球菌细菌细胞在离心分离后回收，随后接种到来自掺加的全血样品的微生物细胞的琼脂上，随后接种最终细胞悬浮液并在37℃孵育4小时。
图8C绘制了不同时间点假单孢菌细菌细胞的集落形成单位(CFU)的数目，其中假单孢菌细菌细胞在离心分离后回收，随后接种到来自掺加的全血样品的微生物细胞的琼脂上，随后接种最终细胞悬浮液并在37℃孵育4小时。
图8D绘制了不同时间点大肠杆菌(Escherichia coli)细菌细胞的集落形成单位(CFU)的数目，其中大肠杆菌细菌细胞在离心分离后回收，随后接种到来自掺加的全血样品的微生物细胞的琼脂上，随后接种最终细胞悬浮液并在37℃孵育6小时。
图9A是表示接种的革兰氏阳性菌ATCC菌株的测量生长参数的表，所述菌株通过离心分离从掺加的血液样品中回收并随后接种到琼脂上。提供了在血液培养瓶(液体培养物)内接种细胞生长相对于参考生长的生长前的滞后时间、生长速率、估计的阳性时间和微集落中的细胞数目达到104和105CFU所需的平均时间。
图9B是表示接种的革兰氏阳性菌临床分离物的测量的生长参数的表，所述临床分离物通过离心分离从掺加的血液样品中回收并随后接种到琼脂上。提供了在血液培养瓶(液体培养物)内接种细胞生长相对于参考生长的生长前的滞后时间、生长速率、估计的阳性时间和小菌落中的细胞数目达到104和105CFU所需的平均时间。
图9C是表示额外接种的革兰氏阳性菌临床分离物的测量的生长参数的表，所述临床分离物通过离心分离从掺加的血液样品中回收并随后接种到琼脂上。提供了在血液培养瓶(液体培养物)内接种细胞生长相对于参考生长的生长前的滞后时间、生长速率、估计的阳性时间和微集落中的细胞数目达到104和105CFU所需的平均时间。
图9D是表示接种的革兰氏阴性菌ATCC菌株的测量生长参数的表，所述菌株通过离心分离从掺加的血液样品中回收并随后接种到琼脂上。提供了在血液培养瓶(液体培养物)内接种细胞生长相对于参考生长的生长前的滞后时间、生长速率、估计的阳性时间和微集落中的细胞数目达到104和105CFU所需的平均时间。图9E是表示接种的革兰氏阴性菌临床分离物的测量的生长参数的表，所述临床分离物通过离心分离从掺加的血液样品中回收并随后接种到琼脂上。提供了在血液培养瓶(液体培养物)内接种细胞生长相对于参考生长的生长前的滞后时间、生长速率、估计的阳性时间和微集落中的细胞数目达到104和105CFU所需的平均时间。
图9F是表示额外接种的革兰氏阴性菌临床分离物的测量的生长参数的表，所述临床分离物通过离心分离从掺加的血液样品中回收并随后接种到琼脂上。提供了在血液培养瓶(液体培养物)内接种细胞生长相对于参考生长的生长前的滞后时间、生长速率、估计的阳性时间和小菌落中的细胞数目达到104和105CFU所需的平均时间。
图9G是表示接种的真菌细胞的ATCC菌株的测量的生长参数的表，所述菌株通过离心分离从掺加的血液样品中回收并随后接种到琼脂上。提供了在血液培养瓶(液体培养物)内接种细胞生长相对于参考生长的生长前的滞后时间、生长速率、估计的阳性时间和微集落中的细胞数目达到104和105CFU所需的平均时间。
图9H是表示接种的真菌的临床分离物的测量的生长参数的表，所述临床分离物通过离心分离从掺加的血液样品中回收并随后接种到琼脂上。提供了在血液培养瓶(液体培养物)内接种细胞生长相对于参考生长的生长前的滞后时间、生长速率、估计的阳性时间和微集落中的细胞数目达到104和105CFU所需的平均时间。
图10说明在从全血样品中分离并孵育4小时后，通过光学显微镜测定掺加的血液样品对白色念珠菌细胞(在卵圆内可见)的阳性。
图11A提供了说明用于对微集落进行快速抗微生物易感性测试(AST)的示例方法的流程图。
图11B说明了大肠杆菌的平均直径与微集落细胞含量的关系图。该图已经用幂律趋势线拟合，以使得能够估计平均微集落直径，例如，在103和105细胞含量水平。
图11C绘制了在血流感染中普遍存在的各种致病性革兰氏阳性菌在103和105细胞含量水平下的平均微集落直径。
图11D说明了在血流感染中普遍存在的各种致病性革兰氏阴性菌在103和105细胞含量水平下的平均微集落直径。
图12是用集成的流体处理盒进行自动离心和洗涤的系统的示意图。
图13A至13E示出了示例集成流体处理盒，其配置成用于直接从收集管中提取样品，随后离心和洗涤，以获得浓缩和纯化的微生物细胞悬浮液。
图14提供了说明用于进行自动离心和洗涤的示例方法的流程图。
图15A显示了用于孵育生长室、监测微生物细胞生长以检测存活的微生物微集落并将微集落细胞分类为属于给定微生物细胞种类的示例系统的示意图。采用具有低放大率的物镜来增加观察面积并且可以增加时间推移成像的时间分辨率。
图15B显示了用于孵育生长室、监测微生物细胞生长以检测存活微生物微集落的另一个示例系统的示意图。
图15C说明样品接种和在35℃下孵育4小时(右)和20小时(左)后在固相生长培养基上检测到的大肠杆菌微集落/集落的比较。右边的图像是448个对准/配准的显微图像的马赛克拼接的结果，显微图像是在与图15B中示意性示出的系统类似的自动系统中由5×明视场物镜拍摄的。左侧图像用常规相机拍摄。
图15D说明了在图15C所示的平板上鉴定的18个微集落，其通过时间推移图像处理在孵育4小时期间检测。如图中可见，在3小时时检测到18个微集落中的15个，由白色圆圈显示，并且在2小时时检测到一个微集落(微集落7)。
图15E显示了分别在存在(左上)和不存在(右上)CO2包装的情况下生长过夜的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)集落的形态。用5×明视场物镜拍摄图像。在不存在CO2填充的情况下孵育4小时后形成的肺炎链球菌的典型微集落呈现在左下角。图像由10×明视场物镜拍摄。微集落的放大图像呈现在右下角，更类似于在CO2填充下形成的过夜集落。
图16是在其上金黄色葡萄球菌细胞已被划线的血琼脂凝胶的照片。将分别浸渍有1μg/mL苯唑西林(Oxacillin)、30μg/mL四环素和10μg/mL诺氟沙星的市售纸盘(HardydiskTM)放置在固相生长培养基上，并在过夜培养后拍照。测定值r1显示直至离中心一定距离不存在可见的微生物泳道，并代表抑制区。超过该距离，直至距离r2观察到稀疏泳道，超过该距离泳道是满的。
图17A和17B示意性地比较了抗微生物剂从已经放置在凝胶表面上的浸渍盘的扩散。图17A示出了常规盘扩散AST的情况，而图17B示出了示例环形盘扩散AST实施方案。箭头表示分别与盘扩散抗微生物剂敏感性测试和环形-盘扩散抗微生物剂敏感性测试相关的抗微生物剂的扩散方向。
图18A示意性地示出了表示参数r1、rad和h的示例环形盘扩散装置(“LD-AST单元”)。
图18B-18I示出了用于执行侧向扩散AST的固体支撑结构的示例实施方案。
图18J示出了一组图像，该组图像展示了当将环放置在凝胶表面上并且将微生物细胞悬浮液分配在该孔上时，从100μm厚的热塑性聚氨酯(TPU)片材切割的引导环将微生物细胞定位并集中在该环的内孔内的能力。
图19A-19E示意性地表示将环形盘扩散“LD-AST单元”组装到阵列中。向浸渍有不同浓度水平的抗微生物剂的环形盘提供相互作用环并组装成条带(图19A)。互补条带(图19B)包括具有琼脂凝胶的密封微孔的组件。在测定期间，连接两个部件，并将样品的等分试样分配在相互作用环内(图19C)。
图20A绘制了穿过环形扩散盘(盘用黑色条带表示)的中心线在凝胶表面上的模拟浓度。凝胶厚度为h＝4mm，半径为r2＝14mm。用粗线表示内半径r1＝1.5mm和外半径rad＝3mm的环形盘的横截面。
图20B绘制了穿过由黑色条带表示的环形盘的中心线在凝胶表面上的模拟浓度的变化。凝胶厚度为h＝2mm，半径r2＝14mm。
图20C绘制了穿过由黑色条带表示的环形盘的中心线在凝胶表面上的模拟浓度的变化。凝胶厚度为h＝4mm，半径r2＝5mm。
图20D绘制了穿过由黑色条表示的环形盘的线在凝胶表面上的模拟浓度的变化。凝胶厚度为h＝2mm，直径r2＝5mm。
图20E绘制了环形盘上的示例浸渍浓度分布，以下称为双重1。
图20F绘制了根据图20E中所示的浸渍浓度分布，跨过穿过环形盘的中心线在凝胶表面上的模拟浓度的变化。凝胶厚度为h＝2mm，半径r2＝5mm。
图20G绘制了环形盘上的示例浸渍浓度分布，以下称为双重2。
图20H绘制了根据图20G中所示的浸渍浓度分布，跨过穿过环形盘的中心线在凝胶表面上的模拟浓度的变化。凝胶厚度为h＝2mm，半径r2＝5mm。
图21A表示对于图20A至20H的LD-AST单位，在感兴趣区域中心的药物浓度的模拟时间行为。图中标记有(r2＝14mm,h＝4mm)、(r2＝14mm,h＝2mm)、(r2＝5mm,h＝4mm)、(r2＝5mm,h＝2mm)、(r2＝5mm,h＝2dual1)和(r2＝5mm,h＝2dual2)，分别对应于图20A、20B、20C、20D、20F和20G。r-凝胶的水平尺寸；h-凝胶厚度。
图21B绘制了在将环形盘放置在凝胶上之后～0.5小时和4小时达到最大浓度期间，图21A的曲线在感兴趣区域中心的浓度的相对变化。图中标记有(r2＝14mm,h＝4mm)、(r2＝14mm,h＝2mm)、(r2＝5mm,h＝4mm)、(r2＝5mm,h＝2mm)、(r2＝5mm,h＝2dual1)和(r2＝5mm,h＝2dual2)，分别对应于图20A、20B、20C、20D、20F和20G。
图21C表示根据实施例9B的方法沉积在环形盘上的染料溶液的定性和定量浓度分布。
图22表示用于快速执行环形盘扩散AST的流程图。
图23A是用于在8个药物浓度水平下运行LD-AST的条带的照片。照片对应于薄条带的情况，即每个微孔中50μL的凝胶。
图23B是示出图23A中所示的条的侧视图的照片。照片对应于薄条带的情况，即每个微孔中50μL的凝胶。
图24A-24C示出了图23A和23B所示(低凝胶体积为～50μL；凝胶厚度～1mm)的条的感兴趣区域(ROI)在分别孵育3小时、4小时和过夜后的俯视图像。抗生素为诺氟沙星，微生物细胞为大肠杆菌。
图25A-25C示出了中厚(凝胶体积为～150μL；凝胶厚度～3mm)条的ROI在分别孵育3小时、4小时和过夜后的俯视图像。抗生素为诺氟沙星，微生物细胞为大肠杆菌。
图26A-26C示出了厚(凝胶体积为～350μL；凝胶厚度～7mm)条的ROI在分别孵育3小时、4小时和过夜后的俯视图像。抗生素为诺氟沙星，微生物细胞为大肠杆菌。
图27A显示了孵育3和4小时后“薄带”型LD-AST(示于图23A和23B)的ROI的俯视图像。抗生素为万古霉素，微生物细胞为金黄色葡萄球菌。
图27B显示了“中-厚条”类型L-AST的ROI在孵育3和4小时后的俯视图像。抗生素为万古霉素(Vancomycin)，微生物细胞为金黄色葡萄球菌。
图28显示了“中-厚条”类型L-AST的ROI在接种后孵育4小时后的俯视图像。抗生素为万古霉素，微生物细胞为金黄色葡萄球菌。
图29显示了“薄条”型LD-AST的感兴趣区域(ROI)在测试Amphotoricin B对白色念珠菌的敏感性的同时孵育3小时4小时过夜后的俯视图像。
图30显示了对于干净的细胞悬浮液(顶部)和稀释1000倍的阳性血液培养物(底部)而言，“薄条”型LD-AST的感兴趣区域(ROI)在分别孵育3小时和4小时后的俯视图像。抗生素是苯唑西林并且微生物细胞是甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA 111，具有不强抗性)。
图31A显示MRSA-110在市售肉汤微量稀释AST平板的孔中的生长模式。指示的浓度以μg/mL计。缩写如下：CHL＝氯霉素(Chloramphenicol)，DAP＝达托霉素(Daptomycin)，GEN＝庆大霉素(Gentamicin)，LZD＝利奈唑胺(Linezolid)，RIF＝利福平(Rifampin)，SXT＝甲氧苄啶(Trimethoprim)/磺胺甲恶唑(Sulfamethoxazole)，SYN＝奎奴普丁(Quinupristin)/达福普汀(Dalfopristin)，TET＝四环素(Tetracycline)，ERY＝红霉素(Erythromycin)，OXA+＝苯唑西林(Oxacillin)+2％NaCl，AMP＝氨苄青霉素(Ampicillin)，PEN＝青霉素(Penicillin)，VAN＝万古霉素(Vancomycin)，LEVO＝左氧氟沙星(Levofloxacin)，TGC＝替加环素(Tigecycline)，MXF＝莫西沙星(Moxifloxacin)，CLI＝克林霉素(Clindamycin)，STR＝链霉素(Streptomycin)，CIP＝环丙沙星(Ciprofloxacin)，NIT＝呋喃妥因(Nitrofurantoin)，DT1＝D测试1，DT2＝D测试2，FOXS＝头孢西丁(Cefoxitin)筛选，NEG＝阴性对照，POS＝阳性对照。
图31B显示在进行LD-AST测定的96孔微量培养板的孔中MRSA-110的生长模式。缩写与图31A相同。
图32显示了所选择的药虫组合的LD-AST和标准肉汤微量稀释AST的结果之间的比较。微生物细胞的缩写如下：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(SA)，甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)(MRSA)，鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)(AB)，大肠杆菌(Escherichia coli)(EC)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(PA)，奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)(PM)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)(KP)，碳青霉烯抗性肠杆菌科肺炎克雷伯氏菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae Klebsiella pneumoniae)(CRE)。
具体实施方式
将参考以下论述的细节来描述本发明的各种实施方案和方面。以下描述和附图是对本发明的说明，并且不应被解释为限制本发明。描述了许多具体细节以提供对本发明的各种实施方案的透彻理解。然而，在某些情况下，为了提供对本发明的实施方案的简要讨论，没有描述公知的或常规的细节。
如在此使用的，术语“包含(comprise/comprising)”被解释为是包括性的和开放式的，而不是排他的。具体地，当在说明书和权利要求书中使用时，术语“包含(comprise/comprising)”及其变化形式意指包括指定的特征、步骤或组分。这些术语不应被解释为排除其他特征、步骤或组分的存在。
如本文中所使用，术语“示例”意指“充当示例，例子或说明”，且不应解释为比本文中所揭示的其他配置优选或有利。
如本文所用，术语“约”和“大约”旨在涵盖可能存在于值范围的上限和下限中的变化，如性质、参数和尺寸的变化。除非另外指明，否则术语“约”和“大约”意指加或减25百分比或更少。
应当理解，除非另外指明，否则任何指定的范围或基团是单独地提及范围或基团的每个和每个成员，以及其中涵盖的每个和每个可能的子范围或子基团的简写方式，并且关于其中的任何子范围或子基团是类似的。除非另外指明，否则本发明涉及并且明确地并入子范围或子组的每个特定成员和子组合。
如本文所用，当与数量或参数结合使用时，术语“大约”是指范围为所述数量或参数的约十分之一至十倍。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语都旨在具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。除非另外指明，如贯穿全文，如本文所用，以下术语旨在具有以下含义：
如本文所用，短语“完整细胞”是指含有目的核酸、蛋白质或细胞内内容物的微生物细胞，其中微生物细胞可通过分离方法分离，诸如但不限于离心分离、过滤、微流体分离或免疫磁性分离。
如本文所用，短语“样品”是指含有、可能含有或怀疑含有一种或多种微生物细胞的液体或悬浮液。样品的非限制性示例包括体液，诸如尿、淋巴液、脑脊液、血液(例如全血、血液培养物和血浆)、痰和唾液。样品的其他示例包括均质化组织悬浮液，包括但不限于粪便、肌肉组织、脑组织和肝脏组织的均质化悬浮液。样品可以是经处理的或未经处理的，并且可以任选地包括一种或多种试剂或生长培养基。在血液培养物样品(包含生长培养基和全血的样品)的情况下，血液培养物样品可以是已经通过检测方式(例如，通过自动化血液培养系统)被认为对微生物细胞的存在呈阳性的血培养样品，基于通过一种或多种中间培养物检测方式进行的测量怀疑存在微生物细胞的中间培养物血液培养物样品，或没有初始检测结果可用的中间培养物血液培养物样品。
如本文所用，短语“血细胞”是指存在于血液中的哺乳动物细胞，包括但不限于红血球(红细胞)、白血球(白细胞)和血小板(凝血细胞)。
如本文所用，短语“血液样品”是指包含一种或多种血细胞的任何样品。血液样品的非限制性示例包括全血样品、血液培养物样品、血沉棕黄层样品和血小板样品。
如本文所用，短语“全血”或“全血样品”是指包含血浆和血细胞的哺乳动物血液。“全血”或“全血样品”可包括一种或多种试剂，诸如抗凝血剂。例如，可以将全血收集在可以包括一种或多种试剂的样品瓶中，所述试剂诸如但不限于抗凝血剂，包括SPS(多茴香脑磺酸钠)、EDTA(乙二胺四乙酸)、柠檬酸钠和肝素。
如本文所用，短语“选择性裂解”是指血液裂解试剂或裂解过程，由此裂解后保持存活的微生物细胞的分数超过裂解后保持存活的真核细胞的分数，其中真核细胞与收集样品的受试者相关。
如本文所用，短语“微生物细胞”和“微生物”包括细菌(例如革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，以及细菌孢子)和单细胞真菌(例如酵母和霉菌)。
如本文所用，短语“真核细胞”是指来源于不包括真菌的真核生物的细胞，诸如动物，特别是含有血液的动物，包括无脊椎动物，诸如甲壳类动物和脊椎动物。如本文所用，“脊椎动物”包括冷血动物(鱼、爬行动物、两栖动物)和温血动物(鸟和哺乳动物)。
如本文所用，短语“有效缓冲液浓度”当用于涉及通过将一定体积的样品与一定体积的血液裂解试剂混合而形成的混合物时，其中血液裂解试剂包括缓冲液系统，其是指所述血液裂解试剂的缓冲液浓度与所述血液裂解试剂的体积除以所述血液裂解试剂的体积和所述样品的体积的总和所形成的比率的乘积。有效缓冲液浓度表示最终混合物中血液裂解试剂对缓冲液系统的贡献(即，应用于血液裂解试剂的缓冲液浓度的稀释因子)，并且由于样品中存在的缓冲组分，其可以不同于最终混合物中的实际缓冲液浓度。
如本文所用，短语“分离方法”是指适于分离和任选地浓缩微生物细胞的方法。分离方法的非限制性示例包括离心、过滤、免疫磁性分离和微流体分离。
如本文所用，短语“细胞悬浮液”是指含有微生物细胞的水性介质。
如本文所用，术语“集落”和“微集落”是指微生物的多样性或集落，所述微生物彼此紧邻，位于表面上，并且是通过原位复制的单一祖先微生物的克隆后代。通常，“集落”是人眼可见的，并且直径通常大于约50μm、60μm、80μm或100μm。然而，如本文所用，除非另有说明，否则术语“集落”意指包括直径为100μm或更大的两个集落，并且术语“微集落”意指直径小于100μm的集落。
本发明的各种示例实施方案解决了关于微生物生长和抗微生物剂敏感性测试(AST)的常规方法的上述缺点。如下面详细解释的，本发明的许多示例实施方案采用集成流体盒，以促进微生物细胞的分离和微生物集落在集成流体盒内的原位随后的生长。在许多示例实施方案中，微生物细胞被分离并与固相生长培养基接触，用于随后的集落生长，同时保持集成流体盒的至少一部分处于闭合构型。
现在参考图1，示意性示出了用于进行微生物集落生长的示例集成流体盒(装置)。可以将样品20引入集成流体盒10，集成流体盒包括细胞分离模块(集成流体盒的一部分或区域)30和集落生长模块(集成流体盒的另一部分或区域)40。集成流体盒10促进微生物细胞与样品的其他组分的分离，诸如与真核细胞(例如，来自宿主受试者的宿主细胞)的分离，使得分离的微生物细胞以完整且有活力的形式(能够细胞分裂)分离。可以在液体培养基(例如盐水或适于维持微生物细胞活力的另一种缓冲液)中提供、任选地浓缩分离的微生物细胞，从而提供微生物细胞悬浮液。随后例如通过一个或多个流体导管35将细胞悬浮液引入集落生长模块40中，并在其中与固相生长培养基接触(例如接种在固相生长培养基上)，下文详细描述了固相生长培养基的示例。集落生长模块40被配置为允许监测(例如通过光学或电学方式)在固相生长培养基上生长的集落。集成流体盒10随后可在合适的温度和环境下孵育以促进生长(例如35-38℃)，同时允许监测微生物集落的生长。
如上所述，微生物细胞可被分离并与固相生长培养基接触，用于随后的集落生长，同时保持集成流体盒的至少一部分处于闭合构型。应当理解，短语“闭合”和“闭合状态”是指集成流体盒的内部区域至少暂时进入(进入或引入)外部微生物细胞在集成流体装置的内部区域内的状态的能力或构造，从而避免污染从样品中分离并在集落生长模块内生长成集落的微生物细胞。可以通过致动适当定位的阀使集成流体盒的内部区域进入关闭状态。
在一些示例实施方案中，集成流体盒的内部区域可以处于关闭状态，同时允许内部区域例如通过阻止微生物细胞通过的过滤器与外部气体源或外部环境气体连通。流体盒的一个内部区域可以配置成闭合状态，而流体盒的其他内部区域处于非闭合状态。如在下面的一些示例实施方案中所解释的，例如，在已经检测到用于进一步测试的足够的微生物生长之后，可以打开处于关闭状态的集成流体盒的内部区域的至少一部分以提供到存在于其中的微生物细胞(例如，微生物集落)的外部通路。
应当理解，集成流体盒10可构造成使得细胞分离模块在活微生物细胞与固相生长培养基接触之前进行活微生物细胞的分离。根据手动方法、半自动方法或全自动方法，使得可将所得微生物悬浮液输送到集落生长模块，同时将微生物细胞悬浮液保持在集成流体盒内的封闭环境中。
例如，在一些示例实施方案中，微生物细胞可以通过自动裂解-离心方法，使用集成流体盒来分离，诸如使用图13A-13E中所示的盒(以下详细描述为提供集成流体装置的细胞分离模块的示例)或其变化形式，使得悬浮液自动接触固相生长培养基。在另一个示例实施方式中，该方法可以在封闭的集成盒内完全自动化，这在将分离的微生物细胞转移到固相生长培养基中时可以有利于避免引入污染物。在另一个示例实施方案中，可以使用过滤器分离微生物细胞，其中集成的流体盒包括手动或自动致动的柱塞。
应当理解，尽管图13A-13E中所示的示例集成盒采用自动裂解-离心来进行活微生物细胞的分离，但是这种集成盒可以被修改为包括替代的分离方式，诸如但不限于过滤、免疫磁性分离或其他分离方式，包括但不限于细胞分选技术，诸如流式细胞术细胞分选、电细胞分选或微流体细胞分选。此外，虽然本文公开的一些示例实施方案涉及从血液样品中分离活微生物细胞，但是应当理解，根据上文提供的短语“样品”的定义，可以使用多种样品类型。
集落生长模块包括生长室，该生长室促进固相生长培养基上的微生物集落的生长和监测。图2A-2B示出了具有内部生长室的这种生长模块的示例实施方案。首先参考图2A(平面图)和2B(截面图A-A)，集落生长模块180包括具有下内壁105、上壁120、导管101的生长室100，下内壁上形成有固相生长培养基层110，导管例如通过路径161(或图1中的35)流体连接到细胞分离模块。生长室100还可以通过导管150流体连接到通风口130，或者这种通风口可以形成在室的上壁120中。
在一些示例实施方案中，上壁120可以包含气体可渗透部分以允许在微生物细胞生长期间室与外部环境之间的空气交换。气体可渗透部分可以是例如气体可渗透膜。合适的气体可渗透膜的示例包括但不限于聚氨酯膜。这些示例膜能够以足够的速率与周围环境进行气体交换以促进细胞在固相上生长，同时维持室内的无污染环境。
固相生长培养基110适于向微生物细胞提供合适的生长培养基来源。固相生长培养基的非限制性示例包括具有合适的生长营养物的常规琼脂、明胶、瓜耳胶、黄原胶。在一些示例实现方式中，固相生长培养基可以根据微生物细胞的类型是生色的。在一些实施方案中，可将生色或荧光底物加入琼脂培养基中，用于通过对集落进行特异性或非特异性染色来鉴定微生物，如例如欧洲专利申请No.EP1088896A2所述。
如下面进一步详细解释的，固相生长培养基可以是干燥或部分干燥的形式，使得来自细胞悬浮液的液体组分在接触时(至少部分地)被吸收。
应当理解，根据多个不同的示例实现方式，可以将微生物细胞悬浮液引入到生长室中。例如，细胞悬液可以通过例如来自上游位置的正压或来自下游位置的负压(例如通过图2B的路径150)和通过致动适当放置的阀和泵。在一些示例实现方式中，可以在生长室内提供物理结构，诸如阻止或减少流体流动的屏障，以便促进细胞悬浮液的适当扩散，从而将这些微生物细胞分布在固相生长培养基的表面上。
应当理解，在涉及少量集落生长和/或集落生长至有限尺寸的一些示例实现方式中，可以在不存在气体可渗透区域的情况下关闭生长室。例如，在下面描述的一些示例实施方案中，可以在不存在气体可渗透区域的情况下将足够体积的所需大气(诸如环境空气或5％CO2)封闭在用于微生物呼吸的集落室内。
在替代的示例实施方案中，生长室可以通过用作对外部微生物细胞的屏障的过滤器与氧源(例如外部环境)气体连通，以促进向室提供连续的或间断的氧。例如，生长室可以通过阻止外部微生物细胞进入的中间过滤器与通向大气或通向加压或气动气体源的外部端口气体连通。与外部氧源的气体连通可以通过中间阀控制。
在一个示例实施方案中，上壁120可以包括光学透明或透射区域(例如，窗口)，通过该区域可以检查集落的生长(例如，视觉地或通过成像装置，诸如相机)。在另一个实施方案中，上壁120为可分离盖子的形式，其可偶尔被移除用于成像或目测检查凝胶表面的微生物集落的生长。
生长室100可任选地包括能够通过比色传感器检测由微生物产生的挥发性有机化合物来检测生长集落的代谢活性的一个或多个指示器。合适的指示剂的非限制性示例已经公开在美国专利公开No.20150099694中。此类指标可以允许以某种程度的分类粒度(例如革兰氏状态、科、属、种、品系)识别菌落中的细胞。在一个示例实施方案中，一种或多种指示剂可提供类似于革兰氏染色测试的信息，允许以非破坏性方式选择合适的抗生素敏感性测试组，而不干扰或牺牲任何生长集落。
在一些示例实施方案中，通过提供具有指示剂的固相生长培养基，可以以非破坏性方式鉴定集落。合适的指示剂的非限制性示例包括发色或荧光底物、生化染料、pH指示剂，如例如美国专利公开No.2012/0295299A1中所述。
在一些示例实施方式中，气体可渗透膜或包围生长室的结构的另一部分可以由透明材料(例如聚氨酯)形成或可以包括透明材料，并且可以在与生长培养基相关的空间区域上延伸，如图2B所示的示例实施方案中所示，从而允许观察集落生长。该观察可以例如在视觉地或使用光学检测(例如成像)系统进行，诸如相衬或暗场显微术。或者，可通过单色光源(诸如激光)的准直光束从背面照射集落，并且可检查或处理光学散射图案以进行微生物细胞鉴定或确定给定集落的微生物细胞种类，如下文进一步描述。
应当理解，不同的检测形式将对固相生长培养基上的集落生长具有不同的检测限度。例如，在直接显微监测方法中，在每个集落的细胞数目方面的检测极限可以是103的数量级。例如，Yoshiakiet al.[Colony fingerprint for discrimination of microbialspecies based on lensless imaging of microcolonies.(基于微集落的无透镜成像用于区分微生物物种的集落指纹。)"PloS one 12.4(2017):e0174723]能够检测直径在10-500μm范围内的微集落。
可能限制微集落检测的重要因素是表面伪影(背景)的大小和密度，所述表面伪影在将处理的样品与固相生长培养基接触后可通过显微镜观察到，其中这样的表面伪影不代表微生物细胞或微生物细胞集落。这类造成背景的表面伪影的两种示例类型包括(i)凝胶表面的表面不均匀性和(i)在样品裂解后残留的裂解碎片颗粒，诸如由血细胞消化产生的裂解碎片颗粒，其在离心洗涤后保留在样品中。
通过凝胶的受控制造，可以降低第一类伪影的表面密度，即凝胶表面的不均匀性。下面在实施例6中描述用于制备具有低密度表面不均匀性的凝胶的示例非限制性方法。
第二类伪影(即裂解碎片颗粒)的尺寸和数量可以从一个全血样品到另一个全血样品而变化，并且已经发现取决于血液裂解试剂(BLR)的组成。
国际专利申请号标题为“用于提取微细胞的设备和方法”的PCT/CA2013/000992公开了许多不同的血液裂解试剂组合物，其可用于在离心之前消化血液组分。如上所述，血液裂解试剂的存在引起血细胞的选择性裂解。在国际专利申请No.PCT/CA2013/000992中，血液裂解试剂可以是包括皂苷和多茴香脑磺酸钠(多茴香脑磺酸的钠盐，称为SPS)的水性液体，并且具有这样的组合物的血液裂解试剂在下文中称为“1型”血液裂解试剂。血液裂解试剂还可以包括消泡剂，诸如聚(丙二醇)(PPG，例如具有大约2000的分子量)。国际专利申请No.PCT/CA2013/000992教导了在混合全血和血液裂解试剂后，1型血液裂解试剂的皂苷和SPS的示例浓度范围分别为约1.5至80mg/mL和0.5至20mg/mL。
如国际专利申请No.PCT/CA2013/000992中所教导，SPS是抗凝血剂和抗吞噬作用剂并且已知抑制抗微生物剂(Sullivan,N.M.,Sutter,V.L.,&Finegold,S.M.(1975).Practical aerobic membrane filtration blood culture technique:development ofprocedure.(实用的好氧膜过滤血液培养技术：程序的开发)Journal of clinicalmicrobiology,1(1),30-36)。SPS有助于血细胞裂解的机制尚不清楚。不希望受理论限制，据信SPS可在血细胞裂解期间对微生物提供一定水平的保护，降低细胞碎片中细菌截留的发生率，和/或降低否则可能存在于沉淀物中的裂解碎片组分的量。
在由国际专利申请No.PCT/CA2013/000992教导的血液裂解试剂组合物的另一个实施例中，血液裂解试剂可以是在pH范围为9至11的缓冲液中包括Triton X-100和SPS的水性液体，并且具有这种组合物的血液裂解试剂此后称为“2型”血液裂解试剂。血液裂解试剂还可以包括消泡剂，诸如聚(丙二醇)(PPG，例如具有大约2000的分子量)。国际专利申请No.PCT/CA2013/000992教导了在混合全血和血液裂解试剂后，2型血液裂解试剂的TritonX-100和SPS的示例浓度范围分别为约0.5至1.5％w/v和5至10mg/mL。
如上所述，根据国际专利申请No.PCT/CA2013/000992的教导，发现上述1型血液裂解试剂组合物适用于从全血手动和半自动分离和浓缩微生物细胞。然而，当将国际专利申No.PCT/CA2013/000992中公开的试剂配方适用于根据国际专利申请No.PCT/CA2015/050449(标题为“Apparatus,System and Method for Performing AutomatedCentrifugal Separation”，于2015年5月19日提交，其全文以引用方式并入本文)的自动化方法，从全血中自动分离和浓缩微生物细胞以及随后的鉴定时，本发明人发现1型血液裂解试剂组合物最适合于全血量少于约1毫升的情况。
用于实现裂解碎片颗粒的低表面密度的另一个示例血液裂解试剂描述于2019年5月24日提交的国际专利申请No.PCT/CA 2019/050716，标题为“METHODS AND COMPOSITIONSFOR THE SELECTIVE LYSIS OF BLOOD CELLS AND SEPARATION OF MICROBIAL CELLS”，其通过引用全部并入本文，并且其描述了用于保持微生物细胞活力并将样品粘度降低至流体移动操作通过盒上的窄通道可以在没有不可容忍的阻碍的情况下进行的水平的示例血液裂解试剂组合物和方法。本发明的血液裂解试剂组合物(以下称为3型血液裂解试剂)可以含有皂苷、SPS、碱性缓冲剂和任选的非离子型表面活性剂。
在一个示例实施方案中，3型血液裂解试剂可以具有使得在将血液裂解试剂与样品混合后，皂苷的浓度为介于3和60mg/ml之间，SPS的浓度介于1.5和50mg/ml之间，非离子型表面活性剂的浓度为0-3％w/v内，pH为7.8-10内。在一些示例实施方案中，可以选择缓冲液浓度使得有效缓冲液浓度在10-300mM的范围内。应当理解，对于给定的一组条件，通过实验研究给定组分的浓度变化对一种或多种性能度量的影响，可以确定血液裂解试剂的给定组分的合适浓度范围，所述性能度量诸如但不限于溶血效率、残留血细胞碎片的量、微生物细胞完整性和微生物细胞活力。3型血液裂解试剂可作为两种或多种试剂提供，所述试剂可单独储存并在使用前混合，使得血液裂解试剂的皂苷组分储存在与血液裂解试剂的碱性组分分离的酸性环境中。在一个示例实施方案中，被混合以形成最终血液裂解试剂的一种或多种试剂可以被储存在固相中。
因此，在一些示例实施方式中，可以用3型裂解试剂处理样品，所述3型裂解试剂包含皂苷、多茴香脑磺酸钠(SPS)、非离子表面活性剂(诸如，但不限于，TritonTM X-100)、缓冲液(例如，碳酸盐--碳酸氢盐缓冲液)，碱性pH。血液裂解试剂还可以包括消泡剂，诸如SE-15(例如10％w/v的活性硅酮聚合物和非离子乳化剂的乳液)。
已知不含非离子型表面活性剂和碳酸根-碳酸氢根缓冲液的血液裂解试剂对微生物细胞是有益的。然而，如下所示，在处理全血样品的情况下，已经发现根据使用这样的血液裂解试剂转移到最终细胞悬浮液中的血液碎片的尺寸导致表面伪影(背景)水平升高，这可能妨碍微集落检测和表征。相反，在不显著影响细胞活力的同时，添加适量的非离子型表面活性剂(例如TritonTM X-100)，和碳酸根-碳酸氢盐缓冲液，以及皂苷和SPS，可有益于显著减少由裂解碎片引起的表面伪影。
在一些示例实现方式中，体积高达10mL的全血样品可以与3型血液裂解试剂混合，使得最终混合物中皂苷的浓度范围在10-30mg/ml之间(或，在一些示例实现方式中，3-60mg/ml)，最终混合物中SPS的浓度范围在5-50mg/ml之间(或，在一些示例实现方式中，1.5-50mg/ml)，有效缓冲剂浓度在10-300mM的范围内，非离子型表面活性剂的浓度在0-3％w/v(或者，在一些示例实施方式中，0-1％w/v)，最终混合物的pH可以在7.8-10的范围内(或者，在一些示例实现方式中，8.2-9.5)，消泡剂乳液的浓度为0.005至0.5％(v/w)内。
为了说明表面伪影密度对血液裂解试剂组成的依赖性，根据实施例5的方法处理4mL全血样品，二者均使用血液裂解试剂洗涤循环2次，血液裂解试剂具有如下组成：35mg/mL皂苷，20mg/mL SPS(BLR1)和(ii)35mg/mL皂苷，20mg/mL SPS，0.3％w/v TritonTMX-100和50mM碳酸根-碳酸氢根缓冲液，pH为10(BLR2)。在将样品暴露于相应的血液裂解试剂并且离心分离之后，将1μL的每种最终微生物细胞悬浮液移液到琼脂糖凝胶板上的点上。将微生物细胞悬浮液样品铺展成直径约5mm的圆形区域，并在约三分钟内风干。通过装备有5×物镜的显微镜对本文中标记为微小培养区(MCR)的这些区域成像，并且呈现在图3A和3B中。在这些图中，MCR，未使用的琼脂平板表面和两个区域之间的边界分别由310、312和311表示。如观察到的，包含TritonX-100和碳酸根-碳酸氢盐缓冲液显著降低了背景(表面伪影的密度)。
本发明人发现这种背景水平不能通过增加洗涤循环而进一步显著降低。例如，这通过使用具有如上所述的配方的BLR2以2个或4个后续离心洗涤循环处理4mL全血样品来证明。将1μL的所产生的微生物细胞悬浮液分配在琼脂平板上并且允许展开并且风干。用10×显微物镜记录所得MCR的照片，并分析2次和4次洗涤循环结束时碎片的尺寸分布。通过基于强度的自适应自动阈值方法定位粒子并用椭圆拟合。更准确地，执行图像分割并且将标记分配给图像中的每个连接的像素组，使得具有相同标记的像素共享特定的强度特性。测量的主粒径(拟合椭圆的长轴)分布的直方图呈现在图3C中。如观察到的，尽管样品在2次和4次洗涤之间稀释了400倍，但分布曲线在性质上是相似的。
这些结果表明，当处理血液样品用于随后的直接集落生长时，碎片颗粒的尺寸受到血液裂解试剂的组成的强烈影响。然而，对微生物细胞活力的要求，特别是在革兰氏阴性菌的情况下，限制了通过增加血液裂解试剂的消化能力实现更小碎片尺寸的能力。只要碎片的尺寸和密度不妨碍微生物细胞在微集落水平上生长的检测，这种限制是可以耐受的。在这方面的一个示例标准是在将最终细胞悬浮液铺展在细胞生长室上之后，裂解碎片伪影不应以超过90％、或优选不超过50％、或更优选不超过20％的面积分数覆盖固相生长培养基的表面。本发明人已经发现，可以通过用3型血液裂解试剂处理全血样品来满足该标准。
在伪影的表面密度不是过高的情况下，通过在一段时间内通过时间推移成像记录多个图片，或者例如通过大小阈值去除背景，来区分背景与微集落是可行的。为了进行大小选择，可以在孵育之前或之后从表面的有限区域拍摄凝胶表面的图像。在一个示例实现方式中，执行图像分析以确定碎片颗粒的平均尺寸Rback.av和碎片颗粒尺寸的标准偏差sd，并且可以基于Rback.av和sd来确定尺寸阈值。尺寸选择标准可以被设置为例如R>R阈值＝Rback.av+n*sd，其中n通常是在范围1至6中选择的整数，并且更通常n＝3。在另一个实施方案中，Rback.av和sd可以被预先确定(例如与盒一起提供或嵌入装置/仪器的软件中)以在集落分析阶段变得可用。
在一些示例实施方案中，集落生长模块配置成用于在使细胞悬浮液流入生长室中之后去除微生物悬浮液的液体组分(即，液体组分的至少一部分)，这样使得悬浮液内的微生物细胞的至少一部分保留在固相生长培养基的表面上。去除细胞悬浮液的液体组分有助于将微生物细胞接种到固相生长培养基上，促进随后的集落生长。此外，通过除去细胞悬浮液的液体组分，还减轻了与残留液体的存在相关的其他并发症，诸如凝结和过量水分，凝结和过量水分可以干扰通过光学或其他(例如电)方式对生长集落的监测。
在一些实施方案中，除去细胞悬浮液的液体组分可以通过蒸发实现，或者被动地通过通风口或蒸气可渗透膜，或者主动地借助于强制对流蒸发。在其他实施方案中，液体组分可被生长培养基或注入生长培养基的基质吸收。
在一个示例实施方式中，如图4A所示，存在于生长室中的细胞悬浮液的液体组分可以通过生长室上壁中的蒸汽可渗透膜115被动蒸发。在另一个示例实施方案中，可以通过降低室的环境压力以加速细胞悬浮液流体的蒸发来主动增强蒸发。例如，在25℃下，水的蒸气压为约24mmHg。这可以通过以下方式实现：通过阀或其他装置关闭室入口和出口并且通过室的上壁中的可渗透膜115施加负压，或者通过将关闭的且不可渗透的室连接到真空泵的流体导管施加负压。
在图4B所示的另一个示例实现方式中，空气可以流过细胞悬浮液以通过强制对流蒸发帮助细胞悬浮液流体的蒸发。空气可以被干燥和/或加热以进一步增加蒸发速率。
在其他示例实施方案中，细胞悬浮液的液体组分可通过吸收被动地除去，如图4C所示。在该实施方案中，以多种干燥形式之一提供生长培养基，干燥形式吸收液体并使微生物细胞与生长培养基接触以促进集落生长，并且在一些实施方案中固定集落用于随后的收获。
下面将更详细地描述合适的吸收液体的固相生长培养基的各种实施例及其制造方法。在一些示例实施方案中，生长培养基110的至少上部部分(图2B)可以具有具有亲水性特性的多孔网络，其中多孔网络是以至少部分干燥的状态提供的，这样使得内部多孔网络是至少部分开放的并且能够吸收液体。换言之，固相生长培养基110可以以不被液体完全饱和的状态提供。因此，由细胞分离模块提供的细胞悬浮液的液体组分可在与固相生长培养基110接触时被固相生长培养基吸收，使固相生长培养基110水合并将细胞悬浮液的微生物细胞吸到固相生长培养基的表面上。可以选择固相生长培养基的孔隙率以防止微生物细胞进入多孔网络，使得当细胞悬浮液的液体组分被吸收时，微生物细胞保留在固相生长培养基的表面上或其附近(邻近固相生长培养基的表面)。
吸收液体的固相生长培养基(未完全水合并且具有进一步吸收的能力的固相生长培养基)的使用解决了在封闭的集成流体装置内促进微生物细胞从细胞悬浮液受控吸附到用于集落生长的表面上的显著问题。通过快速和有效地吸收细胞悬浮液的液体组分，避免了与残余液体(例如残余液滴或局部聚集)的存在相关的并发症。本发明人已经发现这样的残余液体可以阻碍细胞表面缔合。此外，残余液体可导致凝结和过量水分，这可通过光学或其他(例如电)方式干扰对生长集落的监测。下面将更详细地描述合适的吸收液体的固相生长培养基的各种实施例及其制造方法。
在一些示例实施方案中，固相生长培养基可以以脱水或部分脱水的形式提供。因此，细胞悬浮液的液体组分在被引入到生长室中时被吸走到固相的孔中，并且微生物细胞保留在表面上。
在美国专利No.4,565,783中公开了脱水固相生长培养基的一个示例。用粘合剂(诸如丙烯酸异辛基酯/丙烯酰胺的共聚物(摩尔比为94/6))涂覆自支撑防水基底，诸如聚酯膜，粘合剂对微生物的生长没有抑制性。将冷水可溶的胶凝剂，诸如瓜耳胶与用于生长微生物细胞的营养物一起分散到粘合剂中。在与液体接触时，液体与胶凝剂的颗粒反应，形成固相用于支持微生物细胞的生长。
在另一个实现方式中，胶凝的固相在低湿度环境中部分脱水并在湿度受控包装中保持部分脱水直至使用。或者，胶凝的固相可通过冷冻干燥技术部分脱水。
在另一个示例实施方案中，细胞悬浮液的液体组分的至少一部分可以在与细胞悬浮液接触之前通过基于凝胶的固相生长培养基的离心处理除去。图5A-5D说明了该实施方案的示例实现。固相生长培养基由于绕轴线旋转而受到离心力103，如图5A所示。虽然该图示出离心力的方向垂直于图5A中的凝胶表面，但是应当理解，在其他示例实现方式中，离心力的方向可以相对于固相生长培养基的表面成一定角度(例如，在与垂直方向成30度的角度内)。由于离心力，凝胶部分地脱水(“去水化”)，至少在凝胶的上部除去凝胶的液体组分而不使凝胶显著坍塌，如图5B所示。
如图5C所示，当含有微生物细胞的微生物细胞悬浮液分配在凝胶上(与凝胶接触)时，其在凝胶表面上铺展，其中微生物细胞悬浮液的至少一部分液体内容物被部分脱水的凝胶吸收，如图5D所示。微生物细胞悬浮液可以散布在凝胶上，并且微生物悬浮液的液体组分可以被动地(例如，在重力下)或例如在随后的离心力的施加下被吸收。在去除微生物细胞悬浮液的液体组分之后，在凝胶表面上留下微生物细胞。
凝胶的渗出的液体组分(例如水)可以收集在凝胶后面的空腔内。从凝胶中渗出的水可以在离心过程中或之后排出。
当琼脂糖多糖螺旋圈形成的凝胶网络的弹性压力超过通常引起凝胶膨胀的水的渗透压时，大多数水凝胶材料发生脱水现象，也称为脱水收缩。外部机械压力，诸如离心，通过挤压凝胶促进脱水收缩，类似于从湿海绵中挤出水。从凝胶中除去一些水提供了通过打开凝胶网络中的空位以允许新水进入而快速吸收细胞悬浮液的机会。控制被交换的水的体积将是生长室设计的关键设计特征。因此，在本发明的以下部分中，呈现了实验观察，证明脱水现象作为凝胶组成的函数而定量。
为了模拟离心时从琼脂凝胶中损失的水，将凝胶放置在离心管内的多孔膜的顶部并以4000RPM旋转。在离心之前和之后测量凝胶的质量，差异归因于作为对凝胶的离心力的结果的水损失。在一个实验中，将约0.15克切片的琼脂凝胶从皮氏培养皿中切出并放置到具有0.45μm改性尼龙过滤膜的NanoSep管中。然后将该管以4000RPM(3200g)旋转8分钟，导致水与凝胶分离，穿过膜并在管的底部收集。然后测量残留在膜上的凝胶的质量，并且根据离心之前和之后的凝胶的质量差异确定水损失百分比。
结果示于图5E，表明用较高含量琼脂(1至3％)制备的琼脂凝胶更耐脱水。这种更大的水保留是由于凝胶更大的强度，使其更抗由离心力的脱水收缩。本发明人还观察到较硬的凝胶在离心过程中不易开裂或变形。还研究了不同的凝胶添加剂以确定它们对离心失水的影响。所选择的添加剂主要是具有胶凝(琼脂、结冷胶、阿拉伯树胶和角叉菜胶)或非胶凝(右旋糖酐)性质的其他多糖类水胶体。此外，结冷胶(GelzanTM CM)和角叉菜胶通常用作微生物培养物的琼脂替代物。与仅1.35％(49％损失)或甚至1.85％琼脂(39％损失)相比，具有0.5％结冷胶的1.35％琼脂在0.45μm Nanosep管中离心后保留最多的水(按质量计，平均27％水损失)。认为这种更大的保留是由于抵抗来自离心机的外部压力的凝胶的更大强度。
使用具有较小孔尺寸的过滤膜重复实验。在这种情况下，在高压同时保持温热(～50℃)的釜中，在Amicon Ultra-15超滤管的10,000MWCO(<5nm孔尺寸)纤维素膜上分配凝胶。每个试管冷却时具有约1.5克凝胶，然后以4000RPM离心9分钟。然后测量保留在膜顶部上的凝胶的质量，并且计算水损失的百分比并呈现在图5F中。结果展示了与较大的0.45μm孔相比，较小的膜孔尺寸如何降低所有凝胶的脱水水平。在1.35％琼脂中加入0.5％结冷胶与其他22至23％的凝胶相比，在约16％时水损失较少(即保水率较大)。
本发明人观察到，如果凝胶很好地限制在其侧面和背面，则可以减少或防止脱水。可以采用凝胶限制的使用来限制脱水水平(低于该水平的脱水被消除或减少)，使得从凝胶去除的液体的体积对应于样品的液体组分的体积，该样品希望在凝胶表面上铺展并且通过再水化过程被凝胶吸收。
不受理论的约束，假定脱水在凝胶内的分子线圈中留下空隙，空隙可能被来自微生物悬浮液的新鲜液体(例如水溶液)再填充。为了通过实验说明这一点，将在10,000MWCO超滤管中离心后脱水的凝胶部分(参见上文)从管中取出并置于小塑料平皿上以确定它们的质量。每个平皿装有2mL淡水以浸入凝胶中。浸泡20分钟后，通过将多余的水从平皿中倒出并小心地从平皿和凝胶上擦掉剩余的液滴来除去多余的水。然后获得凝胶的质量并记录为相对于脱水凝胶的质量的质量增加百分比，如图5G所示。
结果表明，在离心过程中损失的水的量可以通过使凝胶再水化而重新获得。即，脱水的百分比类似于每种凝胶的再水化的百分比。因此，当凝胶再水化时，用大约相同体积的水重新填充当从凝胶中排出水时在凝胶网络中产生的空隙。
还可以通过与环境进行水交换来实现凝胶的部分脱水。如果凝胶脱水程度较低，则该过程是可逆的，可实现几乎完全的再水化。如果离心辅助的凝胶脱水将通过适当的室设计由几乎完全限制凝胶来防止，同时通过离心进行用于样品接种目的再水化，则该性质是有用的。为了说明该方法的可行性，进行了以下实验。
将琼脂浓度为1、2、3和4％重量的琼脂凝胶在35mm培养皿中于4℃开放储存3天期间脱水。在储存之前和之后记录平皿中凝胶的质量，证明每种凝胶平均损失6至7％的质量(参见图5H)。然后通过向凝胶顶部的皮氏培养皿中加入1mL水使凝胶再水化，4小时后，除去水并将凝胶再称重，显示1％重量的琼脂凝胶重新获得与脱水损失相同量的水，而2％重量或更多的凝胶在再水化4小时后获得约1％的质量。为了确定在第一次脱水之前水容量是否可以超过其原始量，将凝胶在1mL水中再浸泡24小时。在除去水并测定质量之后，发现使用1％和2％重量的琼脂凝胶，除了在初始再水化之后吸收的水之外，没有额外的水被吸收。用3％和4％琼脂制成的凝胶通过额外的水吸收使它们的质量从它们的初始质量增加2.1至2.6％。
不受理论的约束，图5H中给出的结果可以通过考虑由水包围的琼脂糖多糖制成的琼脂凝胶复合螺旋卷来考虑(琼脂凝胶还含有琼脂果胶，琼脂果胶是一种非胶凝多糖，占琼脂组合物重量的30％)。一些水通过氢键合相互作用结合至琼脂糖卷(并且可能地琼脂果胶)，但是其大部分以未结合的、流体样形式存在，其不对凝胶卷提供结构支撑。用1至4％琼脂制成的琼脂凝胶，所有凝胶通过蒸发失去未结合的水而脱水相同程度(6至7％)。在再水化时，水在渗透梯度的驱动下再次进入凝胶，并再次占据蒸发后留下的一些空隙。对于用更高浓度的琼脂(>2％重量)制备的凝胶，渗透梯度稍高，导致比新鲜凝胶中的初始量吸收更多的水(多2-3％)，但凝胶的刚性螺旋结构由于额外的水可以进入的位置的限制而限制其体积。
为了确定仅在重力存在下的再水化，将在35mm培养皿中以2％重量琼脂浓度制备的两种凝胶脱水至不同程度；一个在室温下未密封储存后脱水30％，另一个在4℃下密封储存后脱水约2％。然后将4个区域的25μL红色染料溶液添加至每个凝胶(为了改善可视化)并且观察溶液完全渗透凝胶所花费的时间。在30％脱水凝胶的情况下，溶液用约5分钟浸泡凝胶内部，在其表面上留下红色斑点。在4％脱水凝胶的情况下，溶液用近20分钟浸泡凝胶。
在一个实施方案中，如图5I所示，凝胶放置在位于吸收材料(例如吸收垫)132上的膜131上。在一些示例实施方式中，膜可以具有范围从0.2μm到小于5nm的孔尺寸(例如10,000道尔顿的尺寸排阻)。在这种情况下，当通过离心对凝胶施加足够的压力(例如>30psi)时，来自凝胶的水仅通过膜。合适的膜材料的示例包括厚度范围从50至250μm的聚碳酸酯、聚酯、PTFE、PEEK或PVDF。可以使用胶或其他粘合剂将膜结合到生长室的侧壁，以防止热的液体凝胶在凝胶被倒入平皿中时泄漏到吸收材料上。吸收垫被放置在平皿的底部并且吸收在离心时从凝胶中去除的水并且穿过顶部上的膜。吸收材料可由例如但不限于纤维素或玻璃纤维的材料制成。在离心过程中，从凝胶中渗出的水被吸收材料置换和吸收。在图5J所示的另一实施方案中，在凝胶旁边设置有用于排出渗出水的通道。
图5K示出了用于研究图5I所示实施方案的示例实现方式的示例生长室。.标准的35mm透明聚苯乙烯皮氏培养皿在底部边缘周围衬有双面粘合剂环133，并且将两层WhatmanNo.2纸132放置在环内。纸用作吸收在脱水过程中释放的水的吸收材料。将0.5μL的染料溶液点样在吸水纸上的多个位置中，作为指示符点，如在134处所示，以便估计在储存期间从凝胶转移至吸水纸的水的量。
期望膜131在储存条件下防止水转移并且仅允许在离心期间转移。在这方面，测试了两种不同膜的适用性：孔径为0.1μm的聚碳酸酯膜和孔尺寸为10μm的PTFE膜。PTFE膜是强疏水性的，并且预期在防止离心之前的水转移方面胜过聚碳酸酯膜。为了研究这种假说，制备了两个示例生长室：一个生长室具有聚碳酸酯膜，另一个生长室具有PTFE膜。然后将50℃的琼脂溶液(1.35％重量)倾倒在每个膜的顶部上并且允许固化成凝胶并且固化超过3小时。将各室用石蜡膜密封并在4℃储存过夜。在倾倒凝胶后7小时和20小时拍摄凝胶的照片，并与三小时拍摄的照片比较，如图5L所示。如观察到的，尽管具有大得多的孔径，但PTFE膜在上述储存条件下几乎防止水转移，仅可观察到极小的染料斑点模糊。因此，期望具有甚至更小孔尺寸的PTFE膜可以更有效地防止水传递。
图5K的示例生长室的研究的第二目的是说明PTFE膜允许在离心期间将凝胶水转移到吸收材料，从而能够实现自动的样品接种。为此，准备三个生长室：一个生长室构造为具有根据图5K的实施方案的膜过滤器，并且另外两个生长室构造为没有膜过滤器和吸收纸。将具有膜的生长室和一个非膜生长室在3200g下离心8分钟。离心后，将100μL染料溶液分配在每种凝胶(包括未进行离心的生长室的凝胶)的四个点上，并使其沉降5分钟以评估每种凝胶通过吸收染料溶液而局部再水化的能力。
分配染料溶液后的凝胶照片示于图5M。如观察到的，对于未经受离心的室，染料溶液以液滴形式保持在凝胶表面上。相反，在没有膜和吸收垫的室的情况下，在离心阶段期间，通过脱水过程(～100μL)，通过通过侧面泄漏到凝胶表面，除去凝胶的一小部分水含量。该释放的水在分配染料溶液之前已经排出，但是由于凝胶从室表面分离，分配的液体的一部分流到凝胶和室壁之间的间隙。相反，具有膜和吸收垫的生长室非常容易吸收分配的样品。该吸收过程可以通过在分配染料溶液之后离心生长室而加速，例如，以至少1000rpm的速度离心至少一分钟的持续时间。
在涉及基于凝胶的固相生长培养基的离心脱水的一些示例实现方式中，可以在离心分离过程(例如，使用集成流体装置的分离模块执行的分离过程)期间向凝胶施加离心力。
在一个示例实施方案中，细胞悬浮液可与固相生长培养基接触，随后可进行离心以同时除去凝胶的一部分液体组分，并将来自微生物细胞悬浮液的液体组分引入凝胶中。
从凝胶中渗出的液体的体积优选与细胞悬浮液的体积相似(例如在25％内、在10％内或在5％内)。应当理解，进行凝胶的部分离心脱水和微生物细胞悬浮液的液体组分的吸收的能力取决于包括但不限于凝胶浓度、凝胶厚度、凝胶表面积和凝胶经受的离心力的持续时间和大小的因素。为了获得合适的性能，可以通过实验根据经验确定合适的参数组，诸如选择材料和加工参数，使得从凝胶中渗出的液体体积大约等于微生物细胞悬浮液的体积。
例如，在通过图13A-13D所示的示例盒进行细胞分离的示例情况下，最终细胞悬浮液的体积是100μL。在这种示例情况下，包括在生长室中的凝胶可以具有10cm2的表面积和5mm的厚度。对于1.5％琼脂糖凝胶的示例情况，在4000g离心约10分钟后渗出的水的体积接近100μL。本发明人已经发现，更浓缩的凝胶，诸如4％，在类似条件下渗出约20μL的水，并且本领域技术人员可以使用前述实验方法或其变型来确定在给定的一组材料和加工条件下挤出的凝胶的液体组分的体积，并且选择合适的相应体积的微生物细胞悬浮液。
如上所述，细胞接种过程(即，使微生物细胞悬浮液与固相生长培养基接触并使其液体内容物被部分脱水的凝胶吸收的过程)可通过被动吸收(例如通过重力辅助)或离心进行。本发明人已经发现，前述凝胶(1.5％凝胶，具有5mm厚度和10cm2表面积以及100μL细胞悬浮液体积)的被动接种(仅通过使细胞悬浮液与凝胶表面接触)可能在室温下耗费20分钟。这可以通过使用离心接种来减少。例如，在使微生物细胞悬浮液与脱水凝胶接触之后，可以通过斜线上升至500-4000g并且随后斜线下降来离心生长模块，其中离心力将悬浮液中的微生物细胞导向凝胶表面。此操作可能需要30s到1分钟。当使用较低的离心力时，例如500-1500g，在斜线上升和斜线下降之间停留(例如20-40秒)可以提供更有效的细胞接种。
在使来自细胞悬浮液的微生物细胞与固相生长培养基的表面接触，同时使至少生长室保持在封闭状态之后，集成流体盒可以在至少生长室处于封闭状态的情况下，在具有适于促进微生物细胞生长(例如37℃)和集落形成的温度的环境中孵育。
在一个示例实施方案中，至少包含生长模块(例如，仅生长模块)的集成流体盒的一部分可从集成流体盒的其余部分拆卸。该实施方案在两个方面是有利的。首先，避免可能包括生物废物的集成流体盒的剩余部分的孵育。其次，当集成流体盒在配备有利用穿过生长培养基的光透射的集落监测形式的孵育器中孵育时，包含生长室的集成流体盒的拆卸部分可以是有益的。
一旦形成微集落，它们就可用于随后的测试。例如，在一个示例实施方案中，可以移除或打开上壁，以提供通向集落的通路，用于其收获(例如，移除和转移)，用于后续处理，诸如但不限于MALDI鉴定测定、代谢鉴定测定和AST。上壁120可以包含可移除的盖子、可剥离区段或其他打开装置以便于接近这些集落。
由于多种原因，涉及分离的微生物细胞与固相生长培养基的接触和孵育的本示例实施方案可能是有利的。首先，如上所述，初始分离步骤可以有效地降低可能已经存在于样品中的抗生素的浓度。实际上，在从怀疑患有脓毒症的患者获得全血样品的情况下，通常在静脉切开术开始之前开始经验性的抗微生物治疗。其次，在绕过常规的液相培养步骤中，本实施例的方法有利于从先前未培养的样品直接形成微生物集落，节省了大量的时间(例如1-2天)并因此减少了阳性时间。
本实施例方法的第三个益处是单个微生物细胞在固相生长培养基上的空间性区别生长促进了来自多微生物样品的不同细胞种类(即细胞种类；不同分类的微生物细胞，诸如不同的属、种或菌株，或细菌与对真菌细胞)的独立生长。因此，本实施例方法允许直接测定样品固有的和真实的多微生物性质，而不受在液体培养环境中另外发生的竞争的干扰和无偏见。结果，可以基于在固相中生长的集落的一种或多种性质，鉴定存在两种或多种不同微生物细胞种类，具有以单独和独立的方式对存在的两种或多种不同细胞种类进行进一步处理(例如鉴定，诸如通过MALDI或AST，诸如通过肉汤微量稀释或其他方法)的能力。在一些示例实施方案中，可以处理与给定细胞种类相关的单个集落，而在其他示例实施方案中，可以汇集并处理来自给定细胞种类的两个或更多个集落。
可以根据一种或多种检测方式监测在固相生长培养基上形成的集落的生长，随后在固相生长培养基上分配分离的微生物细胞悬浮液。在一个示例实施方案中，可采用光学检测来监测一个或多个微生物细胞集落的生长。例如，在一个示例实现方式中，可以采用相机来对固相生长培养基的至少一部分成像。在另一个示例实施方案中，可以在没有成像元件的情况下使用光电检测器阵列以获得一个或多个微生物细胞集落的图像，其中与集落相关的生长表面位于足够接近光电检测器阵列的位置以在其照射时在其上形成图像。在光学系统的视场小于固相生长培养基的空间范围的实现方式中，可以相对于固相生长培养基扫描光学系统，或者反之亦然，以便于整个固相生长培养基表面或其期望子集的光学查询。
可以使用已知的图像处理算法来处理图像以识别微集落并且可选地估计所识别的微集落的一维或多维量度。例如，可以使用公众可获得的软件，诸如ImageJ/Fiji程序。在一个示例方法中，在将图像转换为灰度图像之后，可以通过基于强度水平的直方图分析根据Phansalkar方法应用局部自适应图像阈值化来二进制化灰度图像。然后可以根据Phansalkar方法采用自适应图像分割，其中尺寸约束将图像分割成段用于微集落识别。然后可任选地进一步分析所识别的部分以确定与微集落相关的感兴趣的度量(例如圆形度、面积、长轴和短轴)。有许多不同的示例算法可用来以无偏差的方式计算阈值。Phansalkar阈值方法是对Sauvola阈值方法的修改，针对低对比度图像进行了优化[Phansalskar,N；More,S&Sabale,A et al.(2011),"Adaptive local thresholding for detection ofnuclei in diversity stained cytology images.",International Conference onCommunications and Signal Processing(ICCSP):218-220,doi:10.1109/ICCSP.2011.5739305]。其他示例方法包括Bernsen、Contrast、Mean、Median、MidGrey、Niblack、Otsu和Sauvola方法。
在一个示例实施方案中，可查询微集落的微生物细胞(例如通过图像处理或检测一种或多种光学信号，诸如拉曼信号或荧光信号)以根据两种或更多种微生物细胞种类对在固相生长培养基上生长的一个或多个集落的微生物细胞进行分类。当随后执行具有较高置信度/准确度或较大类集的后续分类方式时，这种类别的确定可被称为“推定识别”或“推定分类”。应当理解，可以基于集落形态或其他技术确定细胞的种类。
例如，如上所述，固相生长培养基可以提供有生色或荧光底物，其变化引起集落的特异性或非特异性染色(例如可检测的光谱特征或特征)，如例如欧洲专利申请No.EP1088896A2所述。
或者，透射穿过菌落的单色光的散射模式可用于对属和种水平进行分类，在某些情况下可下至血清型水平，例如，根据美国专利No.8,787,633或国际专利申请公开No.WO2016/162132中描述的方法。例如，可以通过将目标微集落暴露于相干光的光束，监测由微集落对光的衍射产生的衍射图，并且处理所监测的衍射图和参考衍射图以确定与微集落的微生物细胞相关的分类量度来进行微集落内的微生物细胞的假定鉴定。
如果在抗微生物易感性测试之前没有开始或进行更完整的物种水平的微生物鉴定测试(例如由于时间或成本节约或集落稀少等原因)，则至少对一大类诸如真菌与细菌和/或革兰氏阴性与革兰氏阳性的分类量度的确定，可以将其用于药虫选择(例如基于革兰氏状态选择合适的一组测试抗微生物剂)。在一些示例实施方案中，可以在多个波长下执行成像以便收集高光谱图像集，该高光谱图像集可以被处理以帮助细胞种类识别并且产生微生物细胞的种类的推定识别。
如上所述，本发明的推定识别或推定分类步骤可以导致在细胞收获之前将微生物细胞分类成细胞种类，诸如革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和任选地包括一种或多种物种的亚类。普通革兰氏染色试验是一个推定识别的示例。在微集落的情况下，非破坏性和试剂较少的方法是优选的，因为下游测定(诸如AST)需要有活力的和无损害的细胞。
在非破坏性和无试剂(无标记/标志物)方法中有光学方法，包括基于荧光的方法，以及弹性和非弹性散射。拉曼(微)光谱是非弹性散射的示例，并且来自集落的明场和暗场显微术或激光衍射的组合属于弹性散射类别。用于获得至少初步的微生物细胞种类确定的另一个示例光学形式是傅里叶变换红外显微术。用于在病原微生物细胞的类别之间进行区分的潜在机制与它们的特征属性相关，并且包括但不限于细胞壁组成、细胞形状和细胞运动性。后一属性引起跨越微集落的细胞的物种特异性包装。
在使用散射模式用于微生物分类的情况下，例如，使用微生物细胞的参考菌株的生长的基础真实图像库训练的卷积神经网络或其变型，可以用于鉴定给定的微生物细胞集落。图像库可以包括参考菌株在各种已知生长时间的图像。例如，可以在参考菌株的集落生长期间使用来自不同时间点的图像单独训练多个神经网络，使得在未知样品的集落生长期间的给定时间，可以使用使用对应于给定时间(或在相对于给定时间的时间窗内)的图像数据训练的合适的神经网络。可替换地，可以使用在不同时间点来自不同参考菌株的图像来训练单个神经网络。
在涉及固相生长培养基上生长的集落的光学成像的一个示例实施方案中，可以使用直接或间接测量的集落尺寸或大小，任选地连同给定成像集落的更多特性(诸如集落中微生物细胞的类型；(例如，属、科、种或菌株)，以估计集落中微生物细胞的数量和/或确定何时可以终止孵育并收获集落用于下游应用，诸如但不限于抗微生物易感性测试。该确定可以基于例如在给定数量的浓度下，用给定数量的对照或例如足够数量的微生物细胞促进通过MALDI鉴定对于给定数量的药虫组合进行抗微生物易感性测试所需的最小数量的微生物细胞。在一些示例实施方案中，可以收获尺寸小于1mm、小于500微米、小于250微米、小于200微米、小于150微米、小于100微米或小于50微米的检测集落。
通常，获得所需数量的微生物细胞的合适生长时间的确定将取决于细胞种类(例如属、科、种、菌株)和下游应用而变化。可根据查找表建立微生物细胞种类与达到用于后续测试的足够细胞计数的时间之间的关系。例如，自动化系统可以采用光学图像处理来确定与给定集落相关的细胞种类(例如，推断的或估计的微生物种类)，然后采用预定的关系(例如，查找表或预定的函数关系)，来确定例如合适的时刻，其中足够数量的微生物细胞存在于一个或多个集落中用于后续加工，或例如集落的合适尺寸量度(例如半径或其他空间量度)，其中足够数量的微生物细胞存在于一个或多个集落中用于后续处理。在一些示例实施方案中，涉及集落大小量度和时刻的多个标准可以与微生物细胞种类相关，以便估计集落中何时存在足够数量的微生物细胞。
为了说明基于直接从全血样品获得的微生物细胞的微集落形成的动态性质的示例，在4mL全血样品中掺入3000CFU的奇异变形杆菌(PM)细胞，并根据以下实施例5中描述的方法进行处理。将一μL的所得细胞悬浮液分配在四个琼脂板中的每一者上并且使其自发地扩散至直径为～5mm的圆形区域，该圆形区域此后被称为“小型培养”区(MCR)。在图6中呈现了所得到的MCR的一部分的图像。通过在开始孵育后3和4小时肉眼观察图像，可以观察到一些微集落，用箭头表示。然而，为了在较短的孵育时间(例如2小时内)检测微集落，可以分析图像以将用箭头标记的微集落与背景区分开。
用于微集落监测的一个示例方法描述如下。如从图7观察到的，为了对准在不同时间点(接种后0、2、3和4小时，如图中所示)采集的成像数据，执行具有刚性变换约束的2D-2D配准(采用平移和旋转)。使用关键点检测器SURF自动识别t0＝0小时图像与每个其他图像(t2＝2小时，t3＝3小时，t4＝4小时)之间的对应强度特征点，并将其用于相对于t0的对准成像日期。将在t0时存在的强度特征分类为背景，而将在另外图像(细胞/虫)上出现的强度特征分类为前景。在连续的图像中已经标记了给定的单个微集落的位置。
应当理解，可以采用各种配准方法来执行图像配准，包括但不限于基于特征的配准算法、基于强度的配准算法和非刚性配准算法。合适的基于特征的算法的示例包括SURF(加速鲁棒特征)和SIFT(缩放不变特征变换)方法。
在一个示例实现方式中，图像配准可以通过如下的基于强度的算法来执行。该算法对运动图像(在稍后时间点获取的图像)进行变换，使得其与固定/参考图像(在稍后时间点获取的图像)在空间上配准。基于该设置，要执行的变换的类型被定义为‘刚性的’或‘仿射的’。根据简化定义，算法在内存(用户指定的金字塔层级)内部构建多解金字塔，求解金字塔每一层的优化问题。换言之，该算法构建具有N个层级(例如，N＝5)的图像金字塔。在每个金字塔层级，图像尺寸减少2倍。优化从金字塔的最粗层级开始并继续，直到达到用户允许的迭代次数，或者直到优化器收敛，试图在下一金字塔层级上细化当前变换估计。
背景的确定允许微集落的增强检测。例如，尽管在图7的情况下获得的4个图像之间存在异常大的平移和旋转偏移，但在孵育后t3＝3小时时集落的鉴定是明确的。使用这种方法，可以更容易地开发全自动微菌落识别(减少阳性TTP的时间)和跟踪系统，以筛选未染色的活微生物的图像序列。下面结合图9A至9H中呈现的结果，与基于前述背景阈值方法的估计(例如，如果微集落的半径R>R阈值＝＝Rback.av+n*sd，则宣布斑点为菌落)相比，示出了方法的稳健性。
本示例时间推移成像方法是半定量成像技术，其中在不同时间点拍摄同一场景(或近似同一场景)的一系列图像以捕获动态变化，同时静态分量被分类为背景并且可以被移除。当前用于微集落动态分布的方法依赖于静态背景和照明的假设。然而，如果固体生长培养基的碎片或表面的光谱或空间特性不是静态的，则这种技术可能经受许多处理变化。首先，应注意，在获取图像期间，应提供合适的环境，其允许微集落在图像获取期间保持存活，同时表面基本上不老化(与碎片的尺寸变化及其移位相关的来自固体生长培养基表面的液体蒸发)。为了解决这些问题，除了其他因素之外，控制温度和湿度可以有益于孵育器的设计。在图15A所示的一个示例实施方案中，可以将一个或多个生长模块放置在具有透明且光学平坦的窗口的孵育器中，通过该窗口拍摄图像。在另一个实施方案中，可以将物镜和生长模块放置在具有受控湿度和温度的孵育器内。
为了表征用于快速和直接形成和检测微集落的本实施方案方法的性能，测量了在血流感染中发现的两种常见病原体的特征，即(i)滞后时间和(ii)生长速率。还使用图14的方法学和上述3型血液裂解试剂测量了来自血液样品的这些病原体的回收分数。
按照以下实施例7的步骤测定固相生长培养基(凝胶)上的生长速率。计数MCR中集落形成单位的数量，并将其对数(Log(CFU))对孵育时间作图，对于奇异变形杆菌(PM)的情况如图8A所示。该曲线的斜率，即0.97，用于通过关系式生长速率＝斜率/log(2)＝3.23周期/小时来计算生长速率。作为另一实施例，测量表皮葡萄球菌(SE)的生长速率且在图8B的时间图中展示测量的v(Log(CFU))与孵育。计算的生长速率为2.4个周期/小时。该生长速率比在CMOS芯片[Jung,Jae Hee,and Jung Eun Lee."Real-time bacterial microcolonycounting using on-chip microscopy."Scientific reports 6(2016):21473.]上孵育的表皮葡萄球菌的测量生长速率高约1.5倍。根据储备溶液的制备方法，接种的微生物细胞可以在增殖至微集落之前经过滞后期。例如，如从图8C观察到的，铜绿假单胞菌(PA)细胞显示约2小时的滞后时间。当集落中的细胞数量足够低以使大部分细胞能够分裂时，预期半对数尺度的线性趋势继续。一旦在微集落的内部区域的细胞数(其被剥夺用于增殖的空间)超过在周围的细胞数，则微集落的总生长速率预期降低。在大肠杆菌的情况下，对于含有多达106个细胞的微集落，本发明人没有观察到这样的偏差，如图8D所示。因此，使用生长速率和滞后时间数据来估计达到所需细胞数目所需的时间似乎是合理的。
图9A-9F显示了通过微集落检测对构成通常在血流感染中遇到的大部分病原微生物的微生物细胞物种的集合测得的接种细胞的时滞和生长速率。该表还包括根据实施方案8的方法测定的测量的细胞回收分数，即成功地从掺加的血液样品中分离并在保持细胞活力的同时重悬于细胞悬浮液中并因此能够形成集落的细胞分数。此外，该表还呈现了涉及集落在固相生长培养基(“固相”)上生长的本示例生长方法的估计阳性时间(TTP)，如通过相对于背景可辨别的微集落的时间所确定的(使用上文公开的示例方法)。
检测方法及其相关分析的灵敏度和背景将影响TTP。在查询从微生物细胞生长的微集落的存在的最简单的情况下，可以如下估计TTP，其中所述微生物细胞已经通过使用上述简单的大小选择方法从全血样品中分离。在图3C中的2次洗涤的情况下使用这些参数来计算阈值大小R阈值＝Rback.av+n*std：R阈值＝2+3*1.5＝6.5μm。假设最糟糕的情况是封闭包装并且平均细菌尺寸为1μm2，则具有半径R阈值的圆内的细胞数量将为约120CFU。因此，TTP＝Tlag+7/生长速率。
在真菌物种的情况下，由于它们相对于细菌的大尺寸，导致二元分裂的单一分裂足以检测微集落并确定阳性。这在图10中示出，其示出了血琼脂平板的截面的时间推移图像，在该血琼脂平板上已经分配了1μL的含有从全血样品中分离的微生物细胞的微生物细胞悬浮液。如可从图9G和9H中的生长速率数据计算的，孵育约4小时后，细胞的数量增加了～3倍。比较两张照片，真菌细胞增殖容易被识别。因此，可以得出结论，在真菌细胞的大分布中，阳性时间是TTP＝Tlag+1/生长速率。在典型的血液样本中，个位位数的细胞数和泊松统计是不可忽视的。因此，应该用TTP＝Tlag+n生长速率代替公式，其中n大于一。在一个示例实现方式中，采用n＝2的值。
其特征生长率与浮游生物状态的生长率相当。为了说明这种一致性，从如下所述进行的实验估计液体培养物中的生长速率。将十mL全血样品以5CFU/mL的浓度掺入不同菌株的微生物细胞，分别接种到BacT/
FA Plus培养瓶中，并在BacT/
VIRTUO中孵育。在孵育器指示阳性后，从每个瓶中抽取1mL等分试样，连续稀释，并铺板以确定CFU数。忽略滞后时间，并假设生长速率是恒定的，基于初始掺料浓度比和通过平板计数的阳性最终细菌浓度以及阳性时间(TTP)估计生长速率。如从图9A-9H观察到的，固相生长培养基上和液相生长培养基中的生长速率是相似的。然而，如通过TTP值可以清楚地理解的，由于微集落的局部性质，固相是有利的，从而有助于在更早的时间检测固相。例如，虽然大多数细菌物种在根据本发明的微集落示例方法平板接种后～3小时内容易检测到，但是用于在培养瓶中孵育的TTP通常高于10小时。
图9A-9G还包括估计细菌细胞产生具有104和105个细胞的微集落所需的时间。这些量与进行随后的微生物鉴定和/或抗微生物剂敏感性测试有关，如下所述。
现在考虑使用常规方法对生长在集落中的微生物细胞进行后续测试的示例情况，用
-MS[bioMérieux]进行微生物鉴定所需的细菌和真菌细胞的数量分别为每个MALDI斑点约105和104CFU。基于根据本示例方法在固相生长培养基上生长的集落的实验观察，快速生长的细菌，如屎肠球菌(E.faecium)和大肠杆菌可在约5小时内达到所需数量104-105个细胞，而生长较慢的细菌细胞，诸如铜绿假单胞菌将需要约7小时。对于真菌物种，达到所需细胞数量的孵育时间可能超过10小时。
在一些示例实施方案中，其中采用光学成像用于检测集落生长，来自多个集落的微生物细胞可以被组合以获得足够数量的微生物细胞用于随后的测试(例如，MALDI或表型AST)。例如，在涉及集落生长的光学成像以确定何时～104CFU可用的前述实施例中，如果存在10个集落(并通过光学图像处理确定与单一类型的微生物细胞相关)，则仅需要103CFU/集落，从而将生长所需时间减少log210(＝3.3)个倍增周期。通常，不受理论的限制，在监测和组合来自多个生长集落的微生物细胞以提供给定数量的微生物细胞的实施方案中，相对于采用单一集落的生长持续时间，生长持续时间减少log2N个倍增周期，其中N是集落的数量。在多个集落中的至少一些属于不同微生物细胞种类的多微生物情况下，获得用于随后测试的足够数量的微生物细胞(使用汇集的集落)所需的时间在不同细胞种类之间可能显著不同，这是因为细胞种类依赖性生长时间和每种细胞种类的集落数量。该依赖性可以例如以查找表的形式，或者例如以规定基于存储在查找表中的细胞种类特定参数对集落数的依赖性的数学关系的形式来规定。
如上所述，可能需要最小的细菌细胞数或浓度范围以通过将细胞与抗微生物剂在液体培养基中孵育来进行抗微生物易感性测试。在固相生长培养基上进行抗微生物易感性测试的情况下，该要求可以更宽松，这将在下面进一步详细描述。在后一种情况下，接种在表面上的微生物细胞悬浮液的液体内容物等分试样至少部分地吸收到凝胶网络中，留下彼此紧邻的细菌细胞。因此，集落的最小细胞含量可由所需浓度范围和悬浮集落的液体体积预先确定。
集落细胞含量的计数(例如，确定是否已经达到足够的集落大小和/或细胞计数，诸如在～103-104CFU水平)可以通过不同的方法实现。在一个示例实现方式中，基于与将一种或多种几何特性与微生物细胞计数相关联的参考数据的比较，可以处理与集落相关的一种或多种几何或光学性质(诸如，但不限于，由图像处理方法(诸如图像分割)确定的半径/面积或散射/反射/透射强度)，以确定集落内是否存在足够数量的微生物细胞用于后续处理。在另一个示例中，基于给定微生物细胞集落的成像，可以采用神经网络确定集落内是否存在足够数量的微生物细胞用于随后的测试，其中神经网络基于具有已知相关细胞计数的参考菌株的图像进行训练(或，例如，对于给定类型的后续测试，已知二元确定集落中是否存在足够数量的微生物细胞)。在一些示例实现方式中，可以部分地基于集落的一个或多个分类类别的检测的或推定鉴别来确定给定集落内是否存在足够数目的微生物细胞(例如，革兰氏状态、属、科、种、菌株等)。
如下面图11C和11D所示，可以采用选定的大小阈值(例如直径阈值)以确保针对多种细胞种类(例如物种)收获足够数量的微生物细胞。例如，如图11C和11D所示，可以在宽范围的微生物细胞物种中获得至少103个微生物细胞，条件是在达到70微米的直径阈值之后，但在达到100微米的直径之前(或者，至少65微米，但在达到100微米的直径之前，至少75微米但在达到100微米的直径之前，至少80微米但在达到100微米的直径之前，至少85微米但在达到100微米的直径之前，至少90微米但在达到100微米的直径之前，或至少100微米但在达到120微米的直径之前)收获集落。同样地，如图11C和11D所示，可以在宽范围的微生物细胞物种中获得至少105个微生物细胞，条件是在达到150微米的直径阈值之后，但在达到200微米的直径之前(或者，至少165微米，但在达到200微米的直径之前，至少175微米但在达到200微米的直径之前，至少180微米但在达到200微米的直径之前，至少185微米但在达到200微米的直径之前，至少190微米但在达到200微米的直径之前，或至少200微米但在达到250微米的直径之前)收获集落。虽然本示例阈值实施方案涉及直径，但是应当理解，在替代方案中可以采用其他尺寸度量，诸如半径或面积。
应当理解，光学成像仅仅是用于监测微生物细胞生长的一种示例检测形式，并且在替代方案中可以使用其他检测形式，诸如电阻抗，检测与微生物细胞生长相关的挥发性有机化合物，或者量热法。
如上所述，在已经确定具有足够量的微生物细胞的一个或多个集落的存在之后，可以采用微生物细胞进行一个或多个后续测定。可以在进行后续测试之前从固相生长培养基中收获(去除)微生物细胞。例如，可以收获一个或多个检测到的集落(例如使用人工收获、自动收获或其组合提取)并随后进行处理，使得它们以适合于后续测试的形式提供。例如，在一些示例实现方式中，收获的微生物细胞可以被稀释或浓缩。在一些示例实现方式中，收获的微生物细胞可以与液体组合以形成悬浮液，该悬浮液可以任选地被稀释或浓缩，并且任选地等分，之后进行一个或多个测定。
在一个示例实施方案中，已经鉴定了集落的位置，可以通过活组织检查穿孔、接种环或无菌棉签手动收获集落。对于一些应用，诸如通过MALDI鉴定，取出的集落可以放置在鉴定载玻片上。对于一些应用，例如抗微生物敏感性测试，可以将取去的集落悬浮在合适的介质中，诸如盐水溶液中。
在另一个示例实施方案中，已经鉴定了集落的位置，可以机器人方式收获集落。例如，使用类似于活检穿孔器的圆形仪器，可以将一小部分固体生长培养基与微集落一起取出。美国专利公开No.2018/0284146描述了一种装备有用于保持培养板的平台和具有挑取工具的可移动机械臂的装置，该挑取工具可以降低以从板上挑取集落。在装置的另一部分中，储存含有悬浮介质的无菌管。挑取工具挑取集落的一部分后，将挑取的集落移动并转移到无菌试管中。任选地，工具可以配备有超声波仪(超声换能器)或涡流混合器以更有效地释放所收获的微生物细胞。然后可以测量溶液的浊度并且可以将细胞浓度稀释至适合于后续微生物学测试(诸如抗微生物剂敏感性测试)的预定值。
在一些示例实施方案中，可以使用来自一个或多个集落或根据前述方法在固相生长培养基上形成的细胞来进行AST。进行AST的示例方法包括肉汤微量稀释法、盘扩散法和琼脂扩散法，诸如Kirby-Bauer法和e-检验。这类方法可得益于用于初始选择抗微生物组的推定的(高水平，诸如革兰氏状态和真菌与细菌的确定)微生物鉴定。
图11A提供了描述基于从根据上述方法生长的集落或微集落收获的微生物细胞进行AST的示例方法的流程图。首先按照上述示例实施方案进行细胞分离和接种，其中将微生物细胞与全血样品分离，同时保持它们的活力，并使其与生长模块内封闭的固相生长培养基接触。如上所述，该方法有利地以封闭方式进行以使污染的可能性最小化，特别是对于已知具有非常低的微生物细胞浓度的样品，诸如全血样品。然后将生长模块容纳在孵育/成像仪器内(其中生长模块任选地与集成流体盒的剩余部分分离)，其中孵育生长模块并监测可检测的微集落，例如用于在<4小时的持续时间测定阳性/阴性。然后可将检测到的微集落孵育以促进进一步生长，从而获得足够高的细胞计数用于随后的分析步骤(例如鉴定和/或抗微生物易感性测试)。例如，可将微集落孵育直至确定它们已达到>104和>105细胞的细胞含量，这分别足以进行抗微生物易感性测试(AST)和通过MALDI的细胞鉴定。在一个示例实施方案中，其中AST是根据下面描述的示例方法进行的，收获的微集落中的微生物细胞的最小数量可以设定在103至105的范围内。因此，给定的微集落可以在其推断的细胞含量已经达到至少103之后收获。在一个示例实施方案中，该确定通过通过显微术估计微集落尺寸并相应地估计微集落细胞含量的下限来进行。为了说明该示例微集落收获方法，如下所述进行一系列实验。
图11B绘制了对于大肠杆菌的示例情况，测得的微集落直径与无细胞含量的相关性(根据实施例7中描述的方法获得)。用幂律趋势线拟合散点图，计算出103和105细胞的平均微集落直径分别为60μm和170μm。按照类似的方法，计算17种普遍致病性革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在103和105CFU细胞含量下的平均直径，结果分别示于图11C和11D。根据该信息，如果当细菌微集落的直径达到65μm时收获细菌微集落，则不管其特性如何，微集落中的微生物细胞的数量将可能在103至105CFU的范围内。
如上所述，为了确定微生物细胞种类的量度(例如，确定革兰氏状态，和确定细菌与真菌细胞，和/或初步物种估计)，可以在收获之前非侵入性地查询一个或多个检测到的微集落的细胞。
然后可以收获检测到的具有相关种类的微集落并从生长室转移，再悬浮于缓冲液中以产生微生物细胞悬浮液，并用于进行抗微生物易感性测试。例如，如以下进一步详细描述的，可以将微生物细胞悬浮液的等分试样(例如～1μL)分配到多个含有固相生长培养基的微孔上，这些微孔含有厚度范围在0.5至10mm(或0.5-3mm)之间并且凝胶体积范围在20至150μl(或20μl至60μl)之间的凝胶。然后可以使微孔内的凝胶表面与具有不同浓度的一种或多种抗微生物剂的相应固体支持物接触(涂覆和/或浸渍)。抗微生物剂快速扩散到微孔中，并且可以监测保留在微孔表面上的微生物细胞的生长，例如，以确定最小抑制浓度(MIC)。例如，由于固相生长培养基的低体积和小空间范围以及抗微生物剂的快速扩散(例如，在1-2小时内实现指定的浓度或浓度范围)，确定哪些微孔支持微生物细胞生长以及哪些微孔抑制微生物细胞生长使得能够确定每种抗微生物剂的最小抑制浓度(MIC)。
在生长模块内检测到的第二微集落可以进一步孵育，与对第一次收获的微集落进行AST平行进行，随后在已经确定包括用于进行微生物细胞鉴定的最少数量的细胞(例如>105个细胞)后收获，例如通过使用二级(例如常规的)鉴定方式，如MALDI-TOF质谱。与从第一微集落收获微生物细胞之前采用的初始分类方式相比，第二鉴定方式可以具有更高的准确度、更高的置信水平和/或更大的可能类别集合。如图11A所示，第二微集落的收获和第二鉴定步骤可以与对第一微集落进行的抗微生物易感性测试同时进行。在许多情况下，该方法将导致鉴别结果在AST结果之前变得可用，使得鉴别结果可以与AST结果一起报告用于解释。例如，当基于AST结果选择抗生素和剂量时，可以采用鉴定结果、已知的物种特异性断点和其他临床因素。
在一些示例实施方案中，在从第二微集落收获微生物细胞之前，可以在第一集落和第二集落之间建立表型对应。这种表型对应可以例如通过比较与两个微集落相关的种类，或例如比较从两个微集落检测的光学图像或光学信号来建立。
如上所述，在一些示例实施方案中，AST可以在从一个或多个集落收获的微生物细胞上进行，任选地在已经进行了集落微生物细胞种类的至少推定鉴定或分类之后进行(在一些情况下，推定鉴定可能不是必需的，例如，如果集落在达到已知在多种微生物细胞种类中具有最小细胞计数的大小之后收获的话，以及如果采用广泛的AST组，例如，足以提供对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌组的覆盖的广泛的AST组)。然后将收获的集落(例如使用手工收获、自动收获或其组合获得的)悬浮在液体中以形成悬浮液(任选稀释或浓缩)，等分并与不同浓度的抗生素接触。抗生素(以及任选地它们的浓度)可以基于微生物细胞的特性来选择。例如，可以使等分的微生物细胞与三种不同浓度的所选择的抗生素接触，并且可以随后监测微生物细胞生长以确定易感性和/或抗性的量度。在其他示例实施方案中，可以采用额外浓度的抗生素。
微生物细胞分离和随后在液体生长培养基中培养
虽然许多前述示例实施方案涉及通过使分离的微生物细胞与固相生长培养基接触而促进集落生长的方法，但在另一个示例实施方案中，在进行分离过程以获得分离的活微生物细胞之后，分离的活微生物细胞(任选地用一个或多个洗涤循环分离)可与液相中的生长培养基混合并在适于促进微生物细胞生长的环境中孵育。例如，可以将含有分离的微生物细胞的悬浮液引入血液培养瓶中，并根据常规血液培养孵育方案孵育(例如在37℃下储存在孵育器中)。在与取样前已经用抗生素经验性治疗的患者相关的样品的情况下，与仅通过在血液培养瓶中包含抗微生物吸收剂(例如木炭或树脂)所提供的相比，这种方法可以更有效地促进抗微生物剂浓度(和影响)的降低。
在一个示例实现方式中，液相生长培养基可以在封闭的盒中与分离的细胞组合，并且封闭的盒可以随后被孵育以促进微生物细胞的生长。这种方法提供了避免污染的益处，否则如果将分离的细胞转移到外部细胞培养容器或装置中可能发生污染。如果封闭的盒包括离心室(如在以上描述的示例实施方案中)，该盒可以被周期性地离心(在孵育过程中或在孵育阶段之间)，并且可以查询离心室的远侧区域(例如，通过成像光学地或通过基于容纳在离心室内的内部电极(例如，电极的圆形阵列)的局部阻抗测量电气地)以监测微生物细胞的生长。例如，可以查询在离心管的远侧区域中收集的微生物细胞以确定是否存在足够数量的微生物细胞来支持随后的抗生素敏感性测试。如果检测到不足量的微生物细胞，则可将微生物细胞再悬浮并孵育给定的持续时间，然后重复评估。
在一些示例方法中，可以从诸如血液培养物样品的液体培养物样品中分离活微生物细胞。在一些示例实现方式中，血液培养物样品(或在液相中培养的另一种样品类型)可以被处理以在确定血液培养物样品的阳性之前获得分离的有活力的和/或完整的微生物细胞。然后可将分离的微生物细胞用于一个或多个后续测定，诸如但不限于MALDI鉴定、基于代谢的鉴定、和/或表型抗微生物易感性测试(例如通过肉汤微量稀释或另一种表型抗微生物易感性测试方法)。在一个示例实施方案中，可以采用分离的微生物细胞的第一部分执行通过MALDI进行微生物鉴定，可以采用分离的微生物细胞的第二部分执行抗微生物易感性测试(例如在使用微生物细胞的第一部分执行MALDI之后)。
后续分析处理所需的微生物细胞的数量通常取决于检测类型。通常，可以确定对于给定的检测需要最小量的微生物细胞。给定检测所需的微生物细胞的量还可以取决于微生物细胞的类型(例如，革兰氏状态、属、科、或种)。在一些示例实施方案中，可以通过对分离的微生物细胞执行测量来确定在分离的微生物细胞中是否已经获得了足够量的微生物细胞。例如，可以将分离的微生物细胞悬浮并且可以对悬浮液进行浊度测量。或者，分离的细胞的量的测量可例如使用选自以下非限制性示例罗列的模式来确定：流式细胞术和电阻抗测量。可以浓缩分离的微生物细胞的悬浮液以实现足够的检测灵敏度。例如，可以采用过滤和/或离心，随后在足够小体积的液体中重悬浮，以实现合适的检测灵敏度。给定的光学检测方式所需的浓度可以通过对来自参考微生物细胞的浓缩储备液的连续稀释的等分试样进行测量来确定。在一个示例实施方案中，可对微生物细胞的浓缩悬浮液进行光学浊度测量，其中悬浮液通过在具有适于光学散射测量的侧壁的器皿或其他合适容器内的激光散射来测量。
如以上在图9A-9F中所述，微生物细胞在生长培养基中的生长速率将通常取决于物种或属水平的微生物细胞种类。因此，使用快速分子鉴定检测，在属或种水平上的微生物细胞种类的初始确定可用于估计处理液体培养物样品的合适时间，以获得足够大量的分离的微生物细胞用于随后的检测处理或用于收获由分离的细胞形成的生长的微生物细胞集落。合适的快速鉴定检测的非限制性示例包括上述基于快速rRNA的鉴定检测的示例和快速gDNA检测，诸如Septifast检测和T2Bacteria检测。可以在对应于存在足够高量的微生物细胞的合适时间从血液培养瓶获得血液培养样品(例如，通过从血液培养瓶获得合适的等分试样)。在一些示例实施方案中，合适的时间可以增加额外的持续时间，诸如保护频带时间(例如0.5或1小时)和/或时间的标准偏差的规定倍数(例如1或2个标准偏差)。
在一些示例实现方式中，如果快速鉴定检测是定量的并且提供指示初始样品中的微生物细胞的浓度的定量测量(诸如通过在扩增过程中确定周期阈值)，则可以采用定量测量来细化对获得液体培养样品或收获由分离的细胞形成的生长的微生物细胞集落的合适时间的估计，以获得用于后续检测的所需微生物细胞量。例如，定量测量可与初始鉴定结果组合以获得在与微生物生长相关的给定事件之前将经过的时间的估计，诸如但不限于，阳性时间和达到预选浓度的时间。
集成流体盒中的微生物细胞分离的示例
国际专利申请No.PCT/CA2015/050449中教导了基于国际专利申请No.PCT/CA2013/000992的方法进行微生物细胞分离和浓缩的示例自动化系统。图12提供了用于进行自动离心分离(和/或洗涤)的示例集成系统400的图示。示例系统400包括离心机410，离心机接收用于离心分离的一个或多个集成流体处理盒420。离心机410包括一个或多个接受器412，这些接受器连接到机动化转子414上并且配置成用于接纳集成流体处理盒420。盒接受器412可以是例如实验室离心机中常见的固定角度类型或摆动桶类型(例如，每个接受器412可以枢转地连接到机动化转子414)。
盒接口组件(单元)430配置成当机动化转子414静止时与集成流体处理盒420可移除地接合(或对接)，用于控制集成流体处理盒420内的流体流动。盒接口组件430与集成流体盒的接口可例如通过盒接口组件与集成流体盒420之间的直接接口发生，或者例如通过离心机410上(例如机动化转子414或盒接收器412上)的接口(例如致动接口)发生。
离心机410和盒接口组件430通过控制和处理单元440控制。控制和处理单元440可以包括：一个或多个处理器445(例如，CPU/微处理器)，总线442，可以包括随机存取存储器(RAM)和/或只读存储器(ROM)的存储器455，一个或多个内部存储设备450(例如，硬盘驱动器、光盘驱动器或内部闪存)，电源480，一个或多个通信接口460，外部存储器165，显示器470和各种输入/输出设备和/或接口475(例如，接收器，发送器，扬声器，显示器，输出端口，用户输入设备，诸如键盘、小键盘、鼠标、位置跟踪触笔、位置跟踪探头、脚踏开关、和/或用于捕获语音命令的麦克风)。
根据国际专利申请No.PCT/CA2015/050449的教导，参考图13A至13E中的示例示意图，示出了示例集成流体处理盒500，其结合了适于从全血中自动分离和洗涤微生物细胞以获得浓缩悬浮液的元件。示例集成流体处理盒包括样品转移接收器501、宏流体离心室502、稀释剂室504和上清液室506。稀释剂室504预填充有洗涤缓冲液流体505，通过配备有截流阀512的导管510流体连接到宏流体离心室502，包含通向大气515的排气口，并且以其他方式关闭。上清液室506通过配备有截流阀513的导管511与宏流体离心室502流体连接，并且包含通向大气516的排气口，否则上清液室506在大气中关闭。宏流体离心室502具有圆锥形或圆形底部形状和平滑内表面，其最小化在离心期间微生物细胞的吸附或捕集，并且除了通向相应导管的开口522、523、524、525、526之外被封闭。在本示例实施方案中，宏流体离心室用于处理含有血液的样品(例如全血、血液培养样品或其他含有血液的样品)，并且含有血液裂解试剂503和缓冲溶液529以帮助微生物细胞回收并使可能损害靶标核酸的完整性和回收的细胞的压实损伤最小化。
样品转移接受器配备有安装在接受器底部的针507。针连接至配备有截留阀509的流体路径508，截留阀通向宏流体离心室502。具有可刺穿帽521的样品管或容器520，例如
采血管或包含血液样品和生长培养基的血液培养管，可以插入样品转移接受器中，使得针507刺穿帽521，从而允许通过针和流体路径508将样品流体转移到靶标盒。可选地，针507覆盖有保护针免受污染的可刺穿孔罩508。
国际专利申请No.PCT/CA2015/050449教导的示例集成流体处理盒是一种封闭的盒(除了下面描述的通风孔之外)，该盒在插入样品之后执行分离和洗涤盒的室和管道内的浓缩悬浮液所需的所有功能，将所有试剂和溶液储存在盒上的室中，并且将包括废料上清液在内的所有过量液体保留在盒上的室中。这些通风孔和端口中的一个或多个可以由透气膜保护，该透气膜具有足够小的孔尺寸以防止微生物病原体进入装置的目标范围内。根据本示例实施方案，所有多余的和废弃的液体被储存在盒上并且不暴露给使用者。因此，封闭的盒提供了一种装置，该装置保护使用者不与样品直接接触，并且对于该装置，样品在分离和洗涤过程中不易受外部因素的污染。
如国际专利申请No.PCT/CA2015/050449所教导的，参考图13A中所示的示例集成流体处理盒500，在图14中大致描述了自动分离和洗涤工艺。国际专利申请No.PCT/CA2015/050449中详细描述的盒接口组件配备有执行必要动作所需的所有部件，包括盒阀509、512、513和517的致动以及能够通过盒端口518将正和负表压施加到盒离心室的空气置换装置。
将含有样品的样品管520插入标本盒500的样品转移容器501中，从而刺穿管帽521以执行样品转移到如图13A的502处所示的宏流体离心室。如下文详细描述，盒接口组件通过盒接受器与盒接合，并且被致动，使得阀509打开并且阀512、513和517关闭，从而密封除了来自样品管的路径508之外的从宏流体离心室发出的所有流体路径。
空气置换装置通过连接器与端口518接合，连接器提供与端口的密封连接。任选地，刚性或柔性管将空气置换装置连接到连接器。通过操作空气置换装置从宏流体离心室抽取空气以使样品通过流体路径508从样品管520流入宏流体离心室502来使样品转移到宏流体离心室502。端口518的入口523必须定位在流体水平面上方并且在流体水平面上方与入口523之间具有足够的气隙，使得没有流体流入入口523到达端口518。空气置换致动的流是以受控的方式进行的，使得预定体积的样品被转移到宏流体离心室中。
根据国际专利申请No.PCT/CA2015/050449的教导的一个实施方案，流动路径508的入口522也在流体水平面上方的空气间隙中，使得在转移所需体积的样品之后，通过端口518的空气置换可以反向，以提供进入宏流体离心室的少量空气置换，以清除样品流体的流动路径508并将此剩余样品移回到样品管520中。然后，阀509关闭，并且任选地将样品管520从接受器501移除。
在样品转移过程之前，血液裂解试剂503可以存在于离心室502中，或者可以以与样品类似的方式从血液裂解试剂管中转移。可替代地，可以在盒上提供血液裂解试剂存储室，并且可以提供具有阀和通风口的流体路径，以允许血液裂解试剂503以类似于如下所述的洗涤缓冲液到宏流体离心室的移动的方式移动到宏流体离心室。
如国际专利申请No.PCT/CA2015/050449中所教导的，在将样品加入到宏流体离心室502中之后，可以任选地混合样品和血液裂解试剂503，如图14中905所示。可以提供混合机构，由此仪器执行盒的涡旋、摇动或循环倒置。该操作在从宏流体离心室502发出的所有流体路径上阀关闭的情况下执行。可在通向端口518的流体路径上提供阀以防止流体在混合期间进入空气路径。另外，或可选地，防止流体通过的透气膜可以放置在宏流体离心室和端口518之间的空气路径中，以防止流体到达端口518。该膜还可以配置成用作空气过滤器以防止微生物从环境或从空气置换装置进入。可替代地，端口518和进入开口523之间的通向宏流体离心室的路径可设计成具有高流体阻力，使得在主要条件下将防止流体进入开口523或将防止流体一直行进到端口518。同样地，分别在稀释剂室505和上清液室506中的通风口515和516可以配备有透气膜和/或具有高流体阻力的路径以用于类似目的。
在混合步骤905之后，执行离心沉降步骤910，由此盒接口组件与机动化转子414脱离接合，并且盒420被离心，使得宏流体离心室中的微生物细胞沉积在缓冲溶液上，例如，根据PCT专利申请No.PCT/CA2013/000992，如上所述。离心机可以是例如角式离心机或吊斗式离心机，并且离心参数可以例如根据PCT专利申请No.PCT/CA2013/000992选择。
施加到宏流体离心容器内的流体的相对离心力可例如在1000-15,000g、或例如2,000-12,000g、或例如3000-10,000g、或例如3000-7,000g、或例如5000-10,000g、或例如4000-8,000g的范围内。在涉及从生物样品分离细菌和真菌细胞的应用中，已经发现合适的相对离心力(RCF)在1000g-15000g范围内，更具体地在3000g-7000g范围内。
在图14的离心沉降步骤910之后，停止离心转子，并将盒接口组件与机动化转子重新接合，如915所示，并将上清液527从宏流体离心室502提取到上清液室506，如920所示，由此残留物528(含有微生物细胞)保留在宏流体离心室502的底部。通过打开阀513同时阀509、512和517保持关闭并使空气置换装置连接器与端口518接合并且可控地将空气置换到宏流体离心室中来执行该动作。因此，引起上清液流动的空气置换通过流体路径511发生，流体路径的入口524位于上清液的最低范围的下方。任选地，将入口524放置在将从宏流体离心室排出的上清液的最低限度处，从而防止从宏流体离心室提取残余物528。
在上清液提取步骤920之后，执行洗涤缓冲液分配步骤925和930，由此将洗涤缓冲液分配到宏流体离心室502中。该动作通过打开阀512同时保持阀509、513和517关闭并使空气置换装置连接器与端口518接合，并可控地将空气从宏流体离心室502排出来执行。因此，由空气置换引起的洗涤缓冲液的流动通过流体路径510发生。洗涤缓冲液路径510的入口525优选位于宏流体离心室中的流体水平面的最高范围之上。
在洗涤缓冲液分配步骤544之后，执行混合步骤932以充分混合宏流体离心室中的洗涤缓冲液和残留流体。这可以通过如前所述的盒的涡旋、摇动或循环倒置来执行。在混合步骤932之后，执行离心沉降步骤910以重新沉降收集的微生物细胞，并如步骤920中那样从离心室除去上清液。步骤925-935和910-920的序列共同形成洗涤循环，由此将细胞悬浮液在洗涤缓冲液中稀释，将微生物细胞再沉淀，并提取上清液。可将洗涤循环重复多次以根据需要进行多次额外的洗涤循环，以获得充分稀释的污染物和干扰物的最终微生物细胞悬浮液。
在最终上清液提取步骤920之后，进行混合步骤942以将沉淀的微生物细胞再悬浮在最终残留流体528中以产生最终悬浮液。在再悬浮步骤942之后，通过流体路径510的空气置换提取最终悬浮液。最终悬浮液的体积取决于应用的性质。例如，当预期应用是检测全血中或培养的血液中的微生物细胞时，最终细胞悬浮液的体积可以选定在10μL-500μL范围内，而更优选的范围是20μL-120μL、或50-100μL。在提取最终细胞悬浮液的过程中，打开阀517并且关闭阀509、512和513，并且将空气通过端口518转移到宏流体离心室中以将流体从开口526通过流体路径516转移到端口519。开口526定位在缓冲流体529的顶表面处，使得最终悬浮液整体或基本上全部悬浮液从宏流体离心室排出，而不挤出任何缓冲流体529。可替代地，开口526定位成使得最终悬浮液和缓冲流体的一部分或全部可通过流体路径516从宏流体离心室排出。流体路径516流体连接到细胞集落生长模块入口路径101和161，如图2所述。
图13B和13C示出了用于执行自动样品制备的示例集成盒，自动样品制备包括将微生物细胞从样品中分离并将它们以封闭盒构型接种到固相生长培养基上。示例集成盒700(图13B)示出为具有三个部件。第一部件698包括样品转移接受器501、宏流体离心室502、稀释剂室504和上清液室506(参见图13A)。第一部件698可以是由与该装置的形式和功能相容的材料制成的单一塑料模制部件。可替代地，第一部件698可以是子部件的组件，这些子部件是由与装置的材料、形式和功能一致的装置模制或形成的塑料部件。在这方面，材料应被选择为具有足够高的强度以承受盒将经受的高离心力，并且材料应与所使用的流体相容，并且在分子应用的情况下，不应将干扰下游过程的污染物引入预处理的细胞悬浮液中。可以制造第一部件698的材料的非限制性示例是聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、PET、聚苯乙烯、环烯烃共聚物或这些材料的一些变体。
第二部件699是安装在部件698的侧面上的微流体装置。第二部件699包含连接部件698中的室和细胞集落生长模块720的流体路径和阀。流体路径和部件用于使细胞悬浮液从细胞悬浮液路径516和519(参见图13A)流到细胞集落生长室，以及用于如本文先前所述接种生长培养基的附加部件。部件699是由其中形成孔、通道和室的多个层构成的层压件。这些层可以被机加工、冲压、压纹或模制以形成必要的特征。基于通过粘合剂粘合、热粘合、超声波粘合或本领域技术人员已知的其他方法层压的亚层的功能，每个层可以由单个或多个亚层组成，每个亚层是不同材料或先前列出的相同材料。
在一个实施方案中，如图13B所示，细胞集落生长模块720可作为可拆卸模块与层叠件699结合，使得生长模块可与盒的剩余部分分离以用于后续处理。可移除的集落生长模块可以包括便于将模块从盒移除的多个特征，诸如指状突出部和卡扣特征，指状突出部和卡扣特征固定该模块但是为了便于移除而容易断裂，连接到层压件699的剩余部分上可断裂连接件或以其他方式可拆卸的流体连接件。此外，集落生长模块包括透明基材，透明基材具有雕刻在其中或标记在其上的一组网格，如图13E中示意性示出的。该特征将有助于定位待收获的微集落用于其他应用，而不需要观察微集落。
在一个实施方案中，如图13D所示，细胞集落生长模块720可以结合到第二组分699和第一组分698中，使得其垂直于离心场存在，以便将样品铺展在凝胶上。有助于将第二部件(层压件)699流体连接到细胞集落生长模块720的一个示例实施方案是通过可破坏的层压件突出部725，其例如可通过激光焊接或压敏粘合剂局部结合到流体连接件721和722的位置处的699和720，结合强度足以承受操作载荷，然而使用者可以将部件725从层压件699剥离，从而将720从盒释放。任选地，现在游离的725的部分可以随后通过压敏粘合剂再结合至720，压敏粘合剂一旦720从盒中移除就暴露，以便将密封环境维持在720内。
在将洗涤缓冲液和预处理流体分别分配到稀释剂室和宏流体离心室中之后，盒的室的开口710(图13B中所示)可以用膜密封，箔密封或帽697(图13C中所示)密封。图13C分别示出离心室、稀释剂室和废料室的外表面703、704和705。这些密封件或帽可以使用与热密封、粘合剂结合、超声结合相容的方法和材料来结合。可替代地，这些室可以在分配这些液体之前被密封，并且可以提供替代端口以用于分配这些液体的目的，并且这些端口可以在分配操作之后被密封。帽697可以是模制的、压纹的、机加工的或快速原型的，并且可以由聚碳酸酯、聚苯乙烯、PET、聚酯或适于其形式和功能的其他材料构造。
用于微集落检测和执行推定鉴定的系统的示例
在图15A中示意性地呈现了用于孵育和检测微集落并任选地进行推定鉴定的示例微生物孵育和监测系统。系统包括开放的或封闭的孵育室81，孵育室可以由可移除的或滑动的盖子82封闭，并且孵育室容纳一个或多个生长模块720。盖82可以是透明的并且足够平坦以避免图像失真。盖82可以被加热以防止凝结。盖可以包括用于‘浸入’物镜转换器的开口。附加地或可选地，可以使用物镜(例如，一个或多个长工作距离物镜)。加热器、温度传感器和相关的控制电路可用于将温度保持在相对于设定温度(例如37℃)的可接受范围内。还可以通过将气体入口和出口端口83连接到一个或多个合适的外部模块来调节气体组成和环境湿度(例如气体混合物以控制CO2/O2以提供合适的有氧或厌氧气氛；用于控制湿度的水的储存器)。整个系统可以封闭，同时通过再循环控制温度、气体组成和湿度。室可以包括一个或多个固位装置(例如卡子或夹子)，用于牢固地保持生长模块720。
示例系统配备有至少两个成像模块。设置具有第一视场和相关放大率的第一成像模块84，并且设置具有第二视场和相关放大率的第二成像模块85，其中第二成像模块具有比第一成像模块更小的视场和更高的放大率。成像系统可以配备有快速自动聚焦能力，例如通过根据与一个或多个图像相关联的基于对比度的反馈来驱动的线性马达。成像模块可以包括用于‘浸没’光学器件的物镜加热器。在将生长模块720放置在室内之后，第一成像模块84由驱动致动器(例如马达)和控制和处理电路86(诸如图12中所示的示例控制和处理电路440)控制，使得固相生长培养基的表面的至少一部分在视场内。
在视场小于固相生长培养基的整个表面的情况下，成像模块可以在成像期间被机械扫描，并且可以使用控制和处理电路来组合图像。该任务可以通过处理来自多个视场(FOV)的重叠图像拼接块，将重叠图像拼接块拼合在一起，从而能够通过大的2D时间推移马赛克来研究生长模块的大区域(例如，整个区域)来实现。由于系统中的潜在不准确性，未对准的单个FOV可能在最终的马赛克图像中产生未对准，这可能导致错误和信息丢失。在一些示例实现方式中，控制和处理电路86可以补偿机械不精确性(线性马达反冲和阶段可重复性)，并且这通过通过与指定变换约束(例如，仅平移或平移+旋转)的成对配准来优化指定区域内的平移来避免或最小化拼接误差。例如，可以采用基于强度或基于特征的算法来生成相邻图像之间的变换，使得相邻图像在空间上配准。在此背景下，阶段轨迹函数可以提供相邻图像拼接块之间的初始映射，初始映射是通过图像配准来细化的。
呈现比第一成像模块84更高的放大率的第二成像模块85可以可选地配备有附加照明以用于补充暗场成像。一旦集落通过从第一成像模块84获得的图像被检测和定位，控制和处理电路86可以控制第二成像模块，使得被检测的微集落被第二成像系统成像。在调焦之后，可以采集更高分辨率的图像(即，具有比使用第一成像模块获得的图像更高的分辨率)，例如，以收集用于基于所采集的图像(例如如前所述，成像集落的一个或多个空间、形态和/或衍射参数，任选地进一步基于这些参数的时间相关变化，或通过成像模块，诸如采用第二成像模块的拉曼显微镜或傅里叶变换红外显微镜)收集图像以进行推定鉴定。本示例系统或其变型可以用于对标记有荧光标记的微生物和/或未标记的微生物进行成像。
图15B显示了微集落孵育和检测系统的一个示例实施方案。支撑在平移台上的孵育室被基部加热并且被滑动盖82关闭。平移台除了在x和y方向上移动之外，还可以在z方向上移动，以便能够在凝胶表面上自动聚焦，例如通过尝试锐化从样品转移的血液碎片的图像。物镜84穿过设置在盖82中的开口821。通过通过环加热器841将物镜加热到升高的温度(与室内的温度相比)来避免物镜上的凝结。通过在室内放置部分填充水的开放容器725来保持室内的湿度升高。
为了证明用于检测微集落的系统的适合性，4mL全血掺加约20CFU的根据实施例5的方法处理大肠杆菌细胞，以获得分离的细胞悬浮液。将按照实施例6的方法制备的琼脂平板离心8分钟，将细胞悬浮液分配在其上并使其吸附在表面上。将琼脂平板置于图15B的培养箱中，并通过在凝胶表面上拍摄448张图像每小时成像一次。对于每个第五成像事件，5×物镜在z方向上移动用于自动聚焦以减少扫描时间。将所收集的图像对齐、配准和拼合，并且将结果呈现在图15C的右侧。然后将平板孵育过夜，通过常规照相机拍摄其图像并呈现在图15C的左侧。尽管用肉眼无法检测，但在接种样品后t＝4时使用5×物镜收集的图像中可检测到微集落。一个例外是集落#19，由于板壁的遮蔽而没有检测到。
在图15D中，显示了检测到微集落的平板上18个位置的详细显微图像。在图像的底侧，显示了在孵育时间t＝3和t＝4小时时含有集落的区域的扣除背景的图像。可以看出，通过t＝2h检测到一个微集落(微集落7)，而通过t＝3h检测到18个微集落中总共15个微集落。3h标志物仍然高于在图9C中估计和报告的2.1h的阳性时间(TTP)。这种降低的性能归因于以下事实：凝胶表面在放置于成像系统的孵育器内之后不久经历微尺度形态变化。因此，在t＝0h时的图像可能不是用于将目标微集落与背景碎片区分开的最适合的参考图像。为了避免这个问题，可以在孵育后10-30分钟拍摄第一(参考)图像。或者，可以通过以更短的时间间隔(例如，每0.5小时与每1小时)执行扫描和收集图像来改善TTP方面的性能。
注意，虽然图15B的系统不提供主动管理/控制的CO2环境，但尚未发现诸如肺炎链球菌的细菌物种的生长受到显著影响。实际上，涉及1个ATCC菌株和4个不同的肺炎链球菌临床分离物的实验发现，对于所有菌株，肺炎链球菌在空气环境中的生长速率约为2个周期/小时。如可从图9B和9C观察到的，该生长速率正好在典型致病性革兰氏阳性菌的生长速率的下端。然而，在不需要添加CO2的情况下，所有细菌和真菌细胞可以在相似的气氛中检测到的事实可以提供显著的优点，并且可以归因于在较小的集落尺寸下，细胞堆积较低，因此细胞与细胞的相互作用较少。
为了说明该断言的一些证据，在图15E的顶部显示了肺炎链球菌集落的图像，其中集落在存在(左)和不存在(右)CO2填充的情况下孵育过夜。如注意到的，在CO2填充存在下孵育的集落看起来更健康，因为与在没有CO2填充存在下孵育的集落相比，在整个集落中没有可见的细胞耗尽区域。该图的底部显示使用图15E中所示的系统在不存在CO2包的情况下孵育的微集落(左)和特定微集落(右)的图像。从微集落的图像可以看出，微集落的形态类似于在CO2填充存在下孵育过夜的集落的情况。
进行快速表型抗微生物易感性测试的方法
本发明即将描述的部分解决了诸如微量稀释测定法和盘扩散测定常规抗微生物剂敏感性测试(AST)方法的缺点，并且提供了用于快速评估诸如抗微生物剂的化学试剂对微生物细胞的影响的示例实施方案。如下所述，本示例系统和方法可以允许在4小时的持续时间内确定许多微生物细胞种类的抗微生物剂敏感性(包括允许确定最小抑制浓度)，甚至对于低至104CFU或低至103CFU的微生物细胞计数。
目前检测细菌对抗菌药物敏感性或耐药性的黄金标准是按照标准化的Kirby-Bauer方法，用琼脂扩散试验方法进行半定量的体外药敏试验。盘扩散AST(DD-AST)测试方法(基于Kirby-Bauer方法/Stokes方法)包括将微生物细胞接种在琼脂平板上，并放置用特定浓度的抗菌剂浸渍的常规6毫米纸盘。抗微生物药物从椎间盘中的扩散和提取速率不快。因此，浓度梯度以最接近盘的最高浓度存在，并且随着与盘的距离的对数减少。在相对于盘中心的给定位置处的微生物细胞的集落生长期间，抗微生物剂的局部浓度随时间演变。
通常，抗微生物剂的抑制效果表现为在距中心一定距离内可见不存在微生物泳道，称为抑制区，如图16中符号2r1所示，对于存在三种抗微生物剂苯唑西林1μg/mL、四环素30μg/mL和诺氟沙星10μg/mL的金黄色葡萄球菌的情况。超过该距离，直至距离r2观察到稀疏泳道，超过该距离泳道是满的。试验耗时18-30小时，需要高的细菌浓度(浊度超过或等于0.5McFarland)。此外，通过视觉检查主观地评价结果，确定完全抑制的区域(2r1)并以mm记录区域的直径。当完全抑制的区域不是圆形时，MIC确定可能不准确，如图16所示的四环素的情况。因此，在值的范围内指定r1。作为这些缺点的结果，盘扩散AST方法是半定量且缓慢的测试。尽管如此，该测试是表型的，因为来自微集落的光的散射使得能够进行目视检查，并且因此抑制微生物细胞生长的推断是明确的。此外，干燥形式的抗微生物剂的储存及其在盘与凝胶表面接触时的有效释放使得测试容易进行。
当进行微量稀释AST时，将微生物细胞悬浮液的等分试样在多种浓度的抗微生物剂的存在下孵育，通常相差2倍，并且通过在测试过程中或在终点监测微生物浓度，相对于在抗微生物剂不存在下的生长速率评估生长速率。在测试的早期阶段的监测方法需要加入信号发生剂，诸如酶，其监测细胞代谢活性，因此不是细胞增殖的直接指征。终点分析(通过测量光散射进行)仅对高微生物负荷敏感并且在长孵育时间(典型地10小时或更长)之后可以给出令人满意的结果。此外，样品中的起始细胞浓度不应降到所需浓度以下，如已公开的技术[Smith,Kenneth P.,and James E.Kirby."The Inoculum Effect in the Era ofMultidrug Resistance:Minor Differences in Inoculum Have Dramatic Effect onMinimal Inhibitory Concentration Determination."Antimicrobial agents andchemotherapy(2018):AAC-00433]。因此，样品通常从浓缩样品获得，通常具有超过或等于0.5McFarland的浊度。尽管存在上述问题，微量稀释提供了用于定量评价抗微生物剂敏感性的MIC值。
本发明提供了用于评估化学药剂对微生物细胞的作用的改进的系统、装置和方法，利用了盘扩散AST和微生物肉汤稀释AST两者的有利特性，同时避免了它们各自的许多缺点。在本文公开的几个示例实施方案中，AST通过使固相生长培养基与固体支持物接触来进行，固体支持物具有在其上干燥或浸渍的抗微生物剂，构造为抗微生物剂从固体支持物侧向向内扩散到一种至少部分被固体支持物包围的固相生长培养基的子区域，以快速建立抗微生物剂的局部浓度，这与盘扩散AST方法中使用的向外扩散方式形成对比，盘扩散AST方法中，抗微生物剂从盘侧向径向扩散。通过通过抗微生物剂的局部侧向扩散在固相生长培养基的子区域内快速建立抗微生物剂的浓度，可以将分配到子区域表面上的微生物细胞快速暴露于抗微生物剂，用于快速评估抗微生物剂对微生物细胞生长的影响(例如，通过头顶光学成像)，从而促进快速表型AST。与依赖于抗微生物剂的整体向外侧向扩散的常规盘扩散方法相比，通过抗微生物剂的局部侧向扩散促进的这种快速表型形态此后称为“局部扩散”AST或LD-AST。
通过参考图17A和17B可以理解LD-AST测定相对于常规盘扩散测定的差异，图17A和17B提供了用于促进AST的相应盘的俯视图。在盘扩散AST(图17A)的情况下，将抗微生物剂浸渍在纸或塑料盘上，210，并且通过查询暴露于从盘释放的药物的微生物细胞的生长来评价相互作用和易感性，药物侧向向外扩散至琼脂平板上超出盘的区域。用于执行AST的感兴趣区域211是具有内部区域的环形区域，该内部区域具有盘的半径rdisk和大约三倍于盘的典型3mm半径的外部无约束半径。
相反，在图17B所示的LD-AST的示例实施方案的情况下，抗微生物剂设置和/或浸渍在环形盘220(固体载体，诸如纸或塑料)的表面上，环形盘220具有设置在其中的中心孔(中心开口区域)，盘与固相生长培养基接触，使得抗微生物剂从环形盘释放并且在由环形盘包围的内部子区域内至少部分地侧向扩散(即，与仅在垂直于固相生长培养基的平面的方向上的竖直传输相反)。在其上提供抗微生物剂和/或在其中浸渍抗微生物剂的表面240被称为“接触表面”，因为该表面与固相生长培养基接触以在固相生长培养基内侧向扩散地转移抗微生物剂。在图17B所示的示例实施方案中，接触表面是接触固相生长培养基的表面的环形盘220的底面。
将微生物细胞悬浮液的小滴分配到生长培养基的子区域上，并且小滴内的微生物细胞保留在子区域的表面上(例如通过小滴的蒸发和/或吸收)。保留的细胞因此暴露于抗微生物剂的局部浓度，该抗微生物剂的局部浓度通过抗微生物剂从环形盘的接触表面的局部向内侧向扩散建立，并且局部抗微生物剂浓度对微生物细胞的影响通过孵育结构和监测细胞的生长(例如，通过从上到下，通过孔成像)来确定。因此，在本示例实施方案中，用于评估AST 221的感兴趣区域是由环形盘围绕的固相的子区域的表面。通过使用具有小内径(例如，小于2mm、或小于1.5mm、或小于1mm)的环形盘，快速建立子区域的表面下方的抗微生物剂的局部浓度(例如，在2小时内、在1.5小时内、1小时或0.5小时内)，由此允许通过光学显微镜快速评估在抗微生物剂存在下的微生物细胞生长。
当比较图17A的盘扩散方法与图17B的局部扩散方法时，显而易见的是，这两种实现方式之间的显著差异是在局部扩散AST方法的情况下发生抗微生物扩散的侧向距离的显著减小。在DD-AST的情况下，抗微生物剂连续侧向向外扩散，使得抗微生物剂在存在于盘的外径之外的固相生长培养基内的任何给定位置内单向(径向向外)扩散。相反，在LD-AST的情况下，在抗微生物剂的一部分侧向向外扩散的同时，抗微生物剂的另一部分侧向向内扩散到固相生长培养基的被环形盘包围的子区域中，其结果是抗微生物剂从多个向内的径向被递送到子区域中，由此促进在子区域内快速且受控地产生接近空间均匀浓度的抗微生物剂。
通过考虑抗微生物剂在固相生长培养基(诸如基于琼脂的凝胶生长培养基)中扩散的相关时间标度，可以进一步理解本示例实施方案的有利方面。通过一维浓度均匀化的特征长度标度由下式给出：λ＝sqrt(2*D*TD)，其中sqrt表示平方根，TD是特征扩散时间，且D是扩散系数。相关扩散时间超过1小时，因为大部分病原菌细胞在对数生长期开始生长前具有约1小时的滞后期。D的值由Stewart制成表格(Stewart,Philip S."Theoreticalaspects of antibiotic diffusion into microbial biofilms.”Antimicrobial agentsand chemotherapy 40.11(1996):2517-2522.)用于估计DD-AST和LD-AST的扩散时间。抗微生物剂的D的典型值为约5×10-4mm2/s，结果药物分子通常在一小时内被置换约sqrt(2×5×10-4x3600)～2mm。
该结果意味着，在LD-AST的情况下，在由环形盘围绕的子区域的表面下方建立的抗微生物剂的浓度预期在小于1小时内变得在空间上大致均匀。另一方面，在盘扩散AST的情况下，抗微生物剂扩散至感兴趣的区域将需要大约10小时。因此，使用向内侧向扩散作为环形盘的中心区域内的抗微生物剂暴露的手段，同时允许容易地将药物储存在盘上，还允许显著减少在感兴趣区域上建立均匀的抗微生物剂浓度的时间。此外，如下文进一步详细描述的，通过控制和配置LD-AST平台的其他方面，可以定制子区域内抗微生物剂浓度的时间依赖性演变，使得浓度在空间和时间上的变化在大于1小时或甚至两小时的时间标度上小于10％。
这种减少抗微生物剂浓度的空间和时间变化的能力使得本LD-AST平台有助于定量AST测量。如下面进一步详细描述的，当多个LD-AST装置被用于产生不同的局部抗微生物浓度时，抗微生物剂对微生物细胞的生长的影响可以以类似于微生物稀释AST的方式被离散地评估，从而有助于从该组离散测量中定量确定最小抑制浓度。
在常规盘扩散AST(盘的外径周围的大区域)和LD-AST(由环形盘围绕的相对小的子区域)中采用的感兴趣区域的尺寸的差异在降低样品所需的浓度方面也具有明显的优点。将细菌细胞浓度保持在适当范围内的要求已在已发表的技术中说明[Smith,KennethP.,and James E.Kirby."The Inoculum Effect in the Era of Multidrug Resistance:Minor Differences in Inoculum Have Dramatic Effect on Minimal InhibitoryConcentration Determination."Antimicrobial agents and chemotherapy(2018):AAC-00433]。然而，在对固相进行抗微生物剂敏感性测试的情况下，该要求可能更宽松。
抗微生物剂向内和侧向扩散的固相培养基区域，并且被环形盘包围(或更一般地，至少部分被固体支持物包围，如下文进一步描述的)，其可以具有相关联的0.5mm2至2mm2范围内的表面积，在本发明的上下文中被称为固相培养基的“暴露区域”、“感兴趣区域”或“子区域”。本发明人已经发现，在一些情况下，可以在约1至3小时之间的时间间隔内建立抗微生物剂的近似均匀(在本文中定义为与平均值的变化小于25％)浓度，如通过以下呈现的模拟所证明的。对抗微生物剂的敏感性通过用配备有(例如，无限平面物镜5×/0.12/∞/-(BF)或10×/0.25/∞/-(BF/DF))的BF物镜的反射照射监测分配到子区域表面上的微生物细胞的生长来测定。因为预期固相的细胞-细胞相互作用不影响最小抑制浓度(MIC)，所以可以使用在一个子区域内高达1000CFU或更高的细胞数。另一方面，低至10CFU或更低的细胞数可能足以避免或充分降低没有细胞分配到并因此保留在给定子区域表面上的统计可能性(当将细胞悬浮液的等分试样分配到多个子区域时，每个子区域具有不同的抗微生物剂浓度)。
在图18A中呈现了示例非限制性环形LD-AST装置。在本发明中，一种促进来自单个子区域内的微生物细胞悬浮液的等分试样(例如，单个微滴)的微生物细胞暴露的装置被称为LD-AST单元。图中所示的示例L-AST单元包括被配置为支持微生物细胞生长的基于凝胶的生长培养基，其中基于凝胶的生长培养基被限制在具有壁223和底部224的微孔内。
在环形盘220的接触表面(环形盘220的下表面)上提供和/或浸渍有抗菌剂。环形盘200粘附或附接(机械地联接)到引导环222上。在将这些部件放置到固相生长培养基上时，由引导环的壁和被引导环222包围的固相生长培养基221的表面的子区域的表面形成引导孔。抗微生物剂从环形盘220向内扩散。引导环222的上表面可以是疏水性的，使得在分配等分试样的微生物细胞悬浮液时，将等分试样通过孔引导到固相生长培养基的暴露子区域上。如图中所示，引导环的上表面可以具有倾斜(例如弯曲)部分252，该倾斜(例如弯曲)部分朝向孔倾斜，用于促进液体递送(芯吸)到由环形盘围绕的凝胶的子区域的表面。
在一些示例实施方案中，沉积在子区域的表面上的微生物细胞悬浮液的体积内的微生物细胞的数目可以是小于50个、小于20个、或小于10个细胞。在一些示例实施方案中，沉积在子区域的表面上的微生物细胞悬浮液的体积是小于5微升、或小于2微升。
在一些示例实施方案中，固体支持物可以与在微孔中提供的固相生长培养基接触，使得固相生长培养基的体积小于300μl、小于200μl、小于150μl、小于100μl、小于75μl或小于50μl。
如图所示，引导环222的下表面可具有邻近孔设置的防水特征251，使得在联接环形盘和引导环之后，防水特征251穿透固相生长培养基的表面(例如，穿透到小于500微米、小于250微米或小于100微米的深度)，以锚定组件并防止液体在盘接触表面和固相生长培养基的表面之间流入盘下面。在替代实施方案中，环形盘和引导环可以形成为一体部件，并且抗微生物剂可以涂覆在结构的下部上和/或浸渍在结构的下部下方。
为了证明引导环有助于将细胞悬浮液递送至被环形盘包围的固相生长培养基的暴露表面区域的能力，如下进行实验。制备浓度为105CFU/mL的屎肠球菌悬浮液。在厚度为100μm且直径为5mm的基于聚醚的热塑性聚氨酯(TPU)膜上，切割直径分别为1和0.8mm的两个盘。将环放在琼脂凝胶上。然后将1μL细胞悬浮液分配在环上以及凝胶的未覆盖部分上。将板孵育4小时，并通过金相显微镜的5×物镜成像分配样品的区域。图像呈现在图18J中。在没有限制的情况下(顶部图像)，样品在干燥之前已经膨胀到直径为约5mm的圆形区域。在环的情况下，微生物细胞已被导入环的内部区域。观察到微集落间隔紧密，可以明显看出细胞的浓度。
如图18A所示的示例实施方案所示，环形盘具有两个特征半径；内半径r1和外半径rad。在这两个半径之间，抗微生物剂涂覆在盘的下接触表面上和/或浸渍在盘的下接触表面下方。在一些示例实施方案中，r1处于0.5至2mm的范围内，或处于0.8至2mm的范围内，或处于1至1.5mm的范围内。在一些示例实施方案中，rad在2mm至6mm、或2.5mm至4mm的范围内。
虽然图17B和图18A示出了环形盘(和环形引导环)形式的固体支持物的示例构型，但是应当理解，该构型仅提供了用于进行LD-AST测定的合适结构的一个示例。下面提供其他示例实施方案，其中提供固体支持物，固体支持物至少部分包围孔(即部分包围中心开放区域)，其中固体支持物包括其上提供和/或浸渍有化学试剂的接触表面，其中接触表面可与固相生长接触培养基接触，使得固相生长培养基的子区域可通过孔进入，并且使得化学试剂的至少一部分侧向向内扩散到子区域中，使得沉积在子区域的表面上的微生物细胞暴露于已经在子区域的表面下方扩散的化学试剂。
例如，尽管前述示例实施方案采用环形盘，但将理解的是，用于将抗微生物剂扩散地递送到子区域的固体支持物可采用多种形状，诸如椭圆形、正方形或其他形状。
此外，尽管图18A中所示的固体支持物完全包封子区域，但在其他示例实施方案中，固体支持物可仅部分包封子区域。例如，固体支持物220可以以部分环绕(或包围)间隙或孔或内部区域221的两个或更多个区段的形式提供，如图18B所示，使得当接触表面接触固相生长培养基时，抗微生物剂从接触表面向内从多个方向扩散到固相生长培养基的子区域中。例如，其上和/或其中提供了抗微生物剂的固体支持物可以在多个区域接触固相生长培养基，并将抗微生物剂扩散地递送到固相生长培养基的子区域中，使得当第一平面和第二平面被定义为各自垂直于固相培养基的表面并且各自通过子区域时，第一平面垂直于第二平面，多个区域位于第一平面和第二平面中的每一个的两侧。
在一些示例实施方案中，抗微生物剂可均匀分布在固体支持物的接触表面上和/或下方。然而，在其他示例实施方案中，可以在接触表面上的两个或更多个分离区域处提供抗微生物剂。
在其他示例实施方案中，抗微生物剂的局部面积或表面下密度可沿着接触表面在空间上变化。例如，可以根据面积密度梯度或表面下密度梯度在接触表面上提供抗微生物剂。可提供面积密度梯度或表面下密度梯度，使得化学剂的面积密度或表面下密度在最接近孔的表面区域中最低，如下文实施方案模拟中所示，这可有益于在子区域内产生浓度，所述浓度表现出比具有均匀抗微生物剂密度的固体支持物更小的时间依赖性变化。
虽然本发明的许多示例实施方案采用LD-AST装置，其中接触表面被配置为接触固相生长培养基的顶表面并且将抗微生物剂扩散递送到子区域中，但是固体支持物还可以包括侧向限制部件，其被配置为浸入(淹没)到固相生长培养基中。这种实施方案的示例在图18C-18G中示出。图18D和18E示出了示例LD-AST装置，其中固体支持物220包括侧向圆柱形限制部件225，当接触表面240与固相生长培养基的上表面接触时，圆柱形限制部件浸入固相生长培养基250中。侧向圆柱形限制部件225被定位成比平面接触表面240更远离孔，由此对抗菌剂的扩散呈现至少部分外部屏障，使得抗菌剂在接触表面的外径之外的向外扩散被至少部分地限制。这样的实施方案促进了抗微生物剂的浓度的更快速的累积，并且还促进了在1-2小时的时间段之后具有较少时间变化的浓度的建立。在一些示例实现方式中，侧向限制部件可配置成封闭具有小于5mm、小于4mm或小于2mm的宽度的区域。
如图18E所示，侧向限制部件225可用于在固相生长培养基内形成“虚拟微孔”，固相生长培养基延伸超过固体支持物的外径。在一些示例实施方案中，该侧向限制部件的远端可以接触固相生长培养基所在的下支撑表面，由此完全包围固相生长培养基的一个区域。在图18F和18G所示的另一个示例实施方式中，具有侧向限制部件225的固体支持物220可以与存在于微孔260内的固相生长培养基接触。在这样的示例实施方案中，当接触表面与固相生长培养基接触时，侧向限制部件可以帮助保持接触表面的平行取向。
在一些示例实施方案中，接触表面可以包括表面区域，此后称为“侧向接触表面”，表面区域具有提供在其上或浸没在其中的抗微生物剂，其中表面区域配置成当固体支持物与固相生长培养基接触时浸没在固相生长培养基内以便进行LD-AST。例如，参见图18D，侧向限制部件225的内表面226可以具有设置在其上或浸入其中的抗微生物剂，使得内表面226形成接触表面的至少一部分。这样的侧向接触表面可以插入固相生长培养基中，例如到至少1mm或至少2mm的深度。
在一些示例实施方案中，固体支持物包括管状部件，并且其中管状部件的内表面的至少远侧表面区域用抗微生物剂涂覆和/或浸渍，并且其中管状部件与固相接触生长培养基接触，使得所述远侧表面区域的至少一部分浸没在所述固相生长培养基内，并且使得所述化学试剂在所述固相生长培养基的驻留在所述管状部件的管腔内的子区域内向内扩散。图18H示出了这样的实施方案的示例，其示出了示例圆柱形管状部件的横截面，圆柱形管状部件具有近侧区域270、远侧区域275和设置在和/或浸没在远侧区域275的内表面280内的抗微生物剂。如图18I所示，管状部件可以插入固相生长培养基中，使得管状部件的近侧部分从固相生长培养基向外延伸。可以将微生物细胞悬浮液290分配到管状部件的近侧部分270中，在此处微生物细胞悬浮液290被保留并与固相生长培养基的表面接触。管状部件可以被插入使得管状部件的远端接触支撑固相生长培养基的下支撑表面295，从而封闭子区域并限制管状部件内的化学试剂的扩散。在一个示例实现方式中，下支撑表面295包括设置在其中或其上的一个或多个配合特征，一个或多个配合特征接触管状部件的远端。一个或多个配合特征可包括突起和凹陷中的一者或两者，并且可以完全包围管状部件的远端。管状部件的远端部分的壁厚可以小于500微米，以便于将管状部件引入固相生长培养基中。
其上提供抗微生物剂和/或其中浸渍抗微生物剂的固体载体部分可由多种材料形成，包括但不限于：塑料材料，诸如聚碳酸酯、聚丙烯、聚砜和环烯烃共聚物，它们被涂覆以使其更具疏水性或亲水性；以及诸如纸形成的多孔材料；和由例如对水具有疏水性或亲水性的纤维素酯、聚醚砜、尼龙、聚碳酸酯、聚酯、聚四氟乙烯或聚偏二氟乙烯形成的其他多孔材料。
在一些示例实施方案中，可以采用多个LD-AST单元，每个LD-AST单元配置成将保留在其上的微生物细胞暴露于不同的抗微生物剂。确定哪些微孔支持微生物细胞生长以及哪些微孔抑制微生物细胞生长使得能够确定每种抗微生物剂的最小抑制浓度(MIC)。例如，如图19A所示，可以以条的形式提供多个连接的(机械地附接或联接的)LD-AST单元。用不同浓度水平(C1至Cn)的抗微生物剂浸渍的环形盘供应有引导(相互作用)环并且组装成条带300的形式。浓度水平的数目n可以在2至7或更大的范围内，并且在一些实现方式中，浓度可以沿着阵列从一个环形盘到下一个环形盘加倍。如图19B所示，可以提供具有多个微孔的互补条310，每个微孔包含一定体积的基于琼脂凝胶的固相生长培养基(其可以通过密封311密封)。当要进行LD-AST测定时，可以使两种组分接触，如图19C所示，使得LD-AST单元的相应接触表面与相应微孔中的固相生长培养基接触，并且抗微生物剂从相应接触表面扩散到微孔中的固相生长培养基的相应子区域中。然后，显示为小滴320的微生物细胞悬浮液的等分试样可以分配到相互作用环内部，使得具有等分试样的微生物细胞保留在相应的子区域表面上，在那里它们暴露于已经扩散到子区域中的抗微生物剂。可以使用多个阵列来评估不同浓度的多种抗微生物剂，其中LD-AST单元和固相生长培养基微孔任选地形成为相应的二维阵列(例如板形式的单片阵列)。
图19D和19E说明涉及图18B中所示的LD-AST单元的示例多单元阵列实施方案。在一些示例实施方案中，LD-AST单元的阵列和固相生长培养基微孔的阵列中的一个或多个包括有助于在相应接触表面与相应微孔之间对齐的带键特征。所述带键特征可以便于每个接触表面的侧向位置和深度中的一个或多个相对于所述相应微孔的对准。
图22提供了示出用于执行LD-AST的示例方法的流程图。该方法包括在步骤100中制备具有充分已知的分类和浓度的细胞悬浮液。分类应当已知到可以在步骤601决定抗微生物剂组的程度。分类粒度的示例是细菌/真菌和革兰氏阳性/阴性。浓度应该已知到这样的程度，即在样品分配之后确保在感兴趣区域中在10和1000之间的细胞数。一旦选择了抗菌组，则在步骤602中，通过在凝胶上重叠适当形状的药物浸渍盘形成多个药物暴露区域。抗微生物剂向内扩散到固相生长培养基的子区域中，并在药物暴露区域上建立抗微生物剂浓度(步骤603)。在步骤604中，将细胞悬浮液的等分试样分配在药物浸渍盘上，盘可具有用于将所分配的样品引导到药物暴露区域中的形式和结构。在步骤605中，通过时间推移显微成像监测每个药物暴露区中微生物细胞的生长行为。将每个药物暴露区域中的微生物细胞的生长速率与无药物区域(对照)中的细胞的生长速率进行比较，在步骤606中确定板中每个抗微生物剂的MIC值。在步骤607至609期间，这些值与细胞的鉴定相关联，用于在步骤610中确定细胞的抗微生物剂敏感性谱。
本示例方法基于细胞悬浮液进行，细胞悬浮液已在估计的细胞浓度和至少推定的初始微生物细胞种类确定(例如，至少细菌细胞与真菌细胞的确定，和细菌细胞的革兰氏状态的确定)方面充分表征。细胞种类用于选择合适的抗微生物剂测试组(例如，革兰氏阳性或革兰氏阴性测试组)。
不需要准确地知道细胞浓度，并且可以仅用于确认在等分之后，每个等分试样预期含有足够量的微生物细胞，以避免分配含有太多的微生物细胞以促进生长监测的等分试样的可能性，并且避免等分试样由于统计波动而不存在微生物细胞的可能性。例如，考虑测试革兰氏阳性细菌以确定其对一组Nd药物的敏感性的示例情况，每种药物具有Nc浓度水平。在分配～1μL在Nd X Nc LD-AST单元中的悬浮液后(Nd＝药物数量，Nc＝浓度数量)，每个LD-AST单元在其ROI上接收～1mm2的Cc(CFU/微升)细胞。结果，每个微生物细胞周围的面积σ为106/Ccμm2。在具有106CFU/mL＝103CFU/μL的细胞悬浮液的情况下，σ＝103μm2。这对应于仅仅0.1％的表面覆盖度，意味着每个细胞可以被认为独立于其相邻细胞增殖。另一方面，可以舒适地监测每个ROI上低至10CFU的细胞数，对应于104CFU/mL的细胞浓度，而不受泊松统计的后果的影响。因此可以评估微生物细胞悬浮液的初始细胞浓度以确认其处于该范围内。
细胞悬浮液可根据多种方法制备，并可直接或间接(有或没有先前的生长步骤)从多种样品类型获得。在一个示例实施方案中，根据以上描述的示例方法，例如，在微集落已经生长至目标尺寸并且任选地已经推测性分类(例如，细菌于真菌，任选地革兰氏阳性与革兰氏阴性)之后，可以通过从微集落收获微生物细胞来获得微生物细胞悬浮液。可以将收获的微集落重悬于合适的培养基(例如，盐水溶液，或生长培养基，诸如例如，TSB或BHI)中并任选地稀释或浓缩，然后分配到LD-AST单元上。在另一个示例中，微生物细胞可以通过处理血培养样品以获得微生物细胞悬液来获得，例如根据国际专利申请No.PCT/CA2019/050716中公开的方法。
可以通过显微技术或其他方法监测生长或非生长的存在，所述显微技术或其他方法可以以约2倍的准确度监测或确定区域中微生物细胞计数的时间变化。在一个示例实施方案中，药物暴露区域可以通过显微镜成像，诸如装备有5×或10×物镜的显微镜间歇地(例如每30分钟一次)成像，并且可以使用图像处理方法比较图像序列以验证细胞是否生长和/或增殖。本发明人已经发现，由于抗微生物剂在MIC浓度下的作用，微生物生长的停止通常在孵育3至5小时之间检测到。
为了说明图18所示的示例LD-AST单元的尺寸对LD-AST测定的性能的影响，基于通过有限差分方法(时间推进)的扩散方程(傅里叶方程)的模拟，计算5分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时和4小时的选定扩散方案的浓度分布。所采用的数值格式是时间上的一阶迎风格式和空间上的二阶中心差格式。在本发明的上下文中要求解的扩散方程写为δC/δt＝D(δ2C/δz2+(1/r)δ(rδ(C/δr)/δr)，其中C(r,z,t)是浓度，其取决于柱坐标r和z，但不取决于极角Φ。系数D是扩散系数并且δ/δt、δ/δr、和δ/δz分别是相对于时间(t)和空间坐标r和z的偏导数。
在初始接触后的不同时间，沿着通过图20A至20H中的目标区域的中心的线绘制抗微生物剂浓度的空间分布。图20A中的图对应于r1＝1.5mm、rad＝3mm、r2＝14mm、h＝4mm以及r1和rad之间的均匀抗微生物剂分布的情况。如观察到的，在将环形盘放置在凝胶上之后的前30分钟内，横跨暴露在孔下方的子区域的抗微生物剂的表面浓度变得均匀，然而浓度水平随时间降低。
为了进一步说明抗微生物剂浓度的时间依赖性，图21A绘制了r2、h(除了其中rad＝4mm的双重2的情况之外，r1和rad分别固定在1.5mm和3mm)和r1和rad之间的初始抗微生物剂分布的不同组合在子区域中心的抗微生物剂浓度水平。此外，在将环形盘放置在凝胶上之后～0.5小时和4小时达到最大浓度的期间，该抗菌剂浓度的变化呈现在图21B中。如观察到的，～0.5h和4h期间内的变化为约160％。这种浓度对时间的强依赖性可能是不期望的，因为它使AST的定量复杂化。本发明人因此寻求实现跨越子区域的浓度的较小时间变化的配置。在一个模拟研究中，发明人修改了三个参数，即rad、r2和h。
图20B中的图对应于r1＝1.5mm、rad＝3mm、r2＝14mm、h＝2mm以及r1和rad之间的均匀抗微生物剂分布的情况。这些图与图20A的图定性地相当。然而，参见图21A和21B，观察到微小的差异；并且抗微生物剂浓度的变化是128％而不是图20A的160％。因此，降低凝胶厚度似乎实现改进的性能，尽管程度不明显。另一方面，较薄的凝胶在测定过程中更倾向于凝胶脱水，特别是在r2远大于rad并且大部分凝胶表面暴露于周围环境的情况下。
增加凝胶的侧向限制的有益效果示于图20C中。在这种情况下，浓度变化的幅度从峰值160％(对应于图20A)降低到132％。虽然降低r2或h在降低浓度的时间变化方面具有较小的益处，但同时应用这两种变化导致76％，对应于图20D的图，这是相对于图20A的较不受限制的情况的显著改进。
测定性能的进一步改进可以通过使用已经以径向可变的方式浸渍的环形环来实现。为了说明这一点，计算两个双环的示例情况的浓度分布，其强度分布分别如下：
双重1：若1.5<r<2.5，则C0＝0.5；若2.5<r<3，则C0＝1；否则，C0＝0(参见图20E)。
双重2：若1.5<r<3，C0＝0.5；若3<r<4，C0＝1；否则C0＝0(参见图20G)。
所得曲线分别示于图20F和20H中。从图21B可以看出，在相关时间内中心浓度的变化分别下降到61％和19％。这表明以径向变化的浓度将药物以如下形式沉积：
{在r1<r<rad中C0提供递增函数，否则C0＝0}可以显着地减少在相关时间段上跨越ROI的浓度变化。
通过制备具有径向增加的干燥抗生素浓度的环形盘，可以减少跨越ROI的扩散抗微生物剂的瞬时浓度变化和潜在浓度非均匀性。在实施例9B中描述了该方法的一个示例实现方式。为了说明该方法的实现方式及其改进的性能，进行了以下实验。用染料溶液代替抗生素溶液，制备环形盘。在图21C中，显示了在施加水和干燥之后(左上)和在内部打孔之后(右上)的盘。染料的相对浓度示于图底部的图中。如观察到的，已经产生浓度梯度，使得浓度通过接近外边缘而增加。该实施例的确提供了用于调节浓度分布的实用方法。
为了说明LD-AST方法的可行性，对微生物物种和抗微生物剂的不同组合进行若干实验LD-AST测定。
在一种情况下，遵循实施例9A和10的方法，在这些环形盘上在0-16μg范围内涂覆不同浓度的诺氟沙星来制造LD-AST测试条。制备三种类型的条：每个微孔具有80μL凝胶的低体积琼脂类型，每个微孔具有150μL凝胶的中等体积琼脂类型，以及每个微孔具有350μL凝胶的高体积琼脂类型。相应的凝胶厚度分别为2mm、4mm和9mm。然后将环形盘放置在凝胶上。对于低体积琼脂类型的情况，微孔条的图像呈现在图23A和23B中，其中220、221、222和223分别是指药物浸渍的环形盘、药物暴露区域、引导环和凝胶。将根据实施例12的方法制备的1μL大肠杆菌细胞悬浮液分配到每个LD-AST单元的ROI中。将条带在37℃下孵育并且通过具有5×物镜的落射显微镜使它们的ROI每小时成像一次。对于t＝3小时、t＝4小时和t＝过夜的孵育时间，这些图像分别呈现在图24A-24C(低体积凝胶)、25A-C(中体积凝胶)和26A-C(高体积凝胶)中。
图24A-24C中的标记示出了在制备期间涂覆在环形盘上的抗微生物剂的质量。如图21A所示，固相生长培养基中产生的最终浓度作为时间的函数变化，最初上升到峰值，然后衰减到平台。尽管该时间变化，有效的抗微生物剂浓度可以与每个微孔相关。该有效抗微生物剂浓度可以例如通过模拟抗微生物剂的扩散来估计，如图21A所示，或者例如通过将LD-AST测定的结果与参考测定诸如肉汤微量稀释测定的结果进行比较来估计。
在低体积凝胶的情况下(图24A-24C)，因为预期抗微生物剂快速且有效地扩散遍及固相生长培养基的体积，并且因为预期抗微生物剂几乎完全从环形盘扩散，有效抗微生物剂浓度可以通过将在环形盘上提供的抗微生物剂的质量除以凝胶的体积来估计。如可以在图21A中看到的，预期该浓度在超过1-2小时的时间窗口期间是真实浓度的良好近似。因此，图24A-24C的低-体积凝胶的有效抗微生物剂浓度估计为浸渍在盘上的药物质量的0.25倍。例如，负载16μg诺氟沙星的环形盘的药物暴露区域的药物浓度为4μg/mL。因此，计算不同药物暴露区域的药物浓度并呈现在图24C中。
比较图24B和24C，可以观察到(或通过计算确定)对于被0.5μg(具有0.1μg/ml的估计有效浓度)标记的LD-AST单位，似乎在孵育的3小时与4小时之间没有可见的生长。通过成像过夜培养后的ROI验证该生长停止，如图24C所示。结果，该测试的MIC值估计为0.1μg/mL。根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)和欧洲抗微生物敏感性测试委员会(EUCAST)在欧洲公布的解释标准，该MIC值可归类为S＝敏感。可以将该值与通过常规微量稀释方法学获得的0.1的MIC值和由Vitek 2(Biomerieux)报告的<＝0.5Sμg/mL的值进行比较。因此，0.1的MIC值与两种参比方法基本一致，因为所报道的MIC在参比方法的±1倍稀释内。
图25A-25C和26A-26C分别对应于中等体积(微孔中150μL的凝胶体积)和高体积(微孔中350μL的凝胶体积)情况。在这些情况下，由于孵育期间浓度的较大时间变化，有效抗微生物剂浓度可通过将观察结果与参考微量稀释测定相关联来测定。如在图中可以看出的，在用1μg标记的微孔处的微生物生长的停止是明显的。
本发明人已经发现，在较低凝胶体积的情况下，当与较大凝胶体积相比时，抗微生物剂浓度的较低时间依赖性导致在确定哪个微孔对应于生长抑制方面更清楚。这通过提供测定暴露于万古霉素的金黄色葡萄球菌的MIC值的示例来说明。图27A和27B分别示出了两种类型的LD-AST单元，即“薄型”和“中厚型”的ROI的图像。即使对于“薄型”(图27A)的情况，在MIC下的LD-AST单元的集落和下一个孔(具有较低的药物水平)的集落之间存在明显的差异，对于“中厚型”(图27B)相应的差异也不明显。在这种情况下，将优选地通过图像处理来确定边界线LD-AST单元处的细胞增殖，诸如标记为12μg的单元。例如，时间推移可以获得对准的显微图像，并且可以处理差异图像(通过减去对准的图像获得)以检测生长的证据。例如，该步骤已经根据实施例13在图27B中以12μg对图像执行。第三行的差异图像不为零，表明集落确实继续生长。通过将所述条进一步孵育过夜来验证该结论。
从图27A中，发现MIC值为3μg/mL。根据CLSI公布的解释标准，所获得的MIC值可以分类为I＝中间。当处于参考值的“小误差”下时，由Vitek 2获得的MIC明显大于1μg/mL的值(敏感；S)。此外，根据实施例11进行肉汤微量稀释AST并且发现1.5μg/mL的MIC，这对应于根据CLSI的“S”结果。虽然不在分类上一致，但测试方法(LD-AST)的MIC是参考方法的+/-1倍稀释，这对应于与肉汤微量稀释AST相比的微小误差。
LD-AST的MIC与参考方法之间的微小差异是预期的。根据盘扩散的标准方案[HARDYDISKTM抗微生物敏感性测试(AST)-使用说明]，与其他生物体和试剂的常规16至18小时相比，对于万古霉素和苯唑西林，葡萄球菌或肠球菌属需要培养24小时。根据文献，通过管微量稀释和琼脂测试的万古霉素MIC分布与通过肉汤微量稀释评估的那些显著不同，并且在24小时和48小时可能不同[Vaudaux,Pierre et al.“Underestimation ofvancomycin and teicoplanin MICs by broth microdilution leads tounderdetection of glycopeptide-intermediate isolates of Staphylococcusaureus.”Antimicrobial agents and chemotherapy vol.54,9(2010):3861-70.doi:10.1128/AAC.00269-10]。此外，已知通过E-检验(bioMérieux AB BIODISK,bioMerieux,Inc.,Hazelwood,Mo.)产生的万古霉素MIC高于通过肉汤或琼脂稀释测定的MIC。因此，使用万古霉素的实验结果用肉汤微量稀释和简化的集落分析琼脂方法进行交叉验证[Determination of minimum inhibitory concentrations.Andrews JM J AntimicrobChemother.2001Jul；48Suppl 1():5-16.]。如上所述，可将观察结果与参考方法比较以推断合适的有效抗微生物剂浓度。
为了验证小体积凝胶的MIC与EUCAST报告的金黄色葡萄球菌和万古霉素的典型MIC值之间观察到的差异不是由环形盘的几何形状及其相应的扩散动力学引起的，执行以下实验。在水中制备目标抗微生物剂的两倍连续稀释。然后将20μL的每种稀释液吸移到根据实施例10的方法制备的“稀型”微孔的表面上。约10分钟后，抗微生物剂溶液已扩散到凝胶的顶部。然后添加1μL的微生物细胞悬浮液并且将它们一起在37℃下孵育直到在对照孔(零抗微生物剂浓度)的微生物集落可见。以这种方式发现的MIC为3g/mL。
为了进一步说明LD-AST在测定的第一小时期间对抗微生物剂浓度在ROI处的变化的不敏感性，以两种不同的方案进行测定；第一直接方案，其涉及在使环形盘与固相生长培养基接触之后立即接种微生物细胞悬浮液，和第二延迟方案，其中在使环形盘与固相生长培养基接触之后1小时接种微生物细胞悬浮液。在图28中呈现了暴露于万古霉素的金黄色葡萄球菌的情况的结果。如在图中可见，对于两种方案，微生物细胞生长曲线没有可观察到的差异，并且对于两种方案，MIC是相等的。
对慢致病性真菌细胞进行药敏试验
致病性真菌细胞生长缓慢，市售真菌细胞的抗微生物敏感性测试相应缓慢。在本实施方案中，说明了就产生时间而言，细菌和真菌细胞的LD-AST方法和装置是相似的。此外，由于可用抗真菌剂的数量小于抗细菌剂的数量，真菌微集落可以被再悬浮在较低体积中，例如对于真菌细胞为20μL，而对于细菌细胞为100μL。因此，可以在细胞数达到～500CFU(～9个生长周期)时进行真菌细胞收获。
制备具有不同水平的两性霉素B的一系列LD-AST单位，并针对白色念珠菌(ATCC90028)进行测试。在孵育时间为3和4小时时得到的ROI图像示于图29中。按照实施例13的步骤分析图像，并且发现在对应于2μg/mL的LD-AST单位下的细胞已经停止生长。因此，MIC测定为2μg/mL。在对应于1μg/mL的LD-AST单元的生长结束，尽管在图29中通过目视检查t＝3和4孵育图像不容易注意到，但通过参考图中的过夜孵育行进行验证。
对阳性培养物样品进行药敏试验
可以使用上述方法测试阳性培养物样品(诸如阳性血液培养物样品)的抗微生物敏感性，同时最少或不需要额外的样品处理步骤。这种灵活性是由于两个特征：i)方法对微生物细胞浓度的不敏感性至少在跨越两个数量级的范围内，和ii)对固相进行测定并通过成像微集落监测细胞生长。这些特征意味着不需要通常通过需要低水平背景散射体的光学散射测量来精确测量细胞浓度。为了证明LD-AST对阳性血培养样品进行AST的灵活性，进行了以下实验。
将甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA 111，没有强抗性)以5-10CFU/ml的标称浓度掺入10mL全血样品中。然后，用10mL掺加的全血接种FA Plus需氧血培养瓶并在37℃孵育直至培养物变为阳性。此时，将细菌细胞的30μL的甘油储备液接种在3mL的TSB中并且在37℃下在150rpm下振荡孵育3小时。基于OD测量，在TSB中以105CFU/mL的标称浓度制备各细菌的连续稀释液。将阳性血液样品的等分试样在TSB中稀释1000倍。用“薄条”型LD-AST同时测定两个样品对苯唑西林的敏感性。图30中呈现的结果表明类似的MIC值为1μg/mL。
在抗微生物剂组上进行抗微生物剂敏感性测试
在该实施例中，制备类似于致敏革兰氏阳性GPALL1F板(ThermoFisherScientific)的抗微生物剂组。市售的96孔微板形式的板包括23种抗微生物剂，每种具有几个临床相关浓度。根据实施方案14的方案针对MRSA-110进行微生肉汤稀释AST测试，并且结果呈现在图31A中。
制备对应于上述平板的稀型LD-AST单元，即采用相同的抗微生物剂和相同的浓度，使得在微生物肉汤稀释孔和LD-AST单元之间存在一对一的对应。将LD-AST单元置于凝胶孔上并根据实施例15的方法进行LD-AST。结果被确定并呈现在图31B中。可以看出，结果与市售肉汤稀释AST的结果一致。
用于几种示例抗微生物剂-微生物细胞组合的LD-AST
提供本实施例以说明LD-AST方法和肉汤微量稀释AST之间性能的潜在相似性，即使LD-AST产生的时间仅仅是4小时，也与常规肉汤微量稀释AST所需的16-20小时形成鲜明对比。
制备对应于抗微生物剂的选定组的薄型LD-AST单元，并且根据实施例15的方法对选定的微生物菌株进行LD-AST方法。结果示于图32中，其中根据CLSI指导原则使用如下缩写：测试方法的EA-MIC为参考方法的+/-1倍稀释，CA/次要类别一致(即，测试方法的MIC的易感(S)，中间(I)或抗性(R)解释与参考方法的S、I或R解释相匹配)。
实施例
提供以下实施例以使本领域技术人员能够理解和实践本发明的实施方案。它们不应被认为是对本发明范围的限制，而仅仅是其说明性和代表性的。
实施例1：微生物细胞培养物的制备
如下制备除了金黄色葡萄球菌(SA)和肺炎链球菌(SP)细胞培养物之外的革兰氏阳性菌：
1.将三十L的相应的细菌物种和菌株甘油储备液接种在3mL的胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中并且在37℃下在150rpm下振荡孵育过夜。
2.将TSB中十倍稀释的培养物在37℃孵育1小时(粪肠球菌(Efcl)、屎肠球菌(Efcm)和无乳链球菌(Sag))或2小时(表皮葡萄球菌(SE)、溶血葡萄球菌(SH)和酿脓链球菌(Spyo))。
如下制备铜绿假单胞菌(PA)细胞培养物之外的革兰氏阴性菌：
1.将30μL的相应的细菌物种和菌株甘油储备液接种在3mL的TSB中并且在37℃下在150rpm下振荡孵育过夜。
2.将在TSB中十倍稀释的培养物在37℃孵育1小时(鲍氏不动杆菌(AB)、阴沟肠杆菌复合物(Ecl)、产气肠杆菌(EA)、大肠杆菌(EC)、产酸克雷伯氏菌(KO)、肺炎克雷伯氏菌(KP)和奇异变形杆菌(PM))或2小时(粘质沙雷氏菌(SM))。
如下制备金黄色葡萄球菌(SA)细胞培养物：
将30μL的相应菌株甘油储备液接种在3mL的TSB中并且在37℃在150rpm振荡下孵育3小时。
如下制备肺炎链球菌(SP)细胞培养物：
将30μL的相应物种或菌株甘油储备液接种在3mL的TSB中并且在产生CO2的小袋存在下在37℃下在80rpm下振荡孵育3小时。
如下制备铜绿假单胞菌(PA)：
1.将6μL的PA菌株甘油储备液在具有5％绵羊血平板的胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)上划线并且在37℃下孵育过夜(P1)。
2.将细菌集落在琼脂平板(P2)上再传代培养一次。
3.将来自平板的一个集落接种于3ml中。
真菌细胞培养物按如下制备：
1.将三十μL的相应的细菌物种和菌株甘油储备液接种在3mL的TSB中并且在37℃下在150rpm下振荡孵育过夜。
2.在TSB中10倍稀释的培养物在30℃孵育2小时(白色念珠菌(CA)、光滑念珠菌(CG)、近平滑念珠菌(CP)和热带假丝酵母(CT))。
基于光密度(OD)测量，在TSB中以103CFU/mL的标称浓度制备各细菌的连续稀释液。
实施例2：掺加全血样品的制备
用SPS管，从健康个体抽取5-8mL血标本，置于BD
中。在掺加细菌细胞之前将管保持在室温下平均4小时。然后，将100μL具有105CFU/mL的相应细菌细胞的标称浓度的细菌细胞悬浮液加入到4mL的血液中并且通过温和涡旋混合。因此，微生物细胞的浓度标称为约2.5×103CFU/mL。
实施例3：掺加磷酸盐缓冲液样品的制备
将具有约105CFU/mL的相应细菌细胞的100μL细菌细胞悬浮液储备液加入4mL的1mM磷酸盐缓冲液(PB)中，并通过温和涡旋混合。因此，微生物细胞的浓度标称为约2.5×103CFU/mL。
实施例4：血液裂解试剂的制备
通过将10mL缓冲浓度为100mM、pH为10的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲溶液与10mL浓度为40mg/ml SPS、皂苷浓度为70mg/ml、Triton X-100浓度为0.3w/v的溶液混合，制备血液裂解试剂溶液，得到体积为20ml、SPS浓度为20mg/ml、皂苷浓度为35mg/ml、Triton X-100浓度为0.15％w/v、缓冲液浓度为50mM、pH值在9.5-10的范围内的试剂溶液。
实施例5：4mL掺加全血样品的样品处理
按如下对掺加的全血样品进行样品制备：
1.在15mL离心管中，将4ml血液裂解试剂加入4ml掺加的全血样品中。
2.将离心管在涡旋器的最大速度下涡旋混合1分钟。
3.将离心管以4000rpm离心8分钟。
4.除去7.9ml的上清液。
5.按如下进行第一洗涤循环，向残余物中添加2.9mL洗涤缓冲液，通过轻轻涡旋混合溶液，在4000rpm下离心3min，并且取出并弃去2.9mL上清液，使得保留100μl的残余液体。
6.按如下进行第二洗涤循环，向残余物中添加2.9mL洗涤缓冲液，通过轻轻涡旋混合溶液，在4000rpm下离心3min，并且取出并弃去2.9mL上清液，使得保留100μl的残余液体。
7.按如下进行第三洗涤循环，向残余物中添加1.9mL洗涤缓冲液，通过轻轻涡旋混合溶液，在4000rpm下离心3min，并且取出并弃去1.9mL上清液，使得保留100μl的残余液体。
8.按如下进行第四洗涤循环，向残余物中添加1.9mL洗涤缓冲液，通过轻轻涡旋混合溶液，在4000rpm下离心3min，并且取出并弃去1.9mL上清液，使得保留100μl的残余液体(细胞悬浮液)。
实施例6：琼脂平板的制备
制备琼脂平板，最终琼脂浓度为1-5％w/v。为了制备胰蛋白酶大豆琼脂血(TSAB)平板，使用TSAB脱水培养基：每升配方，琼脂13.5g，酪蛋白胨15.0g，大豆蛋白胨5.0gm，氯化钠5.0gm(Hardy Diagnostics，加州)。为了制备具有更高琼脂浓度(>1.35％w/v)的琼脂平板，根据所需的琼脂浓度使用琼脂细菌学级脱水培养基(Hardy Diagnostics，加州)。
使用灭菌的去纤维蛋白羊血(Hardy Diagnostics，加州)来富集凝胶并促进细菌生长。制备步骤如下：
1.将具有附加琼脂粉末(如果需要)的TSAB粉末在100℃的热板上在水浴中以水分子生物学级溶解10分钟。
2.将溶液(具有水浴)在121℃高压灭菌15分钟。
3.将溶液冷却至约55℃，保持15分钟。
4.将3-5％绵羊血(在水浴中预热至50℃保持30分钟)加入到冷却的溶液中并充分混合。
5.将溶液分配至皮氏培养皿(35×10mm)并使其固化5分钟。
6.为了防止微生物污染，将板储存在无菌环境中。
实施例7：测定琼脂平板上微生物细胞的生长速率和集落大小
通过以下步骤测定微生物细胞在琼脂平板上的生长速率：
1.制备标称浓度为105CFU/mL的起始细胞悬浮液。
2.将1μL的细胞悬浮液分配在琼脂凝胶板上的三个可识别区域之一上并且使它们在迷你培养区域(MCR)上展开并且风干。因此，板上将存在3个MCR，标识为MCR1、MCR2和MCR3。
3.t0＝0小时时在MCR上成像。
4.将板在37℃下孵育1小时。
5.对于细菌在2小时，且对于真菌物种在4小时的时间点成像MCR1。
6.通过分析图像计算微集落的面积，并通过关系D＝2*sqrt(面积/3.1416)计算它们相应的直径D。然后通过对所有微集落取平均值来计算平均直径。
7.通过拭子去除MCR的微生物内容物并且将其再悬浮于200μL TSB生长培养基中(细胞再悬浮)。
8.将细胞在TSB中以10的倍数连续稀释，并将所得样品标记为S100、S10-1、S10-2、S10-3、和S10-4。
9.将样品铺板并孵育过夜。
10.对于MCR2和MCR3，分别在3、4和任选地对于细菌物种在6小时重复步骤5至9(对于真菌物种在5和6小时)。计数过夜集落并将它们制表。
11.因此，计算各个MCR上的微生物细胞的数量。
12.通过在对数-线性曲线上计算细胞数目对时间曲线的斜率来确定生长速率。
13.绘制平均集落直径对集落细胞含量的图。
14.确定微集落中的细胞数目达到103和105时的平均直径。
实施例8：测定从血液样品中分离微生物细胞并使其在琼脂平板上形成集落的回收率
按如下测定掺加的全血样品的回收率：
1.在盒中，如图13A所示并且在室503中包含4mL实施例4的BLR，将四mL掺加的全血样品(根据实施例2制备)添加到室501中。
2.通过将BLR移动到室501并将所得混合物在室501和503之间来回移动5次来混合血液样品和BLR。
3.将盒在3000g下离心8分钟。
4.将7.9ml的上清液移至废物室506。
5.第一洗涤循环按如下进行：向残余物中加入2.9mL洗涤缓冲液，通过在室501和503之间轻柔地移动溶液来混合溶液。
6.在3000g下离心3min，
7.将2.9ml的上清液移至废物室506。
8.重复步骤5至7进行第二洗涤。
9.去除100μL残余物(细胞悬浮液)
10.将细胞悬浮液接种于琼脂平板上并在37℃下孵育过夜。
11.计数集落，根据对照平板计算相对于预期数目的回收率。
实施例9A：用抗生素涂覆环形盘
将直径为6.35mm、厚度为0.75mm的空白AST纸盘(Hardy Diagnostics，Z7121)修改为在中心包括3mm的孔。每个纸盘在饱和之前具有吸收大约20μL液体的能力。对于每种抗生素，在水中进行两倍连续稀释，其包括接近其可疑MIC值的浓度。将这些盘分离到96孔微孔板的单独孔中，并且然后将20μL的每种抗生素稀释液吸移到纸盘上，确保整个盘均匀润湿。在室温下孵育约20分钟后，在真空干燥器中干燥微板中的盘。可替代地，在微孔板孔中分离的单个盘可以浸泡在过量体积(30至50μL)的抗生素稀释液中。在孵育之后，通过移液管除去过量的流体并在真空干燥器中干燥。然后将微板用粘合剂覆盖并储存在4℃下。
实施例9B：在具有径向变化浓度的环形盘上涂布抗生素
将直径为6.35mm、厚度为0.75mm的空白AST纸盘(Hardy Diagnostics,Z7121)分离成平板培养皿(例如，24孔培养皿)。如实施例9A中所述制备每种抗生素的两倍连续稀释物，并且然后将20μL的每种稀释物滴加到每个盘上。然后将盘在高真空(0.5-2mTorr)下在干燥器中干燥1小时。一旦干燥，就将15μL的水吸入每个盘的中心，使得水向外辐射至盘的边缘。然后将盘在真空干燥器下再次干燥1小时。然后在盘的中心冲出3mm的孔。将它们转移至96孔微孔板的单独孔中，然后用粘合剂盖密封并储存在4℃下。
实施例10：制备血琼脂微孔
根据制造商，用1％去纤维蛋白绵羊血制备胰酶大豆琼脂血基(HardyDiagnostics C5221)。在琼脂仍然温暖时(45-50℃)，将其吸移到12×8孔条平板的孔中。对于“薄凝胶”情况，将大约50μL琼脂分配到单个孔中，使凝胶厚度约为～1mm。对于“中等厚度凝胶”的情况，分配大约150μL的琼脂，使凝胶厚度约为～3mm。最后，对于“厚凝胶”的情况，分配大约350μL的琼脂，使凝胶厚度约为～7mm。然后将琼脂凝胶冷却至室温以固化，然后立即使用或在4℃下储存，在孔上覆盖粘合剂以防止凝胶干燥。
实施例11：进行肉汤微量稀释AST
抗微生物剂在肉汤中的中间两倍稀释液(胰蛋白酶大豆，并且在一些情况下，脑心浸液)。将100μL抗微生物剂/肉汤溶液一式三份分配到96孔板的每个孔中。然后，向各孔中加入10μL根据实施例5的方法制备的5×106CFU/mL细胞悬浮液。将板密封并置于35-37℃的孵育器中16-24小时以测定MIC值。
实施例12：接种准备
使用肉汤培养法制备接种物。简而言之，根据要培养的细菌将30-100μl细菌甘油储备液的等分试样解冻，并加入到2-3mL合适的培养基中(胰蛋白酶大豆或脑心浸液)。然后将细菌培养物在37℃用设定在150rpm的摇床孵育并生长2-3小时。在制备的15分钟内，将接种物悬浮液调节至0.5McFarland标准(1×108CFU/mL)，随后在肉汤中1:20稀释以产生5×106CFU/mL。
实施例13：处理时间推移图像以确定生长
为了对准在不同时间点(接种后2、3、4和5小时)采集的成像数据，执行具有刚性变换约束的2D-2D配准(仅允许平移和旋转)。使用关键点检测器SURF自动识别先前时间点(tn-1或tn-2)图像(所谓的参考图像)与每个另外图像(所谓的浮动图像)之间的对应强度特征点，并将其用于相对于参考数据对准成像日期。在参考图像处存在的强度特征被分类为背景，而在另外的图像(细胞/虫)上出现的强度特征被分类为前景。在连续的图像中已经标记了给定的单个微集落的位置。设置背景允许微集落及其生长的增强检测。
实施例14：使用市售平板进行肉汤微量稀释
1.将3-5个集落加入水中，制备0.5McFarland细胞悬浮液。
2.根据靶细胞，将1μL、10μL或30μL的细胞悬浮液加入到M-H肉汤(MHB)生长培养基中，在微孔板的各孔中达到50μL的体积。
4.将板密封并在34-36℃下在非-CO2孵育器中孵育18-24小时。
5.检查各孔的浊度。
实施例15：进行LD-AST
1.根据实施例1的方法制备微生物储备悬浮液。
2.通过加入TSB培养基稀释储备液至105CFU/mL的浓度。
3.将LD-AST单元与微孔条中的相应凝胶偶联。
4.将1μL来自步骤2的样品的分散到每个LD-AST单元的ROI中。
5.将条在37℃孵育三小时。
6.对这些ROI进行成像。
7.将条再孵育1小时。
8.对这些ROI进行成像。
9.根据实施例13的方法比较这两个图像。
10.将条孵育过夜以验证生长的存在。
已经通过举例示出了上述具体实施方案，并且应当理解，这些实施方案可以容许各种修改和替代形式。还应当理解，权利要求不旨在限于所公开的具体形式，而是涵盖落入本发明的精神和范围内的所有修改、等同物和替代方案。
Claims (202)
1.一种处理含有微生物细胞的样品的方法，所述方法包含：
将所述样品引入集成流体装置，所述集成流体装置包含样品处理模块和生长模块；
在将所述集成流体装置保持在关闭状态以防止外部微生物细胞进入时：
在所述样品处理模块内处理所述样品以从所述样品分离所述微生物细胞并获得微生物细胞悬浮液，所述微生物细胞悬浮液包含悬浮在液体内的所述微生物细胞；
将所述微生物细胞悬浮液从所述样品处理模块输送到所述生长模块，使得所述微生物细胞悬浮液接触存在于所述生长模块内的固相生长培养基，所述固相生长培养基被配置为促进微生物细胞生长；
从所述微生物细胞悬浮液去除所述液体的至少一部分，使得至少一种微生物细胞保留在所述固相生长培养基的表面上；以及
在适于促进集落生长的条件下孵育至少所述生长模块。
2.根据权利要求1所述的方法，其中通过所述固相生长培养基吸收所述液体的所述至少一部分来去除所述液体的所述至少一部分。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述液体是第一液体并且所述固相生长培养基是基于凝胶的培养基，所述方法进一步包含在使所述微生物细胞悬浮液与所述固相生长培养基接触之前，使所述集成流体装置经受离心力，以从所述固相生长培养基去除第二液体，从而获得部分脱水的固相生长培养基，使得当所述微生物细胞悬浮液与所述部分脱水的固相生长培养基接触时，所述第一液体的所述至少一部分通过所述部分脱水的固相生长培养基的吸收而去除。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述离心力的范围在1,000g与10,000g之间。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中在所述样品处理模块内处理所述样品以根据基于离心分离的分离方法从所述样品分离所述微生物细胞，并且其中在所述基于离心分离的分离方法期间向所述固相生长培养基施加所述离心力。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其中在离与所述固相生长培养基的表面相关联的表面法线小于30度的方向上施加所述离心力。
7.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其中在垂直于所述固相生长培养基的表面的方向上施加所述离心力。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的方法，其中接触所述微生物细胞悬浮液的所述表面是第一表面，所述固相生长培养基进一步包含与所述第一表面相对的第二表面，施加所述离心力使得所述第二液体从邻近所述第二表面的区域移除。
9.根据权利要求3至7中任一项所述的方法，其中接触所述微生物细胞悬浮液的所述表面是第一表面，所述固相生长培养基进一步包含与所述第一表面相对的第二表面，施加所述离心力使得所述固相生长培养基的邻近所述第一表面的第一区域比所述固相生长培养基的邻近所述第二表面的第二区域脱水得更多。
10.根据权利要求3至9中任一项所述的方法，其中所述第二液体被与所述固相生长培养基流动连通的吸收材料吸收。
11.根据权利要求10所述的方法，其中多孔膜位于所述固相生长培养基和所述吸收材料之间。
12.根据权利要求3至11中任一项所述的方法，所述离心力是第一离心力，所述方法进一步包含在已经使所述部分脱水的固相生长培养基与所述微生物细胞悬浮液接触之后，使所述集成流体装置经受第二离心力，以促进来自所述微生物细胞悬浮液的至少一部分液体被部分脱水的固相生长培养基吸收并促进所述至少一种微生物细胞保留在表面上。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述第二离心力的范围在500g与4000g之间。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述固相生长培养基配置成被动地吸收所述液体的至少一部分。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述固相生长培养基包含多孔网络并且在与所述微生物细胞悬浮液接触之前处于至少部分脱水的状态。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述固相生长培养基是作为部分脱水的水凝胶提供的。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述液体的所述至少一部分通过气体可渗透膜蒸发地去除。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述液体的所述至少一部分通过空气的主动循环蒸发地去除。
19.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中通过由选自由以下组成的组的分离方法分离所述微生物细胞：过滤、免疫磁分离和微流体分离。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中保留在所述固相生长培养基表面上的至少一种微生物细胞是肺炎链球菌微生物细胞，并且其中在不控制所述生长模块内的二氧化碳环境的情况下实现与所述肺炎链球菌微生物细胞相关的集落生长。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述样品是全血样品，并且其中通过以下步骤在所述样品处理模块中将所述微生物细胞与所述样品分离：
将所述全血样品与血液裂解试剂混合，所述血液裂解试剂包含皂苷类、聚赖氨酸磺酸钠和碱性缓冲液，以获得皂苷类浓度介于0.75与60mg/ml之间、聚赖氨酸磺酸钠浓度介于0.35与50mg/ml之间、pH介于7.8与10之间的混合物；以及
从所述混合物中分离微生物细胞。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，进一步包含：
检测所述固相生长培养基上集落的存在，所述集落具有小于100微米的直径；
从所述集落收获微生物细胞。
23.根据权利要求22所述的方法，其中检测所述固相生长培养基上所述集落的存在包含：
获得所述固相生长培养基的第一图像；
获得所述固相生长培养基的第二图像，其中所述第二图像是在所述生长模块孵育期间经过时间延迟后获得的；
使用所述图像中存在的表面伪影将所述第一图像配准到所述第二图像；
对配准后的第一图像和第二图像进行图像相减，去除所述第二图像中的表面伪影，从而得到相减图像；以及
处理所述相减图像以标识所述集落的位置。
24.根据权利要求23所述的方法，进一步其中所述表面伪影的至少一个子集是所述固相生长培养基的表面中的不均匀性。
25.根据权利要求23所述的方法，进一步其中所述表面伪影的至少一个子集是驻留在所述固相生长培养基的所述表面上的裂解碎片颗粒，所述裂解碎片颗粒是通过用所述样品处理模块裂解所述样品而产生的。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述裂解碎片颗粒是血液裂解碎片颗粒。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述血液裂解碎片颗粒的平均颗粒直径小于10微米。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述样品处理模块配置成使得所述固相生长培养基被所述裂解碎片颗粒覆盖的面积分数小于20百分比。
29.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述样品处理模块配置成使得所述固相生长培养基被所述裂解碎片颗粒覆盖的面积分数小于50百分比。
30.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述样品处理模块配置成使得所述固相生长培养基被所述裂解碎片颗粒覆盖的面积分数小于90百分比。
31.根据权利要求22至30中任一项所述的方法，进一步包含使用所收获的微生物细胞进行抗微生物易感性测试。
32.根据权利要求31所述的方法，所述方法进一步包含在从所述集落中收获所述微生物细胞之前，在不损害所述集落的活力的情况下查询所述集落，以将所述微生物细胞分类为属于选自一组微生物种类的一种微生物细胞种类。
33.根据权利要求32所述的方法，其中至少部分地基于所测量的所述集落的生长速率来确定所述选定的微生物细胞种类。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述微生物细胞的所述选定的微生物细胞种类选自包含细菌细胞和真菌细胞的一组微生物细胞种类。
35.根据权利要求32所述的方法，其中所述微生物细胞的所述选定的微生物细胞种类选自由细菌细胞和真菌细胞组成的一组微生物细胞种类。
36.根据权利要求32所述的方法，其中所述微生物细胞的所述选定的微生物细胞种类选自包含革兰氏阳性菌细胞、革兰氏阴性菌细胞和真菌细胞的一组微生物细胞种类。
37.根据权利要求32所述的方法，其中所述微生物细胞的所述选定的微生物细胞种类选自由革兰氏阳性菌细胞、革兰氏阴性菌细胞和真菌细胞组成的一组微生物细胞种类。
38.根据权利要求32至37中任一项所述的方法，其中所述抗微生物易感性测试使用一种或多种抗生素进行，其中所述一种或多种抗生素根据所述选定的微生物细胞种类来选择。
39.根据权利要求32至38中任一项所述的方法，进一步包含：
使用所述选定的微生物细胞种类来确定何时预期所述集落含有足够量的微生物细胞以进行抗微生物易感性测试；
其中所述收获的微生物细胞是在确定所述集落含有足够量的微生物细胞后收获的。
40.根据权利要求39所述的方法，其中基于所述选定的微生物细胞种类和与集落大小相关的光学检测的集落大小量度，确定所述集落含有足够量的微生物细胞。
41.根据权利要求40所述的方法，其中确定所述集落何时含有足够量的微生物细胞基于所述选定微生物细胞种类和所述集落大小量度之间的预定关系。
42.根据权利要求39所述的方法，其中确定所述集落何时含有足够量的微生物细胞基于所述选定的微生物细胞种类和生长持续时间之间的预定关系。
43.根据权利要求39所述的方法，其中确定所述集落何时含有足够量的微生物细胞至少部分基于测得的集落生长速率。
44.根据权利要求42所述的方法，其中基于与所述集落大小相关的光学检测的集落大小量度进一步确定所述集落含有足够量的微生物细胞。
45.根据权利要求32所述的方法，其中所述固相生长培养基是生色生长培养基，并且其中所述选定的微生物细胞种类是基于检测到的所述集落的光谱特征来确定的。
46.根据权利要求45所述的方法，其中通过拉曼显微术检测所述光谱特征。
47.根据权利要求45所述的方法，其中通过傅里叶变换红外光谱显微术检测所述光谱特征。
48.根据权利要求45所述的方法，其中通过荧光显微术检测所述光谱特征。
49.根据权利要求32所述的方法，其中查询所述集落以确定所述选定的微生物细胞种类包含：
将光束引导到所述集落上；
从所述集落获得散射光图像；以及
处理所述图像以确定所述选定的微生物细胞种类。
50.根据权利要求31至49中任一项所述的方法，其中在所述集落通过肉眼可检测之前从所述集落收获微生物细胞。
51.根据权利要求31至49中任一项所述的方法，其中当所述集落具有在70微米与100微米之间的直径时从所述集落收获微生物细胞。
52.根据权利要求31至49中任一项所述的方法，其中在所述集落达到100微米的直径之前从所述集落收获微生物细胞。
53.根据权利要求31至49中任一项所述的方法，其中在所述集落达到50微米的直径之前从所述集落收获微生物细胞。
54.根据权利要求31至49中任一项所述的方法，其中在所述集落达到70微米的直径之前从所述集落收获微生物细胞。
55.根据权利要求32至49中任一项所述的方法，其中所述集落是第一集落，从所述第一集落收获的微生物细胞是第一微生物细胞，所述方法进一步包含：
检测所述固相生长培养基上第二集落的存在；以及
从所述第二集落收获第二微生物细胞。
56.根据权利要求55的方法，其中使用从所述第一集落和所述第二集落收获的微生物细胞进行抗微生物易感性测试。
57.根据权利要求55所述的方法，进一步包含在进行所述抗微生物易感性测试之前，查询所述第一集落和所述第二集落以确定所述第一集落和所述第二集落之间表型对应的存在或不存在。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述第一集落与所述第二集落之间的表型对应的存在或不存在是通过将从所述第一集落检测到的第一光信号与从所述第二集落检测到的第二光信号进行比较来确定的。
59.根据权利要求57所述的方法，其中通过将所述第一集落的第一光学图像与所述第二集落的第二光学图像进行比较来确定所述第一集落与所述第二集落之间是否存在所述表型对应。
60.根据权利要求57所述的方法，其中所述选定的微生物细胞种类是与所述第一集落内的第一微生物细胞的第一类型相关联的第一选定微生物细胞种类，并且其中所述第一集落与所述第二集落之间存在或不存在表型对应是通过以下步骤确定的：
在不损害所述集落的活力的情况下查询所述第二集落，以确定与所述第二集落内的第二微生物细胞的第二类型相关的第二选定微生物细胞种类，其中所述第二选定微生物细胞种类选自所述一组微生物细胞种类；以及
确定所述第一微生物细胞种类与所述第二微生物细胞种类是否相同。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述第一微生物细胞种类与所述第一集落的第一微生物细胞的第一物种相关联，并且其中所述第二微生物细胞种类与所述第二集落的第二微生物细胞的第二物种相关联，并且其中当确定所述第一物种与所述第二物种相同时建立所述表型对应的存在。
62.根据权利要求57至61中任一项所述的方法，其中在已经确定所述第一集落与所述第二集落之间所述表型对应的存在之后，使用来自所述第一微生物细胞和所述第二微生物细胞两者的微生物细胞进行所述抗微生物易感性测试。
63.根据权利要求57至61中任一项所述的方法，其中确定所述第一微生物细胞与所述第二微生物细胞之间不存在所述表型对应，并且使用所述第一微生物细胞和所述第二微生物细胞分开进行抗微生物易感性测试以确定针对所述第一微生物细胞和所述第二微生物细胞的分开的抗微生物易感性量度。
64.根据权利要求57至61中任一项所述的方法，其中所述选定的微生物细胞种类是初步选定的微生物细胞种类，并且其中所述初步选定的微生物细胞种类是根据第一分类方法确定的，并且其中所述一组微生物细胞种类是第一组微生物细胞种类，所述方法进一步包含，在已经确定了所述第一集落与所述第二集落之间的表型对应关系之后：
查询从所述第二集落收获的所述第二微生物细胞以确定与所述第二微生物细胞的类型相关联的补充微生物细胞种类，其中所述补充微生物细胞种类选自第二组微生物细胞种类，其中所述补充微生物细胞种类根据第二分类方法确定。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述第二组微生物细胞种类包括比所述第一组微生物细胞种类更多数量的微生物细胞种类。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述补充微生物细胞种类不存在于所述第一组微生物细胞种类中。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述补充微生物细胞种类是物种级微生物细胞种类。
68.根据权利要求65所述的方法，其中所述第一组微生物细胞种类不存在物种水平的微生物细胞种类，并且其中所述第二组微生物细胞种类包含多种物种水平的微生物细胞种类。
69.根据权利要求65所述的方法，其中所述第二分类方法能够以比所述第一分类方法更高的置信度确定给定的微生物细胞种类。
70.根据权利要求64至69中任一项所述的方法，其中所述补充微生物细胞种类使用基质辅助激光解吸/电离质谱法测定。
71.根据权利要求64至69中任一项所述的方法，其中使用拉曼检测和/或傅里叶变换红外光谱测定所述补充微生物细胞种类。
72.根据权利要求64至71中任一项所述的方法，其中在从所述第一集落收获所述第一微生物细胞之后，从所述第二集落收获所述第二微生物细胞，并且其中将所述第二集落孵育比所述第一集落更长的持续时间，使得当收获时所述第二集落大于当收获时所述第一集落。
73.根据权利要求64至72中任一项所述的方法，进一步包含：
确定所述第二集落何时预期含有足够量的微生物细胞以便于通过所述第二分类方法确定所述补充微生物细胞种类；
其中在确定所述第二集落含有足够量的微生物细胞后，从所述第二集落收获所述第二微生物细胞。
74.根据权利要求73所述的方法，其中在已经对来自所述第一集落的第一微生物细胞开始抗微生物易感性测试之后，确定所述第二集落含有足够数量的微生物细胞，并且其中在所述抗微生物易感性测试完成之前，确定与所述第二微生物细胞相关的所述补充微生物细胞种类。
75.根据权利要求73或74的方法，其中在收获所述第一微生物细胞之后和收获所述第二微生物细胞之前孵育所述第二集落以促进进一步的集落生长。
76.根据权利要求64至75中任一项所述的方法，进一步包含报告与所述第二微生物细胞相关的所述补充微生物细胞种类和与所述第一微生物细胞相关的最小抑制浓度。
77.根据权利要求31至76中任一项所述的方法，其中所述固相生长培养基是第一固相生长培养基并且所述微生物细胞悬浮液是第一微生物悬浮液，并且其中所述抗微生物易感性测试是通过以下步骤进行的：
将所述收获的微生物细胞重悬浮，从而获得第二微生物细胞悬浮液；
在多个位置将所述第二微生物细胞悬浮液分配到另外的固相生长培养基上，每个位置具有不同的局部抗生素浓度；以及
监测所述多个位置以推断所述微生物细胞的抗微生物易感性。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述另外的固相生长培养基具有设置在其上的疏水层和形成在所述疏水层中的多个孔，其中每个孔形成在相应的位置上，并且其中所述液体在每个位置处通过相应的孔分配。
79.根据权利要求31至76中任一项所述的方法，其中所述固相生长培养基是第一固相生长培养基并且所述微生物细胞悬浮液是第一微生物悬浮液，并且其中所述抗微生物易感性测试是通过以下步骤进行的：
将所述收获的微生物细胞重悬浮，从而获得第二微生物细胞悬液；
提供至少部分包围孔的固体支持物，所述固体支持物包含接触表面，其中化学剂提供在所述接触表面上和/或浸渍在所述接触表面下方；
使第二相生长培养基与所述固体支持物的所述接触表面接触，使得所述第二固相生长培养基的子区域通过所述孔可进入，并且使得所述化学试剂的至少一部分向内扩散到所述子区域中；
将一定体积的所述第二微生物细胞悬浮液沉积到所述子区域的表面上，使得所述第二微生物细胞悬浮液内的微生物细胞保留在所述子区域的表面上；
在足够长的持续时间内孵育所述第二固相生长培养基以允许所述保留的微生物细胞暴露于所述化学试剂；以及
检测所述子区域内微生物细胞生长的存在或不存在。
80.一种处理怀疑含有微生物细胞的样品的方法，所述方法包含：
在适于促进活微生物细胞生长的条件下使所述活微生物细胞的悬浮液与固相生长培养基接触；
检测所述固相生长培养基上集落的存在，所述集落具有小于100微米的直径；
光学查询所述集落以鉴定与所述集落相关的微生物细胞种类；
使用所述微生物细胞种类来确定何时预期所述集落含有足够量的微生物细胞以进行抗微生物易感性测试；
在所述集落生长至含有足够量的微生物细胞用于抗微生物易感性测试后，从所述集落收获微生物细胞；以及
使用所述收获的微生物细胞进行抗微生物易感性测试。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述集落是第一集落，从所述第一集落收获的所述微生物细胞是第一微生物细胞，所述方法进一步包含：
检测所述固相生长培养基上第二集落的存在；以及
从所述第二集落收获第二微生物细胞。
82.根据权利要求81的方法，其中使用从所述第一集落和所述第二集落收获的微生物细胞进行抗微生物易感性测试。
83.根据权利要求81所述的方法，进一步包含在进行所述抗微生物易感性测试之前，查询所述第一集落和所述第二集落以确定所述第一集落和所述第二集落之间表型对应的存在或不存在。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述第一集落与所述第二集落之间的表型对应的存在或不存在是通过将从所述第一集落检测到的第一光信号与从所述第二集落检测到的第二光信号进行比较来确定的。
85.根据权利要求83所述的方法，其中通过将所述第一集落的第一光学图像与所述第二集落的第二光学图像进行比较来确定所述第一集落与所述第二集落之间是否存在所述表型对应。
86.根据权利要求83所述的方法，其中所述选定的微生物细胞种类是与所述第一集落内的第一微生物细胞的第一类型相关联的第一选定微生物细胞种类，并且其中所述第一集落与所述第二集落之间存在或不存在表型对应是通过以下步骤确定的：
在不损害所述集落的活力的情况下查询所述第二集落，以确定与所述第二集落内的第二微生物细胞的第二类型相关的第二选定微生物细胞种类，其中所述第二选定微生物细胞种类选自所述一组微生物细胞种类；以及
确定所述第一微生物细胞种类与所述第二微生物细胞种类是否相同。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述第一微生物细胞种类与所述第一集落的第一微生物细胞的第一物种相关联，并且其中所述第二微生物细胞种类与所述第二集落的第二微生物细胞的第二物种相关联，并且其中当确定所述第一物种与所述第二物种相同时建立所述表型对应的存在。
88.根据权利要求81至87中任一项所述的方法，其中在已经确定所述第一集落与所述第二集落之间的表型对应之后，使用来自所述第一微生物细胞和所述第二微生物细胞两者的微生物细胞进行所述抗微生物易感性测试。
89.根据权利要求81至87中任一项所述的方法，其中确定所述第一微生物细胞与所述第二微生物细胞之间不存在所述表型对应，并且使用所述第一微生物细胞和所述第二微生物细胞分开进行抗微生物易感性测试以确定针对所述第一微生物细胞和所述第二微生物细胞的分开的抗微生物易感性量度。
90.根据权利要求81至87中任一项所述的方法，其中所述选定的微生物细胞种类是初步选定的微生物细胞种类，并且其中所述初步选定的微生物细胞种类是根据第一分类方法确定的，并且其中所述一组微生物细胞种类是第一组微生物细胞种类，所述方法进一步包含，在已经确定了所述第一集落与所述第二集落之间的对应之后：
查询从所述第二集落收获的所述第二微生物细胞以确定与所述第二微生物细胞的类型相关联的补充微生物细胞种类，其中所述补充微生物细胞种类选自第二组微生物细胞种类，其中所述补充微生物细胞种类根据第二分类方法确定。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述第二组微生物细胞种类包括比所述第一组微生物细胞种类更多数量的微生物细胞种类。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述补充微生物细胞种类不存在于所述第一组微生物细胞种类中。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述补充微生物细胞种类是物种级微生物细胞种类。
94.根据权利要求91所述的方法，其中所述第一组微生物细胞种类不存在物种水平的微生物细胞种类，并且其中所述第二组微生物细胞种类包含多种物种水平的微生物细胞种类。
95.根据权利要求91所述的方法，其中所述第二分类方法能够以比所述第一分类方法更高的置信度确定给定的微生物细胞种类。
96.根据权利要求90至95中任一项所述的方法，其中所述补充微生物细胞种类使用基质辅助激光解吸/电离质谱法测定。
97.根据权利要求90至95中任一项所述的方法，其中使用拉曼检测和/或傅里叶变换红外光谱测定所述补充微生物细胞种类。
98.根据权利要求90至97中任一项所述的方法，其中在从所述第一集落收获所述第一微生物细胞之后，从所述第二集落收获所述第二微生物细胞，并且其中将所述第二集落孵育比所述第一集落更长的持续时间，使得当收获时所述第二集落大于当收获时所述第一集落。
99.根据权利要求90至98中任一项所述的方法，进一步包含：
确定所述第二集落何时预期含有足够量的微生物细胞以便于通过所述第二分类方法确定所述补充微生物细胞种类；
其中在确定所述第二集落含有足够量的微生物细胞后，从所述第二集落收获所述第二微生物细胞。
100.根据权利要求99所述的方法，其中在已经对来自所述第一集落的第一微生物细胞开始抗微生物易感性测试之后，确定所述第二集落含有足够数量的微生物细胞，并且其中在所述抗微生物易感性测试完成之前，确定与所述第二微生物细胞相关的所述补充微生物细胞种类。
101.根据权利要求99或100的方法，其中在收获所述第一微生物细胞之后和收获所述第二微生物细胞之前孵育所述第二集落以促进进一步的集落生长。
102.根据权利要求90至101中任一项所述的方法，进一步包含报告与所述第二微生物细胞相关的所述补充微生物细胞种类和与所述第一微生物细胞相关的最小抑制浓度。
103.根据权利要求81至102中任一项所述的方法，其中所述活微生物细胞的悬浮液获自全血样品。
104.一种用于分离和培养活微生物细胞的集成流体装置，所述集成流体装置包含：
分离区，所述分离区配置成便于在所述集成流体装置的适当致动下从样品分离微生物细胞；以及
包含固相生长培养基的集落生长区域，其中所述集落生长区域配置成在所述集成流体装置的适当致动下接收来自所述分离区域的输出的分离的微生物细胞，使得所述分离的微生物细胞与所述固相生长培养基接触，同时保持所述集成流体装置的内部流动路径处于关闭状态，从而防止外部微生物细胞进入。
105.根据权利要求104所述的集成流体装置，其中所述集落生长区配置成便于在适于促进所述分离的微生物细胞生长的条件下得孵育期间，监测存在于所述固相生长培养基上的所述分离的微生物细胞的生长。
106.根据权利要求104所述的集成流体装置，其中所述固相生长培养基配置成被动地吸收液体，所述分离的微生物细胞在所述液体中从所述分离区域递送。
107.根据权利要求106所述的集成流体装置，其中所述固相生长培养基包含多孔网络并且以部分水合状态提供。
108.根据权利要求107所述的集成流体装置，其中所述固相生长培养基作为部分水合的水凝胶提供。
109.根据权利要求104至108中任一项所述的集成流体装置，其中，所述集落生长区域从所述集成流体装置的剩余部分可拆卸地移除。
110.一种确定化学试剂对微生物细胞生长的影响的方法，所述方法包含：
提供含有微生物细胞的微生物细胞悬浮液；
提供至少部分包围孔的固体支持物，所述固体支持物包含接触表面，其中化学剂提供在所述接触表面上和/或浸渍在所述接触表面下方；
使固相生长培养基与所述固体支持物的所述接触表面接触，使得所述固相生长培养基的子区域通过所述孔可进入，并且使得所述化学试剂的至少一部分向内扩散到所述子区域中；
将一定体积的所述微生物细胞悬浮液沉积到所述子区域的表面上，使得所述微生物细胞悬浮液内的微生物细胞保留在所述子区域的表面上；
在足够长的持续时间内孵育所述固相生长培养基以允许保留的微生物细胞暴露于所述化学试剂；以及
检测所述子区域内微生物细胞生长的存在或不存在。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述接触表面包括平面接触表面，并且其中所述固体支持物与所述固相生长培养基接触，使得所述平面接触表面接触所述固相生长培养基的表面并且至少部分地包围所述子区域，并且使得所述化学试剂的一部分从所述平面接触表面扩散到所述子区域中。
112.根据权利要求111所述的方法，其中所述固体支持物完全包围所述孔。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述固体支持物进一步包含位于所述孔附近的防水特征，所述防水特征配置成使得当所述平面接触表面与所述固相生长培养基接触时，所述防水特征浸没在所述固相生长培养基的所述表面下方，从而防止或减少所述微生物细胞悬浮液进入所述固相生长培养基的接触表面和表面之间。
114.根据权利要求113所述的方法，其中所述防水特征配置成穿透所述固相生长培养基至小于250微米的深度。
115.根据权利要求113所述的方法，其中所述防水特征配置成穿透所述固相生长培养基至小于100微米的深度。
116.根据权利要求112所述的方法，其中所述固体支持物的至少一部分具有环形形状。
117.根据权利要求111至116中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包含比所述平面接触表面更远离所述孔定位的侧向限制部件，所述侧向限制部件被配置为使得当所述平面接触表面与所述固相生长培养基接触时，所述侧向限制部件浸没在所述固相生长培养基内。
118.根据权利要求117所述的方法，其中所述侧向限制部件完全包围所述孔。
119.根据权利要求111至116中任一项所述的方法，其中所述接触表面包含比所述平面接触表面更远离所述孔定位的侧向接触表面，所述侧向接触表面配置成使得当所述平面接触表面与所述固相生长培养基接触时，所述侧向接触表面浸没在所述固相生长培养基内，其中所述侧向接触表面面向所述子区域，使得所述化学试剂从所述平面接触表面和所述侧向接触表面两者扩散到所述子区域中。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述侧向接触表面完全包围所述孔。
121.根据权利要求119所述的方法，其中所述侧向接触表面配置成使得当所述平面接触表面与所述固相生长培养基接触时，所述侧向接触表面插入所述固相生长培养基中的深度超过1mm。
122.根据权利要求119所述的方法，其中所述侧向接触表面配置成使得当所述平面接触表面与所述固相生长培养基接触时，所述侧向接触表面插入所述固相生长培养基中的深度超过2mm。
123.根据权利要求110所述的方法，其中所述固体支持物包含管状部件，并且其中所述管状部件的内表面的至少远侧表面区域用所述化学试剂涂覆和/或浸渍，并且其中所述管状部件与所述固相生长培养基接触，使得所述远侧表面区域的至少一部分浸没在所述固相生长培养基内，并且使得所述化学试剂在所述固相生长培养基的驻留在所述管状部件的管腔内的子区域内向内扩散。
124.根据权利要求123所述的方法，其中将所述管状部件插入所述固相生长培养基中，使得所述管状部件的近侧部分从所述固相生长培养基向外延伸，并且其中将所述一定体积的微生物细胞悬浮液分配到所述管状部件的所述近侧部分中。
125.根据权利要求123所述的方法，其中插入所述管状部件使得所述管状部件的远端接触支撑所述固相生长培养基的支撑表面，从而封闭所述子区域并限制所述管状部件内的所述化学试剂的扩散。
126.根据权利要求125所述的方法，其中，所述支撑表面包含设置在其中或其上的一个或多个配合特征，所述一个或多个配合特征配置成接触所述管状部件的远端。
127.根据权利要求126所述的方法，其中所述一个或多个配合特征包含突起和凹陷中的一者或两者。
128.根据权利要求126或127所述的方法，其中所述一个或多个配合特征完全包围所述管状部件的远端。
129.根据权利要求123至128中任一项所述的方法，其中所述管状部件是圆柱形部件。
130.根据权利要求123至129中任一项所述的方法，其中所述管状部件的远侧部分的壁厚小于500微米。
131.根据权利要求110至130中任一项所述的方法，其中所述化学试剂均匀分布在所述接触表面上。
132.根据权利要求110至130中任一项所述的方法，其中在所述接触表面上的多个分离区域处提供所述化学试剂。
133.根据权利要求110至130中任一项所述的方法，其中所述化学试剂的面积密度和表面下密度中的一个或多个沿着所述接触表面在空间上变化。
134.根据权利要求133所述的方法，其中根据所述局部面积密度和所述表面下密度中的一个或多个的梯度在所述接触表面上提供所述化学试剂。
135.根据权利要求134所述的方法，其中所述梯度设置成使得所述化学试剂的所述局部面积密度和所述表面下密度中的一个或多个在最接近所述孔的表面区域中最低。
136.根据权利要求110至135中任一项所述的方法，其中以合适的量和合适的空间分布在所述接触表面上提供所述化学试剂，使得在所述接触表面与所述固相生长培养基接触后一小时和三小时之间，紧挨在所述子区域的表面的中心部分下方的所述化学试剂的浓度变化小于10％。
137.根据权利要求110至135中任一项所述的方法，其中以合适的量和合适的空间分布在所述接触表面上提供所述化学试剂，使得在所述接触表面与所述固相生长培养基接触后一小时和三小时之间，紧挨在所述子区域的表面的中心部分下方的所述化学试剂的浓度变化小于5％。
138.根据权利要求110至135中任一项所述的方法，其中以合适的量和合适的空间分布在所述接触表面上提供所述化学试剂，使得在所述接触表面与所述固相生长培养基接触后两小时和四小时之间，紧挨在所述子区域的表面的中心部分下方的所述化学试剂的浓度变化小于10％。
139.根据权利要求110至135中任一项所述的方法，其中以合适的量和合适的空间分布在所述接触表面上提供所述化学试剂，使得在所述接触表面与所述固相生长培养基接触后两小时和四小时之间，紧挨在所述子区域的表面的中心部分下方的所述化学试剂的浓度变化小于5％。
140.根据权利要求110至135中任一项所述的方法，其中使所述固相生长培养基与所述接触表面接触，使得在所述固相生长培养基与所述接触表面之间接触的30分钟内，紧挨在所述子区域的表面的中心部分下方的所述化学试剂的浓度达到最大浓度。
141.根据权利要求110至140中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包含疏水性上表面，所述疏水性上表面配置成促进所述一定体积的所述微生物细胞悬浮液在所述子区域上的保留。
142.根据权利要求141所述的方法，其中所述疏水性上表面朝所述孔倾斜以帮助将所述一定体积的微生物细胞悬浮液在所述子区域上的保留。
143.根据权利要求110至142中任一项所述的方法，其中所述孔的最小宽度小于5mm。
144.根据权利要求110至142中任一项所述的方法，其中所述孔的最小宽度小于2mm。
145.根据权利要求110至142中任一项所述的方法，其中所述孔的最小宽度小于1mm。
146.根据权利要求110至145中任一项所述的方法，其中沉积到所述子区域的表面上的所述微生物细胞悬浮液的体积内的微生物细胞的数目小于50。
147.根据权利要求110至145中任一项所述的方法，其中沉积到所述子区域的表面上的所述微生物细胞悬浮液的体积内的微生物细胞的数目小于20。
148.根据权利要求110至145中任一项所述的方法，其中沉积到所述子区域的表面上的所述微生物细胞悬浮液的体积内的微生物细胞的数目小于10。
149.根据权利要求110至145中任一项所述的方法，其中沉积到所述子区域的表面上的所述微生物细胞悬浮液的体积小于5微升。
150.根据权利要求110所述的方法，其中沉积到所述子区域表面上的所述微生物细胞悬浮液的体积内的微生物细胞的数量小于2微升。
151.根据权利要求110至150中任一项所述的方法，其中所述固相生长培养基保留在微孔内，并且其中所述固相生长培养基的体积小于100微升。
152.根据权利要求110至150中任一项所述的方法，其中所述固相生长培养基保留在微孔内，并且其中所述固相生长培养基的体积小于50微升。
153.根据权利要求110至152中任一项所述的方法，其中所述固相生长培养基的厚度小于2mm。
154.根据权利要求110至152中任一项所述的方法，其中所述固相生长培养基的厚度小于1mm。
155.根据权利要求110至154中任一项所述的方法，其中所述化学试剂是抗微生物剂。
156.根据权利要求110至155中任一项所述的方法，其中所述微生物细胞悬浮液通过在不存在血液培养物的情况下处理全血样品获得。
157.根据权利要求110至155中任一项所述的方法，其中所述微生物细胞悬浮液在不进行传代培养的情况下从血液培养瓶获得。
158.根据权利要求157所述的方法，其中所述微生物细胞悬浮液通过稀释血液培养物样品获得。
159.根据权利要求110至158中任一项所述的方法，其中通过获得所述子区域的表面的一个或多个图像并处理所述一个或多个图像来执行检测所述子区域内微生物细胞生长的存在或不存在。
160.根据权利要求110至158中任一项所述的方法，进一步包含提供一个或多个另外的固体支持物，每个另外的固体支持物至少部分地包围相应的另外的孔，每个另外的固体支持物包含相应的另外的接触表面，其中每个另外的接触表面具有提供在其上和/或浸渍在其下方的不同量的所述化学试剂；
使所述固相生长培养基与每个另外的接触表面接触，使得所述固相生长培养基的另外的子区域通过所述相应的另外的孔可进入，并且使得所述化学试剂的至少一部分从每个相应的另外的接触表面向内扩散到每个相应的另外的子区域中；
将另外体积的所述微生物细胞悬浮液沉积到每个另外子区域的相应表面上，使得所述微生物细胞悬浮液内的微生物细胞保留在所述另外子区域的相应表面上；以及
在孵育所述固相生长培养基之后，检测每个子区域内微生物细胞生长的存在或不存在。
161.根据权利要求160所述的方法，进一步包含基于对所述子区域内存在或不存在微生物细胞生长的评估来确定所述化学试剂的最小抑制浓度。
162.根据权利要求161所述的方法，其中所述最小抑制浓度根据在所述固相生长培养基的孵育期间所述化学试剂在每个子区域的表面下方的估计浓度或浓度范围来确定。
163.根据权利要求160至162中任一项所述的方法，其中所述固体支持物和所述另外的固体支持物机械联接并形成固体支持物阵列。
164.根据权利要求163所述的方法，其中所述固相生长培养基由固相生长培养基支撑结构支撑，所述支撑结构包含多个微孔，每个微孔包含相应体积的所述固相生长培养基，并且其中所述固体支持物阵列与所述固相生长培养基接触，使得所述固体支持物阵列的每个接触表面在不同的相应微孔中与所述固相生长培养基的不同的相应体积接触。
165.根据权利要求164所述的方法，其中所述固体支持物阵列和所述固相生长培养基支持物结构中的一个或多个包含促进所述相应接触表面和所述相应微孔之间的对齐的带键特征。
166.根据权利要求165所述的方法，其中所述带键特征便于每个接触表面的侧向位置和深度中的一个或多个相对于所述相应微孔的对准。
167.一种确定化学试剂对微生物细胞生长的影响的方法，所述方法包含：
提供含有微生物细胞的微生物细胞悬浮液；
使固相生长培养基与所述化学试剂在一个或多个接触区域接触，所述接触区域至少部分包围所述固相生长培养基的子区域并位于所述子区域附近，使得所述化学试剂的至少一部分从所述一个或多个接触区域扩散到子区域，其中所述一个或多个接触区域设置成使得当在平行于所述固相生长培养基的表面的至少一个方向上测量时，所述子区域的空间范围小于5mm；
将一定体积的所述微生物细胞悬浮液沉积到所述子区域的表面上，使得所述微生物细胞悬浮液内的微生物细胞保留在所述子区域的表面上；
在足够长的持续时间内孵育所述固相生长培养基以允许保留的微生物细胞暴露于所述化学试剂；以及
检测所述子区域内微生物细胞生长的存在或不存在。
168.一种将化学试剂引入固相生长培养基中的方法，所述方法包含：
提供至少部分包围孔的固体支持物，所述固体支持物包含接触表面，其中化学剂提供在所述接触表面上和/或浸渍在所述接触表面下方；
使所述固相生长培养基与所述固体支持物的所述接触表面接触，使得所述固相生长培养基的子区域通过所述孔可进入，并且使得所述化学试剂的至少一部分向内扩散到所述子区域中。
169.一种用于评估化学试剂对微生物细胞的影响的装置，所述装置包含：
至少部分地包围孔的固体支持物，所述固体支持物包含其上提供有所述化学试剂和/或在其下方浸渍有所述化学试剂的接触表面，使得在所述固体支持物的所述接触表面与固相生长培养基接触之后，所述化学试剂至少部分地从所述接触表面向内扩散进入所述固相生长培养基的子区域，所述子区域通过所述孔可进入，由此当含有所述微生物细胞的微生物细胞悬浮液接种到所述子区域时，允许微生物细胞暴露于所述抗微生物剂。
170.根据权利要求169所述的装置，其中所述接触表面包含平面接触表面。
171.根据权利要求170所述的装置，其中所述固体支持物完全包围所述孔。
172.根据权利要求171所述的装置，其中所述固体支持物还包含位于所述孔附近的防水特征，所述防水特征配置成使得当所述平面接触表面与所述固相生长培养基接触时，所述防水特征浸没在所述固相生长培养基的所述表面下方，从而防止或减少所述微生物细胞悬液进入所述固相生长培养基的接触表面和表面之间。
173.根据权利要求172所述的装置，其中所述防水特征配置成当所述平面接触表面接触所述固相生长培养基的表面时穿透所述固相生长培养基至小于250微米的深度。
174.根据权利要求172所述的装置，其中所述防水特征配置成当所述平面接触表面接触所述固相生长培养基的表面时穿透所述固相生长培养基至小于100微米的深度。
175.根据权利要求171所述的装置，其中所述固体支持物的至少一部分具有环形形状。
176.根据权利要求170至175中任一项所述的装置，其中所述固体支持物包含比所述平面接触表面更远离所述孔定位的侧向限制部件，所述侧向限制部件被配置为使得当所述平面接触表面与所述固相生长培养基接触时，所述侧向限制部件浸没在所述固相生长培养基内。
177.根据权利要求176所述的装置，其中所述侧向限制部件完全包围所述孔。
178.根据权利要求170至175中任一项所述的装置，其中所述接触表面包含比所述平面接触表面更远离所述孔定位的侧向接触表面，所述侧向接触表面配置成使得当所述平面接触表面与所述固相生长培养基接触时，所述侧向接触表面浸没在所述固相生长培养基内，其中所述侧向接触表面面向所述子区域，使得所述化学试剂从所述平面接触表面和所述侧向接触表面两者扩散到所述子区域中。
179.根据权利要求178所述的装置，其中所述侧向接触表面完全包围所述孔。
180.根据权利要求178所述的装置，其中所述侧向接触表面配置成使得当所述平面接触表面与所述固相生长培养基接触时，所述侧向接触表面插入所述固相生长培养基中的深度超过1mm。
181.根据权利要求178所述的装置，其中所述侧向接触表面配置成使得当所述平面接触表面与所述固相生长培养基接触时，所述侧向接触表面插入所述固相生长培养基中的深度超过2mm。
182.根据权利要求169所述的装置，其中所述固体支持物包含管状部件，并且其中所述管状部件的内表面的至少远侧表面区域用所述化学试剂涂覆和/或浸渍，使得当所述远侧表面区域的至少一部分浸没在所述固相生长培养基内时，所述化学试剂在所述固相生长培养基的位于所述管状部件的管腔内的子区域内向内扩散。
183.根据权利要求182所述的装置，其中将所述管状部件插入所述固相生长培养基中，使得所述管状部件的近侧部分从所述固相生长培养基向外延伸，并且其中将所述一定体积的微生物细胞悬浮液分配到所述管状部件的所述近侧部分中。
184.根据权利要求182所述的装置，其中插入所述管状部件使得所述管状部件的远端接触支撑所述固相生长培养基的支撑表面，从而封闭所述子区域并限制所述管状部件内的所述化学试剂的扩散。
185.根据权利要求182至184中任一项所述的装置，其中所述管状部件是圆柱形部件。
186.根据权利要求182至185中任一项所述的装置，其中所述管状部件的远侧部分的壁厚小于500微米。
187.根据权利要求110至186中任一项所述的装置，其中所述化学试剂均匀分布在所述接触表面上。
188.根据权利要求110至186中任一项所述的装置，其中在所述接触表面上的多个分离区域处提供所述化学试剂。
189.根据权利要求110至186中任一项所述的装置，其中所述化学试剂的局部面积密度和表面下密度中的一个或多个沿着所述接触表面在空间上变化。
190.根据权利要求189所述的装置，其中根据所述局部面积密度和所述表面下密度中的一个或多个的梯度在所述接触表面上提供所述化学试剂。
191.根据权利要求190所述的装置，其中所述面积密度梯度设置成使得所述化学试剂的所述局部面积密度和所述表面下密度中的一个或多个在最接近所述孔的表面区域中最低。
192.根据权利要求110至191中任一项所述的装置，其中所述固体支持物包含疏水性上表面。
193.根据权利要求192所述的装置，其中所述疏水性上表面朝所述孔倾斜以帮助将所述一定体积的微生物细胞悬浮液在所述子区域上的保留。
194.根据权利要求110至193中任一项所述的装置，其中所述孔的最小宽度小于5mm。
195.根据权利要求110至193中任一项所述的装置，其中所述孔的最小宽度小于2mm。
196.根据权利要求110至193中任一项所述的装置，其中所述孔的最小宽度小于1mm。
197.根据权利要求110至196中任一项所述的装置，其中所述化学试剂是抗微生物剂。
198.根据权利要求169至197中任一项所述的装置，进一步包含一个或多个另外的固体支持物，每个另外的固体支持物至少部分地包围相应的另外的孔，每个另外的固体支持物包含相应的另外的接触表面，其中每个另外的接触表面具有提供在其上和/或浸渍在其下方的不同量的所述化学试剂。
199.根据权利要求198所述的装置，其中所述固体支持物和所述另外的固体支持物机械联接并形成固体支持物阵列。
200.一种试剂盒，其包含：
根据权利要求199所述的装置，以及
固相生长培养基支撑结构，所述支撑结构包含多个微孔，每个微孔包含相应体积的所述固相生长培养基，所述固相生长培养基支撑结构配置成与所述固相支持物阵列可接触，所述固相支持物阵列的每个接触表面在不同的相应微孔中与所述固相生长培养基的不同的相应体积接触。
201.根据权利要求200所述的试剂盒，其中所述固体支持物阵列和所述固相生长培养基支持物结构中的一个或多个包含促进所述相应接触表面和所述相应微孔之间的对齐的带键特征。
202.根据权利要求201所述的试剂盒，其中所述带键特征便于每个接触表面的侧向位置和深度中的一个或多个相对于所述相应微孔的对准。
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