JP2022515405A - 微小コロニーの増殖及び微生物細胞の特性決定のためのシステムと方法 - Google Patents

微小コロニーの増殖及び微生物細胞の特性決定のためのシステムと方法 Download PDF

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Abstract

統合流体デバイスは、微生物細胞の分離、原位置微小コロニー増殖、及び任意選択的な同定と抗微生物剤感受性試験を実施するために用いられる。統合流体デバイスが閉じた状態に維持されている間に、微生物細胞の分離が実施されて、固相増殖培地と接触する微生物細胞懸濁液が提供される。懸濁液の液体構成要素が除去され、それによって、インキュベーション、増殖、及び引き続く採取と特性決定のために、増殖培地上に微生物細胞が保持される。いくつかの実施形態では、固体支持体によって少なくとも部分的に囲まれた開口部からアクセス可能な増殖培地の下位領域内に抗微生物剤が拡散するように、抗微生物剤を有する固体支持体に増殖培地を接触させて、抗微生物剤感受性試験が実施される。下位領域の表面上に保持された微生物細胞は、抗微生物剤の存在下における増殖又は阻害について評価されてもよい。【選択図】図２２

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、２０１８年１２月２１日に出願された“ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＰＥＲＦＯＲＭＩＮＧ ＡＮＤ ＭＯＮＩＴＯＲＩＮＧ ＲＡＰＩＤ ＭＩＣＲＯＢＩＡＬ ＣＯＬＯＮＹ ＧＲＯＷＴＨ”と題された米国仮特許出願第６２／７８４，２３４号明細書、及びその内容全体が参照により本明細書に援用される、２０１９年１０月３１日に出願された“ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＭＩＣＲＯＣＯＬＯＮＹ ＧＲＯＷＴＨ ＡＮＤ ＭＩＣＲＯＢＩＡＬ ＣＥＬＬ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＺＡＴＩＯＮ”と題された米国仮特許出願第６２／９２８，９３５号明細書の優先権を主張する。
本開示は、微生物細胞の増殖、検出、及び特性決定に関する。より具体的には、本開示は、微小コロニーの増殖及び特性決定及び抗微生物剤感受性試験に関する。
微生物感染の原因菌を同定し、それらの抗微生物剤感受性プロファイルを判定することは、臨床微生物学研究所における診断工程計画の主な目標である。一般的な方法として、このタスクは現在、抗生物質吸収剤を含有する培養ボトルに患者の血液を採取し、血液中の微生物細胞の増殖を促す環境下でボトルをインキュベートし、グラム染色を実施して、細胞壁の特性と形態の観点から細菌細胞を分類し、寒天プレートなどの固相増殖培地上で細胞を継代培養して純粋な微生物コロニーを得て、微生物細胞を部分的又は完全に同定し、細胞濃度が所望の範囲に収まるようにコロニー内容物を培地に懸濁し、細胞懸濁液のアリコートを適切な培地中で、異なる用量の選択された抗菌剤と接触させてインキュベートし、細胞アリコートの増殖プロファイルから最小阻害濃度（ＭＩＣ）を判定することによって実施されている。この診断工程計画の主な欠点は、結果が出るまでの時間が長いこと（数日間程度）と、多微生物サンプルの場合の優先的増殖の可能性である。
統合流体デバイスは、微生物細胞の分離、原位置微小コロニー増殖、及び任意選択的な同定と抗微生物剤（antimicrobial）感受性試験を実施するために用いられる。統合流体デバイスが閉じた状態に維持されている間に、微生物細胞の分離が実施されて、固相増殖培地と接触する微生物細胞懸濁液が提供される。懸濁液の液体構成要素が除去され、それによって、インキュベーション、増殖、及び引き続く採取と特性決定のために、増殖培地上に微生物細胞が保持される。いくつかの実施形態では、固体支持体によって少なくとも部分的に囲まれた開口部からアクセス可能な増殖培地の下位領域内に抗微生物剤が拡散するように、抗微生物剤を有する固体支持体に増殖培地を接触させて、抗微生物剤感受性試験が実施される。下位領域の表面上に保持された微生物細胞は、抗微生物剤の存在下における増殖又は阻害について評価されてもよい。
したがって、第１の態様では、微生物細胞を含有するサンプルを処理する方法であって、
サンプル処理モジュール及び増殖モジュールを含んでなる統合流体デバイスに、サンプルを導入するステップと；
統合流体デバイスを閉じた状態に維持して、外部微生物細胞の侵入を防ぎながら：
サンプルをサンプル処理モジュール内で処理して、微生物細胞をサンプルから分離し、液体中に懸濁された微生物細胞を含んでなる微生物細胞懸濁液を得るステップと；
微生物細胞懸濁液が、増殖モジュール内に存在する微生物細胞増殖を促進するように構成されている固相増殖培地と接触するように、微生物細胞懸濁液をサンプル処理モジュールから増殖モジュールに輸送するステップと；
少なくとも１つの微生物細胞が固相増殖培地の表面上に保持されるように、液体の少なくとも一部を微生物細胞懸濁液から除去するステップと；
コロニーの増殖を促進するのに適した条件下で、少なくとも増殖モジュールをインキュベートするステップと
を含んでなる、方法が提供される。
方法のいくつかの実装形態では、液体の少なくとも一部が、固相増殖培地による液体の少なくとも一部の吸収によって除去される。
この方法のいくつかの実装形態では、液体は第１の液体であり、固相増殖培地はゲルベースの培地であり、この方法は、微生物細胞懸濁液が部分的に脱水された固相増殖培地と接触したときに、第１の液体の少なくとも一部が、部分的に脱水された固相増殖培地による吸収を介して除去されるように、微生物細胞懸濁液を固相増殖培地と接触させる前に、統合流体デバイスを遠心力に曝して、固相増殖培地から第２の液体を除去し、それによって部分的に脱水された固相増殖培地を得るステップをさらに含んでなる。遠心力は、１，０００ｇ～１０，０００ｇの間の範囲であってもよい。サンプルはサンプル処理モジュール内で処理され、遠心分離ベースの分離法に従ってサンプルから微生物細胞が分離されてもよく、遠心力は、遠心分離ベースの分離法の間に固相増殖培地に印加される。遠心力は、固相増殖培地の表面に関連する表面法線から３０度未満の方向に印加されてもよい。遠心力は、固相増殖培地の表面に垂直な方向に印加されてもよい。
方法のいくつかの実装形態では、微生物細胞懸濁液と接触する表面は第１の表面であり、固相増殖培地は、第１の表面に対向する第２の表面をさらに含んでなり、遠心力は、第２の液体が、第２の表面に近接する領域から除去されるように印加される。
方法のいくつかの実装形態では、微生物細胞懸濁液と接触する表面は第１の表面であり、固相増殖培地は第１の表面に対向する第２の表面をさらに含んでなり、遠心力は、第１の表面に近接する固相増殖培地の第１の領域が、第２の表面に近接する固相増殖培地の第２の領域よりもさらに脱水されるように印加される。
方法のいくつかの実装形態では、第２の液体は、固相増殖培地と流体連通する吸収性材料によって吸収される。
方法のいくつかの実装形態では、多孔質膜が、固相増殖培地と吸収性材料の間に存在する。
方法のいくつかの実装形態では、遠心力は第１の遠心力であり、方法は、部分的に脱水された固相増殖培地を微生物細胞懸濁液と接触させた後に、統合流体デバイスを第２の遠心力に曝して、部分的に脱水された固相増殖培地による微生物細胞懸濁液からの液体の少なくとも一部の吸収、及び表面上の少なくとも１つの微生物細胞の保持を促進するステップをさらに含んでなる。第２の遠心力は、５００ｇ～４０００ｇの範囲であってもよい。
方法のいくつかの実装形態では、固相増殖培地は、液体の少なくとも一部を受動的に吸収するように構成されている。固相増殖培地は、多孔質ネットワークを含んでなってもよく、微生物細胞懸濁液と接触する前に、少なくとも部分的に脱水された状態で存在する。固相増殖培地は、部分的に脱水されたハイドロゲルとして提供されてもよい。
方法のいくつかの実装形態では、液体の少なくとも一部は、ガス透過性膜を通じて蒸発的に除去される。
方法のいくつかの実装形態では、液体の少なくとも一部は、空気の能動的循環を介して蒸発的に除去される。
方法のいくつかの実装形態では、微生物細胞は、濾過、免疫磁気分離、及びマイクロ流体分離からなる群から選択される分離方法を介して分離される。
方法のいくつかの実装形態では、固相増殖培地の表面上に保持される少なくとも１つの微生物細胞は、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）微生物細胞であり、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）微生物細胞に関連するコロニー増殖は、増殖モジュール内で二酸化炭素環境の制御の不在下で達成される。
方法のいくつかの実装形態では、サンプルは全血サンプルであり、微生物細胞は、（ｉ）全血サンプルと、サポニン、ポリアネトールスルホン酸ナトリウム、及びアルカリ性緩衝液を含んでなる血液溶解試薬とを混合し、サポニンの濃度が０．７５～６０ｍｇ／ｍｌの間、ポリアネトールスルホン酸ナトリウムの濃度が０．３５～５０ｍｇ／ｍｌの間、ｐＨが７．８～１０の間の混合物を得るステップと、（ｉｉ）微生物細胞を混合物から分離するステップとによってサンプル処理モジュール内のサンプルから分離される。
いくつかの実装形態では、方法は、（ｉ）固相増殖培地上の１００ミクロン未満の直径を有するコロニーの存在を検出するステップと；（ｉｉ）微生物細胞をコロニーから採取するステップとをさらに含んでなる。
方法のいくつかの実装形態では、固相増殖培地上のコロニーの存在を検出するステップは、（ｉ）固相増殖培地の第１の画像を取得するステップと；（ｉｉ）増殖モジュールのインキュベーション中の時間遅延後に、固相増殖培地の第２の画像を取得するステップと；（ｉｉｉ）画像に存在する表面アーチファクトを使用して、第１の画像を第２の画像にレジストレーションするステップと；（ｉｖ）レジストレーションした第１及び第２の画像に対して画像減算を実施して、第２の画像から表面アーチファクトを除去し、それによって減算された画像を取得するステップと；（ｖ）減算された画像を処理して、コロニーの位置を特定するステップとを含んでなる。表面アーチファクトの少なくともサブセットは、固相増殖培地の表面上の不均一性であってもよく、及び／又は表面アーチファクトの少なくともサブセットは、固相増殖培地の表面上に存在する、サンプル処理モジュールによるサンプルの溶解によって生成された溶解残骸粒子であってもよく、溶解残骸粒子は血液溶解残骸粒子であってもよく、血液溶解残骸粒子の平均粒径は１０ミクロン未満であってもよい。サンプル処理モジュールは、溶解残骸粒子による固相増殖培地の被覆の面分率が２０％、５０％、又は９０％未満になるように構成されてもよい。
いくつかの実装形態では、方法は、採取された微生物細胞を使用して、抗微生物剤感受性試験を実施するステップをさらに含んでなる。コロニーから微生物細胞を採取する前に、方法は、コロニーの生存能力を損なうことなくコロニーを照会し（interrogate）、微生物クラスのセットから選択された微生物細胞クラスに属するものとして微生物細胞を分類するステップを含んでもよい。選択された微生物細胞クラスは、コロニーの測定された増殖速度に少なくとも部分的に基づいて判定されてもよい。微生物細胞の選択された微生物細胞クラスは、細菌細胞及び真菌細胞を含んでなる微生物細胞クラスのセットから選択されてもよい。微生物細胞の選択された微生物細胞クラスは、細菌細胞及び真菌細胞からなる微生物細胞クラスのセットから選択されてもよい。微生物細胞の選択された微生物細胞クラスは、グラム陽性細菌細胞、グラム陰性細菌細胞、及び真菌細胞を含んでなる微生物細胞クラスのセットから選択されてもよい。微生物細胞の選択された微生物細胞クラスは、グラム陽性細菌細胞、グラム陰性細菌細胞、及び真菌細胞からなる微生物細胞クラスのセットから選択されてもよい。
抗微生物剤感受性試験は、１つ又は複数の抗生物質を使用して実施されてもよく、１つ又は複数の抗生物質は、選択された微生物細胞クラスに従って選択される。いくつかの実装形態では、方法は、選択された微生物細胞クラスを用いて、コロニーが、抗微生物剤感受性試験を実施するのに十分な量の微生物細胞を含有すると予想される時期を判定するステップをさらに含んでなり、採取された微生物細胞は、コロニーが十分な量の微生物細胞を含有すると判定された後に採取される。コロニーが十分な量の微生物細胞を含有するという判定は、選択された微生物細胞クラス及びコロニーサイズに関連する光学的に検出されたコロニーサイズ測定に基づいて行われてもよい。コロニーが十分な量の微生物細胞を含有する時点の判定は、選択された微生物細胞クラスとコロニーサイズ測定値との間の所定の関係に基づいてもよい。コロニーが十分な量の微生物細胞を含有する時点の判定は、選択された微生物細胞クラスと増殖持続時間との間の所定の関係に基づいてもよい。コロニーが十分な量の微生物細胞を含有する時点の判定は、コロニーの測定された増殖速度に少なくとも部分的に基づいてもよい。コロニーが十分な量の微生物細胞を含有するという判定は、コロニーサイズに関連する光学的に検出されたコロニーサイズ測定値に基づいてさらに行われてもよい。
固相増殖培地は、発色性増殖培地であってもよく、選択された微生物細胞クラスは、コロニーの検出されたスペクトル特徴に基づいて判定され、スペクトル特徴は、ラマン顕微鏡法、フーリエ変換赤外分光顕微鏡法、又は蛍光顕微鏡法を介して検出されてもよい。
方法のいくつかの実装形態では、コロニーを照会し選択された微生物細胞クラスを判定するステップは、（ｉ）光ビームをコロニーに向けるステップと；（ｉｉ）コロニーから散乱光の画像を取得するステップと；（ｉｉｉ）画像を処理して、選択された微生物細胞クラスを判定するステップとを含んでなる。
方法のいくつかの実装形態では、コロニーが肉眼で検出可能になる前に、微生物細胞がコロニーから採取される。方法のいくつかの実装形態では、微生物細胞は、コロニーが７０ミクロン～１００ミクロンの直径を有した時点でコロニーから採取される。方法のいくつかの実装形態では、微生物細胞は、コロニーが１００ミクロンの直径に達する前にコロニーから採取される。方法のいくつかの実装形態では、微生物細胞は、コロニーが５０ミクロンの直径に達する前にコロニーから採取される。方法のいくつかの実装形態では、微生物細胞は、コロニーが７０ミクロンの直径に達する前にコロニーから採取される。
方法のいくつかの実装形態では、コロニーは第１のコロニーであり、第１のコロニーから採取された微生物細胞は第１の微生物細胞であり、方法は、（ｉ）固相増殖培地上の第２のコロニーの存在を検出するステップと；（ｉｉ）第２の微生物細胞を第２のコロニーから採取するステップとをさらに含んでなる。方法のいくつかの実装形態では、抗微生物剤感受性試験は、第１のコロニー及び第２のコロニーの双方から採取された微生物細胞を使用して実施される。
いくつかの実装形態では、方法は、抗微生物剤感受性試験を実施する前に、第１のコロニー及び第２のコロニーを照会して、第１のコロニーと第２のコロニーとの間の表現型対応の有無を判定するステップをさらに含んでなる。第１のコロニーと第２のコロニーとの間の表現型対応の有無は、第１のコロニーから検出された第１の光信号を第２のコロニーから検出された第２の光信号と比較することによって判定されてもよい。第１のコロニーと第２のコロニーとの間の表現型対応の有無は、第１のコロニーの第１の光学画像を第２のコロニーの第２の光学画像と比較することによって判定されてもよい。
方法のいくつかの実装形態では、選択された微生物細胞クラスは、第１のコロニー内の第１の微生物細胞の第１のタイプに関連する第１の選択された微生物細胞クラスであり、第１のコロニーと第２のコロニーとの間の表現型対応の有無は、（ｉ）第２のコロニーの生存能力を損なうことなく、第２のコロニーを照会して、第２のコロニー内の第２のタイプの第２の微生物細胞に関連する第２の選択された微生物細胞クラスを判定し、第２の選択された微生物細胞クラスは微生物細胞クラスのセットから選択されるステップと；（ｉｉ）第１の微生物細胞クラスが第２の微生物細胞クラスと同じであるかどうかを判定するステップとによって判定されてもよい。
方法のいくつかの実装形態では、第１の微生物細胞クラスは、第１のコロニーの第１の微生物細胞の第１の種に関連し、第２の微生物細胞クラスは、第２のコロニーの第２の微生物細胞の第２の種に関連し、表現型対応の存在は、第１の種が第２の種と同じであると判定されたときに確立されてもよい。
抗微生物剤感受性試験は、第１のコロニーと第２のコロニーとの間の表現型対応の存在を判定した後、第１の微生物細胞及び第２の微生物細胞の双方からの微生物細胞を使用して実施されてもよい。
表現型対応は、第１の微生物細胞と第２の微生物細胞との間に不在であると判定されてもよく、抗微生物剤感受性試験は、第１の微生物細胞と第２の微生物細胞を使用して別々に実施され、第１の微生物細胞と第２の微生物細胞の別々の抗微生物剤感受性測定値が判定されてもよい。
方法のいくつかの実装形態では、選択された微生物細胞クラスは、予備的に選択された微生物細胞クラスであり、予備的に選択された微生物細胞クラスは、第１の分類方法に従って判定され、微生物細胞クラスのセットは、微生物細胞クラスの第１のセットであり、第１のコロニーと第２のコロニーとの間の表現型対応を判定した後、第２のコロニーから採取された第２の微生物細胞を照会して、第２の微生物細胞のタイプに関連する補足的微生物細胞クラスを判定するステップをさらに含んでなってもよく、補足的微生物細胞クラスは、微生物細胞クラスの第２のセットから選択され、補足的微生物細胞クラスは、第２の分類方法に従って判定される。微生物細胞クラスの第２のセットは、微生物細胞クラスの第１のセットよりも多数の微生物細胞クラスを含んでもよい。補足的微生物細胞クラスは、微生物細胞クラスの第１のセットには不在であってもよい。補足的微生物細胞クラスは、種レベルの微生物細胞クラスであってもよい。微生物細胞クラスの第１のセットは、種レベルの微生物細胞クラスが不在であってもよく、微生物細胞クラスの第２のセットは、複数の種レベルの微生物細胞クラスを含んでなってもよい。第２の分類方法は、第１の分類方法よりも高い信頼性で所与の微生物細胞クラスを判定できてもよい。補足的微生物細胞クラスは、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析、ラマン検出、及び／又はフーリエ変換赤外分光法を用いて判定されてもよい。
方法のいくつかの実装形態では、第２のコロニーからの第２の微生物細胞は、第１のコロニーから第１の微生物細胞を採取した後に採取され、採取時に、採取時に採取時の第２のコロニーが第１のコロニーよりも大きくなるように、第２のコロニーが、第１のコロニーよりも長い持続時間でインキュベートされてもよい。
いくつかの実装形態では、方法は、第２の分類方法による補足的微生物細胞クラスの判定を容易にするのに十分な量の微生物細胞を第２のコロニーが含有すると予想される時点を判定するステップをさらに含んでなり、第２のコロニーが十分な量の微生物細胞を含有すると判定された後に、第２の微生物細胞が第２のコロニーから採取される。第２のコロニーが十分な数の微生物細胞を含有するという判定は、第１のコロニーからの第１の微生物細胞に対する抗微生物剤感受性試験を開始した後に行われてもよく、第２の微生物細胞に関連する補足的微生物細胞クラスの判定が、抗微生物剤感受性試験の完了前に行われる。第２のコロニーは、第１の微生物細胞が採取された後、第２の微生物細胞が採取される前にインキュベートされて、さらなるコロニーの増殖が促進されてもよい。
いくつかの実装形態では、方法は、第２の微生物細胞に関連する補足的微生物細胞クラスと第１の微生物細胞に関連する最小阻害濃度とを報告するステップをさらに含んでなる。
方法のいくつかの実装形態では、固相増殖培地は第１の固相増殖培地であり、微生物細胞懸濁液は第１の微生物懸濁液であり、抗微生物剤感受性試験は、（ｉ）採取した微生物細胞を再懸濁し、それによって第２の微生物細胞懸濁液を得るステップと；（ｉｉ）各位置が異なる局所抗生物質濃度を有する複数の位置で、追加的な固相増殖培地上に第２の微生物細胞懸濁液を分注するステップと；（ｉｉｉ）複数の位置をモニターして、微生物細胞の抗微生物剤感受性を推測するステップとによって実施される。追加的な固相増殖培地は、その上に提供される疎水性層を有し、疎水性層中に形成された複数の開口部を有してもよく、各開口部はそれぞれの位置に形成され、液体はそれぞれの開口部を通じて各位置に分注される。
方法のいくつかの実装形態では、固相増殖培地は第１の固相増殖培地であり、微生物細胞懸濁液は第１の微生物懸濁液であり、抗微生物剤感受性試験は、（ｉ）採取した微生物細胞を再懸濁し、それによって第２の微生物細胞懸濁液を得るステップと；（ｉｉ）開口部を少なくとも部分的に取り囲む、接触面を含んでなる固体支持体を提供し、化学薬品を接触面上に提供し、及び／又は接触面の下に含浸させるステップと；（ｉｉｉ）第２の固相増殖培地の下位領域が開口部を通じてアクセス可能であり、化学薬品の少なくとも一部が下位領域内に内向きに拡散するように、第２の固相増殖培地を固体支持体の接触面と接触させるステップと；（ｉｖ）第２の微生物細胞懸濁液内の微生物細胞が下位領域の表面上に保持されるように、第２の微生物細胞懸濁液の体積を下位領域の表面に沈着させるステップと；（ｖ）保持された微生物細胞を化学薬品に曝露させるのに十分に長い時間にわたり、第２の固相増殖培地をインキュベートするステップと；（ｖｉ）下位領域内の微生物細胞増殖の有無を検出するステップとによって実施されてもよい。
別の態様では、
生存能力がある微生物細胞の増殖を促進するのに適した条件下で、生存能力がある微生物細胞の懸濁液を固相増殖培地と接触させるステップと；
固相増殖培地上の１００ミクロン未満の直径を有するコロニーの存在を検出するステップと；
コロニーを光学的に照会し、コロニーに関連する微生物細胞クラスを同定するステップと；
微生物細胞クラスを用いて、コロニーが、抗微生物剤感受性試験を実施するのに十分な量の微生物細胞を含有すると予想される時点を判定するステップと；
コロニーが抗微生物剤感受性試験に十分な量の微生物細胞を含有するように増殖した後、コロニーから微生物細胞を採取するステップと；
採取した微生物細胞を用いて、抗微生物剤感受性試験を実施するステップと
を含んでなる、微生物細胞を含有することが疑われるサンプルを処理する方法が提供される。
方法のいくつかの実装形態では、コロニーは第１のコロニーであり、第１のコロニーから採取された微生物細胞は第１の微生物細胞であり、方法は、（ｉ）固相増殖培地上の第２のコロニーの存在を検出するステップと；（ｉｉ）第２の微生物細胞を第２のコロニーから採取するステップとをさらに含んでなる。抗微生物剤感受性試験は、第１のコロニー及び第２コロニーの双方から採取された微生物細胞を使用して実施されてもよい。
いくつかの実装形態では、方法は、抗微生物剤感受性試験を実施する前に、第１のコロニー及び第２のコロニーを照会して、第１のコロニーと第２のコロニーとの間の表現型対応の有無を判定するステップをさらに含んでなる。第１のコロニーと第２のコロニーとの間の表現型対応の有無は、第１のコロニーから検出された第１の光信号を第２のコロニーから検出された第２の光信号と比較することによって判定されてもよい。第１のコロニーと第２のコロニーとの間の表現型対応の有無は、第１のコロニーの第１の光学画像を第２のコロニーの第２の光学画像と比較することによって判定されてもよい。
方法のいくつかの実装形態では、選択された微生物細胞クラスは、第１のコロニー内の第１の微生物細胞の第１のタイプに関連する、第１の選択された微生物細胞クラスであり、第１のコロニーと第２のコロニーとの間の表現型対応の有無は、（ｉ）第２のコロニーの生存能力を損なうことなく、第２のコロニーを照会して、第２のコロニー内の第２のタイプの第２の微生物細胞に関連する第２の選択された微生物細胞クラスを判定し、第２の選択された微生物細胞クラスを微生物細胞クラスのセットから選択するステップと；（ｉｉ）第１の微生物細胞クラスが第２の微生物細胞クラスと同じであるかどうかを判定するステップとによって判定されてもよい。第１の微生物細胞クラスは、第１のコロニーの第１の微生物細胞の第１の種に関連してもよく、第２の微生物細胞クラスは、第２のコロニーの第２の微生物細胞の第２の種に関連し、表現型対応の存在は、第１の種が第２の種と同じであると判定されたときに確立されてもよい。
方法のいくつかの実装形態では、抗微生物剤感受性試験は、第１のコロニーと第２のコロニーとの間の表現型対応を判定した後、第１の微生物細胞及び第２の微生物細胞の双方からの微生物細胞を使用して実施される。
方法のいくつかの実装形態では、表現型対応は、第１の微生物細胞と第２の微生物細胞との間に不在であると判定され、抗微生物剤感受性試験は、第１の微生物細胞と第２の微生物細胞を使用して別々に実施され、第１の微生物細胞と第２の微生物細胞の別々の抗微生物剤感受性測定値が判定される。
方法のいくつかの実装形態では、選択された微生物細胞クラスは予備的に選択された微生物細胞クラスであり、予備的に選択された微生物細胞クラスは第１の分類方法に従って判定され、微生物細胞クラスのセットは微生物細胞クラスの第１のセットであり、方法は、第１のコロニーと第２のコロニーとの間の対応を判定した後、第２のコロニーから採取された第２の微生物細胞を照会して、第２の微生物細胞のタイプに関連する補足的微生物細胞クラスを判定するステップをさらに含んでなり、補足的微生物細胞クラスは、微生物細胞クラスの第２のセットから選択され、補足的微生物細胞クラスは、第２の分類方法に従って判定される。微生物細胞クラスの第２のセットは、微生物細胞クラスの第１のセットよりも多数の微生物細胞クラスを含んでもよい。補足的微生物細胞クラスは、微生物細胞クラスの第１のセットには不在であってもよい。補足的微生物細胞クラスは、種レベルの微生物細胞クラスであってもよい。第１の微生物細胞クラスのセットは、種レベルの微生物細胞クラスが不在であってもよく、第２の微生物細胞クラスのセットは、複数の種レベルの微生物細胞クラスを含んでなる。第２の分類方法は、第１の分類方法よりも高い信頼性で所与の微生物細胞クラスを判定できてもよい。補足的微生物細胞クラスは、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析法を用いて判定されてもよい。補足的微生物細胞クラスは、ラマン検出及び／又はフーリエ変換赤外分光法を用いて判定されてもよい。
方法のいくつかの実装形態では、第２のコロニーからの第２の微生物細胞は、第１のコロニーから第１の微生物細胞を採取した後に採取され、採取時に、採取時に第２のコロニーが第１のコロニーよりも大きくなるように、第２のコロニーは、第１のコロニーよりも長い時間インキュベートされる。
いくつかの実装形態では、方法は、第２のコロニーが、第２の分類方法による補足的微生物細胞クラスの判定を容易にするのに十分な量の微生物細胞を含有すると予想される時点を判定するステップをさらに含んでなり、第２のコロニーが十分な量の微生物細胞を含有すると判定された後に、第２の微生物細胞が第２のコロニーから採取される。第２のコロニーが十分な数の微生物細胞を含有するという判定は、第１のコロニーからの第１の微生物細胞に対する抗微生物剤感受性試験を開始した後に行われてもよく、第２の微生物細胞に関連する補足的微生物細胞クラスの判定は、抗微生物剤感受性試験の完了前に行われる。第２のコロニーは、第１の微生物細胞が採取された後、第２の微生物細胞が採取される前にインキュベートされて、さらなるコロニーの増殖が促進されてもよい。
いくつかの実装形態では、方法は、第２の微生物細胞に関連する補足的微生物細胞クラス及び第１の微生物細胞に関連する最小阻害濃度を報告するステップをさらに含んでなる。
方法のいくつかの実装形態では、生存能力がある微生物細胞の懸濁液は、全血サンプルから得られる。
別の態様では、
統合流体デバイスの内部流路を閉じた状態に維持し、それによって外部微生物細胞の侵入を防ぎながら、分離された微生物細胞が固相増殖培地と接触するように、
統合流体デバイスの適切な作動下でサンプルからの微生物細胞の分離を容易にするように構成されている分離領域；及び
統合流体デバイスの適切な作動下で、分離領域の出力から分離された微生物細胞を受け取るように構成されている、固相増殖培地を含んでなるコロニー増殖領域
を含んでなる、生存能力がある微生物細胞を分離及び増殖させるための統合流体デバイスが提供される。
デバイスのいくつかの実装形態では、コロニー増殖領域は、分離された微生物細胞の増殖を促進するのに適した条件下でのインキュベーション中に、固相増殖培地上に存在する分離された微生物細胞の増殖のモニタリングを容易にするように構成されてもよい。固相増殖培地は、その中で分離された微生物細胞が分離領域から送達される液体を、受動的に吸収するように構成されてもよい。
固相増殖培地は、多孔質ネットワークを含んでなってもよく、部分的に水和された状態で提供される。固相増殖培地は、部分的に水和されたハイドロゲルとして提供されてもよい。
デバイスのいくつかの実装形態では、コロニー増殖領域は、統合流体デバイスの残りの部分から取り外し可能である。
別の態様では、
微生物細胞を含有する微生物細胞懸濁液を提供するステップと；
開口部を少なくとも部分的に取り囲む、接触面を含んでなる固体支持体を提供し、化学薬品を接触面上に提供し、及び／又は接触面の下に含浸させるステップと；
固相増殖培地の下位領域が開口部を通じてアクセス可能であり、化学薬品の少なくとも一部が下位領域内に内向きに拡散するように、相増殖培地を固体支持体の接触面と接触させるステップと；
微生物細胞懸濁液内の微生物細胞が下位領域の表面上に保持されるように、微生物細胞懸濁液の体積を下位領域の表面上に沈着させるステップと；
保持された微生物細胞を化学薬品に曝露させるのに十分に長い時間にわたり、固相増殖培地をインキュベートするステップと；
下位領域内の微生物細胞増殖の有無を検出するステップと
を含んでなる、微生物細胞の増殖に対する化学薬品の効果を判定する方法が提供される。
この方法のいくつかの実装形態では、接触面は平面接触面を含んでなってもよく、平面接触面が固相増殖培地の表面と接触して少なくとも部分的に下位領域を取り囲むように、及び化学薬品の一部が平面接触面から下位領域内に拡散するように、固体支持体が固相増殖培地と接触される。固体支持体は、開口部を完全に取り囲んでもよい。固体支持体は、開口部に隣接して存在するフラッシング特徴部をさらに含んでなってもよく、フラッシング特徴部は、平面接触面が固相増殖培地と接触したときに、フラッシング特徴部が固相増殖培地の表面の下に浸漬されるように構成されており、それによって接触面と固相増殖培地の表面との間の微生物細胞懸濁液の侵入を防止又は低減する。フラッシング特徴部は、固相増殖培地に２５０ミクロン未満の深さまで挿入されるように構成されていてもよい。フラッシング特徴部は、固相増殖培地に１００ミクロン未満の深さまで挿入されるように構成されていてもよい。
方法のいくつかの実装形態では、固体支持体の少なくとも一部は環状形状を有してもよい。
方法のいくつかの実装形態では、固体支持体は、平面接触面よりも開口部から離れて位置する側方拘束構成要素を含んでなってもよく、側方拘束構成要素は、平面接触面が固相増殖培地と接触したときに、側方拘束構成要素が固相増殖培地内に浸漬されるように構成されている。側方拘束構成要素は、開口部を完全に取り囲んでもよい。
方法のいくつかの実装形態では、接触面は、平面接触面よりも開口部から離れて位置する側方接触面を含んでなってもよく、側方接触面は、平面接触面が固相増殖培地と接触したときに、化学薬品が平面接触面と側方接触面の双方から下位領域内に拡散するように、側方接触面面が下位領域方向を向いて固相増殖培地に浸漬されるように構成されている。側方接触面は、開口部を完全に取り囲んでもよい。側方接触面は、平面接触面が固相増殖培地と接触したときに、側方接触面が１ｍｍを超える深さまで固相増殖培地中に挿入されるように構成されてもよい。側方接触面は、平面接触面が固相増殖培地と接触したときに、側方接触面が２ｍｍを超える深さまで固相増殖培地中に挿入されるように構成されてもよい。
方法のいくつかの実装形態では、固体支持体は、管状構成要素を含んでなってもよく、管状構成要素の内表面の少なくとも遠位表面領域は、化学薬品で被覆及び／又は含浸され、管状構成要素は、遠位表面領域の少なくとも一部が固相増殖培地内に浸漬されるように、及び化学薬品が管状構成要素の管腔内に存在する固相増殖培地の下位領域内に内向きに拡散するように、固相増殖培地と接触される。管状構成要素は、管状構成要素の近位部分が固相増殖培地から外向きに延長し、微生物細胞懸濁液の体積が管状構成要素の近位部分内に分注されるように、固相増殖培地中に挿入されてもよい。管状構成要素は、管状構成要素の遠位端が固相増殖培地を支持する支持面と接触するように挿入されてもよく、それによって下位領域を囲み、管状構成要素内の化学薬品の拡散を拘束する。支持面は、その中又はその上に提供される１つ又は複数の嵌合特徴部を含んでなってもよく、１つ又は複数の嵌合特徴部は、管状構成要素の遠位端と接触するように構成されている。１つ又は複数の嵌合特徴部は、突起及び凹部の片方又は双方を含んでなってもよい。１つ又は複数の嵌合特徴部は、管状構成要素の遠位端を完全に取り囲んでもよい。管状構成要素は、円筒形構成要素であってもよい。管状構成要素の遠位部分の壁厚は、５００ミクロン未満であってもよい。
方法のいくつかの実装形態では、化学薬品は接触面上に一様に分布する。
方法のいくつかの実装形態では、化学薬品は、接触面上の複数の分割された領域に提供される。
方法のいくつかの実装形態では、化学薬品の面密度及び表面下密度の１つ又は複数は、接触面に沿って空間的に変動する。化学薬品は、局所面密度及び表面下密度の１つ又は複数における勾配に従って接触面上に提供されてもよい。勾配は、化学薬品の局所面密度及び表面下密度のうちの１つ又は複数が、開口部に最も近い表面領域内で最も低くなるように提供されてもよい。
方法のいくつかの実装形態では、化学薬品は、下位領域の表面の中央部分のすぐ下の化学薬品の濃度が、接触表面を固相増殖培地と接触させた後、１時間～３時間の間に１０％未満変動するように、適切な量及び適切な空間分布で接触面に提供されてもよい。
方法のいくつかの実装形態では、化学薬品は、下位領域の表面の中央部分のすぐ下の化学薬品の濃度が、接触表面を固相増殖培地と接触させた後、１時間～３時間の間に５％未満変動するように、適切な量及び適切な空間分布で接触面に提供されてもよい。
方法のいくつかの実装形態では、化学薬品は、下位領域の表面の中央部分のすぐ下の化学薬品の濃度が、接触表面を固相増殖培地と接触させた後、２時間～４時間の間に１０％未満変動するように、適切な量及び適切な空間分布で接触面に提供されてもよい。
方法のいくつかの実装形態では、化学薬品は、下位領域の表面の中央部分のすぐ下の化学薬品の濃度が、接触表面を固相増殖培地と接触させた後、２時間～４時間の間に５％未満変動してもよいように、適切な量及び適切な空間分布で接触面に提供されてもよい。
方法のいくつかの実装形態では、固相増殖培地は、下位領域の表面の中央部分のすぐ下の化学薬品の濃度が、固相増殖培地と接触表面との間の接触の３０分間以内に最大濃度に達するように、接触面と接触されてもよい。
方法のいくつかの実装形態では、固体支持体は、下位領域にわたる微生物細胞懸濁液の体積の保持を容易にするように構成されている疎水性上面を含んでなってもよい。疎水性上面は、開口部に向けて斜角であり、下位領域にわたる微生物細胞懸濁液の体積の保持を助けてもよい。
方法のいくつかの実装形態では、開口部の最小幅は、５ｍｍ未満、２ｍｍ未満、又は１ｍｍ未満であってもよい。
方法のいくつかの実装形態では、下位領域の表面に沈着した微生物細胞懸濁液の体積内の微生物細胞の数は、５０未満、２０未満、又は１０未満であってもよい。
方法のいくつかの実装形態では、下位領域の表面に沈着した微生物細胞懸濁液の体積は、５マイクロリットル未満又は２マイクロリットル未満であってもよい。
方法のいくつかの実装形態では、固相増殖培地はマイクロウェル内に保持され、固相増殖培地の体積は、１００マイクロリットル未満又は５０マイクロリットル未満であってもよい。
方法のいくつかの実装形態では、固相増殖培地の厚さは、２ｍｍ未満又は１ｍｍ未満であってもよい。
方法のいくつかの実装形態では、化学薬品は抗微生物剤であってもよい。
方法のいくつかの実装形態では、微生物細胞懸濁液は、血液培養の不在下で全血サンプルを処理することによって得られてもよい。
方法のいくつかの実装形態では、微生物細胞懸濁液は、継代培養を実施することなく血液培養ボトルから得られてもよい。微生物細胞懸濁液は、血液培養サンプルを希釈することによって得られてもよい。
方法のいくつかの実装形態では、下位領域内の微生物細胞増殖の有無の検出は、下位領域の表面の１つ又は複数の画像を取得し、１つ又は複数の画像を処理することによって実施されてもよい。
いくつかの実装形態では、方法は、（ｉ）各追加的な固体支持体が、それぞれの追加的な開口部を少なくとも部分的に取り囲み、各追加的な固体支持体が、それぞれの追加的な接触面を含んでなり、それぞれの追加的な接触面が、その上に提供され及び／又はその下に含浸される異なる量の化学薬品を有する、１つ又は複数の追加的な固体支持体を提供するステップと；（ｉｉ）固相増殖培地の追加的な下位領域が、それぞれの追加的な開口部を通じてアクセス可能であるように、及び化学薬品の少なくとも一部が、それぞれの追加的な接触面からそれぞれの追加的な下位領域に内向きに拡散するように、固相増殖培地を各追加的な接触面と接触させるステップと；（ｉｉｉ）微生物細胞懸濁液内の微生物細胞が追加的な下位領域のそれぞれの表面上に保持されるように、追加的な体積の微生物細胞懸濁液を各追加的な下位領域のそれぞれの表面上に沈着させるステップと；（ｉｖ）固相増殖培地をインキュベートした後、各下位領域内の微生物細胞増殖の有無を検出するステップとをさらに含んでなる。
方法のいくつかの実装形態では、下位領域内の微生物細胞増殖の有無の評価に基づいて、化学薬品の最小阻害濃度を判定するステップをさらに含んでなってもよい。最小阻害濃度は、固相増殖培地のインキュベーション中の各下位領域の表面下の化学薬品の推定濃度又は濃度範囲に従って判定されてもよい。固体支持体と追加的な固体支持体は機械的に結合され固体支持体のアレイが形成されてもよい。固相増殖培地は、固相増殖培地支持構造によって支持されてもよく、支持構造は複数のマイクロウェルを含んでなり、各マイクロウェルは、それぞれの体積の固相増殖培地を含んでなり、固体支持体のアレイは、固体支持体のアレイの各接触面が、異なるそれぞれのマイクロウェル内の異なるそれぞれの体積の固相増殖培地と接触するように、固相増殖培地と接触する。固体支持体のアレイ及び固相増殖培地支持構造は、それぞれの接触面とそれぞれのマイクロウェルとの間の位置合わせを容易にする、キー付き特徴部を含んでなってもよい。キー付き特徴部は、それぞれのマイクロウェルに対する各接触面の側方位置及び深さの１つ又は複数の位置合わせを容易にしてもよい。
別の態様では、
微生物細胞を含有する微生物細胞懸濁液を提供するステップと；
固相増殖培地の下位領域を少なくとも部分的に取り囲み、隣接して存在する１つ又は複数の接触領域で、化学薬品の少なくとも一部が１つ又は複数の接触領域から下位領域内に拡散するように、固相増殖培地を化学薬品と接触させ、１つ又は複数の接触領域が、固相増殖培地の表面に平行な少なくとも一方向で測定されたときに、下位領域の空間的広がりが５ｍｍ未満であるように提供されるステップと；
微生物細胞懸濁液内の微生物細胞が下位領域の表面上に保持されるように、微生物細胞懸濁液の体積を下位領域の表面上に沈着させるステップと；
保持された微生物細胞を化学薬品に曝露させるのに十分に長い時間にわたり、固相増殖培地をインキュベートするステップと；
下位領域内の微生物細胞増殖の有無を検出するステップと
を含んでなる、微生物細胞の増殖に対する化学薬品の効果を判定する方法が提供される。
別の態様では、
開口部を少なくとも部分的に取り囲む、接触面を含んでなる固体支持体を提供し、化学薬品を接触面上に提供し、及び／又は接触面の下に含浸させるステップと；
固相増殖培地の下位領域が開口部を通じてアクセス可能であり、化学薬品の少なくとも一部が下位領域内に内向きに拡散するように、固相増殖培地を固体支持体の接触面と接触させるステップと
を含んでなる、化学薬品を固相増殖培地に導入する方法が提供される。
別の態様では、微生物細胞に対する化学薬品の効果を評価するためのデバイスであって、固体支持体の接触面が固相増殖培地と接触された後、化学薬品の少なくとも一部が接触面から、開口部を通じてアクセス可能な固相増殖培地の下位領域内に内向きに拡散し、それによって微生物細胞を含有する微生物細胞懸濁液が下位領域上に接種されたときに、微生物細胞の抗微生物剤への曝露を可能にするように、化学薬品がその上に提供され、及び／又はその下に含浸された接触面を含んでなる、開口部を少なくとも部分的に取り囲む固体支持体を含んでなる、デバイスが提供される。
このデバイスのいくつかの実装形態では、接触面は、平面接触面を含んでなってもよい。固体支持体は、開口部を完全に取り囲んでもよい。固体支持体は、開口部に隣接して存在するフラッシング特徴部をさらに含んでなってもよく、フラッシング特徴部は、平面接触面が固相増殖培地と接触したときに、フラッシング特徴部が固相増殖培地の表面の下に浸漬されるように構成されており、それによって接触面と固相増殖培地の表面との間の微生物細胞懸濁液の侵入を防止又は低減する。フラッシング特徴部は、平面接触面が固相増殖培地の表面と接触したとき、２５０ミクロン未満の深さまで固相増殖培地に挿入されるように構成されていてもよい。フラッシング特徴部は、平面接触面が固相増殖培地の表面と接触したとき、１００ミクロン未満の深さまで固相増殖培地に挿入されるように構成されていてもよい。
デバイスのいくつかの実装形態では、固体支持体の少なくとも一部は環状形状を有する。
デバイスのいくつかの実装形態では、固体支持体は、平面接触面よりも開口部から離れて位置する側方拘束構成要素を含んでなってもよく、側方拘束構成要素は、平面接触面が固相増殖培地と接触したときに、側方拘束構成要素が固相増殖培地内に浸漬されるように構成されている。側方拘束構成要素は、開口部を完全に取り囲んでもよい。
デバイスのいくつかの実装形態では、接触面は、平面接触面よりも開口部から離れて位置する側方接触面を含んでなってもよく、側方接触面は、平面接触面が固相増殖培地と接触したときに、化学薬品が平面接触面と側方接触面の双方から下位領域内に拡散するように、側方接触面が下位領域方向を向いて固相増殖培地に浸漬されるように構成されている。側方接触面は、開口部を完全に取り囲んでもよい。側方接触面は、平面接触面が固相増殖培地と接触したときに、側方接触面が１ｍｍを超える深さまで固相増殖培地中に挿入されるように、構成されてもよい。側方接触面は、平面接触面が固相増殖培地と接触したときに、側方接触面が２ｍｍを超える深さまで固相増殖培地中に挿入されるように、構成されてもよい。
デバイスのいくつかの実装形態では、固体支持体は管状構成要素を含んでなり、管状構成要素の内表面の少なくとも遠位表面領域は、遠位表面領域の少なくとも一部が固相増殖培地内に浸漬されたときに、化学薬品が管状構成要素の管腔内に存在する固相増殖培地の下位領域内に内向きに拡散するように、化学薬品で被覆及び／又は含浸される。管状構成要素は、管状構成要素の近位部分が固相増殖培地から外向きに延長し、微生物細胞懸濁液の体積が管状構成要素の近位部分内に分注されるように、固相増殖培地中に挿入されてもよい。管状構成要素は、管状構成要素の遠位端が固相増殖培地を支持する支持面と接触するように挿入されてもよく、それによって下位領域を囲み、管状構成要素内の化学薬品の拡散を拘束する。管状構成要素は、円筒形構成要素であってもよい。管状構成要素の遠位部分の壁厚は、５００ミクロン未満であってもよい。
デバイスのいくつかの実装形態では、化学薬品は接触面上に一様に分布してもよい。
デバイスのいくつかの実装形態では、化学薬品は、接触面上の複数の分割された領域内に提供されてもよい。
デバイスのいくつかの実装形態では、化学薬品の局所面密度及び表面下密度の１つ又は複数は、接触面に沿って空間的に変動する。化学薬品は、１つ又は複数の局所面密度及び表面下密度の勾配に従って接触面上に提供されてもよい。面密度勾配は、化学薬品の局所面密度及び表面下密度のうちの１つ又は複数が開口部に最も近い表面領域内で最も低くなるように、提供されてもよい。
デバイスのいくつかの実装形態では、固体支持体は、疎水性上面を含んでなってもよい。疎水性上面は、開口部に向けて斜角であり、下位領域にわたる微生物細胞懸濁液の体積の保持を助けてもよい。
デバイスのいくつかの実装形態では、開口部の最小幅は、５ｍｍ未満、２ｍｍ未満、又は１ｍｍ未満であってもよい。
デバイスのいくつかの実装形態では、化学薬品は抗微生物剤である。
いくつかの実装形態では、デバイスは、１つ又は複数の追加的な固体支持体をさらに含んでなり、各追加的な固体支持体は、それぞれの追加的な開口部を少なくとも部分的に取り囲み、各追加的な固体支持体は、それぞれの追加的な接触面を含んでなり、それぞれの追加的な接触面は、その上に提供され及び／又はその下に含浸される異なる量の化学薬品を有する。固体支持体と追加的な固体支持体は機械的に結合され、固体支持体のアレイを形成してもよい。
別の態様では、キットが提供され、キットは（ｉ）１つ又は複数の追加的な固体支持体をさらに含んでなる上述のデバイスであって、各追加的な固体支持体が、それぞれの追加的な開口部を少なくとも部分的に取り囲み、各追加的な固体支持体が、それぞれの追加的な接触面を含んでなり、それぞれの追加的な接触面が、その上に提供され及び／又はその下に含浸される異なる量の化学薬品を有する、デバイスと；（ｉｉ）固相増殖培地とを含んでなり、支持構造は複数のマイクロウェルを含んでなり、各マイクロウェルが、それぞれの体積の固相増殖培地支持構造を含んでなり、前記固相増殖培地支持構造は、固体支持体のアレイと接触可能であるように構成されており、固体支持体のアレイの各接触面が、異なるそれぞれのマイクロウェル内の異なるそれぞれの体積の固相増殖培地と接触する。固体支持体のアレイ及び固相増殖培地支持構造の１つ又は複数は、それぞれの接触面とそれぞれのマイクロウェルとの間の位置合わせを容易にするキー付き特徴部を含んでなってもよい。キー付き特徴部は、それぞれのマイクロウェルに対する各接触面の側方位置及び深さの１つ又は複数の位置合わせを容易にしてもよい。
本開示の機能的及び有利な態様のさらなる理解は、以下の詳細な説明及び図面を参照することによって理解され得る。
ここで実施形態を単なる例として、図面を参照して説明する。
サンプルからの微生物細胞の分離、及び引き続く分離した微生物細胞の閉鎖型カートリッジ構成内の固相増殖培地上への播種を意図する、例の統合流体カートリッジの２つの例の機能モジュールを概略的に示す。 それぞれ、引き続く微小コロニーの増殖のために微生物細胞懸濁液を受け取り、播種するための統合されたサンプル処理及び増殖流体カートリッジの例の増殖モジュールの上面図及び側面図を示す。 ５倍の無限計画（ｐｌａｎ）対物レンズを有する直立反射照明（エピ）明視野（ＢＦ）金属顕微鏡によって画像化された血液寒天プレートの断面を図示する。サポニン及びポリアネトールスルホン酸ナトリウム（ＳＰＳ）からなる血液溶解試薬で選択的に溶解処理した後、２回の遠心洗浄を行った全血から得られた微生物細胞懸濁液１μＬをプレート上に分注し、風乾させた後、顕微鏡画像を取得した。サンプルが広げられた領域は、３１２で示される。 ５倍の無限計画（ｐｌａｎ）対物レンズを有する直立反射照明（エピ）明視野（ＢＦ）金属顕微鏡によって画像化された血液寒天プレートの断面を図示する。サポニン、ＳＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、炭酸塩－重炭酸塩緩衝液を含むアルカリ性血液溶解試薬で選択的に溶解処理した後、２回の洗浄サイクルを経た、全血から得られた微生物細胞懸濁液１μＬをプレート上に分注し、風乾させた後、顕微鏡写真を撮影した。 図３Ｂを参照して説明した方法でサンプルを処理する際に用いられた血液溶解試薬を使用して得られた、血液残骸のサイズ分布を図示する。サポニン、ＳＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、炭酸塩－重炭酸塩緩衝液を含むアルカリ性血液溶解試薬で選択的に溶解処理した後、２回又は４回の洗浄サイクルを経た、全血から得られた微生物細胞懸濁液１μＬをプレート上に分注し、風乾させた後、１０倍の無限計画（ｐｌａｎ）対物レンズによって、顕微鏡写真を撮影した。画像の粒度分布を分析し、粒度分布のヒストグラムを２回の洗浄サイクル（左）と４回の洗浄サイクル（右）の双方についてプロットした。 微生物細胞播種後の別個のインキュベーション及びモニタリングのための、統合流体カートリッジから任意選択的に取り外し可能な例の増殖モジュールを概略的に図示する（微生物細胞の微小コロニーの増殖に適した環境条件下）。 増殖モジュールの増殖チャンバー内で、サンプルの微生物懸濁液をゲルベースの固相増殖培地と接触させるための例の遠心分離法を概略的に示す。図５Ａに示すようにゲルが遠心分離され、遠心力に曝されると、その液体（例えば、水）構成要素の一部が（遠心分離軸に対して）外側に押し出され、遠心分離後、図５Ｂに示すようにゲル表面が部分的に脱水される。図５Ｃでは、微生物細胞懸濁液をゲル表面と接触させ、その液体構成要素を脱水されたゲル表面に吸収させ（例えば、任意選択的に重力的に補助し、又はさらに遠心分離を介して）、それによって図５Ｄに示すように、微生物細胞をゲル表面上に保持する。 図５Ｅは、遠心分離後の様々な組成のゲルの部分的な水分損失をプロットする。各ゲルは、孔径０．４５μｍのメンブレン上に置き、３２００ｇで８分間遠心分離された（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｅｄ）。図５Ｆは、遠心分離後の様々な組成のゲルの部分的な水分損失をプロットする。各ゲルは、孔径５ｎｍのメンブレン上に置き、３２００ｇで８分間遠心分離された（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｅｄ）。 図５Ｇは、孔径５ｎｍの膜上で３２００ｇで８分間遠心分離され（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｅｄ）、それに続いて２０分間水に浸漬された、異なる組成のゲルの脱水（水分損失）及び再水和（水分増加）レベルをプロットする。図５Ｈは、様々なゲルの蒸発による部分的な脱水と、それに続く水への浸漬を介した再水和のレベルをプロットする。 図５Ａ及び図５Ｂに示すステップの間に、遠心分離的に滲出した液体を強制メンブレンを通じてゲルから除去するための１つの例の実施形態を概略的に示す。 図５Ａ及び図５Ｂに示すステップの間に、遠心分離的に滲出した液体をチャネルを通じてゲルから除去するための別の例の実施形態を概略的に示す。 図５Ｊに提示された実施形態の実装を試験するための増殖チャンバーを概略的に示す。 ゲルを注いだ後の異なる時点における、図５Ｋの増殖チャンバーの実験的実現の写真を示す。 ３２００ｇで８分間遠心分離した後、４箇所に１００μＬの染料液を分注し、５分間液体を沈降させた後の異なる時点における、図５Ｋの増殖チャンバーの実験的実現の写真を示す。 インキュベーションに続いて、０時間、２時間、３時間、及び４時間の時点で、５倍の無限計画（ｐｌａｎ）対物レンズを有する明視野（ＢＦ）金属顕微鏡によって画像化された、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）を添加した全血サンプルを遠心分離して得られた微生物細胞懸濁液１μＬを分注した後、寒天プレート上に形成されたミニ培養領域（ＭＣＲ）の断面を図示する。矢印は、血液溶解残骸と比較して視覚的に識別できるいくつかのＰＭ微小コロニーを示す。 タイムラプス画像解析を介して、図６のＭＣＲ上の微生物コロニーを血液溶解残骸から区別するための手順の例を図示する。異なる時点（播種後０、２、３、及び４時間）で取得されたイメージングデータは、０時間の画像に対して空間的に位置合わせ（レジストレーション）され、続いて０時間の画像が減算された。０時間の画像内に存在する強度の特徴は背景（血液残骸）として分類され、減算された画像に現れる強度の特徴は前景の微小コロニーとして分類された）。 図８Ａは、スパイクされた全血サンプルからの微生物細胞の遠心分離と、引き続く寒天上への播種の後に回収された、ＰＭ細菌細胞のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数をプロットする（図６の実験で用いられたように、最終的な細胞懸濁液を播種し、３７℃で４時間インキュベートした後の異なる時点における）。図８Ｂは、最終細胞懸濁液を播種し、３７℃で４時間インキュベートした後の異なる時点で、スパイクされた全血サンプルからの微生物細胞の遠心分離と、引き続く寒天上への播種の後に回収された、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の細菌細胞のＣＦＵ数をプロットする。 図８Ｃは、最終細胞懸濁液を播種し、３７℃で４時間インキュベートした後の異なる時点で、スパイクされた全血サンプルからの微生物細胞の遠心分離と、引き続く寒天上への播種の後に回収された、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の細菌細胞のＣＦＵ数をプロットする。図８Ｄは、最終細胞懸濁液を播種し、３７℃で６時間インキュベートした後の異なる時点で、スパイクされた全血サンプルからの微生物細胞の遠心分離と、引き続く寒天上への播種の後に回収された、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の細菌細胞のＣＦＵ数をプロットする。 図９Ａは、スパイクされた血液サンプルからの遠心分離と、引き続く寒天上への播種を介して回収された、グラム陽性細菌の播種されたＡＴＣＣ株の測定された増殖パラメータを提示する表である。血液培養ボトル（液体培養）内における播種された細胞の増殖対参考増殖について、増殖前の遅延時間、増殖速、陽性になるまでの推定時間、微小コロニー内の細胞数が１０４及び１０５ＣＦＵに達するまでの平均所要時間を示す。図９Ｂは、スパイクされた血液サンプルからの遠心分離と、引き続く寒天上への播種を介して回収された、グラム陽性細菌の播種された臨床分離株の測定された増殖パラメータを提示する表である。血液培養ボトル（液体培養）内における播種された細胞の増殖対参考増殖について、増殖前の遅延時間、増殖速、陽性になるまでの推定時間、微小コロニー内の細胞数が１０４及び１０５ＣＦＵに達するまでの平均所要時間を示す。図９Ｃは、スパイクされた血液サンプルからの遠心分離と、引き続く寒天上への播種を介して回収された、グラム陽性細菌の追加的な播種された臨床分離株の測定された増殖パラメータを提示する表である。血液培養ボトル（液体培養）内における播種された細胞の増殖対参考準増殖について、増殖前の遅延時間、増殖速、陽性になるまでの推定時間、微小コロニー内の細胞数が１０４及び１０５ＣＦＵに達するまでの平均所要時間を示す。 図９Ｄは、スパイクされた血液サンプルからの遠心分離と、引き続く寒天上への播種を介して回収された、グラム陰性細菌の播種されたＡＴＣＣ株の測定された増殖パラメータを提示する表である。血液培養ボトル（液体培養）内における播種された細胞の増殖対参考増殖について、増殖前の遅延時間、増殖速、陽性になるまでの推定時間、微小コロニー内の細胞数が１０４及び１０５ＣＦＵに達するまでの平均所要時間を示す。図９Ｅは、スパイクされた血液サンプルからの遠心分離と、引き続く寒天上への播種を介して回収された、グラム陰性細菌の播種された臨床分離株の測定された増殖パラメータを提示する表である。血液培養ボトル（液体培養）内における播種された細胞の増殖対参考増殖について、増殖前の遅延時間、増殖速、陽性になるまでの推定時間、微小コロニー内の細胞数が１０４及び１０５ＣＦＵに達するまでの平均所要時間を示す。図９Ｆは、スパイクされた血液サンプルからの遠心分離と、引き続く寒天上への播種を介して回収された、グラム陰性細菌の追加的な播種された臨床分離株の測定された増殖パラメータを提示する表である。血液培養ボトル（液体培養）内における播種された細胞の増殖対参考増殖について、増殖前の遅延時間、増殖速、陽性になるまでの推定時間、微小コロニー内の細胞数が１０４及び１０５ＣＦＵに達するまでの平均所要時間を示す。 図９Ｇは、スパイクされた血液サンプルからの遠心分離と、引き続く寒天上への播種を介して回収された、真菌細胞の播種されたＡＴＣＣ株の測定された増殖パラメータを提示する表である。血液培養ボトル（液体培養）内における播種された細胞の増殖対参考増殖について、増殖前の遅延時間、増殖速、陽性になるまでの推定時間、微小コロニー内の細胞数が１０４及び１０５ＣＦＵに達するまでの平均所要時間を示す。図９Ｈは、スパイクされた血液サンプルからの遠心分離と、引き続く寒天上への播種を介して回収された、真菌の播種された臨床分離株の測定された増殖パラメータを提示する表である。血液培養ボトル（液体培養）内における播種された細胞の増殖対参考増殖について、増殖前の遅延時間、増殖速、陽性になるまでの推定時間、微小コロニー内の細胞数が１０４及び１０５ＣＦＵに達するまでの平均所要時間を示す。 全血サンプルからの分離と４時間の培養した後における、スパイクされた血液サンプルのカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）細胞（楕円の内部に見える）の陽性度の光学顕微鏡を介した判定を図示する。 微小コロニーに対して迅速抗微生物剤感受性試験（ＡＳＴ）を実施するための例の方法を示す、フローチャートを提供する。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の平均直径対微小コロニー細胞含有量のプロットを図示する。プロットには、例えば、１０３及び１０５細胞含有量レベルでの平均微小コロニー直径の推定を可能にする、べき乗則趨勢線が適合されている。 図１１Ｃは、血流感染症で流行している様々な病原性グラム陽性細菌について、１０３及び１０５の細胞含有量レベルでの平均微小コロニー直径をプロットする。図１１Ｄは、血流感染症で流行している様々な病原性グラム陰性細菌について、１０３及び１０５の細胞含有量レベルでの平均微小コロニー直径を図示する。 統合流体処理カートリッジを使用して、自動遠心分離及び洗浄を実施するためのシステムの概略図である。 微生物細胞の濃縮及び精製された懸濁液を得るための、採取管からのサンプルの直接抽出と、引き続く遠心分離及び洗浄のために構成されている、例の統合流体処理カートリッジを図示する。 微生物細胞の濃縮及び精製された懸濁液を得るための、採取管からのサンプルの直接抽出と、引き続く遠心分離及び洗浄のために構成されている、例の統合流体処理カートリッジを図示する。 微生物細胞の濃縮及び精製された懸濁液を得るための、採取管からのサンプルの直接抽出と、引き続く遠心分離及び洗浄のために構成されている、例の統合流体処理カートリッジを図示する。 自動遠心分離及び洗浄を実施するための例の方法を図解する、フローチャートを提供する。 増殖チャンバーをインキュベートし、生存能力がある微生物微小コロニーの検出のために微生物細胞の増殖をモニターし、微小コロニー細胞を所与の微生物細胞クラスに属するものとして分類するための、例のシステムの概略図を示す。低倍率の対物レンズを用いて観察領域を拡大し、タイムラプスイメージングの時間分解能を向上させ得る。 増殖チャンバーをインキュベートし、生存能力がある微生物微小コロニーの検出のために微生物細胞の増殖をモニターするための別の例のシステムの概略図を示す。 サンプルの播種及び３５℃でのインキュベーションの４時間後（右）及び２０時間後（左）に固相増殖培地上で検出された、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）微小コロニー／コロニーの比較を図示する。右の画像は、図１５Ｂに概略的に提示されたものと同様の自動システムにおいて５倍の明視野対物レンズによって撮影された、４４８個の位置合わせ／レジストレーションされた顕微鏡画像のモザイクステッチングの結果である。左の画像は従来のカメラで撮影された。 タイムラプス画像処理を介して４時間の培養中に検出された、図１５Ｃに示したプレート上で同定された１８個の微小コロニーを図示する。図に見られるように、白丸で示される１８個の微小コロニーのうち１５個は３時間で検出され、１個の微小コロニー（微小コロニー７）は２時間で検出された。 ＣＯ２パックの存在下（左上）及び不在下（右上）でそれぞれ一晩培養されたストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）コロニーの形態を示す。画像は５倍の明視野対物レンズで撮影される。ＣＯ２パックの不在下で４時間のインキュベーション後に形成された、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の典型的な微小コロニーが左下隅に示される。画像は１０倍の明視野対物レンズで撮影されている。右下に提示される微小コロニーの拡大画像は、ＣＯ２パックの存在下で形成された一晩のコロニーにより類似している。 スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）細胞が画線塗抹された、血液寒天ゲルの写真である。オキサシリン１μｇ／ｍＬ、テトラサイクリン３０μｇ／ｍＬ、ノルフロキサシン１０μｇ／ｍＬをそれぞれ含浸させた、市販のペーパーディスク（Ｈａｒｄｙｄｉｓｋ（商標））を固相増殖培地の上に置き、一晩のインキュベーション後に写真が撮影された。測定値ｒ１は、中心からの距離まで微生物のレーンが目に見えて存在しないことを示し、阻害ゾーンを表す。この距離を超えると、距離ｒ２まではまばらなレーンが観察され、それを超えるとレーンが満たされる。 ゲル表面上に置かれた含浸ディスクからの抗微生物剤の拡散を概略的に比較する。従来のディスク拡散ＡＳＴの場合を図１７Ａに、環状ディスク拡散ＡＳＴＡＳＴの実施形態を図１７Ｂに示す。矢印は、ディスク拡散抗微生物剤感受性試験及び環状ディスク拡散抗微生物剤感受性試験にそれぞれ関連する、抗微生物剤の拡散方向を表す。 パラメータｒ１、ｒａｄ、及びｈを示す、環状ディスク拡散デバイス（「ＬＤ－ＡＳＴユニット」）の例を概略的に示す。 側方拡散ＡＳＴを実施するための固体支持構造の例の実施形態を図示する。 側方拡散ＡＳＴを実施するための固体支持構造の例の実施形態を図示する。 側方拡散ＡＳＴを実施するための固体支持構造の例の実施形態を図示する。 側方拡散ＡＳＴを実施するための固体支持構造の例の実施形態を図示する。 厚さ１００μｍの熱可塑性ポリウレタン（ＴＰＵ）シートから切り出されたガイドリングが、ゲル表面上に置かれ、微生物細胞懸濁液が開口部上に分注されたときに、リングの内側の開口部内に微生物細胞を局所的に集中させる能力を示す一連の画像である。 環状ディスク拡散「ＬＤ－ＡＳＴユニット」のアレイへのアセンブリを概略的に表す。異なる濃度レベルで抗微生物剤を含浸させた環状ディスクには、相互作用リングが供給され、ストリップに組み立てられる（図１９Ａ）。相補的なストリップ（図１９Ｂ）は、寒天ゲルを有する密封された微小ウェルのアセンブリを含む。アッセイ中、２つの構成要素が装着され、サンプルのアリコートが相互作用リング内に分注される（図１９Ｃ）。 図１９－１の続きである。 環状拡散ディスク（ディスクは黒の帯で示される）を通過する中心線を横切る、ゲル表面上のシミュレートされた濃度をプロットする。ゲルの厚さをｈ＝４ｍｍとし、その半径をｒ２＝１４ｍｍとする。内側半径ｒ１＝１．５ｍｍ、外側半径ｒａｄ＝３ｍｍの環状円盤の断面を太線で示す。 黒い帯によって示される、環状ディスクを通過する中心線を横切る、ゲルの表面上のシミュレートされた濃度の推移をプロットする。ゲルの厚さをｈ＝２ｍｍとし、その半径をｒ２＝１４ｍｍとする。 黒い帯によって示される、環状ディスクを通過する中心線を横切る、ゲルの表面上のシミュレートされた濃度の推移をプロットする。ゲルの厚さをｈ＝４ｍｍとし、その半径をｒ２＝５ｍｍとする。 黒い帯によって示される、環状ディスクを通過する線を横切る、ゲルの表面上のシミュレートされた濃度の推移をプロットする。ゲルの厚さをｈ＝２ｍｍとし、その直径をｒ２＝５ｍｍとする。 下でｄｕａｌ１と称される、環状ディスク上の含浸濃度プロファイルの例を示す。 図２０Ｅに示された含浸濃度プロファイルに従って、環状ディスクを通過する中心線を横切るゲルの表面上のシミュレートされた濃度の推移をプロットする。ゲルの厚さをｈ＝２ｍｍとし、その半径をｒ２＝５ｍｍとする。 下でｄｕａｌ２と称される、環状ディスク上の含浸濃度プロファイルの例を示す。 図２０Ｇに示された含浸濃度プロファイルに従って、環状ディスクを通過する中心線を横切るゲルの表面上のシミュレートされた濃度の推移をプロットする。ゲルの厚さをｈ＝２ｍｍとし、その半径をｒ２＝５ｍｍとする。 図２０Ａ～図２０ＨのＬＤ－ＡＳＴユニットの関心領域の中心における、薬物濃度のシミュレートされた時間的挙動を表す。プロットは、（ｒ２＝１４ｍｍ、ｈ＝４ｍｍ）、（ｒ２＝１４ｍｍ、ｈ＝２ｍｍ）、（ｒ２＝５ｍｍ、ｈ＝４ｍｍ）、（ｒ２＝５ｍｍ、ｈ＝２ｍｍ）、（ｒ２＝５ｍｍ、ｈ＝２ ｄｕａｌ１）、及び（ｒ２＝５ｍｍ、ｈ＝２ ｄｕａｌ２）で標識され、それぞれ図２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ、２０Ｄ、２０Ｆ、及び２０Ｇに対応する。ｒ－ゲルの水平寸法；ｈ－ゲル厚。 環状ディスクをゲル上に配置してから約０．５時間後と４時間後に最大濃度に達する時間との間の、図２１Ａの曲線の関心領域の中心における濃度の相対的変化をプロットする。プロットは、（ｒ２＝１４ｍｍ、ｈ＝４ｍｍ）、（ｒ２＝１４ｍｍ、ｈ＝２ｍｍ）、（ｒ２＝５ｍｍ、ｈ＝４ｍｍ）、（ｒ２＝５ｍｍ、ｈ＝２ｍｍ）、（ｒ２＝５ｍｍ、ｈ＝２ ｄｕａｌ１）、及び（ｒ２＝５ｍｍ、ｈ＝２ ｄｕａｌ２）で標識され、それぞれ図２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ、２０Ｄ、２０Ｆ、及び２０Ｇに対応する。 実施例９Ｂに従った方法で環状ディスクに沈着させた、染料溶液の定性的及び定量的濃度プロファイルを示す。 環状ディスク拡散ＡＳＴを迅速に実施するためのフローチャートを表す。 図２３Ａは、８つの薬物濃度でＬＤ－ＡＳＴを実行するためのストリップの俯瞰写真である。写真は薄いストリップの場合、すなわち、各マイクロウェルに５０μＬのゲルを入れた場合に相当する。図２３Ｂは、図２３Ａに示されるストリップの側面図を示す写真である。写真は薄いストリップの場合、すなわち、各マイクロウェルに５０μＬのゲルを入れた場合に相当する。 それぞれ３時間、４時間、及び一晩インキュベートした後の図２３Ａ及び２３Ｂに示されるストリップ（約５０ｕＬの低ゲル体積；約１ｍｍのゲル厚）の関心領域（ＲＯＩ）の俯瞰画像を示す。抗生物質はルフロキサシンであり、微生物細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。 それぞれ３時間、４時間、及び一晩インキュベートした後の中厚のストリップ（約１５０μＬのゲル体積；約３ｍｍのゲル厚）のＲＯＩの俯瞰画像である。抗生物質はルフロキサシンであり、微生物細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。 それぞれ３時間、４時間、及び一晩インキュベートした後の厚いストリップ（約３５０μＬのゲル体積；約７ｍｍのゲル厚）のＲＯＩの俯瞰画像である。抗生物質はルフロキサシンであり、微生物細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。 ３時間及び４時間インキュベートした後の「薄いストリップ」タイプＬＤ－ＡＳＴ（図２３Ａ及び２３Ｂに示される）のＲＯＩの俯瞰画像である。抗生物質はバンコマイシンであり、微生物細胞はスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）である。 ３時間及び４時間インキュベートした後の「中厚ストリップ」タイプＬＤ－ＡＳＴのＲＯＩの俯瞰画像を示す。抗生物質はバンコマイシンであり、微生物細胞はスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）である。 接種後４時間インキュベートした後の「中厚ストリップ」タイプＬＤ－ＡＳＴのＲＯＩの俯瞰画像を示す。抗生物質はバンコマイシンであり、微生物細胞はスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）である。 カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）に対するアンフォトリシンＢの感受性を試験しながら、３時間、４時間、及び一晩インキュベートした後の「薄いストリップ」タイプＬＤ－ＡＳＴの関心領域（ＲＯＩ）の俯瞰画像を示す。 清浄な細胞懸濁液（上）と１０００倍に希釈された陽性血液培養液（下）をそれぞれ３時間及び４時間インキュベートした後の「薄いストリップ」タイプＬＤ－ＡＳＴの関心領域（ＲＯＩ）の俯瞰画像を示す。抗生物質はオキサシリンであり、微生物細胞はメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（強い耐性のないＭＲＳＡ１１１）である。 市販のブロス微量希釈ＡＳＴプレートのウェル内のＭＲＳＡ－１１０の増殖パターンを示す。表示濃度はμｇ／ｍＬである。略語は次のとおりである：ＣＨＬ＝クロラムフェニコール、ＤＡＰ＝ダプトマイシン、ＧＥＮ＝ゲンタマイシン、ＬＺＤ＝リネゾリド、ＲＩＦ＝リファンピン、ＳＸＴ＝トリメトプリム／スルファメトキサゾール、ＳＹＮ＝キヌプリスチン／ダルフォプリスチン、ＴＥＴ＝テトラサイクリン、ＥＲＹ＝エリスロマイシン、ＯＸＡ＋＝オキサシリン＋２％ＮａＣｌ、ＡＭＰ＝アンピシリン、ＰＥＮ＝ペニシリン、ＶＡＮ＝バンコマイシン、ＬＥＶＯ＝レボフロキサシン、ＴＧＣ＝チゲサイクリン、ＭＸＦ＝モキシフロキサシン、ＣＬＩ＝クリンダマイシン、ＳＴＲ＝ストレプトマイシン、ＣＩＰ＝シプロフロキサシン、ＮＩＴ＝ニトロフラントイン、ＤＴ１＝Ｄ試験１、ＤＴ２＝Ｄ試験２、ＦＯＸＳ＝セフォキシチンスクリーニング、ＮＥＧ＝陰性対照、及びＰＯＳ＝陽性対照。 ＬＤ－ＡＳＴアッセイが実施される９６ウェルマイクロプレートのウェル内のＭＲＳＡ－１１０の増殖パターンを示す。略語は図３１Ａと同じである。 選択された薬物－微生物の組み合わせについてのＬＤ－ＡＳＴ及び標準ブロス微量希釈ＡＳＴの結果の間の比較を示す。微生物細胞の略語は次のとおりである：スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＳＡ）、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）、アシネトバクター・バウマンニイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）（ＡＢ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＥＣ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）、クレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＫＰ）、カルバペネム耐性腸内細菌科クレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＣＲＥ）。
本開示の様々な実施形態及び態様は、以下に記載される詳細を参照して説明される。以下の説明及び図面は、本開示を例示するものであり、本開示を限定するものとして解釈されるべきではない。本開示の様々な実施形態の完全な理解を提供するために、多数の特定の詳細が説明されている。しかし、特定の事例において、本開示の実施形態の簡潔な考察を提供するために、周知の又は従来の詳細は記載されていない。
本明細書の用法では、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、包括的で制約がなく、排他的ではないものと解釈される。具体的には、本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語、及びその変形は、指定された特徴、ステップ、又は構成要素が含まれることを意味する。これらの用語は、その他の特徴、ステップ、又は構成要素の存在を除外するものと解釈されるべきでない。
本明細書の用法では、「例示的」という用語は、「例、事例、又は例証の役目を果たす」ことを意味し、本明細書で開示されるその他の構成よりも好ましい又は有利であると解釈されるべきではない。
本明細書の用法では、「約」及び「およそ」という用語は、特性、パラメータ、及び寸法の変動など、値の範囲の上限及び下限に存在してもよい変動をカバーすることを意味する。特に明記されない限り、「約」及び「およそ」という用語は、＋／－２５％以下を意味する。
特に明記されない限り、指定された任意の範囲又は群は、範囲又は群のありとあらゆる構成員を個別に言及する省略表現法として、その中に包含されるありとあらゆる可能な下位範囲又は下位群を参照し、その中の任意の下位範囲又は下位群に関しても同様に参照するものと理解されるべきである。特に明記されない限り、本開示は、下位範囲又は下位群のありとあらゆる特定の構成員及び組み合わせに関連し、それらを明示的に組み込んでいる。
本明細書の用法では、量又はパラメータと共に使用される「～と同等の」という用語は、記載された量又はパラメータのおよそ１０分の１から１０倍に及ぶ範囲を意味する。
別段の定義がない限り、本文書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、当該技術分野の通常の熟練者当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有することが意図される。別段の指示がない限り、本明細書の用法では、文脈などを通じて、以下の用語は、以下の意味を有することが意図される。
本明細書の用法では、「無傷細胞」という語句は、関心のある核酸、タンパク質、又は細胞内内容物を含有する微生物細胞を指し、微生物細胞は、遠心分離、濾過、マイクロ流体分離、又は免疫磁気分離などであるが、これらに限定されるものではない、分離法を介して分離可能である。
本明細書の用法では、「サンプル」という語句は、１つ又は複数の微生物細胞を含有する、含有してもよい、又は含有することが疑われる、液体又は懸濁液を指す。サンプルの非限定的例としては、尿、リンパ液、脳脊髄液、血液（例えば、全血、血液培養、及び血漿）、痰、及び唾液などの体液が挙げられる。その他のサンプルの例としては、便、筋肉組織、脳組織、及び肝臓組織の均質化懸濁液をはじめとするが、これらに限定されるものではない、均質化組織懸濁液が挙げられる。サンプルは処理済みでも未処理であってもよく、任意選択的に１つ又は複数の試薬又は増殖培地を含んでもよい。血液培養サンプル（増殖培地及び全血を含有するサンプル）の場合、血液培養サンプルは、検出様式を介して（例えば、自動化血液培養システムを介して）、微生物細胞の存在について陽性と見なされた血液培養サンプル、１つ又は複数の培養中検出様式を介して行われた測定に基づいて微生物細胞の存在が疑われる培養中血液培養サンプル、又は初期検出結果が得られていない培養中の血液培養サンプルであってもよい。
本明細書の用法では、「血液細胞」という語句は、赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）（赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ））、白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ））、及び血小板（ｂｌｏｏｄ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）（血小板（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅｓ））をはじめとするが、これらに限定されるものではない、血液中に存在する哺乳類細胞を指す。
本明細書の用法では、「血液サンプル」という語句は、１つ又は複数の血液細胞を含んでなる任意のサンプルを指す。血液サンプルの非限定的例としては、全血サンプル、血液培養サンプル、バフィーコートサンプル、及び血小板サンプルが挙げられる。
本明細書の用法では、「全血」又は「全血サンプル」という語句は、血漿及び血液細胞を含んでなる哺乳類血液を指す。「全血」又は「全血サンプル」は、抗凝固療法試薬などの１つ又は複数の試薬を含んでもよい。例えば、全血は、限定されるものではないがＳＰＳ（ポリアネトールスルホン酸ナトリウム）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、クエン酸ナトリウム、及びヘパリンをはじめとする抗凝固剤などの、１つ又は複数の試薬を含んでもよい、サンプルボトル内に採取されてもよい。
本明細書の用法では、「選択的溶解」という語句は、溶解後に生存能力を維持する微生物細胞の割合が、溶解後に生存能力を維持する真核細胞の割合を超える、血液溶解試薬又は溶解プロセスを指し、真核細胞は、それからサンプルが採取された対象に関連付けられる。
本明細書の用法では、「微生物細胞」及び「微生物」という語句は、細菌（例えば、グラム陽性及びグラム陰性細菌、並びに細菌胞子）及び単細胞真菌（酵母及びカビなど）を含んでなる。
本明細書の用法では、「真核細胞」という語句は、真菌を除く真核生物、特に甲殻類などの無脊椎動物及び脊椎動物を含んでなる、血液を含有する特定の動物などの動物に由来する細胞を指す。本明細書の用法では、「脊椎動物」は、冷血動物（魚、爬虫類、両生類）及び温血動物（鳥及び哺乳類）の双方を含んでなる。
本明細書の用法では、「有効緩衝液濃度」という語句は、血液溶解試薬が緩衝液系を含む場合に、サンプルの体積と血液溶解試薬の体積を混合することによって形成される混合物に関連して使用されるとき、血液溶解試薬の緩衝液濃度と、血液溶解試薬の体積を血液溶解試薬の体積及びサンプルの体積の合計で除した比率との積を意味する。有効緩衝液濃度は、最終混合物中の緩衝系に対する血液溶解試薬の寄与度（すなわち、血液溶解試薬の緩衝液濃度に適用される希釈倍率）を表し、サンプル中に存在する緩衝構成要素のために、最終混合物中の実際の緩衝液濃度とは異なってもよい。
本明細書の用法では、「分離プロセス」という語句は、微生物細胞を分離し、任意選択的に濃縮するのに適したプロセスを指す。分離プロセスの非限定的例としては、遠心分離、濾過、免疫磁気分離、及びマイクロ流体分離が挙げられる。
本明細書の用法では、「細胞懸濁液」という語句は、微生物細胞を含有する水性媒体を指す。
本明細書の用法では、「コロニー」及び「微小コロニー」という用語は、互いに近接して位置し、表面上に位置し、単一の祖先微生物の原位置複製によるクローン子孫である、微生物の多重性又は集団を指す。一般に「コロニー」は肉眼で見えるもので、典型的に直径が約５０μｍ、６０μｍ、８０μｍ、又は１００μｍを超える。しかし、本明細書の用法では、別段の記載がない限り、「コロニー」という用語は、直径が１００μｍ以上のコロニーの双方を含むことが意図され、「微小コロニー」という用語は、直径が１００μｍ未満のコロニーを指すことが意図される。
本開示の様々な例の実施形態は、微生物増殖及び抗微生物剤感受性試験（ＡＳＴ）への従来のアプローチに関する前述の欠点に対処する。以下で詳細に説明するように、本開示の例の実施形態の多くは、統合流体カートリッジを用いて、微生物細胞の分離と引き続く統合流体カートリッジ内の原位置での微生物コロニーの増殖を容易にする。多くの例の実施形態では、統合流体カートリッジの少なくとも一部を閉じた構成に維持しながら、微生物細胞が、引き続くコロニー増殖のために分離され、固相増殖培地と接触される。
ここで図１を参照すると、微生物コロニーの増殖を実施するための例の統合流体カートリッジ（デバイス）が概略的に図示される。サンプル２０は、細胞分離モジュール（統合流体カートリッジの一部又は領域）３０、及びコロニー増殖モジュール（統合流体カートリッジの別の部分又は領域）４０を含む、統合流体カートリッジ１０内に導入されてもよい。統合流体カートリッジ１０は、分離された微生物細胞が無傷で生存能力がある形態（細胞分裂が可能）で分離されるように、真核細胞（例えば、宿主対象からの宿主細胞）などのサンプルのその他の構成要素からの微生物細胞の分離を容易にする。分離された微生物細胞は、任意選択的に濃縮され、液体培地（例えば、生理食塩水又は微生物細胞の生存能力を維持するのに適した別の緩衝液）中に提供されてもよく、それによって微生物細胞懸濁液が提供される。引き続いて、細胞懸濁液が、例えば、１つ又は複数の流体導管３５を介してコロニー増殖モジュール４０に導入されて、その中で固相増殖培地と接触され（例えば、播種され）、その例は以下に詳細に記載される。コロニー増殖モジュール４０は、固相増殖培地上で増殖するコロニーのモニタリング（例えば、光学的又は電気的様式を介して）を可能にするように構成されている。引き続いて、統合流体カートリッジ１０は、微生物コロニーの増殖のモニタリングを可能にしながら、増殖を促進するための適切な温度と環境（例えば、３５～３８℃）でインキュベートされてもよい。
上述したように、統合流体カートリッジの少なくとも一部を閉じた構成に維持しながら、微生物細胞が、引き続くコロニー増殖のために分離され、固相増殖培地と接触されてもよい。「閉じた」及び「閉じた状態」という語句は、一体型流体カートリッジの内部領域が少なくとも一時的に、統合流体デバイスの内部領域内への外部微生物細胞の侵入（参入又は導入）を妨げる状態にする能力又は構成を指し、それによって、サンプルから分離され、コロニー増殖モジュール内でコロニーに増殖した微生物細胞の汚染を回避することが理解されるであろう。統合流体カートリッジの内部領域は、適切に配置された弁の作動によって閉じた状態にされてもよい。
いくつかの例の実施形態では、統合流体カートリッジの内部領域は、例えば、微生物細胞の通過を妨げるフィルターを通じて、内部領域と外部気体源又は外部環境との気体連絡を可能にしながら、閉じた状態にあってもよい。流体カートリッジのその他の内部領域が非閉鎖状態にある間、流体カートリッジの１つの内部領域が閉じた状態に構成されてもよい。以下のいくつかの例の実施形態で説明するように、閉じた状態で存在する統合流体カートリッジの内部領域の少なくとも一部は、例えば、さらなる検査のための十分な微生物の増殖が検出された後に開かれて、その中に存在する微生物細胞（例えば、微生物コロニー）への外部アクセスが提供されてもよい。
統合流体カートリッジ１０が、手動方式、半自動方式、又は全自動方式に従って、生存能力がある微生物細胞が固相増殖培地と接触する前に、細胞分離モジュールが、生存能力がある微生物細胞の分離を実施するように、得られた微生物懸濁液が、統合流体カートリッジ内の閉鎖環境内で微生物細胞懸濁液を維持しながら、コロニー増殖モジュールに輸送されてもよいように、構成されてもよいことが理解されるであろう。
例えば、いくつかの例の実施形態では、微生物細胞は、図１３Ａ～１３Ｅに示されるカートリッジなどの統合流体カートリッジ（統合流体デバイスの細胞分離モジュールの例を提供するものとして、以下に詳細に記載される）、又は懸濁液が自動的に固相増殖培地と接触するようなその変形を使用して、自動化溶解遠心分離プロセスを介して分離されてもよい。代替の例の実装形態では、プロセスは、閉じた統合カートリッジ内で完全に自動化されてもよく、これは、分離された微生物細胞を固相増殖培地に移すときに汚染物質の導入を回避するのに有益であってもよい。別の例の実施形態では、微生物細胞はフィルターを使用して分離されてもよく、統合流体カートリッジは手動又はロボット制御いずれかのプランジャーを含む。
図１３Ａ～１３Ｅに示される例の統合カートリッジは、生存能力がある微生物細胞の分離を実施するために自動溶解遠心分離を用いているが、このような統合カートリッジは、濾過；免疫磁気分離；又はフローサイトメトリー細胞選別、電気的細胞選別又はマイクロ流体細胞選別などの細胞選別技術をはじめとするその他の分離様式などであるが、これらに限定されない、代替の分離様式を含むように改変されてもよい。さらに、本明細書で開示される例の実施形態のいくつかは、血液サンプルからの生存能力がある微生物細胞の分離を伴うが、上に提供された相「サンプル」の定義に従って、多種多様なサンプルタイプが用いられてもよいことが理解されるであろう。
コロニー増殖モジュールは、固相増殖培地上の微生物コロニーの増殖及びモニタリングの双方を容易にする増殖チャンバーを含む。内部増殖チャンバーを有するこのような増殖モジュールの例の実施形態は、図２Ａ－２Ｂに示される。最初に、図２Ａ（平面図）及び図２Ｂ（断面図Ａ－Ａ）を参照すると、コロニー増殖モジュール１８０は、その上に固相増殖培地１１０の層が形成された下部内壁１０５を有する増殖チャンバー１００と、上壁１２０と、例えば経路１６１（又は図１の３５）を介して細胞分離モジュールに流体接続された導管１０１とを含む。増殖チャンバー１００はまた、導管１５０を介して通気孔１３０に流体接続されてもよく、又はこのような通気孔は、チャンバーの上壁１２０内に形成され得てもよい。
いくつかの例示的な実施形態では、上壁１２０は、微生物細胞の増殖中にチャンバーと外部環境との間の空気交換を可能にするためのガス透過性セクションを含有してもよい。ガス透過性セクションは、例えば、ガス透過性膜であってもよい。適切なガス透過性膜の一例としてはポリウレタン膜が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの例の膜は、チャンバー内の汚染物質を含まない環境を維持しながら、周囲環境との十分な速度のガス交換を可能にし、固相上での細胞増殖を促進する。
固相増殖培地１１０は、微生物細胞に適切な増殖培地源を提供するのに適している。固相増殖培地の非限定的な例としては、適切な増殖栄養素を有する従来の寒天、ゼラチン、グアーガム、キサンタンガムが挙げられる。いくつかの例の実装形態では、固相増殖培地は、微生物細胞のタイプに応じた発色性であってもよい。いくつかの実施形態では、発色性又は蛍光発生基質は、例えば、欧州特許出願第１０８８８９６Ａ２号明細書に記載されるように、コロニーの特異的又は非特異的染色によって微生物を同定するために寒天培地に添加されてもよい。
以下でさらに詳細に説明するように、固相増殖培地は、細胞懸濁液からの液体構成要素が接触時に（少なくとも部分的に）吸収されるように、乾燥形態又は部分的乾燥形態であってもよい。
微生物細胞懸濁液は、いくつかの異なる例の実装形態に従って、増殖チャンバーに導入され得ることが理解されよう。例えば、細胞懸濁液は、例えば、上流位置からの陽圧又は下流位置からの陰圧（例えば、図２Ｂの経路１５０を介して）、及び適切に配置された弁及びポンプの作動を介して、チャンバー内及び固相増殖培地上に流し込まれてもよい。いくつかの例の実装形態では、細胞懸濁液の適切な拡散を容易にし、微生物細胞を固相増殖培地の表面上に分散させるために、流体の流れを妨害又は低減する障壁などの物理的構造が、増殖チャンバー内に提供されてもよい。
少数のコロニーの増殖及び／又は限定的サイズへのコロニーの増殖を伴ういくつかの例の実装形態では、ガス透過性領域の不在下で増殖チャンバーを閉じてもよいことが理解されるであろう。例えば、以下に説明する例の実施形態のいくつかでは、ガス透過性領域不在下の微生物の呼吸のために、周囲空気又は５％のＣＯ２などの必要な大気の十分な量が、コロニーチャンバー内に封入されてもよい。
代替の例の実施形態では、増殖チャンバーは、外部微生物細胞に対する障壁として機能するフィルターを通じて酸素源（例えば、外部環境）とガス連絡し、チャンバーへの連続的又は断続的な酸素の供給を容易にしてもよい。例えば、増殖チャンバーは、外部微生物細胞の侵入を妨げる中間フィルターを通じて、大気又は加圧又は空気圧ガス源に通気される外部ポートとガス連絡してもよい。外部酸素源とのガス連絡は、中間弁を介して制御されてもよい。
一例の実施形態では、上壁１２０は、それを通じてコロニーの増殖が検査され得る（例えば、視覚的に又はカメラなどのイメージングデバイスを介して）、光学的に透明又は透過性の領域（例えば、窓）を含んでもよい。別の実施形態では、上壁１２０は、分離可能な蓋の形態であり、それは微生物コロニーの増殖についてゲル表面を画像化し、又は視覚的に照会するために時々除去され得る。
増殖チャンバー１００は、微生物によって生成された揮発性有機化合物の比色センサー検出を介して増殖コロニーの代謝活性を検出できる、１つ又は複数の指示薬を任意選択的に含んでもよい。適切な指示薬の非限定的な例は、米国特許公開第２０１５００９９６９４号明細書で開示されている。このような指示薬は、ある程度の分類学的粒度（例えば、グラム状態、科、属、種、株）で、コロニー内の細胞の識別を可能にしてもよい。一例の実施形態では、１つ又は複数の指示薬はグラム染色試験の情報と同様の情報を提供してもよく、増殖コロニーを混乱させ又は犠牲にすることなく、非破壊的な方法で適切な抗生物質感受性試験パネルの選択を可能にする。
いくつかの例の実施形態では、コロニーは、固相増殖培地に指示薬を提供することによって、非破壊的な方法で同定されてもよい。適切な指示薬の非限定的例としては、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０２９５２９９Ａ１号明細書に記載されているような、発色性又は蛍光発生性基質、生化学的染料、ｐＨ指示薬が挙げられる。
いくつかの例の実装形態では、ガス透過性膜又は増殖チャンバーを囲む構造の別の部分は、透明な材料（例えば、ポリウレタンなど）から形成され又はそれを含んでもよく、図２Ｂに示される例の実施形態で図示されるように増殖培地に関連する空間領域上に延びてもよく、それによってコロニー増殖の観察を可能にする。観察は、例えば、視覚的に、又は位相差顕微鏡法又は暗視野顕微鏡法などの光学的検出（例えば、イメージング）システムを使用して、実施され得る。代案としては、下でさらに詳しく説明されるように、レーザーなどの単色光源の平行ビームによってコロニーを裏側から照射し、光散乱パターンを検査又は処理して、微生物細胞同定を実施し、又は所定のコロニーの微生物細胞のクラスが判定されもよい。
異なる検出様式は、固相増殖培地上でのコロニー増殖の異なる検出限界を有することが理解されるであろう。例えば、顕微鏡での直接モニタリング法では、コロニーあたりの細胞数での検出限界は、ほぼ１０３程度である。例えば、Ｙｏｓｈｉａｋｉｅｔ ａｌ．［Ｃｏｌｏｎｙ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｆｏｒ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｌｅｎｓｌｅｓｓ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｍｉｃｒｏｃｏｌｏｎｉｅｓ．”ＰｌｏＳ ｏｎｅ １２．４（２０１７）：ｅ０１７４７２３］は、直径１０～５００μｍ範囲の微小コロニーを検出することができた。
微小コロニーの検出を制限してもよい重要な要因は、処理したサンプルを固相増殖培地と接触させた後に顕微鏡法を介して観察可能な表面アーチファクト（背景）のサイズ及び密度であり、このような表面アーチファクトは微生物細胞又は微生物細胞コロニーを代表するものではない。背景に寄与するこのような表面アーチファクトの例の２つのタイプとしては、（ｉ）ゲル表面の表面不均一性、及び（ｉ）遠心洗浄後にサンプル中に長く残る、血液細胞の消化に起因する溶解残骸粒子などのサンプルの溶解後に残る溶解残骸粒子が挙げられる。
最初のタイプのアーチファクトの表面密度、すなわちゲル表面の不均一性は、ゲルの管理された製造を通じて低減し得る。低密度の表面不均一性を有するゲルを調製するための非限定的な方法の一例は、以下の実施例６に記載される。
第２のタイプのアーチファクト、すなわち溶解残骸粒子のサイズと量は全血サンプル毎に変動してもよく、血液溶解試薬（ＢＬＲ）の組成に依存することが分かっている。
“ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤ ＦＯＲ ＥＸＴＲＡＣＴＩＮＧ ＭＩＣＲＯＢＩＡＬ ＣＥＬＬＳ”と題された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００９９２号明細書は、遠心分離の前に血液構成要素の消化に用いられてもよい、多くの異なる血液溶解試薬組成物を開示している。上述したように、血液溶解試薬の存在は、血球細胞の選択的溶解を引き起こす。国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００９９２号明細書によって教示される一例の実装形態では、血液溶解試薬は、サポニン及びポリアネトール硫酸ナトリウム（ＳＰＳとして知られるポリアネトール硫酸のナトリウム塩）を含む水性液体であってもよく、このような組成を有する血液溶解試薬は、以後、「タイプ１」血液溶解試薬と称される。血液溶解試薬はまた、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ、例えば、およそ２０００の分子量を有する）などの消泡剤も含んでもよい。国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００９９２号明細書は、全血と血液溶解試薬を混合したときの、タイプ１血液溶解試薬に対するサポニン及びＳＰＳの濃度範囲の例が、それぞれ約１．５～８０ｍｇ／ｍＬ及び０．５～２０ｍｇ／ｍＬであると教示する。
国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００９９２号明細書で教示されるように、ＳＰＳは抗凝固剤及び抗食作用剤であり、抗微生物剤を阻害することが知られている（Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｎ．Ｍ．，Ｓｕｔｔｅｒ，Ｖ．Ｌ．，＆ Ｆｉｎｅｇｏｌｄ，Ｓ．Ｍ．（１９７５）．Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｅｒｏｂｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｂｌｏｏｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１（１），３０－３６）。ＳＰＳが血液細胞溶解を助ける機序は、良く分かっていない。理論によって制限されることを意図せずに、ＳＰＳは、血液細胞溶解中に微生物にある程度の保護を提供し、細胞残骸への細菌の捕捉の発生率を低減し、及び／又はさもなければ沈降物中に存在し得る溶解残骸構成要素の量を低減してもよいと考えられる。
国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００９９２号明細書によって教示される、血液溶解試薬組成物の別の例の実装形態では、血液溶解試薬は、９～１１の範囲のｐＨを有する緩衝液中にＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及びＳＰＳを含む水性液体であってもよく、このような組成を有する血液溶解試薬は、以降、「タイプ２」血液溶解試薬と称される。血液溶解試薬はまた、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ、例えば、およそ２０００の分子量を有する）などの消泡剤も含んでもよい。国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００９９２号明細書は、全血と血液溶解試薬を混合したときの、タイプ２血液溶解試薬に対するＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及びＳＰＳの濃度範囲の例が、それぞれおよそ０．５～１．５％ｗ／ｖ及び５～１０ｍｇ／ｍＬであると教示する。
上述したように、上記のタイプ１血液溶解試薬組成物は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００９９２号明細書の教示に従った、全血からの微生物細胞の手動及び半自動分離及び濃縮に適することが見いだされた。しかしその全体が本明細書に参照により援用される、２０１５年５月１９日に出願された“Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ”と題された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１５／０５０４４９号明細書の自動化法に従って、国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００９９２号明細書で開示される試薬製剤を全血からの微生物細胞の自動分離と濃縮、及びその後の同定に適合させた場合、本発明者らは、全血の量がおよそ１ｍｌ未満の場合には、タイプ１血液溶解試薬組成物が最も適することを見いだした。
溶解残骸粒子の低い表面密度を達成するための別の例の血液溶解試薬は、その実体（ｅｎｔｉｔｙ）が参照により本明細書に援用される、２０１９年５月２４日に出願されたＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＳＥＬＥＣＴＩＶＥ ＬＹＳＩＳ ＯＦ ＢＬＯＯＤ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＡＬ ＣＥＬＬＳ”と題され、微生物細胞の生存率を維持し、カートリッジ上の狭いチャネルを通る流体移動操作が耐容できない障害なしに実施され得るレベルまで、サンプル粘度を低下させるための例の血液溶解試薬組成物及び方法を記載する、国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１９／０５０７１６号明細書に記載される。以後タイプ３血液溶解試薬と称されるこの血液溶解試薬組成物は、サポニン、ＳＰＳ、アルカリ性緩衝液、及び任意選択的に非イオン性界面活性剤を含有して提供されてもよい。
一例の実施形態では、タイプ３血液溶解試薬は、血液溶解試薬がサンプルと混合された後、サポニンの濃度が３～６０ｍｇ／ｍｌの間、ＳＰＳの濃度が１．５～５０ｍｇ／ｍｌの間、非イオン性界面活性剤の濃度が０～３％ｗ／ｖ内にあり、ｐＨが７．８～１０の範囲内にあるような組成を有してもよい。いくつかの例の実施形態では、緩衝液濃度は、有効緩衝液濃度が１０～３００ｍＭの範囲にあるように選択されてもよい。所与の構成要素の濃度の変化が、血液溶解効率、残留血液細胞残骸の量、微生物細胞の無傷、及び微生物細胞生存率などであるが、これらに限定されるものではない、１つ又は複数の性能測定基準に及ぼす影響を実験的に調査することによって、所与の条件のセットに対して、血液溶解試薬の所与の構成要素に適した濃度範囲が判定され得ることが理解されるであろう。タイプ３血液溶解試薬は、血液溶解試薬のサポニン構成要素が、血液溶解試薬のアルカリ性構成要素から分離された酸性環境内に貯蔵されるように、別々に貯蔵されて使用前に混合され得る２つ以上の試薬として提供されてもよい。一例の実装形態では、最終的な血液溶解試薬を形成するために混合される１つ又は複数の試薬は、固相で保蔵されてもよい。
したがって、いくつかの例の実装形態では、サンプルは、サポニン、ポリアネトールスルホン酸ナトリウム（ＳＰＳ）、非イオン性界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００などであるが、これに限定されるものではない）、緩衝液（例えば、炭酸塩－重炭酸塩緩衝液）を含んでなる、アルカリ性ｐＨを有するタイプ３溶解試薬によって処理されてもよい。血液溶解試薬はまた、ＳＥ－１５などの消泡剤（例えば、活性シリコーンポリマー及び非イオン性乳化剤の１０％ｗ／ｖエマルション）を含んでもよい。
非イオン性界面活性剤及び炭酸塩－重炭酸塩緩衝液を含まない血液溶解試薬は、微生物細胞に無害であることが知られている。しかし、以下に示すように、全血サンプルを処理する場合、このような血液溶解試薬の使用に従って最終的な細胞懸濁液に移される血液残骸のサイズは、微小コロニーの検出と特性決定を妨害し表面アーチファクト（背景）のレベルの上昇を引き起こし得ることが見いだされている。対照的に、サポニン及びＳＰＳと並んで適度な量の非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００）と炭酸塩－重炭酸塩緩衝液を添加することは、細胞生存率に有意に影響を与えることなしに、溶解残骸から生じる表面アーチファクトを有意に減少させるという点で有益であり得る。
いくつかの例の実装形態では、最終混合物中のサポニンの濃度が１０～３０ｍｇ／ｍｌ（又はいくつかの例の実装形態では、３～６０ｍｇ／ｍｌ）の範囲であり、最終混合物中のＳＰＳの濃度が、５～５０ｍｇ／ｍｌ（又はいくつかの例の実装形態では、１．５～５０ｍｇ／ｍｌ）の範囲であってもよく、有効緩衝液濃度が、１０～３００ｍＭの範囲であり、非イオン性界面活性剤の濃度が、０～３％ｗ／ｖ（（又はいくつかの例の実装形態では、０～１％ｗ／ｖ）以内であり、最終混合物のｐＨが、７．８～１０（又はいくつかの例の実装形態では、８．２～９．５）の範囲であってもよく、消泡剤エマルションの濃度が、０．００５～０．５％（ｖ／ｗ）以内であるように、最大１０ｍＬの全血サンプルがタイプ３血液溶解試薬と混合されてもよい。
表面アーチファクト密度の血液溶解試薬の組成物への依存性を図示するために、どちらも次のような組成を有する血液溶解試薬を使用して２回の洗浄サイクルで、実施例５の方法に従って４ｍＬの全血サンプルが処理された：３５ｍｇ／ｍＬのサポニン、２０ｍｇ／ｍＬのＳＰＳ（ＢＬＲ１）及び（ｉｉ）３５ｍｇ／ｍＬのサポニン、２０ｍｇ／ｍＬのＳＰＳ、０．３％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００、及び５０ｍＭの炭酸塩－重炭酸塩緩衝液、ｐＨ１０（ＢＬＲ２）。サンプルのそれぞれの血液溶解試薬への曝露と遠心分離後、１μＬの各最終微生物細胞懸濁液が、スポットオン寒天ゲルプレート上にピペットで移された。微生物細胞懸濁液サンプルは、直径約５ｍｍの円形領域に広げられ、約３分間風乾かされた。本明細書でミニ培養領域（ＭＣＲ）と標識されるこれらの領域は、５倍の対物レンズを備えた顕微鏡によって画像化され、図３Ａ及び３Ｂに提示される。これらの図では、ＭＣＲ、未使用寒天プレート表面、及び２つの領域間の境界が、それぞれ３１０、３１２、及び３１１で示される。観察されているように、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び炭酸塩－重炭酸塩緩衝液の組み入れは、背景（表面アーチファクトの密度）を有意に減少させる。
本発明者らは、この背景レベルが、洗浄サイクルを増加させても、これ以上有意に低減され得ないことを見いだした。例えば、これは、上記の製剤を含むＢＬＲ２を使用して４ｍＬの全血サンプルを処理し、その後２回又は４回の遠心洗浄サイクルを行うことで実証された。得られた微生物細胞懸濁液の１μＬが寒天プレート上に分注され、広げられて風乾された。得られたＭＣＲの写真は、１０倍の顕微鏡対物レンズで記録され、２回及び４回の洗浄サイクルの終わりに残骸のサイズ分布について分析された。粒子は、強度ベースの適応自動閾値法を介して配置され、楕円に適合された。より正確には、画像セグメンテーションが実施され、同じラベルを有するピクセルが特定の強度特性を共有するように、画像内の接続された全てのピクセルグループにラベルが割り当てられた。測定された主要粒子径（適合楕円の長軸）の分布のヒストグラムが、図３Ｃに示される。観察されるように、サンプルが２～４回の洗浄で４００倍に希釈されているという事実にもかかわらず、分布プロットは定性的に類似している。
これらの結果は、残骸粒子のサイズが、引き続く直接コロニー増殖のために血液サンプルを処理するときに、血液溶解試薬の組成によって強く影響されることを示唆する。しかし、特にグラム陰性細菌の場合、微生物細胞の生存能力の要件は、血液溶解試薬の消化能力を高めることによって、より小さな残骸サイズを達成する能力を制限する。この制限は、残骸のサイズと密度が微小コロニーレベルでの微生物細胞増殖の検出を妨げない限り、耐容され得る。この点に関する一例の基準は、最終的な細胞懸濁液を細胞増殖チャンバー上に散布した後、溶解残骸アーチファクトが固相増殖培地の表面を、９０％を超えず、又は好ましくは５０％を超えず、又はより好ましくは２０％を超えない面分率で覆うべきであるというものである。本発明者らは、全血サンプルをタイプ３血液溶解試薬で処理することによって、この基準が満たされ得ることを見いだした。
アーチファクトの表面密度が極端に高くなければ、タイムラプスイメージングを介して経時的に複数の写真を記録することによって、又は例えば、サイズ閾値によって背景を除去することによって、背景と微小コロニーを区別することが可能である。サイズ選択を実施するために、インキュベーション前又はインキュベーションから程なくして、ゲル表面の限られた領域からゲル表面の画像が取得され得る。一例の実装形態では、画像解析を実施して、残骸粒子の平均サイズＲｂａｃｋ．ａｖと残骸粒子サイズの標準偏差ｓｄを判定し、Ｒｂａｃｋ．ａｖとｓｄに基づいてサイズ閾値が判定されてもよい。サイズ選択基準は、例えば、Ｒ＞Ｒｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝Ｒｂａｃｋ．ａｖ＋ｎ＊ｓｄのように設定され得て、ｎは、典型的には１～６の範囲で選択される整数であり、より典型的にはｎ＝３である。別の実施形態では、Ｒｂａｃｋ．ａｖ及びｓｄは、コロニー分析段階で利用可能になるように予め決定されてもよい（例えば、カートリッジと一緒に提供され、又はデバイス／機器のソフトウェアに埋め込まれる）。
いくつかの例の実施形態では、コロニー増殖モジュールは、懸濁液中の微生物細胞の少なくとも一部が固相増殖培地の表面に保持されるように、細胞懸濁液を増殖チャンバー内に流した後、微生物懸濁液の液体構成要素（すなわち、液体構成要素の少なくとも一部）を除去するように構成されている。細胞懸濁液の液体構成要素の除去は、微生物細胞の固相増殖培地への播種を助け、引き続くコロニー増殖を促進する。さらに、細胞懸濁液の液体構成要素を除去することによって、例えば、光学的又はその他の（例えば、電気的）手段による増殖中のコロニーのモニタリングを妨げ得る、結露及び過剰な水分など、残留液体の存在に関連したその他の問題も軽減される。
いくつかの実施形態では、細胞懸濁液の液体構成要素の除去は、通気孔又は蒸気透過性膜を介した受動的、又は強制対流式蒸発の手段による能動的のいずれかで、蒸発によって達成されてもよい。その他の実施形態では、液体構成要素は、増殖培地又は増殖培地が注入された基質によって吸収されてもよい。
一例の実装形態では、増殖チャンバー内に存在する細胞懸濁液の液体構成要素は、図４Ａに示されるように、増殖チャンバーの上壁内の蒸気透過性膜１１５を介して受動的に蒸発されてもよい。別の例の実施形態では、蒸発は、細胞懸濁流体の蒸発が加速されるように、チャンバーの周囲圧力を低下させることによって能動的に増強されてもよい。例えば、２５℃では、水蒸気圧はおよそ２４ｍｍＨｇである。これは、弁又はその他の手段によってチャンバーの入口及び出口を閉じて、チャンバーの上壁の透過性膜１１５を介して陰圧を印加することによって、又は閉じた非透過性チャンバーを真空ポンプに接続する流体導管を介して陰圧を印加することによって、達成されてもよい。
図４Ｂに図示される別の例の実装形態では、強制対流式蒸発による細胞懸濁液の蒸発を助けるために、細胞懸濁液の上に空気を流してもよい。蒸発速度をさらに上げるために、空気が乾燥及び／又は加温されてもよい。
その他の例の実施形態では、細胞懸濁液の液体構成要素は、図４Ｃに図示されるように、吸収によって受動的に除去されてもよい。この実施形態では、増殖培地は、液体を吸収し、微生物細胞を増殖培地と接触させてコロニー増殖を促進し、いくつかの実施形態では、引き続く採取のためにコロニーを固定化する、いくつかの乾燥形態の１つで提供される。
適切な液体吸収性固相増殖培地の様々な例、及びその製造方法は、下で詳述される。いくつかの例の実施形態では、増殖培地１１０（図２Ｂ）の少なくとも上部は、親水性の特性を有する多孔質ネットワークを有してもよく、多孔質ネットワークは、内部多孔質ネットワークが少なくとも部分的に開いており、液体を吸収できるように、少なくとも部分的に乾燥した状態で提供される。換言すれば、固相増殖培地１１０は、液体で完全に飽和されていない状態で提供されてもよい。したがって、細胞分離モジュールによって提供される細胞懸濁液の液体構成要素は、それと接触したときに固相増殖培地１１０によって吸収されてもよく、固相増殖培地１１０を水和させ、細胞懸濁液の微生物細胞を固相増殖培地の表面上に吸い込む。細胞懸濁液の液体構成要素が吸収されたときに、微生物細胞が固相増殖培地の表面上又はその近く（近位）に保持されるように、固相増殖培地の多孔質性は、微生物細胞が多孔質ネットワークに入るのを防止するように選択されてもよい。
液体吸収性固相増殖培地（完全に水和しておらず、さらに吸収する能力を有する固相増殖培地）の使用は、閉じた統合流体デバイス内で、コロニー増殖のための表面上への細胞懸濁液からの微生物細胞の制御された吸着を容易にするという重要な問題を解決する。細胞懸濁液の液体構成要素を迅速且つ効率的に吸収することによって、残留液体の存在に関連する問題（例えば、残留液滴又は局所的に蓄積されたプール）が回避される。本発明者らは、このような残留液体が細胞表面の会合を妨げる得ることを見いだしている。さらに、残留液体は結露及び過剰な水分をもたらし得て、光学的又はその他の（例えば電気的）様式による増殖中のコロニーのモニタリングを妨げ得る。適切な液体吸収性固相増殖培地の様々な例、及びその製造方法は、下で詳述される。
いくつかの例の実施形態において、固相増殖培地は、脱水され又は部分的に脱水された形態で提供されてもよい。したがって、細胞懸濁液の液体構成要素は、増殖チャンバーに導入されると固相の孔内に吸い上げられ、微生物細胞は表面上に保持される。
脱水固相増殖培地の一例は、米国特許第４，５６５，７８３号明細書で開示される。ポリエステルフィルムなどの自立型防水基質は、微生物の増殖を阻害しないイソオクチルアクリレート／アクリルアミド（モル比９４／６）の共重合体などの接着剤で被覆される。グアーガムなどの冷水溶性ゲル化剤が、微生物細胞を増殖させるための栄養素と共に、接着剤中に分散される。液体と接触すると、液体はゲル化剤の粒子と反応し、微生物細胞の増殖をサポートするための固相が形成される。
別の実装形態では、ゲル化した固相は、低湿度環境で部分的に脱水され、使用するまで湿度制御された包装内に部分的に脱水された状態で維持される。代案としては、ゲル化した固相は、凍結乾燥技術によって部分的に脱水され得る。
別の例の実施形態では、細胞懸濁液の液体構成要素の少なくとも一部は、細胞懸濁液と接触される前に、ゲルベースの固相増殖培地の遠心処理を介して除去されてもよい。この実施形態の一例の実装形態は、図５Ａ～５Ｄに示されている。固相増殖培地は、図５Ａに示されるように、軸周囲の回転による遠心力１０３に曝される。図は、遠心力が図５Ａのゲル表面に垂直に向けられていることを示す一方で、その他の例の実装形態では、遠心力は、固相増殖培地の表面に対してある角度（例えば、垂直方向から３０度の角度内）に向けられてもよいことが理解されるであろう。遠心力の結果として、ゲルは部分的に脱水（ｄｅｈｙｄｒａｔｅｄ）（「脱水（ｄｅｗａｔｅｒｅｄ）」）され、図５Ｂに図示されるように、少なくともゲルの上部でゲルを著しく崩壊させることなく、ゲルの液体構成要素を除去する。
微生物細胞を含有する微生物細胞懸濁液がゲル上に分注される（接触される）と、図５Ｃに示されるようにゲル表面上に広がり、図５Ｄに示されるように微生物細胞懸濁液の液体含有量の少なくとも一部が、部分的に脱水されたゲルに吸収される。微生物細胞懸濁液は、ゲル上に広げられ得て、微生物懸濁液の液体構成要素は、受動的に（例えば、重力下で）、又は例えば、引き続く遠心力の印加下で吸収されてもよい。微生物細胞懸濁液の液体構成要素が除去された後、ゲル表面上に微生物細胞が残る。
ゲルの滲出した液体構成要素（例えば、水）は、ゲルの背後の空のチャンバー内に収集されてもよい。ゲルから滲出した水は、遠心分離中又はその後に排出されてもよい。
離液としても知られている脱水現象は、アガロース多糖類のらせん状コイルによって形成されるゲルネットワークの弾性圧力が、通常はゲルの膨張を引き起こす水の浸透圧を超えると、ほとんどのハイドロゲル材料で発生する。遠心分離などの外部の機械的圧力は、湿ったスポンジから水を絞り出すのと同様に、ゲルを絞り出すことによって離液を促進する。ゲルからいくらかの水を除去すると、ゲルネットワークの空孔を開いて新しい水を入れることによって、細胞懸濁液を迅速に吸収する機会を提示する。交換される水の量を制御することは、増殖チャンバー設計の重要な設計特徴になる。したがって、本開示の次のセクションでは、ゲル組成物の関数としての脱水現象の定量化を実証する実験的観察が提示される。
遠心分離時の寒天ゲルからの水分損失をシミュレートするために、ゲルを遠心分離管内の多孔質膜の上に置き、４０００ＲＰＭで回転させた。遠心分離前後のゲルの質量が測定され、その差はゲル上への遠心力の結果としての水分損失に起因する。一実験では、寒天ゲルの約０．１５グラムの切片をペトリ皿から切り出して、０．４５μｍの変性ナイロンフィルター膜を有するＮａｎｏＳｅｐチューブに入れた。次に、チューブを４０００ＲＰＭ（３２００ｇ）で８分間回転させた結果、水がゲルから分離され、膜を通過してチューブの底部に集まった。次に、膜上に残ったゲルの質量を測定し、遠心分離前後のゲルの質量差に従って水分損失率を判定した。
図５Ｅに提示される結果は、寒天の含有量が多い（１～３％）寒天ゲルの方が、脱水により抵抗性であることを示す。このより高い水分保持力は、ゲルの強度がより高いため、遠心力による離液に対する抵抗性がより高くなっているためである。より硬いゲルはまた、本発明者らによって、遠心分離中に亀裂又は変形しにくいことが観察されている。遠心分離による水分損失に対する影響を調べるために、異なるゲル添加剤もまた調査した。選択された添加剤は、主に、ゲル化（寒天、ジェランガム、アラビアガム、及びカラゲニン）又は非ゲル化（デキストラン）特性のいずれかを有する、その他の多糖類親水コロイドであった。さらに、ジェランガム（Ｇｅｌｚａｎ（商標）ＣＭ）及びカラゲニンは、微生物培養のための寒天代替品としてしばしば使用される。０．５％ジェランガムを添加した１．３５％寒天は、０．４５μｍのＮａｎｏｓｅｐチューブ内で遠心分離された後、１．３５％（４９％損失）又は１．８５％寒天単独（３９％損失）と比較して、最も多くの水分を保持したことが示された（平均で２７質量％の水分損失）。このより大きな保持は、遠心分離機からの外圧に抵抗するゲルのより大きな強度によると考えられた。
より小さな孔径のフィルター膜を使用して、実験を繰り返した。この場合、ゲルはオートクレーブ内で調製され、まだ温かいうちに（～５０℃）、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５限外濾過チューブの１０，０００ ＭＷＣＯ（＜５ｎｍの孔径）セルロース膜上に分注された。冷却時、各チューブは約１．５グラムのゲルを有し、次にそれは４０００ＲＰＭで９分間遠心分離された。次に、膜の上に残存するゲルの質量が測定され、水分損失のパーセントが計算されて図５Ｆに示される。結果は、より小さな膜の孔径が、より大きな０．４５μｍの孔と比較して、全てのゲルの脱水レベルをどのように減少させるかを明らかにする。０．５％ジェランガムの１．３５％寒天への添加は、水分損失が２２～２３％の間であったその他のゲルと比較して、約１６％の水分損失をもたらした（すなわち、より大きな水分保持）。
提示された（ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）発明者は、ゲルがその側面と裏面で十分に拘束されている場合、脱水が低減又は防止され得ることを観察した。ゲルから除去される液体の体積が、ゲル表面上に広げられ再水和プロセスを介してゲルによって吸収されることが望ましいサンプルの液体構成要素の体積に相当するように、ゲル拘束の使用を採用して脱水レベル（それ未満では脱水が排除又は低減されるレベル）が制限され得る。
理論に束縛されることなく、脱水はゲル内の分子コイル内に空隙を残し、それは微生物懸濁液からの新鮮な液体（例えば、水溶液）で潜在的に再充填さ得るという仮説が立てられている。これを実験的に例示するために、１０，０００ ＭＷＣＯ限外濾過チューブ（上記参照）で遠心分離した後に脱水されたゲルの部分をチューブから取り出し、小さなプラスチック皿の上に置いて質量を測定した。各皿を２ｍＬの真水で充填し、ゲルに染み込ませた。２０分間の浸漬後、過剰な水を皿から注ぎ出し、皿とゲルから残りの滴を注意深く拭き取って除去した。次に、図５Ｇに示されるように、脱水ゲルの質量と比較したパーセント質量増加として、ゲルの質量が得られ記録された。
結果は、遠心分離中に失われた水の量は、ゲルを再水和することによって取り戻し得ることを示唆する。すなわち、脱水のパーセントは、各ゲルの再水和のパーセントと同様である。したがって、水がゲルから排出されたときに生じたゲルネットワーク内の空隙は、ゲルが再水和されたときにほぼ同じ体積の水で再充填される。
ゲルの部分的な脱水はまた、環境との水交換によっても達成され得る。ゲルの脱水レベルが比較的低い場合、プロセスは可逆的であり、ほぼ完全な再水和が達成される。この特性は、適切なチャンバー設計を通じたゲルのほぼ完全な拘束によってゲルの遠心分離補助脱水が防止されるが、サンプル播種を目的とした再水和が遠心分離によって実施される場合に有用である。このアプローチの実現可能性を例示するために、以下の実験が実施された。
寒天濃度が１、２、３、及び４重量％の寒天ゲルは、３５ｍｍペトリ皿内で４℃で３日間、開放貯蔵中に脱水された。貯蔵前後の皿の中のゲルの質量が記録され、各ゲルは平均して６～７％の質量を水で失ったことが実証された（図５Ｈを参照されたい）。次に、ペトリ皿のゲルの上面に１ｍＬの水を加えて再水和し、４時間後に水を除去してゲルの重量を再測定したところ、１重量％の寒天ゲルが脱水で失ったのと同じ量の水を取り戻したのに対し、２重量％以上のゲルは４時間の再水和後におよそ１％質量が増加した。保水量が最初の脱水前の元の量を超えられるかどうかを判定するために、ゲルは１ｍＬの水にさらに２４時間浸漬された。水を除去して質量を測定したところ、１重量％及び２重量％の寒天ゲルでは、最初の再水和後に吸収された水以上の追加的な水は吸収されなかった。３％及び４％の寒天で作られたゲルは、追加的な吸水によって、質量が元の質量から２．１～２．６％増加した。
理論により拘束されることなく、図５Ｈに示される結果は、寒天ゲルが水に囲まれたアガロース多糖類から構成される複雑ならせん状のコイルであることを考慮して考察されてもよい（寒天ゲルはまた、寒天の組成の最大３０重量％を占める非ゲル化多糖類であるアガロペクチンも含有する）。水の一部は、水素結合相互作用を介してアガロースコイル（及び場合によってはアガロペクチン）に結合するが、そのほとんどは、ゲルコイルに構造的支持を提供しない非結合の流体のような形で存在する。１～４％の寒天で作られた寒天ゲルでは、蒸発によって未結合の水が失われるため、全てのゲルが同程度に（６～７％）脱水される。再水和すると、水は浸透圧勾配によって駆動されてゲルに再侵入し、蒸発後に残された空隙の一部を再び占有する。高濃度（２重量％を超える）の寒天で作られたゲルでは、浸透圧勾配がわずかに大きく、新鮮なゲルの初期量（２～３％多い）よりも多くの水を取り込むが、ゲルの硬いらせん構造が、追加的な水が侵入する場所を制限することから、体積が制限される。
重力のみの存在下での再水和を判定するために、３５ｍｍペトリ皿に２重量％の寒天濃度で作られた２つのゲルを様々な程度に脱水させ；１つは室温で密封されていない貯蔵後に３０％脱水され、もう１つは４℃で密封された貯蔵後に約２％脱水された。次に、２５μＬの赤色染料溶液の４つの領域を各ゲルに添加し（視覚化を改善するため）、溶液がゲルに完全に浸透するのにかかる時間を観察した。３０％脱水ゲルの場合、溶液がゲル内に染み込むのにおよそ５分間かかり、表面に赤い斑点が残った。４％脱水ゲルの場合、溶液がゲルに染み込むのに２０分近くかかった。
一例の実施形態では、図５Ｉに提示されるように、ゲルは、吸収性材料（例えば、吸収性パッド）１３２の上に存在する膜１３１上に配置される。いくつかの例の実装形態では、膜は、０．２μｍ～５ｎｍ未満の範囲の孔径を有してもよい（例えば、１０，０００ダルトンのサイズ排除）。このような場合、ゲルからの水は、遠心分離によってゲルに十分な圧力（例えば、３０ｐｓｉを超える）が印加された場合にのみ膜を通過する。適切な膜材料の例としては、５０～２５０μｍの範囲の厚さのポリカーボネート、ポリエステル、ＰＴＦＥ、ＰＥＥＫ又はＰＶＤＦが挙げられる。ゲルが皿に注がれている間に高温の液体ゲルが吸収性材料上に漏れるのを防止するために、糊又はその他の接着剤を使用して、膜を増殖チャンバーの側壁に結合させてもよい。吸収性パッドは皿の底に置かれ、遠心分離の際にゲルから除去されて上部の膜を通過する水を吸収する。吸収性材料は、セルロース又はガラス繊維などであるが、これらに限定されるものではないい材料から製造されてもよい。遠心分離中、ゲルからの滲出水は排水され、吸収性材料に吸収される。図５Ｊに示される別の実施形態では、滲出水を排出するためのチャネルがゲルの横に提供される。
図５Ｋは、図５Ｉに図示される実施形態の一例の実装形態を調べるために使用される、一例の増殖チャンバーを示す。標準の３５ｍｍの透明なポリスチレンペトリ皿は、底部の縁の周りで両面接着リング１３３で裏打ちされ、２層のワットマン２号紙１３２がリングの内側に配置された。この紙は、脱水プロセス中に放出された水を吸収するための吸収性材料として使用された。貯蔵中にゲルから吸収紙に移動した水の量を推定するために、１３４に示さるように、指示薬スポットとして０．５μＬの染料溶液が吸収紙の複数の位置にスポットされた。
膜１３１は、貯蔵条件下での水の移動を防ぎ、遠心分離中の移動のみを可能にすることが望ましい。この点において、２つの異なる膜の適合性が試験された：孔径０．１μｍのポリカーボネート膜及び孔径１０μｍのＰＴＦＥ膜。ＰＴＦＥ膜は強度に疎水性であり、遠心分離前の水の移動を防止する点でポリカーボネート膜よりも優れていると予想される。この仮説を調べるために、２つの例の増殖チャンバーが準備された：１つの増殖チャンバーはポリカーボネート膜を有し、もう１つの増殖チャンバーはＰＴＦＥ膜を有する。次に、５０℃の寒天溶液（１．３５重量％）を各膜の上に注ぎ、ゲルに固化させ、３時間かけて固化させた。各チャンバーはパラフィルムで密封され、４℃で一晩貯蔵された。ゲルの写真は、ゲルを注いだ後７時間及び２０時間目に撮影され、図５Ｌに提示されるように、３時間目に撮影された写真と比較された。観察されるように、はるかに大きな孔径を有するにもかかわらず、ＰＴＦＥ膜は、上記の貯蔵条件下で水の移動をほぼ防止し、染料スポットの最小限のぼやけのみが観察可能である。したがって、孔径がさらに小さいＰＴＦＥ膜は、水の移動をより効果的に防ぎ得ると予想される。
図５Ｋの例の増殖チャンバーの調査の第２の目的は、ＰＴＦＥ膜によって、遠心分離中にゲル水が吸収性材料に移動して自動サンプル播種が可能になることを例示することである。この目的を達成するために、３つの増殖チャンバーが準備された：１つの増殖チャンバーは、図５Ｋの実施形態に従ったメンブレンフィルターありで構築され、他の２つの増殖チャンバーは、メンブレンフィルター及び吸収紙なしで構築されている。メンブレンありの増殖チャンバーと、メンブレンなしの増殖チャンバーの１つは、３２００ｇで８分間遠心分離された。遠心分離後、１００μＬの染料溶液を各ゲルの４つのスポット（遠心分離に供されなかった増殖チャンバーのゲルを含めて）に分注し、５分間沈降させ、染料溶液の吸収を介して局所的に再水和される各ゲルの能力が評価された。
染料溶液分注後のゲルの写真は、図５Ｍに示される。観察されるように、遠心分離に供されなかったチャンバーでは、染料溶液はゲル表面上に液滴として存続する。対照的に、膜及び吸収性パッドのないチャンバーの場合、遠心分離段階中に、ゲルの含水量のごく一部（約１００μＬ）が脱水プロセスによって、ゲル表面の側面からの漏出によって除去された。この放出された水は、染料溶液を分注する前に排出されていたが、チャンバー表面からゲルが剥離したため、分注された液体の一部がゲルとチャンバー壁との間のギャップに流れた。対照的に、メンブレン及び吸収性パッドがある増殖チャンバーは、分注されたサンプルを非常に容易に吸収した。この吸収プロセスは、染料溶液を分注した後、例えば、少なくとも１分間、少なくとも１０００ｒｐｍの速度で増殖チャンバーを遠心分離することによって加速され得る。
ゲルベースの固相増殖培地の遠心脱水を伴ういくつかの例の実装形態では、遠心分離プロセス中に遠心力がゲルに印加されてもよい（例えば、統合流体デバイスの分離モジュールを用いて実行される分離プロセス）。
一例の実施形態では、細胞懸濁液が固相増殖培地と接触されてもよく、引き続いて遠心分離を用いてゲルの液体構成要素の一部が同時に除去され、微生物細胞懸濁液から液体構成要素がゲル中に導入されてもよい。
ゲルから滲出する液体の体積は、好ましくは、細胞懸濁液の体積と同様である（例えば、２５％以内、１０％以内、又は５％以内）。ゲルの部分的な遠心脱水及び微生物細胞懸濁液の液体構成要素の吸収を実施する能力は、ゲル濃度、ゲル厚、ゲル表面積、及びゲルが受ける遠心力の持続時間と大きさをはじめとするが、これらに限定されるものではない要因に依存することが理解されるであろう。パラメータの適切なセットは、ゲルから滲出する液体の体積が微生物細胞懸濁液の体積とほぼ等しくなるように、材料及び処理パラメータを選択するなど、適切な性能を達成するために、実験を通じて経験的に判定されてもよい。
例えば、図１３Ａ～１３Ｄに示される例のカートリッジによる細胞分離の例の場合において、最終的な細胞懸濁液の体積は１００μＬである。このような例の場合、増殖チャンバーに含まれるゲルは、表面積１０ｃｍ２及び厚さ５ｍｍで提供されてもよい。１．５％アガロースゲルの例の場合、４０００ｇで約１０分間遠心分離したときの滲出水の量は、１００μＬ近くになる。本発明者らは、４％などのより濃厚なゲルは、同様の条件下で約２０μＬの水を滲出することを見いだしており、当業者は、前述の実験法又はそのバリエーションを用いて、所定の材料及び処理条件のセットで押し出されるゲルの液体構成要素の体積を判定し、微生物細胞懸濁液の適切な対応する体積を選択してもよい。
上述したように、細胞播種プロセス（すなわち、微生物細胞懸濁液を固相増殖培地と接触させ、その液体内容物を部分的に脱水されたゲルによって吸収させるプロセス）は、受動的吸収（例えば、重力によって補助される）又は遠心分離のいずれかによって実施され得る。本発明者らは、前述のゲル（厚さ５ｍｍ、表面積１０ｃｍ２の１．５％ゲル、細胞懸濁液量１００μＬ）の受動的播種（細胞懸濁液のゲル表面への単なる接触による）には、室温で最大２０分間かかることを見いだした。この時間は、遠心播種を採用することによって短縮され得る。例えば、微生物細胞懸濁液を脱水ゲルと接触させた後、増殖モジュールは、懸濁液中の微生物細胞をゲル表面に向かわせる遠心力を５００～４０００ｇまで上昇させ、引き続いて下降させることによって、遠心分離されてもよい。この措置には、３０秒間～１分間かかってもよい。例えば、５００～１５００ｇの間などのより低い遠心力を使用する場合は、上昇と下降の間（例えば２０～４０秒間）に滞留させることで、より効率的な細胞播種を提供してもよい。
少なくとも増殖チャンバーを閉じた状態に維持しながら、細胞懸濁液からの微生物細胞を固相増殖培地の表面に接触させた後、統合流体カートリッジは、微生物細胞の増殖（例えば、３７℃）とコロニー形成を促進するのに適した温度の環境内で、少なくとも増殖チャンバーが閉じた状態でインキュベートされてもよい。
一例の実施形態では、少なくとも増殖モジュール（例えば、増殖モジュールのみ）を含む統合流体カートリッジの一部は、統合流体カートリッジの残りの部分から取り外し可能であってもよい。この実施形態は、２つの点で有利である。第１に、生物学的廃棄物を含むこともある、統合流体カートリッジの残りの部分のインキュベーションが回避される。第２に、増殖チャンバーを含む統合流体カートリッジの分離部分は、統合流体カートリッジが、増殖培地を通じた光透過を用いるコロニーモニタリング様式を備えたインキュベーター内でインキュベートされるときに有益であり得る。
微小コロニーが形成されると、それらは引き続く試験で用いられてもよい。例えば、一例の実施形態では、上壁を除去又は開放して、ＭＡＬＤＩ同定アッセイ、代謝同定アッセイ、及びＡＳＴなどであるが、これらに限定されるものではない引き続く処理のために、コロニーを採取する（例えば、除去及び移送）ためのコロニーへのアクセスが提供され得る。上壁１２０は、コロニーへのアクセスを容易にするために、取り外し可能な蓋、剥離可能なセクション、又はその他の開口手段を含んでもよい。
分離された微生物細胞と固相増殖培地との接触及びインキュベーションを伴う、本例の実施形態は、いくつかの理由で有利であってもよい。第１に、上述したように、最初の分離ステップは、サンプル中に既に存在してもよい抗生物質の濃度を低減するのに効果的であり得る。実際、敗血症が疑われる患者から得られた全血サンプルの場合、最初の瀉血の前に経験的抗微生物療法が開始されるのが一般的である。第２に、従来の液相培養ステップをバイパスする際に、本例の方法は、事前に培養されていないサンプルからの微生物コロニーの直接形成を容易にし、かなりの時間（例えば、１～２日間）を節約し、結果として陽性化までの時間が短縮される。
本例の方法の第３の利点は、固相増殖培地上で個々の微生物細胞を空間的に区別して増殖させることで、多微生物サンプルからの異なる細胞クラス（すなわち、細胞タイプ；異なる属、種、又は株などの異なる分類群の微生物細胞、又は細菌細胞対真菌細胞）の非依存性増殖を容易にすることである。したがって、本例の方法は、さもなければ液体培養環境で発生するであろう競合によって乱されず、偏りのない、サンプルの固有の真の多微生物性の直接判定を可能にする。結果として、存在する２つ以上の異なる細胞クラスに対して別個の非依存性様式で、さらなる処理（例えば、ＭＡＬＤＩなどを介した同定、又はブロス微量希釈又はその他のアプローチなどを介したＡＳＴを介した同定）を実施する能力をもって、固相内で増殖したコロニーの１つ又は複数の特性に基づいて、２つ以上の異なる微生物細胞クラスの存在が同定されてもよい。いくつかの例の実施形態では、所与の細胞タイプに関連する単一のコロニーが処理されてもよく、その他の例の実施形態では、所与の細胞タイプからの２つ以上のコロニーがプールされ処理されてもよい。
固相増殖培地上に形成されたコロニーの増殖は、その上で分離された微生物細胞懸濁液の分布に続いて、１つ又は複数の検出様式に従ってモニターされてもよい。一例の実装形態では、光学的検出を用いて、１つ又は複数の微生物細胞コロニーの増殖がモニターされてもよい。例えば、一例の実装形態では、カメラを用いて、固相増殖培地の少なくとも一部が画像化されてもよい。別の例の実装形態では、画像化素子の不在下で光検出器のアレイを用いて、１つ又は複数の微生物細胞コロニーの画像が取得されてもよく、コロニーに関連する増殖表面は、光検出器のアレイに十分に近接して配置され、その照明時にその上に画像を形成する。光学的システムの視野が固相増殖培地の空間的広がりよりも小さい実装形態では、固相増殖培地の表面全体又はその所望のサブセットの光学的照合を容易にするために、光学的システムが固相増殖培地に対して走査されてもよく、又は逆もまた然りである。
画像は、既知の画像処理アルゴリズムを用いて処理され、微小コロニーを識別し、任意選択的に、同定された微小コロニーの１つ又は複数の次元測定値が推定されてもよい。例えば、ＩｍａｇｅＪ／Ｆｉｊｉプログラムなどの公的に利用可能なフトウェアが用いられてもよい。一例の方法では、画像をグレースケール画像に変換した後、強度レベルのヒストグラム分析に基づいて、Ｐｈａｎｓａｌｋａｒ法に従って局所適応画像閾値を適用することによって、グレースケール画像が二値化されてもよい。その後、微小コロニー同定のために画像をセグメントに分割する寸法拘束があるＰｈａｎｓａｌｋａｒ法に従って、適応画像セグメンテーションが用いられてもよい。次に、同定されたセグメントの任意選択的なさらなる分析を用いて、微小コロニーに関連する関心のある測定基準（例えば、真円度、面積、長軸、及び短軸）が判定され得る。偏りのない方法で閾値を計算するために用いられ得る、多数の異なる例のアルゴリズムがある。Ｐｈａｎｓａｌｋａｒ閾値法は、低コントラスト画像のために最適化されたＳａｕｖｏｌａの閾値法の変法である［Ｐｈａｎｓａｌｓｋａｒ，Ｎ；Ｍｏｒｅ，Ｓ ＆ Ｓａｂａｌｅ，Ａ ｅｔ ａｌ．（２０１１），“Ａｄａｐｔｉｖｅ ｌｏｃａｌ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉ ｉｎ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｓｔａｉｎｅｄ ｃｙｔｏｌｏｇｙ ｉｍａｇｅｓ．”，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｉｇｎａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（ＩＣＣＳＰ）：２１８－２２０，ｄｏｉ：１０．１１０９／ＩＣＣＳＰ．２０１１．５７３９３０５］。その他の例の方法としては、Ｂｅｒｎｓｅｎ、Ｃｏｎｔｒａｓｔ、Ｍｅａｎ、Ｍｅｄｉａｎ、ＭｉｄＧｒｅｙ、Ｎｉｂｌａｃｋ、Ｏｔｓｕ、及びＳａｕｖｏｌａの方法が挙げられる。
一例の実施形態では、微小コロニーの微生物細胞を（例えば、画像処理又はラマン信号又は蛍光信号などの１つ又は複数の光信号の検出を介して）照会し、固相増殖培地上で増殖している１つ又は複数のコロニーの微生物細胞が、２つ以上の微生物細胞クラスに従って分類されてもよい。クラスのこの判定は、より高い信頼性／精度又はより大きなクラスのセットのいずれかを有する引き続く分類様式がその後実行されるときに、「推定的同定」又は「推定的分類」と称されてもよい。細胞のクラスは、コロニー形態学又はその他の技術に基づいて判定されてもよいことが理解されるであろう。
例えば、上述したように、固相増殖培地に、例えば、欧州特許出願第１０８８８９６Ａ２号明細書に記載されているように、コロニーの特異的又は非特異的な染色（例えば、検出可能なスペクトルの特徴又はシグネチャ）を生じる変化をもたらす発色性又は蛍光性の基質が提供されてもよい。
代案としては、コロニーを透過する単色光の散乱パターンが、例えば、米国特許第８，７８７，６３３号明細書及び国際公開第２０１６／１６２１３２号パンフレットに記載される方法に従って、属及び種のレベル、場合によっては血液型亜型のレベルまで分類するために使用され得る。例えば、微小コロニー内の微生物細胞の推定的同定は、目標微小コロニーをコヒーレント光のビームに曝露させ、微小コロニーによる光の回折に起因する回折パターンをモニターし、モニターされた回折パターン及び参照回折パターンを処理して、微小コロニーの微生物細胞に関連する分類尺度を判定することによって実施されてもよい。
少なくとも真菌対細菌及び／又はグラム陰性細菌対グラム陽性細菌などの幅広いクラスに対する分類尺度の判定は、抗微生物剤感受性試験の前に、より完全な種レベルの微生物同定試験が開始又は実施されていない場合（例えば、時間又は費用の節約、コロニーの不足などの理由で）に、薬剤－バグの選択（例えば、グラム状態に基づいた適切な試験抗微生物剤のセットの選択）のために用いられてもよい。いくつかの例の実施形態では、細胞タイプ同定を助けて微生物細胞クラスの推定的同定を作製するのに処理され得る、ハイパースペクトル画像セットを収集するために、イメージングが複数の波長で実施されてもよい。
上述したように、本推定的同定又は推定的分類ステップは、細胞採取前に、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、真菌などの細胞クラス、及び任意選択的に、１つ又は複数の種を包含する亜綱への、微生物細胞の分類をもたらしてもよい。一般的なグラム染色試験は、推定的同定の一例である。微小コロニーの場合、ＡＳＴなどの下流アッセイは、生存能力がある、損なわれていない細胞を必要とするため、非破壊的で試薬のない方法が好ましい。
非破壊的で試薬のない（標識／マーカーフリー）方法には、蛍光及び弾性及び非弾性散乱に基づく方法をはじめとする、光学的方法がある。ラマン（ミクロ）分光法は、非弾性散乱の一例であり、明視野及び暗視野顕微鏡法の組み合わせ又はコロニーからのレーザー回折は、弾性散乱のカテゴリーに属する。少なくとも予備的な微生物細胞クラスの判定を得るための別の例の光学的様式は、フーリエ変換赤外顕微鏡法である。病原性微生物細胞クラスを区別するための基本的な機序としては、細胞壁組成、細胞形状、及び細胞運動性をはじめとするが、これらに限定されるものではない、それらの特徴的な属性に関連する。この後者の属性は、微小コロニー全体の細胞の種特異的なパッキングをもたらす。
微生物の分類のために散乱パターンを採用する場合、例えば、微生物細胞の参考株の増殖のグラウンドトルース画像のライブラリーを使用して訓練された、畳み込みニューラルネットワーク又はそのバリエーションを用いて、所与の微生物細胞コロニーが同定されてもよい。画像のライブラリーは、様々な既知の増殖時間における参考株の画像を含んでもよい。例えば、未知のサンプルからのコロニーの増殖中の所与の時点で、所与の時間（又はそれに関連する時間窓内）に対応する画像データを使用して訓練された適切なニューラルネットワークが使用されてもよいように、参考株のコロニー増殖中の異なる時点からの画像を使用して複数のニューラルネットワークが別々に訓練されてもてもよい。代案としては、単一のニューラルネットワークは、異なる時点での異なる参照株からの画像を使用して訓練されてもよい。
固相増殖培地上で増殖したコロニーの光学イメージングを伴う一例の実施形態では、直接的又は間接的に測定されたコロニーの寸法又はサイズが、任意選択的に所定の画像化されたコロニーのより多くの特性（コロニー内の微生物細胞のタイプ；例えば、属、科、種、又は株など）と共に用いられて、コロニー内の微生物細胞の数が推定され及び／又は抗微生物剤感受性試験などであるが、これに限定されない下流用途のために、インキュベーションを終了してコロニーを採取し得る時期が判定される。この判定は、例えば、所与の数の対照、又は例えば、ＭＡＬＤＩを介した同定を容易にするのに十分な数の微生物細胞を用いて、所与の濃度数で、所与の数のバグ－薬物の組み合わせに対する抗微生物剤感受性試験を容易にするのに必要な、微生物細胞の最小数に基づいてもよい。いくつかの例の実施形態では、検出されたコロニーは、１ｍｍ未満、５００ミクロン未満、２５０ミクロン未満、２００ミクロン未満、１５０ミクロン未満、１００ミクロン未満、又は５０ミクロン未満のサイズで採取されてもよい。
一般に、微生物細胞の所望の数を達成するまでの適切な増殖時間の判定は、細胞タイプ（例えば、属、科、種、株）及び下流用途に応じて変動するであろう。微生物細胞タイプと、引き続く試験に十分な細胞数に達するまでの時間との関係は、ルックアップ表に従って確立されてもよい。例えば、自動システムでは光学的画像処理が用いられて、所与のコロニーに関連する細胞のクラス（例えば、推測又は推定された微生物種）が判定され、次に予め定められた関連性（例えば、ルックアップ表又は所定の機能的関係）が用いられて、例えば、引き続く処理のために十分な数の微生物細胞が１つ又は複数のコロニーに存在する、又は例えば、引き続く処理のために十分な数の微生物細胞が１つ又は複数のコロニー内に存在する、コロニーの適切なサイズ測定値（例えば、半径又は他の空間的測定値）が存在する、適切な時点が判定されてもよい。いくつかの例の実施形態では、十分な数の微生物細胞がコロニー内に存在する時点を推定するために、微生物細胞クラスがコロニーサイズの測定値と時間の双方が関与する複数の基準と関連付けられてもよい。
全血サンプルから直接得られた微生物細胞に基づく微小コロニー形成の動的な性質の一例を例示するために、４ｍＬの全血サンプルに３０００ＣＦＵのプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）細胞がスパイクされ、以下の実施例５に記載される方法に従って処理された。得られた細胞懸濁液の１μＬが４枚の寒天プレートのそれぞれに分注され、直径約５ｍｍの円形領域に自然に広がり、これは以降「ミニ培養」領域（ＭＣＲ）と称される。得られたＭＣＲの一部の画像が図６に提示される。インキュベーション開始後３時間及び４時間目に画像を目視検査することによって、矢印で示されるいくつかの微小コロニーが観察され得た。しかし、例えば、２時間以内などのより短いインキュベーション時間で微小コロニーを検出するために、画像を分析し、矢印でマークされた微小コロニーが背景から区別されてもよい。
微小コロニーモニタリングの一例の方法を以下に説明する。図７から観察されるように、異なる時点（図に示されるように、播種後０、２、３及び４時間）で取得されたイメージングデータを位置合わせするために、剛体変換拘束を伴う２Ｄ－２Ｄレジストレーション（並進及び回転を用いる）が実施された。ｔ０＝０時間の画像と、それ以降の各画像（ｔ２＝２時間、ｔ３＝３時間、ｔ４＝４時間）との間の対応する強度特徴点は、キーポイント検出器ＳＵＲＦを用いて自動的に同定され、ｔ０に対する撮影日の位置合わせに用いられた。ｔ０に存在する強度の特徴を背景として分類する一方、それ以降の画像（細胞／バグ）に出現する強度の特徴は前景として分類した。所与の個々の微小コロニーの位置は、連続的画像でマーキングされている。
特徴ベース、強度ベース、及び非剛体レジストレーションアルゴリズムをはじめとするが、これらに限定されるものではない多種多様なレジストレーション法を使用して、画像レジストレーションを実行できることが理解されるであろう。適切な機能ベースのアルゴリズムの例としては、ＳＵＲＦ（Ｓｐｅｅｄｅｄ Ｕｐ Ｒｏｂｕｓｔ Ｆｅａｔｕｒｅｓ）及びＳＩＦＴ（Ｓｃａｌｅ－ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｆｅａｔｕｒｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）法が挙げられる。
一例の実装形態では、画像レジストレーションは、以下のように強度ベースのアルゴリズムを介して実施されてもよい。アルゴリズムは、動画（後の時点で取得された画像）が固定／参照画像（後の時点で取得された画像）に空間的にレジストレーションされるように変換する。設定に基づいて、実施される変換のタイプは「リジッド」又は「アフィン」として定義された。簡略化された定義によれば、アルゴリズムは内部で多重解像度ピラミッドをメモリ内に構築し（ユーザー指定のピラミッドレベルで）、ピラミッドの各レベルで最適化問題を解決する。換言すれば、アルゴリズムはＮレベル（例えば、Ｎ＝５）を有する画像ピラミッドを構築する。各ピラミッドレベルで、画像の寸法は２分の１に減少する。最適化はピラミッドの最も粗いレベルで始まり、ユーザーが許可した反復回数に達するまで、又はオプティマイザーが収束して現在の変換推定値を次のピラミッドレベルで精緻化しようとするまで継続される。
背景を判定することで、微小コロニーの強化された検出が可能になる。例えば、図７の場合、取得された４枚の画像間の並進及び回転のオフセットが異常に大きいにもかかわらず、インキュベーション後ｔ３＝３時間目のコロニーの同定は明確である。この方法を用いることで、完全に自動化された微小コロニー同定（陽性化までの時間、ＴＴＰの短縮）の開発、及び未染色の生きている微生物の画像シーケンスをスクリーニングするための追跡システムの開発が容易になる。この方法の堅牢性は、図９Ａ～９Ｈに示された結果に関連して、前述の背景閾値法に基づく推定値と比較して下で説明される（例えば、その半径Ｒ＞Ｒｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝Ｒｂａｃｋ．ａｖ＋ｎ＊ｓｄの場合に、スポットを微小コロニーと宣言する）。
本例のタイムラプスイメージング法は、同じシーン（又はほぼ同じシーン）の一連の画像を異なる時点で撮影することで、動的な変化を捉え、静的な構成要素は背景として分類して除去し得る、半定量的イメージング技術である。微小コロニーの動的プロファイリングの現在のアプローチは、静的な背景と照明の仮定に依存している。しかし、このような技術は、残骸又は固体増殖培地の表面のスペクトル的又は空間的特徴が静的でない場合、多くの処理変動を被ってもよい。第１に、画像の取得中に、表面が実質的に老化しない（残骸の寸法の変化とその転置に関連する固体増殖培地の表面からの液体の蒸発）一方で、微小コロニーが生存し続けることを可能にする適切な環境が提供されるべきであることに留意されたい。これらの問題に対処するには、いくつかある要因の中で、特に温度と湿度を制御することが、インキュベーターの設計に有益であり得る。図１５Ａに提示される一例の実施形態では、それを通じて画像が撮影される透明で光学的に平坦な窓を有するインキュベーター内に、１つ又は複数の増殖モジュールが配置されてもよい。別の実施形態では、対物レンズ及び増殖モジュールは、湿度と温度が制御されたインキュベーター内に配置されてもよい。
微小コロニーの迅速で直接的な形成及び検出のための本例の方法の性能を特性決定するために、血流感染に見られる一般的な病原体の２つの特徴、すなわち（ｉ）遅延時間及び（ｉｉ）増殖速度が測定された。上記の図１４の方法とタイプ３血液溶解試薬を用いて、血液サンプルからのこれらの病原体の回収率もまた測定された。
固相増殖培地（ゲル）上の増殖速度は、下の実施例７のステップに従って判定された。プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）について図８Ａに提示されるように、ＭＣＲ中でユニットを形成するコロニーの数を数え、その対数（Ｌｏｇ（ＣＦＵ））をインキュベーション時間に対してプロットした。この曲線の勾配、すなわち、０．９７を用いて、増殖速度＝勾配／対数（２）＝３．２３サイクル／時間の関係によって、増殖速度が計算される。別の例として、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）（ＳＥ）の増殖速度を測定し、測定されたｖ（Ｌｏｇ（ＣＦＵ））対インキュベーションが図８Ｂの時間プロットに示される。計算された増殖速度は、２．４サイクル／時間である。この増殖速度は、ＣＭＯＳチップ上でインキュベートされたスタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の測定された増殖速度よりも約１．５倍高い［Ｊｕｎｇ，Ｊａｅ Ｈｅｅ，ａｎｄ Ｊｕｎｇ Ｅｕｎ Ｌｅｅ．“Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｍｉｃｒｏｃｏｌｏｎｙ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｏｎ－ｃｈｉｐ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．”Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ ６（２０１６）：２１４７３．］。ストック溶液の調製方法によっては、播種された微生物細胞は、微小コロニーへの増殖前に誘導期を通過してもよい。例えば、図８Ｃから観察されるように、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）細胞は、約２時間の遅延時間を示す。片対数スケールの線形傾向は、ほとんどの細胞が分裂し得るようにコロニー内の細胞数が十分に少ない間は、継続すると予想される。微小コロニーの内側領域で増殖スペースを奪われた細胞の数が、周辺部の細胞の数を上回ると、微小コロニー全体の増殖速度が低下すると予想される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）について図８Ｄに示されるように、本発明者らは、１０６個もの細胞を含有する微小コロニーで、このような偏差を観察していない。したがって、増殖速度及び遅延時間のデータを用いて、所望の細胞数に到達するのに必要な時間を推定することは正当化されるようである。
図９Ａ～９Ｆは、血流感染で典型的に遭遇する病原性微生物の大部分を構成する微生物細胞種のコレクションについて、微小コロニー検出によって測定された、時間差及び播種された細胞の増殖速度を提示する。この表には、測定された細胞回収率、すなわち、生存能力を維持しながら、したがって、実施例８の方法に従って判定されるコロニーを形成できる、スパイクされた血液サンプルから成功裏に分離されて細胞懸濁液に再懸濁された、細胞の割合もまた含まれる。さらに、この表は、固相増殖培地（「固相」）上でのコロニーの増殖を伴う本例の増殖方法について、微小コロニーが背景と比較して識別可能になる時間によって判定される、推定された陽性化までの時間（ＴＴＰ）もまた示す（上述の例の方法を使用する）。
ＴＴＰは、検出方法とそれに伴う分析の感度、及び背景の影響を受ける。上述の単純なサイズ選択法を採用して、全血サンプルから分離された微生物細胞から増殖した微小コロニーの存在を照会する最も単純な状況では、ＴＴＰは以下のように推定され得る。閾値サイズＲｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝Ｒｂａｃｋ．ａｖ＋ｎ＊ｓｔｄは、図３Ｃの２回洗浄の場合のパラメータＲｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝２＋３＊１．５＝６．５μｍを用いて計算された。閉鎖パッキングで、平均細菌サイズが１μｍ２という最悪の状況を仮定すると、半径Ｒｔｈｒｅｓｈｏｌｄの円内の細胞数は約１２０ＣＦＵとなる。したがって、ＴＴＰ＝Ｔｌａｇ＋７／増殖速度である。
真菌種の場合、細菌に比べてサイズが大きいため、微小コロニーを検出して陽性と判定するには、二分裂をもたらす１回の分裂で十分であってもよい。これは、全血から分離された微生物細胞を含有する微生物細胞懸濁液の１μＬがその上に分注されている、血液寒天プレートの断面のタイムラプス画像を示す図１０で例示される。図９Ｇ及び９Ｈの増殖速度データから計算され得るように、約４時間のインキュベーション後、細胞数は約３倍に増加した。真菌細胞の増殖は、２枚の写真を比較すると容易に認識される。したがって、真菌細胞の大規模な分布では、陽性化までの時間は、ＴＴＰ＝Ｔｌａｇ＋１／増殖速度であると結論付けられる。細胞数が一桁である典型的な血液サンプルでは、ポアソン統計が無視できない。したがって、式は、ＴＴＰ＝Ｔｌａｇ＋ｎ／増殖速度（式中、ｎは１より大きい）で置き換えなくてはならない。一例の実装形態では、ｎ＝２という値が採用される。
特徴的な増殖速度は、プランクトン状態での増殖速度と同等である。この一致を例示するために、液体培養中の増殖速度は、以下に記載されるように実施された実験から推定された。異なる株の微生物細胞が５ＣＦＵ／ｍＬの濃度でスパイクされた１０ｍＬの全血サンプルが、それぞれのＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＦＡ Ｐｌｕｓ培養ボトルに接種され、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＶＩＲＴＵＯ内でインキュベートされた。インキュベーターが陽性を示した後、１ｍＬのアリコートが各ボトルから抜取られ、連続希釈されて、ＣＦＵの数を判定するためにプレーティングされた。遅延時間を無視し、増殖速度が一定であると仮定して、プレートカウントによる陽性での初期スパイク濃度比と最終細菌濃度、及び陽性化までの時間（ＴＴＰ）に基づいて増殖速度が推定された。図９Ａ～９Ｈから観察されるように、固相増殖培地上及び液相増殖培地中の増殖速度は類似している。しかし、ＴＴＰ値によって明確に理解され得るように、固相は、微小コロニーの局所的な性質の結果として有利であり、はるかに早い時点での固相上の検出を容易にする。例えば、本微小コロニーの例の方法によれば、ほとんどの細菌種はプレーティング後約３時間で容易に検出されるが、培養ボトル内のインキュベーションのＴＴＰは、典型的には１０時間を超える。
図９Ａ～９Ｇはまた、細菌細胞が１０４及び１０５個の細胞を有する微小コロニーを生じるのに要する時間の推定値も含む。下で考察されるように、これらの量は、引き続く微生物同定及び／又は抗微生物剤感受性試験の実施に関係がある。
ここで、従来法でコロニー状に増殖した微生物細胞を使用して引き続く試験を実施する例を考察すると、ＶＩＴＥＫ（登録商標）－ＭＳ［ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ］で微生物の同定を実施するのに必要な細菌細胞と真菌細胞の数は、ＭＡＬＤＩスポットあたり、それぞれ約１０５と１０４ＣＦＵであることが分かる。本実施例の方法に従って固相増殖培地上で増殖させたコロニーの実験観察に基づくと、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの増殖の早い細菌は、約５時間で所望の数である１０４～１０５細胞に達し得る一方、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）などの増殖の遅い細菌細胞では約７時間かかる。真菌種では、所望の細胞数に達するまでのインキュベーション時間は、１０時間以上にわたり得る。
コロニー増殖を検出するために光学的イメージングが用いられているいくつかの例の実施形態では、引き続く試験（例えば、ＭＡＬＤＩ又は表現型ＡＳＴ）のために十分な数の微生物細胞に達するために、複数のコロニーからの微生物細胞が組み合されてもよい。例えば、約１０４ＣＦＵが利用可能になる時点を判定するための、コロニー増殖の光学的イメージングが関与する前述の例の実装形態では、１０個のコロニーが存在する（及び光学的画像処理によって単一タイプの微生物細胞に関連していると判定される）場合、コロニーあたり１０３ＣＦＵのみが必要になるため、増殖に必要な時間がｌｏｇ２１０（＝３．３）倍増サイクル分、短縮される。一般に、理論による制限は望まないが、複数の増殖するコロニーからの微生物細胞がモニターされ、所定の数の微生物細胞を提供するために組み合わされる実施形態では、単一コロニーが用いられる場合と比較して、増殖のための持続時間がｌｏｇ２Ｎ（式中、Ｎはコロニーの数である）倍増サイクル分、短縮される。複数のコロニーの少なくともいくつかが異なる微生物細胞タイプに関係する多微生物の場合、細胞タイプに依存する増殖時間と、異なる細胞タイプ毎のコロニー数の双方のために、引き続く試験に十分な数の微生物細胞を（プールされたコロニーを使用して）達成するのに必要な時間は、細胞タイプ間で著しく異なってもよい。この依存性は、例えば、ルックアップ表の形式で規定されてもよく、又は例えば、ルックアップ表に保存されているセルタイプ固有のパラメータに基づいて、コロニー数の依存性を規定する数学的関係の形式で、規定されていてもよい。
上述したように、液体培地中で抗微生物剤と共に細胞をインキュベートして抗微生物剤感受性試験を実施するためには、最小の細菌細胞数又は濃度範囲が必要になることもある。この要件は、固相増殖培地上で抗微生物剤感受性試験を実施する場合は、より緩和されてもよく、これについては以下でさらに詳細に説明される。この後者の場合、表面上に接種される微生物細胞懸濁液の液体内容物のアリコートは、少なくとも部分的にゲルネットワークに吸収され、細菌細胞を互いに近接させて残す。したがって、コロニーの最小細胞含有量は、必要な濃度範囲及びコロニーが懸濁される液体の体積によって予め決定されてもよい。
コロニー細胞含有量の数え上げ（例えば、約１０３～１０４ＣＦＵレベルなど、十分なコロニーサイズ及び／又は細胞数が達成されたかどうかの判定）は、異なるアプローチによって達成され得る。一例の実装形態では、コロニーに関連する１つ又は複数の幾何学的又は光学的特性（画像セグメンテーションなどの画像処理方法から判定される、半径／面積又は散乱／反射／透過強度などであるが、これらに限定されるものではない）を、１つ又は複数の幾何学的特性を微生物細胞数に関連付ける参照データとの比較に基づいて、引き続く処理のために十分な数の微生物細胞がコロニー内に存在するかどうかを判定するために処理されてもよい。別の例では、ニューラルネットワークを用いて、所与の微生物細胞コロニーのイメージングに基づいて、引き続く試験のために十分な数の微生物細胞がコロニー内に存在するかどうかが判定されてもよく、ニューラルネットワークは、既知の関連する細胞数を有する参照株の画像（又は例えば、所与のタイプの引き続く試験のために十分な数の微生物細胞がコロニー内に存在するかどうかの既知のバイナリ判定）に基づいて訓練される。いくつかの例の実装形態では、所与のコロニー内に十分な数の微生物細胞が存在するかどうかの判定は、部分的には、コロニーの１つ又は複数の分類学的クラスの検出又は推定されたアイデンティティ（例えば、グラム状態、属、科、種、株など）に基づいて判定されてもよい。
以下の図１１Ｃ及び１１Ｄに示されるように、選択されたサイズ閾値（例えば、直径閾値）を用いて、多種多様な細胞クラス（例えば、種）に対して十分な数の微生物細胞が確実に採取されるようにできてもよい。例えば、図１１Ｃ及び図１１Ｄに示されるように、直径が７０ミクロンの閾値に達した後、直径が１００ミクロンに達する前に（又は代案としては、少なくとも６５ミクロンであるが直径１００ミクロンに達する前に、少なくとも７５ミクロンであるが直径１００ミクロンに達する前に、少なくとも８０ミクロンであるが直径１００ミクロンに達する前に、少なくとも８５ミクロンであるが直径１００ミクロンに達する前に、少なくとも９０ミクロンであるが直径１００ミクロンに達する前に、又は少なくとも１００ミクロンであるが直径１２０ミクロンに達する前に）コロニーを採取するという条件で、広範な微生物細胞種にわたり少なくとも１０３個の微生物細胞が得られ得る。同様に、図１１Ｃ及び図１１Ｄに示されるように、直径が１５０ミクロンの閾値に達した後、直径が２００ミクロンに達する前に（又は代案としては、少なくとも１６５ミクロンであるが直径２００ミクロンに達する前に、少なくとも１７５ミクロンであるが直径２００ミクロンに達する前に、少なくとも１８０ミクロンであるが直径２００ミクロンに達する前に、少なくとも１８５ミクロンであるが直径２００ミクロンに達する前に、少なくとも１９０ミクロンであるが直径２００ミクロンに達する前に、又は少なくとも２００ミクロンであるが直径２５０ミクロンに達する前に）コロニーを採取するという条件で、広範な微生物細胞種にわたり少なくとも１０５個の微生物細胞が得られ得る。本例の閾値実施形態は直径に言及しているが、半径又は面積などのその他のサイズ測定値が、代替法で用いられてもよいことが理解されるであろう。
光学的イメージングは、微生物細胞の増殖をモニターするための一例の検出様式であり、電気インピーダンス、微生物細胞増殖に関連する揮発性有機化合物の検出、又は熱量測定などのその他の検出様式が、代替法で用いられてもよいことが理解されるであろう。
上述したように、十分な量の微生物細胞を有する１つ又は複数のコロニーの存在を判定した後、微生物細胞を用いて１つ又は複数の引き続くアッセイが実施されてもよい。微生物細胞は、引き続く試験を実施する前に、固相増殖培地から採取（除去）されてもよい。例えば、検出されたコロニーの１つ又は複数が採取され（例えば、手動採取、自動採取、又はそれらの組み合わせを使用した採取）、それらが引き続く試験に適した形態で提供されるように、引き続いて処理されてもよい。例えば、いくつかの例の実装形態では、採取された微生物細胞は、希釈又は濃縮されてもよい。いくつかの例の実装形態では、１つ又は複数のアッセイが実施される前に、採取された微生物細胞が液体と組み合わされて懸濁液が形成されてもよく、任意選択的に希釈又は濃縮されて、任意選択的に等分されてもよい。
一例の実施形態では、コロニーの位置を特定した後、コロニーは、生検パンチ、接種ループ、又は滅菌綿棒によって手動で採取されてもよい。ＭＡＬＤＩによる同定などのいくつかの用途では、除去されたコロニーは同定スライド上に配置され得る。抗微生物剤感受性試験などのいくつかの用途では、除去されたコロニーは生理食塩水などの適切な培地に懸濁されてもよい。
コロニーの位置が特定されている別の例の実施形態では、コロニーはロボットで採取されてもよい。例えば、生検パンチと同様の円形の器具を使用して、固体増殖培地の小さなセクションが微小コロニーと共に除去されてもよい。米国特許公開第２０１８／０２８４１４６号明細書は、培養プレートを保持するためのプラットフォームと、プレートからコロニーを摘出するために降下させ得るピックツールを有する可動ロボットアームとを備えたデバイスを記載している。デバイスの別の部分には、懸濁液を含有する滅菌チューブが収納されている。ピックツールは、コロニーの一部を摘出した後、摘出されたコロニーを移動させ、滅菌チューブに移す。任意選択的に、ツールは、採取された微生物細胞をより効率的に放出するために、超音波処理器（超音波振動子）又はボルテックスミキサーを装備していてもよい。次に、溶液の濁度が測定され、抗微生物剤感受性試験などの引き続く微生物学試験に適する所定の値に、細胞濃度が希釈されてもよい。
いくつかの例の実施形態では、１つ又は複数のコロニーからの細胞、又は前述の方法に従って固相増殖培地上に形成された細胞が、ＡＳＴを実施するために用いられ得る。ＡＳＴを実施する例の方法としては、ブロス微量希釈法、ディスク拡散法、及びＫｉｒｂｙ－Ｂａｕｅｒ法及びｅ－Ｔｅｓｔなどの寒天拡散法が挙げられる。このような方法は、抗微生物パネルの最初の選択のための推定（グラム状態及び真菌対細菌判定などの高レベル）微生物同定から恩恵を受けてもよい。
図１１Ａは、上記の方法に従って増殖されたコロニー又は微小コロニーから採取された微生物細胞に基づいて、ＡＳＴを実施する一例の方法を説明するフローチャートを提供する。細胞の単離及び播種は、最初に、微生物細胞がそれらの生存能力を維持しながら全血サンプルから分離され、増殖モジュール内に封入された固相増殖培地と接触させられる、上記の例の実施形態に従って実施される。上記のように、このプロセスは、特に微生物細胞濃度が非常に低いことが知られている全血サンプルなどのサンプルについて、汚染の可能性を最小限に抑えるために、閉鎖様式で有利に実施される。次に、増殖モジュールはインキュベーション／イメージングデバイス内に収容され（任意選択的に、増殖モジュールは統合流体カートリッジの残りの部分から分離される）、そこで増殖モジュールはインキュベートされて、検出可能な微小コロニーがモニターされ、例えば、４時間未満の時間で陽性／陰性が判定される。次に、検出された微小コロニーがインキュベートされ、引き続く分析ステップ（例えば、同定及び／又は抗微生物剤感受性試験）のために十分に高い細胞数を達成するために、さらなる増殖が促進されてもよい。例えば、微小コロニーは、それらが、抗微生物剤感受性試験（ＡＳＴ）及びＭＡＬＤＩによる細胞同定を実施するのに十分である、１０４細胞を超え、１０５細胞を超える細胞含有量にそれぞれ到達したと判定されるまでインキュベートされてもよい。以下に説明する例の方法に従ってＡＳＴが実施される一例の実施形態では、採取された微小コロニー内の微生物細胞の最小数は、１０３～１０５の範囲内になるように設定されてもよい。したがって、所与の微小コロニーは、その推定された細胞含有量が少なくとも１０３に達した後に採取されてもよい。一例の実装形態では、この判定は、顕微鏡を介して微小コロニーのサイズを推定し、それに応じて微小コロニー細胞含有量の下限を推定することによって実施される。微小コロニー採取のこの例の方法を例示するために、以下に記載されるように、一連の実験が実施された。
図１１Ｂは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の例（実施例７に記載された方法に従って得られた）について、微小コロニーの直径の細胞含有量に対する依存性の測定値をプロットする。この散布図にべき乗則の傾向線が適合され、細胞含有量が１０３及び１０５細胞である微小コロニーの平均直径は、それぞれ６０μｍ及び１７０μｍと計算された。同様のアプローチに従って、１７のよく見られる病原性グラム陽性及びグラム陰性細菌について、１０３及び１０５ＣＦＵの細胞含有量における平均直径が計算され、結果はそれぞれ図１１Ｃ及び図１１Ｄに示される。この情報によると、直径が６５μｍに達した時点で細菌の微小コロニーが採取された場合、そのアイデンティティにかかわらず、微小コロニー内の微生物細胞の数は、１０３～１０５ＣＦＵの範囲内である可能性が高い。
上で説明したように、微生物細胞のクラスの測定値を判定するために、採取前に、１つ又は複数の検出された微小コロニーの細胞が非侵襲的に照会されてもよい（例えば、グラム状態の判定、細菌細胞対真菌細胞の判定、及び／又は予備的な種の推定）。
次に、関連するクラスを有する検出された微小コロニーが採取され、増殖チャンバーから移され、緩衝液に再懸濁されて微生物細胞懸濁液が作製され、抗微生物剤感受性試験を実施するために使用されてもよい。例えば、下で詳述されるように、微生物細胞懸濁液のアリコート（例えば、約１μＬ）が、固相増殖培地を含有する複数のマイクロウェル上に分注されてもよく、マイクロウェルは、厚さが０．５～１０ｍｍ（又は０．５～３ｍｍ）の間の範囲、ゲル体積が２０～１５０μｌ（又は２０～６０ｕｌ）の間の範囲のゲルを含有する。次に、マイクロウェル内のゲル表面が、その上に配置された（被覆及び／又は含浸された）１つ又は複数の抗微生物剤の様々な濃度を有するそれぞれの固体支持体と接触されてもよい。抗微生物剤はマイクロウェル内に迅速に拡散し、マイクロウェルの表面上に保持された微生物細胞の増殖がモニターされ、例えば、最小阻害濃度（ＭＩＣ）が判定されてもよい。例えば、固相増殖培地の低体積と小さな空間的な広がり、及び抗微生物剤の迅速な拡散（例えば、１～２時間以内に所定の濃度又は濃度範囲（ｒａｇｅ）が達成される）のために、どのマイクロウェルが微生物細胞増殖をサポートし、どのマイクロウェルが微生物細胞増殖阻害するかの判定は、各抗微生物剤の最小阻害濃度（ＭＩＣ）の判定を可能にする。
増殖モジュール内で検出された第２の微小コロニーは、第１の採取された微小コロニーに対してＡＳＴを実施するのと並行して、さらにインキュベートされてもよく、引き続いて、例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法などの二次的な（例えば、従来の）同定様式を採用することによって、微生物細胞同定を実施するための最小細胞数（例えば、１０５細胞を超える）を含むと判定された後に採取される。二次同定様式は、第１の微小コロニーから微生物細胞を採取する前に用いられた最初の分類様式よりも、より高い精度、より高い信頼水準、及び／又はより多くの可能なクラスのセットを有してもよい。図１１Ａに示されるように、第２の微小コロニーの採取、及び第２の同定ステップは、第１の微小コロニーで実施される抗微生物剤感受性試験と同時に実施されてもよい。多くの場合、このアプローチにより、ＡＳＴ結果の前に同定結果が利用可能になり、同定結果がＡＳＴ結果と共に報告され解釈されるようになる。例えば、ＡＳＴ結果に基づいて抗生物質と用量を選択する場合に、同定結果、既知の種固有の限界点、及びその他の臨床的要因が使用されてもよい。
いくつかの例の実施形態では、第２の微小コロニーから微生物細胞を採取する前に、表現型対応が第１のコロニーと第２のコロニーとの間に確立されてもよい。この表現型対応は、例えば、２つの微小コロニーに関連するクラスを比較することによって、又は例えば、２つの微小コロニーから検出された光学的画像又は光学信号を比較することによって、確立されてもよい。
上述したように、いくつかの例の実施形態では、ＡＳＴは、任意選択的に、コロニー微生物細胞クラスの少なくとも推定上の同定又は分類の実施後に、１つ又は複数のコロニーから採取された微生物細胞に対して実施されてもよい（場合によっては、例えば、多種多様な微生物の細胞クラスにわたり、最小の細胞数を有することが知られているサイズに達した後にコロニーが採取される場合、及び例えば、グラム陽性及びグラム陰性細菌の双方のセットをカバーするのに十分に広範なパネルなどの広範なＡＳＴパネルを採用した場合など、推定同定が必要でないこともある）。次に、採取されたコロニー（例えば、手動採取、自動採取、又はそれらの組み合わせを使用して得られる）が液体に懸濁されて、懸濁液（任意選択的に希釈又は濃縮される）が形成され、分注されて、異なる濃度の抗生物質と接触されてもよい。抗生物質（及び任意選択的にその濃度）は、微生物細胞のアイデンティティに基づいて選択されてもよい。例えば、分注された微生物細胞は、選択された抗生物質の３つの異なる濃度と接触されてもよく、微生物細胞増殖は引き続いてモニターされ、感受性及び／又は耐性の尺度が判定されてもよい。その他の例の実施形態では、追加的な濃度の抗生物質が用いられてもよい。
微生物細胞分離及び引き続く液体増殖培地中のインキュベーション
前述の例の実施形態の多くが、分離された微生物細胞と固相増殖培地との接触を介してコロニー増殖を促進する方法に関係する一方で、別の例の実装形態では、分離された生存能力がある微生物細胞を得るための分離プロセスが実施された後、分離された生存能力がある微生物細胞（任意選択的に、１回又は複数回数の洗浄サイクルで分離された）が、液相内で増殖培地と混合され、微生物細胞の増殖を促進するのに適した環境内でインキュベートされてもよい。例えば、分離された微生物細胞を含有する懸濁液が血液培養ボトル内に導入され、従来の血液培養インキュベーションプロトコル（例えば、インキュベーター内に３７℃で保存）に従ってインキュベートされてもよい。サンプル採取前に経験的に抗生物質で治療された患者に関連するサンプルの場合、このようなアプローチは、血液培養ボトル内に抗微生物吸収剤（例えば、木炭又は樹脂）を単に含めることによってもたらされるよりも高い効率で、抗微生物剤の濃度（及び影響）の低減を促進してもよい。
一例の実装形態では、液相増殖培地は、閉鎖型カートリッジ内で分離された細胞と組み合わされてもよく、引き続いて、閉鎖型カートリッジがインキュベートされ、微生物細胞の増殖が促進されてもよい。このようなアプローチは、さもなければ、分離された細胞が外部の細胞培養容器又はデバイスに移された場合に発生し得る汚染を回避するという利点を提供する。閉鎖型カートリッジが遠心分離チャンバーを含む場合（上記の例の実施形態のように）、カートリッジが定期的に遠心分離され（インキュベーション中又はインキュベーション段階の間に）、遠心分離チャンバーの遠位領域が照会され（例えば、イメージングを介して光学的に、又は遠心分離チャンバー内に収容された内部電極（例えば、電極の円形アレイ）に基づく局所インピーダンス測定を介して電気的に）、微生物細胞の増殖がモニターされ得る。例えば、遠心分離管の遠位領域に採取された微生物細胞は、引き続く抗生物質感受性試験をサポートするのに十分な数の微生物細胞が存在するかどうかを判定するために照会されてもよい。微生物細胞の量が不十分であることが検出された場合、評価を繰り返す前に、微生物細胞が再懸濁され、所定の時間インキュベートされてもよい。
いくつかの例の方法では、生存能力がある微生物細胞は、血液培養サンプルなどの液体培養サンプルから分離されてもよい。いくつかの例の実装形態では、血液培養サンプルの陽性化を判定する前に、分離された生存能力がある及び／又は無傷の微生物細胞を得るために、血液培養サンプル（又は液相内で培養される別のサンプルタイプ）が処理されてもよい。次に、分離された微生物細胞は、ＭＡＬＤＩ同定、代謝アッセイベースの同定、及び／又は表現型抗微生物剤感受性試験などであるが、これらに限定されるものではない、もう１つの引き続くアッセイで用いられてもよい（例えば、ブロス微量希釈又は別の表現型抗微生物剤感受性試験法を介して）。一例の実施形態では、分離された微生物細胞の第１の部分は、ＭＡＬＤＩを介した微生物同定を実施するために用いられてもよく、分離された微生物細胞の第２の部分は、抗微生物剤感受性試験を実施するために用いられてもよい（例えば、微生物細胞の第１の部分を使用してＭＡＬＤＩを実施した後に）。
引き続くアッセイ処理に必要な微生物細胞の数は、一般にアッセイタイプに依存する。一般に、所定のアッセイには最低量の微生物細胞が必要であると判定されてもよい。所与のアッセイに必要な微生物細胞の量はまた、微生物細胞のタイプ（例えば、グラム状態、属、科、又は種）に依存してもよい。いくつかの例の実施形態では、分離された微生物細胞中に十分な量の微生物細胞が得られたかどうかの判定は、分離された微生物細胞に対して測定を実施することによって行われてもよい。例えば、分離された微生物細胞は懸濁されてもよく、懸濁液に対して濁度測定が実施されてもよい。代案としては、分離された細胞の量の測定値は、例えば、以下の非限定的な例の一覧から選択される様式を用いて判定されてもよい：フローサイトメトリー及び電気インピーダンス測定。分離された微生物細胞の懸濁液は、十分な検出感度を達成するために濃縮されてもよい。例えば、適切な検出感度を達成するために、濾過及び／又は遠心分離と、それに続く十分に少量の液体への再懸濁が用いられてもよい。所与の光学的検出様式に必要な濃度は、参照微生物細胞の濃縮ストックからの連続希釈アリコートに対して測定を実施することによって判定されてもよい。一例の実施形態では、光学濁度測定は、微生物細胞の濃縮懸濁液に対して行われてもよく、懸濁液は、光散乱測定に適した側壁を有するキュベット又はその他の適切な容器内で、レーザー散乱を介して測定される。
上の図９Ａ～９Ｆに記載されているように、増殖培地内の微生物細胞の増殖速度は、一般に、種又は属レベルでの微生物細胞クラスに依存するであろう。したがって、迅速な分子同定アッセイを使用する属又は種レベルでの微生物細胞クラスの初期の判定を用いて、引き続くアッセイ処理のために、又は分離された細胞から形成された増殖中の微生物細胞コロニーを採取するために、十分に大量の分離された微生物細胞を得るために、液体培養サンプルを処理する適切な時間が推定されてもよい。適切な迅速な同定アッセイの非限定的例としては、上記の例の迅速なｒＲＮＡベースの同定アッセイ、及びＳｅｐｔｉｆａｓｔアッセイ及びＴ２Ｂａｃｔｅｒｉａアッセイなどの迅速なｇＤＮＡアッセイが挙げられる。血液培養サンプルは、十分に大量の微生物細胞の存在に対応する適切な時点で、血液培養ボトルから（例えば、血液培養ボトルから適切なアリコートを得ることによって）得られてもよい。いくつかの例の実施形態では、適切な時間は、保護帯域時間（例えば、０．５時間又は１時間）及び／又は時間の標準偏差の所定倍（例えば、１又は２標準偏差）などの追加的な持続時間によって増加してもよい。
いくつかの例の実装形態では、迅速な同定アッセイが定量的であり、初期サンプル中の微生物細胞の濃度を示す（増幅中のサイクル閾値の判定などを介して）定量的測定値を提供する場合、引き続くアッセイのための所望の量の微生物細胞を得るために、定量的測定を用いて、液体培養サンプルを得るための、又は分離された細胞から形成された増殖中の微生物細胞コロニーを採取するための、適切な時間の推定が精緻化されてもよい。例えば、定量的測定値が最初の同定結果と組み合わされて、陽性化までの時間及び事前に選択された濃度に達するまでの時間などであるが、これらに限定されるものではない、微生物の増殖に関連する所与の事象の前に経過する時間の推定値を得ることができる。
統合流体カートリッジ内の微生物細胞分離の例
国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００９９２号明細書の方法に基づいて、微生物細胞の分離と濃縮を実施するための一例の自動システムが、国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１５／０５０４４９号明細書で教示される。図１２は、自動遠心分離（及び／又は洗浄）を実施するための例の統合システム４００の例証を提供する。例のシステム４００は、遠心分離のための１つ又は複数の統合流体処理カートリッジ４２０を受け取る遠心分離機４１０を含む。遠心分離機４１０は、電動ロータ４１４に接続されて統合流体処理カートリッジ４２０を受け入れるように構成されている、１つ又は複数のレセプタクル４１２を含む。カートリッジレセプタクル４１２は、例えば、実験室の遠心分離機で一般的である固定角度タイプ又はスイングバケットタイプのものあってもよい（例えば、各レセプタクル４１２は、電動ロータ４１４に枢動可能に接続されてもよい）。
カートリッジインターフェースアセンブリ（ユニット）４３０は、統合流体処理カートリッジ４２０内の流体の流れを制御するために、電動ロータ４１４が静止しているときに、統合流体処理カートリッジ４２０と取り外し可能に係合（又はインターフェース）するように構成されている。カートリッジインターフェーシングアセンブリ４３０と統合流体カートリッジとのインターフェーシングは、例えば、カートリッジインターフェーシングアセンブリと統合流体カートリッジ４２０との間の直接的なインターフェースを介して、又は例えば、遠心分離機４１０上（例えば、電動ロータ４１４又はカートリッジレセプタクル４１２上）のインターフェース（例えば、作動インターフェース）を介して、生じてもよい。
遠心分離機４１０及びカートリッジインターフェーシングアセンブリ４３０は、制御及び処理ユニット４４０を介して制御される。制御及び処理ユニット４４０は、１つ又は複数のプロセッサ４４５（例えば、ＣＰＵ／マイクロプロセッサ）、バス４４２、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）及び／又は読出し専用メモリ（ＲＯＭ）を含んでもよいメモリ４５５、１つ又は複数の内部記憶デバイス４５０（例えば、ハードディスクドライブ、コンパクトディスクドライブ、又は内部フラッシュメモリ）、電源４８０、１つ又は複数の（ｏｎｅ ｍｏｒｅ）通信インターフェース４６０、外部記憶デバイス１６５、ディスプレイ４７０、及び様々な入力／出力デバイス及び／又はインターフェース４７５（例えば、受信機；送信機；スピーカー；ディスプレイ；出力ポート；キーボード、キーパッド、マウス、位置追跡スタイラス、位置追跡プローブ、フットスイッチ、及び／又は音声コマンド捕捉するためのマイクロフォンなどのユーザー入力デバイス）を含んでもよい。
国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１５／０５０４４９号明細書の教示に従い、図１３Ａ～１３Ｅの例の概略図を参照して、全血から微生物細胞を自動分離及び洗浄し、濃縮懸濁液を得るのに適した要素を組み込んだ、一例の統合流体処理カートリッジ５００が示される。例の統合流体処理カートリッジは、サンプル移送レセプタクル５０１、マクロ流体遠心分離チャンバー５０２、希釈チャンバー５０４、及び上清チャンバー５０６を含む。希釈液チャンバー５０４は、洗浄緩衝液５０５で予備充填され、遮断弁５１２を備えた導管５１０を介してマクロ流体遠心分離チャンバー５０２に流体的に接続され、大気への通気孔５１５を含み、さもなければ閉じている。上清チャンバー５０６は、遮断弁５１３を備えた導管５１１を介してマクロ流体遠心分離チャンバー５０２に流体的に接続され、大気への通気孔５１６を含み、さもなければ上清チャンバー５０６は閉じている。マクロ流体遠心分離チャンバー５０２は、円錐形又は丸底形状と滑らかな内表面を有して、遠心分離中の微生物細胞の吸着又は捕捉を最小限に抑え、それぞれの導管への開口部５２２、５２３、５２４、５２５、５２６を除いて閉じている。本例の実施形態では、マクロ流体遠心分離チャンバーは、血液を含有するサンプル（例えば、全血、血液培養サンプル、又はその他の血液を含有するサンプル）の処理のために用いられ、血液溶解試薬５０３及びクッション液５２９を含有し、微生物細胞の回収を助け、目標核酸の完全性と回収を損いかねない細胞の圧縮損傷を最小限に抑える。
サンプル移送レセプタクルは、レセプタクルの底部に取り付けられた針５０７を備えている。針は、マクロ流体遠心分離チャンバー５０２につながる遮断弁５０９を備えた流体経路５０８に接続されている。例えば、Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）採血管、又は血液サンプルと増殖培地を含有する血液培養管などの、貫通可能なキャップ５２１を有するサンプル管又は容器５２０が、針５０７がキャップ５２１を貫通するようにサンプル移送レセプタクル中に挿入されてもよく、ひいては、針及び流体経路５０８を介したカートリッジへのサンプル流体の移送ができるようにする。任意選択的に、針５０７は、針を汚染から保護する貫通可能なフード５０８で覆われている。
国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１５／０５０４４９号明細書によって教示される例の統合流体処理カートリッジ５００は、（以下に記載する通気孔を除いて）閉鎖型カートリッジであり、これは、サンプルの挿入に続いて、カートリッジのチャンバー及び導管内の濃縮懸濁液の分離と洗浄に必要な全ての機能を遂行し、全ての試薬と溶液がカートリッジのチャンバー内に貯蔵され、廃液の上清をはじめとする全ての余分な液体がカートリッジのチャンバー内に保持される。１つ又は複数の通気孔及びポートは、デバイスの目標範囲への微生物病原体の侵入を防止するのに十分に小さい孔径を有する通気性膜によって保護されてもよい。本例の実施形態によれば、全ての過剰な廃液はカートリッジ上に貯蔵され、ユーザーに曝されることはない。したがって、閉鎖型カートリッジは、サンプルとの直接接触からユーザーを保護し、サンプルが分離及び洗浄プロセス中に外部要因の汚染を受けにくいデバイスを提供する。
国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１５／０５０４４９号明細書によって教示されるように、自動分離及び洗浄プロセスは、図１３Ａで示される例の統合流体処理カートリッジ５００を参照して、図１４で一般的に説明されている。国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１５／０５０４４９号明細書に詳細が記載されているカートリッジインターフェーシングアセンブリは、カートリッジ弁５０９、５１２、５１３、及び５１７の作動をはじめとする必要な作動を遂行するのに必要な全ての構成要素と、カートリッジポート５１８を介してカートリッジ遠心分離チャンバーに陽及び陰のゲージ圧の双方を適用できる空気置換デバイスとを備えている。
サンプルを含有するサンプル管５２０は、カートリッジ５００のサンプル移送レセプタクル５０１中に挿入され、ひいてはチューブキャップ５２１を貫通し、図１３Ａの５０２に示されるように、マクロ流体遠心分離チャンバーへのサンプル移送を遂行する。カートリッジインターフェースアセンブリは、以下に詳細に記載されるカートリッジレセプタクルを介してカートリッジと係合し、弁５０９が開いて弁５１２、５１３、及び５１７が閉じるように作動し、ひいては、サンプル管からの経路５０８を除く、マクロ流体遠心分離チャンバーから発出する全ての流体経路を封止する。
空気置換デバイスは、ポートとの密閉接続を提供するコネクタを介してポート５１８と係合している。任意選択的に、硬質又は軟質のチューブが空気置換デバイスをコネクタに接続する。マクロ流体遠心分離チャンバー５０２へのサンプル移送は、空気置換デバイスを操作してマクロ流体遠心分離チャンバーから空気を抽出し、サンプル管５２０から流体経路５０８を介してマクロ流体遠心分離チャンバー５０２内へのサンプルの流動を引き起こすことによって実施される。ポート５１８の入口５２３は、流体レベルよりも上に配置され、流体レベルと入口５２３との間に十分な空隙を設けて、流体が入口５２３からポート５１８に流入しないようにする必要がある。この空気置換による活性化された流れは、所定の量のサンプルがマクロ流体遠心分離チャンバーに移送されるように、制御された様式で行われる。
国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１５／０５０４４９号明細書の教示の一実施形態によれば、流路５０８への入口５２２もまた、所望量のサンプルの移送に続いて、ポート５１８を介した空気置換が逆転され、マクロ流体遠心分離チャンバー内に少量の空気置換を提供し、サンプル流体の流路５０８をクリアし、この残留サンプルがサンプル管５２０に戻され得るように、流体レベルより上の空隙内にある。次に、弁５０９が閉じられ、サンプル管５２０が任意選択的にレセプタクル５０１から取り外される。
血液溶解試薬５０３は、サンプル移送プロセスの前に遠心分離チャンバー５０２内に存在してもよく、又は代案としては、それはサンプルと同様の方法で血液溶解試薬管から移送されてもよい。代案としては、カートリッジ上に血液溶解試薬貯蔵チャンバーが提供されてもよく、弁と通気孔を備えた流体経路が提供されて、以下に説明されるような洗浄緩衝液のマクロ流体遠心分離チャンバーへの移動と同様の方法で、血液溶解試薬５０３がマクロ流体遠心分離チャンバーに移動されるようにしてもよい。
国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１５／０５０４４９号明細書で教示されるように、マクロ流体遠心分離チャンバー５０２へのサンプルの添加後、図１４の９０５に示されるように、サンプルと血液溶解試薬５０３が任意選択的に混合されてもよい。混合機序が提供されてもよく、それによって、機器は、カートリッジのボルテックス処理、振盪、又は周期的反転を遂行する。この操作は、マクロ流体遠心分離チャンバー５０２から発出する全ての流体経路上の弁を閉鎖して実施される。ポート５１８への流体経路上に弁が提供され、混合中に流体が空気経路に入ることが防止されてもよい。さらに、又は代案としては、流体の通過を防止する通気性膜が、マクロ流体遠心分離チャンバーとポート５１８との間の空気経路内に配置され、流体がポート５１８に到達することが防止されてもよい。この膜はまた、環境からの又は空気置換デバイスからの微生物の侵入を防止するためのエアフィルターとして機能するように構成されてもよい。代案としては、ポート５１８とマクロ流体遠心分離チャンバーへの入口開口部５２３との間の経路は、支配的な条件下において、流体が開口部５２３に入ることが妨げられ、又はポート５１８に行き着くところまで進行することが妨げられるように、高い流体抵抗を有して設計され得る。同様に、希釈液チャンバー５０５及び上清チャンバー５０６内の通気孔５１５及び５１６は、それぞれ、通気性膜及び／又は高い流体抵抗を有する経路を備えて、同様の目的を果たしてもよい。
例えば、上述のＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００９９２号明細書の方法に従って、混合ステップ９０５に続いて、遠心沈降ステップ９１０が実施され、それによって、カートリッジインターフェーシングアセンブリが、電動ロータ４１４から切り離され、マクロ流体遠心分離チャンバー内の微生物細胞がクッション液上に沈降するように、カートリッジ４２０が遠心分離される。遠心分離機は、例えば、角度遠心分離機又はハンギングバケット遠心分離機であってもよく、遠心分離パラメータは、例えば、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００９９２号明細書に提供される条件に従って選択されてもよい。
マクロ流体遠心分離容器内の流体に印加される相対遠心力は、例えば、１０００～１５，０００ｇ、又は例えば、２，０００～１２，０００ｇ、又は例えば、３０００～１０，０００ｇ、又は例えば、３０００～７，０００ｇ、又は例えば、５０００～１０，０００ｇ、又は例えば、４０００～８，０００ｇの範囲内であり得る。生物学的サンプルからの細菌及び真菌細胞の分離を伴う用途では、適切な相対遠心力（ＲＣＦ）は１０００ｇ～１５０００ｇの範囲内、より具体的には３０００ｇ～７０００ｇの範囲内であることが分かった。
図１４の遠心沈降ステップ９１０に続いて、９１５に示されるように、遠心分離器のロータが停止され、カートリッジインターフェーシングアセンブリが電動ロータと再係合され、９２０に示されるように、マクロ流体遠心分離チャンバー５０２から上清チャンバー５０６への上清５２７の抽出が実施され、それによって、残留物５２８（微生物細胞を含有する）がマクロ流体遠心分離チャンバー５０２の底部に保持される。この措置は、弁５０９、５１２、及び５１７が閉じたまま、バルブ５１３を開き、空気置換デバイスのコネクタをポート５１８に係合させて、マクロ流体遠心分離チャンバー内に空気を制御可能に置換することによって実施される。したがって、上清の空気置換によって誘発される流れは、流体経路５１１を介して発生し、その入口５２４は、上清の最も低い範囲の下に配置される。任意選択的に、入口５２４は、マクロ流体遠心分離チャンバーから圧出される上清の最も低い範囲に配置され、ひいては、残留物５２８がマクロ流体遠心分離チャンバーから抽出されるのを防止する。
上清抽出ステップ９２０に続いて、洗浄緩衝液分注ステップ９２５及び９３０が実施され、それによって、洗浄緩衝液がマクロ流体遠心分離チャンバー５０２に分注される。この措置は、弁５０９、５１３、及び５１７が閉じたまま、バルブ５１２を開き、空気置換デバイスのコネクタをポート５１８に係合させて、マクロ流体遠心分離チャンバー５０２から空気を制御可能に排出することによって実施される。したがって、洗浄緩衝液の空気置換によって誘発される流れは、流体経路５１０を通して発生する。洗浄緩衝液経路５１０の入口５２５は、好ましくは、マクロ流体遠心分離チャンバー内の流体レベルの最高範囲より上に配置される。
洗浄緩衝液分注ステップ５４４に続いて、混合ステップ９３２が実施され、マクロ流体遠心分離チャンバー内で洗浄緩衝液及び残留流体が徹底的に混合される。これは、前述のように、カートリッジのボルテックス処理、振盪、又は周期的反転によって実施されてもよい。混合ステップ９３２に続いて遠心沈降ステップ９１０が実施されて、採取された微生物細胞が再沈降され、ステップ９２０と同様に上清が遠心分離チャンバーから除去される。ステップ９２５～９３５及び９１０～９２０の順序は、集合的に洗浄サイクルを形成し、それによって、細胞懸濁液が洗浄緩衝液で希釈され、微生物細胞が再沈降されて上清が抽出される。必要に応じて洗浄サイクルを複数回繰り返すことで、複数の追加的な洗浄サイクルが実施され、汚染物質及び干渉物質（ｉｎｔｅｒｆｅｒａｎｔｓ）が十分に希釈された、最終的な微生物細胞懸濁液を得られてもよい。
最終上清抽出ステップ９２０に続いて、混合ステップ９４２が実施され、沈殿した微生物細胞が最終残留流体５２８に再懸濁されて、最終懸濁液が生成される。再懸濁ステップ９４２に続いて、最終懸濁液は、流体経路５１０を通る空気置換によって抽出される。最終的な懸濁液の体積は、用途の性質に依存する。例えば、意図される用途が全血又は培養血中の微生物細胞の検出である場合、最終的な細胞懸濁液の体積は１０μＬ～５００μＬの範囲で選択されてもよいが、より好ましい範囲は２０μＬ～１２０μＬ、又は５０～１００μＬである。最終的な細胞懸濁液の抽出の間、弁５１７が開かれ、弁５０９、５１２、及び５１３が閉じられ、空気がポート５１８を通ってマクロ流体遠心分離チャンバー内に移され、流体が流体経路５１６を介して開口部５２６からポート５１９へと移される。開口部５２６は、クッション液５２９の上面に配置されているので、最終的な懸濁液の全体、又は実質的に全ての懸濁液が、いかなるクッション液５２９も圧出することなく、マクロ流体遠心分離チャンバーから圧出される。代案としては、開口部５２６は、最終懸濁液及びクッション液の一部又は全部が、マクロ流体遠心分離チャンバーから流体経路５１６を通って圧出されてもよいように配置される。流体経路５１６は、図２に記載されるように、細胞コロニー増殖モジュール入口経路１０１及び１６１に流体的に接続されている。
図１３Ｂ及び１３Ｃは、サンプルからの微生物細胞の分離を含む自動サンプル準備を実施し、それらを閉鎖型カートリッジ構成の固相増殖培地上に播種するための一例の統合カートリッジを示す。例の統合カートリッジ７００（図１３Ｂ）は、３つの構成要素を有することが示されている。第１の構成要素６９８は、サンプル移送レセプタクル５０１、マクロ流体遠心分離チャンバー５０２、希釈液チャンバー５０４、及び上清チャンバー５０６を含む（図１３Ａを参照されたい）。第１の構成要素６９８は、デバイスの形態及び機能と適合性のある材料から製造された単一のプラスチック成形部品であってもよい。代案としては、第１の構成要素６９８は、デバイスの材料、形態、及び機能と一致する手段によって成形又は形成された、プラスチック部品であるサブコンポーネントのアセンブリであってもよい。この点において、材料は、カートリッジが被るであろう高い遠心力に耐えるのに十分な高強度であるように選択されなくてはならず、材料は使用される液体と適合性があり、分子用途の場合、前処理された細胞懸濁液中に汚染物質を導入して下流の処理に支障をきたすべきではない。第１の構成要素６９８をそれから製造し得る材料の非限定的例は、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ＰＥＴ、ポリスチレン、環状オレフィン共重合体、又はこれらの材料のいくつかの変種である。
第２の構成要素６９９は、構成要素６９８の側面表面に取り付けられたマイクロ流体デバイスである。第２の構成要素６９９は、構成要素６９８内のチャンバーと細胞コロニー増殖モジュール７２０とを接続する、流体経路及び弁を含んでなる。流体経路及び構成要素は、細胞懸濁液を細胞懸濁液経路５１６及び５１９（図１３Ａを参照されたい）から細胞コロニー増殖チャンバーに流すためのものであり、本明細書に既述のように、増殖培地に播種するための追加的な構成要素である。構成要素６９９は、その中で孔、チャネル、及びチャンバーが形成される、いくつかの層から構成されている積層体である。層は、機械加工、打ち抜き、エンボス加工、又は成形されて、必要な特徴部が形成されてもよい。各層は、当業者に知られている接着剤接着、熱接着、超音波接着、又はその他の方法によって積層された副層の機能に基づいて、先に挙げた異種材料又は同種材料のいずれかの単層又は複数の副層を含んでなってもよい。
一実施形態では、図１３Ｂに示されるように、細胞コロニー増殖モジュール７２０は、増殖モジュールが引き続く処理のためにカートリッジの残りの部分から分離されてもよいように、取り外し可能なモジュールとして積層体６９９に組み込まれてもよい。取り外し可能なコロニー増殖モジュールは、モジュールを固定するが取り外しを容易にするために簡単に壊れるフィンガータブ及びスナップ特徴部、積層体６９９の残りの部分との壊すことのできる、又はさもなければ取り外し可能な流体接続などの、カートリッジからのモジュールの取り外しを容易にするいくつかの特徴部を含んでもよい。さらに、コロニー増殖モジュールは、図１３Ｅに概略的に図示されるように、その上に刻印又はマークされた、グリッドのセットを有する透明な裏打ち材料を含む。この特徴部は、微小コロニーの視覚化を必要とせずに、その他の用途のために採取される微小コロニーを探し当てるのを助ける。
一実施形態では、図１３Ｄに例示されるように、細胞コロニー増殖モジュール７２０は、ゲル上にサンプルを広げる目的で、遠心力場に対して垂直に存在するように、第２の構成要素６９９及び第１の構成要素６９８に組み込まれてもよい。第２の構成要素（積層体）６９９の細胞コロニー増殖モジュール７２０への流体接続を容易にする一例の実施形態は、壊すことのできる積層体タブ７２５を介したものであり、例えば、それは、動作負荷に耐えるのに十分な強度があるが、ユーザーが部品７２５を積層体６９９から剥がして７２０をカートリッジから解放し得るように、流体接続の位置７２１及び７２２で、レーザー溶接又は感圧接着剤を介して６９９及び７２０に局所的に結合され得る。任意選択的に、自由になった７２５の部分は、引き続いて、７２０内の密閉環境を維持するために、７２０をカートリッジから取り外すと露出する感圧接着剤を介して、７２０に再接着され得る。
カートリッジのチャンバーの開口部７１０（図１３Ｂに示される）は、希釈液チャンバー及びマクロ流体遠心分離チャンバー内にそれぞれ洗浄緩衝液及び前処理液を分注した後、メンブレンシール、ホイルシール又はキャップ６９７（図１３Ｃに示される）で密封されてもよい。図１３Ｃは、それぞれ、遠心分離チャンバー、希釈液チャンバー、及び廃棄物チャンバーの外表面７０３、７０４、及び７０５を示す。シール又はキャップは、ヒートシール、接着剤結合、超音波結合と適合性のある方法及び材料を使用して、結合されてもよい。代案としては、これらの液体を分注する前にチャンバーが密封されてもよく、これらの液体を分注する目的で代替ポートが提供されてもよく、これらのポートは分注操作に続いて密封されてもよい。キャップ６９７は、成形、エンボス加工、機械加工、又はラピッドプロトタイピングされてもよく、ポリカーボネート、ポリスチレン、ＰＥＴ、ポリエステル、又はその形態と機能に適したその他の材料から構築されてもよい。
微小コロニー検出及び推定的同定を実施するためのシステムの例
微小コロニーをインキュベートして検出し、任意選択的に推定的同定を実施する、微生物インキュベーション及びモニタリングシステムの一例が図１５Ａに概略的に提示される。このシステムは、取り外し可能な又はスライド式の蓋８２によって閉鎖されても良く、１つ又は複数の増殖モジュール７２０を収容する、開放又は閉鎖型インキュベーションチャンバー８１を含む。蓋８２は透明で、画像の歪みを回避するために十分に平らであってもよい。蓋８２は、結露を防止するために加熱されてもよい。蓋は、「液浸」ノーズピース用の開口部を含んでもよい。それに加えて又は代案として、対物レンズ（例えば、１つ又は複数の長作動距離対物レンズ）が使用されてもよい。ヒーター、温度センサー、及び関連する制御回路を用いて、設定温度に対して許容範囲内に温度が維持され得る（例えば、３７℃）。気体組成及び周囲湿度はまた、気体入口及び出口ポート８３を１つ又は複数の適切な外部モジュールに接続することによって、調節されてもよい（例えば、ＣＯ２／Ｏ２を制御して、適切な好気的又は嫌気的雰囲気を提供するための気体混合物；湿度を制御するための水のリザバーなど）。温度、気体組成、及び湿度が、再循環を介して制御されている間、システム全体が密閉されてもよい。チャンバーは、増殖モジュール７２０を堅固に保持するための１つ又は複数の保持デバイス（例えば、クリップ又はクランプ）を含んでもよい。
例のシステムには、少なくとも２つのイメージングモジュールが装備されている。第１の視野及び関連する倍率を有する第１のイメージングモジュール８４が提供され、第２の視野及び関連する倍率を有する第２のイメージングモジュール８５が提供され、第２のイメージングモジュールは、第１のイメージングモジュールよりも小さな視野と高い倍率を有する。イメージングシステムには、例えば、１つ又は複数の画像に関連するコントラストベースのフィードバックに従って駆動されるリニアモータを介して、高速オートフォーカス機能が提供されていてもよい。イメージングモジュールは、「液浸」光学系用の対物レンズヒーターを含んでもよい。チャンバー内に増殖モジュール７２０が入れられた後、第１のイメージングモジュール８４は、固相増殖培地の表面の少なくとも一部が視野内に入るように、駆動アクチュエータ（例えば、モータ）と、制御及び処理回路８６（図１２に示される例の制御及び処理回路４４０など）とによって制御される。
視野が固相増殖培地の全表面よりも小さい場合、イメージングモジュールは、イメージング中に機械的にスキャンされてもよく、画像は、制御及び処理回路を使用して組み合わされてもよい。このタスクは、複数の視野（ＦＯＶ）からのオーバーラップした画像タイルを処理し、オーバーラップした画像タイルを共にスティッチングし、それによって大きな２Ｄタイムラプスモザイクを介して、増殖モジュールの大きな領域（例えば、全領域）の試験を可能にすることで達成されてもよい。システムの潜在的な不正確さのために、個々のＦＯＶのずれは最終的なモザイク画像にずれを生じさせ、エラー及び情報損失をもたらし得る。いくつかの例の実装形態では、制御及び処理回路８６は、機械的な不正確さ（リニアモータのバックラッシュ、及びステージの再現性）を代償し得て、これは、指定された変換拘束（例えば、並進のみ又は並進＋回転）を有するペアワイズレジストレーションを介して、指定された領域内の並進を最適化することによって、スティッチングエラーが回避又は最小化される。例えば、強度ベース又は特徴ベースのアルゴリズムを用いて、隣接する画像が空間的にレジストレーションされるように、隣接する画像間の変換が行われてもよい。この文脈において、ステージ軌道関数は、隣接する画像タイル間の初期マッピングが提供されてもよく、これは、画像レジストレーションを介して精緻化される。
第１のイメージングモジュール８４よりも高い倍率を示す第２のイメージングモジュール８５には、補足的な暗視野イメージングのための落射照明が任意選択的に装備されていてもよい。第１のイメージングモジュール８４から取得された画像を介してコロニーが検出されて位置が特定されると、制御及び処理回路８６が、検出された微小コロニーが第２のイメージングシステムによって画像化されるように、第２のイメージングモジュールを制御してもよい。焦点調節後、より高解像度の画像（すなわち、第１のイメージングモジュールを使用して取得された画像よりも高い解像度を有する）が取得され（例えば、任意選択的に、このようなパラメータの時間依存性の変化にさらに基づいて、又は既述のように第２のイメージングモジュールを用いたラマン顕微鏡又はフーリエ変換赤外顕微鏡などのイメージングモジュール方式を介した、画像化されたコロニーの１つ又は複数の空間的、形態的、及び／又は回折的なパラメータ）、例えば、取得された画像の１つ又は複数（ｏｎ ｏｒ ｍｏｒｅ）の特性に基づいて、推定的同定を実施するために画像が収集されてもよい。本例のシステム又はそのバリエーションは、蛍光標識及び／又は未標識の微生物でタグ付けされた微生物を画像化するために用いられてもよい。
微小コロニーのインキュベーション及び検出システムの一例の実装形態は、図１５Ｂに提示される。並進ステージ上に担持されるインキュベーションチャンバーは、基底から加熱され、スライド式蓋８２によって閉じられる。並進ステージは、ｘ及びｙ方向に移動するのに加えて、ｚ方向にも移動し得て、例えば、サンプルから転送された血液残骸の画像を鮮明にすることによって、ゲル表面でのオートフォーカスを可能にする。対物レンズ８４は、蓋８２に提供された開口部８２１を通過する。対物レンズの結露は、カラーヒーター８４１を介して（チャンバー内の温度と比較して）高温に加熱することによって回避される。チャンバー内の湿度は、部分的に水で満たされた開放容器７２５をチャンバー内に入れることによって、上昇した状態に保たれる。
微小コロニーを検出するためのシステムの適合性を実証するために、約２０ＣＦＵの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞がスパイクされた４ｍＬの全血が実施例５の方法に従って処理され、分離された細胞懸濁液が得られた。実施例６の方法に従って調製された寒天プレートが８分間遠心分離され、その上に細胞懸濁液が分注されて表面に吸収された。寒天プレートは図１５Ｂのインキュベーターに入られ、ゲル表面全体にわたり４４８枚の画像を撮影することによって、１時間毎に画像化された。５倍の対物レンズは、オートフォーカスするために５番目のイメージングイベント毎にｚ方向に移動され、スキャン時間が短縮された。収集された画像は、位置合わせ、レジストレーション、及びステッチされ、結果は図１５Ｃの右側に提示された。次に、プレートが一晩インキュベートされ、従来のカメラによってその画像が撮影され、図１５Ｃの左側に提示された。肉眼では検出できないにもかかわらず、サンプル播種後のｔ＝４で５倍対物レンズを使用して収集された画像では、微小コロニーが検出可能であった。１つの例外は、プレートの壁による影のために検出されなかった＃１９のコロニーであった。
図１５Ｄでは、微小コロニーが検出されたプレート上の１８箇所の詳細な顕微鏡画像が示される。画像の下側には、インキュベーション時間ｔ＝３及びｔ＝４時間におけるコロニー含有領域の背景が減算された画像が示される。このように、ｔ＝２時間までに１つの微小コロニーが検出される（微小コロニー７）一方、ｔ＝３時間までに１８個の微小コロニーのうち、合計１５個の微小コロニーが検出されている。３時間という成績は、図９Ｃで推定され報告された陽性化までの時間（ＴＴＰ）２．１時間をなおも上回っている。この性能の低下は、イメージングシステムのインキュベーター内に入れられて間もなく、ゲル表面がマイクロスケールの形態変化を被るという事実に起因する。そのため、ｔ＝０時間の画像は、目標とする微小コロニーと背景の残骸から区別するための最も適した参照画像ではない可能性がある。この問題を回避するために、第１の（参照）画像は、インキュベーションの１０～３０分後に撮影されてもよい。代案としては、より短い時間間隔でスキャンを実施して画像を収集することによって、ＴＴＰに関する性能が改善されてもよい（例えば、１時間毎対０．５時間毎）。
図１５Ｂのシステムは、能動的に管理／制御されるＣＯ２環境を提供していないが、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）などの細菌種の増殖に顕著な影響を与えると判明していないことに留意されたい。実際、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＡＴＣＣの１株と４つの臨床分離株が関与する実験では、大気中でのストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の増殖速度は、全ての株でおよそ２サイクル／時間であることが分かった。図９Ｂ及び９Ｃから観察され得るように、この増殖速度は、典型的な病原性グラム陽性細菌の増殖速度のちょうど下限にある。しかし、ＣＯ２の添加を必要とせず、同様の大気中で全ての細菌及び真菌の細胞が検出され得るという事実は、顕著な利点を提供してもよく、これは、コロニーのサイズが小さいほど、細胞のパッキングが少なくなり、その結果、細胞間の相互作用が少なくなることに起因してもよい。
この主張のいくつかの証拠を例示するために、図１５Ｅの上部には、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のコロニーの画像が示されており、このコロニーは、ＣＯ２パックの存在下（左）と不在下（右）で一晩インキュベートされた。ＣＯ２パックの存在下でインキュベートされたコロニーは、ＣＯ２パックの不在下でインキュベートされたコロニーと比較して、コロニー全体に細胞が枯渇している領域が見られず、より健康的なようであることが分かる。図の下の部分は、ＣＯ２パックの不在下で、図１５Ｅに示されるシステムを用いてインキュベートされた、微小コロニー（左）と特定の微小コロニー（右）の画像を示す。微小コロニーの画像に見られるように、微小コロニーの形態は、ＣＯ２パックの存在下で一晩インキュベートされたコロニーの状況と類似している。
迅速な表現型抗微生物剤感受性試験を実施する方法
本開示の次のセクションは、微量希釈アッセイ及びディスク拡散アッセイなどの従来の抗微生物剤感受性試験（ＡＳＴ）法の欠点に対処し、微生物細胞に対する抗微生物剤などの化学薬品の効果を迅速に評価するための例示的な実施形態を提示する。以下に説明するように、本例のシステム及び方法は、わずか１０４ＣＦＵ程度に低い、又は１０３ＣＦＵ程度に低い微生物細胞数であっても、多くの微生物細胞種について、４時間という時間内に抗微生物剤感受性の判定（最小阻害濃度の判定を可能にすることを含めて）を可能にしてもよい。
細菌の抗微生物剤に対する細菌の感受性又は耐性を試験するための現在の基準となる検査は、標準化Ｋｉｒｂｙ－Ｂａｕｅｒ法に従った、寒天拡散試験手順による半定量的生体外感受性試験である。ディスク拡散ＡＳＴ（ＤＤ－ＡＳＴ）試験法（Ｋｉｒｂｙ－Ｂａｕｅｒ法／ストークス法に基づく）は、寒天プレート上に微生物細胞を播種し、特定濃度の抗微生物剤を含浸させた従来の６ｍｍペーパーディスクを入れることを伴う。ディスクからの抗微生物剤の拡散と抽出の速度は、迅速でない。そのため、ディスクに最も近いところで最大濃度となり、ディスクからの距離に応じて対数的に減少する濃度勾配が存在する。ディスクの中心に対する所与の位置での微生物細胞のコロニー増殖の間に、抗微生物剤の局所濃度は経時的に変化する。
典型的には、オキサシリン１μｇ／ｍＬ、テトラサイクリン３０μｇ／ｍＬ、及びノルフロキサシン１０μｇ／ｍＬの３種の抗微生物剤の存在下における、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の場合について、図１６の表記２ｒ１によって例示されるように、抗微生物剤の阻害効果は、阻害ゾーンとして知られている、中心からの距離までの微生物レーンの目に見える欠如として顕在化する。この距離を超えると、距離ｒ２まではまばらなレーンが観察され、それを超えるとレーンが満たされる。検査には１８～３０時間と長時間かかり、高い細菌濃度が必要である（０．５マックファーランド以上の濁度）。さらに、結果は、完全阻害ゾーン（２ｒ１）を判定し、ゾーンの直径をｍｍ単位で記録する目視検査を介して、主観的に評価される。図１６に示されるテトラサイクリンの場合のように、完全阻害のゾーンが円形でない場合には、ＭＩＣ測定の不正確さが生じ得る。したがって、ｒ１は、その値の範囲内で指定される。これらの欠点の結果として、ディスク拡散ＡＳＴ法は半定量的で遅い試験である。それにもかかわらず、微小コロニーからの光の散乱は目視検査を可能にし、その結果、微生物細胞増殖の阻害の推論が明白であるため、試験は表現型である。さらに、乾燥状態で保存される抗微生物剤、及びディスクとゲル表面の接触時のその効果的放出は、試験の実施を容易にする。
微量希釈ＡＳＴを実施する場合、微生物細胞懸濁液のアリコートが、典型的には２倍の差がある複数の濃度の抗微生物剤の存在下でインキュベートされ、試験の経過中又は終点のいずれかで微生物濃度をモニターすることによって、抗微生物剤不在下の増殖速度と比較して増殖速度が評価される。検査の初期段階でのモニタリングアプローチは、酵素などのシグナル発生剤の添加を必要とするが、これは細胞の代謝活動をモニターし、したがって細胞増殖の直接的な指標ではない。エンドポイントアッセイ（光散乱を測定することによって実施される）は、高い微生物負荷に対してのみ感度が高く、通常１０時間以上の長いインキュベーション時間の後に、満足できる結果を与え得る。さらに、公開された技術に例示されているように、サンプル中の開始細胞濃度は必要な濃度を下回るべきでない［Ｓｍｉｔｈ，Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｐ．，ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｅ．Ｋｉｒｂｙ．“Ｔｈｅ Ｉｎｏｃｕｌｕｍ Ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｒａ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：Ｍｉｎｏｒ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｎｏｃｕｌｕｍ Ｈａｖｅ Ｄｒａｍａｔｉｃ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．”Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（２０１８）：ＡＡＣ－００４３３］。したがって、サンプルは、典型的には、０．５マックファーランド以上の濁度を有する濃縮サンプルから得られることが多い。言及された問題にもかかわらず、微量希釈は抗微生物剤感受性を定量的に評価するためのＭＩＣ値を提供する。
本開示は、ディスク拡散ＡＳＴ及びマイクロブロス希釈ＡＳＴの双方の有利な特性を利用し、それぞれの欠点の多くを回避しながら、微生物細胞に対する化学薬品の効果を評価するための改善されたシステム、デバイス、及び方法を提供する。いくつかの例の本明細書で開示される実施形態では、ＡＳＴは、抗微生物剤が、固体支持体から、固体支持体によって少なくとも部分的に囲まれる固相増殖培地の下位領域へと内向きに側方に拡散して、抗微生物剤の局所濃度を迅速に確立するような構成で、固相増殖培地と、その上の乾燥させた、或いはその中に含浸させた、抗微生物剤を有する固体支持体との接触によって実施され、これは、抗微生物剤がディスクから放射状外向きに側方拡散する、ディスク拡散ＡＳＴ法で採用されている外向き拡散様式とは対照的である。微生物細胞の増殖に対する抗微生物剤の影響の迅速な評価のために（例えば、オーバーヘッド光学イメージングを介して）、抗微生物剤の局所的な側方拡散を介して、固相増殖培地の下位領域内に抗微生物剤の濃度を迅速に確立することによって、下位領域の表面上に分注された微生物細胞が抗微生物剤に迅速に暴露され得て、それによって迅速な表現型ＡＳＴが促進される。従来のディスク拡散法が抗微生物剤の外向き側方拡散に依存するのとは対照的に、抗微生物剤の全体的側方拡散によって促進されるこの迅速な表現型様式は、以降、「局所拡散」ＡＳＴ又はＬＤ－ＡＳＴと称される。
従来のディスク拡散アッセイと比較したＬＤ－ＡＳＴアッセイの差別化は、ＡＳＴを促進するために使用されるそれぞれのディスクの俯瞰図を提供する、図１７Ａ及び図１７Ｂを参照することで理解されてもよい。ディスク拡散ＡＳＴ（図１７Ａ）の場合、抗微生物剤が紙又はプラスチック製のディスク２１０に含浸され、相互作用及び感受性は、ディスクを超えて寒天プレート上の領域に側方外向きに拡散する、ディスクから放出された薬物に曝露された微生物細胞の増殖を照会することによって評価される。ＡＳＴを実施するための関心領域２１１は、ディスク半径ｒディスクを有する内部領域と、ディスクの典型的な３ｍｍの半径の約３倍の外側非拘束半径とを有する環状領域である。
対照的に、図１７Ｂに示されるＬＤ－ＡＳＴの一例の実施形態の場合、抗微生物剤は、環状ディスク２２０（紙又はプラスチックなどの固体支持体）の表面上に提供され、及び／又はその表面内に含浸されて、中央開口（中央開放領域）を有する環状ディスク２２０がその中に提供され、ディスクは、抗微生物剤が、環状ディスクに囲まれた内側の下位領域内で、環状ディスクから遊離されて少なくともある程度は側方に拡散する（すなわち、固相増殖培地の平面に垂直な方向への単なる垂直輸送とは対照的に）ように、固相増殖培地と接触される。抗微生物剤がその上に提供される及び／又はその中に含浸される表面２４０は、この表面が固相増殖培地と接触され、固相増殖培地内で抗微生物剤を側方拡散的に移動させることから、「接触表面」と称される。図１７Ｂに示される例の実施形態では、接触面は、固相増殖培地の表面と接触する環状ディスク２２０の底面である。
微生物細胞懸濁液の液滴が増殖培地の下位領域上に分注され、液滴内の微生物細胞が下位領域の表面上に保持される（例えば、液滴の蒸発及び／又は吸収を介して）。したがって、保持された細胞は、環状ディスクの接触面からの抗微生物剤の局所的な内向き側方拡散を介して確立される抗微生物剤の局所濃度に曝露され、微生物細胞に対する局所抗微生物剤濃度の影響は、構造をインキュベートし、細胞を増殖についてモニターすることによって判定される（例えば、下位領域の画像化を介して、上部から開口部を通して）。したがって、本例の実施形態では、ＡＳＴ ２２１を評価するための関心領域は、環状ディスクによって囲まれる固相の下位領域の表面である。内径が小さい、例えば２ｍｍ未満、又は１．５ｍｍ未満、又は１ｍｍ未満の環状ディスクを採用することにより、下位領域の表面下の抗微生物剤の局所濃度は急速に（例えば、２時間以内、１．５時間以内、１時間以内、又は０．５時間以内に）確立され、それによって光学顕微鏡を介して、抗微生物剤の存在下での微生物細胞増殖の迅速な評価を可能にする。
図１７Ａのディスク拡散法と図１７Ｂの局所拡散法とを比較すると、これら２つの実装形態の間の顕著な違いは、局所拡散ＡＳＴ法の場合における、抗微生物剤拡散が起こる側方距離の顕著な減少であることが容易に分かる。ＤＤ－ＡＳＴの場合、抗微生物剤がディスクの外径を超えて存在する固相増殖培地内の任意の所与の位置内で一方向に（放射状外向きに）拡散するように、抗微生物剤は側方外向きに継続的に拡散している。対照的にＬＤ－ＡＳＴの場合、抗微生物剤の一部が側方外向きに拡散する一方で、抗微生物剤の別の部分は、環状ディスクに囲まれた固相増殖培地の下位領域内に側方内向きに拡散し、その結果、抗微生物剤は、複数の内向きの半径方向から下位領域に送達され、それによって、下位領域内のほぼ空間的に均一な濃度の抗微生物剤の迅速で制御された生成を容易にする。
本例の実施形態の有利な態様は、寒天ベースのゲル増殖培地などの固相増殖培地中の抗微生物剤の拡散に関連するタイムスケールを考慮することによってより良く理解され得る。一次元にわたる濃度均質化の特性長スケールは、λ＝ｓｑｒｔ（２＊Ｄ＊ＴＤ）で与えられ、式中、ｓｑｒｔは平方根を表し、ＴＤは特徴的な拡散時間であり、Ｄは拡散係数である。ほとんどの病原性細菌細胞は対数増殖期を開始する前に約１時間の誘導期を有するため、妥当な拡散時間は１時間を超える。Ｓｔｅｗａｒｔによって表にされたＤの値（Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｐｈｉｌｉｐ Ｓ．“Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｉｎｔｏ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｂｉｏｆｉｌｍｓ．”Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４０．１１（１９９６）：２５１７－２５２２．）を用いて、ＤＤ－ＡＳＴ及びＬＤ－ＡＳＴの拡散時間が推定された。抗微生物剤のＤの典型的な値は約５×１０－４ｍｍ２／ｓであり、その結果、薬物分子は１時間で約ｓｑｒｔ（２×５×１０－４×３６００）～２ｍｍ置換される。
この結果は、ＬＤ－ＡＳＴの場合、環状ディスクに囲まれた下位領域の表面下に確立された抗微生物剤の濃度が、１時間以内にほぼ空間的に均一になると予想されることを意味する。他方、ディスク拡散ＡＳＴの場合、抗微生物剤が関心領域に拡散するまでおよそ１０時間かかるであろう。したがって、環状ディスクの中央領域に抗微生物剤を曝露させる手段として内向き側方拡散を採用することで、ディスク上の薬剤の容易な保存ができるようにする一方で、関心領域上に均一な抗微生物剤濃度を確立する時間を大幅に短縮できるようになる。さらに、以下に詳述するように、ＬＤ－ＡＳＴプラットフォームのその他の側面を制御及び構成することによって、空間的及び時間的の双方での濃度の変動が、１時間又は２時間を超えるタイムスケールで１０％未満であるように、下位領域内の抗微生物剤濃度の時間依存性の推移が調整されてもよい。
抗微生物剤の濃度の空間的及び時間的変動を低減するこの能力は、本ＬＤ－ＡＳＴプラットフォームは定量的なＡＳＴ測定を容易にする。下で詳述されるように、複数のＬＤ－ＡＳＴデバイスを用いて異なる局所抗微生物濃度を生成した場合、微生物細胞の増殖に対する抗微生物剤の効果は、マイクロブロス希釈ＡＳＴと同様の方法で個別に評価されてもよく、それによって、一連の離散測定からの最小阻害濃度の定量的判定が容易になる。
従来のディスク拡散ＡＳＴ（ディスクの外径を取り囲む大きな領域）とＬＤ－ＡＳＴ（環状ディスクに囲まれた比較的小さな下位領域）で採用されている関心領域の大きさの差は、サンプルの必要濃度を下げる観点から、明らかな利点を有する。細菌細胞濃度を適切な範囲に維持するための要件は、出版された技術に示されている［Ｓｍｉｔｈ，Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｐ．，ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｅ．Ｋｉｒｂｙ．“Ｔｈｅ Ｉｎｏｃｕｌｕｍ Ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｒａ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：Ｍｉｎｏｒ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｎｏｃｕｌｕｍ Ｈａｖｅ Ｄｒａｍａｔｉｃ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．”Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（２０１８）：ＡＡＣ－００４３３］。しかし、固相上で抗微生物剤感受性試験を実施する場合、この要件はより緩和されてもよい。
その中に抗微生物剤が内向き側方に拡散し、環状ディスクに囲まれている（又はより一般的には、下でさらに詳しく説明されるように、固体支持体によって少なくとも部分的に囲まれている）、０．５ｍｍ２～２ｍｍ２の範囲の関連表面積を有し得る固相増殖培地の領域は、本開示の文脈において、固相増殖培地の「曝露領域」、「関心領域」、又は「下位領域」として知られている。本発明者らは、場合によっては、以下に示すシミュレーションから明らかなように、抗微生物剤のほぼ均一な（本明細書では平均値から２５％未満の変動を有すると定義される）濃度が、約１～３時間の間の時間間隔にわたって確立され得ることを見いだした。抗微生物剤に対する感受性は、例えば、顕微鏡を介して、ＢＦ対物レンズ（例えば、無限計画（ｐｌａｎ）対物レンズ５×／０．１２／∞／－（ＢＦ）又は１０×／０．２５／∞／－（ＢＦ／ＤＦ））を装備した反射照明を用いて、下位領域の表面上に分注された微生物細胞の増殖をモニターすることによって判定される。固相上における細胞間の相互作用は、最小阻害濃度（ＭＩＣ）に影響を及ぼさないと予想されるため、１つの下位領域内に１０００ＣＦＵ程度に高い細胞数が用いられてもよい。他方、１０ＣＦＵ程度に低い細胞数は、所与の下位領域の表面に細胞が分注されず、したがって保持されないという統計的可能性を回避し又は十分に低減するのに十分であってもよい（細胞懸濁液のアリコートが複数の下位領域に分注され、それぞれ異なる抗微生物剤濃度を有する場合）。
一例の非限定的環状ＬＤ－ＡＳＴデバイスは、図１８Ａに提示される。本開示では、単一の下位領域内の微生物細胞懸濁液のアリコート（例えば、単一の液滴）からの微生物細胞の曝露を容易にするデバイスは、ＬＤ－ＡＳＴユニットと称される。図に示される例のＬＤ－ＡＳＴユニットは、微生物細胞の増殖をサポートするように構成されているゲルベースの増殖培地を含み、ゲルベースの増殖培地は、壁２２３及び底部２２４を有するマイクロウェル内に閉じ込められている。
抗微生物剤は、環状ディスク２２０の接触面上に提供され、及び／又はその中に含浸される（環状ディスク２２０の下表面）。環状ディスク２００は、ガイドリング２２２に接着又は装着されている（機械的に結合されている）。これらの構成要素が固相増殖培地上に配置されると、ガイドウェルは、ガイドリングの壁と、ガイドリング２２２によって囲まれる固相増殖培地２２１の表面の下位領域の表面とによって形成される。抗微生物剤は、環状ディスク２２０から内向きに拡散する。ガイドリング２２２の上面は、アリコートの微生物細胞懸濁液の分注時に、アリコートが開口を通って固相増殖培地の露出した下位領域に誘導されるように、疎水性であってもよい。図に示されるように、ガイドリングの上面は、環状ディスクに囲まれたゲルの下位領域の表面への液体の供給（ウィッキング）を促進するために、開口部に向かって傾斜する、斜角の（例えば、湾曲した）断面２５２を有し得る。
いくつかの例の実施形態では、下位領域の表面に沈着した微生物細胞懸濁液の体積内の微生物細胞の数は、５０未満、２０未満、又は１０未満の細胞であってもよい。いくつかの例の実施形態では、下位領域の表面上に沈着した微生物細胞懸濁液の体積は、５マイクロリットル未満、又は２マイクロリットル未満である。
いくつかの例の実施形態では、固体支持体は、固相増殖培地の体積が、３００μｌ未満、２００μｌ未満、１５０μｌ未満、１００μｌ未満、７５μｌ未満、又は５０μｌ未満であるように、マイクロウェル内に提供される固相増殖培地を接触されてもよい。
図に示されるように、アセンブリを固定し、ディスクの接触面と固相増殖培地の表面との間で、ディスクの下に液体が流入するのを防止するために、ガイドリング２２２の下表面は、環状ディスクとガイドリングが結合された後、フラッシング特徴部２５１が固相増殖培地の表面に挿入される（例えば、５００ミクロン未満、２５０ミクロン未満、又は１００ミクロン未満の深さに達する）ように、開口部に隣接して配置されたフラッシング特徴部２５１を有してもよい。代案の実施形態では、環状ディスク及びガイドリングは、一体式構成要素として形成されてもよく、抗微生物剤は、構造の下部に被覆及び／又は含浸されてもよい。
環状ディスクに囲まれた固相増殖培地の露出面領域への細胞懸濁液の送達を助けるガイドリングの能力を実証するために、以下のように実験を実施した。濃度１０５ＣＦＵ／ｍＬのＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の懸濁液を調製した。厚さ１００μｍ及び直径５ｍｍを有するポリエーテルベースの熱可塑性ポリウレタン（ＴＰＵ）フィルム上で、それぞれ直径１及び０．８ｍｍの２つのディスクを切断した。リングを寒天ゲルの上に置いた。次に、１μＬの細胞懸濁液をリング上及びゲルの未被覆部分に分注した。プレートを４時間インキュベートし、サンプルが分注された領域を金属顕微鏡の５倍の対物レンズで画像化した。画像は図１８Ｊに提示される。拘束がない場合（上の画像）、サンプルは乾燥前に直径約５ｍｍの円形領域に増殖した。リングの場合、微生物細胞はリングの内側領域に導かれた。細胞の濃度は、微小コロニーの間隔が狭いという観察結果からも明らかである。
図１８Ａの例の実施形態で示されるように、環状ディスクは、内側半径ｒ１及び外側半径ｒａｄの２つの特徴的な半径を有する。これらの２つの半径の間で、抗微生物剤は、ディスクの下部接触面上に被覆され及び／又はその下に含浸される。いくつかの例の実施形態では、ｒ１は、０．５～２ｍｍの範囲内、又は０．８～２ｍｍの範囲内、又は１～１．５ｍｍの範囲内にある。いくつかの例の実施形態では、ｒａｄは、２ｍｍ～６ｍｍ、又は２．５ｍｍ～４ｍｍの範囲である。
図１７Ｂ及び図１８Ａが、環状ディスク（及び環状ガイドリング）の形態の固体支持体の一例の構成を示している一方、この構成は、ＬＤ－ＡＳＴアッセイを実施するのに適した構造の一例を提供するものであることが理解されるであろう。固体支持体が提供されて固体支持体が少なくとも部分的に開口部を取り囲む（すなわち、中央の開放領域を部分的に取り囲む）、その他の例の実施形態が、以下に提供され、固体支持体は、その上に提供された及び／又はその下に含浸された化学薬品を有する接触面を含み、固相増殖培地の下位領域が開口部を通じてアクセス可能であり、化学薬品の少なくとも一部が側方に内向きに下位領域内に拡散するように、下位領域の表面上に沈着した微生物細胞が、下位領域の表面の下に拡散した化学薬品に曝露するように、接触面が固相増殖培地と接触され得る。
例えば、先行する例の実施形態が環状ディスクを用いている一方、抗微生物剤を下位領域に拡散的に送達するために用いられる固体支持体は、楕円形、正方形、又はその他の形状など、多様な形状を取ってもよいことが理解されるであろう。
さらに、図１８Ａに示される固体支持体は下位領域を完全に囲み、その他の例の実施形態では、固体支持体は下位領域を部分的にのみ囲んでもよい。例えば、固体支持体２２０は、図１８Ｂに示されるように、接触面が固相増殖培地に接触したときに、抗微生物剤が接触面から固相増殖培地の下位領域に多方向から内向きに拡散するように、隙間又は開口部又は内側領域２２１を部分的に取り囲む（又は封入する）２つ以上のセグメントの形態で提供されてもよい。例えば、抗微生物剤がその上及び／又はその中に提供されている固体支持体は、それぞれが固相増殖培地の表面に垂直に存在し、それぞれが下位領域を通過するように第１の平面及び第２の平面が定義されるとき、第１の平面が第２の平面に垂直である場合、複数の領域が、第１の平面及び第２の平面のそれぞれの両側に存在するように、領域複数の領域で固相増殖培地と接触して抗微生物剤を固相増殖培地の下位領域中に拡散的に送達してもよい。
いくつかの例の実施形態では、抗微生物剤は、固体支持体の接触面上及び／又はその下に一様に分布してもよい。しかし、その他の例の実施形態では、抗微生物剤は、接触面上の２つ以上の分離された領域に提供されてもよい。
その他の例の実施形態では、抗微生物剤の局所領域又は表面下密度は、接触面に沿って空間的に変化してもよい。例えば、抗微生物剤は、面密度勾配又は表面下密度勾配に従って接触表面に提供されてもよい。化学薬品の面密度又は表面下密度が、開口部に最も近い表面領域で最も低くなるように、面密度勾配又は表面下密度勾配が提供されてもよく、これは、以下の例のシミュレーションに示されるように、均一な密度の抗微生物剤を有する固体支持体よりも小さい時間依存性変動を示す下位領域内濃度を生じる上で、有益であり得る。
本開示の例の実施形態の多くは、接触面が固相増殖培地の上面に接触し、抗微生物剤を下位領域に拡散的に送達するように構成されているＬＤ－ＡＳＴデバイスを採用する一方で、固体支持体はまた、固相増殖培地に浸漬される（浸される）ように構成された側方拘束構成要素を含んでもよい。このような実施形態の一例は、図１８Ｃ～１８Ｇに例示される。図１８Ｄ及び１８Ｅは、固体支持体２２０が、接触面２４０が固相増殖培地の上面と接触したときに固相増殖培地２５０に浸漬される側方円筒形拘束構成要素２２５を含む、一例のＬＤ－ＡＳＴデバイスを示す。側方円筒形拘束構成要素２２５は、平面接触面２４０よりも開口部から離れて位置し、それによって、接触面の外側半径を超えた抗微生物剤の外向きの拡散が少なくとも部分的に制限されるように、抗微生物剤の拡散に対して少なくとも部分的な外側の障壁を提示する。このような実施形態は、抗微生物剤の濃度のより迅速な蓄積を容易にし、１～２時間の時間枠後の時間的変動がより少ない濃度の確立もまた容易にする。いくつかの例の実装形態では、側方拘束（ｃｏｎｆｅｒｍｅｎｔ）構成要素は、５ｍｍ未満、４ｍｍ未満、又は２ｍｍ未満の幅を有する領域を封入するように構成されてもよい。
図１８Ｅに示されるように、側方拘束（ｃｏｎｆｅｒｍｅｎｔ）構成要素２２５を用いて、固体支持体の外側半径を超えて延びる固相増殖培地内に「仮想マイクロウェル」が形成され得る。いくつかの例の実施形態では、側方拘束部材の遠位端は、その上に固相増殖培地が存在する下部支持面に接触してもよく、それによって固相増殖培地の領域を完全に封入する。図１８Ｆ及び１８Ｇに例示される別の例の実装形態では、側方拘束構成要素２２５を有する固体支持体２２０は、マイクロウェル２６０内に存在する固相増殖培地と接触されてもよい。このような一例の実施形態では、側方拘束構成要素は、接触面が固相増殖培地と接触させられたときに、接触面の平行配向を維持するのを助けてもよい。
いくつかの例の実施形態では、接触面は、抗微生物剤がその上に提供され、又はその中に浸漬される、以後「側方接触面」と称される表面領域を含んでもよく、表面領域は、ＬＤ－ＡＳＴを実行するために固体支持体が固相増殖培地と接触させられたときに固相増殖培地内に浸漬されるように構成されている。例えば、図１８Ｄを参照すると、側方拘束部材２２５の内表面２２６は、内表面２２６が接触面の少なくとも一部を形成するように、その上に提供され、又はその中に浸漬される、抗微生物剤を有してもよい。このような側方接触面は、例えば、少なくとも１ｍｍ又は少なくとも２ｍｍの深さまで、固相増殖培地中に挿入されてもよい。
いくつかの例の実施形態では、固体支持体は、管状構成要素を含み、管状構成要素の内表面の少なくとも遠位表面領域は、抗微生物剤で被覆及び／又は含浸され、管状構成要素は、遠位表面領域の少なくとも一部が固相増殖培地内に浸漬されるように、及び化学薬品が管状構成要素の管腔内に存在する固相増殖培地の下位領域内に内向きに拡散するように、固相増殖培地と接触される。このような実施形態の一例は図１８Ｈに示されており、それは、近位領域２７０、遠位領域２７５、及び遠位領域２７５の内表面２８０上に提供され、及び／又はその中に浸漬された抗微生物剤を有する、一例の円筒形管状構成要素の断面を示す。図１８Ｉに示されるように、管状構成要素の近位部分が固相増殖培地から外向きに延びるように、管状構成要素が固相増殖培地に挿入されてもよい。微生物細胞懸濁液２９０は、管状構成要素の近位部分２７０に分注されてもよく、そこでそれは保持され、固相増殖培地の表面と接触される。管状構成要素は、管状構成要素の遠位端が固相増殖培地を支持する下部支持面２９５に接触するように挿入されてもよく、それによって下位領域を囲み、管状構成要素内の化学薬品の拡散を拘束する。一例の実装形態では、下部支持面２９５は、その中に又はその上に提供される１つ又は複数の嵌合特徴部を含み、１つ又は複数の嵌合特徴部は、管状構成要素の遠位端と接触する。１つ又は複数の嵌合特徴部は、突起及び凹部の片方又は双方を含んでもよく、管状構成要素の遠位端を完全に囲んでもよい。管状構成要素の固相増殖培地への導入を容易にするために、管状構成要素の遠位部分の壁厚は、５００ミクロン未満であってもよい。
抗微生物剤が提供され、及び／又は抗微生物剤がその中に含浸される固体支持体の部分は、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリスルホン、及びそれらをより疎水性又は親水性にするために被覆された環状オレフィン共重合体などの可塑性材料と、例えば、水に対して疎水性又は親水性の親和性のいずれかを有する、セルロースエステル、ポリエーテルスルホン、ナイロン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリテトラフルオロエチレン又はフッ化ポリビニリデンから形成された、紙及びその他の多孔質材料などの多孔質材料とをはじめとするが、これらに限定されるものではない、広範な材料から形成され得る。
いくつかの例の実施形態では、複数のＬＤ－ＡＳＴユニットが用いられてもよく、各ＬＤ－ＡＳＴユニットは、その上に保持された微生物細胞を異なる抗微生物剤に曝露させるように構成されている。どのマイクロウェルが微生物細胞の増殖をサポートし、どのマイクロウェルが微生物細胞の増殖を阻害するかの判定は、各抗微生物剤の最小阻害濃度（ＭＩＣ）の判定を可能にする。例えば、図１９Ａに示されるように、複数の接続された（機械的に装着又は結合された）ＬＤ－ＡＳＴユニットが、ストリップの形態で提供されてもよい。異なる濃度レベル（Ｃ１～Ｃｎ）の抗微生物剤を含浸させた環状ディスクには、ガイド（相互作用）リングが提供され、ストリップ３００の形態で組み立てられる。濃度レベルの数ｎは２～７以上の範囲にあってもよく、濃度は、いくつかの実装形態では、アレイに沿って１つの環状ディスクから次のディスクにかけて２倍になることもある。図１９Ｂに示されるように、複数のマイクロウェルを有する相補的ストリップ３１０が提供されてもよく、各マイクロウェルは、寒天ゲルベースの固相増殖培地の体積を含有する（これらは、シール３１１によって密封されてもよい）。ＬＤ－ＡＳＴアッセイが実施される場合、図１９Ｃに示されるように、ＬＤ－ＡＳＴユニットのそれぞれの接触面が、それぞれのマイクロウェル内の固相増殖培地と接触され、抗微生物剤が、それぞれの接触面からマイクロウェル内の固相増殖培地のそれぞれの下位領域に拡散されるように、２つの構成要素が接触されてもよい。次に、アリコートを含む微生物細胞が、それぞれの下位領域表面上に保持され、下位領域内に拡散した抗微生物剤に曝露されるように、液滴３２０として示される微生物細胞懸濁液のアリコートが、相互作用リング内に分注され得る。複数のアレイを用いて、複数の抗微生物剤が様々な濃度で評価されてもよく、ＬＤ－ＡＳＴユニット及び固相増殖培地マイクロウェルは、それぞれの二次元アレイとして任意選択的に形成される（例えば、プレートの形態の一体式アレイ）。
図１９Ｄ及び１９Ｅは、図１８Ｂに示されるＬＤ－ＡＳＴユニットを伴う、一例の多ユニットアレイの実施形態を例示する。いくつかの例の実施形態では、ＬＤ－ＡＳＴユニットのアレイ及び固相増殖培地マイクロウェルのアレイの１つ又は複数は、それぞれの接触面とそれぞれのマイクロウェルとの間の位置合わせを容易にするキー付き特徴部を含む。キー付き特徴部は、それぞれのマイクロウェルに対する各接触面の側方位置及び深さの１つ又は複数の位置合わせを容易にしてもよい。
図２２は、ＬＤ－ＡＳＴを実施するための一例の方法を例示するフローチャートを提供する。この方法は、ステップ１００で、十分に既知の分類及び濃度を有する細胞懸濁液を調製することを含んでなる。分類は、抗微生物剤のパネルがステップ６０１で判定できる程度まで、知られていなければならない。分類粒度の一例は、細菌性／真菌及びグラム陽性／陰性である。濃度は、サンプルの分注後に、関心領域で１０～１０００個の細胞数が確保される程度まで、知られていなければならない。抗微生物パネルが選択されると、ステップ６０２において、ゲル上に適切に成形された薬物含浸ディスクを重ねることによって、複数の薬物曝露領域が形成される。抗微生物剤は、固相増殖培地の下位領域に内向きに拡散し、薬物曝露領域全体に抗微生物剤濃度を確立した（ステップ６０３）。ステップ６０４において、細胞懸濁液のアリコートは、分注されたサンプルを薬物曝露領域に誘導するための形態及び構造が供給されてもよい、薬物含浸ディスク上に分注される。ステップ６０５において、各薬物曝露領域中の微生物細胞の増殖挙動は、タイムラプス顕微鏡イメージングによって監視される。各薬物曝露領域における微生物細胞の増殖速度を薬物のない領域（対照）における細胞の増殖速度と比較して、パネル内の各抗微生物剤のＭＩＣ値がステップ６０６で判定される。これらの値は、ステップ６０７～６０９の間に細胞の同定に関連して用いられ、ステップ６１０で細胞の抗微生物剤感受性プロファイルが判定される。
本実施例の方法は、推定された細胞濃度及び少なくとも推定された初期微生物細胞クラスの判定に関して、十分に特性決定された細胞懸濁液に基づいて実施される（例えば、少なくとも細菌細胞対真菌細胞の判定、及び細菌細胞のグラム状態の判定）。細胞クラスを用いて、適切な抗微生物剤試験パネル（例えば、グラム陽性又はグラム陰性パネル）が選択される。
細胞濃度は正確に知る必要はなく、且つ、等分後に各アリコートが十分な量の微生物細胞を含有すると予期されることを確認するためだけに採用されてもよく、増殖モニタリングを容易にするのには多すぎる微生物細胞を含有するアリコートを分注する可能性が回避され、統計変動によってアリコートに微生物細胞が存在しない可能性が回避される。例えば、それぞれがＮｃの濃度レベルを有するＮｄ薬物のパネルに対する感受性を判定するために、グラム陽性細菌を試験する例の場合が考えられる。Ｎｄ×Ｎｃ ＬＤ－ＡＳＴユニット（Ｎｄ＝薬物の数、Ｎｃ＝濃度の数）内に、約１μＬの懸濁液が分注された後、各ＬＤ－ＡＳＴユニットは、約１ｍｍ２のＲＯＩ上にＣｃ（マイクロリットルあたりのＣＦＵ）個の細胞を受け取る。その結果、各微生物細胞の周囲の面積σは、１０６／Ｃｃμｍ２になる。１０６ＣＦＵ／ｍＬ＝１０３ＣＦＵ／μＬの細胞懸濁液の場合、σ＝１０３μｍ２である。これはわずか０．１％の表面被覆率に相当し、すなわち各細胞は、隣接する細胞から独立して増殖していると見なし得る。他方、１０４ＣＦＵ／ｍＬの細胞濃度に対応する各ＲＯＩの１０ＣＦＵ程度に低い細胞数は、ポアソン統計の影響を受けることなく楽にモニターされ得る。したがって、微生物細胞懸濁液の初期細胞濃度が評価され、それがこの範囲内にあることが確認されてもよい。
細胞懸濁液は、多種多様な方法に従って調製されてもよく、直接又は間接的に（先行する増殖ステップの有無にかかわらず）、広範なサンプルタイプから得られてもよい。一例の実施形態では、微生物細胞懸濁液は、例えば、微小コロニーが目標サイズに増殖し、任意選択的に推定的に分類された（例えば、細菌対真菌、任意選択的にグラム陽性対グラム陰性として）後、上記の例の方法に従って、微小コロニーから微生物細胞を採取することによって得られてもよい。採取された微小コロニーは、適切な培地（例えば、生理食塩水、又は例えば、ＴＳＢ又はＢＨＩなどの増殖培地）に再懸濁されてもよく、任意選択的に希釈又は濃縮され、次にＬＤ－ＡＳＴユニット上に分注される。別の例では、微生物細胞は、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１９／０５０７１６号明細書に開示された方法に従って、血液培養サンプルを処理して微生物細胞懸濁液を得ることによって得てもよい。
増殖又は非増殖の存在は、およそ２倍の精度で領域における微生物の細胞数の時間的変化をモニター又は判定し得る、顕微鏡検査技術又はその他の方法によってモニターされてもよい。一例の実施形態では、薬物曝露領域は、５倍又は１０倍の対物レンズを備えた顕微鏡などの顕微鏡によって断続的に（例えば、３０分間毎に１回）画像化されてもよく、画像の順序が画像処理方法を使用して比較され、細胞が成長及び／又は増殖しているかどうかが確認されてもよい。本発明者らは、ＭＩＣ濃度での抗微生物剤の効果による微生物増殖の停止が、典型的には３～５時間のインキュベーションの間に検出されることを見いだした。
図１８に示される例のＬＤ－ＡＳＴユニットの寸法がＬＤ－ＡＳＴアッセイの性能に及ぼす影響を例示するために、濃度プロファイルは、有限差分法（タイムマーチ）による拡散方程式（フーリエの方程式）のシミュレーションに基づいて、５分、３０分、１時間、２時間、３時間、及び４時間の選択された拡散シナリオに対して計算された。用いられた数値スキームは、時間では一次風上、空間では二次中央差であった。本開示の文脈で解析される、拡散方程式は、次のように記載される：δＣ／δｔ＝Ｄ（δ２Ｃ／δｚ２＋（１／ｒ）δ（ｒδ（Ｃ／δｒ）／δｒ）、式中、Ｃ（ｒ，ｚ，ｔ）は濃度であり、円筒座標のｒ及びｚに依存するが、極角θには依存しない。係数Ｄは拡散係数であり、δ／δｔ、δ／δｒ、及びδ／δｚは、それぞれ時間（ｔ）と空間座標ｒ及びｚに対する偏微分である。
抗微生物剤濃度の空間プロファイルは、最初の接触後の様々な時点で、図２０Ａ～２０Ｈの関心領域の中心を通る線に沿ってプロットされた。図２０Ａのプロットは、ｒ１＝１．５ｍｍ、ｒａｄ＝３ｍｍ、ｒ２＝１４ｍｍ、ｈ＝４ｍｍで、ｒ１とｒａｄの間で抗微生物剤が均一に分布している場合に対応する。観察されるように、環状ディスクがゲル上に置かれてから３０分以内に、開口部の下に露出した下位領域全体の抗微生物剤の表面濃度は均一になるが、濃度レベルは経時的に低下する。
この抗微生物剤濃度の時間依存性をさらに例証するために、図２１Ａは、ｒ２、ｈ（ｒａｄ＝４ｍｍであるｄｕａｌ２の場合を除いてｒ１及びｒａｄは、それぞれ１．５ｍｍ及び３ｍｍに固定されている）の異なる組み合わせ、及びｒ１とｒａｄの間の初期抗微生物剤の分布について、下位領域の中心における抗微生物剤濃度のレベルをプロットする。さらに、環状ディスクをゲル上に置いた後、約０．５時間及び４時間で最大濃度に達する期間中のこの抗微生物剤濃度の変化が、図２１Ｂに示される。観察されるように、約０．５時間と４時間の期間中の変動は約１６０％である。この濃度の強い時間依存性は、ＡＳＴの定量化を複雑にするため、望ましくないこともある。したがって、本発明者らは、下位領域全体の濃度のより小さな時間的変動を達成する構成を求めた。一シミュレーション研究において、本発明者らは、３つのパラメータ、すなわちｒａｄ、ｒ２、及びｈを変更した。
図２０Ｂのプロットは、ｒ１＝１．５ｍｍ、ｒａｄ＝３ｍｍ、ｒ２＝１４ｍｍ、ｈ＝２ｍｍで、ｒ１とｒａｄの間で抗微生物剤が均一に分布している場合に対応する。これらのプロットは、図２０Ａのプロットと質的に同等である。しかし、図２１Ａ及び図２１Ｂを参照すると、微妙な違いが観察され；抗微生物剤濃度の変動は、図２０Ａの１６０％ではなく１２８％となっている。したがって、ゲルの厚さを薄くすると、有意でない程度ではあるが、性能が向上するように見える。他方、より薄いゲルは、特にｒ２がｒａｄよりもはるかに大きく、ゲル表面のかなりの割合が周囲環境に曝されている場合には、アッセイ中にゲルが脱水しやすくなる。
ゲルの側方拘束の増加の有益な効果は、図２０Ｃに示されている。この場合、濃度変動の大きさは、ピーク値の１６０％（図２０Ａに対応する）から１３２％に減少する。ｒ２又はｈのどちらかを減少させても、濃度の時間的変動を低下させる効果はわずかであったが、両方の変更を同時に適用すると、図２０Ｄのプロットに対応する７６％がもたらされ、図２０Ａの拘束の少ない場合よりも大幅に改善される。
放射状に可変様式で含浸された環状リングを採用することによって、アッセイ能力のさらなる改善が達成され得る。これを例証するために、２つの二重環状リングの例の場合の濃度プロファイルが計算され、その強度プロファイルはそれぞれ以下のとおりであった：
Ｄｕａｌ１：１．５＜ｒ＜２．５の場合はＣ０＝０．５；２．５＜ｒ＜３の場合はＣ０＝１；それ以外の場合はＣ０＝０（図２０Ｅを参照されたい）。
Ｄｕａｌ２：１．５＜ｒ＜３の場合はＣ０＝０．５；３＜ｒ＜４の場合はＣ０＝１；それ以外の場合はＣ０＝０（図２０Ｇを参照されたい）。
得られたプロファイルは、それぞれ図２０Ｆ及び２０Ｈに提示される。図２１Ｂから分かるように、関連する時間にわたる中心での濃度の変動は、それぞれ、６１％及び１９％に低下している。これは、次の形式で、放射状に変動する濃度で薬物を沈着させることを示す：
｛Ｃ０はｒ１＜ｒ＜ｒａｄの増加関数で提供され、それ以外の場合はＣ０＝０｝は、関連する時間にわたるＲＯＩ全体の濃度変動を顕著に低減し得る。
ＲＯＩ全体に拡散した抗微生物剤の一過性濃度変動と潜在的な濃度の不均一性は、放射状に増加する乾燥抗生物質濃度で環状ディスクを調製することによって低減し得る。このアプローチの一例の実装形態は、実施例９Ｂに記載される。方法の実装形態とその改善された性能を例証するために、以下の実験が実施された。抗生物質溶液を染料溶液に置き換えて、環状ディスクを調製するために用いられた。図２１Ｃでは、水をかけて乾燥させた後（左上）と、内部に穴を打ち抜いた後（右上）のディスクが示される。染料の相対濃度は、図の下部のプロットに提示される。観察されるように、濃度勾配は、外縁に近づくにつれて濃度が増加するように作製されている。この例は、実際に濃度プロファイルを調節するための実用的な方法を提供する。
ＬＤ－ＡＳＴ法の実現可能性を例証するために、微生物種と抗微生物剤の異なる組み合わせに対して、いくつかの実験的なＬＤ－ＡＳＴアッセイが実施された。
ある場合には、実施例９Ａ及び１０の方法に従ってＬＤ－ＡＳＴ試験ストリップが作製され、０～１６μｇの範囲で異なる濃度のノルフロキサシンが環状ディスクに被覆された。３種類のストリップが調製された：マイクロウェルあたり８０μＬのゲルを含む小容量寒天タイプ、マイクロウェルあたり１５０μＬのゲルを含む中容量寒天タイプ、及びマイクロウェルあたり３５０μＬのゲルを含む大容量寒天タイプ。対応するゲル厚は、それぞれ２ｍｍ、４ｍｍ、及び９ｍｍであった。次に環状ディスクをゲルの上に置いた。小容量寒天タイプの場合のマイクロウェルストリップの画像は、図２３Ａ及び２３Ｂに提示され、２２０、２２１、２２２、及び２２３はそれぞれ、薬物含浸環状ディスク、薬物曝露領域、ガイドリング、及びゲルを指す。実施例１２の方法に従って調製された１μＬの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞懸濁液が、各ＬＤ－ＡＳＴユニットのＲＯＩ内に分注された。ストリップは３７℃でインキュベートされ、それらのＲＯＩは、５倍の対物レンズを有する落射照明顕微鏡で１時間毎に１回画像化された。これらの画像は、それぞれｔ＝３時間、ｔ＝４時間、及びｔ＝一晩のインキュベーション時間について、図２４Ａ～２４Ｃ（小容量ゲル）、２５Ａ～Ｃ（中容量ゲル）、及び２６Ａ～Ｃ（大容量ゲル）に提示される。
図２４Ａ～２４Ｃの標識は、調製中に環状ディスク上に被覆された抗微生物剤の質量を示す。図２１Ａで示されるように、得られた固相増殖培地内で生じる濃度は、時間の関数として変動し、最初ピークまで上昇し、次に平坦域まで減衰する。この時間変動にもかかわらず、有効な抗微生物剤濃度は各マイクロウェルに関連していてもよい。この有効抗微生物剤濃度は、例えば、図２１Ａのように抗微生物剤の拡散をモデル化することによって推定されてもよく、又は例えば、ＬＤ－ＡＳＴアッセイの結果をブロス微量希釈アッセイなどの参照アッセイと比較することによって推定されてもよい。
小容量ゲルの場合（図２４Ａ～２４Ｃ）、抗微生物剤は、固相増殖培地の体積全体にわたり迅速且つ効率的に拡散することが予想されるので、及び抗微生物剤は、環状ディスクからほぼ完全に拡散することが予想されるので、有効抗微生物剤濃度は、環状ディスク上に提供された抗微生物剤の質量をゲルの体積で除算することによって推定されてもよい。図２１Ａに見られるように、この濃度は、１～２時間を超える時間窓では、真の濃度の良い近似であることが予想される。したがって、図２４Ａ～２４Ｃの場合の小容量ゲルの有効抗微生物剤濃度は、ディスクに含浸させた薬物質量の０．２５倍と推定された。例えば、１６μｇのノルフロキサシンが装填された環状ディスクの薬物曝露領域における薬物濃度は４μｇ／ｍＬである。したがって、異なる薬物曝露領域での薬物濃度が計算され、図２４Ｃに提示される。
図２４Ｂと図２４Ｃを比較すると、０．５μｇで標識されたＬＤ－ＡＳＴユニット（０．１μｇ／ｍｌの推定有効濃度を有する）では、インキュベーションの３～４時間の間に目に見える増殖がないようであることが観察（又は計算で判定）され得る。この増殖の停止は、図２４Ｃに示されるように、一晩培養した後のＲＯＩを画像化することによって検証された。その結果、この試験のＭＩＣ値は０．１μｇ／ｍＬと推定された。米国のＣＬＳＩ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）及び欧州のＥＵＣＡＳＴ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ）が公表している解釈基準によれば、このＭＩＣ値は、Ｓ＝感受性に分類され得る。この値は、従来の微量希釈法を介して得られた０．１のＭＩＣ値、及びＶｉｔｅｋ ２（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）によって報告された０．５Ｓμｇ／ｍＬ以下の値と比較され得る。したがって、報告されたＭＩＣが参照法の±１の２倍希釈以内であるため、０．１のＭＩＣ値は、双方の参照法と本質的に一致している。
図２５Ａ～２５Ｃ及び２６Ａ～２６Ｃは、それぞれ、中容量（マイクロウェル内の１５０μＬのゲル体積）及び大容量（マイクロウェル内の３５０μＬのゲル体積）の場合に対応する。これらの場合、インキュベーション中の濃度の時間的変動がより大きいため、観察結果を参照微量希釈アッセイと相関させることによって、有効抗微生物剤濃度が判定されてもよい。図に見られるように、１μｇで標識されたマイクロウェルでは、微生物の増殖が停止していることが明らかである。
本発明者らは、より少ないゲル体積の場合、より大きなゲル体積と比較して、抗微生物剤濃度のより低い時間依存性が、どのマイクロウェルが増殖阻害に対応するかを判定する際に、より高い明確さをもたらすことを見いだした。これは、バンコマイシンに曝露されたスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のＭＩＣ値を判定する場合を提示することによって例示される。２種類のＬＤ－ＡＳＴユニット、すなわち「薄型」と「中厚型」のＲＯＩの画像が、それぞれ図２７Ａと２７Ｂに示される。「薄型」の場合（図２７Ａ）、ＭＩＣのＬＤ－ＡＳＴユニットのコロニーと次のウェル（薬剤濃度がより低い）のコロニーとの間に明確な差があるにもかかわらず、「中厚型」の場合（図２７Ｂ）、その差は顕著ではない。この場合、１２μｇと標識されているような境界線上のＬＤ－ＡＳＴユニットでの細胞増殖は、画像処理によって判定されることが好ましいであろう。例えば、タイムラプス顕微鏡画像が取得されて、位置合わせされ、差分画像（位置合わせされた画像の減算によって取得される）を処理し、増殖の証拠が検出され得る。例えば、この手順は、図２７Ｂの１２μｇの画像に対して実施例１３に従って実施された。３行目に提示される差分画像はヌルではなく、コロニーが実際に増殖し続けていることを示唆している。この結論は、ストリップをさらに一晩インキュベートすることによって検証された。
図２７Ａから、ＭＩＣ値は３μｇ／ｍＬであることが分かる。ＣＬＳＩが公表している解釈基準によれば、取得されたＭＩＣ値は、Ｉ＝中間に分類される。参照値との「軽微な誤差」ではあるものの、取得されたＭＩＣは、Ｖｉｔｅｋ ２の１μｇ／ｍＬ（感受性；Ｓ）の値よりも明らかに大きい。さらに、ブロス微量希釈ＡＳＴが実施例１１に従って実施され、１．５μｇ／ｍＬのＭＩＣが見いだされ、これは、ＣＬＳＩによる「Ｓ」結果に対応する。カテゴリー的には一致していないが、試験法（ＬＤ－ＡＳＴ）のＭＩＣは参照法から＋／－１の２倍希釈であり、これはブロス微量希釈ＡＳＴと比較して軽微な誤差に相当する。
ＬＤ－ＡＳＴのＭＩＣと参照法の間の軽微な差が予想される。ディスク拡散の標準化プロトコル［ＨＡＲＤＹＤＩＳＫ（商標）ＡＮＴＩＭＩＣＲＯＢＩＡＬ ＳＥＮＳＩＴＩＶＩＴＹ ＴＥＳＴ（ＡＳＴ）－取扱い説明書］によると、その他の生物及び薬剤に対する従来の１６～１８時間と比較して、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）又は腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種に対しては、バンコマイシン及びオキサシリンでは２４時間のインキュベーションが必要である。文献によると、チューブ微量希釈及び寒天試験によるバンコマイシンＭＩＣ分布は、ブロス微量希釈によって評価されたものとは顕著に異なり、２４時間及び４８時間にわたり異なるかもしれない［Ｖａｕｄａｕｘ，Ｐｉｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．“Ｕｎｄｅｒｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ ａｎｄ ｔｅｉｃｏｐｌａｎｉｎ ＭＩＣｓ ｂｙ ｂｒｏｔｈ ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｕｎｄｅｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ－ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ．”Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．５４，９（２０１０）：３８６１－７０．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＡＣ．００２６９－１０］。さらに、Ｅ－ｔｅｓｔ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ ＡＢ ＢＩＯＤＩＳＫ，ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｉｎｃ．，Ｈａｚｅｌｗｏｏｄ，Ｍｏ．））によって作製されたバンコマイシンＭＩＣは、ブロス又は寒天希釈によって判定されたＭＩＣよりも高いことが知られている。したがって、バンコマイシンを用いた実験結果は、ブロス微量希釈及び簡略化集団分析寒天［Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｎｉｍｕｍ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．Ａｎｄｒｅｗｓ ＪＭ Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００１ Ｊｕｌ；４８ Ｓｕｐｐｌ １（）：５－１６．］法の双方で相互検証された。上述したように、観察された結果を参照法と比較して、適切な有効な抗微生物剤濃度が推測され得る。
小容量ゲルのＭＩＣと、ＥＵＣＡＳＴで報告されているＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及びバンコマイシンの典型的なＭＩＣ値との間に観察された差が、環状ディスクの幾何学形状とそれに対応する拡散力学に起因するものではないことを検証するために、以下の実験が実施された。目標抗微生物剤の２倍連続希釈液が水中で調製された。次に、各希釈液の２０μＬが、実施例１０の方法に従って調製された「薄型」マイクロウェルの表面上にピペットで移された。約１０分後、抗微生物剤溶液はゲルの上部内に拡散した。次に、１μＬの微生物細胞懸濁液が添加され、対照ウェル（抗微生物剤濃度０）の微生物コロニーが目に見えるまで３７℃でインキュベートされた。この様式で認められたＭＩＣは３μｇ／ｍＬであった。
アッセイの最初の１時間におけるＲＯＩでの抗微生物剤濃度の変動に対するＬＤ－ＡＳＴの非感受性をさらに例証するために、アッセイが、環状ディスクが固相増殖培地と接触された後、微生物細胞懸濁液の即時接種を伴う第１の直接プロトコル、及び環状ディスクが固相増殖培地と接触されてから１時間後に、微生物細胞懸濁液が接種される第２の遅延プロトコルの２つの異なるプロトコルで実施された。結果は、バンコマイシンに曝露されたスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の場合について、図２８に示されている。図に見られるように、２つのプロトコルの微生物細胞増殖プロファイルに観察可能な差はなく、ＭＩＣは２つのプロトコルで等しい。
遅延性病原性真菌細胞に対して抗微生物剤感受性試験を実施する
病原性真菌細胞は増殖が遅く、真菌細胞のための市販の抗微生物剤感受性試験はそれに応じて遅い。本例では、ＬＤ－ＡＳＴ法及びデバイスが、結果が出るまでの時間に関して、細菌細胞と真菌細胞で類似していることが例示される。さらに、利用可能な抗真菌剤の数は抗菌剤の数よりも少ないため、真菌微小コロニーは、細菌細胞の場合の１００μＬに対して、真菌細胞の場合は２０μＬなど、より少ない体積で再懸濁させてもよい。したがって、真菌細胞の採取は、細胞数が約５００ＣＦＵ（約９サイクルの増殖）に達した時点で実施され得る。
異なるレベルのアンフォトリシンＢを有する一連のＬＤ－ＡＳＴユニットが調製され、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）（ＡＴＣＣ ９００２８）に対して試験された。３及び４時間のインキュベーション時間で取得されたＲＯＩの画像が、図２９に示される。実施例１３の手順に従って画像を分析したところ、２μｇ／ｍＬに対応するＬＤ－ＡＳＴユニットの細胞が増殖を停止したことが見いだされた。したがって、ＭＩＣは２μｇ／ｍＬと判定された。１μｇ／ｍＬに対応するＬＤ－ＡＳＴユニットでの増殖の結論は、図２９のｔ＝３及び４のインキュベーション画像の目視検査では容易に気付かれなかったが、図中の一晩インキュベーションの行を参照することで検証された。
陽性培養サンプルに対する抗微生物剤感受性試験を実施する
陽性血液培養サンプルなどの陽性培養サンプルは、最小限の追加的なサンプル処理ステップで、又は追加的なサンプル処理ステップなしで、上記の方法を用いて抗微生物剤感受性について試験され得る。この融通性は、次の２つの特徴に起因する：ｉ）少なくとも２桁に広がる範囲にわたる微生物細胞濃度に対する方法の非感受性、及びｉｉ）固相上でアッセイを実施し、微小コロニーの画像化を介して細胞増殖をモニタリングする。これらの特徴は、典型的には、低レベルの背景散乱体を要する光散乱測定を介した細胞濃度の正確な測定が必要でないことを暗示する。陽性血液培養サンプルでＡＳＴを実施するためのＬＤ－ＡＳＴの融通性を実証するために、以下の実験が実施された。
メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（強い耐性がないＭＲＳＡ １１１）が、５～１０ＣＦＵ／ｍｌの名目上濃度で１０ｍＬの全血サンプルにスパイクされた。次に、ＦＡ Ｐｌｕｓ好気性血液培養ボトルに１０ｍＬのスパイクした全血が接種され、培養が陽性になるまで３７℃でインキュベートされた。この時点で、３０μＬの細菌細胞のグリセロールストックが３ｍＬのＴＳＢに接種され、１５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で３時間インキュベートされた。ＯＤ測定に基づいて、それぞれの細菌の連続希釈液は、ＴＳＢ中で名目上濃度１０５ＣＦＵ／ｍＬで調製された。陽性血液サンプルのアリコートは、ＴＳＢで１０００倍に希釈された。２つのサンプルが、「薄いストリップ」タイプのＬＤ－ＡＳＴを用いて、オキサシリンに対する感受性について同時に試験された。図３０に提示される結果は、１μｇ／ｍＬの同様のＭＩＣ値を示す。
抗微生物剤のパネルに対して抗微生物剤感受性試験を実施する
この例では、Ｓｅｎｓｉｔｉｔｒｅグラム陽性ＧＰＡＬＬ１Ｆプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と同様の抗微生物剤のパネルが準備された。９６ウェルマイクロプレートの形態の市販のプレートには、それぞれがいくつかの臨床的に妥当な濃度の２３種類の抗微生物剤が含まれる。実施例１４のプロトコルに従って、ＭＲＳＡ－１１０に対してマイクロブロス希釈ＡＳＴ試験が実施され、結果は図３１Ａに示された。
薄型ＬＤ－ＡＳＴユニットは上記のプレートに対応して調製され、すなわち、マイクロブロス希釈ウェルとＬＤ－ＡＳＴユニットが１対１で対応するように、同じ抗微生物剤と同じ濃度が用いられた。ＬＤ－ＡＳＴユニットはゲルウェル上に置かれ、ＬＤ－ＡＳＴが実施例１５の方法に従って実施された。結果は判定され、図３１Ｂに示された。見られるように、結果は市販のブロス希釈ＡＳＴの結果と一致している。
いくつかの例の抗微生物剤－微生物細胞の組み合わせに対するＬＤ－ＡＳＴ
本例は、ＬＤ－ＡＳＴ法とブロス微量希釈ＡＳＴの間の性能が類似している可能性を例示するために提供され、ＬＤ－ＡＳＴの結果が出るまでの時間がわずか４時間であるのにもかかわらず、従来のブロス微量希釈ＡＳＴでは１６～２０時間必要だったのとは全く対照的である。
抗微生物剤の選択されたパネルに対応する薄型ＬＤ－ＡＳＴユニットが調製され、ＬＤ－ＡＳＴ法が、実施例１５の方法に従って選択された微生物株に対して実施された。結果は図３２に示されるが、その中ではＣＬＳＩガイドラインに従って以下のような略語が用いられる：ＥＡ－試験法のＭＩＣが参照法から＋／－１の２倍希釈；ＣＡ／マイナーカテゴリー一致（すなわち、試験法のＭＩＣの感受性（Ｓ）、中程度（Ｉ）又は耐性（Ｒ）の解釈が、参照法のＳ、Ｉ又はＲの解釈と一致する）。
以下の実施例は、当業者が本開示の実施形態を理解し、実践することを可能にするために提示される。それらは、開示の範囲を制限するものと見なされるべきではなく、単にその例示的且つ代表的なものと見なされるべきである。
実施例１：微生物細胞培養物の調製
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＳＡ）及びストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＳＰ）を除くグラム陽性細菌細胞培養物は、以下のように調製した：
１．３０μＬのそれぞれの細菌種と菌株のグリセロールストックを３ｍＬのトリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）に接種し、１５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。
２．ＴＳＢで１０倍に希釈した培養物を３７℃で１時間（エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）（Ｅｆｃｌ）、エンターコッカス・ファエシウム（Ｅｎｔｅｒｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）（Ｅｆｃｍ）、及びストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａ）（Ｓａｇ））インキュベートし、又は２時間（スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）（ＳＥ）、スタフィロコッカス・ヘモリチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）（ＳＨ）、及びストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｓｐｙｏ））インキュベートした。
シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）を除きグラム陰性細菌細胞培養物を以下のように調製した：
１．３０μＬのそれぞれの細菌種と菌株のグリセロールストックを３ｍＬのＴＳＢに接種し、１５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。
２．ＴＳＢで１０倍に希釈した培養物を３７℃で１時間（アシネトバクター・バウマンニイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）（ＡＢ）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）コンプレックス（Ｅｃｌ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）（ＥＡ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＥＣ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）（ＫＯ）、クレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＫＰ）、及びプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ））インキュベートし、又は２時間（セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）（ＳＭ））インキュベートした。
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＳＡ）細胞培養物は、以下のように調製した：
３０μＬのそれぞれの株のグリセロールストックを３ｍＬのＴＳＢに接種し、１５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で３時間インキュベートした。
ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＳＰ）細胞培養物は、以下のように調製した：
３０μＬのそれぞれの種又は株のグリセロールストックを３ｍＬのＴＳＢに接種し、ＣＯ２発生パウチの存在下で８０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で３時間インキュベートした。
シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ）は、以下のように調製した：
１．６μＬのＰＡ株グリセロールストックを５％ヒツジ血液を含むトリプシンの大豆寒天（ＴＳＡ）プレートに画線塗抹し、３７℃で一晩インキュベートした（Ｐ１）。
２．細菌コロニーを寒天プレート上で、もう１回継代培養した（Ｐ２）。
３．プレートからの１つのコロニーを３ｍｌで接種した。
真菌細胞培養物は、以下のように調製した：
１．３０μＬのそれぞれの真菌種と菌株のグリセロールストックを３ｍＬのＴＳＢに接種し、１５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩インキュベートした。
２．ＴＳＢで１０倍に希釈した培養物を３０℃で２時間（カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）（ＣＡ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）（ＣＧ）、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）（ＣＰ）、及びカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）（ＣＴ））インキュベートした。
光学密度（ＯＤ）測定に基づいて、それぞれの細菌の連続希釈液をＴＳＢ中で名目上濃度１０３ＣＦＵ／ｍＬで調製した。
実施例２：スパイクされた全血サンプルの調製
ＳＰＳチューブを使用して、健常人からＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）内に５～８ｍＬの容量の血液サンプルを採取した。細菌細胞でスパイクする前に、チューブを平均４時間室温に保った。次に、それぞれの細菌細胞の名目上濃度が１０５ＣＦＵ／ｍＬの細菌細胞懸濁液の１００μＬを４ｍＬの血液に添加し、穏やかにボルテックス処理して混合した。したがって、微生物細胞の濃度は、名目上約２．５×１０３ＣＦＵ／ｍＬである。
実施例３：スパイクされたリン酸緩衝液サンプルの調製
約１０５ＣＦＵ／ｍＬのそれぞれの細菌細胞を有する１００ｕＬの細菌細胞懸濁液ストックを４ｍＬの１ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢ）に添加し、穏やかにボルテックス処理して混合した。したがって、微生物細胞の濃度は、名目上約２．５×１０３ＣＦＵ／ｍＬである。
実施例４：血液溶解試薬の調製
血液溶解試薬溶液は、４０ｍｇ／ｍｌのＳＰＳの濃度を有する１０ｍｌの溶液を用いて１００ｍＭ、ｐＨ１０の緩衝液濃度で調製された１０ｍＬの炭酸塩－重炭酸塩緩衝溶液、濃度７０ｍｇ／ｍｌのサポニン及び濃度０．３ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を組み合わせて調製し、体積２０ｍｌ、ＳＰＳ濃度２０ｍｇ／ｍｌ、サポニン濃度３５ｍｇ／ｍｌ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００濃度０．１５％ｗ／ｖ、緩衝液濃度５０ｍＭ、の範囲を有する試薬溶液を得、ｐＨ値は９．５～１０であった。
実施例５：４ｍＬのスパイクされた全血サンプルのサンプル処理
スパイクされた全血サンプルに対するサンプル調製は、次のように実施した：
１．１５ｍＬの遠心分離管内で、４ｍｌの血液溶解試薬を４ｍｌのスパイクされた全血サンプルに添加した。
２．ボルテックス装置の最大速度で１分間ボルテックス処理することによって、遠心分離管を混合した。
３．遠心分離管を４０００ｒｐｍで８分間遠心分離した。
４．７．９ｍｌの上清を取り出した。
５．残留物に２．９ｍＬの洗浄緩衝液を添加し、穏やかにボルテックス処理して溶液を混合し、４０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、１００μｌの残液が保持されるように２．９ｍＬの上清を取り出して廃棄することによって、第１の洗浄サイクルを実施した。
６．残留物に２．９ｍＬの洗浄緩衝液を添加し、穏やかにボルテックス処理して溶液を混合し、４０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、１００μｌの残液が保持されるように２．９ｍＬの上清を取り出して廃棄することによって、第２の洗浄サイクルを実施した。
７．残留物に１．９ｍＬの洗浄緩衝液を添加し、穏やかにボルテックス処理して溶液を混合し、４０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、１００μｌの残液が保持されるように１．９ｍＬの上清を取り出して廃棄することによって、第３の洗浄サイクルを実施した。
８．残留物に１．９ｍＬの洗浄緩衝液を添加し、穏やかにボルテックス処理して溶液を混合し、４０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、１００μｌの残液（細胞懸濁液）が保持されるように１．９ｍＬの上清を取り出して廃棄することによって、第４の洗浄サイクルを実施した。
実施例６：寒天プレートの調製
寒天プレートは、１～５％ｗ／ｖの最終寒天濃度で調製した。トリプシン大豆寒天培地血液（ＴＳＡＢ）プレートを調製するために、ＴＳＡＢ脱水培地：１リットルあたり配合物、寒天１３．５ｇｍ、カゼインペプトン１５．０ｇｍ、大豆ペプトン５．０ｇｍ、塩化ナトリウム５．０ｇｍ（Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＣＡ）を使用した。より高い寒天濃度（＞１．３５％ｗ／ｖ）の寒天プレートを調製するために、寒天細菌学等級の脱水培養培地（Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＣＡ）を所望の寒天濃度に応じて使用した。
滅菌脱線維化ヒツジ血液（Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＣＡ）を使用して、ゲルを濃縮し細菌増殖を促進した。調製ステップは次のとおりである：
１．寒天の追加的な粉末（必要な場合）を含むＴＳＡＢ粉末を１００℃のホットプレート上で、水浴内で分子生物学等級の水に１０分間溶解した。
２．溶液を（水浴で）１２１℃で１５分間オートクレーブ処理した。
３．溶液を約５５℃に１５分間冷却した。
４．３～５％のヒツジ血液（水浴内で５０℃に３０分間予熱）を冷却溶液に添加し、よく混合した。
５．溶液をペトリ皿（３５×１０ｍｍ）に分注し、５分間固化させた。
６．微生物汚染を防止するために、プレートを無菌環境内で保管した。
実施例７：寒天プレート上の微生物細胞の増殖速度及びコロニーサイズを測定する
寒天プレート上の微生物細胞の増殖速度は、以下のステップを通じて判定する：
１．名目上濃度１０５ＣＦＵ／ｍＬの開始細胞懸濁液を準備する。
２．寒天ゲルプレート上の３つの同定可能領域の１つに１μＬの細胞懸濁液を分注し、ミニ培養領域（ＭＣＲ）に広げて風乾させる。したがって、プレート上には、ＭＣＲ１、ＭＣＲ２、及びＭＣＲ３として同定される３つのＭＣＲがある。
３．ｔ０＝０時間でＭＣＲの画像を取得する。
４．プレートを３７℃で１時間インキュベートする。
５．細菌種の場合は２時間、真菌種の場合は４時間の時点でのＭＣＲ１の画像を取得する。
６．画像を分析して微小コロニーの面積を計算し、Ｄ＝２＊ｓｑｒｔ（面積／３．１４１６）の関係から対応する直径Ｄを計算する。次に、全ての微小コロニーを平均して平均直径を計算する。
７．綿棒でＭＣＲの微生物内容物を取り出し、２００μＬのＴＳＢ増殖培地に再懸濁する（細胞再懸濁液）。
８．ＴＳＢの細胞再懸濁液を１０の倍数で連続希釈し、得られたサンプルをＳ１００、Ｓ１０－１、Ｓ１０－２、Ｓ１０－３、及びＳ１０－４とラベルする。
９．サンプルをプレートし、一晩インキュベートする。
１０．ＭＣＲ２とＭＣＲ３について、それぞれ３、４時間、及び任意選択的に細菌種については６時間（真菌種については５時間及び６時間）でステップ５～９を繰り返す。一晩のコロニーを数え、それらを表にする。
１１．それに応じて、それぞれのＭＣＲ上の微生物細胞の数を計算する。
１２．対数線形プロットの時間プロットに対する細胞数の勾配を計算することによって、増殖速度を判定する。
１３．平均コロニー直径対コロニー細胞含有量をプロットする。
１４．微小コロニーの細胞数が、１０３及び１０５に達する平均直径を判定する。
実施例８：血液サンプルから微生物細胞を分離する回収率を測定し寒天プレート上にコロニー形成させる
スパイクされた全血サンプルの回収率を次のように測定した：
１．図１３Ａに示されるように、チャンバー５０３内に実施例４のＢＬＲを４ｍＬ含有するカートリッジ内で、チャンバー５０１に４ｍＬのスパイクされた全血サンプル（実施例２に従って調製された）を添加した。
２．血液サンプル及びＢＬＲは、ＢＬＲをチャンバー５０１に移動させ、得られた混合物をチャンバー５０１と５０３の間で行ったり来たり（ｂａｃｋ ａｎｄ ｆｏｒｅ）５回移動させることによって混合した。
３．カートリッジを３０００ｇで８分間遠心分離した。
４．７．９ｍｌの上清を廃棄物チャンバー５０６に移した。
５．第１の洗浄サイクルは、残留物に２．９ｍＬの洗浄緩衝液を添加し、チャンバー５０１と５０３の間で穏やかに移動させ溶液を混合することによって実施した。
６．３０００ｇで３分間遠心分離する。
７．２．９ｍｌの上清を廃棄物チャンバー５０６に移した。
８．２回目の洗浄では、ステップ５～７を繰り返す。
９．１００μＬの残留物（細胞懸濁液）を取り出す。
１０．細胞懸濁液を寒天プレートにプレートし、３７℃で一晩インキュベートする。
１１．コロニーを数え、対照プレートに従った期待数と比較して回収率を計算する。
実施例９Ａ：抗生物質による環状ディスクの被覆
直径６．３５ｍｍ、厚さ０．７５ｍｍのブランクＡＳＴペーパーディスク（Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｚ７１２１）は、中央に３ｍｍの穴を含むように改変した。各ペーパーディスクには、飽和するまでに約２０μＬの液体を吸収する能力がある。各抗生物質について、ＭＩＣ値が疑われる濃度に近いものも含めて、水で２倍の連続希釈を行った。ディスクを９６ウェルマイクロプレートの個々のウェルに分け入れて、次に各抗生物質希釈液の２０μＬをペーパーディスクにピペットで移し、ディスク全体が確実に均等に濡れるようにした。室温で約２０分間のインキュベーション後、マイクロプレート内のディスクを真空デシケーター内で乾燥させた。代案としては、マイクロプレートウェル内に分け入れた個々のディスクは、過剰量（３０～５０μＬ）の抗生物質希釈液に浸漬し得る。インキュベーション後、過剰な液体をピペットで除去し、真空デシケーター内で乾燥させる。次に、マイクロプレートを粘着性カバーで覆って、４℃で貯蔵した。
実施例９Ｂ：放射状に変動する濃度で環状ディスク上に抗生物質を被覆する
直径６．３５ｍｍ、厚さ０．７５ｍｍのブランクＡＳＴペーパーディスク（Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｚ７１２１）を平型培養皿（例えば、２４ウェル培養皿）に分け入れた。実施例９Ａに記載されるように、各抗生物質の２倍連続希釈を行い、次に２０μＬの各希釈物をピペットで各ディスクに滴下した。次に、ディスクをデシケーター内で高真空（０．５～２ｍＴｏｒｒ）下で１時間乾燥させた。乾燥したら、１５μＬの水を各ディスクの中央にピペットで入れ、水がディスクの端に向かって外向きに放射するようにした。次に、ディスクを真空デシケーター下で、再び１時間乾燥させた。次に、ディスクの中央に３ｍｍの穴を開けた。それらを９６ウェルマイクロプレートの個々のウェルに移し、次に粘着性カバーで密封し４℃で貯蔵した。
実施例１０：血液寒天マイクロウェルを調製する
トリプシン大豆寒天血液ベース（Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃ５２２１）は、製造業者によると、１％の脱線維化ヒツジ血液を使用して調製された。寒天がまだ暖かいうちに（４５～５０℃）、１２×８ウェルストリッププレートのウェルにピペットで移し入れた。「薄いゲル」では、約５０μＬの寒天を個々のウェルに分注して、ゲルの厚さを約１ｍｍにした。「中厚ゲル」では、約１５０μＬの寒天を分注して、ゲルの厚さを約３ｍｍにした。最後に、「厚いゲル」では、約３５０μＬの寒天を分注して、ゲルの厚さを約７ｍｍにした。次に、寒天ゲルを室温まで冷却して固化し、即座に使用し、又はゲルの乾燥を防止するためにウェルを粘着性カバーで覆って４℃で貯蔵した。
実施例１１：ブロス微量希釈ＡＳＴを実施する
ブロス（トリプシンの大豆、場合によっては脳心臓浸出物）中の抗微生物剤の中間２倍希釈。１００μＬの抗微生物剤／ブロス溶液を９６ウェルプレートの各ウェルに三連で分注した。次に、各ウェルに、実施例５の方法に従って調製された１０μＬの５×１０６ＣＦＵ／ｍＬ細胞懸濁液を添加した。プレートを密封し、３５～３７℃のインキュベーターに１６～２４時間入れ、ＭＩＣ値を判定した。
実施例１２：接種物調製
接種材料は、ブロス培養法を用いて調製した。手短に述べると、培養する細菌に応じて細菌グリセロールストックの３０～１００ｕｌのアリコートを解凍し、２～３ｍＬの適切な培地（トリプシン大豆又は脳心臓浸出物）に添加した。次に、１５０ｒｐｍに設定された振盪機を用いて、細菌培養物を３７℃でインキュベートし、２～３時間増殖させた。調製後１５分以内に、接種懸濁液を０．５マックファーランド基準（１×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）に調節し、引き続いてブロスで１：２０に希釈して５×１０６ＣＦＵ／ｍＬを得た。
実施例１３：増殖を判定するためのタイムラプス画像の処理
異なる時点（播種後２、３、４、及び５時間）で取得されたイメージングデータを位置合わせするために、剛体変換拘束を用いた２Ｄ－２Ｄレジストレーション（並進と回転のみが許される）を実施した。以前の時点（ｔｎ－１又はｔｎ－２）の画像、いわゆる参照と、それ以降の各画像（いわゆる浮動画像）との間の対応する強度特徴点を、キーポイント検出器ＳＵＲＦを用いて自動的に同定し、参照データに対して撮影日（ｉｍａｇｉｎｇ ｄａｔｅ）を位置合わせするのに使用した。参照画像に存在する強度の特徴を背景として分類する一方、それ以降の画像（細胞／バグ）に出現する強度の特徴は前景として分類した。所与の個々の微小コロニーの位置は、連続的画像でマーキングされている。背景を設定することで、微小コロニーとその増殖の検出を強化できるようになる。
実施例１４：市販のプレートを使用してブロス微量希釈を実施する
１．３～５個のコロニーを水に添加し、０．５マックファーランド細胞懸濁液を調製した。
２．目標細胞に応じて、１μＬ、１０μＬ、又は３０μＬの細胞懸濁液をＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎブロス（ＭＨＢ）増殖培地に添加し、マイクロウェルプレートの各ウェル内で５０μＬの体積にした。
４．プレートを密封し、非ＣＯ２インキュベーター内で３４～３６℃で１８～２４時間インキュベートした。
５．ウェルを濁度について検査した。
実施例１５：ＬＤ－ＡＳＴを実施する
１．微生物ストック懸濁液を実施例１の方法に従って調製する。
２．このストックにＴＳＢ培地を添加して希釈し、１０５ＣＦＵ／ｍＬの濃度にする。
３．ＬＤ－ＡＳＴユニットは、マイクロウェルストリップ内の対応するゲルと結合している。
４．ステップ２のサンプルの１μＬを各ＬＤ－ＡＳＴユニットのＲＯＩに分注する（ｄｉｓｐｅｎｄｅｄ）。
５．ストリップを３７℃で３時間インキュベートする。
６．ＲＯＩを画像化する。
７．ストリップをさらに１時間インキュベートする。
８．ＲＯＩを画像化する。
９．２つの画像を実施例１３の方法に従って比較する。
１０．ストリップを一晩インキュベートし、増殖の存在を確認する。
上記の特定の実施形態は例示のために示されているが、これらの実施形態は、様々な修正及び代替形態を受け易くあってもよいものと理解されるべきである。特許請求の範囲は、開示された特定形態に限定されることを意図するのではなく、むしろ本開示の精神及び範囲内にある全ての修正、同等物、及び代替物を網羅することを意図するものとさらに理解されるべきである。

Claims (202)

  1. 微生物細胞を含有するサンプルを処理する方法であって、
    サンプル処理モジュール及び増殖モジュールを含んでなる統合流体デバイスに、サンプルを導入するステップと；
    前記統合流体デバイスを閉じた状態に維持して、外部微生物細胞の侵入を防ぎながら：
    前記サンプルを前記サンプル処理モジュール内で処理して、前記微生物細胞を前記サンプルから分離し、液体中に懸濁された前記微生物細胞を含んでなる微生物細胞懸濁液を得るステップと；
    前記微生物細胞懸濁液が、前記増殖モジュール内に存在する微生物細胞増殖を促進するように構成されている固相増殖培地と接触するように、前記微生物細胞懸濁液を前記サンプル処理モジュールから前記増殖モジュールに輸送するステップと；
    少なくとも１つの微生物細胞が前記固相増殖培地の表面上に保持されるように、液体の少なくとも一部を前記微生物細胞懸濁液から除去するステップと；
    コロニーの増殖を促進するのに適した条件下で、少なくとも前記増殖モジュールをインキュベートするステップと
    を含んでなる、方法。
  2. 前記液体の少なくとも一部が、前記固相増殖培地による前記液体の少なくとも一部の吸収によって除去される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記液体が第１の液体であり、前記固相増殖培地がゲルベースの培地であり、前記方法が、前記微生物細胞懸濁液が部分的に脱水された固相増殖培地と接触したときに、前記第１の液体の少なくとも一部が、前記部分的に脱水された固相増殖培地による吸収を介して除去されるように、前記微生物細胞懸濁液を前記固相増殖培地と接触させる前に、前記統合流体デバイスを遠心力に曝して、前記固相増殖培地から第２の液体を除去し、それによって前記部分的に脱水された固相増殖培地を得るステップをさらに含んでなる、請求項２に記載の方法。
  4. 前記遠心力が１，０００ｇ～１０，０００ｇの範囲である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記サンプルが前記サンプル処理モジュール内で処理され、前記微生物細胞を遠心分離ベースの分離法により前記サンプルから分離し、前記遠心力が前記遠心分離ベースの分離法中に前記固相増殖培地に印加される、請求項３又は４に記載の方法。
  6. 前記遠心力が、前記固相増殖培地の表面に関連する表面法線から３０度未満の方向に印加される、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記遠心力が、前記固相増殖培地の前記表面に垂直な方向に印加される、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記微生物細胞懸濁液と接触する前記表面が第１の表面であり、前記固相増殖培地が前記第１の表面に対向する第２の表面をさらに含んでなり、前記遠心力が、前記第２の液体が前記第２の表面に近接する領域から除去されるように印加される、請求項３～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記微生物細胞懸濁液と接触する表面が第１の表面であり、前記固相増殖培地が前記第１の表面に対向する第２の表面をさらに含んでなり、前記遠心力が、前記第１の表面に近接する前記固相増殖培地の前記第１の領域が、前記第２の表面に近接する前記固相増殖培地の第２の領域よりもさらに脱水されるように印加される、請求項３～７のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記第２の液体が、前記固相増殖培地と流体連通する吸収性材料によって吸収される、請求項３～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 多孔質膜が、前記固相増殖培地と前記吸収性材料との間に存在する、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記遠心力が第１の遠心力であり、前記方法が、前記部分的に脱水された固相増殖培地を前記微生物細胞懸濁液と接触させた後に、前記統合流体デバイスを第２の遠心力に曝して、前記部分的に脱水された固相増殖培地による前記微生物細胞懸濁液からの前記液体の少なくとも一部の吸収、及び前記表面上の前記少なくとも１つの微生物細胞の保持を促進するステップをさらに含んでなる、請求項３～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記第２の遠心力が５００ｇ～４０００ｇの範囲である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記固相増殖培地が、前記液体の少なくとも一部を受動的に吸収するように構成されている、請求項１に記載の方法。
  15. 前記固相増殖培地が多孔質ネットワークを含んでなり、前記微生物細胞懸濁液と接触する前に少なくとも部分的に脱水された状態で存在する、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記固相増殖培地が、部分的に脱水されたハイドロゲルとして提供される、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記液体の少なくとも一部が、ガス透過性膜を通じて蒸発的に除去される、請求項１に記載の方法。
  18. 前記液体の少なくとも一部が、空気の能動的循環を介して蒸発的に除去される、請求項１に記載の方法。
  19. 前記微生物細胞が、濾過、免疫磁気分離、及びマイクロ流体分離からなる群から選択される分離法を介して分離される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記固相増殖培地の前記表面上に保持される少なくとも１つの微生物細胞が、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）微生物細胞であり、前記ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）微生物細胞に関連するコロニー増殖が、前記増殖モジュール内の二酸化炭素環境の制御の不在下で達成される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記サンプルが全血サンプルであり、前記微生物細胞が、
    前記全血サンプルと、サポニン、ポリアネトールスルホン酸ナトリウム、及びアルカリ性緩衝液を含んでなる血液溶解試薬とを混合し、サポニンの濃度が０．７５～６０ｍｇ／ｍｌの間、ポリアネトールスルホン酸ナトリウムの濃度が０．３５～５０ｍｇ／ｍｌの間、ｐＨが７．８～１０の間の混合物を得るステップと、
    微生物細胞を前記混合物から分離するステップと
    によって、前記サンプル処理モジュール内の前記サンプルから分離される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記固相増殖培地上の１００ミクロン未満の直径を有するコロニーの存在を検出するステップと；
    微生物細胞を前記コロニーから採取するステップと
    をさらに含んでなる、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記固相増殖培地上の前記コロニーの存在を検出するステップが、
    前記固相増殖培地の第１の画像を取得するステップと；
    前記増殖モジュールのインキュベーション中の時間遅延後に取得される、前記固相増殖培地の第２の画像を取得するステップと；
    前記画像に存在する表面アーチファクトを使用して、前記第１の画像を前記第２の画像にレジストレーションするステップと；
    前記レジストレーションした第１及び第２の画像に対して画像減算を実施して、前記第２の画像から表面アーチファクトを除去し、それによって減算された画像を取得するステップと；
    前記減算された画像を処理して、前記コロニーの位置を特定するステップと
    を含んでなる、請求項２２に記載の方法。
  24. さらに、前記表面アーチファクトの少なくともサブセットが、前記固相増殖培地の前記表面上の不均一性である、請求項２３に記載の方法。
  25. さらに、前記表面アーチファクトの少なくともサブセットが、前記固相増殖培地の前記表面上に存在する溶解残骸粒子であり、前記溶解残骸粒子が、前記サンプル処理モジュールを用いた前記サンプルの溶解によって生成される、請求項２３に記載の方法。
  26. 前記溶解残骸粒子が血液溶解残骸粒子である、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記血液溶解残骸粒子の平均粒径が１０ミクロン未満である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記溶解残骸粒子による前記固相増殖培地の被覆の面分率が２０％未満となるように前記サンプル処理モジュールが構成されている、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記溶解残骸粒子による前記固相増殖培地の被覆の面分率が５０％未満となるように前記サンプル処理モジュールが構成されている、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記溶解残骸片粒子による前記固相増殖培地の被覆の面分率が９０％未満となるように前記サンプル処理モジュールが構成されている、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記採取した微生物細胞を用いて、抗微生物剤感受性試験を実施するステップをさらに含んでなる、請求項２２～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記微生物細胞を前記コロニーから採取する前に、前記コロニーの生存能力を損なうことなく前記コロニーを照会して、微生物クラスのセットから選択される微生物細胞クラスに属するものとして前記微生物細胞を分類することをさらに含んでなる、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記選択された微生物細胞クラスが、前記コロニーの測定された増殖速度に少なくとも部分的に基づいて判定される、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記微生物細胞の前記選択された微生物細胞クラスが、細菌細胞及び真菌細胞を含んでなる前記微生物細胞クラスのセットから選択される、請求項３２に記載の方法。
  35. 前記微生物細胞の前記選択された微生物細胞クラスが、細菌細胞及び真菌細胞からなる前記微生物細胞クラスのセットから選択される、請求項３２に記載の方法。
  36. 前記微生物細胞の前記選択された微生物細胞クラスが、グラム陽性細菌細胞、グラム陰性細菌細胞、及び真菌細胞を含んでなる前記微生物細胞クラスのセットから選択される、請求項３２に記載の方法。
  37. 前記微生物細胞の前記選択された微生物細胞クラスが、グラム陽性細菌細胞、グラム陰性細菌細胞、及び真菌細胞からなる前記微生物細胞クラスのセットから選択される、請求項３２に記載の方法。
  38. 前記抗微生物剤感受性試験が、１つ又は複数の抗生物質を使用して実施され、前記１つ又は複数の抗生物質が、前記選択された微生物細胞クラスに従って選択される、請求項３２～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記選択された微生物細胞クラスを用いて、前記コロニーが、抗微生物剤感受性試験を実施するのに十分な量の微生物細胞を含有すると予想される時期を判定するステップをさらに含んでなり、前記採取された微生物細胞が、前記コロニーが十分な量の微生物細胞を含有すると判定された後に採取される、請求項３２～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記コロニーが前記十分な量の微生物細胞を含有するという判定が、前記選択された微生物細胞クラス及び前記コロニーのサイズに関連する光学的に検出されたコロニーサイズ測定値に基づいて行われる、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記コロニーが前記十分な量の微生物細胞を含有する時点の判定が、前記選択された微生物細胞クラスと前記コロニーサイズ測定値との間の所定の関係に基づく、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記コロニーが前記十分な量の微生物細胞を含有する時点の判定が、前記選択された微生物細胞クラスと増殖持続時間との間の所定の関係に基づく、請求項３９に記載の方法。
  43. 前記コロニーが前記十分な量の微生物細胞を含有する時点の判定が、前記コロニーの測定された増殖速度に少なくとも部分的に基づく、請求項３９に記載の方法。
  44. 前記コロニーが前記十分な量の微生物細胞を含有するという判定が、前記コロニーのサイズに関連する光学的に検出されたコロニーサイズ測定値に基づいてさらに行われる、請求項４２に記載の方法。
  45. 前記固相増殖培地が発色性増殖培地であり、前記選択された微生物細胞クラスが、前記コロニーの検出されたスペクトル特徴に基づいて判定される、請求項３２に記載の方法。
  46. 前記スペクトル特徴が、ラマン顕微鏡法を介して検出される、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記スペクトル特徴が、フーリエ変換赤外分光法顕微鏡法を介して検出される、請求項４５に記載の方法。
  48. 前記スペクトル特徴が、蛍光顕微鏡法を介して検出される、請求項４５に記載の方法。
  49. 光ビームを前記コロニーに向けるステップと；
    前記コロニーから散乱光の画像を取得するステップと；
    前記画像を処理して、前記選択された微生物細胞クラスを判定するステップと
    を含んでなる、前記コロニーを照会して、前記選択された微生物細胞クラスを判定する、請求項３２に記載の方法。
  50. 前記コロニーが肉眼で検出可能になる前に、微生物細胞が前記コロニーから採取される、請求項３１～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記コロニーが７０ミクロン～１００ミクロンの直径を有する時点で、微生物細胞が前記コロニーから採取される、請求項３１～４９のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記コロニーが１００ミクロンの直径に達する前に、微生物細胞が前記コロニーから採取される、請求項３１～４９のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記コロニーが５０ミクロンの直径に達する前に、微生物細胞が前記コロニーから採取される、請求項３１～４９のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記コロニーが７０ミクロンの直径に達する前に、微生物細胞が前記コロニーから採取される、請求項３１～４９のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記コロニーが第１のコロニーであり、前記第１のコロニーから採取された前記微生物細胞が第１の微生物細胞であり、
    前記固相増殖培地上の第２のコロニーの存在を検出するステップと；
    第２の微生物細胞を前記第２のコロニーから採取するステップと
    をさらに含んでなる、請求項３２～４９のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記抗微生物剤感受性試験が、前記第１のコロニー及び前記第２のコロニーの双方から採取された微生物細胞を使用して実施される、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記抗微生物剤感受性試験を実施する前に、前記第１のコロニー及び前記第２のコロニーを照会して、前記第１のコロニーと前記第２のコロニーとの間の表現型対応の有無を判定するステップをさらに含んでなる、請求項５５に記載の方法。
  58. 前記第１のコロニーと前記第２のコロニーとの間の前記表現型対応の有無が、前記第１のコロニーから検出された第１の光信号を前記第２のコロニーから検出された第２の光信号と比較することによって判定される、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記第１のコロニーと前記第２のコロニーとの間の前記表現型対応の有無が、前記第１のコロニーの第１の光学画像を前記第２のコロニーの第２の光学画像と比較することによって判定される、請求項５７に記載の方法。
  60. 前記選択された微生物細胞クラスが、前記第１のコロニー内の前記第１の微生物細胞の第１のタイプに関連する第１の選択された微生物細胞クラスであり、前記第１のコロニーと前記第２のコロニーとの間の前記表現型対応の有無が、
    前記第２のコロニーの生存能力を損なうことなく、前記第２のコロニーを照会して、前記第２のコロニー内の第２のタイプの第２の微生物細胞に関連する第２の選択された微生物細胞クラスを判定し、前記第２の選択された微生物細胞クラスは前記微生物細胞クラスのセットから選択される、ステップと；
    前記第１の微生物細胞クラスが前記第２の微生物細胞クラスと同じであるかどうかを判定するステップと
    によって判定される、請求項５７に記載の方法。
  61. 前記第１の微生物細胞クラスが、前記第１のコロニーの前記第１の微生物細胞の第１の種に関連し、前記第２の微生物細胞クラスが、前記第２のコロニーの前記第２の微生物細胞の第２の種に関連し、前記表現型対応の存在が、前記第１の種が前記第２の種と同じであると判定されたときに確立される、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記抗微生物剤感受性試験が、前記第１のコロニーと前記第２のコロニーとの間の前記表現型対応の存在を判定した後、前記第１の微生物細胞及び前記第２の微生物細胞の双方からの微生物細胞を使用して実施される、請求項５７～６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記表現型対応が、前記第１の微生物細胞と前記第２の微生物細胞との間に不在であると判定され、抗微生物剤感受性試験が、前記第１の微生物細胞と前記第２の微生物細胞を使用して別々に実施され、前記第１の微生物細胞と前記第２の微生物細胞の別々の抗微生物剤感受性測定値が判定される、請求項５７～６１のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記選択された微生物細胞クラスが、予備的に選択された微生物細胞クラスであり、前記予備的に選択された微生物細胞クラスが、第１の分類方法に従って判定され、前記微生物細胞クラスのセットが、微生物細胞クラスの第１のセットである、請求項５７～６１のいずれか一項に記載の方法であって、前記第１のコロニーと前記第２のコロニーとの間の前記表現型対応を判定した後、
    前記第２のコロニーから採取された前記第２の微生物細胞を照会して、前記第２の微生物細胞のタイプに関連する補足的微生物細胞クラスを判定するステップをさらに含んでなり、前記補足的微生物細胞クラスが、微生物細胞クラスの第２のセットから選択され、前記補足的微生物細胞クラスが、第２の分類方法に従って判定される、方法。
  65. 微生物細胞クラスの前記第２のセットが、微生物細胞クラスの前記第１のセットよりも多数の微生物細胞クラスを含む、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記補足的微生物細胞クラスが、微生物細胞クラスの前記第１のセットに不在である、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記補足的微生物細胞クラスが種レベルの微生物細胞クラスである、請求項６６に記載の方法。
  68. 微生物細胞クラスの前記第１のセットが種レベルの微生物細胞クラスを欠いており、微生物細胞クラスの前記第２のセットが複数の種レベルの微生物細胞クラスを含んでなる、請求項６５に記載の方法。
  69. 前記第２の分類方法が、前記第１の分類方法よりも高い信頼性で所与の微生物細胞クラスを判定できる、請求項６５に記載の方法。
  70. 前記補足的微生物細胞クラスが、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析を使用して判定される、請求項６４～６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記補足的微生物細胞クラスが、ラマン検出及び／又はフーリエ変換赤外分光法を使用して判定される、請求項６４～６９のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記第２のコロニーからの前記第２の微生物細胞は、前記第１のコロニーから前記第１の微生物細胞を採取した後に採取され、採取時に、採取時に前記第２のコロニーが前記第１のコロニーよりも大きくなるように、前記第２のコロニーが、前記第１のコロニーよりも長い時間インキュベートされる、請求項６４～７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記第２の分類方法による前記補足的微生物細胞クラスの判定を容易にするのに十分な量の微生物細胞を前記第２のコロニーが含有すると予想される時点を判定するステップをさらに含んでなり、前記第２のコロニーが前記十分な量の微生物細胞を含有すると判定された後に、前記第２の微生物細胞が前記第２のコロニーから採取される、請求項６４～７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記第２のコロニーが十分な数の微生物細胞を含有するという判定が、前記第１のコロニーからの前記第１の微生物細胞に対する抗微生物剤感受性試験を開始した後に行われ、前記第２の微生物細胞に関連する前記補足的微生物細胞クラスの判定が、前記抗微生物剤感受性試験の完了前に行われる、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記第１の微生物細胞が採取された後、前記第２の微生物細胞が採取される前に、前記第２のコロニーがインキュベートされて、さらなるコロニーの増殖が促進される、請求項７３又は７４に記載の方法。
  76. 前記第２の微生物細胞に関連する前記補足的微生物細胞クラスと、前記第１の微生物細胞に関連する最小阻害濃度とを報告するステップをさらに含んでなる、請求項６４～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記固相増殖培地が第１の固相増殖培地であり、前記微生物細胞懸濁液が第１の微生物懸濁液であり、前記抗微生物剤感受性試験が、
    前記採取した微生物細胞を再懸濁し、それによって第２の微生物細胞懸濁液を得るステップと；
    各位置が異なる局所抗生物質濃度を有する複数の位置で、追加的な固相増殖培地上に前記第２の微生物細胞懸濁液を分注するステップと；
    前記複数の位置をモニターして、前記微生物細胞の抗微生物剤感受性を推測するステップと
    によって実施される、請求項３１～７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記追加的な増殖培地が、その上に提供される疎水性層を有し、前記疎水性層上に形成された複数の開口部を有し、各開口部がそれぞれの位置に形成され、前記液体がそれぞれの開口部を通じて各位置に分注される、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記固相増殖培地が第１の固相増殖培地であり、前記微生物細胞懸濁液が第１の微生物懸濁液であり、前記抗微生物剤感受性試験が、
    前記採取した微生物細胞を再懸濁し、それによって第２の微生物細胞懸濁液を得るステップと；
    開口部を少なくとも部分的に取り囲む、接触面を含んでなる固体支持体を提供し、化学薬品を前記接触面上に提供し、及び／又は前記接触面の下に含浸させるステップと；
    前記第２の固相増殖培地の下位領域が前記開口部を通じてアクセス可能であり、前記化学薬品の少なくとも一部が前記下位領域内に内向きに拡散するように、第２の固相増殖培地を前記固体支持体の前記接触面と接触させるステップと；
    前記第２の微生物細胞懸濁液内の微生物細胞が前記下位領域の表面上に保持されるように、前記第２の微生物細胞懸濁液の体積を前記下位領域の前記表面上に沈着させるステップと；
    前記保持された微生物細胞を前記化学薬品に曝露させるのに十分に長い時間にわたり、前記第２の固相増殖培地をインキュベートするステップと；
    前記下位領域内の微生物細胞増殖の有無を検出するステップと
    によって実施される、請求項３１～７６のいずれか一項に記載の方法。
  80. 生存能力がある微生物細胞の増殖を促進するのに適した条件下で、前記生存能力がある微生物細胞の懸濁液を固相増殖培地と接触させるステップと；
    前記固相増殖培地上の１００ミクロン未満の直径を有するコロニーの存在を検出するステップと；
    前記コロニーを光学的に照会し、前記コロニーに関連する微生物細胞クラスを同定するステップと；
    前記微生物細胞クラスを用いて、前記コロニーが、抗微生物剤感受性試験を実施するのに十分な量の微生物細胞を含有すると予想される時点を判定するステップと；
    前記コロニーが抗微生物剤感受性試験に十分な量の微生物細胞を含有するように増殖した後、前記コロニーから微生物細胞を採取するステップと；
    前記採取した微生物細胞を用いて、抗微生物剤感受性試験を実施するステップと
    を含んでなる、微生物細胞を含有することが疑われるサンプルを処理する方法。
  81. 前記コロニーが第１のコロニーであり、前記第１のコロニーから採取された前記微生物細胞が前記第１の微生物細胞であって、
    前記固相増殖培地上の第２のコロニーの存在を検出するステップと；
    第２の微生物細胞を前記第２のコロニーから採取するステップと
    をさらに含んでなる、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記抗微生物剤感受性試験が、前記第１のコロニー及び前記第２のコロニーの双方から採取された微生物細胞を使用して実施される、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記抗微生物剤感受性試験を実施する前に、前記第１のコロニー及び前記第２のコロニーを照会して、前記第１のコロニーと前記第２のコロニーとの間の表現型対応の有無を判定するステップをさらに含んでなる、請求項８１に記載の方法。
  84. 前記第１のコロニーから検出された第１の光信号を前記第２のコロニーから検出された第２の光信号と比較することによって、前記第１のコロニーと前記第２のコロニーとの間の前記表現型対応の有無を判定する、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記第１のコロニーと前記第２のコロニーとの間の前記表現型対応の有無が、前記第１のコロニーの第１の光学画像を前記第２のコロニーの第２の光学画像と比較することによって判定される、請求項８３に記載の方法。
  86. 前記選択された微生物細胞クラスが、前記第１のコロニー内の前記第１の微生物細胞の第１のタイプに関連する第１の選択された微生物細胞クラスであり、前記第１のコロニーと前記第２のコロニーとの間の前記表現型対応の有無が、
    前記第２のコロニーの生存能力を損なうことなく、前記第２のコロニーを照会して、前記第２のコロニー内の第２のタイプの第２の微生物細胞に関連する第２の選択された微生物細胞クラスを判定し、前記第２の選択された微生物細胞クラスが前記微生物細胞クラスのセットから選択されるステップと；
    前記第１の微生物細胞クラスが前記第２の微生物細胞クラスと同じであるかどうかを判定するステップと
    によって判定される、請求項８３に記載の方法。
  87. 前記第１の微生物細胞クラスが、前記第１のコロニーの前記第１の微生物細胞の第１の種に関連し、前記第２の微生物細胞クラスが、前記第２のコロニーの前記第２の微生物細胞の第２の種に関連し、前記表現型対応の存在が、前記第１の種が前記第２の種と同じであると判定されたときに確立される、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記抗微生物剤感受性試験が、前記第１のコロニーと前記第２のコロニーとの間の前記表現型対応を判定した後、前記第１の微生物細胞及び前記第２の微生物細胞の双方からの微生物細胞を使用して実施される、請求項８１～８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記表現型対応が、前記第１の微生物細胞と前記第２の微生物細胞との間に不在であると判定され、抗微生物剤感受性試験が、前記第１の微生物細胞と前記第２の微生物細胞を使用して別々に実施され、前記第１の微生物細胞と前記第２の微生物細胞の別々の抗微生物剤感受性測定値が判定される、請求項８１～８７のいずれか一項に記載の方法。
  90. 請求項８１～８７のいずれか一項に記載の方法であって、前記選択された微生物細胞クラスが予備的に選択された微生物細胞クラスであり、前記予備的に選択された微生物細胞クラスが第１の分類方法に従って判定され、前記微生物細胞クラスのセットが微生物細胞クラスの第１のセットであって、前記方法が、前記第１のコロニーと前記第２のコロニーとの間の対応を判定した後、前記第２のコロニーから採取された前記第２の微生物細胞を照会して、前記第２の微生物細胞のタイプに関連する補足的微生物細胞クラスを判定するステップをさらに含んでなり、
    前記補足的微生物細胞クラスが、微生物細胞クラスの第２のセットから選択され、前記補足的微生物細胞クラスが、第２の分類方法に従って判定される、方法。
  91. 微生物細胞クラスの前記第２のセットが、微生物細胞クラスの前記第１のセットよりも多数の微生物細胞クラスを含む、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記補足的微生物細胞クラスが、微生物細胞クラスの前記第１のセットに不在である、請求項９１に記載の方法。
  93. 前記補足的微生物細胞クラスが、種レベルの微生物細胞クラスである、請求項９２に記載の方法。
  94. 微生物細胞クラスの前記第１のセットが、種レベルの微生物細胞クラスを欠いており、微生物細胞クラスの前記第２のセットが、複数の種レベルの微生物細胞クラスを含んでなる、請求項９１に記載の方法。
  95. 前記第２の分類方法が、前記第１の分類方法よりも高い信頼性で所与の微生物細胞クラスを判定できる、請求項９１に記載の方法。
  96. 前記補足的微生物細胞クラスが、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析を使用して判定される、請求項９０～９５のいずれか一項に記載の方法。
  97. 前記補足的微生物細胞クラスが、ラマン検出及び／又はフーリエ変換赤外分光法を使用して判定される、請求項９０～９５のいずれか一項に記載の方法。
  98. 前記第２のコロニーからの前記第２の微生物細胞が、前記第１のコロニーから前記第１の微生物細胞を採取した後に採取され、採取時に、採取時に前記第２のコロニーが前記第１のコロニーよりも大きくなるように、前記第２のコロニーが、前記第１のコロニーよりも長い時間インキュベートされる、請求項９０～９７のいずれか一項に記載の方法。
  99. 前記第２のコロニーが、前記第２の分類方法による前記補足的微生物細胞クラスの判定を容易にするのに十分な量の微生物細胞を含有すると予想される時点を判定するステップをさらに含んでなり、前記第２のコロニーが前記十分な量の微生物細胞を含有すると判定された後に、前記第２の微生物細胞が前記第２のコロニーから採取される、請求項９０～９８のいずれか一項に記載の方法。
  100. 前記第２のコロニーが十分な数の微生物細胞を含有するという判定が、前記第１のコロニーからの前記第１の微生物細胞に対する前記抗微生物剤感受性試験を開始した後に行われ、前記第２の微生物細胞に関連する前記補足的微生物細胞クラスの判定が、前記抗微生物剤感受性試験の完了前に行われる、請求項９９に記載の方法。
  101. 前記第２のコロニーが、前記第１の微生物細胞が採取された後、前記第２の微生物細胞が採取される前にインキュベートされて、さらなるコロニーの増殖が促進される、請求項９９又は１００に記載の方法。
  102. 前記第２の微生物細胞に関連する前記補足的微生物細胞クラスと、前記第１の微生物細胞に関連する最小阻害濃度とを報告するステップをさらに含んでなる、請求項９０～１０１のいずれか一項に記載の方法。
  103. 前記生存能力がある微生物細胞の懸濁液が、全血サンプルから得られる、請求項８１～１０２のいずれか一項に記載の方法。
  104. 統合流体デバイスの内部流路を閉じた状態に維持し、それによって外部微生物細胞の侵入を防ぎながら、分離された微生物細胞が固相増殖培地と接触するように、
    前記統合流体デバイスの適切な作動下でサンプルからの微生物細胞の分離を容易にするように構成されている分離領域；及び
    前記統合流体デバイスの適切な作動下で、前記分離領域の出力から分離された微生物細胞を受け取るように構成されている、前記固相増殖培地を含んでなるコロニー増殖領域
    を含んでなる、生存能力がある微生物細胞を分離し増殖させるための統合流体デバイス。
  105. 前記コロニー増殖領域が、前記分離された微生物細胞の増殖を促進するのに適した条件下でのインキュベーション中に、前記固相増殖培地上に存在する前記分離された微生物細胞の増殖のモニタリングを容易にするように構成されている、請求項１０４に記載の統合流体デバイス。
  106. 前記固相増殖培地が、その中で前記分離された微生物細胞が前記分離領域から送達される液体を、受動的に吸収するように構成されている、請求項１０４に記載の統合流体デバイス。
  107. 前記固相増殖培地が多孔質ネットワークを含んでなり、部分的に水和された状態で提供される、請求項１０６に記載の統合流体デバイス。
  108. 前記固相増殖培地が、部分的に水和されたハイドロゲルとして提供される、請求項１０７に記載の統合流体デバイス。
  109. 前記コロニー増殖領域が、前記統合流体デバイスの残りの部分から取り外し可能である、請求項１０４～１０８のいずれか一項に記載の統合流体デバイス。
  110. 前記微生物細胞を含有する微生物細胞懸濁液を提供するステップと；
    開口部を少なくとも部分的に取り囲む、接触面を含んでなる固体支持体を提供し、化学薬品を前記接触面上に提供し、及び／又は前記接触面の下に含浸させるステップと；
    固相増殖培地の下位領域が前記開口部を通じてアクセス可能であり、前記化学薬品の少なくとも一部が前記下位領域内に内向きに拡散するように、前記固相増殖培地を前記固体支持体の接触面と接触させるステップと；
    前記微生物細胞懸濁液内の微生物細胞が前記下位領域の表面上に保持されるように、前記微生物細胞懸濁液の体積を前記下位領域の前記表面上に沈着させるステップと；
    前記保持された微生物細胞を前記化学薬品に曝露させるのに十分に長い時間にわたり、前記固相増殖培地をインキュベートするステップと；
    前記下位領域内の微生物細胞増殖の有無を検出するステップと
    を含んでなる、微生物細胞の増殖に対する化学薬品の効果を判定する方法。
  111. 前記接触面が平面接触面を含んでなり、前記平面接触面が前記固相増殖培地の表面と接触して少なくとも部分的に前記下位領域を取り囲むように、及び前記化学薬品の一部が前記平面接触面から前記下位領域内に拡散するように、前記固体支持体が前記固相増殖培地と接触される、請求項１１０に記載の方法。
  112. 前記固体支持体が前記開口部を完全に取り囲む、請求項１１１に記載の方法。
  113. 前記固体支持体が、前記開口部に隣接して存在するフラッシング特徴部をさらに含んでなり、前記フラッシング特徴部が、前記平面接触面が前記固相増殖培地と接触したときに、前記フラッシング特徴部が前記固相増殖培地の表面の下に浸漬されるように構成されており、それによって前記接触面と前記固相増殖培地の前記表面との間の前記微生物細胞懸濁液の侵入を防止又は低減する請求項１１２に記載の方法。
  114. 前記フラッシング特徴部が、前記固相増殖培地に２５０ミクロン未満の深さまで挿入されるように構成されている、請求項１１３に記載の方法。
  115. 前記フラッシング特徴部が、前記固相増殖培地に１００ミクロン未満の深さまで挿入されるように構成されている、請求項１１３に記載の方法。
  116. 前記固体支持体の少なくとも一部が環状形状を有する、請求項１１２に記載の方法。
  117. 前記固体支持体が、前記平面接触面よりも前記開口部から離れて位置する側方拘束構成要素を含んでなり、前記側方拘束構成要素が、前記平面接触面が前記固相増殖培地と接触したときに、前記側方拘束構成要素が前記固相増殖培地内に浸漬されるように構成されている、請求項１１１～１１６のいずれか一項に記載の方法。
  118. 前記側方拘束構成要素が、前記開口部を完全に取り囲む、請求項１１７に記載の方法。
  119. 前記接触面が、前記平面接触面よりも前記開口部から離れて位置する側方接触面を含んでなリ、前記側方接触面が、前記平面接触面が前記固相増殖培地と接触したときに、前記側方接触面が、化学薬品が前記平面接触面と前記側方接触面の双方から前記下位領域内に拡散するように、前記側方接触面が前記下位領域の方向を向いて前記固相増殖培地内に浸漬されるように構成されている、請求項１１１～１１６のいずれか一項に記載の方法。
  120. 前記側方接触面が、前記開口部を完全に取り囲む、請求項１１９に記載の方法。
  121. 前記側方接触面が、前記平面接触面が前記固相増殖培地と接触したときに、前記側方接触面が１ｍｍを超える深さまで前記固相増殖培地中に挿入されるように構成されている、請求項１１９に記載の方法。
  122. 前記側方接触面が、前記平面接触面が前記固相増殖培地と接触したときに、前記側方接触面が２ｍｍを超える深さまで前記固相増殖培地中に挿入されるように構成されている、請求項１１９に記載の方法。
  123. 前記固体支持体が管状構成要素を含んでなり、前記管状構成要素の内表面の少なくとも遠位表面領域が、前記化学薬品で被覆及び／又は含浸され、前記管状構成要素が、前記遠位表面領域の少なくとも一部が前記固相増殖培地内に浸漬されるように、及び前記化学薬品が前記管状構成要素の管腔内に存在する前記固相増殖培地の前記下位領域内に内向きに拡散するように、前記固相増殖培地と接触される、請求項１１０に記載の方法。
  124. 前記管状構成要素が、前記管状構成要素の近位部分が前記固相増殖培地から外向きに延長し、前記微生物細胞懸濁液の体積が、前記管状構成要素の前記近位部分内に分注されるように、前記固相増殖培地中に挿入される、請求項１２３に記載の方法。
  125. 前記管状構成要素が、前記管状構成要素の遠位端が前記固相増殖培地を支持する支持面と接触するように挿入され、それによって前記下位領域を囲み、前記管状構成要素内に前記化学薬品の拡散を拘束する、請求項１２３に記載の方法。
  126. 前記支持面が、その中に又はその上に提供される１つ又は複数の嵌合特徴部を含んでなり、前記１つ又は複数の嵌合特徴部が、前記管状構成要素の前記遠位端と接触するように構成されている、請求項１２５に記載の方法。
  127. 前記１つ又は複数の嵌合特徴部が、突起及び凹部の片方又は双方を含んでなる、請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記１つ又は複数の嵌合特徴部が、前記管状構成要素の前記遠位端を完全に取り囲む、請求項１２６又は１２７に記載の方法。
  129. 前記管状構成要素が円筒形構成要素である、請求項１２３～１２８のいずれか一項に記載の方法。
  130. 前記管状構成要素の遠位部分の壁厚が５００ミクロン未満である、請求項１２３～１２９のいずれか一項に記載の方法。
  131. 前記化学薬品が前記接触面上に一様に分布する、請求項１１０～１３０のいずれか一項に記載の方法。
  132. 前記化学薬品が、前記接触面上の複数の分離された領域に提供される、請求項１１０～１３０のいずれか一項に記載の方法。
  133. 前記化学薬品の面密度及び表面下密度の１つ又は複数が、前記接触面に沿って空間的に変動する、請求項１１０～１３０のいずれか一項に記載の方法。
  134. 前記化学薬品が、前記局所領域密度及び前記表面下密度の１つ又は複数における勾配に従って前記接触表面上に提供される、請求項１３３に記載の方法。
  135. 前記勾配が、前記化学薬品の前記局所面密度及び前記表面下密度の１つ又は複数が、前記開口部に最も近い表面領域で最も低くなるように提供される、請求項１３４に記載の方法。
  136. 前記下位領域の前記表面の中央部分のすぐ下の前記化学薬品の濃度が、前記接触表面を前記固相増殖培地と接触させた後、１時間～３時間の間に１０％未満変動するように、前記化学薬品が、適切な量及び適切な空間分布で前記接触面上に提供される、請求項１１０～１３５のいずれか一項に記載の方法。
  137. 前記下位領域の前記表面の中央部分のすぐ下の前記化学薬品の濃度が、前記接触表面を前記固相増殖培地と接触させた後、１時間～３時間の間に５％未満変動するように、前記化学薬品が、適切な量及び適切な空間分布で前記接触面上に提供される、請求項１１０～１３５のいずれか一項に記載の方法。
  138. 前記下位領域の前記表面の中央部分のすぐ下の前記化学薬品の濃度が、前記接触表面を前記固相増殖培地と接触させた後、２時間～４時間の間に１０％未満変動するように、前記化学薬品が、適切な量及び適切な空間分布で前記接触面上に提供される、請求項１１０～１３５のいずれか一項に記載の方法。
  139. 前記下位領域の前記表面の中央部分のすぐ下の前記化学薬品の濃度が、前記接触表面を前記固相増殖培地と接触させた後、２時間～４時間の間に５％未満変動するように、前記化学薬品が、適切な量及び適切な空間分布で前記接触面上に提供される、請求項１１０～１３５のいずれか一項に記載の方法。
  140. 前記下位領域の前記表面の中央部分のすぐ下の前記化学薬品の濃度が、前記固相増殖培地と前記接触表面との間の接触の３０分間以内に最大濃度に達するように、前記固相増殖培地が前記接触面と接触される、請求項１１０～１３５のいずれか一項に記載の方法。
  141. 前記固体支持体が、前記下位領域にわたる前記微生物細胞懸濁液の体積の保持を容易にするように構成されている疎水性上面を含んでなる、請求項１１０～１４０のいずれか一項に記載の方法。
  142. 前記疎水性上面が前記開口部に向けて斜角であり、前記下位領域にわたる前記微生物細胞懸濁液の体積の保持を助ける、請求項１４１に記載の方法。
  143. 前記開口部の最小幅が５ｍｍ未満である、請求項１１０～１４２のいずれか一項に記載の方法。
  144. 前記開口部の最小幅が２ｍｍ未満である、請求項１１０～１４２のいずれか一項に記載の方法。
  145. 前記開口部の最小幅が１ｍｍ未満である、請求項１１０～１４２のいずれか一項に記載の方法。
  146. 前記下位領域の前記表面に沈着した前記微生物細胞懸濁液の体積内の前記微生物細胞の数が５０未満である、請求項１１０～１４５のいずれか一項に記載の方法。
  147. 前記下位領域の前記表面に沈着した前記微生物細胞懸濁液の体積内の前記微生物細胞の数が２０未満である、請求項１１０～１４５のいずれか一項に記載の方法。
  148. 前記下位領域の前記表面に沈着した前記微生物細胞懸濁液の体積内の前記微生物細胞の数が１０未満である、請求項１１０～１４５のいずれか一項に記載の方法。
  149. 前記下位領域の前記表面に沈着した前記微生物細胞懸濁液の体積が５マイクロリットル未満である、請求項１１０～１４５のいずれか一項に記載の方法。
  150. 前記下位領域の前記表面に沈着した前記微生物細胞懸濁液の体積内の前記微生物細胞の数が、２マイクロリットル未満である、請求項１１０に記載の方法。
  151. 前記固相増殖培地がマイクロウェル内に保持され、前記固相増殖培地の体積が１００マイクロリットル未満である、請求項１１０～１５０のいずれか一項に記載の方法。
  152. 前記固相増殖培地がマイクロウェル内に保持され、前記固相増殖培地の体積が５０マイクロリットル未満である、請求項１１０～１５０のいずれか一項に記載の方法。
  153. 前記固相増殖培地の厚さが２ｍｍ未満である、請求項１１０～１５２のいずれか一項に記載の方法。
  154. 前記固相増殖培地の厚さが１ｍｍ未満である、請求項１１０～１５２のいずれか一項に記載の方法。
  155. 前記化学薬品が抗微生物剤である、請求項１１０～１５４のいずれか一項に記載の方法。
  156. 前記微生物細胞懸濁液が、血液培養の不在下で全血サンプルを処理することによって得られる、請求項１１０～１５５のいずれか一項に記載の方法。
  157. 前記微生物細胞懸濁液が、継代培養を実施することなく血液培養ボトルから得られる、請求項１１０～１５５のいずれか一項に記載の方法。
  158. 前記微生物細胞懸濁液が、血液培養サンプルを希釈することによって得られる、請求項１５７に記載の方法。
  159. 前記下位領域内の微生物細胞増殖の有無を検出することが、前記下位領域の表面の１つ又は複数の画像を取得し、前記１つ又は複数の画像を処理することによって実施される、請求項１１０～１５８のいずれか一項に記載の方法。
  160. 各追加的な固体支持体が、それぞれの追加的な開口部を少なくとも部分的に取り囲み、各追加的な固体支持体は、それぞれの追加的な接触面を含んでなり、それぞれの追加的な接触面は、その上に提供され及び／又はその下に含浸される異なる量の前記化学薬品を有する、１つ又は複数の追加的な固体支持体を提供するステップと；
    前記固相増殖培地の追加的な下位領域が、それぞれの追加的な開口部を通じてアクセス可能であるように、及び前記化学薬品の少なくとも一部が、前記それぞれの追加的な接触面からそれぞれの追加的な下位領域に内向きに拡散するように、前記固相増殖培地を各追加的な接触面と接触させるステップと；
    前記微生物細胞懸濁液内の微生物細胞が前記追加的な下位領域の前記それぞれの表面上に保持されるように、追加的な体積の前記微生物細胞懸濁液を各追加的な下位領域のそれぞれの表面上に沈着させるステップと；
    前記固相増殖培地をインキュベートした後、各下位領域内の微生物細胞増殖の有無を検出するステップと
    をさらに含んでなる、請求項１１０～１５８のいずれか一項に記載の方法。
  161. 前記下位領域内の微生物細胞増殖の有無の評価に基づいて、前記化学薬品の最小阻害濃度を判定するステップをさらに含んでなる、請求項１６０に記載の方法。
  162. 前記最小阻害濃度が、前記固相増殖培地のインキュベーション中の各下位領域の表面下の前記化学薬品の推定濃度又は濃度範囲に従って判定される、請求項１６１に記載の方法。
  163. 前記固体支持体及び前記追加的な固体支持体が機械的に結合され固体支持体のアレイを形成する、請求項１６０～１６２のいずれか一項に記載の方法。
  164. 前記固相増殖培地が、固相増殖培地支持構造によって支持され、前記支持構造が、複数のマイクロウェルを含んでなり、各マイクロウェルが、それぞれの体積の前記固相増殖培地を含んでなり、前記固体支持体のアレイが、前記固体支持体のアレイの各接触面が、異なるそれぞれのマイクロウェル内の異なるそれぞれの体積の前記固相増殖培地と接触するように、前記固相増殖培地と接触する、請求項１６３に記載の方法。
  165. 前記固体支持体のアレイ及び前記固相増殖培地支持体構造の１つ又は複数が、それぞれの接触面とそれぞれのマイクロウェルとの間の位置合わせを容易にするキー付き特徴部を含んでなる、請求項１６４に記載の方法。
  166. 前記キー付き特徴部が、それぞれのマイクロウェルに対する各接触面の側方位置及び深さの１つ又は複数の位置合わせを容易にする、請求項１６５に記載の方法。
  167. 微生物細胞を含有する微生物細胞懸濁液を提供するステップと；
    固相増殖培地の下位領域を少なくとも部分的に取り囲み、隣接して存在する１つ又は複数の接触領域で、前記化学薬品の少なくとも一部が前記１つ又は複数の接触領域から前記下位領域内に拡散するように、前記固相増殖培地を前記化学薬品と接触させ、前記１つ又は複数の接触領域が、前記固相増殖培地の表面に平行な少なくとも一方向で測定されたときに、前記下位領域の空間的広がりが５ｍｍ未満であるように提供されるステップと；
    前記微生物細胞懸濁液内の微生物細胞が前記下位領域の表面上に保持されるように、前記微生物細胞懸濁液の体積を前記下位領域の前記表面上に沈着させるステップと；
    前記保持された微生物細胞を前記化学薬品に曝露させるのに十分に長い時間にわたり、前記固相増殖培地をインキュベートするステップと；
    前記下位領域内の微生物細胞増殖の有無を検出するステップと
    を含んでなる、前記微生物細胞の増殖に対する前記化学薬品の効果を判定する方法。
  168. 開口部を少なくとも部分的に取り囲む、接触面を含んでなる固体支持体を提供し、化学薬品を前記接触面上に提供し、及び／又は前記接触面の下に含浸させるステップと；
    前記固相増殖培地の下位領域が前記開口部を通じてアクセス可能であり、前記化学薬品の少なくとも一部が前記下位領域内に内向きに拡散するように、前記固相増殖培地を前記固体支持体の前記接触面と接触させるステップと
    を含んでなる、前記化学薬品を前記固相増殖培地に導入する方法。
  169. 微生物細胞に対する化学薬品の効果を評価するためのデバイスであって、前記固体支持体の前記接触面が固相増殖培地と接触された後、前記化学薬品の少なくとも一部が前記接触面から、前記開口部を通じてアクセス可能な前記固相増殖培地の下位領域内に内向きに拡散し、それによって前記微生物細胞を含有する微生物細胞懸濁液が前記下位領域上に接種されたときに、微生物細胞の前記抗微生物剤への曝露を可能にするように、前記化学薬品がその上に提供され、及び／又はその下に含浸された接触面を含んでなる、開口部を少なくとも部分的に取り囲む固体支持体を含んでなる、デバイス。
  170. 前記接触面が平面接触面を含んでなる、請求項１６９に記載のデバイス。
  171. 前記固体支持体が前記開口部を完全に取り囲む、請求項１７０に記載のデバイス。
  172. 前記固体支持体が、前記開口部に隣接して存在するフラッシング特徴部をさらに含んでなり、前記フラッシング特徴部が、前記平面接触面が前記固相増殖培地と接触したときに、前記フラッシング特徴部が前記固相増殖培地の前記表面の下に浸漬されるように構成されており、それによって前記接触面と前記固相増殖培地の前記表面との間の前記微生物細胞懸濁液の侵入を防止又は低減する、請求項１７１に記載のデバイス。
  173. 前記フラッシング特徴部が、前記平面接触面が前記固相増殖培地の前記表面と接触したときに、２５０ミクロン未満の深さまで前記固相増殖培地に挿入されるように構成されている、請求項１７２に記載のデバイス。
  174. 前記フラッシング特徴部が、前記平面接触面が前記固相増殖培地の前記表面と接触したときに、１００ミクロン未満の深さまで前記固相増殖培地に挿入されるように構成されている、請求項１７２に記載のデバイス。
  175. 前記固体支持体の少なくとも一部が環状形状を有する、請求項１７１に記載のデバイス。
  176. 前記固体支持体が、前記平面接触面よりも前記開口部から離れて位置する側方拘束構成要素を含んでなり、前記側方拘束構成要素が、前記平面接触面が前記固相増殖培地と接触したときに、前記側方拘束構成要素が前記固相増殖培地内に浸漬されるように構成されている、請求項１７０～１７５のいずれか一項に記載のデバイス。
  177. 前記側方拘束構成要素が、前記開口部を完全に取り囲む、請求項１７６に記載のデバイス。
  178. 前記接触面が、前記平面接触面よりも前記開口部から離れて位置する側方接触面を含んでなり、前記側方接触面が、前記平面接触面が前記固相増殖培地と接触したときに、化学薬品が前記平面接触面と前記側方接触面の双方から前記下位領域内に拡散するように、前記側方接触面が前記下位領域の方向を向いて前記固相増殖培地内に浸漬されるように構成されている、請求項１７０～１７５のいずれか一項に記載のデバイス。
  179. 前記側方接触面が、前記開口部を完全に取り囲む、請求項１７８に記載のデバイス。
  180. 前記側方接触面が、前記平面接触面が前記固相増殖培地と接触したときに前記側方接触面が１ｍｍを超える深さまで前記固相増殖培地に挿入されるように、構成されている、請求項１７８に記載のデバイス。
  181. 前記側方接触面が、前記平面接触面が前記固相増殖培地と接触したときに前記側方接触面が２ｍｍを超える深さまで前記固相増殖培地に挿入されるように、構成されている、請求項１７８に記載のデバイス。
  182. 前記固体支持体が管状構成要素を含んでなり、前記管状構成要素の内表面の少なくとも遠位表面領域が、前記遠位表面領域の少なくとも一部が前記固相増殖培地内に浸漬されたときに、前記化学薬品が前記管状構成要素の管腔内に存在する前記固相増殖培地の前記下位領域内に内向きに拡散するように、前記化学薬品で被覆及び／又は含浸される、請求項１６９に記載のデバイス。
  183. 前記管状構成要素が、前記管状構成要素の近位部分が前記固相増殖培地から外向きに延長し、前記微生物細胞懸濁液の体積が、前記管状構成要素の前記近位部分内に分注されるように、前記固相増殖培地中に挿入される、請求項１８２に記載のデバイス。
  184. 前記管状構成要素が、前記管状構成要素の遠位端が前記固相増殖培地を支持する支持面と接触するように挿入され、それによって前記下位領域を囲み、前記管状構成要素内に前記化学薬品の拡散を拘束する、請求項１８２に記載のデバイス。
  185. 前記管状構成要素が円筒形構成要素である、請求項１８２～１８４のいずれか一項に記載のデバイス。
  186. 前記管状構成要素の遠位部分の壁厚が５００ミクロン未満である、請求項１８２～１８５のいずれか一項に記載のデバイス。
  187. 前記化学薬品が前記接触面上に一様に分布する、請求項１１０～１８６のいずれか一項に記載のデバイス。
  188. 前記化学薬品が、接前記触面上の複数の分離された領域に提供される、請求項１１０～１８６のいずれか一項に記載のデバイス。
  189. 前記化学薬品の局所面密度及び前記表面下密度の１つ又は複数が、前記接触面に沿って空間的に変動する、請求項１１０～１８６のいずれか一項に記載のデバイス。
  190. 前記化学薬品が、前記局所領域密度及び前記表面下密度の１つ又は複数の勾配に従って前記接触表面上に提供される、請求項１８９に記載のデバイス。
  191. 前記面密度勾配が、前記化学薬品の前記局所面密度及び前記表面下密度の１つ又は複数が前記開口部に最も近い表面領域で最も低くなるように提供される、請求項１９０に記載のデバイス。
  192. 前記固体支持体が疎水性上面を含んでなる、請求項１１０から１９１のいずれか一項に記載のデバイス。
  193. 前記疎水性上面が前記開口部に向けて斜角であり、前記下位領域にわたる前記微生物細胞懸濁液の体積の保持を助ける、請求項１９２に記載のデバイス。
  194. 前記開口部の最小幅が５ｍｍ未満である、請求項１１０～１９３のいずれか一項に記載のデバイス。
  195. 前記開口部の最小幅が２ｍｍ未満である、請求項１１０～１９３のいずれか一項に記載のデバイス。
  196. 前記開口部の最小幅が１ｍｍ未満である、請求項１１０～１９３のいずれか一項に記載のデバイス。
  197. 前記化学薬品が抗微生物剤である、請求項１１０～１９６のいずれか一項に記載のデバイス。
  198. １つ又は複数の追加的な固体支持体をさらに含んでなり、各追加的な固体支持体が、それぞれの追加的な開口部を少なくとも部分的に取り囲み、各追加的な固体支持体が、それぞれの追加的な接触面を含んでなり、それぞれの追加的な接触面が、その上に提供され及び／又はその下に含浸される異なる量の前記化学薬品を有する、請求項１６９～１９７のいずれか一項に記載のデバイス。
  199. 前記固体支持体と前記追加的な固体支持体が機械的に結合され、固体支持体のアレイを形成する、請求項１９８に記載のデバイス。
  200. 請求項１９９に記載のデバイス；及び固相増殖培地支持構造を含んでなるキットであって、前記支持構造が、複数のマイクロウェルを含んでなり、各マイクロウェルが、それぞれの体積の前記固相増殖培地を含んでなり、前記固相増殖培地支持構造が、前記固体支持体のアレイと接触可能であるように構成されており、前記固体支持体のアレイの各接触面が、異なるそれぞれのマイクロウェル内の異なるそれぞれの体積の前記固相増殖培地と接触する、キット。
  201. 前記固体支持体のアレイ及び前記固相増殖培地支持体構造の１つ又は複数が、前記それぞれの接触面と前記それぞれのマイクロウェルとの間の位置合わせを容易にするキー付き特徴部を含んでなる、請求項２００に記載のキット。
  202. 前記キー付き特徴部が、前記それぞれのマイクロウェルに対する各接触面の側方位置及び深さの１つ又は複数の位置合わせを容易にする、請求項２０１に記載のキット。
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