CN108474019A - 用于检测至少一个第一抑制区存在或不存在的方法 - Google Patents
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Abstract
用于检测至少一个抑制区的存在或不存在的方法,所述方法包括由下述组成的步骤:沿着设置区设置一定体积的液体形式的样品,所述设置区沿着在琼脂培养基的表面处的轴线延伸,和由下述组成的步骤:将确定量的化学试剂设置在琼脂培养基的表面处,所述设置限定了潜在的抑制区,所述样品的设置区的轴线与潜在的抑制区相交。
Description
技术领域
本发明的技术领域是微生物学的技术领域。更具体而言,本发明涉及在化学试剂存在下,检测含有或易于含有微生物的样品的至少一个第一抑制区的存在或不存在。
更具体而言,本发明涉及用于测定微生物对抗生素的敏感性的测试。
背景技术
常规灵敏度测试是盘扩散测试,通常称为Kirby-Bauer方法。该标准化方法涉及用从微生物分离物获得的一般标准化为0.5McFarland的样品接种琼脂培养基(例如90mm或150mm Mueller-Hinton琼脂)。接种可以通过常规手动方法,借助于拭子或环进行。可替代地,接种可以通过将琼脂用标准化至0.5McFarland的十分之一的悬浮液浸没来进行,随后去除过量的样品。在接种之后,在琼脂的表面上设置浸渍有确定浓度的抗生素的一个或多个纸盘。在温育期之后,一般为在35℃下16至20小时,盘周围的抑制区的直径使得能够测定接种样品中存在的微生物对每个盘中浸渍的每种抗微生物剂的敏感性。由于Kirby-Bauer方法的标准化,通过比较每个抑制区的直径与由监管机构如NCCLS(美国国家临床实验室标准委员会(National Committee for Clinical Laboratory Standards))或EUCAST(欧洲抗微生物药物敏感测试委员会(European Committee on Antimicrobial SusceptibilityTesting))公布的推荐值,来分析这种方法的结果。结果因此通常根据下述三个陈述之一进行分类:敏感、中等或抗性。这些推荐值因此反映在与每种抗生素相关的每种微生物的抑制区大小的相关参考敏感性阈值中。
“敏感”意指在抗生素的存在下,由于一定浓度的抗生素,样品中存在的微生物的生长或甚至存活是不可能的。“中等”意指在抗生素的存在下,由于一定浓度的抗生素,微生物的生长受到损害。“抗性”意指在抗生素的存在下,微生物的生长是可能的,至少直到抗生素对于待治疗患者毒性的阈值。
用于检测对抗生素的敏感性的另一种方法使用设置在琼脂培养基上的抗生素梯度。为此,用抗生素的浓度梯度浸渍纸或塑料测试条。以这种方式浸泡的测试条是有刻度的,以便指示沿着测试条存在的抗生素浓度值。可以将一个或多个测试条放置在Mueller-Hinton琼脂上,所述Mueller-Hinton琼脂预先以与上述方法相同的方式接种。在温育后,如果样品中存在的微生物对测试条中含有的抗生素敏感,则出现在每个测试条周围的微生物生长的卵圆形抑制区。因此能够推断关于微生物生长的最小抑制浓度(MIC)。使得能够抑制一般保留的微生物生长的抗微生物剂的最小浓度因此是可以直接在抑制区与测试条的长边缘之间的接触点下方的刻度上读取的浓度值。换言之,MIC是在微生物生长区和非生长区之间的边界处,在抑制区的极限处可见的浓度。更具体而言,可以通过记录在其下抑制区的卵形区域与测试条相交的点,并且通过记录相应的刻度来读取MIC。
这些方法的缺点是它们难以自动化。特别地,通过浸没的接种步骤需要通过操作者对盘的环形运动和旋转,以便将样品设置物正确地分布在琼脂的整个表面上。这种特殊的运动需要进行其的操作者的一定技术能力,并且特别难以用机器再现。因此,为了以自动化方式进行,该方法需要用于目视检查沉积物的工具,以确保琼脂的整个表面被样品覆盖。可以使用的不同类型的液体样品之间,尤其是在直接获得自血培养物和再悬浮样品的样品之间的粘度变化,也使设置的自动化变得复杂。此外,用于去除过量样品的操作也需要用于精确检测和移液琼脂表面的工具。最后,这种方法需要毫升量级的大量样品,这增加了与通过操作者处理这些样品相关的生物学风险。
用拭子或环设置的自动化也是漫长和繁琐的,尤其是为了覆盖培养基的整个表面。
此外,从传统的接种方法,无论是盘还是测试条方法开始,抑制区的自动读取是特别困难的。抑制区尤其具有不太明显的对比度的边缘,这可能难以通过成像系统来鉴定。
最后,另一个缺点是这些方法需要含有大量生物量的大体积样品,尤其是1ml校准到0.5McFarland的悬浮液。这个量通常需要在肉汤的存在下或在琼脂培养基上预先温育样品的先前步骤,以便能够收获必要量的微生物菌落。该先前步骤因此延迟了从业者可以作出适合于存在的微生物类型的抗生素治疗选择的时间。因此在等待敏感性结果的同时施用广谱抗生素是常见的,这种选择有时证明是无效的并且已知有利于抗性微生物的出现。
发明内容
本发明的一个目的是因此提出用于检测至少一个第一抑制区的存在或不存在的方法,使得能够使用与常规方法相比减少量的待接种的生物量,并且因而使得可以减少产生这种生物量所需的预温育时间。更具体而言,期望能够可靠且快速地表征样品中存在或易于存在的微生物对化学试剂存在的应答。该应答优先获得自少于6小时的培养,重悬浮于小体积的缓冲液中。
本发明的第二个目的是提出可以容易地自动化的方法,尤其是包括快速、可靠和可重复的设置样品和读取抑制区的步骤。
为此,本发明涉及用于检测至少一个抑制区的存在或不存在的方法,所述方法包括由下述组成的步骤:
a.提供琼脂培养基;
b.提供液体形式的含有或易于含有微生物的样品;
c.沿着设置区设置一定体积的液体形式的样品,所述设置区沿着在琼脂培养基的表面处的轴线延伸;
d.将确定量的化学试剂设置在琼脂培养基的表面处,所述设置限定了潜在的抑制区,所述样品的设置区的轴线与潜在的抑制区相交;
e.温育所述琼脂培养基;
f.测定所述第一抑制区的存在或不存在。
例如,如果微生物对化学试剂的敏感性是未知的,和/或如果微生物是未知的,和/或如果微生物在样品中的存在是未知的,则潜在的抑制区的大小可以被定义为琼脂的表面积。
在另一种情况下,其中微生物的类型例如属、种或亚种是已知的,这种信息使得能够从监管机构(如NCCLS(美国国家临床实验室标准委员会)或EUCAST(欧洲抗微生物药物敏感测试委员会))的建议中获得关于对化学试剂的假定敏感性的信息。对于由化学试剂和给定的微生物形成的每一对,这些建议呈现了在温育给定时间后的潜在抑制区的大小,取决于微生物对化学试剂是敏感、中等还是抗性。
因此,根据本发明的有利的检测方法,样品含有已知类型的微生物的培养物,潜在抑制区的面积然后由所述类型的微生物限定。
样品的设置步骤尤其可以借助于机器臂或移液机器人来自动化,所述机器臂或移液机器人具有根据三个自由度平移移动的工具支架,例如 Microlab Star移液器。用于测定抑制区的存在的步骤可以尤其借助于包括光源和捕获工具的检测装置来进行,以便捕获设置在培养基上的样品的图像,然后通过进行目视检查或以这种方式获得的图像的自动化处理。
本发明的优点因此是能够提出可以容易自动化的方法,尤其是因为设置一定体积的液体形式的样品的步骤根据沿着在琼脂培养基的表面处的轴线延伸的设置区进行。可编程的自动化设备因此很容易沿着轴线进行该设置步骤,所述轴线的坐标被预先编程或通过常规成像方法确定。此外,由于样品以及因此的抑制区位于培养基中更受限的区中的事实,所以与浸没或环接种的常规方法相比,读取检测方法的结果也得到极大促进。样品的设置轴线因此将是直线的,或者甚至是大致直线的。如果样品设置在紧邻化学试剂的设置区,则可以设想使用直线的连续部分、曲线部分或曲线的设置轴线的变化。尤其是在具有化学试剂的浓度梯度的支撑物例如测试条的情况下,重要的是沿着大致直线的轴线设置样品,优先邻近化学试剂的支撑物,而不管支撑物的形状。
根据一个实施方案:
-借助于预定的设置技术来设置所述体积的样品,所述设置技术对于一定体积的液体形式的样品中的微生物的给定生物量是适合的,用于将所述体积设置在琼脂培养基的最大表面积上,以便获得大于预定阈值的基本上均匀的微生物表面密度;
-借助于粗制样品的预培养来获得样品,所述预培养包括微生物菌株的分离阶段,随后为所述菌株的温育阶段,以便增加微生物的生物量,所述生物量取决于温育的持续时间;和
-粗制样品的温育持续时间选择为小于10小时,有利地小于6小时,且甚至更有利地在3小时至6小时之间,选择由预限定的设置技术设置的所述体积的样品的表面积以获得所述密度。
换言之,寻求设置具有就微生物和基本上均匀两者而言是最小的浓度的样品的液体层。在相反的情况下,不具有这些浓度特征的区可能呈现非常差的微生物生长,这将歪曲测量,因为这样的区将被鉴定为抑制区。然而,对于给定的设置技术,例如通过浸没、借助于拭子或环,每单位表面积需要最小的生物量。在现有技术中,接种由设置在培养皿的整个表面上组成,这需要大的生物量,并且因而需要长温育时间来获得该生物量。根据本发明,靶向较小的设置区,必要的生物量因此也减少,并且因此获得该生物量的温育时间减少。本发明人因此观察到小于6小时的温育时间使得能够获得足够的生物量,以进行MIC的测量。
特别地,获得用于在所述密度下设置在琼脂培养基的整个表面上的足够生物量必要的温育持续时间大于20小时,其对应于直径9cm的培养皿直径,接种在其整个表面上。
根据第一实施方案,根据本发明的检测方法的步骤c)由下述组成:
c.沿着设置区以连续线设置一定体积的液体形式的样品,所述设置区沿着在琼脂培养基的表面处的轴线延伸。
以连续线形式设置的一定体积的样品可以具有在0.0005McFarland和0.5McFarland之间的浓度。本发明因此可适用于下述样品浓度:常规,在0.5McFarland和0.1McFarland之间,弱:在0.1McFarland和0.01McFarland之间,或者甚至非常弱:在0.01McFarland和0.0005McFarland之间,这些浓度能够用最小的温育时间或甚至无需温育而产生。
根据第二实施方案,根据本发明的检测方法的步骤c)由下述组成:
c.沿着设置区以液滴设置一定体积的液体形式的样品,所述设置区沿着在琼脂培养基的表面处的轴线延伸。
因此,如果液滴一旦被设置之后通过大于其直径的距离间隔开,则样品可以以离散形式设置。有利地,设置的液滴通过预定的间距间隔开,所述预定的间距优先由潜在抑制区的面积和/或设置的液滴的直径预定。例如,设置的液滴的中心可以通过在毫米范围内,优先通过一毫米的间距间隔开,以便能够快速比较抑制液滴的数目与监管机构的推荐值。实际上,对于给定的微生物和化学试剂,这些推荐值描述了所测量的以抑制区的毫米的尺寸,取决于微生物是敏感、中等还是抗性。通过计数抑制液滴的数目和/或显示出生长的液滴数目,可以容易地获得敏感性结果。因此,在该方法的一个可替代实施方案中,后者包括由下述组成的步骤:测定潜在的抑制区中的抑制液滴的数目和/或样品的设置区中的未抑制液滴的数目,以便检测潜在抑制区的存在,并且推断样品中存在的微生物对化学试剂的敏感性。
每个设置的液滴的体积有利地在1nl和10μl之间。该方法因此适用于从低体积到极低体积的样品,尤其是源于儿科医院服务的样品。该方法的另一个优点在于它不消耗太多的体积的样品,这使得能够从同一样品进行其他分析。
因此,本发明人已估计,根据本发明的方法的有利实施方案可以从每个设置的液滴中含有的1个微生物/滴至106个微生物/滴,优先104个微生物/滴的微生物量开始实施。这些浓度级因此使得能够无需温育或用有限的温育持续时间分析样品,使得能够达到必要的浓度。
化学试剂的设置例如减少至含有化学试剂的水滴。根据本发明的检测方法因此可直接应用于使用浸渍有化学试剂的支撑物的测试。因此,步骤d)可以有利地由下述组成:
d.将浸渍有确定量的化学试剂的支撑物设置在琼脂培养基的表面处,所述支撑物限定了潜在的抑制区,样品的设置区与潜在的抑制区相交。
化学试剂的设置例如在浸渍纸或塑料支撑物上进行。这种支撑物可以是例如浸渍有化学试剂的盘,所述盘整体成形为薄圆柱形部分。盘包含其体积一般为均匀的一定量的化学试剂。
浸渍的支撑物因此可以是含有确定量的化学试剂的盘。在盘的情况下,根据本发明的检测方法可以包括由下述组成的另外步骤:测量盘的中心与第一抑制区之间的距离,以便估计样品中包含的微生物对化学试剂的敏感性。有利地,样品的设置轴线与设置在培养基上的盘的中心相交。优先地,该方法可以用由下述组成的步骤继续:根据对应于样品中存在的微生物和对化学试剂的敏感性图表,根据基于标准的分类法(例如:敏感、中等或抗性)将微生物分类。这个图表可能尤其通过学习在实验上或由监管机构的建议获得。
根据本发明的特定实施方案,步骤d)由下述组成:
d)在琼脂培养基的表面处进行确定量的化学试剂的至少两次设置,所述设置各自限定了潜在的抑制区,样品的设置区的轴线与所有潜在的抑制区相交。
该特定模式使得尤其能够研究尤其是浸渍在盘上的几种化学试剂的协同效应。例如,包含两种不同试剂的两个盘可以设置在培养基上,样品的设置轴线与这两个盘的中心相交。在另一个例子中,包含四种不同试剂的四个盘设置在培养基上,样品的设置轴线与这四个盘的中心相交,使得它沿着矩形的边缘。
浸渍的支撑物例如是整体矩形构造的薄测试条。该测试条包括例如一定浓度的化学试剂,其遵循从测试条的一个短边缘到另一个相对的短边缘渐增的浓度梯度。因此,在根据本发明的检测方法的一个可替代实施方案中,浸渍的支撑物是含有化学试剂的浓度梯度的测试条,所述体积的液体形式的样品平行设置并且优先邻近测试条的至少一个长边缘。邻近意指设置尽可能靠近测试条的长边缘进行,然而设置的液体样品不与测试条接触。实际上,样品与测试条直接接触并不是非常期望的,因为这可能弄湿测试条并且因此局部改变化学试剂在琼脂内和在琼脂上的扩散。
有利地,该方法包括由下述组成的另外步骤:
-定位第一抑制区和微生物生长区之间的边界;
-从所述边界的位置测定化学试剂的最小抑制浓度。
定位微生物的第一抑制区和生长区之间的边界的步骤可以目视进行,或通过使用获取工具在温育步骤之后捕获培养基的图像,然后通过寻找在样品的生长区与抑制区之间的交点处存在的直线或弧线来进行。根据本领域技术人员已知的技术,在抑制区和生长区之间的边界可以从图像或图像组合获得。这个图像或这些图像有利地使得能够显现在测试条上以及抑制区和生长区之间的边界存在的刻度。常规技术由下述组成:获得测试条的刻度的平面图图像,并且将其与培养基的透射图像组合。
常规方法由下述组成:从数字图像开始限定笛卡尔参考坐标系,其横坐标轴通常被定义为测试条的主轴。然后能够在测试条上定位限定的记号,通常是已知的文本,例如刻度。例如,对应于以256μg.ml-1的化学试剂浓度的字符“256”可以位于参考坐标系中。限定的记号能够由实际上任何其他指示组成。限定的标记也可以对应于测试条的短边缘之一。限定的记号然后包括笛卡尔参考坐标系中的笛卡尔坐标。类似地,测试条的长边缘可以由常规图像处理工具容易地识别,以便获得其在参考坐标系中的坐标。
随后,处理图像以便找到在抑制区和生长区之间的边界。该步骤可以任选地包括平滑操作以使图像均匀化。这种平滑操作例如使用高斯滤波来进行。平滑操作优选进行几次,尤其是七次。该步骤可以任选地包括拉伸图像的像素强度的动态以形成图像的对比度直方图的操作,该对比度被视为在图像的暗像素和亮像素之间。这导致确定图像的有用动态。该步骤因此可以包括图像的阈值化操作,其包括例如阈值的检测和来自图像的数字化的轮廓的确定。从这个轮廓可以外推出一条直线或弧线,这代表了在生长区和抑制区之间的边界,这个直线或弧线在靠近测试条的长边缘,例如在距离长边缘小于一厘米处的像素区中进行搜索。
根据这个边界,可以进行估计最小抑制浓度的操作。一种可能的方法由确定所获得的直线或弧线与测试条的长边缘之间的交点的横坐标组成。可替代地,一种方法可以由确定所获得的直线或弧线与笛卡尔参考坐标系的横坐标轴之间的交点的横坐标组成。一旦获得横坐标,与参考坐标系的原点和测试条的已知长度相关,可以确定最小抑制浓度。在某些情况下,培养基仅含有完全抑制或完全生长的液滴是可能的,也就是说,不存在可见或可以确定的在生长区和抑制区之间的边界。在这种情况下,MIC值可以通过计数与设置间隔相关的液滴来获得,或者得自参考坐标系中液滴的位置,尤其是沿着化学试剂渐增的浓度梯度的第一未抑制液滴的位置。可替代地,MIC值可以直接得自沿着化学试剂渐增的浓度梯度的最后一个抑制液滴的位置。
培养基意指具有琼脂层或类似物的琼脂培养基。培养基通常在培养皿中发现,或以脱水形式施加于支撑物,一般为薄膜。非限制性地,可使用其他类型的培养基,例如纤维支撑物上的培养基或者纸支撑物上的培养基。
化学试剂尤其是抗生素、抗真菌剂、抗分枝杆菌剂或类似化合物。
易于含有意指从所获取的样品的类型或者从其中获取样品的患者或动物的症状可能怀疑样品中微生物的存在。然而,样品中易于含有的微生物的类型是未知的。在母牛中搜索乳腺炎的情况下,例如,在直接从奶牛的乳房取得的样品中存在的微生物类型的鉴定知晓之前,直接确定通过常规化学试剂的最小抑制浓度可能是更有效的。然后可以开出对微生物感染的有效治疗。
附图说明
在参考附图中的图阅读给出的示例性实施方案的描述后,本发明的其他特征和优点将变得更清楚,其中:
-图1是用于实施本发明的检测方法的培养皿的剖视图。
-图2是本发明的检测方法的示意图。
-图3是本发明的检测方法的顺序的图示。
-图4a至4f示出了根据本发明的检测方法的第一实施方案。
-图5是通过影相术用于捕获图像的装置的图示。
-图6a和图6b示出了与常规技术相比,用于进行根据本发明的检测方法的实施方案的培养皿的平面图图像。
-图7a至7f示出了根据本发明的检测方法的第二实施方案。
-图8a示出了本发明的实施的第二示例的示意图。
-图8b、8c和8d示出了本发明的实施的第二示例。
-图9a至9d示出了关于四种不同抗生素的本发明的实施的第二示例。
-图10a和10b示出了在氨苄青霉素/舒巴坦的存在下,在0.5McFarland和0.01McFarland下,在大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 35218样品的5小时温育后,测试条和靠近测试条的液滴的一部分。
-图11a和11b示出了本发明的第三种实施方法。
-图12示出了根据本发明的第三种实施方法,在接种培养基温育6小时30分后的目视检查。
-图13示出了根据本发明的第三种实施方法,可以使用的取样工具的示例。
具体实施方式
参考图1和3,在医学和/或药学领域中,通常必须使用方法100用于检测在支撑物3上浸泡的化学试剂5的存在下,在样品1的培养基2上的抑制区的存在或不存在。培养基2被包含在培养皿4中,例如直径大于或等于9cm的培养皿,并且接收含有或易于含有微生物的样品1,以及能够抑制某些微生物生长的化学试剂5。微生物选自(并无优先)细菌、酵母或真菌。可替代地,根据本发明的方法可以应用于植物或动物细胞。培养基2优先为琼脂、琼脂层或类似物。培养基2也可以是在纸支撑物或纤维支撑物上的脱水培养基。培养基然后被样品再水化。化学试剂5尤其是抗生素、抗真菌剂、抗分枝杆菌剂或类似化合物。
更具体地,期望能够可靠且快速地表征含有微生物1或容易含有微生物1的样品对化学试剂5的存在的响应,这种响应通常根据下述三种陈述之一进行分类:敏感、中等或抗性。还期望获得能够抑制样品中存在的微生物生长的化学试剂的最小抑制浓度值。
这种检测方法100尤其经常用于医学、药学和/或兽医学诊断领域中,用于检测患者或动物中的疾病。因此,这样的检测方法100需要在下述意义上是可靠的:希望样品1中含有或易于含有的微生物对化学试剂5的上述应答的性质是确定的,没有疑问或含糊不清。同样因此,这样的检测方法100(图2和图3中示出了其连续顺序)需要快速响应时间,所述响应时间在其下样品被放置与化学试剂5接触的初始时间T0以及在其下获得所述可靠响应的检测时间TX之间运行,所述检测时间TX需要尽可能短,并且尤其小于八小时。同样因此,期望这样的检测方法100包括适当的可重复性。这样的目的有利地通过实现本发明的检测方法100来实现。
一般而言并且参考图3,本发明的检测方法100包括提供琼脂培养基2的步骤a)和提供液体形式的含有或易于含有微生物的样品1的步骤b),例如直接从患者获取的粗制样品。在这种情况下,粗制样品可以经历预培养阶段,使得能够例如在包含广泛范围的微生物的样品的情况下,分离存在的微生物菌株,以及所选择且分离的微生物的温育。样品1也是例如制备的样品,尤其是以类似的方式过滤、离心和/或纯化的。样品1可以具有足以进行有效分析的微生物生物量,例如浓度在0.0005McFarland和0.5McFarland之间的标准。样品1例如是尿、血液、脑脊液或类似的生物流体。
然后在步骤c)中沿着设置区设置一定体积的液体形式的样品,所述设置区沿着在琼脂培养基的表面处的轴线延伸。样品可以以液滴设置,尤其是借助于手动移液管或自动移液管。液滴可以有利地具有相同的体积并且通过预定的间距P间隔开,P是两个连续液滴的中心之间的距离。在一旦设置后液滴的直径大于间距P的值的情况下,液滴随后形成以连续线的液体设置物。
样品也可以通过拭子设置,尤其是浸渍在一定体积的样品中的植绒或纤维拭子,然后在与琼脂培养基接触时沿轴线移动。可替代地,如国际申请公开号WO2012/083150A2中所述,包括过滤工具的移液装置可以用于移液并且过滤一定体积的样品,并且通过在与琼脂培养物的表面接触时涂抹将其设置。上述拭子或包括过滤工具的移液装置移动与琼脂接触,因此使得能够在连续线上形成样品的设置物,该线沿着轴线延伸。
该方法在步骤d)中通过在琼脂培养基的表面处设置确定量的化学试剂来继续,所述设置限定了潜在的抑制区,所述样品的设置区的轴线与潜在的抑制区相交。可替代地,该设置可以在样品设置之前进行。初始时间T0被视为在其下样品和化学试剂在培养基的表面处接触的时刻。
该方法在步骤e)中通过温育琼脂培养基继续。
该方法在步骤f)中继续,所述步骤f)由下述组成:在温育时间TX时,在潜在抑制区中,确定在化学试剂的设置区周围的样品的所述第一抑制区的存在或不存在。
本发明的实施的第一实例将根据图4a至4f详述,所述图4a至4f在平面图中图示培养皿4(例如直径大于或等于9cm的培养皿)。
参考图4a,根据本发明的检测方法的实施的第一实例包括在培养皿4中提供琼脂培养基2的步骤。
浸渍有确定量的化学试剂5的盘3设置在琼脂培养基的表面处,所述设置限定了在盘周围圆形的潜在抑制区6。
根据图4b,限定了与潜在抑制区6和盘3的中心相交的设置轴线7。该轴线也限定了样品1的设置区8,所述设置区8一般为矩形的且同等分布在设置轴线的任一侧上。
根据图4c,液体样品1在T0时以多个液滴的形式设置在培养基2的表面处的设置区8中并且沿着轴线7。液滴通过间距P间隔开,所述间距P对应于两个连续液滴的中心之间的距离。然后开始培养基的温育。
根据图4d,在温育时间之后的时间T1时,样品1的第一抑制区9的存在例如通过视觉分析来确定。事实上,一些液滴显示出细菌生长1a,而其他的则并未显示出任何细菌生长1c。在第一抑制区9和样品的设置区8之间的交点处,某些液滴显示出生长部分和抑制部分1b。因此在此时能够证实样品中微生物的存在以及在化学试剂5的存在下这些微生物生长的抑制。抑制区9具有可以尤其用卡尺测量的直径D。
根据图4e,在较长的温育时间之后的时间T2时,第一抑制区9的表面及其直径D是稳定的并且不再变化。因此在此时能够可靠地测量抑制区的大小。这种测定在图4e的情况下是特别容易的,其中某些液滴显示出细菌生长1a,而其他的并未显示出任何细菌生长1c,与每个液滴之间的设置间隔P有关的简单计数操作,因此使得能够测定微生物对化学试剂的敏感性。此外,通过获得存在的微生物的鉴定,并且通过比较抑制区的大小和管理机构对存在的一对化学试剂5-微生物的推荐值,也能够将菌株分类为“敏感”、“中等”或“抗性”。
根据图4f,可能在时间T2时,第一抑制区9不再可见或极大减少,并且一些或甚至全部小滴显示出细菌生长1a。因此在此时能够测定样品1中存在的微生物类型对化学试剂5抗性。不管温育的持续时间,没有明显的抑制区也是可能的,证实微生物对化学药剂的抗性。
为了实施根据本发明的方法,例如捕获装置包括捕获工具和光源,以便捕获在化学试剂的存在下设置在培养基上的样品的图像。
图5中示出了影相术捕获装置24的示例。该装置包括捕获工具25。捕获工具25包括捕获轴线A,所述捕获轴线A优先地相对于第一平面P1正交地布置,培养基2沿着所述第一平面P1延伸。捕获工具25有利地直接在培养皿4之上,以便获取培养基2的平面图。捕获工具例如是CCD照相机,尤其是Basler piA2400-17gm型的CCD照相机,其配备有远心镜头23。光源20优先地是能够产生彼此平行的光线21的准直照明器,其在被反射镜22反射之后正交地到达培养基2。光源20可以包括多个二极管,所述二极管包括在红色、绿色、蓝色和白色中同等的发射范围。光源20例如是Opto Engineering-LTCL 048-W型。远心透镜23尤其是OptoEngineering-TC23 048型,包括46x 38.5mm的焦场和134.6mm的工作距离。有利地,装置24可以包括计算工具26,所述计算工具26包括例如图像处理和分析工具,所述计算工具26构成捕捉装置24包括的处理器。有利地,装置24可以包括布置在培养基上方布置并且指向培养基的一个或多个光源(未示出)。这些光源使得能够例如最佳地照亮浸渍有化学试剂的支撑物的印刷部分,尤其是以便更容易地在支撑物上定位限定记号,例如在支撑物上印刷的一个或多个字符。
图6a和图6b使得能够将用于检测至少一个第一抑制区的存在或不存在的传统方法与根据本发明的方法的结果进行比较。为了进行这种比较,用源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923(美国典型培养物保藏中心)的培养物的接种物以0.5McFarland的浓度接种两个Mueller Hinton E琼脂(bioMérieux参考号413822)。第一个琼脂通过用大约1ml体积浸没进行接种,而以5mm的间距分开的10个3μl液滴在设置区8中沿着轴线7设置在第二个琼脂的表面处。含有10μg氨苄青霉素的浸泡盘3也设置在每个琼脂上。在图6b中,盘这样设置以便与液滴的设置轴线7和样品的设置区8相交。然后将两个琼脂在37℃下温育6小时30分钟。在该温育时间之后,借助于如前所述的影相术捕获装置24捕获每个琼脂的平面图图像,使得能够获得图6a和图6b的图像27a和27b。在捕获图像27a和27b时,因此能够观察与抑制区对应的直径D,类似于整个方法并且大于由EUCAST限定的参考阈值R。实际上,抑制区的直径D为22mm,由EUCAST限定的敏感和抗性之间的参考阈值R等于18mm。根据本发明的方法因此使得能够使用最小体积的样品,同时获得与化学试剂相同的灵敏度结果。可以采用本领域技术人员已知的众多技术,以自动方式测定直径D。例如,一种方法由从培养基的数字图像中鉴定液滴的设置轴线以及盘的中心组成。随后能够沿着穿过盘中心的轴线并且沿着或平行于液滴的设置轴线提取图像像素的强度分布图。从这个强度分布图中寻找在盘的任一侧上的最大对比度转变。可以通过寻找第一个上升沿的轮廓中的位置或者轮廓的一阶导数的最大值来寻找这些转变。在盘的任一侧上获得的两个位置对应于所寻找的抑制区的直径D。
本发明的实施的第二示例将根据图7a至图7f详述。
参考图7a,根据本发明的检测方法的实施的第二示例包括在培养皿4中提供琼脂培养基2的步骤,所述培养皿例如是直径大于或等于9cm的培养皿。
浸渍有确定量的化学试剂5的测试条3设置在琼脂培养基的表面处,所述设置限定了在测试条周围卵形的潜在抑制区6。
根据图7b,限定了与潜在抑制区6相交并且与测试条3的长边缘3a之一平行的设置轴线7。该轴线也限定了样品的设置区8,所述设置区8一般为矩形且同等分布在设置轴线的任一侧上。
根据图7c,液体样品1在T0时以多个液滴的形式设置在培养基2的表面处的设置区中并且沿着轴线7。液滴通过间距P间隔开,所述间距P对应于两个连续液滴的中心之间的距离。然后开始培养基的温育。
根据图7d,在温育时间之后的时间T1时,样品1的第一抑制区9的存在例如通过视觉分析来确定。事实上,一些液滴显示出细菌生长1a,而其他的则并未显示出任何细菌生长1c。在第一抑制区9和样品的设置区8之间的交点处,某些液滴显示出生长部分和抑制部分1b。因此在此时能够证实样品中微生物的存在以及在化学试剂5的存在下这些微生物生长的抑制。
根据图7e,在较长温育时间之后的时间T2时,第一抑制区9的表面是稳定的并且不再变化。因此在此时能够可靠地测量抑制区的大小,并且从中推导出与化学试剂的最小抑制浓度相对应的值F。该值F对应于在生长区和样品抑制区之间的交叉点处在测试条上浸泡的化学试剂的浓度。
在其中培养基仅显示出具有细菌生长1a或没有细菌生长1c的液滴的情况下,值F对应于通过下述获得的中间值:绘制垂直于在测试条浓度渐增的方向上在最后一个抑制液滴和第一个生长液滴之间的轴线7的线,并且观察在测试条上相应的化学试剂的浓度值。
在其中培养基显示出具有生长部分和抑制部分1b的液滴的情况下,值F可以尤其通过下述来获得:寻找在生长部分和抑制部分之间的边界处弧线或直线;寻找该弧线或该直线与测试条的长边缘3a的交点,并且观察在该交点处的化学试剂的浓度值。可替代地,可以忽略显示出生长部分和抑制部分1b的液滴,以便寻找完全抑制液滴生长的第一较高浓度值。
根据图7f,可能在时间T2时,第一抑制区9不再可见或极大减少,并且一些或甚至全部小滴显示出细菌生长1a。因此在此时能够测定样品2中存在的微生物对化学试剂5抗性。不管温育的持续时间,没有明显的抑制区也是可能的,证实微生物对化学药剂的抗性。
图8a至8d和9a至9d示出了本发明的实施的该第二示例。根据图8a,样品1以一系列液滴的形式沿着轴线设置,所述轴线平行于含有化学试剂的浓度梯度的测试条3的长边缘。测试条3包括化学试剂13的浓度刻度,使得能够推断出化学试剂的最小抑制浓度。这种测试条的一个例子由申请人以商品名销售。根据图8b,含有化学试剂5的测试条3设置在培养皿4(例如,直径大于或等于9cm的培养皿)中含有的培养基2上。图8b中的细节B在图8c中可见。样品1沿着平行于测试条3的长边缘的轴线7以一系列液滴的形式设置在设置区8中。在该实例中,通过由公司biofluidix销售且安装在机器臂上的Pipejet P9Nanodispenser移液器设置13个纳升液滴。图8c中的细节C在图8d中可见。50个液滴因此沿着轴线7以800μm的间距P进行设置。每个液滴覆盖大约1mm2的表面积。
根据该示例的第一个实验,具有0.5McFarland浓度的大肠杆菌ATCC 35218菌株(美国典型培养物保藏中心)的接种物因此沿着四个测试条(bioMérieux)以液滴设置,各自设置在Mueller Hinton E琼脂培养基(bioMérieux)上。这些测试条分别含有庆大霉素、四环素、氨苄青霉素/舒巴坦、氨苄青霉素的浓度梯度。以相同的方式,具有0.5McFarland浓度的大肠杆菌ATCC 25922菌株的接种物沿着四个测试条(bioMérieux)以液滴设置,各自设置在Mueller Hinton E琼脂培养基(bioMérieux)上。该测试条还含有庆大霉素、四环素、氨苄青霉素/舒巴坦、氨苄青霉素的浓度梯度。
沿着每个测试条设置50个液滴,各自具有13纳升的体积并且通过800μm间隔开。作为0.5McFarland的浓度的函数,因此估计每个液滴中存在大约2000个细菌。然后将以这种方式制备的八种培养基定期温育且监测,以便测定微生物的抑制区和/或生长区的存在或不存在。
图9a至9d示出了其中设置了大肠杆菌ATCC 35218样品的四种培养基的平面图。图9a至9d借助于如与图5相关呈现的影相术捕获装置获得。图9a呈现了在庆大霉素的存在下在样品温育5小时之后的视图。样品随后显示出生长液滴1a、其中生长受到抑制的液滴1c和至少一个部分受到抑制的液滴1b。使用用于分析部分受到抑制的液滴1b的图像的常规技术,获得垂直于测试条的长边缘并且划定微生物的生长区和抑制区的边界的直线14。然后在直线14和测试条的长边缘之间的交点处获得最小抑制浓度值。因此确定2μg/ml的最小抑制浓度(MIC)。
有利地,可以寻找划定微生物的生长区和抑制区的边界的直线或弧线15,该直线不一定垂直于长边缘,并且从而更忠实地再现所述边界。该直线或弧线对应于用常规接种方法观察到的卵形抑制区的一部分,并且因此允许更好地估计MIC。在其中寻找直线或弧线15的情况下,最小抑制浓度可以通过下述获得:描绘垂直于测试条的长边缘的线,穿过直线15和样品的设置轴线7之间的交点,然后寻找与测试条上的该垂直线对应的刻度。
图9b呈现了在四环素的存在下在样品温育5小时之后的视图。重复类似的方法,并且使得能够估计1.5μg/ml的最小抑制浓度。图9c呈现了在氨苄青霉素/舒巴坦的存在下在样品温育5小时后的视图。重复类似的方法,并且使得能够估计18μg/ml的最小抑制浓度。图9d显示了在氨苄青霉素的存在下在样品温育5小时后的视图。在该图中,只观察到生长的小滴1a,证实微生物对氨苄青霉素的抗性;最小抑制浓度的观测值因此大于256μg/ml。
将对于大肠杆菌ATCC 35218菌株以及大肠杆菌ATCC 25922菌株获得的最小抑制浓度结果在下表1中与通过浸没培养基的常规方法进行比较。值在不同的温育时间以μg/ml给出。浸没方法的抑制值从如上所述通过影相术捕获装置获得的图像中测量。根据本发明的方法的抑制值从在5小时通过影相术捕获装置获得的图像以及在7小时目测进行测量。
表1,R=抗性,值以μg/ml表示
表1使得能够得出结论:在常规方法和根据本发明的方法之间估计的MIC具有良好的相关性。值得注意的是,在其中液滴的设置距离测试条的长边缘太远的情况下,或者不平行于长边缘进行的情况下,可以观察到所获得的值中的微小差异。样品设置轴线的最佳位置距离测试条1mm并且平行于长边缘,因此使得能够限制估计的MIC值中的差异。此外,明确的是通过PipeJettm P9 Nanodispenser自动化移液器(bioFluidix)的样品分配不阻止所测试的细菌的生长。该实验还证实能够用体积减小的样品估计MIC,对于根据本发明的方法,设置的微生物总数目/培养基在此处估计为100 000个细菌。最后,对于在5小时的影相术和在7小时的视觉分析观察到非常高的光学对比度,使得能够通过液滴中的样品设置来加速测定最小抑制浓度的方法。这种非常高的对比度也使得能够设想使用常规图像分析技术来,以便以自动化方式测定该浓度值。
进行该示例的第二个实验,以便评估根据本发明的方法对于具有非常低浓度的样品的性能。为此,分别制备以0.5McFarland、0.1McFarland和0.01McFarland的大肠杆菌ATCC 35218的三种悬浮液。在庆大霉素、四环素、氨苄青霉素/舒巴坦或氨苄青霉素的测试条的存在下,评估这些菌株各自的MIC值。为此,对于每个浓度值,以与第一个实验类似的方式,沿着平行于每个测试条的长边缘的轴线设置各18纳升的五十个液滴。图10a示出了在氨苄青霉素/舒巴坦的存在下,以0.5McFarland的大肠杆菌ATCC 35218样品温育5小时后,测试条和接近于所述测试条的液滴的一部分。图10b示出了在氨苄青霉素/舒巴坦的存在下,以0.01McFarland的大肠杆菌ATCC 35218样品温育5小时后,测试条和接近于所述测试条的液滴的一部分。图10a和10b通过如上文呈现的影相术捕获装置获得。这两个图使得能够确定抑制区的存在并且估计以10μg/ml的MIC,即使在非常低的浓度下。下表2呈现了与常规浸没方法相比的该第二个实验的结果。
表2,R=抗性,值以μg/ml为表示
该第二个实验也使得能够得出结论,通过根据本发明的液滴方法与浸没方法所测定的MIC之间存在良好的相关性。该实验还证实根据本发明的方法使得能够估计具有减少体积和以低浓度的样品的MIC,设置的微生物总数目在此处估计为2000个细菌,即50个液滴平均含有40个细菌。最后,对于在5小时的影相术和在7小时的视觉分析也观察到非常高的光学对比度,使得能够加速测定最小抑制浓度的方法。
本发明的第三种实施方法通过图11a、11b和12示出。在该方法中,借助于例如在国际申请号WO2012/083150公开的取样工具,通过涂抹在培养基的表面上(例如,直径大于或等于9cm的培养皿中的琼脂)来设置样品。这样的集成装置使得能够进行一个或多个过滤步骤并且还可以转移液体样品。所述装置包括管状部分,所述管状部分的端部之一覆盖有过滤材料例如膜,所述过滤材料布置在该端部的外部并且将其完全覆盖。管状部分的另一个端部能够连接到抽吸或分配工具例如真空泵。使用这种工具的益处尤其是能够估计源于阳性血培养瓶的样品的MIC,也就是说,在给定的温育时间之后具有证实微生物存在的结果的瓶。为此,样品尤其可以通过下述进行制备:取出一定体积的阳性血培养物,进行所取出的体积的血细胞的裂解步骤,例如化学裂解,然后通过在膜的表面处抽吸进行裂解体积的过滤。然后如图11a所示,通过将覆盖取样工具端部的膜固定到琼脂培养基的表面,然后将其沿着轴线7在培养基2的表面上移动,将微生物浓缩物直接设置在培养基上。操作可以再次进行以便沿着第二轴线7'设置样品。包含化学试剂的测试条3平行于轴线7并且有利地在两个轴线7和7'之间设置。由设置区8,8'所覆盖的表面随后必须优先地与测试条的边缘相邻,以免与其直接接触,并且避免化学试剂扩散的效应。
现在将描述本发明的这个第三种实施方法。庆大霉素的测试条3(bioMérieux)设置在Mueller Hinton E琼脂2(bioMérieux,参考号413822)上。制备校准至0.5McFarland的大肠杆菌ATCC 25922的悬浮液。
为了以自动化方式进行该操作,将琼脂的支撑物放置在沿着轴线X平移移动的机动平台上,所述测试条的轴线平行于该轴线。取样工具由机动臂支撑,该机械臂沿着基本上垂直的轴线Z平移移动。参考图13,取样工具30包括管状本体32,所述管状本体32包括覆盖有孔隙率0.45μm的PES 膜34(Pall)的一个端部。另一个端部42是开放的,以便能够连接到抽吸工具例如真空泵。在本体32中以及在膜34和端部42之间布置有以下部件:纤维部分36例如棉花,其直径在212μm和300μm之间的一组玻璃珠38,所述珠通过由棉制成的纤维部分40保持。在编号WO2012/083150下公开的国际专利号中更详细地描述了这些不同部分的益处。进行以下方案以便制备样品:
●从阳性血培养瓶中取出1ml,然后借助于移液管通过抽吸/分配的3个循环在容器中与0.5ml裂解缓冲液(0.45%w/v Brij-97+0.3M CAPS,pH11.7)混合。
●将混合物在室温下温育2分钟以便获得裂解的样品。
●在温育之后,将支撑取样工具30的膜34的端部浸没在裂解的样品中,然后在-600mbar下抽吸过滤2分钟。
●然后将取样工具移至包含第一洗涤溶液(Brij/盐水溶液(0.45%w/vNaCl+0.05%Brij 97))的另一个容器中。
●将支撑取样工具30的膜34的端部浸没在第一洗涤溶液中,然后抽吸(在-600mbar下)4分钟。
●然后将取样工具移至包含第二洗涤溶液(去离子水)的另一个容器中。
●将支撑取样工具30的膜34的端部浸没在第二洗涤溶液中,然后抽吸(在-600mbar下)3分钟,然后在容器外抽吸20秒,以便限制取样工具30中气泡的出现。
●包含在样品中的微生物因此集中在膜34的表面处。
根据图11a,通过过滤以这种方式制备的样品1然后通过将膜34从琼脂表面移动150μm的Z来设置,以便将其非常轻柔地引入琼脂内。膜然后以常数Z沿着轴线X移动65mm。为了能够精确地测量取样工具的Z移动,可以使用用于检测琼脂表面的常规技术。
样品因此沿着两条轴线7,7'设置,所述两条轴线7,7'相邻并且平行于庆大霉素的测试条3的长边缘。因此,所获得的两个设置区8,8'具有与测试条的长边缘相邻的均匀分布。
每个设置区具有大约2mm的宽度。以这种方式接种的培养基在35℃下进行温育。培养基的平面图图像借助于影相术捕获装置以规律的时间间隔捕获。还进行目视检查。图11a呈现了在温育3小时30分后通过影相术捕获的图像。图11b呈现了在温育6小时30分后通过影相术捕获的图像。图12是在温育6小时30分后在自然光下的相同培养皿的照片。
因此,从温育3小时30分起,能够检测样品的抑制区1c和样品中存在的微生物生长区1a的存在。还能够从通过影相术获得的图像测定1.5μg/ml的最小抑制浓度。在6小时30分时的视觉检查也证实了该值,如图12所示。该方法的益处因此是能够从极少体积的样品中确定MIC,并且具有可以容易地自动化的有限数目的处理操作。在琼脂的表面处的设置移动也可以通过沿着三个自由轴线平移移动的机器臂或工具夹具来进行。
本发明中描述的方法和装置可以通过一个或多个计算机程序来实现,所述计算机程序可以以各种活动和不活动的形式存在于单个计算机上或分布在计算机系统上。例如,它们可以通过包括能够实现本发明的方法的指令的软件来实现,并且以源代码、目标代码、可执行代码或允许进行根据本发明的方法的某些步骤的任何格式描述,所述某些步骤尤其是由下述组成的步骤:
●测定所述第一抑制区的存在或不存在。
●测定潜在的抑制区中的抑制液滴的数目和/或样品的设置区中的未抑制液滴的数目。
●测量盘的中心与第一个抑制区之间的距离,以便估计样品中含有的微生物对化学试剂的敏感性。
●根据与样品中存在的微生物和化学试剂相对应的敏感性图表,根据含有三个标准(敏感、中等或抗性)的分类法将微生物进行分类,该图表例如可在存储装置上获得。
●定位第一个抑制区和微生物的生长区之间的边界。
●从所述边界的位置测定化学试剂的最小抑制浓度。
所有这些计算机程序可以以压缩或解压缩的形式存储在用于计算机的可读存储装置上,所述计算机包括存储装置和相应的信号。
术语计算机指包括处理器(例如中央处理单元(CPU)、专用处理器或微控制器)的任何电子装置。计算机能够接收数据(一个或多个输入),对该数据进行一系列预定的步骤,并且产生以信息或信号(一个或多个输出)的形式的结果。取决于上下文,术语计算机可以意指处理器,特别地或更一般地与包含在单个外壳中的一组互连元件组合的处理器。
用于计算机或存储装置的术语可读存储装置指用于包含、存储、传送、分发或传输计算机程序用于由计算机使用或与计算机有关的任何工具或用于执行所述程序的任何其他工具。用于计算机的可读存储装置可以非限制性地为电子、磁性、光学、电磁或红外系统或包含半导体的系统,以及用于传播所述程序的仪器、装置或工具。存储装置的更具体的非限制性示例可以是软盘、CD-ROM、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、可擦除可编程只读存储器(EPROM或FLASH存储器)、光纤或者包括一条或多条电缆的任何电连接。
本发明还涉及包括计算机的系统,并且还涉及被配置为实现根据本发明的一种或多种方法的一个或多个计算机程序。有利地,所述系统还包括用于控制捕获装置的工具,所述捕获装置能够捕获在温育之后培养基的图像,所述捕获的图像由所述计算机程序处理。有利地,所述系统还包括用于移动培养基的装置,例如机动平台和用于控制这些移动装置的工具。有利地,所述系统还包括用于设置样品的自动化工具,例如机器臂、移液机器人等,以及用于控制这些设置工具的工具。
Claims (18)
1.一种用于检测至少一个抑制区(9)存在或不存在的方法,所述方法包括由下述组成的步骤:
a.提供琼脂培养基(2);
b.提供液体形式的含有或易于含有微生物的样品(1);
c.沿着设置区(8)设置一定体积的液体形式的样品(1),所述设置区(8)沿着在琼脂培养基的表面处的轴线(7)延伸;
d.将确定量的化学试剂(5)设置在琼脂培养基(2)的表面处,所述设置限定了潜在的抑制区(6),所述样品的设置区的轴线与所述潜在的抑制区相交;
e.温育所述琼脂培养基(2);
f.测定所述第一抑制区(9)的存在或不存在。
2.根据权利要求1的方法:
-其中借助于预定的设置技术设置所述体积的样品,所述设置技术对于一定体积的液体形式的样品中的微生物的给定生物量,适于将所述体积设置在琼脂培养基的最大表面积上,以便获得大于预定阈值的基本上均匀的微生物表面密度;
-其中借助于粗制样品的预培养来获得所述样品,所述预培养包括微生物菌株的分离阶段,随后为所述菌株的温育阶段,以便增加微生物的生物量,所述生物量取决于温育的持续时间;和
-其中所述粗制样品的温育持续时间选择为小于10小时,选择由预限定的设置技术设置的所述体积的样品的表面积,以获得所述密度。
3.根据权利要求2的方法,其中获得用于在所述密度下设置在所述琼脂培养基的整个表面上的足够生物量所必要的温育持续时间大于20小时。
4.根据前述权利要求的检测方法,所述样品包含已知类型的微生物的培养物,所述潜在的抑制区的面积由所述类型的微生物限定。
5.根据前述权利要求之一的检测方法,其特征在于,所述步骤c)由下述组成:
c.沿着设置区以连续线设置一定体积的液体形式的样品,所述设置区沿着在所述琼脂培养基的表面处的轴线延伸。
6.根据前述权利要求的方法,其特征在于,所述样品的浓度在0.0005McFarland和0.5McFarland之间。
7.根据前述权利要求之一的检测方法,其特征在于,所述步骤c)由下述组成:
c.沿着设置区以液滴设置一定体积的液体形式的样品,所述设置区沿着在所述琼脂培养基的表面处的轴线延伸。
8.根据前述权利要求的检测方法,其特征在于,所设置的液滴通过预定的间距P间隔开,所述预定的间距优先由所述潜在抑制区的面积和/或所设置的液滴的直径预定。
9.根据前述权利要求的方法,其特征在于,所设置的液滴通过在毫米范围内,优选通过一毫米的间距间隔开。
10.根据权利要求7至9的检测方法,其特征在于,每个设置的液滴的体积在1nl和10μl之间。
11.根据前述权利要求中任一项的方法,其特征在于,每个设置的液滴中含有的微生物的量是已知的,并且是1个微生物/滴至106个微生物/滴,优先104个微生物/滴。
12.根据权利要求7至10之一的方法,其特征在于,所述方法包括由下述组成的步骤:
-测定潜在的抑制区中的被抑制液滴(1c)的数目和/或样品的设置区中的未抑制液滴(1a)的数目。
13.根据前述权利要求中任一项的检测方法,其特征在于,所述步骤d)由下述组成:
d.将浸渍有确定量的化学试剂的支撑物(3)设置在琼脂培养基的表面处,所述支撑物限定了潜在的抑制区,所述样品的设置区与潜在的抑制区相交。
14.根据前述权利要求的检测方法,其特征在于,所述浸渍的支撑物是含有确定量的化学试剂的盘。
15.根据前述权利要求的检测方法,其特征在于,所述检测方法包括另外步骤,其包括:
-测量所述盘的中心与所述第一抑制区之间的距离,以便估计所述样品中包含的微生物对化学试剂的敏感性。
16.根据前述权利要求的检测方法,其特征在于,所述检测方法包括由下述组成的另外步骤:
-从对应于样品中存在的微生物和对化学试剂的敏感性图表,根据包含下述三个标准的分类法将微生物分类:敏感、中等或抗性。
17.根据权利要求13的检测方法,其特征在于,所述浸渍的支撑物是含有化学试剂的浓度梯度的测试条,所述体积的液体形式的样品与所述测试条的长边缘平行且相邻地设置。
18.根据前述权利要求的检测方法,其特征在于,所述检测方法包括由下述组成的另外步骤:
-定位第一抑制区和微生物生长区之间的边界;
-从所述边界的位置测定化学试剂的最小抑制浓度。
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