KR20150096718A - 이미지 내의 미생물 콜로니를 구분하는 방법 - Google Patents

이미지 내의 미생물 콜로니를 구분하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20150096718A
KR20150096718A KR1020157018880A KR20157018880A KR20150096718A KR 20150096718 A KR20150096718 A KR 20150096718A KR 1020157018880 A KR1020157018880 A KR 1020157018880A KR 20157018880 A KR20157018880 A KR 20157018880A KR 20150096718 A KR20150096718 A KR 20150096718A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
image
colony
culture apparatus
colonies
illumination
Prior art date
Application number
KR1020157018880A
Other languages
English (en)
Inventor
필립 에이. 볼리
Original Assignee
쓰리엠 이노베이티브 프로퍼티즈 컴파니
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 쓰리엠 이노베이티브 프로퍼티즈 컴파니 filed Critical 쓰리엠 이노베이티브 프로퍼티즈 컴파니
Publication of KR20150096718A publication Critical patent/KR20150096718A/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06V—IMAGE OR VIDEO RECOGNITION OR UNDERSTANDING
    • G06V20/00—Scenes; Scene-specific elements
    • G06V20/60—Type of objects
    • G06V20/69—Microscopic objects, e.g. biological cells or cellular parts
    • G06V20/693—Acquisition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G06K9/00134—
    • G06K9/00147—
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06V—IMAGE OR VIDEO RECOGNITION OR UNDERSTANDING
    • G06V20/00—Scenes; Scene-specific elements
    • G06V20/60—Type of objects
    • G06V20/69—Microscopic objects, e.g. biological cells or cellular parts
    • G06V20/698—Matching; Classification

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Multimedia (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

배양 장치 내의 미생물 콜로니를 식별하는 방법이 제공된다. 본 방법은 이미징 장치를 사용하여, 장치의 전면에 조명을 제공하는 동안 박막 배양 장치의 제1 이미지를 생성하고, 장치의 배면에 조명을 제공하는 동안 박막 배양 장치의 제2 이미지를 생성하는 단계를 포함한다. 본 방법은 제1 이미지 및 제2 이미지를 분석하여 각각의 이미지 내의 미생물 콜로니를 식별하는 단계, 배양 장치 내의 특정 위치에서 콜로니에 대한 크기 파라미터의 제1 이미지 값 및 제2 이미지 값을 분석하는 단계, 및 이 값들을 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 본 방법은 적어도 2개의 콜로니 타입을 구분하고 계수하는 데 사용될 수 있다.

Description

이미지 내의 미생물 콜로니를 구분하는 방법{METHOD OF DIFFERENTIATING MICROBIAL COLONIES IN AN IMAGE}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2012년 12월 20일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/739,786호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 출원의 개시내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
생물학적 안전은 현대 사회에서 주요한 관심사이다. 음식 또는 다른 재료에서의 생물학적 오염에 대한 검사가 식품의 개발자 및 판매자에게 중요한 그리고 종종 의무적인 요건이 되었다. 생물학적 검사는 또한 내과 환자로부터 채취된 혈액 샘플과 같은 실험실 샘플, 실험 목적으로 개발된 실험실 샘플, 및 다른 타입의 생물학적 샘플 내의 세균 또는 다른 병원체를 식별하는 데 사용된다. 다양한 기술 및 장치가 생물학적 검사를 개선하는 데, 그리고 생물학적 검사 과정을 능률화하고 표준화하는 데 이용될 수 있다.
매우 다양한 배양 장치가 개발되었다. 하나의 예로서, 배양 장치들이 미국 미네소타주 세인트 폴 소재의 쓰리엠 컴퍼니(3M Company)(이하, "쓰리엠(3M)")에 의해 개발되었다. 특히, 배양 장치들이 상표명 페트리필름(PETRIFILM) 플레이트로 쓰리엠에 의해 판매된다. 배양 장치는, 예를 들어, 호기성 세균(aerobic bacteria), 대장균(E. coli), 대장균형(coliform), 장내세균(enterobacteria), 효모균, 곰팡이, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 리스테리아(Listeria), 캄필로박터(Campylobacter) 등을 비롯한, 보통 음식 오염과 연관된 미생물의 빠른 증식 및 검출을 용이하게 하는 데 이용될 수 있다. 페트리필름 플레이트 또는 다른 증식 배지의 사용은 음식 샘플의 세균 검사를 단순화할 수 있다.
배양 장치는 세균을 수측정(enumeration)하거나 그의 존재를 식별하는 데 사용될 수 있어서, (음식 검사의 경우에) 정확한 측정이 수행될 수 있게 하거나 (의료 용도의 경우에) 적절한 진단이 이루어질 수 있게 한다. 다른 응용에서, 배양 장치는, 예를 들어 실험 목적으로, 실험실 샘플 내의 미생물을 빠르게 증식시키는 데 사용될 수 있다.
생물학적 스캐닝 유닛은 미생물 콜로니(microbial colony)를 스캔하고/하거나 계수하는 데 사용되는 장치를 지칭한다. 예를 들어, 음식 샘플 또는 실험실 샘플이 배양 장치 상에 놓일 수 있고, 이어서 플레이트가 배양 챔버(incubation chamber) 내로 삽입될 수 있다. 배양 후에, 세균 증식의 자동화된 검출 및 수측정을 위해 배양 장치가 생물학적 스캐닝 유닛 내에 넣어질 수 있다. 이러한 방식으로, 생물학적 스캐닝 유닛은 배양 장치 내의 미생물 콜로니의 검출 및 수측정을 자동화하고, 이에 의해 인적 오류(human error)를 감소시킴으로써 생물학적 검사 과정을 개선한다.
일반적으로, 본 발명은 스캔된 이미지 내의 대상을 구별하기 위한 기술에 관한 것이다. 특히, 본 기술은 각각의 타입의 미생물이 그것과 반응할 수 있는 2개의 지표 화합물(indicator compound)을 포함하는 배양 배지 내에 존재하는 2가지 미생물 콜로니 타입을 구분하는 데 사용된다. 또한, 본 기술은 추가로 배양 장치의 스캔된 이미지 내의 각각의 미생물 타입의 콜로니의 개수를 계수하는 데 사용될 수 있다. 콜로니를 계수하기 위해, 배양 배지를 포함하는 배양 장치가 스캐닝 유닛 내로 삽입된다. 배양 장치의 삽입 시에, 스캐닝 유닛이 배양 장치의 이미지를 생성한다. 이어서, 스캐닝 유닛 내에서, 또는 데스크톱 컴퓨터, 워크스테이션 등과 같은 외부 컴퓨팅 장치에 의해 수행되는 이미지 처리 및 분석 루틴을 사용하여, 미생물 콜로니의 개수가 계수되거나 달리 결정될 수 있다. 본 발명에 따르면, 콜로니 타입을 구별하는 방법이 기술된다. 본 방법은 스캔된 이미지 내의 미생물 콜로니의 자동화된 계수의 기존 방법에 비해 정확도를 개선하는 데 사용될 수 있다.
하나의 태양에서, 본 발명은 방법을 제공한다. 본 방법은 이미징 장치를 사용하여 박막 배양 장치의 제1 이미지를 생성하는 단계 - 배양 장치는 투명 막 커버 시트를 갖는 전면(front side), 및 반투명 기재(substrate)를 갖는 배면(back side)을 가짐 -; 이미징 장치를 사용하여 박막 배양 장치의 제2 이미지를 생성하는 단계 - 제2 이미지는 장치의 배면에 조명을 제공하는 동안 생성됨 -; 제1 이미지 및 제2 이미지를 분석하여 각각의 이미지 내의 미생물 콜로니를 식별하는 단계; 제1 이미지를 분석하여 배양 장치 내의 특정 위치에서 콜로니에 대한 크기 파라미터의 제1 값을 계산하는 단계; 제2 이미지를 분석하여 배양 장치 내의 특정 위치에서 크기 파라미터의 제2 값을 계산하는 단계; 및 제1 값을 제2 값과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 제1 이미지는 장치의 전면에 조명을 제공하는 동안 생성된다. 배양 장치는 제1 지표 화합물 및 제2 지표 화합물을 포함하며, 여기서 제1 지표 화합물은 미생물에 의해 제1 색상을 갖는 제1 생성물로 변환되고, 제2 지표 화합물은 미생물에 의해 제2 색상을 형성하는 수-확산성(water-diffusible) 제2 생성물로 변환된다.
상기의 실시예들 중 임의의 것에서, 제1 이미지는 전면 조명:배면 조명의 제1 비(ratio)로 장치를 조명하는 동안 생성될 수 있고, 제2 이미지는 제1 비보다 낮은, 전면 조명:배면 조명의 제2 비로 장치를 조명하는 동안 생성될 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 비는 1:1보다 클 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 비는 약 100%:0%일 수 있다. 일부 실시예에서, 제2 비는 약 0%:100%일 수 있다.
상기의 실시예들 중 임의의 것에서, 본 방법은 제1 이미지 또는 제2 이미지를 사용하여 배양 장치 내의 미생물 콜로니의 개수를 계수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기의 실시예들 중 임의의 것에서, 본 방법은 제1 이미지 및 제2 이미지를 사용하여 배양 장치 내의 제1 타입 콜로니의 개수를 계수하고 제2 타입 콜로니의 개수를 계수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 타입 콜로니는 제1 지표를 제1 생성물로 변환시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 제2 타입 콜로니는 제2 지표를 제2 생성물로 변환시킨다.
상기의 실시예들 중 임의의 것에서, 제1 지표 화합물은 테트라졸륨 염료를 포함할 수 있다. 상기의 실시예들 중 임의의 것에서, 제2 지표 화합물은 인돌릴 기를 포함하는 발색성 효소 기질을 포함할 수 있다. 상기의 실시예들 중 임의의 것에서, 크기 파라미터는 관찰된 콜로니 직경일 수 있다. 일부 실시예에서, 콜로니 직경은 콜로니 최소 직경일 수 있다.
다른 태양에서, 본 발명은 컴퓨터 판독가능 명령어들을 포함하는 컴퓨터 판독가능 매체로서, 컴퓨터 판독가능 명령어들은, 프로세서에 의해 실행될 때, 프로세서를 포함하는 배양 플레이트 스캐닝 시스템으로 하여금, 박막 배양 장치의 제1 이미지를 획득하고 - 제1 이미지는 전면 조명:배면 조명의 제1 비로 장치를 조명하는 동안 생성됨 -; 박막 배양 장치의 제2 이미지를 획득하고 - 제2 이미지는 제1 비보다 낮은, 전면 조명:배면 조명의 제2 비로 장치를 조명하는 동안 생성됨 -; 제1 이미지 및 제2 이미지를 분석하여 각각의 이미지 내의 미생물 콜로니를 식별하고; 제1 이미지를 분석하여 배양 장치 내의 특정 위치에서 콜로니에 대한 크기 파라미터의 제1 값을 계산하고; 제2 이미지를 분석하여 배양 장치 내의 특정 위치에서 크기 파라미터의 제2 값을 계산하고; 제1 값을 제2 값과 비교하게 할 수 있는, 컴퓨터 판독가능 매체를 제공한다. 임의의 실시예에서, 컴퓨터 판독가능 매체는, 프로세서에서 실행될 때, 시스템으로 하여금 제1 이미지 또는 제2 이미지를 사용하여 배양 장치 내의 미생물 콜로니의 개수를 계수하게 하는 컴퓨터 판독가능 명령어들을 추가로 포함할 수 있다. 임의의 실시예에서, 컴퓨터 판독가능 매체는 시스템으로 하여금 제1 이미지 및 제2 이미지를 사용하여 배양 장치 내의 제1 타입 콜로니의 개수를 계수하고 제2 타입 콜로니의 개수를 계수하게 하는 컴퓨터 판독가능 명령어들을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 태양은 다수의 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 배양 장치 상의 미생물 콜로니의 자동화된 계수의 정확도를 개선할 수 있다. 특히, 본 명세서에 기술된 규칙은 흔히 일어나는, 그리고 그렇지 않으면 증식 플레이트 상의 병원체의 자동화된 계수의 정확도를 훼손시킬 수 있는 문제에 대처할 수 있다.
이들 및 다른 실시예의 추가의 상세사항이 첨부 도면 및 하기의 설명에 기술된다. 다른 특징, 목적 및 이점이 설명 및 도면으로부터, 그리고 청구범위로부터 명확해질 것이다.
도 1은 스캐닝 장치에 의해 생성된 이미지의 이미징 분석을 수행하는 외부 컴퓨터에 결합된 스캐닝 장치를 포함하는 예시적인 시스템의 사시도.
도 2는 도 1에 예시된 시스템에 대응할 수 있는 생물학적 스캐닝 시스템의 블록 다이어그램.
도 3은 미생물 배양 장치의 자동화된 분석의 과정을 예시하는 흐름도.
도 4는 본 발명에 따른, 미생물 배양 장치를 분석하는 방법의 일 실시예의 블록 다이어그램.
도 5는 본 발명에 따른, 미생물 콜로니 타입을 구별하기 위한 계수 규칙의 흐름도.
도 6은 2가지 타입의 미생물 콜로니가 그 안에서 증식하고 있는 박막 배양 장치의 일부분의 흑백 이미지이며, 여기서 이미지는 배양 장치의 배면만을 조명하는 동안 획득되었음.
도 6a는 도 6의 이미지의 일부분의 상세도.
도 7은 도 6의 박막 배양 장치의 일부분의 흑백 이미지이며, 여기서 이미지는 배양 장치의 전면만을 조명하는 동안 획득되었음.
도 7a는 도 7의 이미지의 일부분의 상세도.
도 8은 도 6a의 라인 스캔(line scan)에서의 픽셀의, 각각, 적색 성분, 녹색 성분, 및 청색 성분의 상대 강도의 그래프.
도 9는 도 7a의 라인 스캔에서의 픽셀의, 각각, 적색 성분, 녹색 성분, 및 청색 성분의 상대 강도의 그래프.
미생물의 검출 및 계수는 많은 다양한 분야에서 보편적인 문제이다. 미생물은 거의 모든 음식에, 물에, 공기에, 그리고 사람들이 접촉하는 수많은 표면 및 물질에 존재한다. 그러한 미생물은 종종 해롭고 이에 따라 측정 및 제어되어야 한다.
물질(예컨대, 음식, 물, 환경 잔류물) 내의 미생물의 존재를 검출하기 위한 널리 사용되는 실무는, 적합하게 준비된 검사할 물질의 샘플을 배양 장치 내에 배치하고, 미생물이 콜로니로 증식하도록 허용하는 것이다. 그러한 배지에서 배양된 때, 콜로니가 눈에 보이게 되고, 계수될 수 있다. 각각의 보이는 콜로니는 하나의 원래의 미생물에 대응한다. 본 발명의 방법은 미생물 콜로니를 증식시키고 계수하기 위한 그러한 배양 장치를 사용하여 수행된다. 전형적으로, 배양 장치는 개별 콜로니들의 분리를 유지하기 위해 수성 배양액(aqueous nutrient medium) 및 매트릭스(matrix)(예컨대, 예를 들어, 한천, 구아 검, 또는 펙틴과 같은 겔화제)를 포함한다. 많은 배양 장치는 본 명세서에 논의된 바와 같은 지표 화합물을 추가로 포함한다. 미생물 콜로니를 증식시키고 계수하기 위한 배양 장치는, 예를 들어, 쓰리엠 컴퍼니에 의해 상표명 페트리필름으로 판매되는 한천 페트리 디쉬(Petri dish) 및 박막 배양 장치를 포함한다. 페트리필름 박막 배양 장치는, 예를 들어, 미국 특허 제5,364,766호; 제5,601,998호; 및 제5,681,712호를 비롯한 수많은 간행물에 개시되어 있으며, 이들 문헌은 모두 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
전형적인 한천 배양 배지, 및 페트리필름 플레이트에서 사용되는 배양 배지를 비롯한 많은 배양 배지는 미생물의 존재를 나타내는 지표 화합물을 포함한다. 지표 화합물은, 예를 들어, pH 지표, 발색성 효소 기질, 및 산화환원 지표를 포함한다. 지표 화합물은, 생성물로 직접적으로 또는 간접적으로 변환된 때, 전형적으로 미생물 콜로니 및/또는 콜로니 주위의 배양 배지에 색상 변화를 부여한다. 색상 변화는 종종 배양 배지 내의 미생물 콜로니의 존재를 검출하는 것을 더 용이하게 만들고(예컨대, 그것은 콜로니와 배양 배지 사이의 색상 대비를 개선함), 색상 변화는 또한 특정 지표 화합물과 반응하는 특정 콜로니를, 그 지표 화합물과 반응하지 않는 다른 미생물 콜로니와 구분하는 역할을 할 수 있다.
미생물을 증식시키고 구분하기 위한 많은 타입의 배양 배지는 2개 이상의 지표 화합물들을 포함한다. 예를 들어, 페트리필름 대장균 계수 플레이트(PETRIFILM E. coli Count Plate) 내의 배양 배지는, 수성 완충액 및/또는 샘플로 수화될 때, 산화환원 지표(트라이페닐테트라졸륨 클로라이드, 이하, "TTC") 및 발색성 효소 기질(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-글루쿠로나이드, 이하, "X-gluc")을 함유한다. TTC는 미생물 세포와 반응하여, 그램-네거티브(Gram-negative) 선택적 증식 배지에서 증식하는 임의의 세균 콜로니의 세포괴(cell mass)를 착색하는 불그스름한 색의 포르마잔을 형성한다. 대조적으로, X-gluc은, 선택적 증식 배지에서 증식할 수 있는 것에 더하여, β-D-글루쿠로니다아제 효소 활성을 갖는 세균(예컨대, β-D-글루쿠로니다아제 효소 활성을 갖는 대장균 균주)과만 반응한다. X-gluc의 가수분해는 남색 염료의 형성을 야기하며, 이는 콜로니의 세포괴를 청색으로 착색하고, β-D-글루쿠로니다아제 효소 활성을 갖는 콜로니를 둘러싸는 청색 할로(halo)(즉, 지표의 확산 구역)를 형성한다.
미생물 세포가 지표 화합물과 반응하여 실질적으로 동일한 색상인 생성물을 형성할지라도, 본 발명의 방법이 미생물 콜로니들을, 복수의 지표 화합물 중 하나 이상과의 그들의 반응에 기초하여 구별하는 데 사용될 수 있음이 고려된다. 이는, 지표 화합물들 중 하나의 지표 화합물의 생성물이 미생물 콜로니의 세포괴와 연관된 채로 유지되고 다른 지표 화합물의 생성물이 콜로니의 세포괴를 둘러싸는 배양 배지 내로 확산될 때 가능하다.
본 발명의 방법에서, 당업계에 주지된 절차에 따라, 샘플이 준비되고, 배양 장치에 접종되고, 배양된다. 샘플 준비는 선택적으로 샘플을 배양 장치 내의 영양 배지 내로(예컨대, 포어-플레이팅(pour-plating)) 또는 영양 배지 상으로(예컨대, 서피스-플레이팅(surface-plating)) 도입하기 전에 샘플로부터 비-미생물 부스러기를 감소시키거나 제거하기 위해 희석, 효소 소화, 여과, 및/또는 침전을 포함할 수 있다.
샘플 내에 존재할 것으로 의심되는 미생물의 증식에 적합한 온도에서의 충분한 배양 기간 후에, 이미징 시스템을 사용하여 배양 장치 내의 미생물 콜로니의 이미지를 캡처하고 다양한 이미지 분석 방식을 적용하여, 미생물 콜로니가 검출되고 계수될 수 있다. 배양 장치 내의 미생물 콜로니를 계수하고/하거나 구분하는 데 사용되는 이미징 시스템의 예가 국제 공개 WO 98/59314호; 및 미국 특허 제7,298,885호; 제8,094,916호; 및 제7,496,225호에서 확인될 수 있으며, 이들 문헌은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 배양 장치 내의 미생물 콜로니를 검출하고/하거나 수측정하는 데 사용되는 이미지 분석 방식의 예가 미국 특허 제6,058,209호 및 제6,243,486호에서 확인될 수 있으며, 이들 문헌은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명은 배양 장치 내의 미생물 콜로니를 계수하기 위한 기술에 관한 것이다. 이 기술은 배양 장치 내의 미생물 콜로니의 자동화된 계수의 정확도를 개선하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 계수 규칙은 전형적으로 컴퓨터 실행가능 소프트웨어 명령어들로서 저장되고, 생물학적 스캐닝 시스템 내의 프로세서에 의해 실행된다. 대안적으로, 이 규칙은 주문형 집적 회로(ASIC), 필드 프로그래머블 게이트 어레이(FPGA), 또는 당업계에 공지된 다양한 하드웨어 컴포넌트와 같은 하드웨어로 구현될 수 있다. 본 명세서에 기술된 다양한 규칙은, 스캔되는 증식 배지에 따라, 개별적으로 또는 다른 계수 규칙과의 임의의 조합으로 적용될 수 있다. 어느 경우에서도, 본 명세서에 기술된 규칙을 적용함으로써, 배양 장치 상의 미생물 콜로니의 자동화된 계수의 정확도가 개선될 수 있다.
임의의 실시예에서, 본 발명의 방법은 배양 장치 내의 미생물 콜로니를 검출하고 계수하기 위한 시스템을 채용한다. 배양 장치 내의 미생물 콜로니를 검출하고 계수하기 위한 시스템이, 예를 들어, 국제 특허 공개 WO 96/18720호, WO 96/18167호, WO 2005/062744호에 기술되어 있으며, 이들 문헌은 모두 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
도 1은 배양 장치 내의 미생물 콜로니를 검출하고 계수하기 위한 시스템(20)의 일 실시예의 사시도를 도시한다. 시스템(20)은 스캐너(21)를 포함하며, 이 스캐너는 스캐너에 의해 생성된 이미지의 이미징 분석을 수행하는 외부 컴퓨터(22)에 결합된다. 외부 컴퓨터(22)는, 예를 들어, 배양 장치(24)의 이미지 분석을 위해 프로그래밍된 마이크로프로세서를 포함할 수 있다. 외부 컴퓨터(22)는 개인용 컴퓨터(PC), 데스크톱 컴퓨터, 랩톱 컴퓨터, 핸드헬드(handheld) 컴퓨터, 워크스테이션, 태블릿 개인 컴퓨팅 장치, 모바일 장치 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 스캐너(21)에 의해 생성된 배양 장치(24)의 이미지의 이미지 분석을 용이하게 하기 위해 소프트웨어 프로그램이 외부 컴퓨터(22)에 로딩될 수 있다.
스캐너(21)는 인터페이스(25)를 통해 외부 컴퓨터(22)에 결합된다. 인터페이스(25)는, 예를 들어, 범용 직렬 버스(USB) 인터페이스, 범용 직렬 버스 2(USB2) 인터페이스, IEEE 1394 파이어 와이어 인터페이스, 소형 컴퓨터 시스템 인터페이스(SCSI) 인터페이스, 어드밴스 테크놀로지 어태치먼트(ATA) 인터페이스, 직렬 ATA 인터페이스, 페리페럴 컴포넌트 인터커넥트(PCI) 인터페이스, 종래의 직렬 또는 병렬 인터페이스, 무선 연결 등을 포함할 수 있다.
배양 장치(24)는 선택적으로 배양 장치(24)를 식별하는 데 사용되는 바코드 또는 다른 타입의 식별 마킹과 같은 표지(29)를 포함할 수 있다. RFID 태그, 2차원 광학 검출가능 코드 등이 또한 표지로서 사용될 수 있다. 어느 경우에서도, 표지(29)는 배양 장치(24) 상에서 증식 및 검사되는 미생물의 타입을 식별하게 할 수 있다. 스캐너(21)는 배양 장치(24)를 스캐너(21) 내로 제1 위치로 끌어당겨 표지(29)의 이미지를 생성하고, 이어서 배양 장치(24)를 제2 위치로 끌어당겨 증식 영역(27)의 이미지를 생성하도록 설계될 수 있다. 이러한 방식으로, 배양 장치의 표지(29) 및 증식 영역(27)의 이미지가 시스템(20)에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 단일의 이미지가 표지(29) 및 증식 영역(27) 둘 모두를 캡처할 수 있다. 어느 경우에서도, 표지(29)의 스캐닝은 사용되는 플레이트의 타입의 식별을 용이하게 할 수 있어서, 하나 이상의 바람직한 계수 규칙이 자동화된 방식으로 적용될 수 있게 한다.
예로서, 배양 장치(24)는 쓰리엠에 의해 상표명 페트리필름 플레이트로 판매되는 박막 배양 장치를 포함할 수 있다. 배양 장치(24)는, 예를 들어, 호기성 세균, 대장균, 대장균형, 장내세균, 효모균, 곰팡이, 황색포도상구균, 리스테리아, 캄필로박터 등을 비롯한, 보통 음식 오염과 연관된 미생물의 빠른 증식 및 검출을 용이하게 하는 데 이용될 수 있다. 배양 장치는 일반적으로 생물학적 증식과 세균 검출 및 수측정에 보통 사용되는 하나의 타입의 증식 배지를 포함한다. 그러나, 본 발명은 또한 매우 다양한 다른 타입의 증식 배지에서 적용될 수 있다.
임의의 실시예에서, 박막 배양 장치는 투명 막 커버 시트를 포함하는 전면, 및 반투명 기재, 이를테면, 예를 들어, 페트리필름 대장균/대장균형 계수 플레이트, 페트리필름 대장균형 계수 플레이트, 및 페트리필름 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 계수 플레이트를 포함하는 배면을 가질 수 있다. 이론에 의해 구애됨이 없이, 반투명 막과 투명 막 사이에 배치된 비교적 얇은(예컨대, 대략 1 내지 2 mm 두께) 배양 배지의 조합이 본 발명에 따라 콜로니를 구별하는 데 이로운 광학 조건을 제공하는 것으로 여겨진다.
배양 장치 상의 미생물 콜로니의 자동화된 계수의 정확도를 개선하기 위해, 본 발명의 방법의 다양한 태양은 이미지 처리 동안 적용될 수 있는 규칙을 확립한다. 다시 말해서, 하기에 보다 상세히 기술되는 규칙은 시스템(20)에서 실행되는 콜로니 계수 알고리즘의 일부를 이룰 수 있다. 이 규칙은, 스캔되는 증식 배지의 타입 및 직면할 수 있는 문제에 따라, 개별적으로 또는 다른 이미지 분석 규칙(본 명세서에 참고로 포함되는 국제 특허 공개 WO 2005/062744호에 기술된 계수 규칙)과의 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 계수 규칙들 중 하나 이상을 적용하는 것은, 박막 배양 장치 등과 같은 증식 배지 상의 미생물 콜로니의 자동화된 계수의 정확도를 개선함으로써 시스템(20)과 같은 생물학적 스캐닝 시스템을 개선할 수 있다.
도 2는 시스템(20)(도 1)에 대응할 수 있는 생물학적 스캐닝 시스템(30)의 블록 다이어그램이다. 시스템(30)은, 증식 배지의 하나 이상의 이미지를 생성하고 이 이미지를 프로세서(34)에 제공하는 이미징 장치(32)를 포함한다. 프로세서(34)는 메모리(36)에 결합된다. 메모리(36)는 이미징 장치(32)에 의해 생성된 이미지의 이미지 분석을 용이하게 하는 다양한 프로세서 실행가능 소프트웨어 명령어들을 저장한다. 특히, 메모리(36)는 배양 장치 상의 미생물 콜로니의 자동화된 계수의 정확도를 개선하기 위해 이미지 분석 동안 적용되는 하나 이상의 계수 규칙(37)을 저장한다. 출력 장치(38)는 프로세서(34)에 의해 결정된 결과를 수신하고 이 결과를 사용자에게 제공한다.
예로서, 이미징 장치(32)는 배양 장치의 하나 이상의 이미지를 생성하기 위한 2차원 단색 카메라를 포함할 수 있다. 다양한 조명기(도시되지 않음)가 배양 장치의 전면 및 배면을 조명하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 조명기는 하나 이상의 색상으로 배양 장치를 조명할 수 있고, 배양 장치의 하나 이상의 이미지가 이미징 장치(32)에 의해 생성될 수 있다. 또한, 제어기(도시되지 않음)가 배양 장치의 각각의 이미지에 대해 전면 조명:배면 조명의 비를 제어할 수 있다. 박막 배양 장치를, 선택적으로 복수의 조명 색상으로, 이미징하는 데 사용될 수 있는 전면 및 배면 조명을 제공하는 이미징 장치의 비제한적인 예가 미국 특허 제8,094,916호에 기술되어 있으며, 이 문헌은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
실시예에서, 제1 이미지가 배양 장치의 전면을 조명하는 조명기로부터 나오는 조명의 100% 및 배양 장치의 배면을 조명하는 조명기로부터 나오는 조명의 0%를 사용하여 획득될 수 있고, 제2 이미지가 배양 장치의 전면을 조명하는 조명기로부터 나오는 조명의 0% 및 배양 장치의 배면을 조명하는 조명기로부터 나오는 조명의 100%를 사용하여 획득될 수 있다. 다른 실시예에서, 예를 들어, 제1 이미지가 배양 장치의 전면을 조명하는 조명기로부터 나오는 조명의 80% 및 배양 장치의 배면을 조명하는 조명기로부터 나오는 조명의 20%를 사용하여 획득될 수 있고, 제2 이미지가 배양 장치의 전면을 조명하는 조명기로부터 나오는 조명의 20% 및 배양 장치의 배면을 조명하는 조명기로부터 나오는 조명의 80%를 사용하여 획득될 수 있다. 전면 조명:배면 조명의 비는 배양 장치 내의 특정의 타입의 영양 배지에 대한 최적의 대비를 제공하도록 선택될 수 있다.
본 방법의 임의의 실시예에서, 제1 이미지는 전면 조명:배면 조명의 제1 비(예컨대, 100%:0%)로 장치를 조명하는 동안 생성되고, 제2 이미지는 제1 비보다 낮은, 전면 조명:배면 조명의 제2 비(예컨대, 0%:100%)로 장치를 조명하는 동안 생성된다. 임의의 실시예에서, 제1 비는 1:1보다 클 수 있다. 임의의 실시예에서, 제2 비는 1:1보다 작을 수 있다.
"제1 이미지"는, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 배양 장치가 주로 플레이트의 전면으로부터 조명을 받는 동안 획득되는 이미지를 말하고 "제2 이미지"는, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 배양 장치가 주로 플레이트의 배면으로부터 조명을 받는 동안 획득되는 이미지를 말한다는 것에 유의해야 한다. 용어 "제1 이미지" 및 "제2 이미지"의 사용에 의해 이미지들을 획득하는 암시된 시간적 순서가 의도되지 않는다. 따라서, 배양 장치의 제1 이미지가 배양 장치의 제2 이미지 전에 또는 그 후에 획득될 수 있다. 또한, 이미지들 중 하나(예컨대, 각각, 제1 이미지 또는 제2 이미지)가 다른 이미지(예컨대, 각각, 제2 이미지 또는 제1 이미지)를 획득한 직후에 배양 장치를 이미징함으로써 획득될 필요는 없다. 제1 이미지 및 제2 이미지가 이미지 취득들 사이의 개재하는 시간 동안 상당한 생물학적 변화(예컨대, 증식 또는 효소 활성) 또는 물리적 변화(예컨대, 탈수)가 일어날 가능성을 배제하기에 충분히 시간 면에서 근접하게 획득되는 것이 추천된다. 따라서, 바람직한 실시예에서, 제1 이미지는 제2 이미지가 획득되는 시간으로부터 약 30초 이내에 획득된다.
당업자는, 이미징 장치가 배양 장치의 전면을 향하여 위치되고 조명기가 또한 조명이 배양 장치의 전면으로 지향되도록 위치된 시스템에서, 이미징 장치에 의해 생성되는 이미지는 배양 장치 및 그의 내용물로부터 반사되는 광을 실질적으로 포함한다는 것을 인식할 것이다. 또한, 당업자는, 이미징 장치가 배양 장치의 전면을 향하여 위치되고 조명기가 또한 조명이 배양 장치의 배면으로 지향되도록 위치된 시스템에서, 이미징 장치에 의해 생성되는 이미지는 배양 장치 및 그의 내용물에 의해 투과되고/되거나 굴절되는 광을 실질적으로 포함한다는 것을 또한 인식할 것이다.
이 이미지들은 프로세서(34)에 제공되며, 또한 메모리(36)에 저장될 수 있다. 어느 경우에서도, 배양 장치 상의 세균 총수를 결정하기 위해 계수 규칙(37)을 적용함으로써 이미지들이 분석된다. 이미징 장치(32)의 해상도는 대략 155 픽셀/센티미터일 수 있다. 그 경우에, 이미지 내의 1 센티미터 라인은 길이가 155 픽셀이다.
프로세서(34)는 메모리(36)에 저장된 소프트웨어를 실행하는 범용 마이크로프로세서를 포함할 수 있다. 대안적으로, 프로세서(34)는 주문형 집적 회로(ASIC) 또는 다른 특별히 설계된 프로세서를 포함할 수 있다. 어느 경우에서도, 프로세서(34)는 배양 장치 상의 미생물 콜로니의 자동화된 계수의 정확도를 개선하도록 다양한 계수 규칙(37)을 실행한다.
메모리(36)는 프로세서(34)에 의해 적용되는 프로세서 실행가능 소프트웨어 명령어들을 저장하는 컴퓨터 판독가능 매체의 일 예이다. 예로서, 메모리(36)는 랜덤 액세스 메모리(RAM), 판독 전용 메모리(ROM), 비-휘발성 랜덤 액세스 메모리(NVRAM), 전기적 소거가능 프로그래밍 가능 판독 전용 메모리(EEPROM), 플래시 메모리 등을 포함할 수 있다. 하기에 기술되는 것과 같은 계수 규칙(37)은 메모리(36)에 저장되며, 이미지 분석을 위해 사용되는 더 큰 소프트웨어 프로그램의 일부를 이룰 수 있다.
출력 장치(38)는 전형적으로 결과를 사용자에게 전달하는 데 사용되는 디스플레이 스크린을 포함한다. 그러나, 출력 장치(38)는 또한 프린터 등과 같은 다른 타입의 장치를 포함할 수 있다. 출력 장치(38)는 디스플레이(도시되지 않음)와 같은, 스캐닝 유닛의 일부를 이룰 수 있거나, 외부 컴퓨터(22)(도 1)의 디스플레이 스크린과 같이, 스캐닝 유닛에 대해 외부에 있을 수 있다.
도 3은 자동화된 배양 장치 분석의 과정을 예시하는 흐름도이다. 도 3에 도시된 바와 같이, 프로세서(34)는 배양 장치의 하나 이상의 이미지를 수신한다(단계 41). 프로세서(34)는 메모리(36)로부터 다양한 소프트웨어 루틴을 호출하여 배양 장치 상의 미생물 콜로니를 계수한다(단계 42). 예를 들어, 세균 콜로니들은 영양 배지 내의 하나 이상의 지표 화합물과 반응(즉, 직접적으로 또는 간접적으로)한 후에 그들이 생성하는 특성 색상에 따라 식별될 수 있다. 콜로니 인식의 다른 태양이 하기에 논의된다. 프로세서(34)에 의해 실행되는 소프트웨어는 배양 장치 상의 증식 영역의 식별, 및 배양 동안 콜로니가 증식한 증식 영역에서의 색상 변화에 기초한 세균 콜로니의 자동화된 계수를 허용할 수 있다.
본 발명에 따르면, 프로세서(34)는 하나 이상의 규칙을 적용하여 증식 배지 상의 미생물 콜로니의 개수의 정확도를 개선한다(단계 43). 분석되는 배양 장치의 타입에 따라, 규칙들이 개별적으로 적용될 수 있거나 규칙들의 다양한 조합이 사용될 수 있다. 규칙들은 메모리(36)로부터 개별적으로 호출될 수 있거나, 더 큰 이미지 분석 소프트웨어 프로그램의 서브루틴을 이룰 수 있다. 규칙들은 개별적으로 적용될 수 있거나, 규칙들의 다양한 세트가 적용될 수 있다. 한 세트의 규칙들이 사용되는 경우, 규칙들이 적용되는 순서는 스캔되는 플레이트의 타입에 기초하여 선택될 수 있다. 규칙들의 적용을 위한 선택된 순서는 최종 결과에 영향을 미칠 수 있다. 규칙들의 다양한 서브세트가 또한 임의의 순서로 적용될 수 있고, 규칙들의 서브세트에 대한 선택된 순서가 또한 최종 결과에 영향을 미칠 수 있다.
도 4는 본 발명에 따른 방법(100)의 일 실시예를 도시한다. 본 방법은 배양 장치의 전면을 조명하는 동안 제1 이미지를 획득하는 단계 51, 및 배양 장치의 배면을 조명하는 동안 제2 이미지를 획득하는 단계 52를 포함한다. 배양 장치의 전면 및 배면은 본 명세서에 개시된 바와 같은 이미징 시스템으로 조명될 수 있다. 방법(100)은 제1 이미지 및 제2 이미지를 분석하여 각각의 이미지 내의 미생물 콜로니를 식별하는 단계 53을 추가로 포함한다.
제1 이미지 및 제2 이미지는 이미지 내의 대상을 하나 이상의 색상의 음영으로 규정하기 위해 획득된다. 따라서, 제1 이미지 및 제2 이미지를 분석하여 각각의 이미지 내의 미생물 콜로니를 식별하는 단계는, 당업계에 주지된 이미지 분석 방법에 따라 이미지 내의 대상을 콜로니로서 식별하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 바이스(Weiss)는 대상 크기, 가시성, 색상, 표면 품질, 및 형상을 비롯한 하나 이상의 기준에 기초하여 이미지 내의 미생물 콜로니를 식별하는 기술을 기술한다(미국 특허 제6,243,486호, 이 문헌은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨). 상기에 논의된 바와 같이, TTC를 포함하는 지표 화합물과 반응하는 미생물 콜로니를 검출하는 방법은 적색의 음영을 검출하도록 구성될 수 있고, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-글루쿠로나이드를 포함하는 지표 화합물과 반응하는 미생물 콜로니를 검출하는 방법은 청색의 음영을 검출하도록 구성될 수 있다.
본 방법의 바람직한 실시예에서, 인돌릴 기를 포함하는 발색성 효소 기질인 제2 지표를 갖는 박막 배양 장치가 배면으로부터 조명되며, 이미지가 이미지의 거의 포화(near saturation)를 야기하는 인테그레이션 타임(integration time)(즉, 노출 시간) 및 조명 강도로 취득된다. 이러한 바람직한 실시예의 조건 하에서, 미생물 콜로니의 세포괴에 의해 한정되는 이미지 내의 영역은 콜로니를 둘러싸는 착색된 생성물의 (즉, 발색성 효소 기질로부터의) 구역보다 상당히 더 어두운(즉, 광의 더 적은 투과를 허용함) 것처럼 보일 수 있다. 이는 상대적으로 더 작은 미생물 콜로니와, 콜로니를 둘러싸는 착색된 생성물의(즉, 효소 반응으로부터의) 상대적으로 더 큰 착색된 구역 사이의 구별을 용이하게 한다. 예를 들어, 이들 조건 하에서, 이미지 프로세서가 영역들의 색상 강도(color intensity)에 있어서의 차이(예컨대, 콜로니의 이미지와 콜로니를 둘러싸는 착색된 구역(존재하는 경우)의 이미지 사이의, 휘도에 있어서의 차이)에 기초하여, 콜로니괴(colony mass)의 에지를, 콜로니를 둘러싸는 착색된 생성물의 에지와 쉽게 구별할 수 있다.
제1 이미지 및 제2 이미지를 분석하여 각각의 이미지 내의 미생물 콜로니를 식별하는 단계는, 이미지 내에서 검출된 임의의 콜로니의 위치를 식별하는 단계를 추가로 포함한다. 이 위치는 각각의 이미지 내의 일치하는 콜로니와 연관된 측정가능 파라미터들을 식별하고 비교하는 데 사용될 것이다. 이 위치는 각각의 이미지 내의 X-Y 좌표에 의해 식별될 수 있다. 따라서, 바람직한 실시예에서, 제1 이미지 및 제2 이미지 둘 모두가, 제1 이미지가 획득된 후에 그러나 제2 이미지가 획득되기 전에 배양 장치를 이동시키거나 달리 취급함이 없이, 획득된다. 대안적으로, 정합 랜드마크(registration landmark)(예컨대, 페트리필름 플레이트의 2개 이상의 모서리, 또는 임의의 배양 장치 상에 형성된 정합 마크)가 제1 이미지 및 제2 이미지 내의 일치하는 콜로니를 결정하기 위해 이미지들을 적절히 배향시키는 데 사용될 수 있다.
제1 이미지 및 제2 이미지를 분석하여 일치하는 콜로니를 식별한 후에, 각각의 일치하는 콜로니에 대한 크기 파라미터에 관련된 값을 계산하기 위해 제1 이미지 및 제2 이미지가 분석된다. 크기 파라미터는, 예를 들어, 평균 콜로니 직경, 최소 콜로니 직경, 최대 콜로니 직경, 또는 콜로니 면적일 수 있다. 따라서, 제1 크기 파라미터 값이 제1 이미지 내의 특정 콜로니에 대해 계산되고(도 4, 단계 54), 제2 크기 파라미터 값이 제2 이미지 내의 대응하는 일치하는 콜로니에 대해 계산된다(도 4, 단계 55).
방법(100)은 제1 크기 파라미터 값을 제2 크기 파라미터 값과 비교하는 단계 56을 추가로 포함한다. 주어진 콜로니의 제1 이미지로부터 계산된 제1 크기 파라미터 값이 주어진 콜로니의 제2 이미지로부터 계산된 제2 크기 파라미터 값으로부터 사전결정된 범위(예컨대, 80% 내지 120%, 90% 내지 110%, 또는 95% 내지 105%) 내에 있는 경우, 콜로니는 제1 그룹(예컨대, 그룹 "A": 유력한 비-대장균 미생물)에 속하는 콜로니로서 계수된다. 이러한 경우에, 그룹 "A" 미생물은 비-확산성 생성물을 생성하는 제1 지표 화합물(예컨대, TTC)과는 반응하지만, 확산성 생성물을 생성하는 제2 지표 화합물(예컨대, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-글루쿠로나이드)과는 반응하지 않는다.
반대로, 주어진 콜로니의 제1 이미지로부터 계산된 제1 크기 파라미터 값이 주어진 콜로니의 제2 이미지로부터 계산된 제2 크기 파라미터 값보다 더 큰(예컨대, 제2 크기 파라미터 값보다 20% 이상 더 큰, 50% 이상 더 큰, 또는 100% 이상 더 큰) 경우, 콜로니는 제2 그룹(예컨대, 그룹 "B": 유력한 대장균 미생물)에 속하는 콜로니로서 계수된다. 이러한 경우에, 그룹 "B" 미생물은 비-확산성 생성물을 생성하는 제1 지표 화합물(예컨대, TTC)과 반응하고, 확산성 생성물을 생성하는 제2 지표 화합물(예컨대, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-글루쿠로나이드)과 반응하며, 이는 제1 크기 파라미터 값이 제2 크기 파라미터 값보다 더 큰 결과를 가져온다.
도 5는 본 발명에 따른, 콜로니들을 복수의 콜로니 타입으로 구분하기 위한 규칙을 예시하는 흐름도이다. 도 2에 예시된 바와 같이, 프로세서(34)는 제1 이미지 및 제2 이미지 내의 콜로니의 위치를 식별하고 맵핑하기 위해 메모리(36)에 저장된 소프트웨어를 호출한다(단계 61). 특히, 프로세서(34)는 제1 이미지 내에서 식별된 콜로니가 제2 이미지 내에서 식별된 콜로니와 동일한 위치에 맵핑되는지 여부를 판정한다(단계 62). 일치하는 콜로니들이 제1 이미지 및 제2 이미지 내에서 발견되는 경우, 프로세서(34)는 일치하는 콜로니들에 대한 크기 파라미터 값을 계산하고, 이 값들을 비교하여 그들이 상이한지 여부를 판정한다(단계 63). 그 값들이 상이하지 않은 경우(예컨대, 상기에 논의된 바와 같이, 사전결정된 범위 내에 있는 경우), 배양 장치 내의 콜로니는 제1 타입(단계 64에서 나타낸 바와 같이, "타입 A")으로서 계수된다. 그 값들이 상이한 경우(예컨대, 제1 이미지에 대한 값이 제2 이미지에 대한 값보다 작은 경우), 배양 장치 내의 콜로니는 제2 타입(단계 65에서 나타낸 바와 같이, "타입 B")으로서 계수된다. 예로서, 타입 "A" 콜로니는 페트리필름 대장균/대장균형 계수 플레이트 내의 TTC와는 반응하지만 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-글루쿠로나이드와는 반응하지 않을 수 있으며, 이에 따라 비-대장균 콜로니로서 식별될 것이다. 반대로, 타입 "B" 콜로니는 페트리필름 대장균/대장균형 계수 플레이트 내의 TTC와 반응하고 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-글루쿠로나이드와 반응하며, 이에 따라 대장균 콜로니로서 식별될 것이다.
이미지를 분석하는 것은 RGB(적색/녹색/청색) 이미지 처리 알고리즘을 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 이미지를 분석하는 것은 HSI(색조, 채도, 및 강도), HSL(색조, 채도, 및 밝기), HSV(색조, 채도, 및 명도) 알고리즘, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
도 6은 2가지 타입의 미생물 콜로니가 그 안에서 증식하고 있는 박막 배양 장치의 일부분의 흑백 이미지를 도시한다. 이미지는, 예 1에 기술된 바와 같이, 배양 장치의 배면만을 조명하는 동안 획득되었다. 각각, 2개의 상이한 타입 "A" 및 "B"의 콜로니를 비롯한 복수의 미생물 콜로니가 증식 영역 내에 있다. 타입 "A"에 속하는 콜로니는 세균 콜로니의 세포괴와 반응하여 착색시키는 제1 지표 화합물과 반응한다. 타입 "B"에 속하는 콜로니는 제1 화합물과 상호작용하고, 게다가, 미생물 콜로니 및/또는 콜로니를 둘러싸는 배양 배지에 색상 변화를 부여하는 제2 지표 화합물과 또한 반응한다. 타입 A(제1 콜로니(74)) 및 타입 B(제2 콜로니(75))에 속하는 대표적인 콜로니의 직경은 예 1에 기재된 기술에 따라 결정되었다. 데이터(하기 표 1에 열거됨)는 배면 조명된 이미지 내의 제1 콜로니(74)의 직경이 22 픽셀이고 배면 조명된 이미지 내의 제2 콜로니(75)의 직경이 15 픽셀임을 보여준다. 따라서, 도 6은, 이러한 타입의 조명(즉, 배면 조명)의 경우에, 양 타입(A 및 B)에 속하는 대표적인 콜로니의 크기 파라미터(즉, 콜로니 직경)가 대략 동일한 크기를 가질 수 있다는 것을 보여준다. 하나 이상의 미생물 콜로니를 포함하는 증식 영역의 일부분의 라인 스캔의 경로(91)가 또한 도 6a에 도시된다.
도 7은 도 6에 도시된 박막 배양 장치의 동일한 부분의 흑백 이미지를 도시한다. 이미지는, 예 1에 기술된 바와 같이, 배양 장치의 전면만을 조명하는 동안 획득되었다. 제1 콜로니(74) 및 제2 콜로니(75)의 직경은 예 1에 기재된 기술에 따라 결정되었다. 데이터는 전면 조명된 이미지 내의 제1 콜로니(74)의 직경이 22 픽셀이고 전면 조명된 이미지 내의 제2 콜로니(75)의 직경이 45 픽셀임을 보여준다. 따라서, 도 7은, 이러한 타입의 조명(즉, 전면 조명)의 경우에, 양 타입(A 및 B)에 속하는 대표적인 콜로니의 크기 파라미터(즉, 콜로니 직경)가 상이한 크기(예컨대, 실질적으로 상이한 크기)를 가질 수 있다는 것을 보여준다. 하나 이상의 미생물 콜로니를 포함하는 증식 영역의 일부분의 라인 스캔의 경로(92)가 또한 도 7a에 도시된다. 경로(92)는 도 6a의 경로(91)에서의 것들과 동일한 픽셀들에 대응한다.
배면 조명된 이미지 내의 콜로니의 존재 및 위치를 식별하고, 전면 조명된 이미지 내의 미생물 콜로니의 존재 및 위치를 식별하기 위해, 이미지 분석 알고리즘이 종종 디지털 이미지 내의 픽셀들을 라인별로 분석하여, 제1 픽셀 또는 제1 픽셀 그룹의 색조 및/또는 색상 강도를, 제1 픽셀에 근접한 제2 픽셀 또는 제1 픽셀 그룹에 근접한 제2 픽셀 그룹의 색조 및/또는 색상 강도와 비교한다. 이러한 타입의 비교는 알고리즘이 이미지 내의 미생물 콜로니 또는 다른 대상의 에지를 나타낼 수 있는 색상 및/또는 강도 변화를 인식할 수 있게 한다. 도 8은 도 6a의 배면 조명된 이미지 내의 경로(91)를 따른 픽셀들로부터 획득된 적색, 녹색, 및 청색에 대한 투과된 픽셀 강도의 그래프를 도시한다. 2개의 네거티브 피크(negative peak)(각각, "1" 및 "2") 각각은, 각자의 콜로니의 중심이 증식 배지의 근접 배경보다 더 어둡고, 이로써 2개의 별개의 콜로니의 존재를 명백히 나타낸다는 것을 보여준다. 도 9는 도 7a의 전면 조명된 이미지 내의 경로(92)를 따른 픽셀들로부터 획득된 적색, 녹색, 및 청색에 대한 반사된 색상 강도의 그래프를 도시한다. 도 9는 콜로니 중심들을 포함하는 픽셀들과 콜로니들에 인접한 증식 배지를 포함하는 픽셀들 사이의, 픽셀 강도에 있어서의 더 작은 차이를 보여준다.
미생물 콜로니를 구분하기 위한 계수 규칙을 갖는 스캐닝 시스템의 사용이 기술되었다. 계수 규칙은 배양 장치 상의 미생물 콜로니의 자동화된 계수의 정확도를 개선하기 위해 스캐닝 시스템에서 사용될 수 있다.
기술들이 소프트웨어 구현되는 것으로 기술되었다. 그 경우에, 컴퓨터 판독가능 매체가 상기에 기술된 규칙들 중 하나 이상을 구현하는 프로세서 실행가능 명령어들을 저장한다. 예를 들어, 컴퓨터 판독가능 매체는 비-일시적 컴퓨터 판독가능 매체, 예를 들어 랜덤 액세스 메모리(RAM), 판독 전용 메모리(ROM), 비-휘발성 랜덤 액세스 메모리(NVRAM), 전기적 소거가능 프로그래밍 가능 판독 전용 메모리(EEPROM), 플래시 메모리 등을 포함할 수 있다. 컴퓨터 판독가능 매체는 또한 소프트웨어를 고객에게 전달하는 데 사용되는 CD-ROM과 같은 비-휘발성 메모리를 포함할 수 있다. 또한, 컴퓨터 판독가능 매체는, 예컨대, 인터넷과 같은 네트워크를 통해 소프트웨어를 전달하기 위한, 전자기 반송파를 포함할 수 있다.
그러나, 동일한 기술이 또한 하드웨어로 구현될 수 있다. 예시적인 하드웨어 구현은 주문형 집적 회로(ASIC), 필드 프로그래머블 게이트 어레이(FPGA), 특별히 설계된 하드웨어 컴포넌트, 또는 이들의 임의의 조합 내에서의 구현을 포함한다. 또한, 본 명세서에 기재된 기술들 중 하나 이상은 하드웨어, 소프트웨어 또는 펌웨어로 부분적으로 실행될 수 있다.
실시예
실시예 A는,
이미징 장치를 사용하여 박막 배양 장치의 제1 이미지를 생성하는 단계 - 배양 장치는 투명 막 커버 시트를 갖는 전면, 및 반투명 기재를 갖는 배면을 가지며,
제1 이미지는 장치의 전면에 조명을 제공하는 동안 생성되고,
배양 장치는 제1 지표 화합물 및 제2 지표 화합물을 포함하며,
제1 지표 화합물은 미생물에 의해 제1 색상을 갖는 제1 생성물로 변환되고,
제2 지표 화합물은 미생물에 의해 제2 색상을 형성하는 수-확산성 제2 생성물로 변환됨 -;
이미징 장치를 사용하여 박막 배양 장치의 제2 이미지를 생성하는 단계 - 제2 이미지는 장치의 배면에 조명을 제공하는 동안 생성됨 -;
제1 이미지 및 제2 이미지를 분석하여 각각의 이미지 내의 미생물 콜로니를 식별하는 단계;
제1 이미지를 분석하여 배양 장치 내의 특정 위치에서 콜로니에 대한 크기 파라미터의 제1 값을 계산하는 단계;
제2 이미지를 분석하여 배양 장치 내의 특정 위치에서 크기 파라미터의 제2 값을 계산하는 단계; 및
제1 값을 제2 값과 비교하는 단계를 포함하는, 방법이다.
실시예 B는, 제1 이미지는 전면 조명:배면 조명의 제1 비로 장치를 조명하는 동안 생성되고, 제2 이미지는 제1 비보다 낮은, 전면 조명:배면 조명의 제2 비로 장치를 조명하는 동안 생성되는, 실시예 A의 방법이다.
실시예 C는, 제1 비는 1:1보다 큰, 실시예 B의 방법이다.
실시예 D는, 제1 비는 약 100%:0%인, 실시예 B의 방법이다.
실시예 E는, 제2 비는 약 0%:100%인, 실시예 B 내지 실시예 D 중 어느 한 실시예의 방법이다.
실시예 F는, 제1 이미지 또는 제2 이미지를 사용하여 배양 장치 내의 미생물 콜로니의 개수를 계수하는 단계를 추가로 포함하는, 실시예 A 내지 실시예 E 중 어느 한 실시예의 방법이다.
실시예 G는, 제1 이미지 및 제2 이미지를 사용하여 배양 장치 내의 제1 타입 콜로니의 개수를 계수하고 제2 타입 콜로니의 개수를 계수하는 단계를 추가로 포함하는, 실시예 A 내지 실시예 F 중 어느 한 실시예의 방법이다.
실시예 H는, 제1 타입 콜로니는 제1 지표를 제1 생성물로 변환시키는, 실시예 G의 방법이다.
실시예 I는, 제2 타입 콜로니는 제2 지표를 제2 생성물로 변환시키는, 실시예 G 또는 실시예 H의 방법이다.
실시예 J는, 제1 지표 화합물은 테트라졸륨 염료를 포함하는, 실시예 A 내지 실시예 I 중 어느 한 실시예의 방법이다.
실시예 K는, 제2 지표 화합물은 인돌릴 기를 포함하는 발색성 효소 기질을 포함하는, 실시예 A 내지 실시예 J 중 어느 한 실시예의 방법이다.
실시예 L은, 크기 파라미터는 관찰된 콜로니 직경인, 실시예 A 내지 실시예 K 중 어느 한 실시예의 방법이다.
실시예 M은, 콜로니 직경은 콜로니 최소 직경인, 실시예 L의 방법이다.
실시예 N은 컴퓨터 판독가능 명령어들을 포함하는 컴퓨터 판독가능 매체로서, 컴퓨터 판독가능 명령어들은, 프로세서에 의해 실행될 때, 프로세서를 포함하는 배양 플레이트 스캐닝 시스템으로 하여금:
박막 배양 장치의 제1 이미지를 획득하고 - 제1 이미지는 전면 조명:배면 조명의 제1 비로 장치를 조명하는 동안 생성됨 -;
박막 배양 장치의 제2 이미지를 획득하고 - 제2 이미지는 제1 비보다 낮은, 전면 조명:배면 조명의 제2 비로 장치를 조명하는 동안 생성됨 -;
제1 이미지 및 제2 이미지를 분석하여 각각의 이미지 내의 미생물 콜로니를 식별하고;
제1 이미지를 분석하여 배양 장치 내의 특정 위치에서 콜로니에 대한 크기 파라미터의 제1 값을 계산하고;
제2 이미지를 분석하여 배양 장치 내의 특정 위치에서 크기 파라미터의 제2 값을 계산하고;
제1 값을 제2 값과 비교하게 하는, 컴퓨터 판독가능 매체이다.
실시예 O는, 프로세서에서 실행될 때, 시스템으로 하여금 제1 이미지 또는 제2 이미지를 사용하여 배양 장치 내의 미생물 콜로니의 개수를 계수하게 하는 컴퓨터 판독가능 명령어들을 추가로 포함하는, 실시예 N의 컴퓨터 판독가능 매체이다.
실시예 P는, 프로세서에서 실행될 때, 시스템으로 하여금 제1 이미지 및 제2 이미지를 사용하여 배양 장치 내의 제1 타입 콜로니의 개수를 계수하고 제2 타입 콜로니의 개수를 계수하게 하는 컴퓨터 판독가능 명령어들을 추가로 포함하는, 실시예 N의 컴퓨터 판독가능 매체이다.
실시예 Q는,
이미징 장치를 사용하여 배양 장치의 제1 이미지를 생성하는 단계 - 배양 장치는 전면 및 전면 반대편의 배면을 가지며,
제1 이미지는 장치의 전면에 조명을 제공하는 동안 생성되고,
배양 장치는 제1 지표 화합물 및 제2 지표 화합물을 포함하며,
제1 지표 화합물은 미생물에 의해 제1 색상을 갖는 제1 생성물로 변환되고,
제2 지표 화합물은 미생물에 의해 제2 색상을 형성하는 수-확산성 제2 생성물로 변환됨 -;
이미징 장치를 사용하여 박막 배양 장치의 제2 이미지를 생성하는 단계 - 제2 이미지는 장치의 배면에 조명을 제공하는 동안 생성됨 -;
제1 이미지 및 제2 이미지를 분석하여 각각의 이미지 내의 미생물 콜로니를 식별하는 단계;
제1 이미지를 분석하여 배양 장치 내의 특정 위치에서 콜로니에 대한 크기 파라미터의 제1 값을 계산하는 단계;
제2 이미지를 분석하여 배양 장치 내의 특정 위치에서 크기 파라미터의 제2 값을 계산하는 단계; 및
제1 값을 제2 값과 비교하는 단계를 포함하는, 방법이다.
실시예 R은, 제1 이미지는 전면 조명:배면 조명의 제1 비로 장치를 조명하는 동안 생성되고, 제2 이미지는 제1 비보다 낮은, 전면 조명:배면 조명의 제2 비로 장치를 조명하는 동안 생성되는, 실시예 Q의 방법이다.
실시예 S는, 제1 비는 약 100%:0%인, 실시예 R의 방법이다.
실시예 T는, 제2 비는 약 0%:100%인, 실시예 R 또는 실시예 S의 방법이다.
실시예 U는, 제1 이미지 및 제2 이미지가 생성되는 동안, 광학 확산기가 배양 장치의 배면에 근접하게 배치되는, 실시예 Q 내지 실시예 T 중 어느 한 실시예의 방법이다.
실시예 V는, 제1 이미지 또는 제2 이미지를 사용하여 배양 장치 내의 미생물 콜로니의 개수를 계수하는 단계를 추가로 포함하는, 실시예 Q 내지 실시예 U 중 어느 한 실시예의 방법이다.
실시예 W는, 제1 이미지 및 제2 이미지를 사용하여 배양 장치 내의 제1 타입 콜로니의 개수를 계수하고 제2 타입 콜로니의 개수를 계수하는 단계를 추가로 포함하는, 실시예 Q 내지 실시예 V 중 어느 한 실시예의 방법이다.
실시예 X는, 제1 타입 콜로니는 제1 지표를 제1 생성물로 변환시키는, 실시예 W의 방법이다.
실시예 Y는, 제2 타입 콜로니는 제2 지표를 제2 생성물로 변환시키는, 실시예 W 또는 실시예 X의 방법이다.
실시예 Z는, 제1 지표 화합물은 테트라졸륨 염료를 포함하는, 청구항 Q 내지 청구항 Y 중 어느 한 청구항의 방법이다.
실시예 AA는, 제2 지표 화합물은 인돌릴 기를 포함하는 발색성 효소 기질을 포함하는, 실시예 Q 내지 실시예 Z 중 어느 한 실시예의 방법이다.
실시예 BB는, 제1 비는 약 100%:0%이고, 제2 비는 약 0%:100%인, 실시예 Q 내지 실시예 AA 중 어느 한 실시예의 방법이다.
실시예 CC는, 크기 파라미터는 콜로니 직경인, 실시예 Q 내지 실시예 BB 중 어느 한 실시예의 방법이다.
실시예 DD는, 콜로니 직경은 콜로니 최소 직경인, 실시예 CC의 방법이다.
예
대장균 콜로니를 검출하기 위한 방법
TSB(Tryptic Soy Broth, 카탈로그 # K89)를 하디 다이어그노스틱스(Hardy Diagnostics)(미국 캘리포니아주 산타 마리아 소재)로부터 입수하였다. 미생물 균주들 대장균(ATCC 25922), 대장균(3M-FR4), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)(ATCC 51812) 및 엔테로박터 암니지너스(Enterobacter amnigenus)(ATCC 51898)를 마이크로바이오로직스 인크(Microbiologics Inc)(미국 미네소타주 세인트 클라우드 소재)로부터 입수하였다. 하룻밤 TSB 배양을 각각의 미생물 균주에 대해 준비하였다. 박막 배양 장치(쓰리엠 페트리필름 대장균/대장균형 계수(EC) 플레이트) 및 버터필드스 포스페이트 버퍼(Butterfield's Phosphate Buffer) 둘 모두를 쓰리엠 컴퍼니(미국 미네소타주 세인트 폴 소재)로부터 입수하였다.
각각의 균주의 하룻밤 배양으로부터의 희석물을 버터필드스 포스페이트 버퍼에서 준비하여 대략 25 CFU(colony-forming unit)/mL를 산출하였다. 투명 막 커버 시트를 들어올리고, 1 mL의 희석된 샘플을 코팅된 하부 막의 중심에 피펫팅하고, 커버 시트를 제자리에 내려놓음으로써, 쓰리엠 페트리필름 플레이트에 접종하였다. 제조사(쓰리엠)에 의해 제공되는 스프레딩(spreading) 장치를 사용하여 샘플을 원하는 표면적(대략 20 ㎠)으로 균일하게 스프레딩하였다. 접종된 플레이트를 35℃에서 24시간 동안 배양하였다.
배양 장치 이미징 시스템을 사용하여 페트리필름 배양 플레이트 상의 콜로니를 이미징하고 식별하였다. 이미징 시스템은 배양 플레이트의 배치를 위한 플랫폼으로서의 역할을 하는 중앙에 위치된 유리 플래튼(백색 플래시드 오팔 유리(White Flashed Opal Glass))을 포함하였다. 발광 다이오드들의 2개의 별개의 세트(각각의 세트는 2개의 적색 LED, 2개의 녹색 LED, 및 2개의 청색 LED를 포함함)를 사용하여 배양 플레이트를 전면에서 조명하였다. 하나의 세트를 배양 플레이트의 (종방향 차원에 대해) 좌측 위쪽에 위치시키고, 다른 세트를 (배양 플레이트의 종방향 차원에 대해) 우측 위쪽에 위치시켰다. 배양 장치 위쪽에 위치된 LED로부터의 광은 배양 장치로부터 멀어지는 쪽으로 그리고 광-확산 반사성 표면 내로 지향되었으며, 이 광-확산 반사성 표면은 실질적으로 균일한 조명 패턴을 배양 플레이트의 전면 상으로 지향시켰다. 유사하게, 발광 다이오드들의 2개의 별개의 세트(각각의 세트는 2개의 적색 LED, 2개의 녹색 LED, 및 2개의 청색 LED를 포함함)를 사용하여 배양 플레이트를 배면에서 조명하였다. 하나의 세트를 배양 플레이트의 (종방향 차원에 대해) 좌측 아래쪽에 위치시키고, 다른 세트를 (배양 플레이트의 종방향 차원에 대해) 우측 아래쪽에 위치시켰다. 배양 장치 아래쪽에 위치된 LED로부터의 광은 배양 장치로부터 멀어지는 쪽으로 그리고 광-확산 반사성 표면 내로 지향되었으며, 이 광-확산 반사성 표면은 실질적으로 균일한 조명 패턴을 (상기에 기술된) 유리 플래튼의 배면 상으로 지향시키고, 배양 플레이트의 배면 상에 균일한 조명 패턴을 생성하였다.
배양 플레이트의 이미지를 취득하기 위해 앱티나(Aptina) 모델 MT9P031 CMOS 이미징 센서(앱티나 이미징(Aptina Imaging), 미국 캘리포니아주 산호세 소재)를 플랫폼 위쪽에 직교로 위치시켰다. 배양 플레이트가 센서의 초점면(focal plane) 내에 위치되도록 이미징 센서 및 플랫폼을 조정하였다. 배양 플레이트의 전면(투명 막 측)이 이미징 센서를 향하도록 배양 플레이트를 플랫폼 상에 배향시켰다. 흑색 커버를 사용하여 이미징 장치를 실내 광으로부터 격리시켰다. 취득된 이미지에서, 이미지 픽셀들 전부의 히스토그램에서 픽셀들 중 약 10% 미만이 포화되도록 이미지 노출을 선택하였다. 배양 플레이트의 전면으로부터의 조명만을 사용하여 제1 이미지를 취득하였고, 배양 플레이트의 배면으로부터의 조명만을 사용하여 제2 이미지를 취득하였다. 배양 플레이트가 플랫폼 상의 정확히 동일한 위치에 유지되는 상태에서 둘 모두의 이미지를 취득하였다(즉, 둘 모두의 이미지가 취득될 때까지 플레이트는 플랫폼으로부터 이동되지 않았음). 이는 대응하는 X-Y 좌표 위치들을 정합시킴으로써 2개의 이미지 내의 일치하는 콜로니의 식별을 허용하였다.
이미지프로 플러스(ImagePro Plus) 소프트웨어(미디어 사이버네틱스(Media Cybernetics), 미국 메릴랜드주 로크빌 소재)를 사용하여 2개의 이미지를 콜로니 타입에 대해 분석하였다. 각각의 이미지에 대해, 개별 콜로니의 크기를, 콜로니 직경을 측정함으로써 결정하였다. 이미징 프로그램은 의심스러운 콜로니의 이미지의 가장 긴 차원을 포함하는 픽셀들의 라인을 따라 관찰된 적색, 녹색, 및 청색 픽셀 강도의 변화에 대해 분석하였다. 국부 배경에 대한 강도의 변화를 규정한 픽셀 위치를 사용하여, 콜로니 이미지의 가장자리를 마킹하고, 콜로니 직경을 측정하였다(직경 거리는 콜로니 가장자리를 마킹하는 픽셀 포인트들 사이에 위치된 픽셀의 개수로서 보고되었음). 이어서 2개의 이미지 내의 일치하는 콜로니에 대한 직경 측정치들을 비교하여 콜로니 타입을 결정하였다. 배양 플레이트 상의 3개의 대표적인 콜로니에 대한 결과가 표 1에 제시된다. 1 및 2로 지정된 콜로니는,각각, 도 6 및 도 7의 콜로니(74) 및 콜로니(75)에 각각 대응한다.
[표 1]
Figure pct00001
어느 경우에서도, 본 발명의 사상 및 범주를 벗어남이 없이 다양한 변경이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 규칙들 중 하나 이상이 다른 규칙과 함께 또는 다른 규칙 없이도 사용될 수 있으며, 규칙들의 다양한 서브세트가, 원하는 구현에 따라, 임의의 순서로 적용될 수 있다. 이들 및 다른 실시예는 하기의 청구범위의 범주 내에 있다.

Claims (16)

  1. 이미징 장치를 사용하여 박막 배양 장치의 제1 이미지를 생성하는 단계 - 상기 배양 장치는 투명 막 커버 시트를 갖는 전면(front side), 및 반투명 기재(substrate)를 갖는 배면(back side)을 가지며, 상기 제1 이미지는 상기 장치의 상기 전면에 조명을 제공하는 동안 생성되고, 상기 배양 장치는 제1 지표 화합물(indicator compound) 및 제2 지표 화합물을 포함하며, 상기 제1 지표 화합물은 미생물에 의해 제1 색상을 갖는 제1 생성물로 변환되고, 상기 제2 지표 화합물은 미생물에 의해 제2 색상을 형성하는 수-확산성(water-diffusible) 제2 생성물로 변환됨 -;
    상기 이미징 장치를 사용하여 상기 박막 배양 장치의 제2 이미지를 생성하는 단계 - 상기 제2 이미지는 상기 장치의 상기 배면에 조명을 제공하는 동안 생성됨 -;
    상기 제1 이미지 및 상기 제2 이미지를 분석하여 각각의 이미지 내의 미생물 콜로니(microorganism colony)를 식별하는 단계;
    상기 제1 이미지를 분석하여 상기 배양 장치 내의 특정 위치에서 콜로니에 대한 크기 파라미터의 제1 값을 계산하는 단계;
    상기 제2 이미지를 분석하여 상기 배양 장치 내의 상기 특정 위치에서 상기 크기 파라미터의 제2 값을 계산하는 단계; 및
    상기 제1 값을 상기 제2 값과 비교하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 이미지는 전면 조명:배면 조명의 제1 비(ratio)로 상기 장치를 조명하는 동안 생성되고, 상기 제2 이미지는 상기 제1 비보다 낮은, 전면 조명:배면 조명의 제2 비로 상기 장치를 조명하는 동안 생성되는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제1 비는 1:1보다 큰, 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 제1 비는 약 100%:0%인, 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 비는 약 0%:100%인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 이미지 또는 상기 제2 이미지를 사용하여 상기 배양 장치 내의 미생물 콜로니의 개수를 계수하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 이미지 및 상기 제2 이미지를 사용하여 상기 배양 장치 내의 제1 타입 콜로니의 개수를 계수하고 제2 타입 콜로니의 개수를 계수하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 제1 타입 콜로니는 상기 제1 지표를 상기 제1 생성물로 변환시키는, 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 제2 타입 콜로니는 상기 제2 지표를 상기 제2 생성물로 변환시키는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 지표 화합물은 테트라졸륨 염료를 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 지표 화합물은 인돌릴 기를 포함하는 발색성 효소 기질을 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크기 파라미터는 관찰된 콜로니 직경인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 콜로니 직경은 콜로니 최소 직경인, 방법.
  14. 컴퓨터 판독가능 명령어들을 포함하는 컴퓨터 판독가능 매체로서, 상기 컴퓨터 판독가능 명령어들은, 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 프로세서를 포함하는 배양 플레이트 스캐닝 시스템으로 하여금:
    박막 배양 장치의 제1 이미지를 획득하고 - 상기 제1 이미지는 전면 조명:배면 조명의 제1 비로 상기 장치를 조명하는 동안 생성됨 -;
    상기 박막 배양 장치의 제2 이미지를 획득하고 - 상기 제2 이미지는 상기 제1 비보다 낮은, 전면 조명:배면 조명의 제2 비로 상기 장치를 조명하는 동안 생성됨 -;
    상기 제1 이미지 및 상기 제2 이미지를 분석하여 각각의 이미지 내의 미생물 콜로니를 식별하고;
    상기 제1 이미지를 분석하여 상기 배양 장치 내의 특정 위치에서 콜로니에 대한 크기 파라미터의 제1 값을 계산하고;
    상기 제2 이미지를 분석하여 상기 배양 장치 내의 상기 특정 위치에서 상기 크기 파라미터의 제2 값을 계산하고;
    상기 제1 값을 상기 제2 값과 비교하게 하는, 컴퓨터 판독가능 매체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 프로세서에서 실행될 때, 상기 시스템으로 하여금 상기 제1 이미지 또는 상기 제2 이미지를 사용하여 상기 배양 장치 내의 미생물 콜로니의 개수를 계수하게 하는 컴퓨터 판독가능 명령어들을 추가로 포함하는, 컴퓨터 판독가능 매체.
  16. 제14항에 있어서, 상기 프로세서에서 실행될 때, 상기 시스템으로 하여금 상기 제1 이미지 및 상기 제2 이미지를 사용하여 상기 배양 장치 내의 제1 타입 콜로니의 개수를 계수하고 제2 타입 콜로니의 개수를 계수하게 하는 컴퓨터 판독가능 명령어들을 추가로 포함하는, 컴퓨터 판독가능 매체.
KR1020157018880A 2012-12-20 2013-12-13 이미지 내의 미생물 콜로니를 구분하는 방법 KR20150096718A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261739786P 2012-12-20 2012-12-20
US61/739,786 2012-12-20
PCT/US2013/074882 WO2014099643A1 (en) 2012-12-20 2013-12-13 Method of differentiating microbial colonies in an image

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20150096718A true KR20150096718A (ko) 2015-08-25

Family

ID=50023841

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157018880A KR20150096718A (ko) 2012-12-20 2013-12-13 이미지 내의 미생물 콜로니를 구분하는 방법

Country Status (7)

Country Link
US (2) US9677108B2 (ko)
EP (2) EP3336195B1 (ko)
JP (1) JP6266017B2 (ko)
KR (1) KR20150096718A (ko)
CN (1) CN104870650B (ko)
BR (1) BR112015014817A2 (ko)
WO (1) WO2014099643A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210004870A (ko) * 2019-07-05 2021-01-13 주식회사 더웨이브톡 미생물 콜로니 검출 시스템
KR102544795B1 (ko) 2022-11-30 2023-06-16 주식회사 알엠에이 미생물 검사 계수를 위한 딥러닝 인공지능 솔루션 시스템

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102013428B1 (ko) * 2011-05-20 2019-08-22 쓰리엠 이노베이티브 프로퍼티즈 컴파니 살모넬라 검출용품 및 사용 방법
KR20150099779A (ko) 2012-12-20 2015-09-01 쓰리엠 이노베이티브 프로퍼티즈 컴파니 기체 생성 미생물 콜로니를 검출하는 방법
US9557331B2 (en) 2013-08-23 2017-01-31 Elwha Llc Systems, methods, and devices for assessing microbiota of skin
US9811641B2 (en) 2013-08-23 2017-11-07 Elwha Llc Modifying a cosmetic product based on a microbe profile
US9526480B2 (en) 2013-11-27 2016-12-27 Elwha Llc Devices and methods for profiling microbiota of skin
US9805171B2 (en) 2013-08-23 2017-10-31 Elwha Llc Modifying a cosmetic product based on a microbe profile
US9456777B2 (en) * 2013-08-23 2016-10-04 Elwha Llc Systems, methods, and devices for assessing microbiota of skin
US10152529B2 (en) 2013-08-23 2018-12-11 Elwha Llc Systems and methods for generating a treatment map
US9549703B2 (en) 2013-11-27 2017-01-24 Elwha Llc Devices and methods for sampling and profiling microbiota of skin
US9390312B2 (en) * 2013-08-23 2016-07-12 Elwha Llc Systems, methods, and devices for assessing microbiota of skin
US10010704B2 (en) 2013-08-23 2018-07-03 Elwha Llc Systems, methods, and devices for delivering treatment to a skin surface
US9610037B2 (en) 2013-11-27 2017-04-04 Elwha Llc Systems and devices for profiling microbiota of skin
US9526450B2 (en) 2013-11-27 2016-12-27 Elwha Llc Devices and methods for profiling microbiota of skin
BR112016017321B1 (pt) 2014-01-30 2021-03-16 Bd Kiestra B.V. sistema e método para imagiologia de amostras biológicas dispostas em meio de cultura
KR102664258B1 (ko) 2015-04-23 2024-05-07 비디 키에스트라 비.브이. 콜로니 콘트라스트 수집
WO2016172532A2 (en) 2015-04-23 2016-10-27 Bd Kiestra B.V. A method and system for automated microbial colony counting from streaked sample on plated media
CN105466921A (zh) * 2015-11-23 2016-04-06 北京普析通用仪器有限责任公司 一种多样品同时检测的方法
JP2017225354A (ja) * 2016-06-20 2017-12-28 東洋製罐グループホールディングス株式会社 培養細胞の撮像方法及び装置
CN117187024A (zh) * 2016-11-04 2023-12-08 伯克顿迪金森公司 用于选择菌落的系统和方法
US11727699B2 (en) * 2017-10-05 2023-08-15 Becton, Dickinson And Company Application development environment for biological sample assessment processing
FR3080211B1 (fr) * 2018-04-16 2020-05-08 Pinqkerton Systeme et procede d'analyse de dispositifs de test
US20210260582A1 (en) 2018-07-23 2021-08-26 Shimadzu Corporation Microfluidic device observation device and microfluidic device observation method
DE102020106819A1 (de) 2020-03-12 2021-09-16 Funke - Dr. N. Gerber Labortechnik Gesellschaft mit beschränkter Haftung Verfahren zum zählen mikrobiologischer kolonien
CN111968174A (zh) * 2020-09-03 2020-11-20 山东省蚕业研究所 一种菌落面积的测量方法及其应用

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4565783A (en) 1981-01-27 1986-01-21 Minnesota Mining And Manufacturing Company Dry culture media
US5089413A (en) 1989-05-19 1992-02-18 Minnesota Mining And Manufacturing Company Method and apparatus for culturing with microbiological dry culture medium
US6058209A (en) 1991-09-27 2000-05-02 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for resolving redundant identifications of an object
DE69411268T2 (de) * 1993-05-14 1999-03-04 Minnesota Mining & Mfg Verfahren zur schnellen quantifizierung von microorganismenwachstum
US5364766A (en) * 1993-05-14 1994-11-15 Minnesota Mining And Manufacturing Company Culture medium for rapid count of coliform bacteria
US5601998A (en) 1994-08-18 1997-02-11 Minnesota Mining & Mfg Culture medium and device for detection and enumeration of enterobacteriaceae
US5694478A (en) 1994-12-15 1997-12-02 Minnesota Mining And Manufacturing Company Method and apparatus for detecting and identifying microbial colonies
US5681712A (en) 1995-06-02 1997-10-28 Minnesota Mining And Manufacturing Company Surface colony counting device and method of use
US6381353B1 (en) 1996-08-30 2002-04-30 Marvin Weiss System for counting colonies of micro-organisms in petri dishes and other culture media
US6002789A (en) 1997-06-24 1999-12-14 Pilot Industries, Inc. Bacteria colony counter and classifier
US6251624B1 (en) * 1999-03-12 2001-06-26 Akzo Nobel N.V. Apparatus and method for detecting, quantifying and characterizing microorganisms
US6649406B1 (en) * 1999-11-23 2003-11-18 3M Innovative Properties Company Device for propagation and storage of microorganisms
US6756225B2 (en) * 2000-12-08 2004-06-29 3M Innovative Properties Company Automated imaging and harvesting of colonies on thin film culture devices
US20040092001A1 (en) * 2001-03-01 2004-05-13 3M Innovative Properties Company Automated imaging and harvesting of colonies on thin film culture devices
US7298885B2 (en) 2002-11-27 2007-11-20 3M Innovative Properties Company Biological growth plate scanner with automated image processing profile selection
US20040102903A1 (en) 2002-11-27 2004-05-27 Graessle Josef A. Biological growth plate scanner
US20040253660A1 (en) * 2003-06-12 2004-12-16 Giles Scientific, Inc. Automated microbiological testing apparatus and method
US7496225B2 (en) * 2003-09-04 2009-02-24 3M Innovative Properties Company Biological growth plate scanner with automated intake
US7298886B2 (en) * 2003-09-05 2007-11-20 3M Innovative Properties Company Counting biological agents on biological growth plates
US20050208539A1 (en) * 2003-12-31 2005-09-22 Vann Charles S Quantitative amplification and detection of small numbers of target polynucleotides
GB2444037A (en) 2006-11-27 2008-05-28 Xsil Technology Ltd Laser Machining
US20100190204A1 (en) * 2007-03-22 2010-07-29 Nanologix, Inc. Detection and Identification of Microorganisms on Transparent Permeable Membranes
JP5174162B2 (ja) * 2007-07-09 2013-04-03 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー 微生物を検出するためのモジュール式システム及び方法
FR2926820B1 (fr) 2008-01-30 2014-10-17 Alain Rambach Procede de selection de microorganismes dans un echantillon biologique
BRPI0918694A2 (pt) * 2008-12-31 2015-12-01 3M Innovative Properties Co processo de detecção de coliforme e kit para uso do mesmo
KR20110132388A (ko) * 2009-02-26 2011-12-07 쓰리엠 이노베이티브 프로퍼티즈 컴파니 데옥시리보뉴클레아제 활성을 검출하기 위한 방법 및 용품
MX2011013562A (es) * 2009-06-15 2012-01-20 3M Innovative Properties Co Deteccion de bacterias que producen acido.
EP2519822B1 (en) * 2009-12-30 2018-09-26 3M Innovative Properties Company Rapid detection of molds that produce glucose oxidase
EP2625508A2 (en) * 2010-10-08 2013-08-14 Dark Field Technologies, Inc. Retro-reflective imaging
NO336049B1 (no) * 2010-10-22 2015-04-27 Seabox As Teknisk system, fremgangsmåte og anvendelse for online måling og overvåking av partikkelinnholdet i en injeksjonsvannstrøm i en undervannsledning
JP2012135240A (ja) * 2010-12-27 2012-07-19 Hitachi High-Technologies Corp 細菌コロニー同定装置およびその方法
EP2520923A1 (en) 2011-05-06 2012-11-07 bioMérieux Bio-imaging method and system

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210004870A (ko) * 2019-07-05 2021-01-13 주식회사 더웨이브톡 미생물 콜로니 검출 시스템
KR102544795B1 (ko) 2022-11-30 2023-06-16 주식회사 알엠에이 미생물 검사 계수를 위한 딥러닝 인공지능 솔루션 시스템

Also Published As

Publication number Publication date
US9677108B2 (en) 2017-06-13
EP3336195B1 (en) 2020-02-26
EP3336195A1 (en) 2018-06-20
CN104870650B (zh) 2018-09-11
US20150339513A1 (en) 2015-11-26
WO2014099643A1 (en) 2014-06-26
EP2935612A1 (en) 2015-10-28
JP6266017B2 (ja) 2018-01-24
JP2016508034A (ja) 2016-03-17
US9809836B2 (en) 2017-11-07
CN104870650A (zh) 2015-08-26
US20170240947A1 (en) 2017-08-24
BR112015014817A2 (pt) 2017-07-11
EP2935612B1 (en) 2018-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9809836B2 (en) Method of differentiating microbial colonies in an image
US10614286B2 (en) Method of detecting gas-producing microbial colonies
CN107580715B (zh) 用于自动计数微生物菌落的方法和系统
CN104903914B (zh) 用于定义细胞培养皿中感兴趣的对象周围的隔离区的方法
CN101981430B (zh) 生物生长培养基的光谱分析
WO2011055791A1 (ja) 細菌コロニー釣菌装置及びその方法
KR20130038345A (ko) 미생물 검출 시스템 및 방법
US20080102487A1 (en) Method and apparatus for non-invasive rapid fungal specie (mold) identification having hyperspectral imagery
CN106462730B (zh) 用于检测样品的琼脂糖培养基或膜上生长的微群落的方法和无菌试验装置
CN111263817B (zh) 用于自动化评估抗生素敏感性的方法和系统
US20220383550A1 (en) Method for assessing assessment targets, image processing device, system for assessing assessment targets
JP2021506286A (ja) 酵母または細菌を識別するための方法
JP2021506288A (ja) 細菌のグラムタイプを識別するための方法およびシステム
KR102233143B1 (ko) 비색법 진단 패드, 이를 이용한 검출 대상물질 정량화 시스템 및 방법
CN115210753A (zh) 用于菌落计数的图像中的强度差异补偿

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid